MX2014012380A - Forma de sal de un inhibidor de histona metiltransferasa humana ezh2. - Google Patents

Abstract

Se proporciona en la presente un bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetr ahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1' -bifenil]-3-carboxamida. También se proporciona en la presente una forma polimorfa particular de este compuesto.

Description

FORMA DE SAL DE UN INHIBI DOR DE HISTONA METI LTRANSFERASA HUMANA EZH2 Solicitud Relacionada La presente solicitud reclama la prioridad y el beneficio de la Solicitud Provisional Norteamericana No. 61 /624,215, presentada el 1 3 de abril de 2012 , cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia. Antecedentes de la Invención Se estima que más de 1 .6 millones de personas fueron diagnosticadas con cáncer en el 2012. Por ejemplo, el tipo de cáncer más común en mujeres es cáncer de seno y esta enfermedad es responsable de uno de los rangos de mayor fatalidad de todos los cánceres que afectan a las mujeres. El tratamiento actual de cáncer de seno se limita a masectomía total , o parcial, terapia de radiación o quimioterapia . Se estima que en el 2012 hubieron casi 230,000 de casos de cáncer de seno, lo cual da como resultado aproximadamente 40,000 muertes . Ver la Publicación de Siegel et al. , Ca Cáncer J Clin 2012 ; 62: 10-29.

U n n úmero de muertes por cáncer es originada por cánceres sanguíneos que incluyen leucemias, mielomas y linfomas. En 2012 , casi el 80,000 de los casos de cáncer serán linfomas, lo cual dará como resultado un estimado de 20,000 muertes.

La terapia de radiación, la quimioterapia y cirug ía son los metodos principales para el tratamiento de cáncer. Sin embargo, estas terapias son más exitosas ú nicamente cuando el cáncer es detectado en una etapa temprana. U na vez que el cáncer alcanza etapas invasivas/metastáticas , las líneas de células invasivas o células con metástasis pueden escapar de la detección , dando como resultado reincidencias, lo cual requiere el uso de terapia q ue es altamente tóxica. En este punto, tanto las células de cáncer como las célu las no afectadas del paciente se exponen a terapia tóxica, dando como resultado, entre otras complicaciones , un debilitamiento del sistema inmune.

Por lo tanto, ha permanecido la necesidad en la téenica de n uevos métodos para tratar cáncer, tal como cáncer de seno o linfomas, en un paciente .

Breve Descri pción de la I nvención Por consiguiente en la presente invención se proporciona bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-dih idropirid in-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 , 1 '-bifenil]-3-carboxamida: Tambien se proporciona u na forma de polimorfo particular de bromhid rato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2 H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 , 1 '-bifenil]-3-carboxamida (“Polimorfo A” o "Polimorfo A de bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-d ihid ropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrah idro-2 H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 , 1 '-bifen il]-3-carboxam¡da”) . Tal como aquí se describe, la sal de bromh idrato aquí proporcionada, así como el Polimorfo A, exhiben propiedades físicas que pueden ser explotadas con el objeto de obtener nuevas propiedades farmacológicas, y que pueden ser utilizadas en el desarrollo de sustancias de fármacos y prod uctos de fármacos.

En una modalidad , el bromhidrato es cristalino. En otra modalidad , el bromhidrato es sustancialmente libre de impurezas. En otra modalidad , el bromhidrato es un sólido cristalino sustancialmente libre de bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahid ro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 , 1 '-bifenil]-3-carboxamida amorfo.

En otro aspecto , se proporciona una composición farmacéutica que comprende el bromhidrato descrito anteriormente, y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En u n aspecto, el bromhidrato descrito anteriormente se prepara utilizando un metodo que comprende combinar N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida con ácido hidrobrómico.

El Polimorfo A de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-dihidropiridin- 3-il)metil)-5-(etM(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 , 1 '-bifenil]-3-carboxamida puede definirse de acuerdo con su patrón de difracción de polvo de rayos X. Por consiguiente, en una modalidad, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de polvo de rayos X que tiene uno o más picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, aproximadamente 17.5 +/-0.3 grados y aproximadamente 22.0 +/- 0.3 grados 2-theta. En otra modalidad, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de polvo de rayos X que tiene picos característicos expresados en grados 2-theta de aproximadamente 3.9 + /- 0.3 grados, aproximadamente 17.5 + /- 0.3 grados y aproximadamente 22.0 + /- 0.3 grados 2-theta. Aún en otra modalidad, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de polvo de rayos X que tiene picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, 10.1 + /- 0.3 grados, 14.3 + /- 0.3 grados, 17.5 +/- 0.3 grados, 18.7 + /- 0.3 grados, 20.6 +/-0.3 grados, 20.9 +/- 0.3 grados, 21.8 + /- 0.3 grados, 22.0 +/-0.3 grados, 23.3 +/- 0.3 grados y 23.6 +/-0.3 grados 2-theta. En otra modalidad, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de polvo de rayos X sustancialmente de acuerdo con la figura 1 . En otra modalidad , el polimorfo exhibe un patrón de difracción de polvo de rayos X sustancialmente de acuerdo con la tabla 1 .

El Polimorfo A tambien puede ser defin ido de acuerdo con su termog rama de calorimetría de expresión diferencial . En una modalidad , el polimorfo exhibe u n termog rama de calorimetría de exploración diferencial que tiene u n pico característico expresado en unidades de °C a una temperatu ra de 255 +/-5°C. En una modalidad , el polimorfo exhibe u n termograma de calorimetría de exploración diferencial sustancialmente de acuerdo con la fig ura 3.

En un aspecto , se prepara el Polimorfo A utilizando un método que comprende combinar N-((4 ,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-dihid ropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 , 1 '-bifenil]-3-carboxamida con ácido hidrobrómico.

En otro aspecto, se proporciona un método para recristalizar el Polimorfo A, en donde el método comprende los siguientes pasos: (a) disolver el Polimorfo A en un primer solvente, y (b) agregar un segundo solvente, de modo que se cristalice el polimorfo . En una modalidad , el primer solvente es etanol, y el segundo solvente es MTBE. En otra modalidad, el método comprende (a) disolver el Polimorfo A en etanol , (b) calentar la mezcla , (c) ag regar MTBE a la mezcla, formar un precipitado q ue comprende el polimorfo y filtrar el precipitado de modo que se recristalice el polimorfo .

Aún en otro aspecto, se proporciona una composición farmaceutica que comprende un Polimorfo A, y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

También se proporciona un método para tratar cáncer, en donde el método comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo u na cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de bromhidrato descrito anteriormente, el Polimorfo A, o una composición farmacéutica que comprende cualquiera de estos compuestos. Se puede tratar una variedad de cánceres, incluyendo linfoma de Hodgkin y cáncer de seno.

En otro aspecto, se proporciona un método para inhibir la actividad de la histona metiltransferasa de EZH2 en un sujeto que necesita del mismo, en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva del compuesto de bromhidrato descrito anteriormente, Polimorfo A, o una composición farmacéutica que comprende cualquiera de estos compuestos.

Aún en otro aspecto, se proporciona un método para inhibir la actividad de histona metiltransferasa de EZH2 in vitro, en donde el método comprende administrar el compuesto de bromhidrato descrito anteriormente, o Polimorfo A.

También se proporciona el uso de un compuesto de bromhid rato descrito anteriormente, el Polimorfo A, o una composición farmacéutica que comprende cualquiera de estos compuestos, para la preparación de u n medicamento para el tratamiento de cáncer en u n sujeto que necesita del mismo.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 ilustra el patrón de difracción de polvo de rayos X del Polimorfo A (monobromh idrato) .

La figu ra 2, ilustra el patrón de difracción de polvo de rayos X de dibromh idrato del Compuesto I .

La figu ra 3, ilustra el termog rama de calorimetría de exploración diferencial del Polimorfo A.

La figu ra 4, ilustra la absorción de vapor dinámica del Polimorfo A, que demuestra la baja h ig roscopicidad de esta compuesto.

La fig u ra 5, ilustra el análisis H PLC de Polimorfo A en tres d ías a una temperatura elevada. El Polimorfo A produjo impurezas mínimas en este tiempo.

La figura 6, ilustra la absorción de vapor dinámica de la sal de sodio de Compuesto I , que demuestra la hig roscopicidad significativa de este compuesto.

La fig ura 7, ilustra la absorción de vapor dinámica de la sal de hemisulfato de Compuesto I , que demuestra q ue este compuesto tiene higroscopicidad moderadamente alta.

La figura 8, muestra los datos de calorimetría de exploración diferencial de la sal de monoclorhidrato del Compuesto I , que indica que este compuesto es deficientemente cristalino.

La figura 9, ilustra el patrón de difracción de polvo de rayos X del intermediario sintetico 5.

La figura 10, ilustra el patrón de difracción de polvo de rayos X del Polimorfo B.

La figura 11, ilustra la estructura de cristal de rayos X del monobromhidrato del Compuesto I.

Las figuras 12 a 14, muestran los resultados de estudios in vivo del bromhidrato del Compuesto I en una línea de célula de linfoma humana.

Las figuras 15 a 16, muestran el efecto anticáncer del bromhidrato del Compuesto I en un modelo de xenomjerto de linfoma de ratón.

La figura 17, ilustra el patrón de difracción de polvo de rayos X del intermediario sintético 2.

Las figuras 18A y B ilustran (A) el patrón de difracción de polvo de rayos X de la sal de tetraclorhidrato del Compuesto I, y (B) la absorción de vapor dinámica de la sal de monoclorhidrato del Compuesto I, que demuestra la higroscopicidad significativa de este compuesto.

Descripción Detallada de la Invención Forma de Sal HBr y Forma de Polimorfo A En la presente invención se proporciona bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiri in-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4,-(morfolinometil)-[1 , 1 '-bifenil]-3-carboxamida: Tal como aquí se utiliza, el “Compuesto I” se refiere a N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4,-(morfolinometil)-[1 , 1 '-bifenil]-3-carboxamida. El bromhidrato del Compuesto I puede ser utilizado para iniciar la actividad de histona metiltransferasa de EZH2, ya sea en un sujeto o in vitro. El bromhidrato del Compuesto I tambien se puede utilizar para tratar cáncer en un sujeto que necesita del mismo.

El Compuesto I puede protonarse en uno o más de sus sitios básicos, tal como morfolina, anilina disustituida y/o porciones de piridona. Por consiguiente, en ciertas modalidades, se proporciona el monobromhidrato, dibromhidrato o tribromhidrato del Compuesto I. En una modalidad, se proporciona el monobromhidrato del Compuesto I. Cuando el compuesto es monobromhidrato, el compuesto puede ser protonado en cualquier sitio básico. En una modalidad no limitante, el Compuesto I es protonado en el nitrógeno del sustituyente de morfolino, proporcionando un monobromhidrato del Compuesto I que tiene la siguiente estructura: Este monobromhidrato particular puede ser referido como bromuro de "4-((3'-(((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-dih idropiridin-3-il)metil)carbamoil)-5'-(etil(tetrahidro-2 H -piran -4-il)a mi no)-4'-m eti I - [ 1 ,-bifenil]-4-il)metil)morfolin-4-io”. La fig ura 1 1 ilustra la estructura de cristal de rayos X de esta forma de sal particular.

El bromhidrato del Compuesto I tiene un número de propiedades físicas convenientes con respecto a su forma de base libre, así como otras sales de la base libre. En particular, el bromhid rato del Compuesto I tiene baja hig roscopicidad en comparación con las otras formas de sal del Compuesto I . Para que un compuesto sea efectivo en terapia , generalmente se requ iere que el compuesto sea mínimamente hig roscópico. Las formas de fármaco que son altamente higroscópicas pueden ser inestables, ya que el rango de disolución de la forma del fármaco puede cambiar conforme se almacena en instalaciones con humedad variante . Asimismo, la higroscopicidad puede impactar el manejo y la fabricación a g ran escala de un compuesto, ya que puede ser difícil determinar el peso real del agente activo hig roscópico cuando se prepara u na composición farmaceutica q ue comprende dicho agente . El bromh idrato del Compuesto I tiene una baja higroscopicidad en comparación con otras formas de sal del Compuesto I . Por lo tanto, se puede almacenar durante períodos apreciables, y no padece de cambios perjudiciales , por ejemplo, en solubilidad , densidad , o incluso composición q u ímica .

Además de las ventajas anteriores, el bromhidrato del Compuesto I puede ser prod ucido en una forma altamente cristali na, que es útil en la preparación de formulaciones farmacéuticas, y mejorará el manejo, manipulación y almacenamiento general del compuesto de fármaco. En una modalidad preferida, la forma cristalina del bromh id rato del Compuesto I es una forma referida como el “Polimorfo A.” La capacidad que tiene la sustancia de existir en más de una forma de cristal , se define como polimorfismo; las d iferentes formas de cristal de una sustancia particular son referidas como “polimorfos”. En general , el polimorfismo se ve afectado por la capacidad de una molécula de una sustancia de cambiar su conformación , o de formar diferentes interacciones intermoleculares e intramoleculares, particu larmente enlaces de h idrógeno, que se reflejan en diferentes órdenes de átomos en las celosías de cristal de los diferentes polimorfos. En contraste , la forma externa general de u na sustancia es conocida como “morfolog ía”, que se refiere a la forma externa de un cristal y los planos presentes, hacen referencia a la estructura interna. Los cristales pueden mostrar diferente morfología con base en diferentes condiciones, tal como por ejemplo, rango de crecimiento, agitación y presencia de impurezas.

Los diferentes polimorfos de una sustancia pueden poseer diferentes energ ías de la celosía de cristal, y por lo tanto, en estado sólido, pueden mostrar diferentes propiedades físicas tal como forma, densidad , punto de fusión , color, estabilidad , solubilidad , rango de solución , etc. , lo cual, a su vez, afecta la estabilidad , rango de disolución y biodisponibilidad de un polimorfo determinado y su capacidad de adecuación para utilizarse como un farmaceutico y en composiciones farmacéuticas.

El Polimorfo A es altamente cristalino, y muestra baja h igroscopicidad . Asimismo, este polimorfo puede obtenerse en forma reproducible, y los ligeros cambios en las condiciones de cristalización no dan como resultado diferentes formas de cristal.

El acceso a diferentes polimorfos del bromhid rato del Compuesto I es deseable por un número de razones. U na razón es que los polimorfos individuales pueden incorporar d iferentes impurezas, o residuos químicos al momento de la cristalización. Por ejemplo, las impurezas pueden ser eliminadas du rante el proceso de convertir el Compuesto I en el Polimorfo A.

Sin pretender limitarse a la teoría, las formas de polimorfo exhiben formas de cristal compactas q ue poseen ventajas en terminos de facilidad de filtración y facilidad de flujo. El Polimorfo A exhibe una forma de cristal compacta q ue por consiguiente posee estas ventajas.

En ciertas modalidades , el Polimorfo A es identificable sobre las bases de picos característicos en un análisis de difracción de polvo de rayos X. La difracción de polvo de rayos X, también referida como XRPD, es una téenica científica que utiliza rayos X, neutrones o difracción de electrones en polvo, microcristalino, u otros materiales para caracterización estructural de los materiales. En una modalidad , el Polimorfo A exhibe un patrón de difracción de polvo de rayos X que tiene uno o más picos característicos expresados en g rados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 g rados, aproximadamente 17.5 + /- 0.3 grados y aproximadamente 22.0 + /- 0.3 grados 2-theta. En otra modalidad , el polimorfo exh ibe un patrón de difracción de polvo de rayos X que tiene picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, aproximadamente 1 7.5 +/- 0.3 g rados y aproximadamente 22.0 + /- 0.3 g rados 2-theta.

En una modalidad , el Polimorfo A exhibe un patrón de d ifracción de polvo de rayos X q ue tiene al menos 5 picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, 10.1 +/- 0.3 grados, 14.3 + /- 0.3 grados, 17.5 +/- 0.3 grados, 18.7 +/- 0.3 grados, 20.6 +/-0.3 grados, 20.9 +/- 0.3 grados, 21.8 +/- 0.3 grados, 22.0 +/-0.3 grados, 23.3 +/- 0.3 grados and 23.6 +/-0.3 grados 2-theta. En otra modalidad, Polimorfo A exhibe un patrón de difracción de polvo de rayos X que tiene al menos 6 picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, 10.1 +/- 0.3 grados, 14.3 +/- 0.3 grados, 17.5 +/- 0.3 grados, 18.7 +/- 0.3 grados, 20.6 +/- 0.3 grados, 20.9 + /- 0.3 grados, 21.8 +/- 0.3 grados, 22.0 +/- 0.3 grados, 23.3 +/- 0.3 grados y 23.6 +/- 0.3 grados 2-theta. Aún en otra modalidad, el Polimorfo A exhibe un patrón de difracción de polvo de rayos X que tiene al menos 7 picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, 10.1 +/-0.3 grados, 14.3 +/- 0.3 grados, 17.5 +/- 0.3 grados, 18.7 +/-0.3 grados, 20.6 +/- 0.3 grados, 20.9 +/- 0.3 grados, 21.8 +/- 0.3 grados, 22.0 +/- 0.3 grados, 23.3 +/- 0.3 grados and 23.6 +/-0.3 grados 2-theta. En otra modalidad, el Polimorfo A exhibe un patrón de difracción de polvo de rayos X que tiene al menos 8 picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, 10.1 +/- 0.3 grados, 14.3 + /- 0.3 grados, 17.5 +/- 0.3 grados, 18.7 +/- 0.3 grados, 20.6 +/-0.3 grados, 20.9 +/- 0.3 grados, 21.8 +/- 0.3 grados, 22.0 +/-0.3 grados, 23.3 +/- 0.3 grados y 23.6 +/- 0.3 grados 2-theta. Aún en otra modalidad, el Polimorfo A exhibe un patrón de difracción de polvo de rayos X que tiene al menos 9 picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, 10.1 +/- 0.3 grados, 14.3 + /- 0.3 grados, 1 7.5 +/- 0.3 grados, 18.7 +/- 0.3 grados, 20.6 +/-0.3 grados, 20.9 +/- 0.3 g rados , 21 .8 +/- 0.3 g rados, 22.0 +/-0.3 g rados, 23.3 +/- 0.3 grados and 23.6 +/-0.3 g rados 2-theta. Aún en otra modalidad, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de polvo de rayos X q ue tiene al menos 10 picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados , 10.1 + /- 0.3 grados, 14.3 + /- 0.3 g rados, 1 7.5 +/- 0.3 grados, 18.7 +/- 0.3 grados, 20.6 +/-0.3 grados, 20.9 +/- 0.3 grados, 21 .8 +/- 0.3 grados, 22.0 +/-0.3 grados , 23.3 +/- 0.3 grados y 23.6 +/- 0.3 grados 2-theta .

Aún en otra modalidad, el polimorfo exhibe un patrón de difracción de polvo de rayos X que tiene picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 + /- 0.3 grados, aproximadamente 14.3 +/- 0.3 g rados, aproximadamente 1 8.7 + /- 0.3 grados, aproximadamente 23.3 +/- 0.3 g rados y aproximadamente 23.6 +/- 0.3 grados 2-theta .

Aún en otra modalidad , el polimorfo exhibe un patrón de difracción de polvo de rayos X q ue tiene picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, aproximadamente 10.1 +/- 0.3 grados, aproximadamente 14.3 +/- 0.3 grados, aproximadamente 17.5 +/- 0.3 grados , aproximadamente 18.7 +/- 0.3 g rados , aproximadamente 20.6 + /- 0.3 grados, aproximadamente 20.9 +/- 0.3 g rados, aproximadamente 21 .8 +/- 0.3 grados , aproximadamente 22.0 + /- 0.3 grados , aproximadamente 23.3 +/- 0.3 grados y aproximadamente 23.6 +/- 0.3 grados 2-theta . Aún en otra modalidad , el polimorfo exhibe un patrón de d ifracción de polvo de rayos X sustancialmente de acuerdo con la figura 1 . En otra modalidad , el polimorfo exhibe un patrón de difracción de polvo de rayos X sustancialmente de acuerdo con los valores 2-theta descritos en la tabla 1 .

Tal como se utiliza en la presente invención , el termino “aproximadamente”, cuando se utiliza en referencia a un valor de grado 2-theta , se refiere a un valor manifestado +/- 0.3 g rados 2-theta.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden el Polimorfo A pueden ser identificadas mediante comparación de los patrones de difracción de polvo de rayos X de las composiciones con un patrón de difracción de polvo de rayos X del Polimorfo A. Se podrá apreciar que las composiciones farmacéuticas que comprenden un Polimorfo A pueden exhibir patrones de difracción de polvo de rayos X no idénticos en comparación con un patrón de difracción de polvo de rayos X del Polimorfo A puro.

En ciertas modalidades , el Polimorfo A es identificable sobre las bases de pico característico observado en un termograma de calorimetría de exploración diferencial. La calorimetría de exploración diferencial , o DSC, es una téenica termoanalítica en la cual se mide la cantidad de calor requerida para incrementar la temperatura de la muestra y la referencia, como una función de la temperatura. En una modalidad , el Polimorfo A exhibe un termograma de calorimetría de exploración diferencial que tiene u n pico característico expresado en unidades de °C a una temperatura de aproximadamente 255 +/- 5°C . En otra modalidad , el Polimorfo A exhibe u n termograma de calorimetría de exploración d iferencial que tiene un pico endotermico individ ual observado en el rango de temperatura de 250 a 255°C . En otra modalidad, el Polimorfo A exhibe un termograma de calorimetría de exploración diferencial sustancialmente de acuerdo con la figura 3.

En ciertas modalidades, el Polimorfo A puede contener impurezas. Los ejemplos no limitantes de impurezas incluyen formas de polimorfo indeseadas, o moléculas orgánicas e inorgánicas residuales tales como solventes, agua o sales. En una modalidad , el Polimorfo A es sustancialmente libre de impurezas. En otra modalidad , el Polimorfo A contiene menos del 10% en peso de impu rezas totales . En otra modalidad, el Polimorfo A contiene menos del 5% en peso de impurezas totales. En otra modalidad , el Polimorfo A contiene menos del 1 % en peso de impurezas totales. Aún en otra modalidad, el Polimorfo A contiene menos del 0.1 % en peso de impurezas totales.

En ciertas modalidades, el Polimorfo A es u n sólido cristalino sustancialmente libre del bromhid rato del Compuesto I amorfo. Tal como se utiliza en la presente invención , el termino “sustancialmente libre del bromhidrato del Compuesto I amorfo” significa que el compuesto no contiene cantidades significativas del bromhidrato del Compuesto I amorfo. En ciertas modalidades, al menos aproximadamente el 95% en peso del Polimorfo A cristalino está presente. En otras modalidades de la invención , está presente al menos aproximadamente el 99% en peso del Polimorfo A cristalino.

En otra modalidad , el Polimorfo A está sustancialmente libre del Polimorfo B.

La sal de la presente invención , y su Polimorfo A de forma de cristal , puede encontrarse junto con otras sustancias o puede aislarse. En algu nas modalidades, la sal de la presente invención , o su forma de cristal , es sustancialmente aislada. Por “sustancialmente aislado” se entiende que la sal o su forma de cristal está al menos parcial o sustancialmente separada del ambiente en el cual se forma o detecta . La separación parcial puede incluir por ejemplo, u na composición enriquecida en la sal de la presente invención . La separación sustancial puede incluir composiciones que contienen al menos aproximadamente 50% , al menos aproximadamente 60% , al menos aproximadamente 70% , al menos aproximadamente 80% , al menos aproximadamente 90% , al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 97% o al menos aproximadamente 99% en peso del bromhidrato del Compuesto I y Polimorfo A. Los metodos para aislar compuestos y sus resultados son de rutina en la téenica.

Tanto el bromhidrato del Compuesto I como del Polimorfo A puede surgir en cualquier tautómero razonable, o una mezcla de tautómeros razonables. Tal como se utiliza en la presente invención, el término “tautómero” se refiere a uno de dos o más isómeros estructurales que existen en equilibrio y que son convertidos fácilmente de una forma isométrica a otra. Los ejemplos incluyen tautómeros ceto-enol , tal como acetona/propen-2-ol, y similares. El bromhidrato del Compuesto I y Polimorfo A puede tener uno o más tautómeros y por consiguiente, inclu ir varios isómeros , es decir, piridin-2(1 H)-ona y el piridin-2-ol correspondiente. Todas de d ichas formas isoméricas de estos compuestos se incluyen expresamente en la presente invención .

Preparación de la Forma de Sal HBr y Polimorfo A El bromhidrato del Compuesto I , así como del Polimorfo A, se puede preparar utilizando técnicas conocidas.

Convencionalmente , se prepara u na forma de sal combinando en la solución el compuesto base libre y un ácido que contiene el anión de la forma de sal deseada , y posteriormente aislando el prod ucto de sal sólido de la solución de reacción (por ejemplo, mediante recristalización , precipitación , evaporación, etc ) . Se pueden emplear otras teenicas de formación de sal .

El Esquema 1 que se encuentra más adelante señala una modalidad particular para la producción de la base libre del Compuesto I , así como el bromhidrato del Compuesto I . En síntesis , se hizo reaccionar 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo (1 ) con dihidro-2H-piran-4(3H)-ona bajo condiciones de aminación red uctora para formar 5-bromo-2-metil-3-((tetrahid ro-2H-piran-4-il)amino)benzoato de metilo (2) en el paso 1 . En el paso 2, se utilizó n uevamente aminación reductiva para formar 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2 H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoato (3) . Este compuesto se h izo reaccionar posteriormente bajo condición de acoplamiento de Suzuki en el paso 3 para formar 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 , 1 '-bifenil]-3-carboxilato de metilo (4) , el cual se hidrolizó al ácido correspondiente (5) en el paso 4. En el paso 5, se hizo reaccionar el ácido (5) bajo condiciones de reacción de acoplamiento de amida con bromh idrato de 3-(aminometil)-4,6-dimetil-dihidro-piridin-2(1 H)-ona para formar el Compuesto I .

Tal como se muestra, el Compuesto I posteriormente se puede hacer reaccionar con H Br acuoso para formar el bromhidrato del Compuesto I .

Esquema 1 rrc i Paso 5 Paso 6 Me' Me e^^^Me Compuesto I Compuesto I - HBr La síntesis descrita anteriormente tiene u n número de ventajas. Por ejemplo, utiliza un número de intermediarios que pueden ser preparados en formas cristalinas que pueden ser aisladas . Por el uso de intermed iarios cristalinos, son necesarias téenicas de pu rificación mínima (por ejemplo, cromatografía) que conducen a un rendimiento del Compuesto I final mejorado de manera general.

Por consiguiente, se proporciona el compuesto 1 intermediario en forma cristalina. En otra modalidad, se proporciona el compuesto 2 intermediario en forma cristalina. La figura 17 muestra u n patrón de difracción de polvo de rayos X del compuesto cristalino 2. Aún en otra modalidad , el compuesto 5 intermediario es cristalino. La figu ra 9 muestra un patrón de difracción de polvo de rayos X del compuesto cristalino 5. En otras modalidades , los compuestos 2 y/o 5 se producen en forma sustancialmente pu ra sin el uso de cromatografía. Los expertos en la teenica pod rán apreciar que los intermediarios de cristalización no necesariamente proceden en forma fácil o eficiente.

También se proporciona un método para preparar N-((4,6-d imetil-2-oxo-1 ,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 , 1 '-bifenil]-3-carboxamida que comprende hacer reaccionar ácido 5-(Etil(tetrahid ro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 , 1 '-bifenil]-3-carboxílico (5) con una sal de 3-(aminometil)-4,6-dimetil-dihid ro-piridin-2(1 H)-ona. En u na modalidad de este método, (5) está en forma cristalina.

El Compuesto I puede hacerse reaccionar con HBr acuoso en la presencia de un solvente adecuado para formar el Polimorfo A, una forma de cristal particular del bromhidrato. En u na modalidad , el Compuesto I se hace reaccionar con H Br acuoso en la presencia de etanol y acetato de etilo para formar el Polimorfo A.

U na vez q ue se prepara el polimorfo, se puede cristalizar, utilizando el mismo solvente (o solventes) que se utilizó para preparar el polimorfo, o un d iferente solvente (o solventes), para producir u na composición q ue tenga cristalinidad incrementada. En general, el Polimorfo A puede ser recristalizado disolviendo el polimorfo en uno o más solventes, calentando opcionalmente, seguido de un paso de enfriamiento opcional , y posteriormente aislando la estructura de cristal , a traves, por ejemplo , de u n paso de filtración. Después de que el polimorfo se disuelve inicialmente en el primer solvente (o combinación de solventes) , se puede agregar un solvente diferente, adicional en cualquier pu nto del proceso (antes o después del calentamiento , antes o después del enfriamiento, etc.) para producir la estructura de cristal deseada . Por ejemplo, se puede utilizar un primer solvente para disolver el compuesto de polimorfo, y posteriormente un segundo solvente (por ejemplo, un antisolvente) puede ser agregado para originar q ue el polimorfo se precipite de la solución . En u na modalidad, se ag rega agua al primer solvente para ayudar a disolver el polimorfo.

Los ejemplos no limitantes de solventes que se pueden utilizar para la recristalización del Polimorfo A son como se indica: metanol , etanol , acetato de etilo, éter metil ter-butílico, agua , alcohol isopropílico, tetrahid rofurano, acetona, acetonitrilo y 2-metiltetrahidrofurano , así como combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de combinaciones de solvente que son útiles para la recristalización del Polimorfo A son (solventes y antisolventes, en donde se puede agregar agua al primer solvente para ayudar a la disolución del polimorfo): metanol/agua y acetato de etilo , alcohol isopropílico/agua y acetato de etilo, tetrahidrofurano/agua y acetato de etilo, acetona y acetato de etilo, acetonitrilo/agua y acetato de etilo, etanol/ag ua y eter metil ter-butílico, alcohol isopropílico/agua y éter metil ter-butílico , etanol/agua y tetrahidrofurano, alcohol isopropílico/agua y acetona , y etanol/agua y acetato de etilo. En modalidades particulares, las combinaciones de solvente son metanol/agua y acetato de etilo, alcohol isopropílico/agua y acetato de etilo, etanol/agua y 2-metiltetrahidrofurano y meta nol/2-metiltetrahidrofu rano.

En un aspecto, se prepara el Polimorfo A utilizando un método que comprende combinar N-((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-dihid ropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrah idro-2 H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 , 1 '-bifenil]-3-carboxamida con ácido bromhídrico.

En otro aspecto, se proporciona un método para recristalizar el Polimorfo A, en donde el método comprende los siguientes pasos: (a) disolver el Polimorfo A en un primer solvente, y (b) agregar un segundo solvente, de modo que se recristalice el primer polimorfo . En una modalidad , el primer solvente es etanol, y el segundo solvente es polimorfo. En otra modalidad , el método comprende (a) disolver el Polimorfo A en etanol, (b) calentar la mezcla, (c) ag regar MTBE a la mezcla, formar un precipitado q ue comprende el polimorfo, y filtrar el precipitado de modo que se recristalice el polimorfo.

Composiciones Farmaceuticas En otro aspecto, se proporciona u na composición farmacéutica q ue comprende el bromhídrato del Compuesto I , y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable. También se proporciona una composición farmacéutica que comprende el Polimorfo A, y un transportador o d iluyente farmacéuticamente aceptable.

El término “composición farmacéutica” incluye preparaciones adecuadas para administración a mamíferos, por ejemplo, humanos. Cuando los compuestos de la presente invención se admin istran como farmacéuticos a mamíferos, por ejemplo, h umanos , se pueden proporcionar per se o como una composición farmacéutica que contiene por ejemplo, 0.1 % a 99.9% (más preferentemente, 0.5 a 90%) de u n ing rediente activo en combinación con un transportador farmacéuticamente aceptable.

Los compuestos aqu í descritos (es decir, el bromhídrato del Compuesto I y Polimorfo A) se pueden combinar con un transportador farmacéuticamente aceptable de acuerdo con téenicas de elaboración de compuestos farmacéuticos convencionales. Tal como se utiliza en la presente invención , un “transportador farmacéuticamente aceptable” puede incluir cualquiera y todos los solventes, diluyentes u otros veh ículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión , agentes de superficie activa, agentes isotónicos, agentes engrosadores o emu lsificantes, conservadores , enlazadores sólidos, lubricantes, y similares, seg ún sea adecuado para la forma de dosificación deseada en particu lar. La Publicación de Remington's Pharmaceutical Sciences, (Ciencias Farmaceuticas de Remington), 16a Edición , E . W. Martin (Mack Publishing Co. , Easton , Pa . , 1 980) describe varios transportadores utilizados para formular composiciones farmacéuticas y téenicas conocidas para la preparación de las mismas . Excepto que cualquier medio transportador convencional sea incompatible con los compuestos, tal como por la producción de cualquier efecto biológico indeseable o que de otra forma interactúe de manera perjud icial con cualquier otro componente(s) de la composición farmacéutica, su uso está contemplado para estar dentro del alcance de la presente invención . Algunos ejemplos de materiales q ue pueden servir como transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen , pero no se limitan a, azúcares tales como lactosa, glucosa y sucrosa ; almidones tales como almidón de ma íz y almidón de papa; celulosa y sus derivados tal como carboximetil celu losa de sodio, etil celulosa y acetato de celulosa ; tragacanto pulverizado; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras de supositorio, aceites tales como aceite de coco, aceite de semilla de algodón ; aceite de cártamo, aceite de ajonjol í; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de frijol de soya ; glicoles tal como propilenglicol; ásteres tal como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes de amortiguación tal como hidróxido de mag nesio e hidróxido de aluminio; ácido algín ico; ag ua libre de pirógeno; solución salina isotónica ; solución de Ringer; alcohol etílico, y soluciones amortiguadoras de fosfato , así como otros lubricantes compatibles no tóxicos tal como sulfato laurilo de sodio y estearato de magnesio, así como agentes de coloración, agentes de liberación , agentes de recubrimiento, ed u lcorantes, saborizantes y agentes de perfumado, conservadores y antioxidantes que pueden estar presentes en la composición , de acuerdo con el juicio del formulador.

Además , el transportador puede tomar u na amplia variedad de formas depend iendo de la forma de preparación deseada para administración , por ejemplo, oral, nasal , rectal, vaginal, parenteral (incluyendo inyecciones intravenosas o infusiones). En la preparación de composiciones para la forma de dosificación oral , se puede emplear cualquier medio farmaceutico usual . El medio farmacéutico usual incluye por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes de saborización , conservadores, agentes de coloración y similares en el caso de preparaciones líquidas orales (tal como por ejemplo, suspensiones, soluciones, emulsiones y elíxires); aerosoles; o transportadores tales como almidones , azúcares, celulosa microcristalina , d iluyentes, agentes de gran u lación, lubricantes , en lazadores, agentes de desinteg ración y similares, en el caso de preparaciones sólidas orales (tal como por ejemplo, polvos , cápsulas y tabletas) .

Los agentes de h umectación , em ulsificadores y lubricantes, tal como sulfato laurilo de sodio y estearato de mag nesio, así como agentes de coloración , agentes de liberación , agentes de recubrimiento, edulcorantes, agentes saborizantes y de perfumado, conservadores y antioxidantes tambien pueden estar presentes en las composiciones.

Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen : antioxidantes solubles en agua , tal como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes solubles en aceite, tal como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina , galato de propilo, tocoferoles, y similares; y agentes de quelación de metal , tal como ácido cítrico, ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Las composiciones farmacéuticas q ue comprenden los compuestos se pueden formular para tener cualquier concentración deseada. En algu nas modalidades, la composición se formula de modo que comprenda al menos una cantidad terapéuticamente efectiva. En algunas modalidades, la composición se formula de modo que comprenda una cantidad que puede no orig inar uno o más efectos secundarios no deseados.

Debido a que d urante su preparación , se mantiene más fácilmente la forma cristalina del bromh id rato del Compuesto I , las formas de dosificación sólida son u na forma preferida para la composición farmaceutica de la presente invención . Son particularmente preferidas las formas de dosificación para administración oral, tal como cápsulas, tabletas, píldoras, polvos y gránulos. Si se desea, las tabletas se pueden recubrir mediante téenicas conocidas para los expertos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas incluyen las que son adecuadas para administración oral, sublingual , nasal, rectal, vaginal, tópica , bucal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular e intravenosa) , aunque la ruta más adecuada dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que esté siendo tratada . Las composiciones pueden ser presentadas convenientemente en forma de dosificación unitaria , y prepararse a través de cualquiera de los métodos conocidos en las artes farmacéuticas. En ciertas modalidades , la composición farmacéutica se formula para admin istración oral en la forma de una píldora, cápsula, grajea o tableta. En otras modalidades, la composición farmacéutica está en la forma de una suspensión .

Los compuestos aqu í proporcionados son adecuados como un agente activo en composiciones farmacéuticas q ue son particularmente eficaces para tratar trastornos asociados con EZH2 , especialmente cáncer. La composición farmaceutica en varias modalidades, tiene u na cantidad farmacéuticamente efectiva del bromh idrato del Compuesto I o Polimorfo A, junto con otros excipientes, transportadores, rellenadores, diluyentes farmacéuticamente aceptables, y similares.

Una “cantidad" terapéutica o farmacéuticamente “efectiva” es una cantidad de un compuesto (el bromhidrato del Compuesto I o Polimorfo A) , que cuando se administra a un paciente dismin uye un síntoma de una enfermedad o condición, por ejemplo, previene varios síntomas morfológicos y somáticos de cáncer. En u n ejemplo, una cantidad efectiva del bromhidrato del Compuesto I o Polimorfo A es la cantidad suficiente para tratar cáncer en un sujeto. La cantidad puede variar dependiendo de factores tales como el tamaño y peso del sujeto, el tipo de enfermedad o compuesto particular de la invención . La cantidad de bromhidrato del Compuesto I o Polimorfo A que constituye una “cantidad efectiva” variará dependiendo del compuesto, el estado de enfermedad y su severidad , la edad del paciente que será tratada y similares. La cantidad efectiva puede ser determinada en forma rutinaria a través de un experto en la téenica que tenga conocimiento y el de la presente descripción .

El régimen de administración puede afectar lo que constituye u na cantidad farmacéuticamente efectiva. El brom hidrato del Compuesto I o Polimorfo A, y las composiciones que comprenden cualquiera de estos compuestos, se pueden administrar al sujeto ya sea antes o despues de la generación de u na enfermedad . Además, se pueden administrar varias dosificaciones divididas, así como dosificaciones escalonadas diariamente o en secuencias, o la dosis puede ser infusionada en forma continua, o puede ser una inyección de bolo. Además, las dosificaciones pueden ser proporcionalmente incrementadas o dismin uidas tal como se indica a través de las exigencias de la situación terapéutica o profiláctica.

Métodos de Tratamiento Los compuestos de la presente invención (es decir, el bromhidrato del Compuesto I , así como el Polimorfo A) inhiben la actividad de histona metiltransferasa de EZH2 o un muíante del mismo, y por consiguiente, en un aspecto de la presente, ciertos compuestos aquí descritos son candidatos para tratar o prevenir ciertas condiciones y enfermedades . La presente invención proporciona métodos para tratar condiciones y enfermedades cuyo enrso puede ser i nfluenciado por la modulación del estado de metilación de las histonas u otras proteínas, en donde el estado de metilación es transmitido al menos en parte por la actividad de EZH2. La modulación del estado de metilación de las histonas a su vez puede influenciar el nivel de expresión de genes objetivo activados mediante metilación y/o genes objetivo suprimidos mediante metilación.

El método incluye administrar a u n sujeto q ue necesita de tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención .

El trastorno en el cual la metilación de proteína transmitida por EZH2 desempeña un papel importante puede ser cáncer o una condición precancerígena . La presente invención proporciona además el uso del compuesto de la presente invención (es decir, el bromhid rato del Compuesto I , así como el Polimorfo A) en el tratamiento de cáncer o precáncer cuyo curso puede ser influenciado por la modulación de la metilación de la proteína transmitida por EZH2 , o por la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de cáncer o precáncer. Los cánceres de ejemplo que pueden ser tratados incluyen linfomas, incluyendo linfoma de no Hodgkin , linfoma folicular (FL) y linfoma de célula B grande difusa (DLBCL) ; melanoma; y leucemia incluyendo C ML. La condición precancerígena de ejemplo incluye síndrome mielodisplásico (MDS; conocido anteriormente como preleucemia) .

Aún en otra modalidad , se proporciona u n método para tratar un linfoma, en donde el método comprende administrar al sujeto que necesita del mismo una cantidad efectiva del bromhidrato del Compuesto I .

Aún en otra modalidad , se proporciona un método para tratar u n linfoma, en donde el método comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo una cantidad efectiva del Polimorfo A. la presente invención proporciona metodos para proteger contra un trastorno en el cual la metilación de proteína transmitida por EZH2 desempeña u n papel importante en un sujeto que necesita del mismo, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la presente invención (es decir, el bromh idrato del Compuesto I , así como el Polimorfo A) a u n sujeto que necesita de dicho tratamiento. El trastorno puede ser cáncer, por ejemplo, cáncer en donde desempeña un papel importante la metilación de proteína transmitida por EZH2. La presente invención también proporciona el uso del compuesto de la presente invención (es decir, el bromh idrato del Compuesto I , así como el Polimorfo A) para la preparación de un medicamento útil para la prevención de un trastorno de proliferación celular asociado, al menos en parte, con una metilación de proteína transmitida por EZH2.

Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar para modu lar la metilación de proteína (por ejemplo, histona), por ejemplo para modular la actividad enzimática de histona metiltransferasa o histona. Al menos algunos de los compuestos de la presente invención pueden ser utilizados in vivo o in vitro para modular la metilación de proteína. La metilación de histona ha sido reportada como implicada en expresión aberrante de ciertos genes en cánceres, y en silenciar los genes neu ronales en células no neuronales. Al menos algunos compuestos aqu í descritos son candidatos adecuados para tratar estas enfermedades , es decir, para d isminuir la metilación y restau rar la metilación rig urosamente a su nivel en celulas normales de contraparte.

Los compuestos q ue son moduladores de metilación pueden ser utilizados para modular la proliferación celular. Por ejemplo, en algunos casos, la proliferación excesiva puede ser reducida con agentes que dismin uyen la metilación , mientras que la proliferación insuficiente puede ser estimu lada con agentes q ue incrementan la metilación . Por consiguiente, las dimensiones que pueden ser tratadas a través de los compuestos de la presente invención pueden incluir enfermedades hiperproliferativas tal como crecimiento de célula benig na y crecimiento de célula maligna .

Tal como se utiliza en la presente invención , un “sujeto que necesita del mismo” es un sujeto que tiene un trastorno en donde la EZH2 desempeña un papel importante, o u n sujeto que tiene un riesgo incrementado de desarrollar dicho trastorno , en forma relativa a la población en general . U n sujeto q ue necesita del mismo puede tener una cond ición precancerígena. Preferentemente un sujeto que necesita del mismo tiene cáncer. U n “sujeto” incluye un mamífero. El mamífero puede ser por ejemplo un mamífero h umano o no h umano adecuado, tal como primate, ratón, rata, perro , gato, vaca, caballo, cabra, camello, oveja o un cerdo. El sujeto también puede ser un ave o ave de corral. En una modalidad, el mamífero es un humano.

Tal como se utiliza en la presente invención , el termino “trastorno de proliferación celular” se refiere a condiciones en donde el crecimiento desregulado o anormal , o ambos, de las células puede conducir al desarrollo de una condición o enfermedad no deseada, que puede o no ser cancerígena . Los trastornos de proliferación celular de ejemplo que pueden ser tratados con los compuestos de la presente invención comprenden una variedad de condiciones en donde la división celular está desregulada. El trastorno de proliferación celular de ejemplo incluye, pero no se limita a , neoplasmas, tumores benig nos, tumores malignos, cond iciones precancerígenas, tumores in situ, tumores encapsulados, tumores metastáticos, tumores líquidos, tumores sólidos , tumores inmunológicos, tumores hematológicos, cánceres, carcinomas, leucemias, linfomas, sarcomas, y células de rápida división . El término “célula de rápida división” tal como se utiliza en la presente invención , se define como cualquier célula que se divide en un rango que excede o es mayor a lo q ue se espera u observa entre células circundantes o yuxtapuestas dentro del mismo tejido. U n trastorno de proliferación celular incluye un precáncer o una condición precancerígena . U n trastorno de proliferación celular incluye un cáncer. En otro aspecto , los métodos aqu í proporcionados se utilizan para tratar o aliviar un síntoma de cáncer o para identificar candidatos adecuados para dichos propósitos. El termino “cáncer” i ncluye tumores sólidos así como tumores hematológicos y/o malignidades. Una “célula de precáncer” o “célu la precancerígena” es una célula que man ifiesta un trastorno de proliferación celular que es un precáncer o una condición precancerígena. U na “célula de cáncer” o “célula cancerígena” es una célula que manifiesta un trastorno de proliferación celular que es cáncer. C ualquier medio de medición reproducible puede ser utilizado para identificar las célu las de cáncer o células precancerígenas . Las células de cáncer o células precancerígenas pueden ser identificadas mediante tipificación histológica o graduación de una muestra de tejido (por ejemplo, una m uestra de biopsia). Las células de cáncer y células precancerígenas pueden ser identificadas a través del uso de marcadores moleculares adecuados.

Las condiciones o trastornos no cancerígenos de ejemplo q ue pueden ser tratados utilizando u no o más de los compuestos de la presente invención incluyen pero no se limitan a, artritis reumatoide; inflamación ; enfermedad autommune; condiciones linfoproliferativas; acromegalia; espondilitis reumatoide; osteoartritis; gota, otras condiciones artríticas; sepsis; choque séptico; choque endotóxico; sepsis gram negativa; síndrome de choque tóxico; asma; síndrome de dificultad respiratoria en ad ultos; enfermedad pulmonar obstructiva crónica; inflamación pulmonar crónica; enfermedad de inflamación intestinal ; enfermedad de CrQhn; psoriasis; eczema ; colitis ulcerativa; fibrosis pancreática ; fibrosis hepática ; fibrosis hepática; enfermedad renal aguda y crónica; síndrome de irritación intestinal; piresis; restenosis; malaria cerebral; ataque y lesión isquemica, trauma neural ; enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Huntington ; enfermedad de Parkinson ; dolor agudo y crónico, rin itis alérgica ; conj untivitis alérgica ; falla card íaca crónica; sínd rome coronario agudo; caquexia; malaria; lepra; leishmaniasis; enfermedad de Lyme; síndrome de Reiter; sinovitis ag uda; degeneración muscular, bursitis; tendonitis; tenosinovitis ; síndrome de disco intervertebral herniado, roto o prolapsado; osteoporosis; trombosis; restenosis; silicosis; sarcosis pulmonar; enfermedad de reabsorción de h uesos; tal como osteoporosis; reacción de injerto versus huésped; Esclerosis Múltiple; lupus ; fibromialgia; S I DA y otras enfermedades virales tal como Herpes Zoster, Herpes Simple I o I I , virus de influenza y citomegalovirus; y diabetes melitus.

Los cánceres de ejemplo que pueden ser tratados utilizando u no o más de los compuestos de la presente invención incluyen pero no se limitan a, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con SI DA, linfoma relacionado con SI DA, cáncer anal , cáncer anorectal, cáncer del canal anal , cáncer de apénd ice, astricitoma cerebelar infantil, astrocitoma cerebelar infantil , carcinoma de célula basal, cáncer de piel (sin melanoma) , cáncer biliar, cáncer de d ucto biliar extrahepático , cáncer de ducto biliar intrahepático; cáncer de ducto biliar hepático; cáncer de vejiga ; cáncer de vejiga u rinaria, cáncer de huesos y articulación , osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno, cáncer de cerebro, tumor de cerebro, glioma de tronco cerebral, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodeimales primitivos o suprasensoriales, glioma de trayectoria visual e hipotalámico, cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, tumor carcinoide, cáncer gastromtestinal , cáncer del sistema nervioso, linfoma del sistema nervioso, cáncer del sistema nervioso central , linfoma del sistema nervioso central , cáncer cervical , cánceres infantiles, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielogenosa crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon , cáncer colorectal, linfoma de celula T cutánea , neoplasma linfoide, fungoides micosis, Sínd rome de Seziary, cáncer endometrial , cáncer de esófago, tumor de célula de germen extracraneal , tumor de célula de germen extragonadal , cáncer de d ucto biliar extrahepático, cáncer de ojos, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal (G IST) , tumor de célula de germen , tumor de célula de germen de ovario, glioma de tumor trofoblástico gestacional, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (h ígado), linfoma de Hodgkin , cáncer h ipofaríngeo, melanoma ¡ntraocular, cáncer ocular, tumores de celula de isleto (páncreas endocrino), Sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer renal , cáncer de riñón , cáncer de laringe, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielogenosa crónica, leucemia de célula peluda, cáncer de labios y cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón , cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de pulmón de célula pequeña, linfoma relacionado con SI DA, linfoma de no Hodgkin, linfoma de sistema nervioso central primario, macroglobu linemia de Waldenstram , meduloblastoma , melanoma, melanoma intraocular (ojo), carcinoma de célula de merkel , mesotelioma maligno, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastático, cáncer de boca, cáncer de la lengua, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, fungoides micosis, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielogena crónica, leucemia mieloide ag uda, mieloma múltiple, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma , cáncer oral, cáncer de cavidad oral, cáncer orofaríngeo, cáncer de ovario , cáncer epitelial de ovario, tumor de ovario de bajo potencial de malig nidad , cáncer pancreático, cáncer pancreático de célula de isleto, cáncer de seno paranasal y cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene , cáncer de faringe, feocromocitoma, tumores de pineoblastoma y neuroectodermicos primitivos suprasensoriales, tumor de pituitaria, neoplasma/mieloma m últiple de célula de plasma , blastoma pleu ropulmonar, cáncer de próstata , cáncer rectal, cáncer de pelvis y uretra renal, cáncer de célula de transición , retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de g lándula salival, tumores de ewing de familia de sarcomas, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejido blando, cáncer uterino, sarcoma uterino, cáncer de piel (sin melanoma) , cáncer de piel (melanoma), carcinoma de piel de célula de merkel, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejido blando, carcinoma de célula escamosa, cáncer de estómago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos suprasensoriales, cáncer testículo, cáncer de garganta , timoma, carcinoma de timoma y tímico, cáncer de tiroides, cáncer de célula de transición de la pelvis y u retra renal y otros órganos urinarios, tumor trofoblástico gestacional, cáncer uretral, cáncer uterino endometrial, sarcoma uterino, cáncer de cuerpo uterino , cáncer vaginal , cáncer vulvar, y Tumor de Wilm .

U n “trastorno de proliferación celular del sistema hematológico” es un trastorno de proliferación celular que implica células del sistema hematológico. U n trastorno de proliferación celular del sistema hematológico puede incluir linfoma, leucemia , neoplasmas mieloides, neoplasmas de mastocito, mielodisplasia, gamopatía monoclonal benigna, g ranulomatosis linfomatoide, papulosis linfomatoide, policitemia vera, leucemia mielocítica crónica, metaplasia mieloide ag nogenica, y trombocitemia esencial . Un trastorno de proliferación celu lar del sistema hematológico puede incluir hiperplasia , displasia , y metaplasia de células del sistema hematológico. Preferentemente, las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para tratar un cáncer seleccionado del grupo que consiste en un cáncer hematológico de la presente invención o un trastorno de proliferación celular hematológico de la presente invención . Un cáncer hematológico de la presente invención puede inclu ir mieloma múltiple, linfoma (incluyendo linfoma de Hodgkin , linfoma de no Hodgkin , linfomas infantiles, y linfomas de origen linfocítico y cutáneo), leucemia (incluyendo leucemia infantil, leucemia de célula peluda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica ag uda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia mielogenosa crónica, y leucemia de mastocito), neoplasmas mieloides y neoplasmas de mastocito.

U n “trastorno de proliferación celular del pulmón” es un trastorno de proliferación celular que implica células del pulmón . Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden inclu ir todas las formas de trastornos de proliferación celular que afectan las célu las de pulmón . Los trastornos proliferación celular del pulmón pueden incluir cáncer de pulmón , u na condición de precáncer o precancerígenas del pulmón , crecimientos o lesiones benignos del pulmón, y crecimientos o lesiones malignos del pulmón , y lesiones metastáticas en tejidos y órganos en el anticuerpo además del pulmón . Preferentemente, las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para tratar cáncer de pulmón o trastornos de proliferación celular del pulmón . El cáncer de pulmón puede inclu ir todas las formas de cáncer del pulmón. El cáncer de pulmón puede incluir neoplasmas de pulmón malignos, carcinoma ¡n situ, tumores carcinoides típicos, y tumores carcinoides atípicos. El cáncer de pulmón puede incluir cáncer de pulmón de celula pequeña (“SCLC”) , cáncer de pulmón de célula no pequeña (“NSCLC”) , carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma, carcinoma de célula pequeña, carcinoma de célula grande, carcinoma de célula adenoescamosa , y mesotelioma . El cáncer de pulmón puede incluir “carcinoma de cicatriz”, carcinoma bronqueoalveolar, carcinoma de célu la g igante, carcinoma de célula de rueda, y carcinoma neu roendocrino de célula grande. El cáncer de pulmón puede incluir neoplasmas de pulmón que tienen heterogenidad histológica y ultraestructural (por ejemplo, tipos de células mezclados) .

Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir todas las formas de trastornos de proliferación celular que afectan las células de pulmón . Los trastornos de proliferación celu lar de pulmón pueden incluir cáncer de pulmón , condiciones precancerígenas del pu lmón . Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir h iperplasia , metaplasia, y displasia del pulmón . Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir hiperplasia inducida por asbestos, metaplasia escamosa , y metaplasia mesotelial reactiva benig na . Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir reemplazo del epitelio columnar con el epitelio escamoso estratificado y displasia mucosa. Los individuos expuestos a agentes ambientales perjudiciales inhalados tal como un h umo de cigarro y asbestos pueden estar en alto riesgo de desarrollar trastornos de proliferación celular del pulmón . Las enfermedades de pulmón anteriores que pueden predisponer a los individuos al desarrollo de trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir enfermedad pulmonar intersticial crónica, enfermedad pulmonar necrotizante, escleroderma, enfermedad reumatoide, sarcoidosis, neumonitis intersticial , tuberculosis, neumon ías repetidas, fibrosis pulmonar idiopática, granulomata, asbestosis, alveolitis fibrosante, y enfermedad de Hodgkin .

Un “trastorno de proliferación celular del colon” es u n trastorno de proliferación celular q ue implica celulas del colon . Preferentemente , el trastorno de proliferación celular del colon es cáncer de colon. Preferentemente, las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para tratar cáncer de colon o trastornos de proliferación celular del colon . El cáncer de colon pueden incluir todas las formas de cáncer del colon. El cáncer de colon pueden incluir cáncer de colon esporádico y hereditario. El cáncer de colon puede incluir neoplasmas de colon malignos, tumores carcinoide típicos y tumores carcinoides atípicos. El cáncer de colon puede incluir adenocarcinoma , carcinoma de celula escamosa, y carcinoma de célula adenoescamosa. El cáncer de colon pueden estar asociado con un síndrome hereditario seleccionado del grupo q ue consiste en cáncer colorectal sin poliposis hereditario, poliposis adenomatosa familiar, sínd rome de Gard ner, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Turcot y poliposis juvenil. El cáncer de colon puede ser orig inado por un síndrome hereditario seleccionado del grupo q ue consiste en cáncer colorectal sin poliposis hereditario, poliposis adenomatoso familiar, síndrome de Gardner, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Tu rcot y poliposis juvenil .

Los trastornos de proliferación celular del colon pueden incluir todas las formas de trastornos de proliferación celular que afectan las células de colon. Los trastornos de proliferación celular del colon pueden inclu ir cáncer de colon , condiciones precancerígenas del colon , pólipos adenomatosos del colon y lesiones metacronosas del colon . Un trastorno de proliferación celular del colon puede incluir adenoma. Los trastornos de proliferación celular del colon pueden estar caracterizados por h iperplasia , metaplasia , y displasia del colon . Las enfermedades de colon previas q ue pueden predisponer los individuos al desarrollo de trastornos de proliferación celular del colon pueden incluir cáncer de colon previo. La enfermedad actual que puede predisponer a los individuos al desarrollo de trastornos de proliferación celular del colon puede incluir enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa . U n trastorno de proliferación celular del colon puede estar asociado con una mutación en un gen seleccionado del grupo que consiste en p53, ras, FAP y DCC . Un individ uo puede tener u n riesgo elevado de desarrollar u n trastorno de proliferación celular del colon debido a la presencia de una mutación en un gen seleccionado del g rupo que consiste en p53, ras, FAP y DCC.

U n “trastorno de proliferación celular del páncreas” es un trastorno de proliferación celular que implica celulas del páncreas. Los trastornos de proliferación celular del páncreas pueden incluir todas las formas de trastornos de proliferación celular que afectan las células pancreáticas. Los trastornos de proliferación celular del páncreas puede incluir cáncer de páncreas, u na condición de precáncer o precancerígenas del páncreas, hiperplasia del páncreas, y displasia del páncreas, crecimientos y lesiones benignas del páncreas, y crecimientos y lesiones malig nas del páncreas, y lesiones metastáticas en tejido y órganos en el cuerpo además del páncreas. El cáncer pancreático incluye todas las formas de cáncer del páncreas. El cáncer pancreático puede incluir adenocarcinoma ductal, carcinoma adenoescamoso, carcinoma de celula gigante pleomórfica, adenocarcinoma mucinoso, carcinoma de célula gigante tipo osteoclasto , q uistadenocarcinoma mucinoso, carcinoma acinar, carcinoma de célula grande no clasificada, carcinoma de célula pequeña , pancreatoblastoma , neoplasma papilar, quistadenoma mucinoso, neoplasma qu ístico papilar, y quistadenoma ceroso . El cáncer pancreático también puede incluir neoplasmas pancreáticos q ue tienen heterogeneidad histológica y ultraestructu ral (por ejemplo , tipos de células mezcladas) .

U n “trastorno de proliferación celular de la próstata” es un trastorno de proliferación celular q ue implica células de la próstata. Los trastornos de proliferación celular de la próstata pueden incluir todas las formas de trastornos de proliferación celular que afectan las células de la próstata. Los trastornos de proliferación celular de la próstata pueden incluir cáncer de próstata, una condición precáncer o precancerígenas de la próstata, crecimientos o lesiones benignos de la próstata, y crecimientos o lesiones malig nos de la próstata, y lesiones metastáticas en tejidos y órganos en el cuerpo además de la próstata . Los trastornos de proliferación celular de la próstata pueden incluir hiperplasia, metaplasia, y displasia de la próstata .

U n “trastorno de proliferación celu lar de la piel” es un trastorno de proliferación celular que implica células de la piel.

Los trastornos de proliferación celular de la piel pueden incluir todas las formas de trastornos de proliferación celular que afectan las celulas de la piel. Los trastornos de proliferación celular de la piel puede incluir u na cond ición de precáncer o precancerígenas de la piel , crecimientos o lesiones malig nas de la piel , melanoma, melanoma maligno y otros crecimientos o lesiones malignos de la piel, y lesiones metastáticas en tejidos y órganos en el cuerpo además de la piel. Los trastornos de proliferación celular de la piel pueden incluir hiperplasia, metaplasia, y displasia de la piel .

Un “trastorno de proliferación celu lar del ovario” es un trastorno de proliferación celular q ue implica células del ovario. Los trastornos de proliferación celular del ovario pueden incluir todas las formas de trastornos de proliferación celular que afectan las células del ovario. Los trastornos de proliferación celular del ovario puede incluir una condición de precáncer o precancerígenas del ovario, crecimientos o lesiones benignas del ovario, cáncer de ovario, crecimientos o lesiones malignas del ovario, y lesiones metastáticas en tejido y órganos en el cuerpo además del ovario. Los trastornos de proliferación celular del ovario pueden incluir hiperplasia , metaplasia, y d isplasia de las células del ovario.

U n “trastorno de proliferación celu lar del seno” es un trastorno de proliferación celular que implica células del seno. Los trastornos de proliferación celu lar del seno pueden incluir todas las formas de trastornos de proliferación celular que afectan las celulas del seno. Los trastornos de proliferación celular del seno puede incluir cáncer de seno, una condición de precáncer o precancerígenas del seno, crecimientos o lesiones benig nas del seno, y crecimientos o lesiones malignas del seno, y lesiones metastáticas en tejido y órganos en el cuerpo además del seno. Los trastornos de proliferación celular del seno pueden incluir hiperplasia, metaplasia, y displasia del seno.

U n trastorno de proliferación celular del seno puede ser u na condición precancerígena del seno. Las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para tratar una condición precancerígena del seno. U na condición precancerígena del seno puede incluir hiperplasia atípica del seno, carcinoma ductal in situ (DC IS) , carcinoma intraductal, carcinoma lobular in situ (LC IS) , neoplasia lobular, y crecimiento o lesión del seno de etapa 0 o g rado 0 (por ejemplo, cáncer de seno etapa 0 o g rado 0, o carcinoma in situ) . U na condición precancerígena del seno puede g raduarse de acuerdo con el esquema de clasificación TNM tal como lo acepta el American Jomt Committee on Cáncer (Comité de Cáncer de la Unión Americana) (AJCC) , en donde al tumor primario (T) se le ha asig nado la etapa de T0 o Tis; y en donde los nudos linfáticos regionales (N) se les han asig nado la etapa de NO; y en donde a la metástasis distante (M) se le ha asignado u na etapa de M0.

El trastorno de proliferación celular del seno puede ser cáncer de seno. En un aspecto , las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para identificar candidatos adecuados para dichos proopósitos. El cáncer de seno incluye todas las formas de cáncer del seno. El cáncer de seno puede incluir cáncer del seno epiteliales primarios. El cáncer de seno puede incluir cánceres en los cuales el seno está implicado por otros tumores tales como linfoma, sarcoma o melanoma. El cáncer de seno puede incluir carcinoma del seno, carcinoma ductal del seno, carcinoma lobular del seno, carcinoma no diferenciado del seno, quistosarcoma piloide del seno, angiosarcoma del seno, y linfoma primario del seno. El cáncer de seno puede incluir cáncer de seno Etapas I , I I , M IA, 111 B , M IC y IV. El carcinoma d uctal del seno puede incluir carcinoma invasivo, carcinoma invasivo in situ con componente intrad uctal predominante, cáncer de seno inflamatorio, y carcinoma ductal del seno con un tipo histológico seleccionado del grupo q ue consiste en comedo, mucino (coloide) , medular, medular con infiltrado linfocitico, papilar, cirroso, y tubular. El carcinoma lobular del seno puede incluir carcinoma lobular invasivo con un com ponente p red ominante in situ, carcinoma lobular invasivo, y carcinoma lobular de infiltración . El cáncer de seno puede incluir enfermedad de Paget, enfermedad de Paget con carcinoma intraductal, y enfermedad de Paget con carcinoma d uctal invasivo. El cáncer de seno puede incluir neoplasmas de seno que tienen heterogenidad histológica y ultraestructu ral (por ejemplo, tipos de celulas mezcladas) .

Los compuestos de la presente invención s epueden utilizar para tratar cáncer del seno, o se pueden utilizar para identificar candidatos adecuados para d ichos propósitos. U n cáncer de seno que será tratado puede incluir cáncer de seno esporádico. Un cáncer de seno q ue será tratado puede surgir en u n hombre. Un cáncer del seno q ue será tratado puede surgir de un sujeto mujer. Un cáncer del seno q ue será tratado puede surgir en una mujer premonopáusica o en una mujer postmenopáusica. U n cáncer del seno que será tratado puede surgir en un sujeto con edad igual o mayor a 30 arios de edad, o u n sujeto más joven de 30 años de edad . Un cáncer del seno q ue será tratado ha surgido en u n sujeto a la edad de o mayor a 50 años de edad , o un sujeto más joven de 50 años de edad. Un cáncer del seno que será tratado puede su rgir en un sujeto con edad igual o mayor a 70 años de edad , o un sujeto con edad menor a 70 años de edad .

U n cáncer del seno que será tratado puede ser tipificado para identificar una mutación familiar o espontánea en BRCA1 , BRCA2 , o p53. Un cáncer del seno que será tratado puede ser tipificado como teniendo amplificación del gen H ER2/neu, como sobreexpresando HER2/neu, o como teniendo un bajo, medio o alto nivel de expresión H ER2/neu . U n cáncer del seno que será tratado puede ser tipificado por un marcador seleccionado del grupo que consiste en receptor de estrógeno (ER), receptor de progesterona (PR), receptor del factor-2 de crecimiento epidermico humano, Ki-67, CA15-3, CA 27-29, y c-Met. U n cáncer del seno que será tratado puede ser tipificado como ER-desconocido, alto contenido de ER o bajo contenido de ER. Un cáncer de seno que será tratado puede ser tipificado como ER-negativo o ER-positivo. La tipificación ER del cáncer de seno puede llevarse a cabo a través de cualquier medio reproducible. La tipificación ER de u n cáncer de seno puede llevarse a cabo tal como se establece en la Publicación de Onkologie 27: 1 75-1 79 (2004). Un cáncer del seno que será tratado puede ser tipificado como PR desconocido, alto contenido de PR, o bajo contenido de PR. U n cáncer de seno que será tratado puede ser tipificado como PR-negativo o PR-positivo. U n cáncer de seno q ue será tratado puede ser tipificado como positivo de receptor o negativo de receptor. Un cáncer de seno q ue será tratado puede ser tipificado como estando asociado con niveles en sang re elevados de CA15-3, o CA 27-29, o ambos.

U n cáncer de seno q ue será tratado puede incluir u n tumor localizado del seno. Un cáncer de seno q ue será tratado puede incluir un tumor del seno que está asociado con una biopsia negativa de nodo linfático centinela (SLN) . Un cáncer de seno que será tratado puede incluir un tumor del seno que está asociado con una biopsia positiva de nodo linfático centinela (SLN) . U n cáncer de seno que será tratado puede incluir un tumor del seno que está asociado con uno o más nodos linfáticos positivos de la axila, en donde los nodos linfáticos de la axila han sido escalonados en cualquier metodo aplicable. Un cáncer del seno que será tratado puede incluir un tumor del seno que ha sido tipificado como teniendo un estado negativo nodal (por ejemplo, nodo-negativo) o estado positivo nodal (por ejemplo, nodo-positivo). U n cáncer de seno que será tratado puede incluir u n tumor del seno que ha hecho metástasis a otros lugares en el cuerpo. Un cáncer del seno que será tratado puede ser clasificado como teniendo metástasis en un lugar seleccionado del grupo que consiste en h uesos, pulmón, h ígado, o cerebro. Un cáncer del seno q ue será tratado pueden ser clasificado de acuerdo con la característica seleccionada del grupo q ue consiste en metastático , localizado, regional, local-regional, avanzado localmente, distante, multicéntrico, bilateral, ¡psilateral, contralateral de nuevo diagnóstico, recu rrente e inoperable.

U n compuesto de la presente invención , se puede utilizar para tratar o prevenir un trastorno de proliferación celular del seno, o para tratar o prevenir cáncer del seno , en u n sujeto que tiene u n riesgo incrementado de desarrollar cáncer de seno relativo a la población en general . U n sujeto con u n riesgo incrementado de desarrollar cáncer del seno relativo a la población en general es una mujer con una historia familiar o historia personal de cáncer de seno. U n sujeto con un riesgo incrementado de desarrollar cáncer de seno relativo a la población en general es una mujer que tiene una m utación en la línea germinal o espontánea de BRCA1 o BRCA2, o ambas. Un sujeto con riesgo incrementado de desarrollar cáncer de seno relativo a la población en general es una mujer con una historia familiar de cáncer de seno y una mutación de línea germinal o espontánea en BRCA1 o BRCA2, o ambos . Un sujeto con riesgo incrementado de desarrollar cáncer de seno relativo a la población en general es una mujer quien tiene más de 30 años de edad , más de 40 años de edad , más de 50 años de edad, más de 60 años de edad, más de 70 años de edad , más de 80 años de edad , o más de 90 años de edad . U n sujeto con riesgo incrementado de desarrollar cáncer de seno relativo a la población en general es u n sujeto con hiperplasia atípica del seno, carcinoma ductal in situ (DCIS) , carcinoma intraductal, carcinoma lobular in situ (LCIS), neoplasia lobular, o un crecimiento o lesión de etapa 0 del seno (por ejemplo, cáncer de seno etapa 0 o grado 0, o carcinoma in situ).

U n cáncer de seno que será tratado puede ser graduado histológicamente de acuerdo con el sistema Scarff-Bloom-Richardson , en donde el tumor de seno se la ha asignado una calificación de conteo de mitosis de 1 , 2 , o 3; una clasificación de pleiomorfismo nuclear de 1 , 2, o 3; una formación túbulo de calificación 1 , 2 , o 3; y una calificación de Scarff-Bloom- Richardson total de entre 3 y 9. Un cáncer de seno que será tratado pueden ser asignado a un grado de tumor de acuerdo con el I nternational Consensus Panel on the Treatment de Breast Cáncer (Panel de Consenso I nternacional en el Tratamiento de Cáncer de Seno) seleccionado del grupo que consiste en g rado 1 , grado 1 -2, g rado 2, grado 2-3, o grado 3.

En u rna modalidad , se proporciona un metodo para tratar cáncer del seno, en donde el método comprende administrar a u n sujeto que necesita del mismo, una cantidad efectiva del bromhidrato del Compuesto 1 .

En otra modalidad, se proporciona u n método para tratar cáncer del seno, en donde el método comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo , una cantidad efectiva del bromhidrato del Polimorfo A.

U n cáncer q ue será tratado pueden grad uarse de acuerdo con el sistema de clasificación de American Jomt Committee on Cáncer (Comité de Cáncer de la Un ión Americana) (AJCC) TN M, en donde el tumor (T) se le ha asignado una etapa de TX, T1 , T1 mic, T1 a, T1 b, T1 c, T2, T3, T4, T4a, T4b , T4c, o T4d; y en donde los nodos linfáticos regionales (N) se le ha asignado una etapa de NX, NO , N 1 , N2, N2a, N2b, N3, N3a, N3b, o N3c; y en donde a la metástasis distante (M) se le puede asignar una etapa de MX, M0, o M 1 . Un cáncer que será tratado pueden ser graduado de acuerdo con la clasificación del American Joint Committee on Cáncer (Comité de U nión Americana de Cáncer) (AJCC) de la Etapa I, Etapa NA, Etapa IIB, Etapa MIA, Etapa IIIB, Etapa NIC, o Etapa IV. Un cáncer que será tratado se le puede asignar un grado de acuerdo con la clasificación AJCC como el Grado GX (por ejemplo, grado que no puede ser evaluado), Grado 1, Grado 2, Grado 3 o Grado 4. Un cáncer que será tratado puede ser clasificado de acuerdo con una clasificación patológica AJCC (pN) de pNX, pNO, PNO (I-), PNO (l + ), PNO (mol-), PNO (mol + ), PN 1 , PN1(mi), PN1a, PN1b, PN1c, pN2, pN2a, pN2b, pN3, pN3a, pN3b, o pN3c.

Un cáncer que será tratado puede incluir un tumor que ha sido determinado como de menos o igual a aproximadamente 2 centímetros de diámetro. Un cáncer que será tratado puede incluir un tumor que ha sido determinado como de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 5 centímetros de diámetro. Un cáncer que será tratado puede incluir un tumor que ha sido determinado como mayor o igual a aproximadamente 3 centímetros de diámetro. Un cáncer que será tratado puede incluir un tumor que ha sido determinado como mayor a 5 centímetros de diámetro. Un cáncer que será tratado puede ser clasificado mediante apariencia en microscopio como bien diferenciado, moderadamente diferenciado, pobremente diferenciado o no diferenciado. Un cáncer que será tratado puede ser clasificado mediante apariencia en microscopio con respecto al conteo de mitosis (por ejemplo, cantidad de división celular) o pleiomorfismo n uclear (por ejemplo, cambio en celulas) . U n cáncer q ue será tratado puede ser clasificado mediante apariencia en microscopio, como estando asociado con áreas de necrosis (por ejemplo, áreas de células muertas o degenerativas). U n cáncer que será tratado puede ser clasificado como teniendo un cariotipo anormal , que tiene u n número anormal de cromosomas, o que tiene uno o más cromosomas que son anormales en apariencia. Un cáncer q ue será tratado puede ser clasificado como siendo aneuploide, triploide, tetraploide, o como teniendo un ploidi alterado. Un cáncer q ue será tratado puede ser clasificado como ten iendo u na translocación cromosomal, una eliminación o duplicación de todo el cromosoma, o una región de eliminación , duplicación o amplificación de una parte del cromosoma .

Tal como se utiliza en la presente invención, el “compuesto candidato” se refiere a u n compuesto de la presente invención (por ejemplo, el bromhidrato del Compuesto I , así como el Polimorfo A) que ha sido o será probado en uno o más ensayos biológicos in vitro o in vivo, con el objeto de determinar si dicho compuesto es probable que genere una respuesta biológica o médica deseada en u na célula, tejido, sistema, animal o humano que esté siendo observado por un investigador o médico. U n compuesto candidato es un compuesto de la presente invención . La respuesta biológica o médica puede ser el tratamiento de cáncer. La respuesta biológica o médica puede ser el tratamiento o prevención de un trastorno de proliferación celu lar. La respuesta o efecto biológico también puede incluir un cambio en la proliferación o crecimiento celular que ocurre in vitro o en un modelo animal, así como otros cambios biológicos que son observables in vitro. Los ensayos biológ icos in vitro o in vivo pueden incluir, pero no se limitan a, ensayos de actividad enzimática, ensayos de cambio de movilidad electroforética, ensayos de gen reportero, ensayos de viabilidad de célula , y los ensayos aq u í descritos.

Tal como se utiliza en la presente invención , el término “monoterapia” se refiere a la administración de un compuesto activo o terapéutico simple a un sujeto que necesita del mismo. Preferentemente, la monoterapia implicará la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto activo. Por ejemplo, la monoterapia de cáncer con uno de los compuestos de la presente invención (es decir, el bromhidrato del Compuesto I , así como con Polimorfo A) a un sujeto que necesita de tratamiento de cáncer. La monoterapia puede contrastarse con terapia de combinación , en donde se administra una combinación de compuestos activos múltiples, preferentemente con cada componente de la combinación presente en una cantidad terapéuticamente efectiva. En un aspecto, la monoterapia con un compuesto de la presente invención es más activa que la terapia de combinación para ind ucir un efecto biológico deseado.

Tal como se utiliza en la presente invención , los terminos “tratamiento” o “tratar” describen el manejo y cuidado de un paciente para el propósito de combatir una enfermedad , condición o trastorno e incluye la administración de un compuesto de la presente invención , (por ejemplo, el bromhidrato del Compuesto 1 , así como el Polimorfo A) para aliviar los síntomas o complicaciones de una enfermedad, condición o trastorno, o para eliminar la enfermedad , condición o trastorno.

U na composición de la presente invención , (por ejemplo, el bromhidrato del Compuesto 1 , así como el Polimorfo A) también se puede utilizar para prevenir una enfermedad, condición o trastorno. Tal como se utiliza en la presente invención , los términos “prevención” o “prevenir” describen reducir o eliminar la generación de síntomas o complicaciones de la enfermedad, condición o trastorno.

Tal como se utiliza en la presente invención , el término “aliviar” se entiende que describe un proceso a través del cual se disminuye la severidad de un signo o síntoma de un trastorno. De manera importante un signo o síntoma pueden ser aliviado sin ser eliminado. En una modalidad preferida, la administración de las composiciones farmacéuticas de la presente invención conduce a la eliminación de un signo o síntoma, sin embargo, no se requiere la eliminación. Se espera que las dosis efectivas disminuyan la severidad del sig no o síntoma . Por ejemplo, un sig no o síntoma de un trastorno tal como cáncer, que puede ocu rrir en múltiples lugares, se alivia si la severidad del cáncer se disminuye dentro de al menos uno de los múltiples lugares.

Tal como se utiliza en la presente invención , el término “severidad” se entiende q ue describe el potencial del cáncer para transformarse de un estado precancerígeno, o benig no, a un estado malig no . Alternativamente, o en forma adicional, la severidad se entiende que describe una etapa de cáncer, por ejemplo, de acuerdo con el sistema TN M (aceptado por la Internacional Union Against Cáncer (Unión Internacional Contra Cáncer) (UI CC) y American Jomt Committee on Cáncer (el Comité de Cáncer de la Unión Americana) (AJCC)) o mediante otros métodos reconocidos en la téenica . La etapa de cáncer se refiere al grado o severidad del cáncer, con base en factores tales como la ubicación del tumor primario, tamaño de tumor, n úmero de tumores, e implicación de nodos linfáticos (versión de cáncer de nodos linfáticos) . Alternativamente o en forma adicional, la severidad se entiende que se describe el g rado de tumor a través de los métodos reconocidos en la técnica (ver Nacional Cáncer I nstitute, www.cancer.gov). El grado de tumor es un sistema utilizado para clasificar células de cáncer en términos de cómo se ven anormales bajo un microscopio y que tan probable es que el tumor crezca y de disperse rápidamente. Se consideran muchos factores cuando se determina un grado de tumor, incluyendo una estructura y patrón de crecimiento de las celulas. Los factores específicos utilizados para determinar el grado de tumor varían con cada tipo de cáncer. La severidad también describe un grado histológico, también llamado diferenciación , que se refiere a que tanto las células de tumor se asemejan a células normales del mismo tipo (ver, Nacional Cáncer I nstitute, www.cancer.gov). Además, la severidad describe un grado nuclear, el cual se refiere al tamaño y forma del núcleo en las células de tumor y el porcentaje de células de tumor que se están dividiendo (ver, Nacional Cáncer I nstitute, www.cancer.gov).

En otro aspecto de la presente invención, la severidad describe el grado en el cual un tumor ha secretado factores de crecimiento, degradado la matriz extracelular, se ha vuelto vascularizado, ha perdido adhesión a tejidos yuxtapuestos, o ha hecho metástasis. Sin embargo, la severidad describe el número de ubicaciones en las cuales ha hecho metástasis un rumor primario. Finalmente, la severidad incluye la dificultad de tratar tumores de varios tipos y ubicaciones. Por ejemplo, los tumores inoperables, que son aquellos cánceres que tienen mayor acceso a múltiples sistemas del cuerpo (tumores hematológicos o inmunológicos), y los que son los más resistentes a tratamientos tradicionales, se consideran los más severos. En dichas situaciones, prolongar la expectativa de vida del sujeto y/o reducir el dolor, disminuye la proporción en celulas cancerígenas o restringir células a un sistema, y mejorar la etapa al tumor/g rado de tumor/grado histológico/grado nuclear se consideran alivio de un signo o síntoma del cáncer.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término “síntoma” se define como una indicación de enfermedad , padecimiento o lesión, o de que algo no está bien en el cuerpo. Los síntomas son percibidos o detectados por el individuo que experimenta el s íntoma, pero no es fácilmente observado por otros. Otros son definidos como que no corresponden a los profesionales de los cuidados para la salud .

Tal como se utiliza en la presente invención , el término “signo” también se define como una indicación de que algo no está bien en el cuerpo. No obstante los signos se definen como aspectos que pueden ser observados por u n doctor, enfermera u otro profesional del cuidado de la salud .

Cáncer es un g rupo de enfermedades q ue puede originar casi cualquier signo o síntoma. Los signos o síntomas dependerán de en donde está el cáncer, el tamaño del cáncer, y que tanto afecta los órganos o estructuras cercanas . Si se d ispersa un cáncer (metástasis) , entonces los síntomas pueden aparecer en diferentes partes del cuerpo.

Conforme crece el cáncer, comienza a empujar órganos, vasos sang uíneos o nervios cercanos. Esta presión crea algunos signos y síntomas de cáncer. Si el cáncer está en un área crítica , tal como ciertas partes del cerebro, incluso el tumor más pequeño puede originar síntomas tempranos.

No obstante, algunas veces los cánceres inician en lugares en donde no originan síntomas hasta que han crecido muy g randes. Los cánceres de páncreas, por ejemplo, normalmente no crecen lo suficientemente grandes para ser percibidos desde la parte exterior del cuerpo. Algunos cánceres pancreáticos, por ejemplo, no originan síntomas hasta que comienzan a crecer alrededor de los nervios cercanos (originando dolor de espalda) . Otros crecimientos alrededor del ducto biliar, cuando bloq uean el flujo de bilis y conduce a un amarillamiento de la piel, conocida como ictericia . Por el tiempo en q ue un cáncer pancreático orig ina estos sig nos o síntomas, normalmente es q ue ha alcanzado una etapa avanzada .

Un cáncer tambien puede originar síntomas tales como fiebre, fatiga , o pérdida de peso. Esto puede ser debido a que las células de cáncer utilizan mucho del suministro de la energía de cuerpo o liberan sustancias que cambian el metabolismo del cuerpo. O el cáncer puede originar q ue el sistema inmune reaccione en formas q ue producen estos síntomas.

Algu nas veces, las células del cáncer liberan sustancias en el torrente sang u íneo que originan síntomas normalmente no considerados como resultado de cánceres. Por ejemplo, algunos cánceres del páncreas pueden liberar sustancias q ue originan que se desarrollen coágulos de sangre en venas de las piernas. Algunos cánceres de pulmón elaboran sustancias tipo hormonas, que afectan los niveles de calcio en la sangre, afectando nervios y músculos y originando debilidad y mareo.

El cáncer presenta varios sig nos o síntomas generales que ocurren cuando está presente una variedad de subtipos de celulas de cáncer. La mayor parte de las personas con cáncer perderán peso en algún momento en su enfermedad . U na pérd ida de peso no explicada (no intencional) de 1 0 libras (4.5 kgs.) o más, puede ser u n primer signo de cáncer, particularmente cánceres del páncreas, estómago, esófago o pulmón .

La fiebre es muy común con cáncer, aunque se observa con más frecuencia en enfermedad avanzada. Casi todos los pacientes con cáncer tendrán fiebre en algún momento, especialmente si el cáncer o su tratamiento afecta el sistema inmune, y hace difícil q ue el cuerpo combata la infección . Con menos frecuencia, la fiebre puede ser un sig no temprano de cáncer, tal como leucemia o linfoma .

La fatiga puede ser un síntoma importante conforme prog resa el cáncer. Puede ocurrir en forma temprana, como por ejemplo en cánceres tal como con leucemia, o si el cáncer está originando una pérdida sangu ínea , como en el caso de cánceres de colon y estómago.

El dolor puede ser un síntoma temprano con algunos cánceres tal como cánceres óseos o cáncer testicular. No obstante el dolor más frecuente es un síntoma de enfermedad avanzada .

J unto con cánceres de la piel (ver sig uiente sección), alg unos cánceres internos pueden originar signos en la piel que pueden ser observables. Estos cambios incluyen oscu recimiento en la apariencia de la piel (hiperpigmentación) , amarillamiento (ictericia) , o enrojecimiento (eritema); comezón ; o crecimiento de cabello excesivo.

Alternativamente , o en forma adicional , los subtipos de cáncer presentan signos o síntomas específicos. Los cambios en los hábitos del intestino o función de la vejiga pueden indicar cáncer. La constipación a largo plazo, diarrea o cambio en el tamaño de la materia fecal puede ser un signo de cáncer de colon . El dolor al orinar, sangre en la orina o cambio en la función de la vejiga (tal como micciones más frecuentes) o menos frecuentes puede estar relacionada con cáncer de vejiga o próstata.

Los cambios en la condición o apariencia de la piel de u na n ueva condición en la piel puede ind icar cáncer. Los cánceres de piel pueden sangrar o verse como llagas que no sanan . Una llaga de larga d uración en la boca puede ser un cáncer oral, especialmente en pacientes que fuman , mastican tabaco o beben con frecuencia alcohol. Las llagas en el pene o vagina tambien pueden ser signos de infección o de u n cáncer temprano.

El sangrado o descarga inusual puede indicar cáncer. El sang rado inusual puede ocurrir en cáncer ya sea temprano o avanzado. La sangre en el esputo (flema) puede ser un signo de cáncer de pulmón . La sangre en la materia fecal (o materia fecal oscura o neg ra) puede ser un sig no de cáncer de colon o rectal . El cáncer de la cerviz o el endometrio (revestimiento del útero) puede originar sang rado vaginal. El sang rado en la orina puede ser un signo de cáncer de vejiga o riñón. Una descarga sang rienta del pezón puede ser un signo de cáncer de seno.

U n engrosamiento o bulto en el seno o en otras partes del cuerpo puede indicar la presencia de un cáncer. Muchos cánceres pueden sentirse a traves de la piel , en su mayoría en el seno, testículo , nodos linfáticos (glándulas) y tejidos blandos del cuerpo. U n bulto o engrosamiento puede ser un signo temprano o tard ío de cáncer. Cualquier bulto o engrosamiento puede ser indicativo de cáncer, especialmente si la formación es reciente o ha crecido de tamaño.

La indigestión o problemas para tragar puede indicar cáncer. Aunque estos síntomas comúnmente tienen otras causas, la indigestión o problemas para tragar pueden ser un signo de cáncer del esófago, estómago o faringe (garganta) .

Los cambios recientes en una verruga o lunar pueden ser indicativos de cáncer. Cualquier verruga , lunar o peca que cambie de color, tamaño o forma o pierda sus bordes definidos indica el desarrollo potencial de cáncer. Por ejemplo, la lesión de la piel puede ser u n melanoma .

U na tos o ronq uera persistente puede ser indicativa de cáncer. Una tos que no se va puede ser un signo de cáncer de pulmón. Un ronquera puede ser un signo de cáncer de laringe (caja de voz) o tiroides.

Aunque los signos y síntomas descritos anteriormente son los más comunes observados con cáncer, existen muchos otros que son menos comunes y no se describen en el presente documento. Sin embargo, todos los signos y síntomas de cáncer reconocidos en la teenica están contemplados y comprendidos por la presente invención.

El tratamiento de cáncer puede dar como resultado la reducción en volumen de tumor. Preferentemente , después del tratamiento, el volumen del tumor se red uce en un 5% o más en forma relativa a su tamaño previo al tratamiento; más preferentemente, el volumen de tumor se reduce en un 10% o más; más preferentemente, se reduce en un 20% o más; más preferentemente, se reduce en un 30% o más; más preferentemente, se reduce en un 40% o más; incluso más preferentemente, se reduce en un 50% o más; y lo más preferentemente, se reduce en más de 75% o más. El volumen de tumor puede ser medido a través de cualquier medio de medición reproducible .

El tratamiento de cáncer da como resultado una disminución en el n úmero de tumores. Preferentemente, despues del tratamiento, el n úmero de tumor se reduce en un 5% o más en forma relativa a su n úmero previo al tratamiento; más preferentemente, el número de tumor se red uce en un 10% o más; más preferentemente, se reduce en un 20% o más ; más preferentemente, se red uce en un 30% o más; más preferentemente , se reduce en un 40% o más; incluso más preferentemente, se reduce en u n 50% o más; y más preferentemente , se reduce en más del 75% . Los n úmeros de tumores pueden medirse a través de cualquier medio de medición reproducidle. El número de tumores puede medirse med iante el conteo de tumores visibles a simple vista o en una mag nificación específica. Preferentemente, la mag nificación específica es de 2x, 3x, 4x, 5x, 1 0x, o 50x.

El tratamiento de cáncer puede dar como resultado la d isminución en número de lesiones metastáticas en otros tejidos u órganos distantes al sitio del tumor primario.

Preferentemente después del tratamiento el número de lesiones metastáticas se reduce en un 5% o más en forma relativa al número previo al tratamiento; más preferentemente, el número de lesiones metastáticas se reduce en un 10% o más; más preferentemente, se reduce en un 20% o más; más preferentemente, se red uce en un 30% o más; más preferentemente , se reduce en un 40% o más; incluso más preferentemente, se reduce en un 50% o más; y más preferentemente, se reduce en más del 75% . El número de lesiones metastáticas puede medirse a traves de cualquier medio de medición reproducible. El número de lesiones metastáticas puede medirse contando las lesiones metastáticas visibles a simple vista o en una magnificación específica. Preferentemente la mag nificación específica es de 2x, 3x, 4x, 5x, 1 Ox, o 50x.

El tratamiento de cáncer puede dar como resultado un incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una población de sujetos tratados en comparación con una población que solo recibe un transportador. Preferentemente el tiempo de supervivencia promedio se incrementa en más de 30 d ías; más preferentemente, más de 60 días; más preferentemente , más de 90 días; y lo más preferentemente, más de 1 20 días. Un incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una población puede med irse a través de cualquier med io reprod ucible. Un incremento en el tiempo de supervivencia promedio en una población puede medirse por ejemplo calculando para una población la du ración de supervivencia promedio después del inicio del tratamiento con un compuesto activo. U n incremento en un tiempo de supervivencia promedio de una población puede medirse también , por ejemplo calculando para una población la du ración de supervivencia promedio después del término de la primera vuelta de tratamiento con un compuesto activo.

El tratamiento de cáncer puede dar como resultado un incremento en el tiempo de supervivencia promedio en una población de sujetos tratados en comparación con una población de sujetos no tratados. Preferentemente, el tiempo de supervivencia promed io se incrementa en más de 30 d ías; más preferentemente , más de 60 d ías; más preferentemente, más de 90 d ías; y lo más preferentemente, más de 1 20 d ías. Un incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una población puede medirse a traves de cualquier medio reproducible. Un incremento en el tiempo promedio de supervivencia en una población puede medirse por ejemplo, calculando para u na población , una tiempo de supervivencia promedio después del inicio del tratamiento con u n compuesto activo. Un incremento en el tiempo de supervivencia promedio en la población también puede ser medido, por ejemplo, calculando para u na población la du ración de supervivencia promedio después del término de la primera vuelta del tratamiento con un compuesto activo.

El tratamiento de cáncer puede dar como resultado un incremento en el tiempo de supervivencia promedio en la población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe monoterapia con un fármaco que no es un compuesto de la presente invención , o una sal, profármaco, metabolito, análogo o derivado farmacéuticamente aceptable del mismo. Preferentemente, el tiempo de supervivencia promedio se incrementa en más de 30 d ías; más preferentemente, más de 60 d ías; más preferentemente, más de 90 d ías; y lo más preferentemente, más de 1 20 d ías. U n incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una población puede medirse a traves de cualquier medio reproducible. Un incremento en el tiempo de supervivencia promedio en u na población puede medirse, por ejemplo, calculando para una población una du ración de supervivencia promed io después del inicio del tratamiento con un compuesto activo. U n incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una población también puede medirse , por ejemplo, calculando para u na población la du ración de supervivencia promedio al término de una primera vuelta de tratamiento con u n compuesto activo.

El tratamiento de cáncer puede dar como resultado una disminución en el rango de mortalidad de u na población de sujetos tratados en comparación con una población q ue sólo recibe transportador. El tratamiento de cáncer puede dar como resultado una disminución en el rango de mortalidad en una población de sujetos tratados en comparación con una población no tratada. El tratamiento de cáncer puede dar como resultado una dismin ución en el rango de mortalidad de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe monoterapia con un fármaco que no es un compuesto de la presente invención , o una sal, profármaco, metabolito, análogo o derivado farmacéuticamente aceptable del mismo. Preferentemente, el rango de mortalidad se disminuye en más de 2%; más preferentemente, más del 5%; más preferentemente más del 10% ; y lo más preferentemente más del 25% . Una dismin ución en el rango de mortalidad de una población de sujetos tratados puede medirse a traves de cualquier medio reprod ucible. U na d isminución en el rango de mortalidad de una población puede medirse, por ejemplo, calculando para una población el número promedio de muertes relacionadas con la enfermedad por unidad de tiempo después del inicio del tratamiento con un compuesto activo. U na disminución en el rango de mortalidad de una población también puede medirse, por ejemplo, calculando para una población el número promedio de muertes relacionadas con la enfermedad por unidad de tiempo después del término de la primera vuelta de tratamiento con un compuesto activo .

El tratamiento de cáncer puede dar como resultado una dismin ución en el rango de crecimiento del tumor.

Preferentemente, después del tratamiento, el rango de crecimiento de tumor se reduce en al menos el 5% en forma relativa al número previo al tratamiento; más preferentemente, el rango de crecimiento de tumor se reduce en al menos el 10%; más preferentemente, se reduce en al menos el 20% ; más preferentemente, se reduce en al menos el 30% ; más preferentemente, se reduce en al menos el 40%; más preferentemente, se reduce en al menos el 50% ; incluso más preferentemente, se reduce en al menos el 50% ; y lo más preferentemente, se reduce en al menos el 75% . El rango de crecimiento de tumor puede medirse a traves de cualquier medio de medición reproducible. El rango de crecimiento de tumor puede medirse de acuerdo con u n cambio en el diámetro de tumor por unidad de tiempo.

El tratamiento de cáncer puede dar como resultado una disminución en el recrecimiento del tumor. Preferentemente, después del tratamiento, el recrecimiento del tumor es menor al 5% ; más preferentemente, el recrecimiento del tumor es menor al 10%; más preferentemente, menor al 20% ; más preferentemente, menor al 30% ; más preferentemente, menor al 40% ; más preferentemente, menor al 50% ; incluso más preferentemente, menor al 50% ; y lo más preferentemente, menor al 75% . El recrecimiento de tumor puede medirse a través de cualquier medio de medición reproducible. El recrecimiento del tumor se mide, por ejemplo, midiendo un incremento en el diámetro de un tumor después de una contracción del tumor previa que sig uió el tratamiento. U na d isminución en el recrecimiento de tumor se indica a través de una falla en que los tumores reincidan después de que se ha detenido el tratamiento .

El tratamiento o prevención de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado una reducción en el rango de proliferación celular. Preferentemente, después del tratamiento, el rango de proliferación celular se reduce en al menos 5% ; más preferentemente, en al menos 10%; más preferentemente, en al menos 20% ; más preferentemente, en al menos 30% ; más preferentemente, en al menos 40%; más preferentemente , en al menos 50% ; incluso más preferentemente, en al menos 50% ; y lo más preferentemente, en al menos 75% . El rango de proliferación celu lar puede medirse a traves de cualquier medio de medición reproducible. El rango de proliferación celular se mide, por ejemplo, midiendo el número de células en división en la muestra de tejido por unidad de tiempo.

El tratamiento o prevención del trastorno de proliferación celular puede dar como resultado una reducción en la proporción de células proliferantes. Preferentemente, después del tratamiento, la proporción de células proliferantes se reduce en al menos el 5%; más preferentemente , en al menos 1 0%; más preferentemente, en al menos 20% ; más preferentemente, en al menos 30%; más preferentemente, en al menos 40% ; más preferentemente, en al menos 50% ; incluso más preferentemente, en al menos 50% ; y lo más preferentemente, en al menos 75% . La proporción de células proliferantes puede medirse a través de cualquier medio de medición reproducible. Preferentemente, se mide la proporción de células proliferantes, por ejemplo, cuantificando el número de células de división relativa al número de células sin división en una muestra de tejido. La proporción de celulas proliferantes puede ser equivalente al índice mitótico.

El tratamiento o prevención de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado una disminución en el tamaño de un área o zona de proliferación celular. Preferentemente, después del tratamiento, el tamaño de área o zona de proliferación celular se reduce en al menos el 5% en forma relativa a su tamaño previo al tratamiento; más preferentemente , se reduce en al menos el 1 0% ; más preferentemente, se reduce en al menos el 20% ; más preferentemente, se reduce en al menos el 30% ; más preferentemente, se reduce en al menos el 40% ; más preferentemente, se reduce en al menos el 50% ; incluso más preferentemente, se reduce en al menos el 50% ; y lo más preferentemente, se reduce en al menos el 75% . El tamaño de un área o zona de proliferación celular puede medirse a través de cualquier medio de medición reprod ucible. El tamaño de un área o zona de proliferación celular puede medirse como un diámetro o ancho de área o zona de proliferación celular.

El tratamiento o prevención de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado u na disminución en el n úmero o proporción de células que tiene una apariencia o morfología anormal. Preferentemente, después del tratamiento, el n úmero de cél u las que tiene una morfolog ía anormal se reduce en al menos el 5% en forma relativa a su tamaño previo al tratamiento; más preferentemente, se reduce en al menos el 1 0% ; más preferentemente, se reduce en al menos el 20% ; más preferentemente, se reduce en al menos el 30% ; más preferentemente, se reduce en al menos el 40% ; más preferentemente , se red uce en al menos el 50% ; incluso más preferentemente, se reduce en al menos el 50%; y lo más preferentemente , se reduce en al menos el 75% . Una apariencia o morfología celu lar anormal puede medirse a traves de cualquier medio de medición reproducible. Una morfolog ía de célula anormal puede medirse med iante microscopio, por ejemplo, utilizando un microscopio de cultivo de tejido invertido. U na morfolog ía de célula anormal puede tomar la forma de un pleiomorfismo n uclear.

Tal como se utiliza en la presente invención , el término “selectivamente” significa q ue tiende a ocurrir con mayor frecuencia en una población q ue en otra población . Las poblaciones comparadas pueden ser poblaciones celulares. Preferentemente, un compuesto de la presente invención , o una sal, profármaco, metabolito , polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, actúa selectivamente en una célula de cáncer o precancerígena pero no en una célula normal . Preferentemente, un compuesto de la presente invención , o una sal , profármaco , metabolito, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, actúa selectivamente para modular u n objetivo molecular (por ejemplo, metiltransferasa de proteína objetivo), pero no modula significativamente otro objetivo molecu lar (por ejemplo, una metiltransferasa de proteína no objetivo) . La presente invención tambien proporciona u n método para inhibir selectivamente la actividad de una enzima, tal como una metiltransferasa de una proteína . Preferentemente, ocurre un evento selectivamente en una población A relativa a la población B si ocurre más de dos veces más frecuentemente en la población A en comparación con la población B. Un evento ocu rre selectivamente si ocurre más de cinco veces más frecuentemente en la población A. Un evento ocu rre selectivamente si ocu rre más de diez veces más frecuentemente en la población A; más preferentemente, más de cincuentta veces; incluso más preferentemente, más de 100 veces; y lo más preferentemente, más de 1 000 veces más frecuentemente en la población A en comparación con la población B. Por ejemplo, la muerte celular puede decirse que ocurre selectivamente en células de cáncer si ocurre con una frecuencia mayor a dos veces en las células de cáncer en comparación con las células normales.

U n compuesto de la presente invención puede modular la actividad de un objetivo molecular (por ejemplo, una proteína metiltransferasa objetivo) . La modulación se refiere a estimular o inhibir una actividad de un objetivo molecular. Preferentemente , un compuesto de la presente invención modula la actividad de un objetivo molecular si estimula o inhibe la actividad del objetivo molecular en al menos 2 veces en forma relativa a la actividad del objetivo molecular bajo las mismas condiciones, pero careciendo únicamente de la presencia del compuesto. Más preferentemente, un compuesto de la presente invención modula la actividad de un objetivo molecular si estimula o inhibe la actividad del objetivo molecular en al menos 5 veces, al menos 1 0 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces en forma relativa a la actividad del objetivo molecular bajo las mismas condiciones pero careciendo únicamente de la presencia del compuesto. La actividad de u n objetivo molecu lar puede medirse a traves de cualquier medio reproducible. La actividad de u n objetivo molecular puede medirse in vitro o in vivo. Por ejemplo, la actividad de un objetivo molecular puede medirse in vitro a través de un ensayo de actividad enzimática o ensayo de enlace de ADN , o la actividad de un objetivo molecular puede medirse in vivo ensayando para la expresión de un gen reportero.

Un compuesto de la presente invención (es decir, el bromhid rato del Compuesto I , así como el Polimorfo A) no modula significativamente la actividad de un objetivo molecular si la adición del compuesto no estimula o inhibe la actividad del objetivo molecular en más del 1 0% en forma relativa a la actividad del objetivo molecular bajo las mismas condiciones, pero careciendo únicamente de la presencia del compuesto.

Tal como se utiliza en la presente invención , el termino “isozima selectiva” significa la in h ibición o estimulación preferencial de una primera isoforma de una enzima en comparación con una segu nda isoforma de u na enzima (por ejemplo, in hibición o estimulación preferencial de una isozima alfa de proteína metiltransferasa en comparación con una isozima beta de proteína metiltransferasa) . Preferentemente, un compuesto de la presente invención , demuestra un mínimo de cuatro veces de diferencia, preferentemente diez veces de diferencia, más preferentemente cincuenta veces de diferencia en la dosificación requerida para lograr un efecto biológico. Preferentemente, u n compuesto de la presente invención, demuestra este diferencial a través del rango de inhibición , y el diferencial es ejemplificado como la IC50, es decir, el 50% de inhibición , para un objetivo molecular de interés.

La administración de un compuesto de la presente invención a una célula o sujeto que necesita del mismo, puede dar como resultado la modulación (por ejemplo, estimulación o inhibición) de una actividad de una proteína metiltransferasa de interés.

El tratamiento de cáncer o un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado la muerte celular, y preferentemente , la muerte celular da como resultado una disminución de al menos el 10% en el número de células en una población . Más preferentemente, la muerte celular significa una disminución de al menos 20% ; más preferentemente, una d isminución de al menos 30% ; más preferentemente, una disminución de al menos 40% ; más preferentemente, una d isminución de al menos 50% ; lo más preferentemente, una disminución de al menos 75% . Los números de celulas en una población pueden medirse a través de cualquier medio reproducible. Un n úmero de células en una población puede med irse med iante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), microscopio de inmunofluorescencia y microscopio de luz. Los métodos para medir la muerte celular son tal como se muestran en la Publicación de Li et al., Proc Nati Acad Sci E. U.A. 1 00(5): 2674-8 , 2003. En un aspecto, la muerte celular ocu rre mediante apoptosis.

Preferentemente, u na cantidad efectiva de un compuesto de la presente invención no es sign ificativamente citotóxica para las células normales. U na cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto no es sign ificativamente citotóxica para las células normales, si la administración del compuesto en una cantidad terapéuticamente efectiva no induce la muerte celular en más del 10% de las células normales. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto no afecta significativamente la viabilidad de las células normales si la administración del compuesto en una cantidad terapéuticamente efectiva no induce la muerte celu lar en más del 10% de las células normales. En un aspecto, la muerte celular ocu rre mediante apoptosis.

Contactar una celula con un compuesto de la presente invención , puede inducir o activar selectivamente la muerte celular en células de cáncer. La administración a un sujeto que necesita del mismo de un compuesto de la presente invención , puede ind ucir o activar selectivamente la muerte celular en células de cáncer. Contactar una célula con un compuesto de la presente invención puede inducir selectivamente la muerte celu lar en una o más células afectadas por un trastorno de proliferación celular. Preferentemente, la administración a un sujeto que necesita del mismo de un compuesto de la presente invención , induce selectivamente muerte celular en una o más células afectadas por un trastorno de proliferación celular.

La presente invención se refiere a un método para tratar o prevenir cáncer (por ejemplo, cuyo enrso puede ser influenciado por la modulación de metilación de proteína transmitida por EZH2) admin istrando un compuesto de la presente invención (por ejemplo, el bromh idrato del Compuesto I , así como el Polimorfo A) a un sujeto que necesita del mismo, en donde la administración del compuesto de la presente invención da como resultado uno o más de los siguientes: prevención de la proliferación de célula de cáncer por la acumulación de células en una o más fases del ciclo cel ular (por ejemplo, G 1 , G 1 /S, G2/M), o inducción de la senescencia celular, o promoción de una diferenciación de célula de tumor, promoción de muerte celular en celulas de cáncer por citotoxicidad , necrosis o apoptosis, sin una cantidad sig nificativa de muerte celular en células normales, actividad antitumor en animales con u n índice terapéutico de hasta 2. Tal como aqu í se utiliza, el “índice terapéutico” es la dosis máxima tolerada dividida entre la dosis eficaz. La presente invención también se refiere a un método utilizado para identificar candidatos adecuados para tratar o prevenir cáncer.

U n experto en la téenica puede referirse a textos de referencia generales para descripciones detalladas de técnicas conocidas aquí descritas o técnicas equivalentes . Estos textos incluyen Ausubel et al , Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos Actuales en Biología Molecular) , Joh n Wilcy y Sons, Inc. (2005); Sambrook et al, Molecular Cloning , A Laboratory Manual (Clonación Molecular, Man ual de Laboratorio) (3° edición) , Coid Spring Harbor Press , Coid Spring Harbor, Nueva York (2000) ; Coligan et al, Current Protocols in Immunology (Protocolos Actuales en Inmu nolog ía) , John Wiley & Sons, N.Y. ; Enna et al, Current Protocols in Pharmacology (Protocoles Actuales en Farmacolog ía) , Joh n Wiley & Sons, N .Y. ; Fingí et al , The Pharmacological Basis of Therapeutics (Bases Farmacológicas de Terapéuticos) (1 975) , Remington's Pharmaceutical Sciences (Ciencias Farmacéuticas de Remington), Mack Publishing Co. , Easton , PA, 18° edición ( 1990) . A estos textos, por supuesto, también se puede hacer referencia en la elaboración o uso de un aspecto de la presente invención .

Ejemplificación Materiales y Metodos Difracción de polvo de Rayos X Se tomó PXRD para todas las muestras en un Rigaku MultiFlex (Objetivo : Cu ; Voltaje de Tubo: 40 kV; Corriente de Tubo: 30 mA) .

Calorimetría de Exploración Diferencial Se tomó DSC para todas las muestras en un Mettler- Toledo DSC 1 /700 (Condiciones de corrida: Temperatura inicial 35°C , Temperatu ra final 325°C , Rango de calentamiento 30°C/min) .

Cristalografía de Rayos X Se montó u n cristal de plata incolora con dimensiones 0.28 x 0.22 x 0.06 mm en un lazo de Nylon utilizando una cantidad muy pequeña de aceite de paratona. Los datos se recolectaron utilizando un difractómetro a base de Bruker CCD (dispositivo acoplado a la carga) equipado con un aparato de baja temperatu ra Oxford Cryostream que opera en 173 K. Los datos se midieron utilizando exploraciones omega y phi de 0.5° por cuadro du rante 45 s. El n úmero total de imágenes estuvo basado en los resultados del programa COSMO, en donde se esperó que la resonancia fuera de 4.0 y la totalidad hasta el 100% de 0.83 A. Se recuperaron los parámetros celulares utilizando el software APEX I I y se refinaron utilizando SAI NT en todas las reflexiones observadas. La reducción de datos se llevó a cabo utilizando el software SAI NT que corrige para Lp. Se aplicó escalado y correcciones de absorción utilizando la teenica de multi-exploración SADABS , suministrada por George Sheldrick. Las estructuras se resolvieron a través del método directo utilizando el programa SH ELXS-97 y se refinaron mediante el método de mínimos cuad rados en F2, SH ELXL- 97, que están incorporados en SH ELXTL-PC V 6.10.

La estructura mostrada en la figura 1 1 se resolvió en un grupo de espacio P2 Jc (# 14). Todos los átomos de hidrógeno se refinaron en forma anisotrópica. Los hidrógenos se calcularon mediante métodos geométricos y se refinaron como un modelo de conducción. El cristal utilizado para el estudio de d ifracción no mostró descomposición durante la recolección de datos. Todos los dibujos se realizaron en elipsoides al 50% . Absorción de Vapor Dinámica Se midió DVS en un sistema VTI Modelo SGA-1 00. Método de medición : La humedad relativa (RH) se cambió en una forma controlada, en pasos del 5% de 5.0% a 95.0% , posteriormente n uevamente a 5.0% utilizando el sistema de absorción de vapor gravimétrico, y se midió el cambio de porcentaje en peso (% en peso) de la muestra en cada etapa .

H PLC Se llevó a cabo H PLC en una bomba cuaternaria Agilent 1200 H PLC , mezclando a baja presión con un eliminador de gas en línea. Condiciones del metodo anal ítico: se inyectó una muestra de 8 mI_ (20 mg con ER-581982-06 diluido con 50 mL de un metanol para proporcionar aproximadamente 0.4 mg/ml_ de solución) sobre una Agilent Zorbax Eclipse XDB-C 1 8 (4.6 x 150 mm, 3.5 um) , Cond iciones de cromatografía : fase móvil A, agua con formato de amon io 5 mM ; fase móvil B, formato de amonio de 5 mM en 50/45/5 acetonitrilo/metanol/agua; rango de flujo, 1 .5 ml/minutos; gradiente: ¡socrático en 10% B de 0 a 3 minutos; incremento lineal al 70% B de 3 a 7 minutos; isocrático a 70% B de 7 a 12 minutos; incremento lineal al 100% B de 12 al 1 5 min utos isocrático al 100% B de 1 5 a 20 minutos; temperatura de la columna, 35°C; detección, UV 230 nm. Tiempo de retención aproximado del Compuesto I = 10.7 minutos.

Síntesis de Polimorfo A Ácido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico. Se agregó en porciones a temperatu ra ambiente una solución agitada de ácido 2-metil-3-nitrobenzoico (100 g , 552 mmol) en H2SO4 concentrado (400 mL) , 1 ,3-dibromo-5,5-dimetil-2,4-imidazolidindiona (88 g , 308 mmol), y la mezcla de reacción se agitó posteriormente a temperatura ambiente durante 5 horas.

La mezcla de reacción se vertió sobre agua enfriada con hielo, el sólido precipitado se filtró, se lavó con agua y se secó bajo vacío para producir el compuesto deseado en la forma de un sólido (140 g, 98%). El compuesto aislado se tomó directamente en el siguiente paso. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) d 8.31 (s, 1 H), 8.17 (s, 1 H), 2.43 (s, 3H). 5-Bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metilo. A una solución agitada de ácido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico (285 g, 1105 mmol) en DMF (2.8L) a temperatura ambiente, se le agregó carbonato de sodio (468 g, 4415 mmol) seguido de la adición de yoduro de metilo (626.6 g, 4415 mmol). La mezcla de reacción resultante se calentó a una temperatura de 60°C durante 8 horas. Al termino (monitoreado mediante TLC), la mezcla de reacción se filtró (para eliminar el carbonato de sodio) y se lavó con acetato de etilo (1L X 3). El filtrado combinado se lavó con agua (3L X 5) y la fase acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo (1L X 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y concentraron bajo presión reducida para producir el compuesto del título en la forma de un sólido (290 g, 97% rendimiento). El compuesto aislado se tomó directamente en el siguiente paso. 1H RMN (CDCI3, 400 MHz) d 8.17 (s, 1H), 7.91 (s, 1 H) , 3.96 (s , 3H), 2.59 (s, 3H). 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo (1). A una solución agitada de 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metilo (290 g, 1058 mmol) en etanol (1.5 L) se le agregó cloruro de amonio acuoso (283 g, 5290 mmol disuelto en 1.5 L de agua). La mezcla resultante se agitó a una temperatura de 80°C a la cual se le agregó polvo de hierro (472 g, 8451 mmol) en porciones. La mezcla de reacción resultante se calentó a una temperatura de 80°C durante 12 horas. Al termino, tal como se determina mediante TLC, la mezcla de reacción se filtró caliente sobre celite® y el lecho de celita se lavó con metanol (5L) seguido de lavado con 30% MeOH en DCM (5L). El filtrado combinado se concentró in vacuo, el residuo obtenido se diluyó con una solución de bicarbonato de sodio acuoso (2L) y se extrajo con acetato de etilo (5L X 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y concentraron bajo presión reducida para producir el compuesto del título en la forma de un sólido (220 g, 85%). El compuesto se tomó directamente en el siguiente paso. 1H RMN (CDCI3, 400 MHz) d 7.37 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.80 (bs, 2H), 2.31 (s, 3H). 5-bromo-2-meti 1-3 -((tetra h id ro-2H-piran-4-i l) amino) benzoato de meti lo (2). Se cargó u n reactor con 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo (455.8 g , 1 .87 mol), 1 ,2-dicloroetano (4.56 L) , y ácido acetico (535 mi, 9.34 mol) . A la mezcla se le agregó dih idro-2H-piran-4(3H)-ona (280 g, 2.80 mol) y triacetoxiborohidruro de sodio (594 g , 2.80 mol) manteniendo una temperatura interna debajo de 40°C . La mezcla se agitó a una temperatura de 25°C durante 2.5 horas y posteriormente la reacción se extinguió con u na solución de hid róxido de sodio (448 g, 1 1 .20 mol) en agua (5.61 L).

Después de agitar durante 20 min utos a temperatu ra ambiente, la capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (3.65 L). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (1 .5 L), y se concentraron bajo vacío.

El residuo se trató con acetato de etilo (1 .8 L) y se calentó a una temperatura de 65-70°C. La mezcla se agitó a una temperatu ra de 65-70°C durante 15 minutos para proporcionar u na solución clara y posteriormente se trató con n-heptano (7.3 L) manteniendo una temperatura entre 60-70°C. U na vez que se completó la adición del heptano a la solución , la mezcla se mantuvo a una temperatura de 65-70°C durante 1 5 minutos y posteriormente se dejó enfriar a una temperatura de 1 8-22°C du rante 3 horas. La suspensión resultante se agitó a una temperatura de 18-22°C du rante 4 horas, se enfrió 0-5°C du rante 1 hora , y se mantuvo a una temperatura de 0-5°C durante 2 horas. El precipitado se filtró, se lavó dos veces con n-heptano (1 .4 L), y se secó bajo vacío para proporcionar el compuesto del título (540 g , 88%) . El patrón XRPD de este compuesto se muestra en la figu ra 17. 5-Bromo-3-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-i l) am ino)-2-metilbenzoato de metilo (3). A u na solución agitada de 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il)am¡no) benzoato de metilo (14 g, 42.7 mmol) en dicloroetano ( 1 50 mL) se le agregó acetaldeh ído (3.75 g, 85.2 mmol) y ácido acetico (15.3 g, 256 mmol) . La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 5 minutos. La mezcla se enfrió a una temperatura de 0°C y se agregó triacetoxiborohidruro de sodio (27 g , 128 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Al término de la reacción , tal como se determinó mediante TLC, se agregó a la mezcla de reacción una solución de bicarbonato de sodio acuoso hasta que se obtuvo un pH 7-8 , la fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se secaron sulfato de sodio anhidro, se filtraron y concentraron bajo presión reducida. El compuesto crudo se purificó mediante cromatografía de columna (gel de sílice malla 100-200) eluyendo con acetato de etilo: hexano para producir el compuesto deseado en la forma de un líquido viscoso (14 g, 93%). 1H RMN DMSO-de, 400 MHz) d 7.62 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 3.80 (bs, 5H), 3.31 (t, 2H), 2.97-3.05 (m, 2H), 2.87-2.96 (m, 1 H), 2.38 (s, 3H), 1.52-1.61 (m, 2H), 1.37-1.50 (m, 2H), 0.87 (t, 3 H , J = 6.8 Hz). 5-(Etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 ,1’-bifenil]-3-carbox¡lato de metilo (4): Una mezcla de metil 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoato de metilo (580 g, 1.63 mol), 4-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)bencil)morfolina (592 g, 1.95 mol), 1,4-dioxano (3.86 L), carbonato de sodio (618 g, 5.83 mol), y agua (771 mi) se le extrajeron los gases burbujeando en nitrógeno en la mezcla a una temperatura de 20°C durante 20 minutos y se trató con tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0) (14.1 1 g , 12.21 mmol). A la mezcla resultante se le extrajeron los gases durante 20 minutos adicionales y posteriormente se calentó a una temperatura de 87-89°C durante 1 7 horas. Después de enfriarse a una temperatu ra de 20°C , la mezcla se diluyó con acetato de etilo (5.80 L) y u na solución de ácido (R)-2-amino-3-mercaptopropiónico (232 g) en agua (2.320 L). Después de agitar du rante 1 hora a una temperatura de 20°C, la capa orgánica se separó y lavó nuevamente con una solución de ácido ( ?)-2-amino-3-mercaptopropión ico (232 g) en agua (2.320 L) . Las capas acuosas se combinaron y se extrajeron con acetato de etilo (5.80 L). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con una solución de hidróxido de sodio (93 g) en agua (2.32 L), y se concentraron bajo vacío a una temperatura de 35°C para proporcionar el compuesto del título en la forma de un aceite naranja (1 .21 kg, 164% rendimiento) . Ácido 5-(etill(tetrahidro-2H-pi ran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 , 1’-bifenil]-3-carboxílico (5): Se suspendió 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 , 1’-bifenil]-3-carboxilato de metilo (69.0 g, 1 52.5 mmol) (con base en el rendimiento teórico del paso anterior) en etanol (380 mL) y se trató con u na solución de h idróxido de sodio (24.84 g, 621 .0 mmol) en agua (207 mL). La mezcla se agitó a una temperatura de 40°C d urante 1 8 horas. Despues del enfriamiento a u na temperatu ra de 0-5°C, la mezcla se neutralizó a u n pH 6.5 con ácido hidroclórico 1 N (580 m L) manteniendo la temperatura debajo de 25°C. Posteriormente, la mezcla se extrajo dos veces con una mezcla de diclorometano (690 m L) y metanol (69.0 m L). Las capas orgánicas se combinaron y concentraron bajo vacío presión reducida para proporcionar un producto crudo en la forma de un sólido amarillo (127 g).

El producto crudo se disolvió en 2-metiltetrahidrofurano (656 mL) a una temperatura de 70°C y posteriormente se trató con I PA (828 mL) . La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente du rante 3 a 4 horas y posteriormente se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El precipitado se filtró, se lavó dos veces con I PA (207 m L) , y se secó bajo vacío para prod ucir el compuesto del título en la forma de un sólido color crema (53.54 g , 80%). El patrón XRPD de este compuesto se muestra en la figura 9.

N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3 il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 ,1’-bifenil]-3-carboxamida (Compuesto I): Una mezcla de ácido 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1 , 1’-bifenil]-3-carboxílico (540 g, 1.23 mol) y clorhidrato de 3-(aminometil)-4,6-dimetil-dihidro-piridin-2(1H)-ona (279 g, 1.48 mol) se suspendió en DMSO (2.70 L) y se trató con trietilamina (223 mi, 1.60 mol). La mezcla se agitó a una temperatura de 25°C durante 30 minutos y se trató con EDC-HCI (354 g, 1.85 mol) e hidrato HOBT (283 g, 1.85 mol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Despues de la adición de trietilamina (292 mi, 2.09 mol), la mezcla se enfrió a una temperatura de 15°C, se diluyó con agua (10.1 L) manteniendo la temperatura debajo de 30°C, y se agitó a una temperatura de 19-25°C durante 4 horas. Se filtró el precipitado resultante, se lavó dos veces con agua (2.70 L), y se secó bajo vacío para producir el producto crudo (695 g, análisis peso-peso = 78%).

Para la purificación adicional del producto, se llevó a cabo la recristalización. Un producto crudo (20.00 g, 34.92 mmol), se suspendió en una mezcla de etanol (190 mi) y agua (10.00 mi) y se calentó a una temperatura de 75°C hasta que se obtuvo una solución clara. La solución se dejó enfriar a temperatura ambiente durante la noche. El precipitado se filtró, se lavó dos veces con una mezcla de etanol (30.0 mi) y agua (30.0 mi), y se secó bajo vacío a una temperatura de 35°C para prod ucir el compuesto del título en la forma de u n sólido color crema (14.0 g , 70% recuperación del crudo y 90% de rendimiento con base en el ensayo de peso-peso).

Brom uro de 4-((3,-(((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-5’-(eti l(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4’-metil-[1 , 1’-bifenil]-4-i l)metil)morfolin-4-io (Polimorfo A) : Se suspendió la N-((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahid ro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1 , 1’-bifenil]-3-carboxamida cruda (595 g, 464 g con base en el ensayo peso-peso, 810.3 mmol) en etanol (3.33 L) . Despues de calentar a una temperatura de 70°C , la mezcla se trató con 48% de H Br acuoso (97 mi , 850.8 mmol) y se agitó a una temperatura de 70°C durante 30 minutos. La resolución naranja-rojo resultante se trató con acetato de etilo (3.33 L) manteniendo una temperatura arriba de 60°C . La mezcla se enfrió lentamente a temperatura ambiente durante 1 8 horas. La mezcla se enfrió a una temperatura de 0°C durante 1 hora y se agitó a dicha temperatura durante 5.5 horas. Se filtró el precipitado resultante , se lavó dos veces con acetato de etilo (1 .39 L) , y se secó bajo vacío para producir el compuesto del título en la forma de un sólido color crema (515 g , 97% rendimiento) .

Recristalización del Polimorfo A: Se suspendió bromuro de 4-((3’-(((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-dihidropiridin-3- ¡l)met¡l)carbamoil)-5’-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4’-metil-[1 , 1’-bifenil]-4-il)metil)morfolin-4-io (0.50 g , 0.77 mmol; 95.6% de pureza mediante H PLC) en etanol (3.0 mL) y se calentó a una temperatura de 80°C hasta que se obtuvo una solución clara. A la solución se le ag regó lentamente MTBE (5.0 mL). La solución resultante se dejó enfriar a una temperatura de 1 8-22°C durante 3 horas y se ag itó a una temperatura de 18-22°C durante 1 5 horas. El precipitado se filtró, se lavó dos veces con MTBE (2 mL) y se secó bajo vacío para producir 0.45 g del compuesto del título (89% de recuperación, 96.6% de pureza mediante HPLC). El patrón de d ifracción de polvo de rayos X del Polimorfo A (monobromohid rato) se muestra en la fig ura 1 . La Tabla 1 , que se encuentra a continuación, describe los picos más significativos.

Tabla 1 Eval uación de Brom hidrato del Compuesto I y Polimorfo A Se prepararon y clasificaron un número de diferentes formas de sal del Compuesto I , incluyendo sales de clorhidrato, bromhidrato, hemisulfato, sodio, fosfato, nitrato, maleato, malonato, y L-tartrato. Entre ellas, la sal de bromhidrato (H Br) tuvo las propiedades fisicoq uímicas más convenientes en terminos de facilidad de preparación e hig roscopicidad.

Se llevaron a cabo estudios detallados de la base libre del Compuesto I , así como la sal de HCI de este compuesto. Se detectaron al menos cinco diferentes formas de cristal de la forma libre del Compuesto I d u rante la clasificación de polimorfo preliminar utilizando XRD y DSC . Debido al alto grado de variabilidad observado durante la cristalización de la forma libre, se compraron formas de cristal de otras sales. De las sales clasificadas , las formas de sal de monoclorhidrato, monobromhidrato, hemisulfato, fosfato, maleato, L-tartarato y sodio fueron cristalinas. Las sales de fosfato y maleato fueron muy higroscópicas y L-tartarato tuvo muy poca cristalinidad .

Fue difícil obtener u n alto grado de cristalinidad de la sal HCI del Compuesto I. Se obtuvo una mezcla de material cristalino y amorfo sin importar las condiciones de cristalización . Tal como se muestra en la figura 8, los datos DSC de la sal de monoclorhidrato del Compuesto I indican cierto g rado de no cristalinidad con un endotermo a una temperatura de 190.5°C. Asimismo, se obtuvieron los datos de absorción de vapor dinámico (DVS) de la sal de monoclorhidrato del Compuesto I y se encontró q ue muestran cierta h igroscopicidad: entre 4 - 6% en peso de ganancia observada en el 75% de humedad relativa (RH) a una temperatura de 25°C (figu ra 18B) . Esto puede atribuirse a cierta cantidad de naturaleza no cristalina de la sal de monoclorhidrato. Ver por ejemplo la figura 1 8 A, que muestra un triclorhidrato amorfo del Compuesto I . Debido a que no fue controlable el nivel de cristalinidad , la sal HCI no se consideró para desarrollo adicional.

Tal como se muestra en la figura 6, el análisis DVS de la sal de sodio del Compuesto I mostró higroscopicidad significativa: se observó aproximadamente el 15% en peso de ganancia en la humedad relativa de 75% (RH) a una temperatura de 25°C . Tal como se muestra en la figura 7 , la sal de hemisulfato del Compuesto I mostró higroscopicidad moderadamente alta: se observó una ganancia de entre el 9 -1 1 % en peso 75% de la humedad relativa (RH) en 25°C. Esto se puede atribuir a la naturaleza altamente no cristalina del compuesto, ya que los datos DSC de la sal de hemisulfato indican un muy alto grado de no cristalinidad sin endotermo limpio.

De estos compuestos cristalinos, el monobromhidrato fue el más cristalino y el menos higroscópico (ver figuras 1 , 3, y 4). Además, el monobromhidrato es altamente estable, y resiste la generación de impurezas (la fig ura 5 ilustra el análisis H PLC de Polimorfo A du rante tres d ías a temperatu ra elevada. El polimorfo A produjo impu rezas mín imas en tres d ías a u na temperatura de 100°C). En forma interesante, la sal de di-H Br del Compuesto I se encontró como principalmente amorfa (figura 2) . Se obtuvieron dos diferentes formas de monobromhidrato del Compuesto I (Polimorfos A y B) de diferentes sistemas de solvente y se caracterizaron utilizando análisis XRD, DSC y TGA-DSC . Los datos XRD y DSC de estas dos diferentes formas de cristal de los lotes representativos del Compuesto I se muestran en las figura 1 , fig ura 3, y fig ura 10. El polimorfo B está caracterizado por un patrón XRD en polvo con picos en 8.5, 10.9, 16.7, 1 7.4, 20.9, 22.1 y 25.7 ±0.2 grados 2 theta (ver fig ura 10). Entre estos dos, el Polimorfo A se encontró más cristalino en naturaleza. Los estudios de absorción de vapor dinámico (DVS) mostraron que el polimorfo A no es higroscópico (figura 4). En los análisis térmicos, se observó un solo pico endotérmico con una temperatura de generación de aproximadamente 251°C. Además, fue evidente a partir del análisis DSC, que la recristalización del polimorfo A incrementa significativamente la cristalinidad del material (ver la figura 3).

En corridas a escala de laboratorio múltiples, el Polimorfo A se obtuvo en forma reproducible, y los ligeros cambios sin las condiciones de cristalización no dieron como resultado diferentes formas de cristal.

Ensayos de enzima PRC2 Tipo Silvestre v Mutante Materiales Generales. Se compraron S-adenosilmetionina (SAM), S-adenosilhomociteína (SAH), bicina, KCI, Tween20, dimetilsulfóxido (DMSO) y gelatina de piel de bovino (BSG) en Sigma-Aldrich en el nivel de pureza más alto posible. Se compró ditiotreitol (DTT) en EMD. Se compró 3H-SAM en American Radiolabeled Chemicals con una actividad específica de 80 Ci/mmol. Se compraron Flashplates de estreptavidina de 384 depósitos en PerkinElmer.

Substratos. Se sintetizaron los péptidos representativos de los residuos de histona 21 - 44 H3 humana que contiene ya sea una Usina no modificada 27 (H3K27meO) o Usina dimetilada 27 (H3K27me2), con un motivo de etiqueta de afinidad de enlazador C-terminal G (K-biotina) y una tapa de amida C-terminal en 21 ° Century Biochemicals. Los peptidos se purificaron mediante cromatografía líquida de alto desempeño (H PLC) a más del 95% de pu reza y se confirmaron mediante espectrometría de masa de cromatografía líquida (LC-MS). Las secuencias q ue se describen a contin uación .

H3K27meO: ATKAARKSAPATGGVKKPH RYRPGGK(biotina)-amida (SEQ I D NO : 1 ) H 3K27me2: ATKAARK(me2)SAPATGGVKKPHRYRPGGK(biotina)-amida (SEQ I D NO: 2).

Se purificaron oligonucleosomas de eritrocito de pollo de sang re de pollo de acuerdo con los procedimientos establecidos.

Completos PRC2 Recom bi nantes. Se purificaron los complejos PRC2 humanos como complejos de enzima de 4 componentes coexpresados en células Spodoptera frugiperda (sf 9 ) utilizando un sistema de expresión de baculovirus. Las subunidades expresadas fueron EZH2 tipo silvestre (N M_004456) o los mutantes EZH2 Y641 F, N, H , S o C generados de la construcción EZH2 tipo silvestre, EED (N M_003797) , Suz12 (N M_01 5355) y RbAp48 (NM_005610). La subunidad EED contenía la etiq ueta FLAG N-terminal que fue utilizada para pu rificar todo el complejo de 4 componentes de los Usados de célula sf9. La pureza de los complejos cumplió o excedió el 95% tal como se determina mediante SDS-PAGE y análisis Agilent Bioanalyzer. Las concentraciones de la existencia de enzimas (generalmente 0.3-1 .0 mg/mL) se determinaron utilizando un ensayo Bradford contra un estándar albúmina de suero de bovino (BSA) .

Procedimiento General para Ensayos de Enzima PCR2 en Sustratos de Peptido. Los ensayos todos se llevaron a cabo en un amortiguado que consiste en 20 M de bicina (pH = 7.6), 0.5 mM de DTT, 0.005% de BSG y 0.002% de Tween 20, preparados el d ía del uso. Los compuestos en 100% DMSO (1 p L) se mancharon en placas de fondo V de 384 depósitos de polipropileno (Greiner) utilizando el Platemate 2 X 3 ajustado con una cabeza de pipeta de 384 canales (Thermo). Se agregó DMSO (1 p L) a las columnas 1 1 , 12, 23, 24, filas A - H para el máximo control de señal, y SAH , un prod ucto conocido y se agregó un inhibidor de PRC2 ( 1 p L) a las columnas 1 1 , 12, 23, 24, filas I - P para el mínimo control de señal. Se agregó un coctel (40 p L) q ue contiene la enzima PRC2 tipo silvestre y el péptido H3K27meO o cualquiera de las enzimas mutantes Y641 y el péptido H3K27me2, mediante M ultidrop Combi (Thermo). Los compuestos se dejaron incubar con PRC2 durante 30 minutos a una temperatura de 25°C , posteriormente se agregó un coctel ( 10 pL) que contiene u na mezcla de SAM no radioactivo y 3H , para iniciar la reacción (volumen final = 51 pL). En todos los casos, las concentraciones finales fueron como se indica: la enzima PRC2 tipo silvestre o muíante fue de 4 nM , el SAH en los depósitos del m ín imo control de señal fue de 1 mM y la concentración DM SO fue de 1 %. Las concentraciones finales del resto de los componentes se indican en la tabla 2 que se encuentra a continuación. Los ensayos se detuvieron mediante la adición de no radioactivo SAM (10 pL) a una concentración final de 600 pM , q ue diluyen el 3H-SAM a un n ivel en donde su incorporación en el substrato del péptido ya no es detectable. Posteriormente se transfirieron 50 p L de la reacción en la placa de polipropileno de 384 depósitos a una Flashplate de 384 depósitos, y los péptidos biotinilados se dejaron enlazar a la superficie de estreptavidina durante al menos 1 hora antes de lavarse tres veces con 0.1 % de Tween20 en un lavador de placa ELx405. Las placas se lcyeron posteriormente en u n lector de placa PerkinElmer para medir la cantidad de péptido etiquetado-3H enlazado a la superficie Flash plate, medido como desintegraciones por minutos (dpm) o alternativamente , referido conteos por minuto (cpm) .

Tabla 2: Concentraciones finales de componentes para cada variación de ensayo con base en la identidad de EZH2 (tipo silvestre o Y641 mutante EZH2) Procedimiento General para Ensayo de Enzima PRC2 Tipo Silvestre en substrato de Oligonucleosoma Substrato. Los ensayos se llevaron a cabo en un amortiguador que consiste en 20 M de bicina (pH = 7.6), 0.5 mM de DTT, 0.005% de BSG y 0.002% de Tween 20, preparado el día del uso. Los compuestos en 100% de DMSO (1 pL) se mancharon en placas de fondo V de 384 depósitos de polipropileno (Greiner) utilizando una Platemate 2 X 3 ajustada con una cabeza de pipeta de 384 canales (Thermo). Se agregó DMSO (1 pL) a las columnas 11, 12, 23, 24, filas A - H para el control de señal máximo, y SAH, un producto conocido y se agregó el inhibidor de PRC2 (1 pL) a las columnas 11,12, 23, 24, filas I - P para el mínimo control de señal. Se agregó med iante M ultidrop Combi (Thermo) un coctel (40 mI_) que contiene la enzima PRC2 tipo silvestre y el oligon ucleosoma de eritrocito de pollo. Los compuestos se dejaron incubar con PRC2 du rante 30 minutos a una temperatura de 25°C, posteriormente se agregó u n coctel ( 10 p L) que contiene una mezcla de SAM no radioactivo y 3H , para iniciar la reacción (volumen final = 51 p L) . Las concentraciones finales fueron como se indica: la enzima PRC2 tipo silvestre fue 4 nM , el SAM no radioactivo fue 430 nM , el 3H-SAM fue de 120 nM , el oligonucleosoma de eritrocito de pollo fue de 120 nM, SAH en los depósitos del mínimo control de señal fue de 1 mM y la concentración de DMSO fue de 1 %. El ensayo se detuvo mediante la adición de SAM no radioactivo ( 10 pL) a una concentración fi nal de 600 pM , que d iluye el 3H-SAM a un nivel en donde su incorporación en el substrato del oligonucleosoma de eritrocito de pollo ya no es detectable. Posteriormente se transfirieron 50 mL de la reacción en una placa de polipropileno de 384 depósitos a u na Flashplate de 384 depósitos , y se inmovilizaron los oligonucleosomas de eritrocito de pollo a la superficie de la placa , la cual posteriormente se lavó tres veces con 0.1 % de Tween20 en un lavador de placa ELx405. Las placas posteriormente se lcyeron en un lector de placa PerkinElmer para medir la cantidad de oligonucleosoma de eritrocito de pollo etiquetado con 3H enlazado a la superficie Flashplate , medidas como desintegraciones por minutos (dpm) o alternativamente , referidos como conteos por min uto (cpm) Cálcu lo de % de Inhibición En donde dpm = desintegraciones por minuto, cmpd = señal en depósito de ensayo, min y max son los mínimos y máximos controles de señal respectivos.

Ajuste ICso de cuatro parámetros Cuando la parte superior inferior se dejan flotar normalmente, no obstante se pueden fijar en 100 o 0 respectivamente en un ajuste de 3 parámetros. El Coeficiente Hill normalmente permite flotar aunq ue tambien puede fijarse 1 en u n ajuste de 3 parámetros. Y es el % de in hibición y X es la concentración del compuesto.

Los valores IC50 para los ensayos de enzima PRC2 en substratos de péptido (por ejemplo, EZH2 tipo silvestre y Y641 F) se presentan en la tabla 3 que se encuentra más adelante.

Ensayo de Metilación WSU-DLCL2 Se compraron células de suspensión WSU-DLCL2 en DSMZ (Germán Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Brau nschweig, Alemania). Se compraron el Medio RPMI/Glutamax, Penicilina-Estreptomicina, Suero de Bovino Fetal Desactivado por Calor, y D-PBS en Life Technologies, Grand Island, NY, E.U.A. El Amortiguador de Extracción y el Amortiguador de Neutralización (5X) se compraron en Active Motif, Carlsbad, CA, E.U.A. El anticuerpo anti-histona-H3 de conejo se compró en Abeam, Cambridge, MA, E.U.A. Se compraron anti-H3K27me3 de conejo y anti-conejo-lgG conjugado con HRP en Cell Signaling Technology, Danvers, MA, E.U.A. Se compró el substrato TMB “Super Sensible” en BioFX Laboratories, Owings Mills, MD, E.U.A. Se compraron Albúmina de Suero de Bovino IgG-libre en Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, E.U.A. Se compró PBS con Tween (10X PBST) en KPL, Gaitersburg, MD, E.U.A. Se compró Ácido Sulfúrico en Ricca Chemical, Arlington, TX, E.U.A. Se compraron placas ELISA Immulon en Thermo, Rochester, NY, E.U.A. Se compraron placas de cultivo celular de fondo V en Corning Inc., Corning, NY, E.U.A. Se compraron placas de polipropileno de fondo V en Greiner Bio-One, Monroe, NC, E.U.A.

Se mantuvieron las celulas de suspensión WSU-DLCL2 en el medio de crecimiento (RPMI 1640 suplementado con 10% v/v de suero de bovino fetal desactivado por calor y 100 unidades/mL de penicilina-estreptomicina) y se cultivó a una temperatura de 37°C bajo 5% CO2. Bajo las condiciones de ensayo, las células fueron incubadas en un Medio de Ensayo (RPMI 1640 suplementado con 20% v/v de suero de bovino fetal desactivado por calor y 100 un idades/m L de penicilina-estreptomicina) a una temperatura de 37°C bajo 5% CO2 en un agitador de placa.

Se sembraron celulas WS U-D LC L2 en medio de ensayo en una concentración de 50 ,000 células por mL en una placa de cultivo celular de fondo V de 96 depósitos con 200 mI_ por depósito. El compuesto (1 p l_) de las placas de fuente de 96 depósitos se ag regó directamente en u na placa de célula de fondo V. las placas se incubaron en u n agitador de placa de titulación en u na temperatura de 37°C, 5% C02 d urante 96 horas. Después de cuatro d ías de incubación , las placas se giraron en 241 x g durante cinco minutos y se aspiró suavemente el medio de cada depósito de la placa celular sin pertu rbar el pelet celular. El pelet se resuspendió en 200 mL de DPBS y las placas de giraron nuevamente en 241 x g durante cinco minutos. El sobrenadante se aspiró y se agregó por depósito amortiguador de Extracción (100 mI_) frío (4°C) . Las placas se incubaron a una temperatu ra de 4°C en un agitador orbital durante dos horas. Las placas se giraron en 3427 x g x durante 10 minutos. Se transfirió el sobrenadante (80 pL por depósito) a su depósito respectivo en u na placa de polipropileno del fondo V de 96 depósitos. Se agregó el Amortiguador de Neutralización 5X (20 p L por depósito) a la placa de polipropileno de fondo V que contiene el sobrenadante. Las placas de polipropileno del fondo V que contienen la preparación de histona cruda (CH P) se incubaron en un agitador orbital d urante cinco minutos. Se ag regaron las Preparaciones de Mistona Cruda (2 mL por depósito) a cada depósito respectivo en placas ELISA de 96 depósitos por duplicado que contienen 100 mL, de Amortiguador de Recubrimiento (1 X PBS + BSA 0.05% p/v) . Las placas se sellaron e incubaron durante la noche a una temperatu ra de 4°C . Al siguiente día, las placas se lavaron tres veces con 300 p L por depósito 1 X PBST. Los depósitos se bloquearon durante dos horas con 300 pL, por depósito de Diluyente ELISA ((PBS (1 X) BSA (2% p/v) y Tween20 (0.05% v/v)). Las placas se lavaron tres veces con 1 X PBST. Para la placa de detección de H istona H3, se agregaron 100 pL por depósito de anticuerpo anti-Histona-H3 (Abeam, abl791 ) diluido 1 : 10,000 en Diluyente ELISA. Para la placa de detección de trimetilación H3K27, se ag regaron 100 pL por depósito de anti-H3K27me3 diluido 1 :2000 en diluyente ELISA. Las placas se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con 300 p L 1 X PBST por depósito. Para la detección H istona H3, se agregaron por depósito 100 pL de anticuerpo IgG anti-conejo conjugado con H RP a 1 :6000 en diluyente ELI SA. Para detección H3K27me3, se ag regaron por depósito 100 p L de anticuerpo IgG anti-conejo conjugado HRP d iluido en 1 :4000 en diluyente ELISA. Las placas se incubaron a temperatu ra ambiente durante 90 minutos. Las placas se lavaron cuatro veces con 1 X PBST 300 mI_ por depósito. Se ag regaron 100 mL de substrato TM B por depósito. Las placas de histona H3 se incubaron durante cinco minutos a temperatu ra ambiente. Las placas H3K27me3 se incubaron durante 1 0 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con ácido sulfú rico 1 N (100 pL por depósito). La absorbancia de cada placa se lcyó en 450 nm. Primero, se determinó la proporción de cada depósito mediante: (Valor H3KL27me3 O D50 ) Valor histona H3 OD50 Cada placa incluyó ocho depósitos de control de DMSO únicamente de tratamiento (I nhibición mínima), así como ocho depósitos de control para inhibición máxima (Depósitos de fondo).

El promedio de los valores de proporción de cada tipo de control se calculó y utilizó para determinar el porcentaje de inhibición de cada depósito de prueba en la placa . El compuesto de prueba se diluyó en serie tres veces con DMSO para un total de diez concentraciones de prueba, comenzando en 25 mM . Se determinó el porcentaje de inhibición y se generaron curvas IC5o utilizando depósitos por duplicado por concentración de compuesto. Los valores IC50 para este ensayo se presentan en la Tabla 3 que se encuentran a continuación . 1 ( (Proporción de Muestra de Prueba Individual) - (Proporción Prom. de Fondo) Porcentaje de Inhibición = 100- (Proporción de Inhibición Mínima) - (Proporción Promedio de Fondo) \ Análisis de proliferación cel ular Se compraron celulas de suspensión en DSMZ (Germán Collection of M icroorganisms and Cell Cultu res, Braunschweig, Alemania) . Se compraron el Medio RPM l/Glutamax, Penicilina-Estreptomicina, Suero de Bovino Fetal Desactivado con Calor, y D-PBS en Life Tech nologies, Grand Island , NY, E. U .A. Se compraron placas de 384 depósitos de polipropileno fondo V en Greiner Bio-One, Monroe, NC , E . U .A. Se compraron placas blancas opacas blancas de 384 depósitos de cultivo celular en Perkin Elmer, Waltam , MA, E. U .A. Se compró Cell-Titer Glo® en Promega Corporation , Madison, Wl , E . U .A. Se compró un lector de placa SpectraMax M5 en Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, E. U .A.

Se mantuvieron las células de suspensión WSU-DLCL2 en el med io de crecimiento (RPM I 1640 suplementado con 10% v/v de suero de bovino fetal desactivado por calor y se cultivaron a u na temperatura de 37°C bajo 5% CO2 Bajo las condiciones de ensayo , las células se incubaron en u n Medio de Ensayo (RPMI 1640 suplementado con 20% v/v de suero de bovino fetal desactivado con calor y 100 unidades/mL de penicilina-estreptomicina) a u na temperatura de 37°C bajo 5% C02- Para la evaluación del efecto de los compuestos en la proliferación de la l ínea celular WSU-DLCL2, se revistieron células exponencialmente en crecimiento en placas opacas color blanco de 384 depósitos a una densidad de 1250 celu las/ml en un volumen final de 50 p L del medio de ensayo. Se preparó una placa de fuente de compuesto llevando a cabo diluciones en serie por triplicado de 3 veces de nueve puntos en DM SO, comenzando en 10 mM (la concentración superior final del compuesto en el ensayo fue de 20 mM y el DMSO fue de 0.2%) . Se agregó una alícuota de 100 nL de la placa de existencia del compuesto a su depósito respectivo en la placa celular. El 100% de control de in hibición consistió en células tratadas con una concentración final 200 nM de estaurosporina y el 0% de control de inhibición consistió en células tratadas con DMSO . Después de la adición de los compuestos, las placas de ensayo se incubaron d u rante 6 días a una temperatura de 37°C , condiciones 5% CO2, humedad relativa > 90% du rante 6 días. La viabilidad celular se midió mediante la cuantificación del ATP presente en los cultivos celulares agregando 35 p L del reactivo Cell Titer Glo® a las placas de depósito. Se lcyó la luminiscencia en el SpectraMax M5. La concentración q ue inhibe la viabilidad celular en un 50% , fue determinado utilizando un ajuste de 4 parámetros de las curvas de respuestas de dosis normalizada. Los valores IC50 de este ensayo se presentan en la tabla 3 que se encuentra a continuación .

Tabla 3 Estudio ln Vivo Línea Celular de Linfoma Humano SUDHL1 0 Ratones Los ratones hembra Fox Chase SC I D® (CB17 llcr-Prkdcscid/lcr\coCr'\ , Beijing Vitalriver Laboratory Animal Co. , LTD) tenían de 6 a 8 semanas de edad y rango de peso corporal (BW) de 16.0-21 .1 g el Día 1 del estudio. Los animales se alimentaron ad libitum con agua (esteril) y alimento en gránulos seco esterilizado por irradiación . Los ratones se alojaron en habitaciones de mazorca de maíz en microaisladores estáticos en un ciclo de luz de 12 horas en 20-22°C (68-72 ° F) y 40-60% de h umedad . Todos los procedimientos cumplieron con las recomendaciones de la Guide for Care and Use of Laboratory Animáis (Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio) con respecto a las restricciones, lavandería, procedimientos quirúrgicos, regulación de alimentos y fluidos y cuidados veterinarios.

Cultivo de Cél ula de Tumor Se obtuvo la línea de célula de linfoma humana SU DHL10 en DSMZ y se mantuvo en CRO como cultivos de suspensión en un medio RPM I-1640 que contiene 100 unidades/mL de sal de sodio de penicilina G, 100 g/mL de estreptomicina y 10% de suero bovino fetal. Las células se cultivaron en frascos de cultivo de tejido en un incubador modificado a temperatura de 37°C , en una atmósfera de 5% C02 y aire 95% . Ú nicamente se utilizaron para el implante los cultivos debajo del pasaje 12. Im plante de Tumor Irt Vivo Se recolectó la línea de célula de linfoma humana SU DHL1 0 durante el crecimiento de fase media-log y se re suspendió en PBS con 50% Matrigel XM (BD Biosciences). Cada ratón recibió 1 x 107 células (0.2 mL suspensión celular) en forma subcutánea en el flanco derecho . Los tumores se calibraron en dos dimensiones para monitorear el crecimiento como el volumen promedio que alcanzó el rango 80-120 mm deseado. El tamaño de tumor, en mm, se calculó a partir de: Volumen de tumor = w2 X 1 2 en donde w = ancho / = longitud , en mm, del tumor. El peso del tumor se estimó con la suposición de que 1 mg es equivalente a 1 mm de volumen de tumor. Después de 10 d ías se clasificaron los ratones con tumores de 72-256 mm en cuatro g rupos (n = 16 por grupo) con volúmenes de tumor promedio de 1 73-1 79 mm3.

Artículos de Prueba Se almacenó el bromhidrato del Compuesto I a temperatu ra ambiente y se protegió de la luz. Cada día de tratamiento, se prepararon formulaciones de compuesto fresca suspendiendo el polvo en 0.5% de carboximetilcelulosa de sodio (NaCM C) y 0.1 % Tween® 80 en agua desionizada. El veh ículo, 0.5% NaC MC y 0.1 % Tween®80 en ag ua desionizada, se utilizó para tratar el grupo de control en el mismo programa. Las formulaciones se almacenaron fuera de la luz a una temperatura de 4°C antes de la administración .

Plan de Tratam iento Los ratones se trataron con dosis de bromhidrato del Compuesto I que fluctúa de 125 - 500 mg/kg en un programa B I D (dos veces al día, cada 12 horas) durante 28 d ías mediante gavage oral . Cada dosis se suministró en un volumen de 0.2 m L/20 g ratón (10 mL/kg), y se ajustó para el último peso registrado de los animales individ uales . El d ía 25 se eligieron los 8 ratones con los tumores más pequeños por g rupo de un punto extremo de retraso de crecimiento de tumor (observación de hasta 60 días) . Los animales restantes fueron eutanizados el d ía 28, 3 horas despues de la última dosis para recolección de tumor.

Anál isis de Volumen de Tumor Promedio (MTV) e Inhibición de Crecim iento de Tumor (TGI) Se determinó la eficacia de tratamiento en el último d ía de tratamiento. MTV(n) , el volumen de tumor promedio para el número de animales, n , evaluable el último d ía, se determinó para cada grupo. Se puede definir varias veces el porcentaje de inhibición de crecimiento de tumor (%TG I) . Primero, se expresó la diferencia entre el MTV(n) del grupo de control designado y el MTV(n) del g rupo tratado con fármaco , como un porcentaje de MTV(n) del g rupo de control : Otra forma para calcular el %TG I es tomando en cuenta el tamaño del tumor del d ía 1 hasta el d ía n, siendo n el último día de tratamiento.

DMT? ^, = M!T{4boG MTVÍl)^ rj-'aí AMTVtratado = MTV (»} tratado - MTV(l}tratado Anál isis de retraso de crecimiento de tumor Se mantuvieron vivos ocho ratones por grupo despues del último d ía de tratamiento para análisis de retraso de crecimiento de tumor. Los tumores se calibraron dos veces a la semana y cada animal de prueba fue eutanizado cuando su neoplasma alcanzó el volumen de punto extremo de 2000 mm o en el último d ía del estudio especificado previamente, lo que fuera primero . Se llevó a cabo análisis de supervivencia Kaplan Meier.

T oxicidad Los animales se pesaron diariamente los d ías 1 a 5, y posteriormente dos veces a la semana hasta el término del estudio. Los ratones se revisaron frecuentemente con respecto a signos de cualquiera efectos secu ndarios relacionados con el tratamiento, adversos, los cuales fueron documentados. Se definió la toxicidad aceptable para la dosis máxima tolerada (MTD) como una perd ida BW promedio del g rupo menor a 20% durante la prueba, y no más del 10% de mortalidad debido a muertes TR. U na muerte era clasificada como TR si era atribuible a los efectos secundarios del tratamiento, tal como se evidencia mediante sig nos clínicos y/o necropsia, o debido a causas desconocidas durante el período de dosificación . U na muerte fue clasificada como NTR si había evidencia de que la muerte no estaba relacionada con los efectos secundarios del tratamiento. Las muertes NTR durante el intervalo de dosificación normalmente pueden ser categorizadas como NTRa (debido a un accidente o error humano) o NTRm (debido a d iseminación de tumor confirmada por necropsia mediante invasión y/o metástasis). Los animales tratados oralmente se murieron de causas desconocidas d u rante períodos de dosificación , se puede clasificar como NTRu cuando el desempeño del grupo no soporta u na clasificación TR, y la necropsia, para descartar un error de dosificación, no es factible.

Muestreo El d ía 28 se mostraron ocho ratones con los tumores más g randes en un modo especificado previamente para evaluar la inhibición objetivo en tumores. Los tumores se recolectaron de ratones específicos bajo condiciones libres de ARNse y se biseccionaron. Se midió el peso de tumor total. El tejido de tumor congelado de cada animal se descongeló en N2 líquido y se pulverizó con mortero.

Anál isis Estadísticos y Gráficos Todos los análisis estad ísticos y gráficos se llevaron a cabo con Prism 3.03 (GrafPad) para Windows. La significancia estad ística de prueba entre los grupos de control y tratados con respecto al tiempo de tratamiento completo , se empleó un curso de med idas ANOVA de repetidas mediante prueba posterior de comparación múltiple de Dunnets. El prisma reporta resultados como no significativos (ns) en P > 0.05 , significativos (simbolizados mediante “*”) en 0.01 < P < 0.05, muy significados en (“**”) en 0.001 < P < 0.01 y extremadamente significativos en (“***") en P < 0.001 . Para la derivación de retraso de crecimiento de tumor del estudio, se presentó el porcentaje de animales en cada grupo que permanece el estudio versus tiempo en u n trazo de supervivencia Kaplan-Meier. Extracción de H istona Para el aislamiento de histonas, se homogenizaron 60-90 mg de tejido de tumor en 1 .5 mi de amortiguador de extracción nuclear (10 mM Tris-HCI , 10 mM MgCI2 , 25 mM KC 1 , 1 % Tritón X-100, 8.6% Sucrosa , más una tableta de inhibidor de proteasa Roche 1 836145) y se incubó en hielo du rante 5 minutos. Los núcleos se recolectaron mediante centrifugación en 600 g d urante 5 minutos a una temperatura de 4°C y se lavaron una vez en PBS. El sobrenadante se eliminó y las histonas se extrajeron durante una hora, con vortizado cada 15 minutos, con 0.4 N de ácido sulfúrico frío. Los extractos se aclararon mediante centrifugación en 10000 g durante 1 0 minutos a una temperatura de 4°C transferidos a un tubo de microcentrifugación fresco q ue contiene un volumen de 10x de acetona enfriada en hielo. Las histonas se precipitaron en -20° C du rante 2 horas en la noche, se peletizaron en 1 0000 g du rante 1 0 minutos y se suspendieron en agua.

ELISA Las histonas se prepararon en concentraciones equivalentes en amortiguador de recubrimiento (PBS + 0.05% BSA) que produce el 0.5 ng/ul de la muestra, y se ag regaron 100 ul de la muestra o estándar por duplicado a placas ELISA 296 depósitos (Thermo Labsystems, Immulon 4H BX #3885) . Las placas se sellaron e incubaron durante la noche a una temperatu ra de 4°C. Al d ía sig uiente, las placas se lavaron 3x con 300 ul/depósito PBST (PBS + 0.05% Tween 20; 10X PBST, KPL #51 -14-02) en u n lavador de placa Bio Tek. Las placas se bloquearon con 300 ul/depósito de diluyente (PBS+2%BSA + 0.05% Tween 20) , se incubaron a temperatura ambiente d urante 2 horas, y se lavaron 3x con PBST. Todos los anticuerpos se diluyeron en diluyentes. Se agregaron a cada placa 1 00 ul/depósito de anti-H3K27me3 (CST #9733, existencia de glicerol al 50% 1 : 1 ,000) o anti-total H3 (Abeam ab1791 , 50% glicerol 1 : 10,000) . Las placas se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente y se lavaron 3x con PBST. Se agregaron 1 00 ul/depósitos de anti-Rb-lgG-H RP (Cell Signaling Tech nology, 7074) 1 :2,000 a la placa de H3K27Me3 y 1 :6,000 a la placa H3 y se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 4X con PBST. Para detección , se ag regaron 100 ul/depósitos de substrato TM B (BioFx Laboratories, #TM BS) y las placas se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 minutos. La reacción se detuvo con 100 ul/depósitos 1 N H2SO4 La absorbancia de 450 nm se lcyó en un lector de Microplaca SpectaMax M5.

Resultados Los ratones que contienen xenomjertos de tumor SUDHL10 se trataron con el bromhid rato del Compuesto I en la máxima dosis tolerada de 500 mg/kg B I D en fracciones de MTD (½ y ¼ MTD). Todas las dosis fueron bien toleradas durante 28 días sin perdida de peso corporal significativa . H ubo una muerte no relacionada con el tratamiento en el grupo de 500 mg/kg el día 1 5 debido a un error de dosificación . Todas las dosis dieron como resultado in hibición de crecimiento de tumor cuando se compararon con el veh ículo el d ía 28 (tabla 4) , y las regresiones ind ucidas por los grupos de 250 mg/kg y 500 mg/kg B I D (TG I > 100%) .

Tabla 4: Síntesis de los valores de inhibición de crecimiento de tumor ind ucidos mediante bromhidrato del Compuesto I en xenomjertos SUDHL10 La figura 12A muestra el crecimiento de los tumores de xenoinjerto SUDHL10 con el tiempo para diferentes grupos de tratamiento. El grupo de 125 mg/kg de BID no fue significativamente diferente del grupo de vehículo mediante las medidas repetidas ANOVA y la prueba posterior de Dunnett, aunque el tamaño de tumor terminal promedio del día 28 fue significativamente mayor que el del grupo de vehículo (ANOVA de 2 vías con prueba posterior de Bonferroni, p < 0.0001). La dosificación de 250 mg/kg de BID y 500 mg/kg de BID del bromhidrato del Compuesto I durante 28 días, indujo respuestas de regresión comparables con el tumor terminal, los pesos el día 28 fueron similares para los 2 grupos (figura 12B).

Las histonas aisladas de tumores recolectados el día 28 (3 horas despues de la última dosis) se sometieron a análisis ELISA para niveles H3K27me3 globales. La figura 13 muestra una clara desregulación dependiente de la dosis de la marca de metilo H3K27me3 contra tratamiento con el bromhidrato del Compuesto I. Esta figura muestra la metilación H3K27me3 global en tumores SUDHL10 de ratones tratados con el bromhidrato del Compuesto I durante 28 d ías.

El d ía 25, se elig ieron ocho ratones por g rupo con los tumores más pequeños para un estudio de retraso de crecimiento de tumor para evaluar el recrecimiento de los tumores despues de detener la dosificación el d ía 28. Los ratones fueron eutanizados cuando sus tumores alcanzaron un tumor de 2000 mm , o el día 60 (lo que fuera primero). Estos datos fueron utilizados para llevar a cabo un análisis de supervivencia de Kaplan Meier. La figura 14A muestra que el recrecimiento de tumor fue claramente dependiente de la dosis, y todos los ratones tratados con la dosis más alta de 500 mg/kg B I D du rante 28 d ías sobrevivieron hasta el día 60. Ú nicamente 2 ratones tuvieron que ser eutanizados en el grupo 250 mg/kg antes del día 60. Los ratones en el grupo de 125 mg/kg tuvieron un claro beneficio de supervivencia con respecto a los ratones tratados con veh ículo, con un incremento en la supervivencia promedio de 15.5 d ías (figura 14B) .

Efecto anti-cáncer del bromhidrato del Compuesto I en modelos de xenomierto en ratón en linfoma de Célula B grande difusa h umana de Pfeiffer El monobromhidrato del Compuesto I se probó para su actividad anti-cáncer en modelo de xenoinjerto de ratón Pfeiffer, el cual es u n modelo de xenoinjerto de linfoma de Célula B difusa humana. A ratones hembras NSG de cinco semanas de edad (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) se les implantó subcutáneamente con 20 a 25 mg de fragmentos de tumor. El tratamiento se inició aproximadamente 31 d ías después del implante de tumor, cuando los tumores promedio alcanzaron aproximadamente 365 mm . El esquema de tratamiento se describe en la tabla 5.

Tabla 5. Esquema de Dosificación s Debido al aspecto de tolerancia del compuesto, únicamente se proporcionaron a este grupo 12 dosis diarias El volumen de tumor se siguió a lo largo del experimento. El volumen de tumor se midió dos veces a la semana después del inicio del tratamiento . Se calculó la carga de tumor (mg = mm3) a partir de las medidas de calibre mediante la fórmula para el volumen de un elipsoide oblongo (LxWz)/2 en donde L y W son las medidas de longitud y ancho ortogonales respectivas.

El día 1 fue el día del primer tratamiento, y el Día 28 fue el d ía del último tratamiento. Este estudio se determinó 36 d ías después de la última dosis, de modo que el Día 64 fue el día del término del estudio. Los pu ntos extremos primarios utilizados para evaluar la eficacia en este estudio fueron regresiones de tumor completas (CR), los tamaños del tumor entre los grupos y el porcentaje de inhibición del tumor al final del estudio . Se definió la respuesta completa como una disminución en el tamaño de tumor hasta un tamaño hasta indetectable (< 20mm3) al final del estudio. Los valores para el porcentaje de inhibición del tumor se calcularon a partir de la fórmula [1 -(DT/DO)] x 100, en donde DT y AC son cambios en el volumen de tumor promedio (crecimiento A) para cada grupo de control tratado (T) y con veh ículo (C) . T0 y C0 (un d ía antes de la primera dosis) se utilizaron para el inicio del volumen del tumor. Además, los volúmenes de tumor que se tomaron el día u no despues de la ú ltima dosis (T29 y C29) se utilizaron para el cálculo de DT y DO. Cuando el valor fue mayor a 100%, se concluyó como el 1 00% . La fórmula utilizada para el cálculo del porcentaje de inicio del tumor se muestra a continuación . porcentaje de inhibición de tumor X 100 % Du rante el período del tratamiento, se descubrió que los animales no pueden tolerar el tratamiento diario de 1 142 g/kg del bromhidrato del Compuesto I , y tres animales en este grupo (g rupo E) requirieron eutanasia después de la primera semana de tratamiento debido a la pérdida además del 20% del peso corporal de línea de base. Por lo tanto, se detuvo la administración de fármaco para este g rupo de 12 dosis. Los animales en los otros tres grupos de dosificación, excepto un animal en el grupo D (342 mg/kg de bromh idrato de Compuesto I) , todos toleraron el tratamiento 28 d ías con una mínima perdida de peso corporal. El peso corporal de ratón relativo fue g raficado en la figu ra. El peso corporal de animal obtenido el d ía 0 se utilizó como el peso corporal de línea de base en la gráfica .

El bromhidrato del Compuesto I mostró actividad anticáncer potente y d uradera en el modelo de Pfeiffer con 100% de rango CR en tres de los cuatro grupos de dosificación (tabla 6). Además, el recrecimiento de tumor no fue observado incluso 36 d ías después del término del tratamiento. Esto sugiere que todas las células de tumor fueron exterminadas durante el tratamiento. Au nque el recrecimiento de tumor se observó en el g rupo con la menor dosificación (g rupo B , 34.2 mg/kg), se observó una clara actividad de estasis de tumor durante el período de tratamiento (figura 16) . El tumor únicamente empezó a crecer al término del tratamiento (figura 16) . Este resultado también sugiere que la actividad de estasis de tumor observada en el grupo B, es de hecho la actividad inducida por el artículo de prueba .

Tabla 6. Tabla de síntesis de resultados múltiple de (Prism versión de software 5.02, Lake Forest, CA). £ se eutanizó 1 animal el día 36 por bajo peso corporal. ¥ se eutanizaron 3 animales los días 7, 9, y 11, individualmente por bajo peso corporal.

Claims (34)

REIVINDICACIONES

1 . Bromhid rato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-dihid ropirid in-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2 H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfol¡nometil)-[1 , 1’-bifen il]-3-carboxamida.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 , el cual es un monobromhidrato.

3. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 2 , en donde el compuesto es cristalino.

4. El compuesto de acuerdo con cualquiera reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto está sustancialmente libre de impurezas.

5. El compuesto de acuerdo con cualquiera reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto es un sólido cristalino sustancialmente libre de bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-d ihidropiridin-3-il)metil)- 5-(etil (tetra h id ro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1 , 1’ - b i f e n i I] - 3-carboxamida amorfo.

6. U na composición farmaceutica que comprende el compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, y un transportador o d iluyente farmacéuticamente aceptables.

7. U n método para preparar el compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 , que comprende combinar N-((4,6-d imetil-2-oxo-1 ,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H- p¡ran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1 , 1’-bifen ¡l]-3-carboxamida con ácido bromh ídrico.

8. Polimorfo A de bromhidrato N-((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-d i h id ro piridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1 , 1’-bifenil]-3-carboxamida.

9. El polimorfo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene uno o más picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, aproximadamente 1 7.5 + /- 0.3 grados, y aproximadamente 22.0 +/- 0.3 grados 2-theta .

10. El polimorfo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-9 , en donde el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, aproximadamente 17.5 +/- 0.3 grados, y aproximadamente 22.0 +/- 0.3 g rados 2-theta.

1 1 . El polimorfo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene uno o más picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, aproximadamente 14.3 +/- 0.3 g rados, aproximadamente 18.7 + /- 0.3 grados, aproximadamente 23.3 +/- 0.3 grados, y aproximadamente 23.6 +/- 0.3 g rados 2-theta.

1 2. El polimorfo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene al menos 5 picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, 10.1 + /- 0.3 grados, 14.3 +/- 0.3 grados, 1 7.5 +/- 0.3 g rados, 18.7 +/-0.3 grados , 20.6 +/- 0.3 g rados, 20.9 +/- 0.3 grados, 21 .8 +/- 0.3 grados, 22.0 +/- 0.3 grados, 23.3 +/- 0.3 grados y 23.6 +/- 0.3 grados 2-theta.

13. El polimorfo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el polimorfo exhibe u n patrón de difracción de rayos X en polvo q ue tiene al menos 6 picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, 10.1 +/-0.3 grados , 14.3 +/- 0.3 grados, 1 7.5 +/- 0.3 g rados, 18.7 +/- 0.3 grados, 20.6 +/- 0.3 grados, 20.9 +/- 0.3 grados, 21 .8 +/- 0.3 grados, 22.0 +/- 0.3 grados , 23.3 +/- 0.3 grados y 23.6 +/-0.3 grados 2-theta.

14. El polimorfo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el polimorfo exhibe u n patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene al menos 7 picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, 10.1 +/-0.3 g rados, 14.3 +/- 0.3 grados , 17.5 +/- 0.3 grados, 18.7 +/- 0.3 g rados, 20.6 + /- 0.3 grados, 20.9 +/- 0.3 grados, 21 .8 +/- 0.3 g rados, 22.0 +/- 0.3 grados , 23.3 +/- 0.3 grados y 23.6 +/-0.3 g rados 2-theta .

15. El polimorfo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene al menos 8 picos característicos expresados en g rados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, 10.1 +/-0.3 g rados, 14.3 +/- 0.3 grados, 1 7.5 +/- 0.3 grados, 18.7 +/- 0.3 g rados, 20.6 +/- 0.3 grados, 20.9 +/- 0.3 g rados, 21 .8 +/-0.3 grados, 22.0 +/- 0.3 grados, 23.3 +/- 0.3 grados y 23.6 +/- 0.3 grados 2-theta.

16. El polimorfo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el polimorfo exhibe u n patrón de difracción de rayos X en polvo q ue tiene al menos 9 picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, 10.1 +/-0.3 grados , 14.3 +/- 0.3 grados, 17.5 +/- 0.3 grados, 18.7 +/- 0.3 grados, 20.6 +/- 0.3 grados, 20.9 +/- 0.3 grados, 21 .8 +/- 0.3 grados, 22.0 +/- 0.3 grados, 23.3 +/- 0.3 g rados y 23.6 +/-0.3 grados 2-theta.

17. El polimorfo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo q ue tiene al menos 10 picos característicos expresados en grados 2-theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, 10.1 + /- 0.3 g rados, 14.3 +/- 0.3 grados, 1 7.5 +/- 0.3 grados, 18.7 +/-0.3 g rados, 20.6 +/- 0.3 g rados, 20.9 +/- 0.3 grados, 21 .8 +/-0.3 grados, 22.0 +/- 0.3 grados, 23.3 +/- 0.3 grados y 23.6 +/-0.3 grados 2-theta.

18. El polimorfo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene picos característicos expresados en grados 2- theta en aproximadamente 3.9 +/- 0.3 grados, 10.1 +/- 0.3 grados, 14.3 +/- 0.3 grados, 17.5 +/- 0.3 g rados, 18.7 +/- 0.3 grados, 20.6 +/- 0.3 g rados, 20.9 + /- 0.3 grados, 21 .8 +/- 0.3 grados, 22.0 +/- 0.3 grados, 23.3 +/- 0.3 grados y 23.6 +/- 0.3 grados 2-theta.

19. El polimorfo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 18, en donde el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente de acuerdo con la figu ra 1 .

20. El polimorfo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 1 9, en donde el polimorfo exhibe un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente de acuerdo con la tabla 1 .

21 . El polimorfo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 20, en donde el polimorfo exhibe un termog rama de calorimetría de exploración diferencial que tiene un pico característico expresado en unidades de °C a temperatu ras de 255 +/- 5°C.

22. El polimorfo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 21 , en donde el polimorfo exhibe un termograma de calorimetría de exploración diferencial sustancialmente de acuerdo con la figura 3.

23. U n metodo para preparar el polimorfo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 22, que comprende combinar ácido bromhídrico de N-((4,6-dimetil-2- oxo- 1 ,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4- ¡l)amino)-4-met¡l-4’-(morfolinomet¡l)-[1 , 1’-bifenil]-3-carboxamida.

24. Un metodo para recristalizar el polimorfo de acuerdo con cualq uiera de las reivindicaciones de la 8 a la 22, que comprende los siguientes pasos: (a) disolver el Polimorfo A en un primer solvente, y (b) agregar un seg undo solvente, de modo que se recristalice el polimorfo.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el primer solvente es etanol, y el segu ndo solvente es MTBE.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende (a) disolver el Polimorfo A en etanol , (b) calentar la mezcla , (c) agregar MTBE a la mezcla, como un precipitado que comprende el polimorfo, y filtrar el precipitado de modo que se recristalice el polimorfo.

27. U na composición farmacéutica que comprende el polimorfo de acuerdo con cualq uiera de las reivindicaciones de la 8 a la 22, y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptables. j

28. U n método para tratar cáncer que comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de u n compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, un polimorfo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 22 , o u na composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 o 27.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el cáncer es linfoma de no Hodgkin o cáncer de seno.

30. Un método para inhibir la actividad de histona metiltransferasa de EZH2 en un sujeto q ue necesita del mismo, en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5 o a polimorfo de acuerdo con cualq uiera de las reivindicaciones de la 8 a la 22.

31 . U n método de para inhibir la actividad de histona metiltransferasa de EZH2 in vitro, en donde el método comprende administrar un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5 o un polimorfo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 22.

32. El uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, o un polimorfo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 22, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer en un sujeto que necesita del mismo.

33. U n método para preparar N-((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahid ro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1 , 1’-bifen il]-3-carboxamida, que comprende hacer reaccionar ácido 5-(Etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1 , 1’-bifenil]-3-carboxílico (5) con sal de 3-(aminometil)-4,6-dimet¡l-dihidro-piridin-2(1 H)-ona.

34. El metodo de acuerdo con la reivindicación 33, en donde (5) está en forma cristalina. RES UM EN Se proporciona en la presente un bromhidrato de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1 ,2,-dihid ropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1 , 1 ' - b i fe n i I] - 3 -carboxamida. Tambien se proporciona en la presente una forma polimorfa particular de este compuesto.