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ES2643856B1 - Triazoles para la regulación de la homeostasis de calcio intracelular - Google Patents

Triazoles para la regulación de la homeostasis de calcio intracelular Download PDF

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ES2643856B1
ES2643856B1 ES201630670A ES201630670A ES2643856B1 ES 2643856 B1 ES2643856 B1 ES 2643856B1 ES 201630670 A ES201630670 A ES 201630670A ES 201630670 A ES201630670 A ES 201630670A ES 2643856 B1 ES2643856 B1 ES 2643856B1
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ryr
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intracellular calcium
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diseases
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Aitziber IRASTORZA EPELDE
Pablo FERRÓN CELMA
José Ignacio Miranda Murua
Ainara Vallejo Illarramendi
Adolfo José LÓPEZ DE MUNAIN ARREGUI
Iván TORAL OJEDA
Garazi ALDANONDO ARISTIZABAL
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Euskal Herriko Unibertsitatea
Administracion General de la Comunidad Autonoma de Euskadi
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Abstract

Triazoles para la regulación de la homeostasis de calcio intracelular.#La presente invención se relaciona con 1,2,3-triazoles de fórmula:#{IMAGEN-01}#útiles para mejorar o restaurar la función de homeostasis de calcio intracelular y la unión RyR-calstabina en células humanas y animales. También está relacionada con métodos de síntesis de dichos compuestos, con composiciones farmacéuticas que los contienen, y con su uso para prevenir o tratar trastornos músculo-esqueléticos, cardíacos y del sistema nervioso.

Description

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De forma más preferente, Y se selecciona del grupo que consiste en CO2H, CO2Me, NH2, -NHMe, -NMe2, -NMe3, -NHEt, -NEt2, -NEt3, pirrolidin-1-ilo, piperidin-1-ilo, morfolin-4-ilo, 4piperazin-1-ilo, 4-metil-piperazin-1-ilo, piridin-1-ilo, más preferiblemente CO2H y -NMe2, aún más preferiblemente Y es –CO2H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Dentro de la variante (A), los compuestos de fórmula (I) se seleccionan del grupo que consiste en: 1-carboximetil-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-1H-1,2,3-triazol, 1-[2-(N,N-dimetilamino)etil]-4-[4-(metoxi)feniltiometil]-1H-1,2,3-triazol, 1-carboximetil-4-[4-(metoxi)feniltiometil]-1H-1,2,3-triazol, (S)-1-(1-carboxi-2-feniletil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-1H-1,2,3-triazol, (R)-1-(1-carboxi-2-feniletil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-1H-1,2,3-triazol, (S)-1-(1-carboxi-3-metilbutil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-1H-1,2,3-triazol, (R)-1-(1-carboxi-3-metilbutil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-1H-1,2,3-triazol, (S)-1-(1-carboxi-2-metilpropil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-1H-1,2,3-triazol, (R)-1-(1-carboxi-2-metilpropil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-1H-1,2,3-triazol, 1-(1-carboxi-1-metiletil)-4-[3-(metoxi)feniltiometil]-1H-1,2,3-triazol, 1-(2-hidroxietil)-4-[4-(metoxi)feniltiometil]-1H-1,2,3-triazol, 1-metoxicarbonilmetil-4-(fenilsulfinilmetil)-1H-1,2,3-triazol, y 1-carboximetil-4-[3-(metoxi)fenilsulfonilmetil]-1H-1,2,3-triazol, 1-carboximetil-4-[3-(cloro)feniltiometil]-1H-1,2,3-triazol,
o una sal del mismo. En una variante (B) de la presente invención, el radical R1 es –CH2-. En una realización preferente de dicha variante (B), R2 es un birradical alquileno C1-4 en el cual
uno o dos grupos –CH2-se encuentran reemplazados por –O-, y donde dicho birradical alquileno C1-C4 está opcionalmente sustituido con uno o dos grupos alquilo C1-C4, preferiblemente seleccionados entre metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo y tert-butilo.
De forma más preferida, R2 es un birradical -CH2-o -CH2-CH2-, opcionalmente sustituido con
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aromáticos, colorantes, agentes de mejora del aroma, conservantes y edulcorantes.
Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, carboximetilcelulosa, celulosa cristalina, glicerina, goma arábiga, lactosa, estearato de magnesio, metilcelulosa, solución salina, alginato de sodio, sacarosa, almidón, talco y agua.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención se preparan por procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, los compuestos de fórmula (I) se mezclan con un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, como una suspensión o solución. La elección del vehículo se determina por la solubilidad y la naturaleza química de los compuestos, la vía de administración elegida y la práctica farmacéutica estándar.
La administración de los compuestos o composiciones de la presente invención a un sujeto humano o animal puede ser mediante cualquier procedimiento conocido incluyendo, sin limitación, administración oral, administración sublingual o bucal, administración parenteral, absorción transdérmica, por vía de inhalación o instilación nasal, administración vaginal, rectal e intramuscular.
En una realización particular, la administración se realiza por vía parenteral, tal como por ejemplo mediante inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección intravenosa. Para la administración parenteral, los compuestos de la invención se combinan con una solución acuosa estéril que es isotónica con la sangre del sujeto. Una formulación de este tipo se prepara disolviendo el ingrediente activo sólido en agua que contiene sustancias fisiológicamente compatibles, tales como cloruro sódico, glicina y similares, y que tiene un pH tamponado compatible con condiciones fisiológicas. Dicha formulación se presenta en recipientes de dosis unitaria o múltiple, tales como ampollas o viales cerrados.
En otra realización particular, la administración se realiza por vía oral. En ese caso, la formulación de los compuestos de la invención se puede presentar en forma de cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos, o como una suspensión o solución. Dicha formulación puede incluir aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón, etc.; aglutinantes, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, goma arábiga, almidón de maíz o gelatinas; disgregantes, tales como almidón de maíz y almidón de patata o carboximetilcelulosa sódica; lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio.
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Aplicaciones
Los compuestos de la presente invención han resultado adecuados para modular los receptores RyR que regulan la función del calcio en células animales o humanas, por lo que son capaces de tratar o prevenir trastornos o enfermedades asociadas a la desregularización de calcio intracelular ocasionado fundamentalmente como consecuencia de la disfunción de los receptores RyR.
Por “desregularización de calcio intracelular” debe entenderse una regulación anormal de los niveles de calcio y los flujos de calcio en las células.
Así, un aumento en la concentración intracelular de calcio (Ca2+) bajo condiciones de reposo contribuye al daño de células musculares (miofibras) tóxicas y a la activación simultánea de proteasas dependientes de Ca2+, tales como la calpaína. Puesto que la actividad de la calpaína se incrementa en fibras musculares necróticas de ratones mdx y la disfunción de la calpaína contribuye a la miodistrofia de cintura y extremidades, la prevención de la actividad de las proteasas dependientes de calcio inhibiendo las elevaciones intracelulares de Ca2+ permite evitar la atrofia muscular y, por tanto, tratar enfermedades tales como la miodistrofia de Duchenne o la miodistrofia de Becker.
Los ensayos in vitro realizados con los compuestos de la invención han mostrado la capacidad de éstos para revertir los incrementos de calcio intracelular en fibras musculares, sugiriéndose que estos compuestos llevan a cabo esta reversión a través de un mecanismo que implica la modulación de canales RyR. Además, dichos compuestos también han mostrado capacidad para reducir a la mitad el número de genes sobreexpresados en músculo distrófico mdx, alguno de los cuales está relacionado con la pérdida de músculo esquelético o atrofia.
Los receptores RyR que regulan la función del calcio intracelular incluyen RyR1, RyR2 y RyR3, así como una proteína RyR o un análogo de RyR. Un análogo de RyR se refiere a una variante funcional de proteína RyR con actividad biológica que tiene una homología del 60% o superior en la secuencia de aminoácidos con la proteína RyR.
En el contexto de la presente invención, por “actividad biológica de RyR” debe entenderse la actividad de la proteína o péptido que demuestra una capacidad para asociarse físicamente con, o unirse a, FKBP 12 (calstabina-1) en el caso de RyR1 y RyR3, y a FKBP12.6 (calstabina-2) en el caso de RyR2 bajo las condiciones de los ensayos descritos en el presente documento.
Los compuestos de la presente invención se pueden emplear para limitar o evitar una
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disminución en el nivel de FKBP (calstabina) unida a RyR en las células de un sujeto. En base a lo descrito en el párrafo anterior, FKBP unida a RyR se refiere a FKBP12 unida a RyR1 (calstabina-1), FKBP 12.6 unida a RyR2 (calstabina-2) y FKBP12 unida a RyR3 (casltabina-1).
Una disminución en el nivel de FKBP unida a RyR en las células de un sujeto se limita o evita cuando dicha disminución está, de cualquier modo, detenida, obstaculizada, impedida, obstruida
o reducida por la administración de los compuestos de la invención, de modo que el nivel de FKBP unida a RyR en las células de un sujeto sea mayor de lo que sería de otro modo en ausencia del compuesto administrado.
El nivel de FKBP unida a RyR en un sujeto se detecta por ensayos o técnicas estándar conocidos por un experto en la materia, tales como técnicas inmunológicas, análisis de hibridación, inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western, técnicas de imagen de fluorescencia y/o detección de radiación, así como cualquier otro como el divulgado en la parte experimental del presente documento.
En una realización particular, la disminución en el nivel de FKBP (calstabina) unida a RyR se produce como consecuencia de someter las células de un sujeto a estrés nitro-oxidativo. De hecho, los ensayos experimentales realizados con los compuestos de la invención han puesto de manifiesto que éstos permiten minimizar los efectos degenerativos del estrés nitro-oxidativo sobre miotubos humanos sanos a través de un incremento de la afinidad de la interacción RyR1calstabina-1.
En consecuencia, se ha demostrado que los compuestos de la invención evitan trastornos o afecciones que implican la modulación de los receptores RyR o el incremento de calcio intracelular, permitiendo así regularizar los niveles del mismo. Ejemplos de dichos trastornos o afecciones incluyen trastornos y enfermedades del músculo esquelético (relacionados con la modulación de RyR1), trastornos y enfermedades cardíacos (relacionados con la modulación de RyR2) y trastornos y enfermedades del sistema nervioso (relacionados con la modulación de RyR1, RyR2 o RyR3).
Por tanto, un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula (I), o un estereoisómero, sal, solvato o complejo del mismo farmacéuticamente aceptable, o un derivado del mismo marcado isotópicamente, o un profármaco del mismo, en la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento y/o prevención de trastornos y enfermedades del músculo esquelético, trastornos y enfermedades cardíacos y trastornos y
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enfermedades del sistema nervioso.
En una realización particular, los trastornos y enfermedades del músculo esquelético se seleccionan entre distrofias musculares, miopatías congénitas, miopatías metabólicas y atrofia muscular. De forma preferida, dicho trastorno o enfermedad del músculo esquelético es distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker.
En otra realización particular, los trastornos y enfermedades cardíacos se seleccionan entre insuficiencia cardíaca, isquemia cardíaca, arritmias cardíacas y cardiomiopatías.
En otra realización particular, los trastornos y enfermedades del sistema nervioso se seleccionan entre accidente cerebral, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal y deterioro cognitivo.
En una realización preferente, los compuestos según la variante (A) de la presente invención son los utilizados en la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento de trastornos y enfermedades del músculo esquelético, así como al tratamiento de trastornos y enfermedades cardíacos, como los descritos anteriormente.
En otra realización preferente, los compuestos según la variante (B) de la presente invención son los utilizados en la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento de trastornos y enfermedades del sistema nervioso como los descritos anteriormente.
Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un compuesto de fórmula (I), o un estereoisómero, sal, solvato o complejo del mismo farmacéuticamente aceptable, o un derivado del mismo marcado isotópicamente, o un profármaco del mismo, para su uso en el tratamiento y/o prevención de trastornos y enfermedades del músculo esquelético, trastornos y enfermedades cardíacos y trastornos y enfermedades del sistema nervioso.
Otro aspecto de la invención se dirige a un método para el tratamiento y/o prevención de trastornos y enfermedades del músculo esquelético, trastornos y enfermedades cardíacos y trastornos y enfermedades del sistema nervioso, que comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I), o un estereisómero, sal, solvato o complejo del mismo farmacéuticamente aceptable, o un derivado del mismo marcado isotópicamente, o un profármaco del mismo.
Por cantidad “terapéuticamente eficaz” debe entenderse la cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, siendo la respuesta preventiva y/o terapéutica, evitando o
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celular conteniendo receptores RyR; (b) poner en contacto las células con el compuesto a ensayar; (c) exponer las células a una o más condiciones conocidas que alteran la regulación de calcio intracelular o generan modificaciones postraduccionales en el receptor RyR; (d) determinar si dicho compuesto modula los niveles de calcio intracelular; y (e) determinar si dicho compuesto limita o previene la disociación de calstabina del complejo proteico de RyR.
En una realización particular, las condiciones que alteran la regulación de calcio intracelular o generan modificaciones postraduccionales en el receptor RyR son estrés oxidativo o estrés nitrosativo.
La presente invención también contempla un método de diagnóstico de un trastorno o enfermedad, donde dicho método comprende:
-obtener una muestra de tejido o células de un sujeto que contenga receptores RyR; -incubar la muestra de tejido o células obtenidas en la etapa a) con un compuesto de fórmula (I) , y -determinar:
(a)
si se produce un incremento en la interacción entre RyR y calstabina con respecto
a la interacción entre RyR y calstabina en células o tejido control; o
(b)
si se produce una disminución en los niveles de calcio intracelulares comparado con una ausencia de tal disminución en las células o tejido control;
donde un aumento en la interacción entre RyR y calstabina en (a) o una disminución en los niveles de calcio intracelulares en (b), indica la presencia de un trastorno o enfermedad en el sujeto.
En una realización particular, el compuesto de formula (I) empleado en el método de diagnóstico es un compuesto según la variante (C) de la presente invención.
En otra realización particular, la muestra de tejido es una muestra de tejido muscular.
En una realización particular, cuando RyR es RyR1, el trastorno o enfermedad a diagnosticar es un trastorno o enfermedad del músculo esquelético.
En una realización particular, cuando RyR es RyR2, el trastorno o enfermedad a diagnosticar es un trastorno o enfermedad cardíaca.
En una realización particular, cuando RyR es RyR1, RyR2 o RyR3, el trastorno o enfermedad a
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Este ensayo se llevó a cabo en miotubos humanos control LHCN-M2 tras 9 días en medio de diferenciación. Dicho miotubos fueron pre-tratados durante 12 horas con los compuestos AHK1 y AHK2 a concentración de 150 nM. Tras el tratamiento, los miotubos fueron sometidos a estrés nitro-oxidativo por peroxitritos mediante la adición de SIN1 (5 mM) durante 30 minutos.
La colocalización de RyR1-calstabina se analizó mediante la técnica de ligación de proximidad in situ (in situ PLA) para lo que se utilizó el kit de Sigma Duolink II Red Fluorescence Kit, y anticuerpos específicos frente a RyR1 y calstabina 1. Esta técnica permite detectar la ubicación exacta de dos antígenos que se encuentren a una distancia menor de 40nm entre sí. Para determinar la colocalización de RyR1 con calstabina 1, se cuantificaron 3 fotografías por cada condición con aproximadamente 9 miotubos por campo, utilizando el software informático Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html). En cada imagen, el área de colocalización se normalizó con el área de expresión de miosina, que se determinó mediante inmunofluorescencia con un anticuerpo específico conjugado a fluoresceína.
Según se muestra en la Figura 3, los compuestos AHK1 y AHK2 según la invención presentan capacidad para recuperar parcialmente la disminución de la interacción de RyR1-calstabina1 en cultivos de miotubos humanos sanos tras ser sometidos a estrés nitro-oxidativo. El análisis de la interacción RyR1-Calst1 mediante la técnica de PLA demostró que en presencia de SIN1 se produce la disociación del complejo RyR1-Calst1 y que dicha disociación puede prevenirse parcialmente con el pretratamiento con los compuestos AHK1 y AHK2. En el panel superior de la Figure 3 se muestra la cuantificación de las imágenes de PLA con ImageJ, mientras que en el panel inferior se muestran imágenes representativas de PLA de cada condición, donde los puntos representan la interacción RyR1-Calst1 (barra de calibración 50 m). Por lo tanto, los compuestos ensayados según la invención no solo mejoran la funcionalidad de miotubos distróficos de tipo Duchenne o Becker, sino que también minimizan los efectos degenerativos del estrés nitro-oxidativo sobre miotubos humanos sanos a través de un incremento de la afinidad de la interacción RyR1-calstabina1.
Según estos resultados, los compuestos de la invención pueden ser útiles como agentes terapéuticos frente a enfermedades causadas por la disminución de la afinidad RyR1-calstabina1 bajo condiciones de estrés nitro-oxidativo.
EJEMPLO 27. Ensayos biológicos in vivo en ratones
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Utrn
Mm.418026 NM_011682 2,03 1,35
Genes sobreexpresados que se normalizan parcialmente con AHK1
Casp3
Mm.34405 NM_009810 10,28 5,27
Igf2
Mm.3862 NM_010514 22,31 9,78
Il1b
Mm.222830 NM_008361 17,77 2,82
Il6
Mm.1019 NM_031168 32,72 9,76
Lmna
Mm.471227 NM_019390 5,29 2,52
Mmp9
Mm.4406 NM_013599 4,51 2,01
Myog
Mm.16528 NM_031189 17,36 3,24
Tgfb1
Mm.248380 NM_011577 6,51 3,61
Tnnc1
Mm.439921 NM_009393 25,00 4,53
Tnnt1
Mm.358643 NM_011618 12,09 3,37
Genes sobreexpresados cuya expresión no varía con AHK1
Bmp4 Mm.6813 NM_007554 1,93 2,08 Capn2 Mm.19306 NM_009794 2,90 1,75 Igf1 Mm.268521 NM_010512 2,87 2,07 Tnf Mm.1293 NM_013693 15,01 10,27 Prkag3 Mm.453463 NM_153744 2,52 2,68 Rhoa Mm.318359 NM_016802 2,30 1,80 Pax3 Mm.1371 NM_008781 2,16 2,48 Pax7 Mm.218760 NM_011039 3,82 2,55 Musk Mm.16148 NM_010944 3,51 2,00 Myf5 Mm.4984 NM_008656 3,40 2,13
En concreto, los resultados ponen de manifiesto que los compuestos según la invención muestran capacidad para reducir a la mitad el número de genes sobreexpresados en músculo distrófico mdx. Los genes susceptibles de ser modulados mediante los compuestos AHK incluyen, pero no
5 se limitan a, Akt1, Bcl2, Casp3, Cast, Cav3, Cryab, Ctnnb1, Dag1, Des, Dysf, Foxo3, Igfbp3, Igfbp5, Ikbkb, Mapk3, Myod1, Nfkb1, Ppargc1b, Prkaa1, Rps6kb1, Utr, Casp3, Igf2, Il1b, Il6, Lmna, Mmp9, Myog, Tgfb1, Tnnc1 y Tnnt1. Dentro de esta lista, Akt1, Il1b, Mapk3, Mmp9 y Utr son genes relacionados con la pérdida de músculo esquelético o atrofia.
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