BR112014025508B1

BR112014025508B1 - forma de sal de um inibidor de histona metiltransferase ezh2 humana

Info

Publication number: BR112014025508B1
Application number: BR112014025508-3A
Authority: BR
Inventors: Kevin Wayne Kuntz; Kuan-Chun Huang; Hyeong Wook Choi; Kristen Sanders; Steven Mathieu; Arani Chanda; Frank Fang
Original assignee: Eisai R&D Management Co., Ltd.; Epizyme, Inc.
Priority date: 2012-04-13
Filing date: 2013-04-11
Publication date: 2020-11-17
Also published as: IL282732A; JP6255382B2; PT2836491T; RU2014145544A; JP6634058B2; AU2013245878B2; SI3184523T1; HUE060881T2; CY1119383T1; SMT201700132T1; AU2018200168B2; SG10201608577RA; MX2014012380A; WO2013155317A1; CN108358899B; AU2018200168A1; EP4190777A1; CA2870005A1; EP3184523B1; US20230140327A1

Abstract

forma de sal de um inibidor de histona metiltransferase ezh2 humana é aqui fornecido hidrobrometo de n-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetra-hidro-2h-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida. também é aqui fornecida uma forma polimorfa particular deste composto.

Description

PEDIDO RELACIONADO

[001]Este pedido reivindica prioridade para, e o benefício de, pedido provisório U.S. N2 61/624.215, depositado em 13 de Abril de 2012, todo o conteúdo do qual está aqui incorporado, como referência, em sua totalidade.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002]Mais de 1,6 milhões de pessoas são estimadas para ser diagnosticadas com câncer em 2012. Por exemplo, o tipo mais comum de câncer em mulheres é o câncer de mama, e esta doença é responsável por uma das mais altas taxas de mortalidade de todos os cânceres que afetam as mulheres. O tratamento atual de câncer de mama é limitado a total, ou parcial, mastectomia, radioterapia, ou quimioterapia. Quase 230.000 dos casos de câncer em 2012 serão câncer de mama, que resultarão em um número estimado de 40.000 mortes. Veja, Siegel et al., Ca Cancer JClin 2012; 62: 10-29.

[003]Várias mortes por câncer são causadas por cânceres do sangue incluindo leucemias, mielomas e linfomas. Em 2012, quase 80.000 dos casos de câncer serão linfomas, que resultarão em um número estimado de 20.000 mortes.

[004]Radioterapia, quimioterapia e cirurgia são os principais métodos de tratamento de câncer. Entretanto, estas terapias são mais bem sucedidas apenas quando o câncer é detectado em um estágio inicial. Uma vez que o câncer atinge estágios invasivos/metastático, linhagens de células invasoras ou células de metástase pode escapar à detecção, assim, resultando em reincidência, que necessita o uso de terapia que é altamente tóxica. Neste ponto, tanto as células cancerosas quanto as células não afetadas de pacientes são expostas à terapia tóxica, resultando, entre outras complicações, um enfraquecimento do sistema imunitário.

[005]Como tal, permanece uma necessidade na técnica para novos métodos para tratar o câncer, tal como câncer de mama ou linfomas, em um paciente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006]Consequentemente, é aqui fornecido hidrobrometo de N-((4,6-dimetil-2-oxo- 1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’- (morfolinometil)-[1,1 ’-bifenil]-3-carboxamida:

[007]Também é aqui fornecida uma forma polimorfa particular de hidrobrometo de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4- il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-carboxamida (“Polimorfo A”, ou “Polimorfo A de hidrobrometo de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-5- (etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3- carboxamida”). Como aqui descrito, o sal de hidrobrometo aqui fornecido, assim como Polimorfo A, exibem propriedades físicas que podem ser explorados de modo a obter novas propriedades farmacológicas e, que podem ser utilizados no desenvolvimento de substância de fármaco e produto de fármaco.

[008]Em uma forma de realização, o hidrobrometo é cristalino. Em uma outra forma de realização, o hidrobrometo é substancial mente livre de impurezas. Em uma outra forma de realização, o hidrobrometo é um sólido cristalino substancialmente livre de hidrobrometo de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-5- (etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3- carboxamida amorfo.

[009]Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma composição farmacêutica compreendendo o hidrobrometo descrito acima, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[010]Em um aspecto, o hidrobrometo descrito acima é preparado usando um método compreendendo a combinação de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3- il)metil)-5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1 ’-bifenil]- 3-carboxamida com ácido bromídrico.

[011]O Polimorfo A de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-5- (etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3- carboxamida pode ser definido de acordo ram o seu padrão de difração em pó de raios X. Consequentemente, em uma forma de realização, o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo um ou mais picos característicos expressados em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, cerca de 17,5 +/- 0,3 graus, e cerca de 22,0 +/- 0,3 graus 2-teta. Em uma outra forma de realização, o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo picos característicos expressados em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, cerca de 17,5 +/- 0,3 graus, e cerca de 22,0 +/- 0,3 graus 2-teta. Em ainda uma outra forma de realização, o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo picos característicos expressados em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, 10,1 +/- 0,3 graus, 14,3 +/- 0,3 graus, 17,5 +/- 0,3 graus, 18,7 +/- 0,3 graus, 20,6 +/- 0,3 graus, 20,9 +/- 0,3 graus, 21,8 +/- 0,3 graus, 22,0 +/- 0,3 graus, 23,3 +/- 0,3 graus e 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta. Em ainda uma outra forma de realização, o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X substancialmente de acordo com a Figura 1. Em uma outra forma de realização, o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X substancialmente de acordo com a Tabela 1.

[012]O Polimorfo A também pode ser definido de acordo com seu termograma de calorimetria diferencial de varredura. Em uma forma de realização, o polimorfo exibe um termograma de calorimetria diferencial de varredura tendo um pico característico expressado em unidades de °C em uma temperatura de 255 +/- 5 °C. Em uma forma de realização, o polimorfo exibe um termograma de calorimetria diferencial de varredura substancialmente de acordo com a Figura 3.

[013]Em um aspecto, o Polimorfo A é preparado usando um método compreendendo a combinação de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)- 5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3- carboxamida com ácido bromídrico.

[014]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de recristalizar Polimorfo A, que compreende as seguintes etapas: (a) dissolver Polimorfo A em um primeiro solvente, e (b) adicionar um segundo solvente, tal que o dito polimorfo é recristalizado. Em uma forma de realização, o primeiro solvente é etanol, e o segundo solvente é MTBE. Em uma outra forma de realização, o método compreende (a) dissolver Polimorfo A em etanol, (b) aquecer a mistura, (c) adicionar MTBE à mistura, formando um precipitado compreendendo o dito polimorfo, e filtrando o precipitado tal que o dito polimorfo é recristalizado.

[015]Em ainda um outro aspecto, é aqui fornecida uma composição farmacêutica compreendendo Polimorfo A, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[016]Também é aqui fornecido um método de tratar o câncer compreendendo administrar a um sujeito em necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto hidrobrometo descrito acima, Polimorfo A, ou uma composição farmacêutica compreendendo quaisquer destes compostos. Uma variedade de cânceres pode ser tratada, incluindo linfoma de não-Hodgkin ou câncer de mama.

[017]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de inibir a atividade histona metiltransferase de EZH2 em um sujeito em necessidade deste compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do composto hidrobrometo descrito acima, Polimorfo A, ou uma composição farmacêutica compreendendo quaisquer destes compostos.

[018]Em ainda um outro aspecto, é aqui fornecido um método de inibir a atividade histona metiltransferase de EZH2 in vitrocompreendendo administrar o composto hidrobrometo descrito acima, ou Polimorfo A.

[019]Também é aqui fornecido o uso do composto hidrobrometo descrito acima, Polimorfo A, ou uma composição farmacêutica compreendendo quaisquer destes compostos, para a preparação de um medicamento para o tratamento de câncer em um sujeito em necessidade deste.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[020]A Figura 1 representa o padrão de difração em pó de raios X de Polimorfo A (mono-hidrobrometo).

[021]A Figura 2 representa o padrão de difração em pó de raios X do di- hidrobrometo de Composto I.

[022]A Figura 3 representa o termograma de calorimetria diferencial de varredura de Polimorfo A.

[023]A Figura 4 representa a sorção de vapor dinâmico de Polimorfo A, que demonstra a higroscopicidade baixa deste composto.

[024]A Figura 5 representa análise de HPLC de Polimorfo A durante três dias em uma temperatura elevada. O Polimorfo A produziu impurezas mínimas durante este tempo.

[025]A Figura 6 representa a sorção de vapor dinâmico do sal de sódio de Composto I, que demonstra a higroscopicidade significante deste composto.

[026]A Figura 7 representa a sorção de vapor dinâmico do sal de hemissulfato de Composto I, que demonstra que este composto tem higroscopicidade moderadamente alta.

[027]A Figura 8 mostra os dados de calorimetria diferencial de varredura do sal de mono-cloridreto de Composto I, que indica que este composto é deficientemente cristalino.

[028]A Figura 9 representa o padrão de difração em pó de raios X de intermediário sintético 5.

[029]A Figura 10 representa o padrão de difração em pó de raios X de Polimorfo B.

[030]A Figura 11 representa a estrutura cristalina de raios X do mono- hidrobrometo de Composto I.

[031]As Figuras 12 a 14 mostram os resultados de estudos in vivo do hidrobrometo de Composto I em uma linhagem celular de linfoma humana.

[032]As Figuras 15 a 16 mostram o efeito anti-câncer do hidrobrometo de Composto I em um modelo de xenoenxerto de camundongo de linfoma.

[033]As Figura 17 representa o padrão de difração em pó de raios X de intermediário sintético 2.

[034]As Figuras 18A e B representam (A) o padrão de difração em pó de raios X do sal de tricloridreto de Composto I e (B) a sorção de vapor dinâmico do sal de mono-cloridreto de Composto I, que demonstra a higroscopicidade significante deste composto.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Forma de Sal de HBr e Forma Polimorfa A

[035]É aqui fornecido hidrobrometo de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3- il)metil)-5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]- 3-carboxamida:

[036]Como aqui usado, o “Composto I” refere-se a N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di- hidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’- (morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-carboxamida. O hidrobrometo de Composto I pode ser usado para inibir a atividade histona metiltransferase de EZH2, em um sujeito ou in vitro. O hidrobrometo de Composto I também pode ser usado para tratar o câncer em um sujeito em necessidade deste.

[037]O Composto I pode ser protonado em um ou mais de seus sítios básicos, tais como a porções de morfolina, anilina dissubstituída e/ou piridona. Consequentemente, em certas formas de realização, é aqui fornecido o mono- hidrobrometo, di-hidrobrometo ou tri-hidrobrometo de Composto I. Em uma forma de realização, é aqui fornecido o mono-hidrobrometo de Composto I. Quando o composto é o mono-hidrobrometo, o composto pode ser protonado em qualquer sítio básico. Em uma forma de realização não limitante, o Composto I é protonado no nitrogênio do substituinte morfolino, fornecendo um mono-hidrobrometo de Composto I tendo a seguinte estrutura:

[038]Este mono-hidrobrometo particular pode ser referido como “brometo de 4- ((3’-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-5’-(etil(tetra-hidro-2H- piran-4-il)amino)-4’-metil-[1,1’-bifenil]-4-il)metil)morfolin-4-io”. A Figura 11 representa a estrutura cristalina de raios X desta forma de sal particular.

[039]O hidrobrometo de Composto I tem várias propriedades físicas vantajosas sobre a sua forma de base livre, assim como, outros sais da base livre. Em particular, o hidrobrometo de Composto I tem higroscopicidade baixa em comparação com outras formas de sal de Composto I. Para um composto ser eficaz em terapia, é geralmente necessário que o composto seja minimamente higroscópico. As formas de fármaco que são altamente higroscópicas podem ser instáveis, como a taxa de dissolução de forma de fármaco pode mudar conforme é armazenada em ambientes com variação de umidade. Também, a higroscopicidade pode impactar manejo e fabricação em grande escala de um composto, como pode ser difícil determinar o peso verdadeiro de um agente ativo higroscópico quando preparando uma composição farmacêutica compreendendo este agente. O hidrobrometo de Composto I tem uma higroscopicidade baixa em comparação com outras formas de sal de Composto I. Como tais, pode ser armazenado durante períodos apreciáveis, e não sofre alterações prejudiciais em, por exemplo, solubilidade, densidade, ou mesmo composição química. Além das vantagens acima, o hidrobrometo de Composto I pode ser produzido em uma forma altamente cristalina, que é útil na preparação de formulações farmacêuticas, e melhorará o manejo, manipulação e armazenamento geral do composto de fármaco. Em uma forma de realização preferida, a forma cristalina do hidrobrometo de Composto I está em uma forma referida como “Polimorfo A”.

[040]A capacidade de uma substância existir em mais do que uma forma de cristal é definida como polimorfismo; as formas de cristal diferentes de uma substância particular são referidas como “polimorfos”. Em geral, o polimorfismo é afetado pela capacidade de uma molécula de uma substância mudar sua conformação ou para formar interações inter-moleculares ou intra-moleculares diferentes, particularmente, ligações de hidrogênio, que é refletida em arranjos de átomos diferentes na estrutura de cristal de polimorfos diferentes. Ao contrário, a forma externa global de uma substância é conhecida como “morfologia”, que refere- se à forma externa do cristal e as superfícies planas presentes, sem referência à estrutura interna. Os cristais podem exibir morfologia diferente com base em condições diferentes, tais como, por exemplo, taxa de crescimento, agitação, e a presença de impurezas.

[041]Os polimorfos diferentes de uma substância podem possuir energias diferentes da estrutura de cristal e, assim, em estado sólido eles podem mostrar propriedades físicas diferentes, tais como forma, densidade, ponto de fusão, cor, estabilidade, solubilidade, taxa de dissolução, etc., que pode, por sua vez, afetar a estabilidade, taxa de dissolução e/ou biodisponibilidade de um determinado polimorfo e sua adequação para o uso como uma substância farmacêutica e em composições farmacêuticas.

[042]O Polimorfo A é altamente cristalino, e exibe higroscopicidade baixa. Também, este polimorfo pode ser obtido reprodutivamente, e ligeiras alterações em condições de cristalização não resultam em formas de cristal diferentes.

[043]O acesso a polimorfos diferentes do hidrobrometo de Composto I é desejável por várias razões. Uma razão é que os polimorfos individuais podem incorporar impurezas diferentes, ou resíduos químicos, mediante a cristalização. Por exemplo, as impurezas podem ser removidas durante o processo de revestimento do Composto I em Polimorfo A.

[044]Sem pretender estar limitado pela teoria, a forma polimorfa que exibe formas de cristal compactas possui vantagens em termos de facilidade de filtração e facilidade de fluxo. O Polimorfo A exibe uma forma de cristal compacta que, portanto, possui estas vantagens.

[045]Em certas formas de realização, o Polimorfo A é identificável na base de picos característicos em uma análise de difração em pó de raios X. A difração em pó de raios X, também referida como XRPD, é uma técnica científica usando difração em pó de raios X, nêutrons ou elétrons, microcristalino, ou outros materiais sólidos para a caracterização estrutural destes materiais. Em uma forma de realização, o Polimorfo A exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo um ou mais picos característicos expressados em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, cerca de 17,5 +/- 0,3 graus, e cerca de 22,0 +/- 0,3 graus 2-teta. Em uma outra forma de realização, o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo picos característicos expressados em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, cerca de 17,5 +/- 0,3 graus, e cerca de 22,0 +/- 0,3 graus 2-teta.

[046]Em uma forma de realização, o Polimorfo A exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo pelo menos 5 picos característicos expressados em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, 10,1 +/- 0,3 graus, 14,3 +/- 0,3 graus, 17,5 +/- 0,3 graus, 18,7 +/- 0,3 graus, 20,6 +/- 0,3 graus, 20,9 +/- 0,3 graus, 21,8 +/- 0,3 graus, 22,0 +/- 0,3 graus, 23,3 +/- 0,3 graus e 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta. Em uma outra forma de realização, o Polimorfo A exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo pelo menos 6 picos característicos expressados em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, 10,1 +/- 0,3 graus, 14,3 +/- 0,3 graus, 17,5 +/- 0,3 graus, 18,7 +/- 0,3 graus, 20,6 +/- 0,3 graus, 20,9 +/- 0,3 graus, 21,8 +/- 0,3 graus, 22,0 +/- 0,3 graus, 23,3 +/- 0,3 graus e 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta. Ainda em uma outra forma de realização, o Polimorfo A exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo pelo menos 7 picos característicos expressados em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, 10,1 +/- 0,3 graus, 14,3 +/- 0,3 graus, 17,5 +/- 0,3 graus, 18,7 +/- 0,3 graus, 20,6 +/- 0,3 graus, 20,9 +/- 0,3 graus, 21,8 +/- 0,3 graus, 22,0 +/- 0,3 graus, 23,3 +/- 0,3 graus e 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta. Em uma outra forma de realização, o Polimorfo A exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo pelo menos 8 picos característicos expressados em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, 10,1 +/- 0,3 graus, 14,3 +/- 0,3 graus, 17,5 +/- 0,3 graus, 18,7 +/- 0,3 graus, 20,6 +/- 0,3 graus, 20,9 +/- 0,3 graus, 21,8 +/- 0,3 graus, 22,0 +/- 0,3 graus, 23,3 +/- 0,3 graus e 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta. Em ainda uma outra forma de realização, o Polimorfo A exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo pelo menos 9 picos característicos expressados em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, 10,1 +/- 0,3 graus, 14,3 +/- 0,3 graus, 17,5 +/- 0,3 graus, 18,7 +/- 0,3 graus, 20,6 +/- 0,3 graus, 20,9 +/- 0,3 graus, 21,8 +/- 0,3 graus, 22,0 +/- 0,3 graus, 23,3 +/- 0,3 graus e 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta. Ainda em uma outra forma de realização, o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo pelo menos 10 picos característicos expressados em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, 10,1 +/- 0,3 graus, 14,3 +/- 0,3 graus, 17,5 +/- 0,3 graus, 18,7 +/- 0,3 graus, 20,6 +/- 0,3 graus, 20,9 +/- 0,3 graus, 21,8 +/- 0,3 graus, 22,0 +/- 0,3 graus, 23,3 +/- 0,3 graus e 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta.

[047]Em ainda uma outra forma de realização, o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo picos característicos expressados em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, cerca de 14,3 +/- 0,3 graus, cerca de 18,7 +/- 0,3 graus, cerca de 23,3 +/- 0,3 graus, e cerca de 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta.

[048]Em ainda uma outra forma de realização, o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo picos característicos expressados em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, cerca de 10,1 +/- 0,3 graus, cerca de 14,3 +/- 0,3 graus, cerca de 17,5 +/- 0,3 graus, cerca de 18,7 +/- 0,3 graus, cerca de 20,6 +/- 0,3 graus, cerca de 20,9 +/- 0,3 graus, cerca de 21,8 +/- 0,3 graus, cerca de 22,0 +/- 0,3 graus, cerca de 23,3 +/- 0,3 graus e cerca de 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta. Ainda em uma outra forma de realização, o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X substancialmente de acordo com a Figura 1. Em uma outra forma de realização, o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X substancialmente de acordo com os valores de 2-teta listados na Tabela 1.

[049]Como aqui usado, o termo “cerca de”, quando usado em referência a um grau 2-teta valor refere-se ao valor estabelecido +/- 0,3 graus 2-teta.

[050]As composições farmacêuticas compreendendo Polimorfo A podem ser identificadas por comparação dos padrões de difração em pó de raios X das composições a um padrão de difração em pó de raios X de Polimorfo A. Será avaliado que as composições farmacêuticas compreendendo Polimorfo A podem exibir padrões de difração em pó de raios X não-idênticos como em comparação com um padrão de difração em pó de raios X de Polimorfo A puro.

[051]Em certas formas de realização, o Polimorfo A é identificável na base de um pico característico observado em um termograma de calorimetria diferencial de varredura. A calorimetria diferencial de varredura, ou DSC, é uma técnica termoanalítica, em que a diferença na quantidade de calor necessária para aumentar a temperatura de uma amostra e referência é medida como uma função de temperatura. Em uma forma de realização, o Polimorfo A exibe um termograma de calorimetria diferencial de varredura tendo um pico característico expressado em unidades de °C em uma temperatura de cerca de 255 +/- 5 °C. Em uma outra forma de realização, o Polimorfo A exibe um termograma de calorimetria diferencial de varredura tendo um único pico endotérmico observado na faixa de temperatura de 250 a 255 °C. Em uma outra forma de realização, o Polimorfo A exibe um termograma de calorimetria diferencial de varredura substancialmente de acordo com a Figura 3.

[052]Em certas formas de realização, o Polimorfo A pode conter impurezas. Os exemplos não limitantes de impurezas incluem forma polimorfa indesejada, ou moléculas orgânicas e inorgânicas residuais, tais como solventes, água ou sais. Em uma forma de realização, o Polimorfo A é substancialmente livre de impurezas. Em uma outra forma de realização, o Polimorfo A contém menos do que 10 % em peso de impurezas totais. Em uma outra forma de realização, o Polimorfo A contém menos do que 5 % em peso de impurezas totais. Em uma outra forma de realização, o Polimorfo A contém menos do que 1 % em peso de impurezas totais. Ainda em uma outra forma de realização, o Polimorfo A contém menos do que 0,1 % em peso de impurezas totais.

[053]Em certas formas de realização, o Polimorfo A é um sólido cristalino substancialmente livre de hidrobrometo de Composto I amorfo. Como aqui usado, o termo “substancialmente livre de hidrobrometo de Composto I amorfo” significa que o composto não contém quantidade significante de hidrobrometo de Composto I amorfo. Em certas formas de realização, pelo menos cerca de 95 % em peso de Polimorfo A cristalino estão presentes. Em ainda outras formas de realização da invenção, pelo menos cerca de 99 % em peso de Polimorfo A cristalino estão presentes.

[054]Em uma outra forma de realização, o Polimorfo A é substancialmente livre de Polimorfo B.

[055]O sal da invenção, e sua forma de cristal de Polimorfo A, pode ser encontrado junto com outras substâncias ou pode ser isolado. Em algumas formas de realização, o sal da invenção, ou sua forma de cristal, é substancialmente isolado. Por “substancialmente isolado” significa que o sal ou sua forma de cristal é pelo menos parcialmente ou substancialmente separado a partir do ambiente, em que ele foi formado ou detectado. A separação parcial pode incluir, por exemplo, uma composição enriquecida no sal da invenção. A separação substancial pode incluir composições contendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 97 %, ou pelo menos cerca de 99 % em peso do hidrobrometo de Composto I e Polimorfo A. Os métodos para isolar os compostos e seus sais são de rotina na técnica.

[056]Tanto o hidrobrometo de Composto I quanto o Polimorfo A podem ocorrer como qualquer tautômero razoável, ou uma mistura de tautômeros razoáveis. Como aqui usado, o “tautômero” refere-se a um de dois ou mais isômeros estruturais que existem em equilíbrio e são facilmente convertidos a partir de uma forma isomérica para uma outra. Os exemplos incluem tautômeros ceto-enol, tais como acetona/propen-2-ol, e semelhantes. O hidrobrometo de Composto I e Polimorfo A podem ter um ou mais tautômeros e, portanto, incluem vários isômeros, isto é, piridin-2(1H)-ona e o piridin-2-ol correspondente. Todas as tais formas isoméricas destes compostos são expressamente incluídas na presente invenção. Preparação de Forma de Sal de HBr e Polimorfo A

[057]O hidrobrometo de Composto I, assim como, Polimorfo A, pode ser preparado usando técnicas conhecidas. Convencionalmente, uma forma de sal é preparada combinando em solução o composto de base livre e um ácido contendo o ânion da forma de sal desejada e, em seguida, isolando o produto de sal de sólido a partir da solução de reação (por exemplo, por cristalização, precipitação, evaporação, etc.). Outras técnicas formadoras de sal podem ser utilizadas.

[058]O Esquema 1 abaixo esboça uma forma de realização particular para a produção da base livre de Composto I, assim como, o hidrobrometo de Composto I. Brevemente, 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metila (1) é reagido com di-hidro- 2H-piran-4(3H)-ona sob condições de aminação redutiva para formar 5-bromo-2- metil-3-((tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)benzoato de metila (2) na etapa 1. Na etapa 2, a aminação redutiva é novamente usada para formar 5-bromo-3-(etil(tetra-hidro- 2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoato (3). Este composto é, em seguida, reagido sob condições de acoplamento Suzuki na etapa 3 para formar 5-(etil(tetra-hidro-2H-piran- 4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-carboxilato de metila (4), que é hidrolisado ao ácido correspondente (5) na etapa 4. Na etapa 5, ácido (5) é reagido sob condições de reação de acoplamento de amida com cloridreto de 3- (aminometil)-4,6-dimetil-di-hidro-piridin-2(1H)-ona para formar o Composto I.

[059]Como mostrado, o Composto I pode ser, em seguida, reagido com HBr aquoso para formar o hidrobrometo de Composto I.

[060]A síntese descrita acima tem várias vantagens. Por exemplo, utiliza vários intermediários que podem ser preparados nas formas cristalinas que podem ser isoladas. Usando intermediários cristalinos, as técnicas de purificação mínima (por exemplo, cromatografia) são necessárias, levando a um rendimento global melhorado de Composto I final.

[061]Consequentemente, é aqui fornecido composto intermediário 1 na forma cristalina. Em uma outra forma de realização, é aqui fornecido composto intermediário 2 na forma cristalina. A Figura 17 mostra um padrão de difração em pó de raios X de composto cristalino 2. Em ainda uma outra forma de realização, o composto intermediário 5 é cristalino. A Figura 9 mostra um padrão de difração em pó de raios X de composto cristalino 5. Em outras formas de realização, os Compostos 2 e/ou 5 são produzidos na forma substancialmente pura sem o uso de cromatografia. Será avaliado pelo técnico habilitado que a cristalização de intermediários não necessariamente procede facilmente ou eficientemente.

[062]Também é aqui fornecido um método de preparar N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2- di-hidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’- (morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-carboxamida compreendendo reagir ácido 5-(etil(tetra- hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1 ’-bifenil]-3-carboxílico (5) com um sal de 3-(aminometil)-4,6-dimetil-di-hidro-piridin-2(1H)-ona. Em uma forma de realização deste método, (5) é na forma cristalina.

[063]O Composto I pode ser reagido com HBr aquoso na presença de um solvente apropriado para formar o Polimorfo A, uma forma de cristal particular do hidrobrometo. Em uma forma de realização, o Composto I é reagido com HBr aquoso na presença de etanol e acetato de etila para formar o Polimorfo A.

[064]Uma vez que o polimorfo é preparado, pode ser recristalizado, usando o mesmo solvente (ou solventes) que foram usados para preparar o polimorfo, ou um solvente diferente (ou solventes), para produzir uma composição que tem cristalinidade aumentada. Em geral, o Polimorfo A pode ser recristalizado dissolvendo o polimorfo em um ou mais solventes, opcionalmente aquecendo, seguido por uma etapa de esfriamento opcional e, em seguida, isolando a estrutura cristalina, por exemplo, através de uma etapa de filtragem. Após o polimorfo ser inicialmente dissolvido no primeiro solvente (ou combinação de solventes), um solvente diferente adicional pode ser adicionado em qualquer ponto no processo (antes ou depois de aquecer, antes ou depois de esfriar, etc.) para produzir a estrutura cristalina desejada. Por exemplo, um primeiro solvente pode ser usado para dissolver o composto polimorfo e, em seguida, um segundo solvente (por exemplo, um anti-solvente) pode ser adicionado para fazer o polimorfo precipitar a partir da solução. Em uma forma de realização, água é adicionada ao primeiro solvente para auxiliar na dissolução do polimorfo.

[065]Os exemplos não limitantes de solventes que podem ser usados para a recristalização de Polimorfo A são como seguem: metanol, etanol, acetato de etila, éter metil terc-butílico, água, álcool isopropílico, tetra-hidrofurano, acetona, acetonitrila, e 2-metiltetra-hidrofurano, assim como combinações destes. Os exemplos não limitantes de combinações de solvente que são úteis para a recristalização de Polimorfo A são (solvente e anti-solvente, em que água pode ser adicionada ao primeiro solvente para auxiliar na dissolução do polimorfo): metanol/água e acetato de etila, álcool isopropílico/água e acetato de etila, tetra- hidrofurano/água e acetato de etila, acetona e acetato de etila, acetonitrila/água e acetato de etila, etanol/água e éter metil terc-butílico, álcool isopropílico/água e éter metil terc-butílico, etanol/água e tetra-hidrofurano, álcool isopropílico/água e acetona, e etanol/água e acetato de etila. Em formas de realização particulares, as combinações de solvente são metanol/água e acetato de etila, álcool isopropílico/água e acetato de etila, etanol/água e 2-metiltetra-hidrofurano, e metanol/2-metiltetra-hidrofurano.

[066]Em um aspecto, o Polimorfo A é preparado usando um método compreendendo a combinação de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)- 5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3- carboxamida com ácido bromídrico.

[067]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de recristalizar o Polimorfo A, que compreende as seguintes etapas: (a) dissolver o Polimorfo A em um primeiro solvente, e (b) adicionar um segundo solvente, tal que o dito polimorfo é recristalizado. Em uma forma de realização, o primeiro solvente é etanol, e o segundo solvente é MTBE. Em uma outra forma de realização, o método compreende (a) dissolver Polimorfo A em etanol, (b) aquecer a mistura, (c) adicionar MTBE à mistura, formando um precipitado compreendendo o dito polimorfo, e filtrando o precipitado tal que o dito polimorfo é recristalizado. Composições Farmacêuticas

[068]Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma composição farmacêutica compreendendo o hidrobrometo de Composto I, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Também é aqui fornecida uma composição farmacêutica compreendendo o Polimorfo A, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[069]O termo “composição farmacêutica” inclui preparações adequadas por administração para mamíferos, por exemplo, seres humanos. Quando os compostos da presente invenção são administrados como medicamentos para mamíferos, por exemplo, seres humanos, eles podem ser fornecidos por si ou como uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, 0,1 % a 99,9 % (mais preferivelmente, 0,5 a 90 %) de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[070]Os compostos aqui descritos (isto é, o hidrobrometo de Composto I e Polimorfo A) podem ser combinados com um veículo farmaceuticamente aceitável de acordo com técnicas de composição farmacêutica convencionais. Como aqui usado, “veículo farmaceuticamente aceitável” pode incluir quaisquer e todos os solventes, diluentes, ou outro veículo líquido, dispersão ou auxiliares de suspensão, agentes ativos de superfície, agentes isotônicos, agentes espessantes ou emulsificadores, preservantes, ligantes sólidos, lubrificantes e semelhantes, como adequados à forma de dosagem particular desejada. Remington’s Pharmaceutical Sciences, Décima Sexta Edição, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) divulga vários veículos usados na formulação de composições farmacêuticas e técnicas conhecidas para a preparação desta. Exceto na medida em que qualquer meio transportador convencional é incompatível com os compostos, tais como produzindo qualquer efeito biológico indesejável ou de outro modo interagindo em uma maneira deletéria com qualquer outro componente da composição farmacêutica, seu uso é considerado estar dentro do escopo desta invenção. Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, açúcares tais como lactose, glicose e sacarose; amidos tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados tais como carboximetil celulose de sódio, etil celulose e acetato de celulose; tragacanto empoado; malte; gelatina; talco; excipientes tais como manteiga de cacau e ceras de supositório; óleos tais como óleo de amendoim, óleo de caroço de algodão; óleo de açafroa, óleo de gergelim; óleo de oliva; óleo de milho e óleo de soja; glicóis; tais como propileno glicol; ésteres tais como oleato de etila e laurato de etila; agar; agentes tamponantes tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água livre de pirógeno; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico, e soluções tampão de fosfato, assim como outros lubrificantes compatíveis não tóxicos tais como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, assim como agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, flavorizantes e perfumantes, preservantes e antioxidantes também podem estar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador.

[071]Além disso, o veículo pode tomar uma ampla variedade de formas dependendo da forma da preparação desejada para a administração, por exemplo, oral, nasal, retal, vaginal, parenteral (incluindo injeções ou infusões intravenosas). Na preparação de composições para a forma de dosagem oral qualquer um dos meios farmacêuticos usuais pode ser utilizado. Meios farmacêuticos usuais incluem, por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoois, agentes flavorizantes, preservantes, agentes corantes, e semelhantes no caso de preparações líquidas orais (tais como por exemplo, suspensões, soluções, emulsões e elixires); aerossóis; ou veículos tais como amidos, açúcares, celulose microcristalina, diluentes, agentes granuladores, lubrificantes, ligantes, agentes desintegrantes e semelhantes, no caso de preparações sólidas orais (tais como, por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos).

[072]Agentes umectantes, emulsificantes e lubrificantes, tais como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, assim como agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, flavorizantes e perfumantes, preservantes e antioxidantes também podem estar presentes nas composições.

[073]Os exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridreto de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propila, tocoferois, e semelhantes; e agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e semelhantes.

[074]As composições farmacêuticas compreendendo os compostos podem ser formuladas para ter qualquer concentração desejada. Em algumas formas de realização, a composição é formulada tal que compreende pelo menos uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em algumas formas de realização, a composição é formulada tal que compreende uma quantidade que não causaria um ou mais efeitos colaterais indesejados.

[075]Como a forma cristalina do hidrobrometo de Composto I é mais facilmente mantida durante sua preparação, as formas de dosagem sólidas são uma forma preferida para a composição farmacêutica da invenção. As formas de dosagem sólidas para administração oral, tais como cápsulas, comprimidos, pílulas, pós, e grânulos, são particularmente preferidas. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos por técnicas conhecidas àqueles habilitados no ramo.

[076]As composições farmacêuticas incluem aquelas adequadas para administração oral, sublingual, nasal retal, vaginal, tópica, bucal e parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular e intravenosa), embora a via mais adequada dependerá da natureza e severidade da condição sendo tratada. As composições podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária, e preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Em certas formas de realização, a composição farmacêutica é formulada para administração oral na forma de uma pílula, cápsula, pastilha expectorante ou comprimido. Em outras formas de realização, a composição farmacêutica está na forma de uma suspensão.

[077]Os compostos aqui fornecidos são adequados como um agente ativo em composições farmacêuticas que são particularmente eficazes para tratar transtornos associados a EZH2, especialmente câncer. A composição farmacêutica em várias formas de realização tem uma quantidade farmaceuticamente eficaz do hidrobrometo de Composto I ou Polimorfo A, junto com outros excipientes, veículos, enchedores, diluentes farmaceuticamente aceitáveis e semelhantes.

[078]Uma “quantidade eficaz” terapeuticamente ou farmaceuticamente é uma quantidade de um composto (o hidrobrometo de Composto I ou Polimorfo A), que quando administrado a um paciente, melhora um sintoma de uma doença ou condição, por exemplo, evita os vários sintomas morfológicos e somáticos de câncer. Em um exemplo, uma quantidade eficaz do hidrobrometo de Composto I ou Polimorfo A é a quantidade suficiente para tratar o câncer em um sujeito. A quantidade pode variar dependendo de tais fatores como o tamanho e peso do sujeito, o tipo de doença, ou o composto particular da invenção. A quantidade do hidrobrometo de Composto I ou Polimorfo A que constitui uma “quantidade eficaz” variará dependendo do composto, do estado da doença e de sua severidade, da idade do paciente a ser tratado, e semelhantes. A quantidade eficaz pode ser determinada rotineiramente por uma pessoa de habilidade comum na técnica tendo em conta o seu conhecimento e a esta divulgação.

[079]O regime de administração pode afetar o que constitui uma quantidade farmaceuticamente eficaz. O hidrobrometo de Composto I ou Polimorfo A, e composições compreendendo quaisquer destes compostos, podem ser administrados ao sujeito antes ou depois do início de uma doença. Além disso, várias dosagens divididas, assim como, dosagens escalonadas podem ser administradas diariamente ou sequencialmente, ou a dose pode ser continuamente infundida, ou pode ser uma injeção em bolus. Além disso, as dosagens podem ser proporcionalmente aumentadas ou diminuídas como indicadas pelas exigências da situação terapêutica ou profilática. Métodos de Tratamento

[080]Os compostos da presente invenção (isto é, o hidrobrometo de Composto I, assim como Polimorfo A) inibem a atividade histona metiltransferase de EZH2 ou um mutante desta e, consequentemente, em um aspecto da invenção, certos compostos aqui divulgados são candidatos para tratar, ou evitar certas condições e doenças. A presente invenção fornece métodos para tratar condições e doenças do curso do qual pode ser influenciado modulando o estado de metilação de histonas ou outras proteínas, em que o dito estado de metilaçào é mediado pelo menos em parte pela atividade de EZH2. A modulação do estado de metilação de histonas pode, por sua vez, influenciar o nível de expressão de genes alvos ativados por metilação, e/ou genes alvos suprimidos por metilação. O método inclui administrar a um sujeito em necessidade de tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção.

[081]O transtorno, em que a metilação de proteína mediada por EZH2 desempenha uma parte pode ser câncer ou uma condição pré-cancerosa. A presente invenção fornece ainda o uso de um composto da presente invenção (isto é, o hidrobrometo de Composto I, assim como, Polimorfo A) no tratamento de câncer ou pré-câncer do curso do qual pode ser influenciado modulando a metilação de proteína mediada por EZH2, ou, para a preparação de um medicamento útil para o tratamento de tal câncer ou pré-câncer. Os cânceres exemplares que podem ser tratados incluem linfomas, incluindo linfoma de não-Hodgkin, linfoma folicular (F L) e linfoma difuso de grandes células B (DLBC L); melanoma; e leucemia, incluindo CML. A condição pré-cancerosa exemplar inclui síndrome mielodisplásica (MDS; anteriormente conhecida como pré-leucemia).

[082]Em ainda uma outra forma de realização, é aqui fornecido um método de tratar um linfoma compreendendo administrar ao sujeito em necessidade deste uma quantidade eficaz do hidrobrometo de Composto I.

[083]Ainda em uma outra forma de realização, é aqui fornecido um método de tratar um linfoma compreendendo administrar a um sujeito em necessidade deste uma quantidade eficaz de Polimorfo A.

[084]A presente invenção também fornece métodos de proteger contra um transtorno, em que a metilação de proteína mediada por EZH2 desempenha uma parte em um sujeito em necessidade deste administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de composto da presente invenção (isto é, o hidrobrometo de Composto I, assim como Polimorfo A) a um sujeito em necessidade de tai tratamento. O transtorno pode ser câncer, por exemplo, câncer em que a metilação de proteína mediada por EZH2 desempenha um papel. A presente invenção também fornece o uso de composto da presente invenção (isto é, o hidrobrometo de Composto I, assim como Polimorfo A) para a preparação de um medicamento útil para a prevenção de um transtorno proliferativo celular associado, pelo menos em parte, com a metilação de proteína mediada por EZH2.

[085]Os compostos desta invenção podem ser usados para modular a metilação de proteína (por exemplo, histona), por exemplo, para modular atividade de enzima histona metiltransferase ou histona demetilase. Pelo menos alguns dos compostos da invenção podem ser usados in vivo ou in vitropara modular metilação de proteína. A metilação de histona foi relatada estar envolvida em expressão aberrante de certos genes em cânceres, e em silenciar os genes neuronais em células não- neuronais. Pelo menos alguns compostos aqui descritos são candidatos adequados para tratar estas doenças, isto é, diminuir a metilação ou restaurar a metilação para aproximadamente o nível de, em contrapartida, células normais.

[086]Os compostos que são moduladores de metilação podem ser usados para modular a proliferação celular. Por exemplo, em alguns casos a proliferação excessiva pode ser reduzida com agentes que diminuam a metilação, enquanto a proliferação insuficiente pode ser estimulada com agentes que aumentam a metilação. Consequentemente, as doenças que podem ser tratadas pelos compostos da invenção podem incluir doenças hiperproliferativas, tais como crescimento de células benignas e crescimento de células malignas.

[087]Como aqui usado, um “sujeito em necessidade deste” é um sujeito tendo um transtorno, em que a metilação de proteína mediada por EZH2 desempenha uma parte, ou um sujeito tendo um risco aumentado de desenvolver tal transtorno em relação à população, em geral. Um sujeito em necessidade deste pode ter uma condição pré-cancerosa. Preferivelmente, um sujeito em necessidade deste tem câncer. Um “sujeito” inclui um mamífero. O mamífero pode ser por exemplo, um ser humano ou mamífero não-humano apropriado, tal como primata, camundongo, rato, cão, gato, vaca, cavalo, cabra, camelo, ovelha ou um porco. O sujeito também pode ser um pássaro ou galinha. Em uma forma de realização, o mamífero é um ser humano.

[088]Como aqui usado, o termo “transtorno proliferativo celular” refere-se a condições, em que o crescimento desregulado ou anormal, ou ambos, de células pode levar ao desenvolvimento de uma condição ou doença indesejada, que pode ser ou não cancerosa. Os transtornos proliferativos celulares exemplares que podem ser tratados com os compostos da invenção abrangem uma variedade de condições, em que a divisão celular está desregulada. O transtorno proliferativo celular exemplar incluem, mas não são limitados a, neoplasias, tumores benignos, tumores malignos, condições pré-cancerosas, tumores in situ,tumores encapsulados, tumores metastáticos, tumores líquidos, tumores sólidos, tumores imunológicos, tumores hematológicos, cânceres, carcinomas, leucemias, linfomas, sarcomas, e células que se dividem rapidamente. O termo “célula que se divide rapidamente” como aqui usado é definido como qualquer célula que se divide em uma taxa que excede ou é maior do que o que é esperado ou observado entre as células vizinhas ou justapostas dentro do mesmo tecido. Um transtorno proliferativo celular inclui um pré-câncer ou uma condição pré-cancerosa. Um transtorno proliferativo celular inclui câncer. Em um aspecto, os métodos aqui fornecidos são usados para tratar ou aliviar um sintoma de câncer ou para identificar candidatos adequados para tais propósitos. O termo “câncer” inclui tumores sólidos, assim como, tumores e/ou malignidades hematológicos. Uma “célula de pré-câncer” ou “célula pré-câncerosa” é uma célula manifestando um transtorno proliferativo celular que é um pré-câncer ou uma condição pré-cancerosa. Uma “célula de câncer” ou “célula cancerosa” é uma célula manifestando um transtorno proliferativo celular que é um câncer. Quaisquer meios reproduzíveis de medição podem ser usados para identificar células cancerosas ou células pré-câncerosas. As células cancerosas ou células pré- câncerosas podem ser identificadas por identificação ou classificação histológica de uma amostra de tecido (por exemplo, uma amostra de biópsia). As células cancerosas ou células pré-câncerosas podem ser identificadas através do uso de marcadores moleculares apropriados.

[089]As condições ou transtornos não-cancerosos exemplares que podem ser tratados usando um ou mais compostos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, artrite reumatoide; inflamação; doença autoimune; condições linfoproliferativas; acromegalia; espondilite reumatoide; osteoartrite; gota, outras condições artríticas; sepse; choque séptico; choque endotóxico; sepse por gram- negativas; síndrome do choque tóxico; asma; síndrome da angústia respiratória do adulto; doença pulmonar obstrutiva crônica; inflamação pulmonar crônica; doença inflamatória intestinal; doença de Crohn; psoríase; eczema; colite ulcerativa; fibrose pancreática; fibrose hepática; doença renal aguda e crônica; síndrome do intestino irritável; pirése; restenose; malária cerebral; acidente vascular cerebral e lesão isquêmica; neural trauma; doença de Alzheimer; doença de Huntington; doença de Parkinson; dor aguda e crônica; rinite alérgica; conjuntivite alérgica; insuficiência cardíaca crônica; síndrome coronariana aguda; caquexia; malária; hanseníase; leishmaniose; doença de Lyme; síndrome de Reiter; sinovite aguda; degeneração do músculo, bursite; tendinite; tenossinovite; hérnia, rupturas, ou síndrome do disco intervertebral prolapso; osteopetrose; trombose; restenose; silicose; sarcose pulmonar; doenças da reabsorsão óssea, tais como osteoporose; reação de enxerto- versus-hospedeiro; Esclerose múltipla; lúpus; fibromialgia; AIDS e outras doenças virais tais como Herpes Zoster, Herpes Simplex I ou II, virus influenza e citomegalovirus; e diabetes mellitus.

[090]Os cânceres exemplares que podem ser tratados usando um ou mais compostos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, carcinoma adrenocortical, cânceres relacionados a AIDS, linfoma relacionado à AIDS, câncer anal, câncer anorretal, câncer do canal anal, câncer de apêndice, astrocitoma cerebelar infantil, astrocitoma cerebral infantil, carcinoma de células basais, câncer de pele (não-melanoma), câncer das vias biliares, câncer do tubo bílico extra- hepático, câncer do tubo bílico intra-hepático, câncer de bexiga, câncer de bexiga, câncer de osso e junta, osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno, câncer cerebral, tumor cerebral, glioma de tronco cerebral, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, glioma visual do caminho e hipotalâmico, câncer de mama, adenomas/carcinoides brônquicos, tumor carcinoide, gastrointestinal, câncer do sistema nervoso, linfoma do sistema nervoso, câncer do sistema nervoso central, linfoma do sistema nervoso central, câncer cervical, cânceres infantis, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, transtornos mieloproliferativos crônicos, câncer de cólon, câncer colorretal, linfoma cutâneo de células t, neoplasma linfoide, micose fungoide, Síndrome de Seziary, câncer do endométrio, câncer esofágico, tumor de células germinativas extracranianas, tumor de células germinativas extragonadais, câncer do tubo bílico extra-hepático, câncer de olho, melanoma intraocular, retinoblastoma, câncer da vesícula biliar, câncer gástrico (estômago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal (GIST), tumor de células germinativas, tumor de células germinativas ovarianas, tumor trofoblástico gestacional glioma, câncer de cabeça e pescoço, câncer hepatocelular (fígado), linfoma de Hodgkin, câncer de hipofaringe, melanoma intraocular, câncer ocular, tumores de células da ilhota (pâncreas endócrino), Sarcoma de Kaposi, câncer de rim, câncer renal, câncer de rim, câncer de laringe, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, leucemia de células pilosas, câncer de lábio e cavidade oral, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, linfoma relacionado à AIDS, linfoma de não-Hodgkin, linfoma do sistema nervoso central primário, macroglobulinemia de Waldenstram, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (olho), carcinoma de células de merkel, mesotelioma maligno, mesotelioma, câncer de pescoço espinocelular metastático, câncer de boca, câncer da língua, síndrome das neoplasias endócrinas múltiplas, micose fungoide, síndromes mielodisplásicas, doenças mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena crônica, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiplo, transtornos mieloproliferativos crônicos, câncer de nasofaringe, neuroblastoma, câncer oral, câncer da cavidade oral, câncer de orofaringe, câncer ovariano, câncer epitelial ovariano, tumor de ovário de baixo potencial maligno, câncer pancreático, câncer de células das ilhotas pancreáticas, câncer do seio paranasal e cavidade nasal, câncer de paratireoide, câncer de pênis, câncer de faringe, feocromocitoma, pineoblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, tumor pituitário, neoplasma de células plasmáticas/mieloma múltiplo, blastoma pleuropulmonar, câncer de próstata, câncer de reto, pelve renal e uréter, câncer de células transicionais, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer de glândulas salivares, família Ewing de tumores de sarcoma, Sarcoma de Kaposi, sarcoma de tecidos moles, câncer uterino, sarcoma uterino, câncer de pele (não-melanoma), câncer de pele (melanoma), carcinoma de células de merkel da pele, câncer de intestino delgado, sarcoma de tecidos moles, carcinoma de células escamosas, câncer de estômago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, câncer testicular, câncer de garganta, timoma, timoma e carcinoma tímico, câncer da tireoide, câncer de células transicionais de pelve renal e uréter e outros órgãos urinários, tumor trofoblástico gestacional, câncer de uretra, câncer uterino endometrial, sarcoma uterino, câncer de corpo uterino, câncer vaginal, câncer vulvar e Tumor de Wilm.

[091]Um “transtorno proliferativo celular do sistema hematológico” é um transtorno proliferativo celular que envolvem células do sistema hematológico. Um transtorno proliferativo celular do sistema hematológico pode incluir linfoma, leucemia, neoplasias mieloides, neoplasias de mastócitos, mielodisplasia, gamopatia monoclonal benigna, granulomatose linfomatoide, papulose linfomatoide, policitemia vera, leucemia mielocítica crônica, metaplasia mieloide agnogênica e trombocitemia essencial. Um transtorno proliferativo celular do sistema hematológico pode incluir hiperplasia, displasia e metaplasia de células do sistema hematológico. Em um aspecto, as composições da presente invenção podem ser usadas para tratar um câncer selecionado a partir do grupo que consiste de um câncer hematológico da presente invenção ou um transtorno proliferativo celular hematológico da presente invenção, ou usadas para identificar candidatos adequados para tais propósitos. Um câncer hematológico da presente invenção pode incluir mieloma múltiplo, linfoma (incluindo linfoma de Hodgkin, linfoma de não-Hodgkin, linfomas infantis, e linfomas de origem linfocítica e cutânea), leucemia (incluindo leucemia infantil, tricoleucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielocítica crônica, leucemia mielógena crônica, e leucemia de mastócitos), neoplasias mieloides e neoplasias de mastócitos.

[092]Um “transtorno proliferativo celular do pulmão” é um transtorno proliferativo celular que envolve as células do pulmão. Os transtornos prol iterativos celulares do pulmão podem incluir todas as formas de transtornos proliferativos celulares que afetam as células pulmonares. Os transtornos proliferativos celulares do pulmão podem incluir câncer de pulmão, um pré-câncer ou condição pré-cancerosa do pulmão, crescimentos ou lesões benignas do pulmão, e crescimentos ou lesões malignos do pulmão, e lesões metastáticas em tecido e órgãos no corpo exceto o pulmão. Em um aspecto, as composições da presente invenção podem ser usadas para tratar o câncer de pulmão ou transtornos proliferativos celulares do pulmão, ou usadas para identificar candidatos adequados para tais propósitos. O câncer de pulmão pode incluir todas as formas de câncer do pulmão. O câncer de pulmão pode incluir neoplasias pulmonares malignas, carcinoma in situ,tumores carcinoides típicos, e tumores carcinoides atípicos. O câncer de pulmão pode incluir câncer de pulmão de pequenas células (“SCLC”), câncer de pulmão de células não-pequenas (“NSCLC”), carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de pequenas células, carcinoma de grandes células, carcinoma de células adenoescamosas e mesotelioma. O câncer de pulmão pode incluir câncer em cicatrizes pulmonares “scar carcinoma”, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma de células gigantes, carcinoma de células fusiformes e carcinoma neuroendócrino de grandes células. O câncer de pulmão pode incluir neoplasias de pulmão tendo heterogeneidade histológica e ultraestrutural (por exemplo, tipos de células misturados).

[093]Os transtornos proliferativos celulares do pulmão podem incluir todas as formas de transtornos proliferativos celulares que afetam as células pulmonares. Os transtornos proliferativos celulares do pulmão podem incluir câncer de pulmão, condições pré-cancerosas do pulmão. Os transtornos proliferativos celulares do pulmão podem incluir hiperplasia, metaplasia e displasia do pulmão. Os transtornos proliferativos celulares do pulmão podem incluir hiperplasia induzida pelo amianto, metaplasia escamosa e metaplasia mesotelial reativa benigna. Os transtornos proliferativos celulares do pulmão podem incluir substituição de epitélio colunar com epitélio escamoso estratificado e displasia da mucosa. Os indivíduos expostos a agentes ambientais nocivos inalados, tais como fumaça de cigarro e amianto podem estar em risco aumentado para desenvolver transtornos proliferativos celulares do pulmão. As doenças de pulmão anteriores que podem predispor indivíduos ao desenvolvimento de transtornos proliferativos celulares do pulmão podem incluir doença de pulmão intersticial crônica, doença pulmonar necrozante, esclerodermia, doença reumatoide, sarcoidose, pneumonite intersticial, tuberculose, pneumonias repetidas, fibrose pulmonar idiopática, granulomata, asbestose, alveolite fibrosante, e doença de Hodgkin.

[094]Um “transtorno proliferativo celular do cólon” é um transtorno proliferativo celular que envolve as células do cólon. Preferivelmente, o transtorno proliferativo celular do cólon é o câncer de cólon. Em um aspecto, as composições da presente invenção podem ser usadas para tratar o câncer de cólon ou transtornos proliferativos celulares do cólon, ou usadas para identificar candidatos adequados para tais propósitos. O câncer de cólon pode incluir todas as formas de câncer do cólon. O câncer de cólon pode incluir cânceres de cólon esporádicos e hereditários. O câncer de cólon pode incluir neoplasias de cólon malignas, carcinoma in situ, tumores carcinoides típicos e tumores carcinoides atípicos. O câncer de cólon pode incluir adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas e carcinoma de células adenoescamosas. O câncer de cólon pode estar associado com uma síndrome hereditária selecionada a partir do grupo que consiste de câncer colorretal sem polipose hereditário, polipose adenomatosa familiar, síndrome de Gardner, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Turcot e polipose juvenil. O câncer de cólon pode ser causado por uma síndrome hereditária selecionada a partir do grupo que consiste de câncer colorretal sem polipose hereditário, polipose adenomatosa familiar, síndrome de Gardner, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Turcot e polipose juvenil.

[095]Os transtornos proliferativos celulares do cólon podem incluir todas as formas de transtornos proliferativos celulares que afetam as células do cólon. Os transtornos proliferativos celulares do cólon podem incluir câncer de cólon, condições pré-cancerosas do cólon, pólipos adenomatosos do cólon e lesões metacrônicas do cólon. Um transtorno proliferativo celular do cólon pode incluir adenoma. Os transtornos proliferativos celulares do cólon pode ser caracterizado por hiperplasia, metaplasia e displasia do cólon. Doenças do cólon anteriores que podem predispor os indivíduos ao desenvolvimento de transtornos proliferativos celulares do cólon podem incluir câncer de cólon anterior. A doença atual que pode predispor os indivíduos ao desenvolvimento de transtornos proliferativos celulares do cólon pode incluir doença de Crohn e colite ulcerativa. Um transtorno proliferative celular do cólon pode estar associado com uma mutação em um gene selecionado a partir do grupo que consiste de p53, ras, FAPe DCC. Um individual pode ter um risco elevado de desenvolver um transtorno proliferativo celular do cólon devido à presença de uma mutação em um gene selecionado a partir do grupo que consiste de p53, ras, FAP e DCC.

[096]Um “transtorno proliferativo celular dos pâncreas” é um transtorno proliferativo celular que envolve células dos pâncreas. Os transtornos proliferativos celulares dos pâncreas podem incluir todas as formas de transtornos proliferativos celulares que afetam as células pancreáticas. Os transtornos proliferativos celulares dos pâncreas podem incluir câncer de pâncreas, um pré-câncer ou condição pré- cancerosa dos pâncreas, hiperplasia dos pâncreas e displasia dos pâncreas, crescimentos ou lesões benignas dos pâncreas, e crescimentos ou lesões malignos dos pâncreas, e lesões metastáticas em tecido e órgãos no corpo exceto os pâncreas. O câncer pancreático inclui todas as formas de câncer dos pâncreas. O câncer pancreático pode incluir adenocarcinoma ductal, carcinoma adenoescamoso, carcinoma de células gigantes pleomórficas, adenocarcinoma mucinoso, carcinoma de células gigantes como osteoclasto, cistoadenocarcinoma mucinoso, carcinoma acinar, carcinoma de grandes células não classificados, carcinoma de pequenas células, pancreatoblastoma, neoplasia papilar, cistadenoma mucinosa, neoplasia cística papilar, e cistadenoma serosa. O câncer pancreático também pode incluir neoplasias pancreáticas tendo heterogeneidade histológica e ultraestrutural (por exemplo, tipos de células misturados).

[097]Um “transtorno proliferativo celular da próstata” é um transtorno proliferativo celular que envolve células da próstata. Os transtornos proliferativos celulares da próstata podem incluir todas as formas de transtornos proliferativos celulares que afetam as células da próstata. Os transtornos proliferativos celulares da próstata podem incluir câncer de próstata, um pré-câncer ou condição pré-cancerosa da próstata, crescimentos ou lesões benignas da próstata, e crescimentos ou lesões malignos da próstata, e lesões metastáticas em tecido e órgãos no corpo exceto a próstata. Os transtornos proliferativos celulares da próstata pode incluir hiperplasia, metaplasia e displasia da próstata.

[098]Um “transtorno proliferativo celular da pele” é um transtorno proliferativo celular que envolve células da pele. Os transtornos proliferativos celulares da pele pode incluir todas as formas de transtornos proliferativos celulares que afetam as células da pele. Os transtornos proliferativos celulares da pele podem incluir um pré- câncer ou condição pré-cancerosa da pele, crescimentos ou lesões benignas da pele, melanoma, melanoma maligno e outros crescimentos ou lesões malignos da pele, e lesões metastáticas em tecido e órgãos no corpo exceto a pele. Os transtornos proliferativos celulares da pele podem incluir hiperplasia, metaplasia e displasia da pele.

[099]Um “transtorno proliferativo celular do ovário” é um transtorno proliferativo celular que envolve células do ovário. Os transtornos proliferativos celulares do ovário podem incluir todas as formas de transtornos proliferativos celulares que afetam as células do ovário. Os transtornos proliferativos celulares do ovário podem incluir um pré-câncer ou condição pré-cancerosa do ovário, crescimentos ou lesões benignas do ovário, câncer ovariano, crescimentos ou lesões malignos do ovário, e lesões metastáticas em tecido e órgãos no corpo exceto o ovário. Os transtornos proliferativos celulares da pele podem incluir hiperplasia, metaplasia e displasia de células do ovário.

[0100]Um “transtorno proliferativo celular da mama” é um transtorno proliferativo celular que envolve células da mama. Os transtornos proliferativos celulares da mama podem incluir todas as formas de transtornos proliferativos celulares que afetam as células da mama. Os transtornos proliferativos celulares da mama podem incluir câncer de mama, um pré-câncer ou condição pré-cancerosa da mama, crescimentos ou lesões benignas da mama, e crescimentos ou lesões malignos da mama, e lesões metastáticas em tecido e órgãos no corpo exceto a mama. Os transtornos proliferativos celulares da mama pode incluir hiperplasia, metaplasia e displasia da mama.

[0101]Um transtorno proliferativo celular da mama pode ser uma condição pré- cancerosa da mama. As composições da presente invenção podem ser usadas para tratar uma condição pré-cancerosa da mama. Uma condição pré-cancerosa da mama pode incluir hiperplasia da mama atípica, carcinoma ductal in situ(DOIS), carcinoma intraductal, carcinoma lobular in situ (LCIS), neoplasia lobular, e estágio 0 ou grau 0 de crescimento ou lesão da mama (por exemplo, estágio 0 ou grau 0 de câncer de mama ou carcinoma in situ).Uma condição pré-cancerosa da mama pode ser encenada de acordo com o esquema de classificação de TNM como aceito pelo American Joint Committee on Cancer (AJCC), onde o tumor primário (T) foi atribuído a um estágio de TO ou Tis; e onde os linfonodos regionais (N) foram atribuídos a urn estágio de NO; e onde a metástase à distância (M) foi atribuída a um estágio de MO.

[0102]O transtorno proliferativo celular da mama pode ser câncer de mama. Em um aspecto, as composições da presente invenção podem ser usadas para tratar o câncer de mama, ou usadas para identificar candidatos adequados para tais propósitos. O câncer de mama pode incluir todas as formas de câncer da mama. O câncer de mama pode incluir cânceres de mama epiteliais primários. O câncer de mama pode incluir cânceres, em que a mama está envolvida por outros tumores, tais como linfoma, sarcoma ou melanoma. O câncer de mama pode incluir carcinoma da mama, carcinoma ductal da mama, carcinoma lobular da mama, carcinoma da mama indiferenciado, cistossarcoma filoides da mama, angiossarcoma da mama e linfoma da mama primário. O câncer de mama pode incluir câncer de mama de Estágio I, II, IIIA, IIIB, NIC e IV. O carcinoma ductal da mama pode incluir carcinoma invasivo, carcinoma invasivo in situ com componente intraductal predominante, câncer de mama inflamatório, e urn carcinoma ductal da mama com um tipo histológico selecionado a partir do grupo que consiste de pústula, muco (coloide), medular, medular com infiltrado linfocitário, papilar, fibroso e tubular. Carcinoma lobular da mama pode incluir carcinoma invasivo lobular com componente in situ predominante, carcinoma invasivo lobular e carcinoma lobular infiltrante. O câncer de mama pode incluir doença de Paget, doença de Paget com carcinoma intraductal e doença de Paget com carcinoma ductal invasivo. O câncer de mama pode incluir neoplasias da mama tendo heterogeneidade histológica e ultraestrutural (por exemplo, tipos de células misturados).

[0103]Os compostos da presente invenção podem ser usados para tratar o câncer de mama, ou usados para identificar candidatos adequados para tais propósitos. Um câncer de mama que é para ser tratado pode incluir câncer de mama familiar. Um câncer de mama que é para ser tratado pode incluir esporádico. Um câncer de mama que é para ser tratado pode surgir em um sujeito macho. Um câncer de mama que é para ser tratado pode surgir em um sujeito fêmea. Um câncer de mama que é para ser tratado pode surgir em um sujeito fêmea pré-menopausa ou um sujeito fêmea pós-menopausa. Um câncer de mama que é para ser tratado pode surgir em um sujeito igual a ou mais de 30 anos de idade, ou um sujeito com menos de 30 anos de idade. Um câncer de mama que é para ser tratado tem surgido em um sujeito igual a ou mais de 50 anos de idade, ou um sujeito com menos de 50 anos de idade. Um câncer de mama que é para ser tratado pode surgir em um sujeito igual a ou mais de 70 anos de idade, ou um sujeito com menos de 70 anos de idade.

[0104]Um câncer de mama que é para ser tratado pode ser classificado para identificar uma mutação familiar ou espontânea em BRCA1, BRCA2 ou p53. Um câncer de mama que é para ser tratado pode ser classificado como tendo uma amplificação de gene de HER2/neu, como superexpressão de HER2/neu, ou como tendo um baixo, nível intermediário ou alto de expressão HER2/neu. Um câncer de mama que é para ser tratado pode ser classificado como um marcador selecionado a partir do grupo que consiste de receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (PR), receptor de fator de crescimento epidérmico humano-2, Ki-67, CA15-3, CA 27-29 e c-Met. Um câncer de mama que é para ser tratado pode ser classificado como ER-desconhecido, ER-rico ou ER-deficiente. Um câncer de mama que é para ser tratado pode ser classificado como ER-negativo ou ER-positivo. A classificação de ER de um câncer de mama pode ser realizada por quaisquer meios reproduzíveis. A classificação de ER de um câncer de mama pode ser realizada como apresentado em Onkologie 27: 175 - 179 (2004). Um câncer de mama que é para ser tratado pode ser classificado como PR-desconhecido, PR-rico ou PR- deficiente. Um câncer de mama que é para ser tratado pode ser classificado como PR-negativo ou PR-positivo. Um câncer de mama que é para ser tratado pode ser classificado como receptor positivo ou receptor negativo. Um câncer de mama que é para ser tratado pode ser classificado como estando associado com níveis de sangue elevados de CA 15-3 ou CA 27-29, ou ambos.

[0105]Um câncer de mama que é para ser tratado pode incluir um tumor da mama localizado. Um câncer de mama que é para ser tratado pode incluir um tumor da mama que está associado com uma biópsia de linfonodo sentinela negativo (SLN). Um câncer de mama que é para ser tratado pode incluir um tumor da mama que está associado com uma biópsia de linfonodo sentinela positivo (SLN). Um câncer de mama que é para ser tratado pode incluir um tumor da mama que está associado com um ou mais linfonodos auxiliares positivos, onde os linfonodos auxiliares foram encenados por qualquer método aplicável. Um câncer de mama que é para ser tratado pode incluir um tumor da mama que foi classificado como não tendo estado nodal negativo (por exemplo, nodo-negativo) ou estado nodal positivo (por exemplo, nodo-positivo). Um câncer de mama que é para ser tratado pode incluir um tumor da mama que tem metástase em outros locais no corpo. Um câncer de mama que é para ser tratado pode ser classificado como tendo metástase em um local selecionado a partir do grupo que consiste de osso, pulmão, fígado ou cérebro. Um câncer de mama que é para ser tratado pode ser classificado de acordo com uma característica selecionada a partir do grupo que consiste de metastático, localizado, regional, local-regional, localmente avançado, distante, multicêntrico, bilateral, ipsilateral, contralateral, recém-diagnosticado, recorrente e inoperável.

[0106]Um composto da presente invenção pode ser usado para tratar ou evitar um transtorno proliferativo celular da mama, ou para tratar ou evitar câncer de mama, em um sujeito tendo um risco aumentado de desenvolver câncer de mama em relação à população, em geral, ou usado para identificar candidatos adequados para tais propósitos. Um sujeito com um risco aumentado de desenvolver câncer de mama em relação à população, em geral, é um sujeito fêmea com um histórico familiar ou histórico pessoal de câncer de mama. Um sujeito com um risco aumentado de desenvolver câncer de mama em relação à população, em geral, é um sujeito fêmea tendo uma mutação de linhagem germinal ou espontânea em BRCA1 ou BRCA2, ou ambos. Um sujeito com um risco aumentado de desenvolver câncer de mama em relação à população, em geral, é um sujeito fêmea com um histórico familiar de câncer de mama e uma mutação de linhagem germinal ou espontânea em BRCA1 ou BRCA2, ou ambos. Um sujeito com um risco aumentado de desenvolver câncer de mama em relação à população, em geral, é uma fêmea que tem mais de 30 anos de idade, mais de 40 anos de idade, mais de 50 anos de idade, mais de 60 anos de idade, mais de 70 anos de idade, mais de 80 anos de idade, ou mais de 90 anos de idade. Um sujeito com um risco aumentado de desenvolver câncer de mama em relação à população, em geral, é um sujeito com hiperplasia da mama atípica, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma intraductal, carcinoma lobular in situ (LCIS), neoplasia lobular, ou um estágio 0 de crescimento ou lesão da mama (por exemplo, estágio 0 ou grau 0 de câncer de mama ou carcinoma in situ).

[0107]Um câncer de mama que é para ser tratado pode ser histologicamente classificado de acordo com o sistema Scarff-Bloom-Richardson, em que um tumor de mama foi atribuído um escore de contagem de mitose de 1,2 ou 3; um escore de pleiomorfismo nuclear de 1,2 ou 3; um escore de formação de túbulo de 1,2, ou 3; e um escore de Scarff-Bloom-Richardson total entre 3 e 9. Um câncer de mama que é para ser tratado pode ser atribuído um grau de tumor de acordo com o Painel de Consenso Internacional no Tratamento de Câncer de Mama selecionado a partir do grupo que consiste de grau 1, grau 1 - 2, grau 2, grau 2 - 3 ou grau 3.

[0108]Em uma forma de realização, é aqui fornecido um método de tratar o câncer de mama compreendendo administrar a um sujeito em necessidade deste uma quantidade eficaz do hidrobrometo de Composto I.

[0109]Em uma outra forma de realização, é aqui fornecido um método de tratar o câncer de mama compreendendo administrar a um sujeito em necessidade deste uma quantidade eficaz de Polimorfo A.

[0110]Um câncer que é para ser tratado pode ser organizado de acordo com o sistema de classificação de TNM do American Joint Committee in Cancer (AJCC), onde o tumor (T) foi atribuído um estágio de TX, T1, T1mic, T1a, T1b, T1c, T2, T3, T4, T4a, T4b, T4c, ou T4d; e onde os linfonodos regionais (N) foram atribuídos um estágio de NX, NO, N1, N2, N2a, N2b, N3, N3a, N3b ou N3c; e onde a metástase à distância (M) pode ser atribuída um estágio de MX, MO ou M1. Um câncer que é para ser tratado pode ser organizado de acordo com uma classificação do American Joint Committee in Cancer (AJCC) como Estágio I, Estágio HA, Estágio IIB, Estágio IIIA, Estágio IIIB, Estágio NIC ou Estágio IV. Um câncer que é para ser tratado pode ser atribuído um grau de acordo com uma classificação do AJCC como Grau GX (por exemplo, o grau não pode ser avaliado), Grau 1, Grau 2, Grau 3 ou Grau 4. Um câncer que é para ser tratado pode ser organizado de acordo com uma classificação patológica do AJCC (pN) de pNX, pNO, PNO (I-), PNO (l+), PNO (mol-), PNO (mol+), PN1, PN1(mi), PN1a, PN1b, PN1c, pN2, pN2a, pN2b, pN3, pN3a, pN3b ou pN3c.

[0111]Um câncer que é para ser tratado pode incluir um tumor que foi determinado para ser menor ou igual a cerca de 2 centímetros em diâmetro. Um câncer que é para ser tratado pode incluir um tumor que foi determinado para ser de cerca de 2 a cerca de 5 centímetros em diâmetro. Um câncer que é para ser tratado pode incluir um tumor que foi determinado para ser maior ou igual a cerca de 3 centímetros em diâmetro. Um câncer que é para ser tratado pode incluir um tumor que foi determinado para ser maior do que 5 centímetros em diâmetro. Um câncer que é para ser tratado pode ser classificado por aparência microscópica como bem diferenciado, moderadamente diferenciado, deficientemente diferenciado ou não diferenciado. Um câncer que é para ser tratado pode ser classificado por aparência microscópica com respeito a contagem de mitose (por exemplo, quantidade de divisão celular) ou pleiomorfismo nuclear (por exemplo, mudança em células). Um câncer que é para ser tratado pode ser classificado por aparência microscópica como estando associado com áreas de necrose (por exemplo, áreas de células morrendo ou degenerando). Um câncer que é para ser tratado pode ser classificado como tendo um cariótipo anormal, tendo um número anormal de cromossomos, ou tendo um ou mais cromossomos que são anormais em aparência. Um câncer que é para ser tratado pode ser classificado como sendo aneuploide, triploide, tetraploide, ou como tendo uma ploidia alterada. Um câncer que é para ser tratado pode ser classificado como tendo uma translocação cromossômica, ou uma deleção ou duplicação de um cromossomo inteiro, ou uma região de deleção, duplicação ou amplificação de uma porção de um cromossomo.

[0112]Um câncer que é para ser tratado pode ser avaliado por citometria de DNA, citometria de fluxo ou citometria de imagem. Um câncer que é para ser tratado pode ser classificado como tendo 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de células no estágio de síntese de divisão celular (por exemplo, em fase S de divisão celular). Um câncer que é para ser tratado pode ser classificado como tendo uma fração de fase S baixo ou uma fração de fase S alta.

[0113]Como aqui usado, uma “célula normal” é uma célula que não pode ser classificada como parte de um “transtorno proliferativo celular”. Uma célula normal carece de crescimento desregulado ou anormal, ou ambos, que pode levar ao desenvolvimento de uma condição ou doença indesejada. Preferivelmente, uma célula normal possui mecanismos de controle de ponto de verificação de ciclo celular funcionando normalmente.

[0114]Como aqui usado, “contatando uma célula” refere-se a uma condição, em que um composto ou outra composição de matéria é em contato direto com uma célula, ou é perto o suficiente para induzir um efeito biológico desejado em uma célula.

[0115]Como aqui usado, “composto candidato” refere-se a um composto da presente invenção (isto é, o hidrobrometo de Composto I, assim como Polimorfo A) que foi ou será testado em um ou mais ensaios biológicos in vitroou in vivo, de modo a determinar se o composto é provável para evocar uma resposta biológica ou médica desejada em uma célula, tecido, sistema, animal ou ser humano que está sendo solicitado por um pesquisador ou clínico. Um composto candidato é um composto da presente invenção. A resposta biológica ou médica pode ser o tratamento de câncer. A resposta biológica ou médica pode ser o tratamento ou prevenção de um transtorno proliferativo celular. A resposta ou efeito biológico também pode incluir uma mudança na proliferação ou crescimento celular que ocorre in vitroou em um modelo de animal, assim como outras mudanças biológicas que são observáveis in vitro.Os ensaios biológicos in vitroou in vivo podem incluir, mas não são limitados a, ensaios de atividade enzimática, ensaios de desvio de mobilidade eletroforética, ensaios de gene repórter, ensaios de viabilidade celular in vitro,e os ensaios aqui descritos.

[0116]Como aqui usado, “monoterapia” refere-se à administração de um único composto ativo ou terapêutico a um sujeito em necessidade deste. Preferivelmente, a monoterapia envolverá a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ativo. Por exemplo, a monoterapia de câncer com um do composto da presente invenção (isto é, o hidrobrometo de Composto I, assim como Polimorfo A) a um sujeito em necessidade de tratamento de câncer. A monoterapia pode ser contrastada com terapia de combinação, em que uma combinação de múltiplos compostos ativos é administrado, preferivelmente, com cada componente da combinação presente em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em um aspecto, a monoterapia com um composto da presente invenção é mais eficaz do que a terapia de combinação em induzir um efeito biológico desejado.

[0117]Como aqui usado, “tratamento” ou “tratar” descreve o manejo e cuidados de um paciente para o propósito de combater uma doença, condição ou transtorno e inclui a administração de um composto da presente invenção (isto é, o hidrobrometo de Composto I, assim como Polimorfo A) para aliviar os sintomas ou complicações de uma doença, condição ou transtorno, ou para eliminar a doença, condição ou transtorno. O termo “tratar” também pode incluir tratamento de uma célula in vitroou um modelo de animal.

[0118]Um composto da presente invenção (isto é, o hidrobrometo de Composto I, assim como Polimorfo A) também pode ser usado para evitar uma doença, condição ou transtorno, ou usado para identificar candidatos adequados para tais propósitos. Como aqui usado, “evitando” ou “evitar” descreve reduzir ou eliminar o início dos sintomas ou complicações da doença, condição ou transtorno.

[0119]Como aqui usado, o termo “aliviar” significa descrever um processo pelo qual a severidade de um sinal ou sintoma de um transtorno é diminuída. De maneira importante, um sinal ou sintoma pode ser aliviado sem ser eliminado. Em uma forma de realização preferida, a administração de composições farmacêuticas da invenção leva à eliminação de um sinal ou sintoma, entretanto, eliminação não é necessária. As dosagens eficazes são esperadas diminuir a severidade de um sinal ou sintoma. Por exemplo, um sinal ou sintoma de um transtorno, tal como câncer, que pode ocorrer em múltiplas localizações, é aliviado se a severidade do câncer é diminuída dentro de pelo menos uma de múltiplas localizações.

[0120]Como aqui usado, o termo “severidade” significa descrever o potencial de câncer para transformar de um estado pré-canceroso, ou benigno, em um estado maligno. Alternativamente, ou além disso, a severidade significa descrever um estágio de câncer, por exemplo, de acordo com o sistema TNM (aceito pela International Union Against Cancer (UICC) e o American Joint Committee on Cancer (AJCC)) ou por outros métodos reconhecidos pela técnica. Estágio de câncer refere- se à extensão ou severidade do câncer, com base em fatores tais como a localização do tumor primário, tamanho de tumor, número de tumores, e comprometimento de linfonodos (propagação de câncer em linfonodos). Alternativamente, ou além disso, a severidade significa descrever o grau de tumor por métodos reconhecidos pela técnica (veja, National Cancer Institute, www.cancer.gov). O grau de tumor é um sistema usado para classificar as células cancerosas em termos de como anormal elas aparecem sob um microscópio e rapidez com que o tumor tende a crescer e se espalhar. Muitos fatores são considerados na determinação do grau de tumor, incluindo o padrão de estrutura e crescimento das células. Os fatores específicos usados para determinar o grau de tumor variam com cada tipo de câncer. A severidade também descreve um grau histológico, também chamado de diferenciação, que refere-se a quanto as células tumorais se assemelham com as células normais do mesmo tipo de tecido (veja, National Cancer Institute, www.cancer.gov). Além disso, a severidade descreve um grau nuclear, que refere-se ao tamanho e forma do núcleo em células tumorais e a percentagem de células tumorais que estão se dividindo (veja, National Cancer Institute, www.cancer.gov).

[0121]Em outro aspecto da invenção, a severidade descreve o grau a que um tumor tem fatores de crescimento secretados, matriz extracelular degradada, torna- se vascularizado, perda de adesão a tecidos justapostos, ou metástase. Além disso, a severidade descreve o número de localizações a que um tumor primário tem metástase. Finalmente, a severidade inclui a dificuldade de tratar tumores de vários tipos e localizações. Por exemplo, tumores inoperáveis, aqueles cânceres que têm maior acesso a múltiplos sistemas do corpo (tumores hematológicos e imunológicos), e aqueles que são os mais resistentes a tratamentos tradicionais são considerados mais severos. Nestas situações, prolongando a expectativa de vida do sujeito e/ou reduzindo a dor, diminuindo a proporção de células cancerosas ou restringindo as células a um sistema, e melhorando o estágio de câncer/grau de tumor/grau histológico/grau nuclear são considerados aliviar um sinal ou sintoma do câncer.

[0122]Como aqui usado, o termo “sintoma” é definido como uma indicação de doença, lesão ou que algo não está bem no organismo. Os sintomas são sentidos ou percebidos pelo indivíduo experimentando o sintoma, mas não pode ser facilmente percebido por outros. Outros são definidos como profissionais não sendo da saúde.

[0123]Como aqui usado, o termo “sinal” é também definido como uma indicação de que algo não está bem no organismo. Mas os sinais são definidos como coisas que podem ser observados por um médico, enfermeiro ou outro professional de saúde.

[0124]O câncer é um grupo de doenças que pode causar quase qualquer sinal ou sintoma. Os sinais e sintomas dependerão de onde o câncer está, o tamanho do câncer, e o quanto afeta os órgãos ou estruturas vizinhas. Se um câncer dissemina (metástases), em seguida, os sintomas podem aparecer em partes diferentes do corpo.

[0125]Conforme um câncer cresce, ele começa a empurrar os órgãos, vasos sanguíneos e nervos vizinhos. Esta pressão cria alguns dos sinais e sintomas de câncer. Se o câncer está em uma área crítica, tal como certas partes do cérebro, mesmo o mais pequeno tumor pode causar sintomas iniciais.

[0126]Mas às vezes os cânceres começam em lugares onde não causam quaisquer sintomas até que o câncer tenha crescido o bastante. Os cânceres de pâncreas, por exemplo, não crescem, usualmente, suficientemente grandes para fazer-se sentir a partir do exterior do corpo. Alguns cânceres pancreáticos não causam sintomas até que eles começam a crescer em torno de nervos vizinhos isto causa um dor nas costas). Outros crescem em torno do duto biliar, que bloqueia o fluxo da bile e leva a uma coloração amarelada da pele conhecida como icterícia. No momento em que um câncer pancreático causa estes sinais ou sintomas, tem usualmente alcançado um estágio avançado.

[0127]Um câncer também pode causar sintomas tais como febre, fadiga ou perda de peso. Isto pode ser porque as células cancerosas usam-se muito de substâncias de fornecimento ou liberação de energia do corpo que mudam o metabolismo do corpo. Ou o câncer pode fazer o sistema imunitário reagir de modo a produzir estes sintomas.

[0128]Algumas vezes, as células cancerosas liberam as substâncias na corrente sanguínea que não causam sintomas usualmente pensados resultar de cânceres. Por exemplo, alguns cânceres dos pâncreas podem liberar substâncias que provocam a formação de coágulos de sangue para desenvolver nas veias das pernas. Alguns cânceres de pulmão fazem substâncias semelhante a hormônios que afetam níveis de cálcio no sangue, afetando nervos e músculos e causando fraqueza e tontura.

[0129]O câncer apresenta vários sinais ou sintomas gerais que ocorrem quando uma variedade de subtipos de células cancerosas está presente. Mais pessoas com câncer perderão peso em algum tempo com a sua doença. Uma perda de peso inexplicada (não intencional) de 10 libras ou mais pode ser o primeiro sinal de câncer, particularmente, cânceres dos pâncreas, estômago, esôfago ou pulmão.

[0130]A febre é muito comum com câncer, mas é mais frequentemente observada em doença avançada. Quase todos os pacientes com câncer terão febre em algum momento, especialmente, se o câncer ou seu tratamento afeta o sistema imunitário e torna mais difícil para o corpo combater a infecção. Menos frequentemente, a febre pode ser um sinal inicial de câncer, tal como com leucemia ou linfoma.

[0131]A fadiga pode ser um sintoma importante conforme o câncer progride. Pode acontecer mais cedo, no entanto, em cânceres tais como com leucemia, ou se o câncer está a causar uma perda contínua de sangue, como em alguns tipos de câncer de cólon ou estômago.

[0132]A dor pode ser um sintoma inicial com alguns cânceres tais como câncer ósseo ou câncer testicular. Mas a maioria das vezes, a dor é um sintoma de doença avançada.

[0133]Juntamente com os cânceres de pele (veja, próxima seção), alguns cânceres internos podem causar sinais de pele que podem ser observados. Estas alterações incluem a pele com uma aparência mais escura (hiperpigmentação), amarela (icterícia) ou vermelha (eritema); comichão; ou crescimento excessivo de pelos.

[0134]Alternativamente, ou além disso, os subtipos de câncer apresentam sinais ou sintomas específicos. Mudanças nos hábitos intestinais ou função da bexiga pode indicar câncer. Obstipação a longo prazo, diarreia, ou uma mudança no tamanho das fezes pode ser um sinal de câncer de cólon. Dor ao urinar, sangue na urina, ou uma mudança na função da bexiga (tal como micção mais frequente ou menos frequente) pode estar relacionado a câncer de bexiga ou próstata.

[0135]As alterações na condição ou aparência da pele de uma nova condição de pele pode indicar câncer. Os cânceres de pele podem sangrar e se parecerem com feridas que não cicatrizam. Uma dor de longa duração na boca pode ser um câncer oral, especialmente em pacientes que, frequentemente, fumam, mascam tabaco ou bebem álcool. Feridas no pênis ou vagina podem ser sinais de infecção ou um câncer inicial.

[0136]Sangramento ou corrimento anormal pode indicar câncer. Hemorragias podem acontecer em qualquer câncer inicial ou avançado. Sangue no escarro (catarro) pode ser um sinal de câncer de pulmão. Sangue nas fezes (ou fezes escuras ou pretas) pode ser um sinal de câncer de cólon ou reto. O câncer do colo do útero ou do endométrio (revestimento do útero) pode causar sangramento vaginal. Sangue na urina pode ser um sinal de câncer de bexiga ou rim. Uma secreção sanguinolenta do mamilo pode ser um sinal de câncer de mama.

[0137]Um espessamento ou nódulo na mama ou em outras partes do corpo pode indicar a presença de um câncer. Muitos cânceres podem ser sentidos através da pele, principalmente na mama, testículos, linfonodos (glândulas), e os tecidos moles do corpo. Um nódulo ou espessamento pode ser um sinal inicial ou tardio de câncer. Qualquer nódulo ou espessamento pode ser indicativo de câncer, especialmente, se a formação é nova ou cresceu em tamanho.

[0138]Indigestão ou dificuldade para engolir pode indicar câncer. Embora estes sintomas comumente têm outras causas, problemas de indigestão ou deglutinação podem ser um sinal de câncer do esôfago, estômago ou faringe (garganta).

[0139]As recentes mudanças em uma verruga ou mancha pode ser indicativo de câncer. Qualquer verruga, mancha ou sarda que muda de cor, tamanho ou forma, ou perde suas fronteiras definitivas indica o desenvolvimento potencial de câncer. Por exemplo, a lesão de pele pode ser um melanoma.

[0140]Uma tosse ou rouquidão persistente pode ser indicativo de câncer. Uma tosse que não vai embora pode ser um sinal de câncer de pulmão. Rouquidão pode ser um sinal de câncer de laringe (cordas vocais) ou tireoide.

[0141]Embora os sinais e sintomas listados acima são os mais comuns observados com câncer, há muitos outros que são menos comuns e não são aqui listados. Entretanto, todos os sinais e sintomas de câncer reconhecidos na técnica são considerados e abrangidos pela presente invenção.

[0142]Tratar o câncer pode resultar em uma redução no tamanho de um tumor. Uma redução no tamanho de um tumor também pode ser referida como “regressão de tumor”. Preferivelmente, após o tratamento, o tamanho de tumor é reduzido por 5 % ou mais em relação a seu tamanho antes do tratamento; mais preferivelmente, o tamanho de tumor é reduzido por 10 % ou mais; mais preferivelmente, reduzido por 20 % ou mais; mais preferivelmente, reduzido por 30 % ou mais; mais preferivelmente, reduzido por 40 % ou mais; ainda mais preferivelmente, reduzido por 50 % ou mais; e o mais preferivelmente, reduzido por 75 % ou mais. O tamanho de um tumor pode ser medido por quaisquer meios reproduzíveis de medição. O tamanho de um tumor pode ser medido como um diâmetro do tumor.

[0143]Tratar o câncer pode resultar em uma redução no volume de tumor. Preferivelmente, após o tratamento, o volume de tumor é reduzido por 5 % ou mais em relação a seu tamanho antes do tratamento; mais preferivelmente, o volume de tumor é reduzido por 10 % ou mais; mais preferivelmente, reduzido por 20 % ou mais; mais preferivelmente, reduzido por 30 % ou mais; mais preferivelmente, reduzido por 40 % ou mais; ainda mais preferivelmente, reduzido por 50 % ou mais; e o mais preferivelmente, reduzido por 75 % ou mais. O volume de tumor pode ser medido por quaisquer meios reproduzíveis de medição.

[0144]Tratar o câncer resulta em uma diminuição no número de tumores. Preferivelmente, após o tratamento, o número de tumor é reduzido por 5 % ou mais em relação ao número antes do tratamento; mais preferivelmente, o número de tumor é reduzido por 10 % ou mais; mais preferivelmente, reduzido por 20 % ou mais; mais preferivelmente, reduzido por 30 % ou mais; mais preferivelmente, reduzido por 40 % ou mais; ainda mais preferivelmente, reduzido por 50 % ou mais; e o mais preferivelmente, reduzido por maior do que 75 %. O número de tumores pode ser medido por quaisquer meios reproduzíveis de medição. O número de tumores pode ser medido pela contagem de tumores visíveis a olho nu ou em uma ampliação específica. Preferivelmente, a ampliação específica é de 2x, 3x, 4x, 5x, 10x ou 50x.

[0145]Tratar o câncer pode resultar em uma diminuição no número de lesões metastáticas em outros tecidos ou órgãos distantes a partir do sítio do tumor primário. Preferivelmente, após o tratamento, o número de lesões metastáticas é reduzido por 5 % ou mais em relação ao número antes do tratamento; mais preferivelmente, o número de lesões metastáticas é reduzido por 10 % ou mais; mais preferivelmente, reduzido por 20 % ou mais; mais preferivelmente, reduzido por 30 % ou mais; mais preferivelmente, reduzido por 40 % ou mais; ainda mais preferivelmente, reduzido por 50 % ou mais; e o mais preferivelmente, reduzido por mais do que 75 %. O número de lesões metastáticas pode ser medido por quaisquer meios reproduzíveis de medição. O número de lesões metastáticas pode ser medido pela contagem de lesões metastáticas visíveis a olho nú ou em uma ampliação específica. Preferivelmente, a ampliação específica é de 2x, 3x, 4x, 5x, 10x ou 50x.

[0146]Tratar o câncer pode resultar em um aumento no tempo médio de sobrevivência de uma população de sujeitos tratados em comparação com uma população que recebe o veículo sozinho. Preferivelmente, o tempo médio de sobrevivência é aumentado por mais do que 30 dias; mais preferivelmente, por mais do que 60 dias; mais preferivelmente, por mais do que 90 dias; e o mais preferivelmente, por mais do que 120 dias. Um aumento no tempo médio de sobrevivência de uma população pode ser medido por quaisquer meios reproduzíveis. Um aumento no tempo médio de sobrevivência de uma população pode ser medido, por exemplo, calculando para uma população o comprimento médio de sobrevivência após a iniciação do tratamento com um composto ativo. Um aumento no tempo médio de sobrevivência de uma população também pode ser medido, por exemplo, calculando para uma população o comprimento médio de sobrevivência após a conclusão de uma primeira rodada de tratamento com um composto ativo.

[0147]Tratar o câncer pode resultar em um aumento no tempo médio de sobrevivência de uma população de sujeitos tratados em comparação com uma população de sujeitos não tratados. Preferivelmente, o tempo médio de sobrevivência é aumentado por mais do que 30 dias; mais preferivelmente, por mais do que 60 dias; mais preferivelmente, por mais do que 90 dias; e o mais preferivelmente, por mais do que 120 dias. Um aumento no tempo médio de sobrevivência de uma população pode ser medido por quaisquer meios reproduzíveis. Um aumento no tempo médio de sobrevivência de uma população pode ser medido, por exemplo, calculando para uma população o comprimento médio de sobrevivência após a iniciação do tratamento com um composto ativo. Um aumento no tempo médio de sobrevivência de uma população também pode ser medido, por exemplo, calculando para uma população o comprimento médio de sobrevivência após a conclusão de uma primeira rodada de tratamento com um composto ativo.

[0148]Tratar o câncer pode resultar no aumento no tempo médio de sobrevivência de uma população de sujeitos tratados em comparação com uma população que recebe monoterapia com um fármaco que não é um composto da presente invenção. Preferivelmente, o tempo médio de sobrevivência é aumentado por mais do que 30 dias; mais preferivelmente, por mais do que 60 dias; mais preferivelmente, por mais do que 90 dias; e o mais preferivelmente, por mais do que 120 dias. Um aumento no tempo médio de sobrevivência de uma população pode ser medido por quaisquer meios reproduzíveis. Um aumento no tempo médio de sobrevivência de uma população pode ser medido, por exemplo, calculando para uma população o comprimento médio de sobrevivência após a iniciação do tratamento com um composto ativo. Um aumento no tempo médio de sobrevivência de uma população também pode ser medido, por exemplo, calculando para uma população o comprimento médio de sobrevivência após a conclusão de uma primeira rodada de tratamento com um composto ativo.

[0149]Tratar o câncer pode resultar em uma diminuição na taxa de mortalidade de uma população de sujeitos tratados em comparação com uma população que recebe o veículo sozinho. Tratar o câncer pode resultar em uma diminuição na taxa de mortalidade de uma população de sujeitos tratados em comparação com uma população não tratada. Tratar o câncer pode resultar em uma diminuição na taxa de mortalidade de uma população de sujeitos tratados em comparação com uma população que recebe monoterapia com um fármaco que não é um composto da presente invenção. Preferivelmente, a taxa de mortalidade é diminuída por mais do que 2 %; mais preferivelmente, por mais do que 5 %; mais preferivelmente, por mais do que 10 %; e o mais preferivelmente, por mais do que 25 %. Uma diminuição na taxa de mortalidade de uma população de sujeitos tratados pode ser medida por quaisquer meios reproduzíveis. Uma diminuição na taxa de mortalidade de uma população pode ser medida, por exemplo, calculando para uma população o número médio de mortes relacionadas à doença por unidade de tempo após a iniciação do tratamento com um composto ativo. Uma diminuição na taxa de mortalidade de uma população também pode ser medida, por exemplo, calculando para uma população o número médio de mortes relacionadas à doença por unidade de tempo após a conclusão de uma primeira rodada de tratamento com um composto ativo.

[0150]Tratar o câncer pode resultar em uma diminuição na taxa de crescimento de tumor. Preferivelmente, após o tratamento, a taxa de crescimento de tumor é reduzido por pelo menos 5 % em relação ao número antes do tratamento; mais preferivelmente, taxa de crescimento de tumor é reduzido por pelo menos 10 %; mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 20 %; mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 30 %; mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 40 %; mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 50 %; ainda mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 50 %; e o mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 75 %. A taxa de crescimento de tumor pode ser medida por quaisquer meios reproduzíveis de medição. A taxa de crescimento de tumor pode ser medida de acordo com uma mudança no diâmetro do tumor por unidade de tempo.

[0151]Tratar o câncer pode resultar em uma diminuição em recrescimento de tumor. Preferivelmente, após o tratamento, o recrescimento de tumor é menor do que 5 %; mais preferivelmente, o recrescimento de tumor é menor do que 10 %; mais preferivelmente, menor do que 20 %; mais preferivelmente, menor do que 30 %; mais preferivelmente, menor do que 40 %; mais preferivelmente, menor do que 50 %; ainda mais preferivelmente, menor do que 50 %; e o mais preferivelmente, menor do que 75 %. O recrescimento de tumor pode ser medido por quaisquer meios reproduzíveis de medição. O recrescimento de tumor é medido, por exemplo, medindo um aumento no diâmetro de um tumor após uma contração de tumor antes que se seguiu o tratamento. Uma diminuição em recrescimento de tumor é indicada pela falha de tumores reaparecerem após o tratamento ter interrompeu.

[0152]Tratar ou evitar um transtorno proliferativo celular pode resultar em uma redução na taxa de proliferação celular. Preferivelmente, após o tratamento, a taxa de proliferação celular é reduzida por pelo menos 5 %; mais preferivelmente, por pelo menos 10 %; mais preferivelmente, por pelo menos 20 %; mais preferivelmente, por pelo menos 30 %; mais preferivelmente, por pelo menos 40 %; mais preferivelmente, por pelo menos 50 %; ainda mais preferivelmente, por pelo menos 50 %; e o mais preferivelmente, por pelo menos 75 %. A taxa de proliferação celular pode ser medida por quaisquer meios reproduzíveis de medição. A taxa de proliferação celular é medida, por exemplo, medindo o número de células em divisão em uma amostra de tecido por unidade de tempo.

[0153]Tratar ou evitar um transtorno proliferativo celular pode resultar em uma redução na proporção de células em proliferação. Preferivelmente, após o tratamento, a proporção de células em proliferação é reduzida por pelo menos 5 %; mais preferivelmente, por pelo menos 10 %; mais preferivelmente, por pelo menos 20 %; mais preferivelmente, por pelo menos 30 %; mais preferivelmente, por pelo menos 40 %; mais preferivelmente, por pelo menos 50 %; ainda mais preferivelmente, por pelo menos 50 %; e o mais preferivelmente, por pelo menos 75 %. A proporção de células em proliferação pode ser medida por quaisquer meios reproduzíveis de medição. Preferivelmente, a proporção de células em proliferação é medida, por exemplo, quantificando o número de células em divisão em relação ao número de células sem divisão em uma amostra de tecido. A proporção de células em proliferação pode ser equivalente ao índice mitótico.

[0154]Tratar ou evitar um transtorno proliferativo celular pode resultar em uma diminuição no tamanho de uma área ou zona de proliferação celular. Preferivelmente, após o tratamento, o tamanho de uma área ou zona de proliferação celular é reduzido por pelo menos 5 % em relação a seu tamanho antes do tratamento; mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 10 %; mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 20 %; mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 30 %; mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 40 %; mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 50 %; ainda mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 50 %; e o mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 75 %. O tamanho de uma área ou zona de proliferação celular pode ser medido por quaisquer meios reproduzíveis de medição. O tamanho de uma área ou zona de proliferação celular pode ser medido como um diâmetro ou largura de uma área ou zona de proliferação celular.

[0155]Tratar ou evitar um transtorno proliferativo celular pode resultar em uma diminuição no número ou proporção de células tendo uma aparência ou morfologia anormal. Preferivelmente, após o tratamento, o número de células tendo uma morfologia anormal é reduzido por pelo menos 5 % em relação a seu tamanho antes do tratamento; mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 10 %; mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 20 %; mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 30 %; mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 40 %; mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 50 %; ainda mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 50 %; e o mais preferivelmente, reduzido por pelo menos 75 %. Uma aparência ou morfologia celular anormal pode ser medida por quaisquer meios reproduzíveis de medição. Uma morfologia celular anormal pode ser medida por microscópio, por exemplo, usando um microscópio de cultura de tecido invertido. Uma morfologia celular anormal pode assumir a forma de pleiomorfismo nuclear.

[0156]Como aqui usado, o termo “seletivamente” significa que tende a ocorrer em uma frequência mais alta em uma população do que em uma outra população. As populações comparadas podem ser populações de células. Preferivelmente, um composto da presente invenção (isto é, o hidrobrometo de Composto I, assim como Polimorfo A) atua seletivamente em um câncer ou célula pré-câncerosa, mas não em uma célula normal. Preferivelmente, um composto da presente invenção atua seletivamente para modular um alvo molecular (por exemplo, uma proteína metiltransferase alvo), mas nào significantemente modula um outro alvo molecular (por exemplo, uma proteína metiltransferase não-alvo). A invenção também fornece um método para seletivamente inibir a atividade de uma enzima, tal como uma proteína metiltransferase. Preferivelmente, um evento ocorre seletivamente na população A em relação a população B se ocorre mais do que duas vezes mais frequentemente na população A como em comparação com a população B. Um evento ocorre seletivamente se ocorre mais do que cinco vezes mais frequentemente na população A. Um evento ocorre seletivamente se ocorre mais do que dez vezes mais frequentemente na população A; mais preferivelmente, mais do que cinquenta vezes; ainda mais preferivelmente, mais do que 100 vezes; e o mais preferivelmente, mais do que 1000 vezes mais frequentemente na população A como em comparação com a população B. Por exemplo, a morte celular seria a dita ocorrer seletivamente em células cancerosas se ocorreu mais do que duas vezes como frequentemente em células cancerosas como em comparação com células normais.

[0157]Um composto da presente invenção pode modular a atividade de um alvo molecular (por exemplo, uma proteína metiltransferase alvo). Modular refere-se a estimulação ou inibição de uma atividade de um alvo molecular. Preferivelmente, um composto da presente invenção modula a atividade de um alvo molecular se ele estimula ou inibe a atividade do alvo molecular por pelo menos 2 vezes em relação à atividade do alvo molecular sob as mesmas condições, mas faltando apenas a presença do dito composto. Mais preferivelmente, um composto da presente invenção modula a atividade de um alvo molecular se ele estimula ou inibe a atividade do alvo molecular por pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes em relação à atividade do alvo molecular sob as mesmas condições, mas faltando apenas a presença do dito composto. A atividade de um alvo molecular pode ser medida por quaisquer meios reproduzíveis. A atividade de um alvo molecular pode ser medida in vitroou in vivo. Por exemplo, a atividade de um alvo molecular pode ser medida in vitropor um ensaio de atividade enzimática ou um ensaio de ligação de DNA, ou a atividade de um alvo molecular pode ser medida in vivo avaliando quanto à expressão de um gene repórter.

[0158]Um composto da presente invenção (isto é, o hidrobrometo de Composto I, assim como Polimorfo A) não significantemente modula a atividade de um alvo molecular se a adição do composto não estimula ou inibe a atividade do alvo molecular por maios do que 10 % em relação à atividade do alvo molecular sob as mesmas condições mas faltando apenas a presença do dito composto.

[0159]Como aqui usado, o termo “isozima seletiva” significa inibição ou estimulação preferencial de uma primeira isoforma de uma enzima em comparação com uma segunda isoforma de uma enzima (por exemplo, inibição ou estimulação preferencial de uma proteína metiltransferase isozima alfa em comparação com uma proteína metiltransferase isozima beta). Preferivelmente, um composto da presente invenção demonstra um mínimo de um diferencial de quatro vezes, preferivelmente um diferencial de dez vezes, mais preferivelmente um diferencial de cinquenta vezes, na dosagem necessária pata obter um efeito biológico. Preferivelmente, um composto da presente invenção demonstra este diferencial ao longo da faixa de inibição, e o diferencial é exemplificado na ICso, isto é, uma inibição de 50 %, para um alvo molecular de interesse.

[0160]Administrar um composto da presente invenção a uma célula ou um sujeito em necessidade deste pode resultar em modulação (isto é, estimulação ou inibição) de uma atividade de uma proteína metiltransferase de interesse.

[0161]Tratar o câncer ou um transtorno proliferativo celular pode resultar em morte celular, e preferivelmente, a morte celular resulta em uma diminuição de pelo menos 10 % no número de células em uma população. Mais preferivelmente, a morte celular significa uma diminuição de pelo menos 20 %; mais preferivelmente, uma diminuição de pelo menos 30 %; mais preferivelmente, uma diminuição de pelo menos 40 %; mais preferivelmente, uma diminuição de pelo menos 50 %; o mais preferivelmente, uma diminuição de pelo menos 75 %. Número de células em uma população pode ser medido por quaisquer meios reproduzíveis. Várias células em uma população podem ser medidas por separação de células ativadas por fluorescência (FACS), imunomicroscopia de fluorescência e microscópio de luz. Os métodos de medir a morte celular são como mostrados em Li et a!., Proc Natl Acad Sei USA. 100(5): 2674 - 8, 2003. Em um aspecto, a morte celular ocorre por apoptose.

[0162]Preferivelmente, uma quantidade eficaz de um composto da presente invenção não é significantemente citotóxica às células normais. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto não é significantemente citotóxica às células normais se a administração do composto em uma quantidade terapeuticamente eficaz não induz a morte celular em mais do que 10 % de células normais. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto não significantemente afeta a viabilidade de células normais se a administração do composto em uma quantidade terapeuticamente eficaz não induz a morte celular em mais do que 10 % de células normais. Em um aspecto, a morte celular ocorre por apoptose.

[0163]Contatar uma célula com um composto da presente invenção pode induz ou ativar a morte celular seletivamente em células cancerosas. Administrar a um sujeito em necessidade deste um composto da presente invenção pode induzir ou ativar a morte celular seletivamente em células cancerosas. Contatar uma célula com um composto da presente invenção pode induzir a morte celular seletivamente em uma ou mais células afetadas por um transtorno proliferativo celular. Preferivelmente, administrar a um sujeito em necessidade deste um composto da presente invenção induz a morte celular seletivamente em uma ou mais células afetadas por um transtorno proliferativo celular.

[0164]A presente invenção refere-se a um método de tratar ou evitar o câncer (por exemplo, o curso do qual pode ser influenciado modulando a metilação de proteína mediada por EZH2) administrando um composto da presente invenção (isto é, o hidrobrometo de Composto I, assim como Polimorfo A) a um sujeito em necessidade deste, onde a administração do composto da presente invenção resulta em um ou mais dos seguintes: prevenção de proliferação de células cancerosas por acúmulo de células em uma ou mais fases do ciclo celular (por exemplo, G1, G1/S, G2/M), ou indução de senescência celular, ou promoção de diferenciação de células tumorais; promoção de morte celular em células cancerosas por intermédio de citotoxicidade, necrose ou apoptose, sem uma quantidade significante de morte celular em células normais, atividade antitumor em animais com um índice terapêutico de pelo menos 2. Como aqui usado, o “índice terapêutico” é a dose máxima tolerada dividida pela dose eficaz. A presente invenção também refere-se a um método usado para identificar candidatos adequados para tratar ou evitar o câncer.

[0165]Uma pessoa habilitada na técnica pode se referir a textos de referência gerais para a descrições detalhadas de técnicas conhecidas debatidas aqui ou técnicas equivalentes. Estes textos incluem Ausubel et ai., Current Protocols em Molecular Biology, John Wiley e Sons, Inc. (2005); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3â edição), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (2000); Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y.; Enna et al., Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, N.Y.; Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975), Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18â edição (1990). Estes textos também podem ser, certamente, referidos na produção ou uso de um aspecto da invenção.

Exemplificação Materiais e Métodos Difração em Pó de Raios X

[0166]PXRD para todas as amostras foi feita em um Rigaku MultiFlex (Alvo: Cu; Voltagem do tubo: 40 kV; Corrente do tubo: 30 mA).

Calorimetria Diferencial de Varredura

[0167]DSC para todas as amostras foi feita em um Mettler-Toledo DSC 1/700 (Condições conduzidas: Temperatura inicial 35 °C, Temperatura final 325 °C, Taxa de aquecimento 30 °C/min).

Cristalografia de Raios X

[0168]Uma placa cristal incolor com dimensões 0,28 x 0,22 x 0,06 mm foi montada em uma malha de Náilon usando quantidade muito pequena de óleo paratone. Os dados foram coletados usando um difratômetro Bruker CCD (dispositivo acoplado a carga) equipado com um aparelho de temperatura baixa Oxford Cryostream operando a 173 K (-100 C). Os dados foram medidos usando scans omega e phi de 0,5° por quadro por 45 s. O número total de imagens foi fundamentado nos resultados a partir do programa COSMO onde a redundância foi esperada ser 4,0 e a completude a 100 % para 0,83 Â. Os parâmetros celulares foram recuperados usando o programa APEX II e refinados usando SAINT em todas as reflexões observadas. A redução dos dados foi realizada usando o programa SAINT que corrige para Lp. Correções de escalada e absorção foram aplicadas usando técnica de multi-scan SADABS, fornecida por George Sheldrick. As estruturas são resolvidas pelo método direto usando o programa SHELXS-97 e refinadas por método de mínimos quadrados em F2, SHELXL- 97, que estão incorporados em SHELXTL-PC V 6,10.

[0169]A estrutura mostrada na Figura 11 foi resolvida no grupo espacial P2i/c (# 14). Todos que não átomos de hidrogênio são refinados anisotropicamente. Os hidrogénios foram calculados por métodos geométricos e refinados como um modelo de transporte. O cristal usado para o estudo de difração não mostrou decomposição durante a coleta de dados. Todos os desenhos são feitos a 50 % de elipsoides.

Sorção de Vapor Dinâmico

[0170]DVS foi medido em um sistema VTI Modelo SGA-100. Método de medição: A umidade relativa (RH) foi alterada em uma forma controlada, em 5 % de etapas de 5,0 % a 95,0 %, em seguida, de volta para 5,0 % usando o sistema de sorção de vapor gravimétrico, e a mudança da percentagem em peso (% em peso) da amostra em cada estágio foi medida.

HPLC

[0171]HPLC foi realizada em uma bomba quaternária de HPLC Agilent 1200, mistura de baixo pressão, com um desgaseificador em linha. Condições de método analítico: 8 pL de amostra (20 mg de ER-581982-06 diluídos com 50 mL de um metanol para fornecer aproximadamente 0,4 mg/mL de solução) foram injetados em um Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 x 150 mm, 3,5 um), Condições de cromatografia: fase móvel A, água com formiato de amónio 5 mM; fase móvel B, formiato de amónio 5 mM em acetonitrila/metanol/água 50/45/5; taxa de fluxo, 1,5 ml/min.; gradiente: isocrático a 10 % de B de 0 a 3 min; aumento linear a 70 % de B de 3 a 7 min; isocrático a 70 % de B de 7 a 12 min; aumento linear a 100 % de B de 12 a 15 min; isocrático a 100 % de B de 15 a 20 min; temperatura de coluna, 35 °C; detecção, UV 230 nm. Tempo de retenção aproximado de Composto I = 10,7 min.

[0172]Ácido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico. Solução agitada de ácido 2-metil-3- nitrobenzoico (100 g, 552 mmols) em H2SO4 conc. (400 mL), 1,3-dibromo-5,5- dimetil-2,4-imidazolidinediona (88 g, 308 mmols) foi adicionada às porções na temperatura ambiente e a mistura de reação depois foi agitada na temperatura ambiente por 5 h. A mistura de reação foi vertida em água gelada, o sólido precipitado foi separado por filtração, lavado com água e seco sob vácuo para propocionar o composto desejado como um sólido (140 g, 98 %). O composto isolado foi feito diretamente na próxima etapa. RMN de 1H (DMSO-cfe, 400 MHz) δ 8,31 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 2,43 (s, 3H).

5-Bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metila A uma solução agitada de ácido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico (285 g, 1105 mmols) em DMF (2,8 L) na temperatura ambiente foi adicionado carbonato de sódio (468 g, 4415 mmols) seguido por adição de iodeto de metila (626,6 g, 4415 mmols). A mistura de reação resultante foi aquecida a 60 °C por 8 h. Depois da conclusão (monitorada por TLC), a mistura de reação foi filtrada (para remover carbonato de sódio) e lavada com acetato de etila (1 L X 3). O filtrado combinado foi lavado com água (3 L X 5) e a fase aquosa foi retro extraída com acetato de etila (1 L X 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas em sulfato de sódio anidro, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para propocionar o composto do título como um sólido (290 g, 97 % de rendimento). O composto isolado foi feito diretamente na próxima etapa. RMN de 1H (CDCh, 400 MHz) δ 8,17 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 3,96 (s, 3H), 2,59 (s, 3H).

3-Amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metila (1) A uma solução agitada de 5- bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metila (290 g, 1058 mmols) em etanol (1,5 L) foi adicionado cloreto de amónio aquoso (283 g, 5290 mmols dissolvidos em 1,5 L de água). A mistura resultante foi agitada a 80 °C, a qual o pó de ferro (472 g, 8451 mmols) foi adicionado às porções. A mistura de reação resultante foi aquecida a 80 °C por 12 h. Após a conclusão como determinada por TLC, a mistura de reação foi filtrada a quente em Celite® e o leito de celite foi lavado com metanol (5 L) seguido por lavagem com 30 % de MeOH em DOM (5 L). O filtrado combinado foi concentrado a vácuo, o resíduo obtido foi diluído com solução aquosa de bicarbonato de sódio (2 L) e extraído com acetato de etila (5 L X 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas em sulfato de sódio anidro, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para propocionar o composto do título como um sólido (220 g, 85 %). O composto foi feito diretamente na próxima etapa. RMN de 1H (CDCb, 400 MHz) δ 7,37 (s, 1H), 6,92 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,80 (bs, 2H), 2,31 (s, 3H).

5-Bromo-2-metil-3-((tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)benzoato de metila (2) Um reator foi carregado com 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metila (455,8 g, 1,87 mol), 1,2-Dicloroetano (4,56 L), e ácido acético (535 ml, 9,34 mols). À mistura foram adicionados di-hidro-2H-piran-4(3H)-ona (280 g, 2,80 mols) e triacetoxiboro- hidreto de sódio (594 g, 2,80 mols) mantendo a temperatura interna abaixo de 40 °C. A mistura foi agitada a 25 °C por 2,5 h e, em seguida, a reação foi resfriada rapidamente com uma solução de hidróxido de sódio (448 g, 11,20 mols) em água (5,61 L). Depois de agitação por 20 minutos na temperatura ambiente, a camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraído com acetato de etila (3,65 L). As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas com salmoura (1,5 L), e concentradas sob vácuo.

[0173]O resíduo foi tratado com acetato de etila (1,8 L) e aquecido entre 65 a 70 °C. A mistura foi agitada entre 65 a 70 °C por 15 minutos para fornecer um solução límpida e, em seguida, tratada com n-heptano (7,3 L) mantendo a temperatura entre 60 a 70 °C. Uma vez que o heptano foi completamente adicionado à solução, a mistura foi mantida entre 65 a 70 °C por 15 minutos e, em seguida, deixada esfriar entre 18 a 22 °C durante 3 h. A suspensão resultante foi agitada entre 18 a 22 °C por 4 h, esfriada entre 0 a 5 °C durante 1 h, e mantida entre 0 a 5 °C por 2 h. O precipitado foi filtrado, lavado duas vezes com n-heptano (1,4 L), e seco sob vácuo para fornecer o composto do título (540 g, 88 %). O padrão de XRPD deste composto é mostrado na Figura 17.

[0174]5-Bromo-3-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoato de metila (3) A uma solução agitada de 5-bromo-2-metil-3-((tetra-hidro-2H-piran-4- il)amino)benzoato de metila (14 g, 42,7 mmols) em dicloroetano (150 mL) foram adicionados acetaldeído (3,75 g, 85,2 mmols) e ácido acético (15,3 g, 256 mmols). A mistura de reação resultante foi agitada na temperatura ambiente por 15 minutos. A mistura foi esfriada a 0 °C e triacetoxiboro-hidreto de sódio (27 g, 128 mmols) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente por 3 horas. Após a conclusão da reação como determinada por TLC, solução aquosa de bicarbonato de sódio foi adicionada à mistura de reação até que um pH 7-8 foi obtido, a fase orgânica foi separada e a fase aquosa foi extraída com acetato de etila. As camadas orgânicas combinadas foram secas em sulfato de sódio anidro, filtradas e concentradas sob pressão reduzida. O composto bruto foi purificado por cromatografia em coluna (gel de sílica, 100 - 200 mesh)eluindo com acetato de etila: hexano para propocionar o composto desejado como um líquido viscoso (14 g, 93 %). RMN de 1H (DMSO-ote, 400 MHz) δ 7,62 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 3,80 (bs, 5H), 3,31 (t, 2H), 2,97 - 3,05 (m, 2H), 2,87 - 2,96 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 1,52 - 1,61 (m, 2H), 1 ,37 - 1,50 (m, 2H), 0,87 (t, 3H, J = 6,8 Hz).

[0175]5-(Etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1 ’-bifenil]- 3-carboxilato de metila (4): Uma mistura de 5-bromo-3-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4- il)amino)-2-metilbenzoato de metila (580 g, 1,63 mol), 4-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolan-2-il)benzil)morfolina (592 g, 1,95 mol), 1,4-dioxano (3,86 L), carbonato de sódio (618 g, 5,83 mols), e água (771 ml) foi desgaseificada borbulhando nitrogênio através da mistura a 20 °Cpor 20 minutos e tratada com tetracis(trifenilfosfino)paládio(0) (14,11 g, 12,21 mmols). A mistura resultante foi desgaseificada por um adicional de 20 minutos e, em seguida, aquecida entre 87 a 89 °C por 17 h. Depois de esfriar a 20 °C, a mistura foi diluída com acetato de etila (5,80 L) e uma solução de ácido (R)-2-amino-3-mercaptopropiônico (232 g) em água (2,320 L). Depois de agitação por 1 ha 20 °C, a camada orgânica foi separada e lavada novamente com uma solução de ácido (R)-2-amino-3-mercaptopropiônico (232 g) em água (2,320 L). As camadas aquosas foram combinadas e extraídas com acetato de etila (5,80 L). As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas com uma solução de hidróxido de sódio (93 g) em água (2,32 L), e concentradas sob vácuo a 35 °C para fornecer o composto do título como um óleo laranja (1,21 kg, 164 % de rendimento).

[0176]Ácido 5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1 bifenil]-3-carboxílico (5): 5-(Etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’- (morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-carboxilato de metila (69,0 g, 152,5 mmols) (com base no rendimento teórico a partir da etapa anterior) foi colocado em suspensão em etanol (380 mL) e tratado com uma solução de hidróxido de sódio (24,84 g, 621,0 mmols) em água (207 mL). A mistura foi agitada a 40 °C por 18 h. Depois de esfriar entre 0 a 5 °C, a mistura foi neutralizada a pH 6,5 com ácido clorídrico 1 N (580 mL) mantendo a temperatura abaixo de 25 °C. Em seguida, a mistura foi extraída duas vezes com uma mistura de diclorometano (690 mL) e metanol (69,0 mL). As camadas orgânicas foram combinadas e concentradas sob vácuo para fornecer um produto bruto como um sólido amarelo (127 g).

[0177]O produto bruto foi dissolvido em 2-metiltetra-hidrofurano (656 mL) a 70 °C e, em seguida, tratado com IPA (828 mL). A mistura foi deixada esfriar até temperatura ambiente durante 3 a 4 h e, em seguida, agitada durante a noite na temperatura ambiente. O precipitado foi filtrado, lavado duas vezes com IPA (207 mL), e seco sob vácuo para fornecer o composto do título como um sólido branco sujo (53,54 g, 80 %). O padrão de XRPD deste composto é mostrado na Figura 9.

[0178]N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetra-hidro-2H-piran- 4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-carboxamida (Composto I): Uma mistura de ácido 5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)- [1,1’-bifenil]-3-carboxílico (540 g, 1,23 mols) e cloridreto de 3-(aminometil)-4,6- dimetil-di-hidro-piridin-2(1 H)-ona (279 g, 1,48 mol) foi colocado em suspensão em DMSO (2,70 L) e tratado com trietilamina (223 ml, 1,60 mol). A mistura foi agitada a 25 °C por 30 min e tratada com EDC-HCI (354 g, 1,85 mol) e HOBT hidratado (283 g, 1,85 mol). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente por 16 h. Depois da adição de trietilamina (292 ml, 2,09 mols), a mistura foi esfriada a 15 °C, diluída com água (10,1 L) mantendo a temperatura abaixo de 30 °C, e agitada entre 19 a 25 °C por 4 h. O precipitado resultante foi filtrado, lavado duas vezes com água (2,70 L), e seco sob vácuo para fornecer um produto bruto (695 g, análise em peso- em peso = 78 %).

[0179]Para a outra purificação do produto, a recristalização foi realizada. Um produto bruto (20,00 g, 34,92 mmols) foi colocado em suspensão em uma mistura de etanol (190 ml) e água (10,00 ml) e aquecido a 75 °C até que uma solução límpida foi obtida. A solução foi deixada agitar até temperatura ambiente durante a noite. O precipitado foi filtrado, lavado duas vezes com uma mistura de etanol (30,0 ml) e água (30,0 ml), e seco sob vácuo a 35 °C para fornecer o composto do título como um sólido branco sujo (14,0 g, 70 % recuperação a partir do bruto e 90 % de rendimento com base em ensaio em peso-em peso).

[0180]Brometo de 4-((3’-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)carbamoil)- 5’-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4’-metil-[1,1’-bifenil]-4-il)metil)morfolin-4-io (Polimorfo A): Um N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetra- hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-carboxamida bruta (595 g, 464 g com base em ensaio em peso-em peso, 810,3 mmols) foi colocado em suspensão em etanol (3,33 L). Depois do aquecimento a 70 °C, a mistura foi tratada com HBr aquoso a 48 % (97 ml, 850,8 mmols) e agitada a 70 °C por 30 min. A solução laranja-vermelho resultante foi tratada com acetato de etila (3,33 L) mantendo a temperatura acima 60 °C. A mistura foi lentamente esfriado até temperatura ambiente durante 18 h. A mistura foi esfriada a 0 qC durante 1 h e agitada a essa temperatura por 5,5 h. O precipitado resultante foi filtrado, lavado duas vezes com acetato de etila (1,39 L), e seco sob vácuo para fornecer o composto do título como um sólido branco sujo (515 g, 97 % de rendimento).

[0181]A recristalização de Polimorfo A: brometo de 4-((3’-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2- di-hidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-5’-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4’-metil- [1,1’-bifenil]-4-il)metil)morfolin-4-io (0,50 g, 0,77 mmol; 95,6 % puro por HPLC) foi colocado em suspensão em etanol (3,0 mL) e aquecida a 80 °C até que uma solução límpida foi obtida. À solução foi adicionado MTBE (5,0 mL) lentamente. A solução resultante foi deixada agitar entre 18 a 22 °C durante 3 h e agitada entre 18 a 22 °C por 15 h. O precipitado foi filtrado, lavado duas vezes com MTBE (2 mL) e seco sob vácuo para fornecer 0,45 g do composto do título (89 % de recuperação, 96,6 % puro por HPLC). O padrão de difração em pó de raios X de Polimorfo A (mono-hidrobrometo) é mostrado na Figura 1. Tabela 1, abaixo, lista os picos mais significantes.

Avaliação de Hidrobrometo de Composto I e Polimorfo A

[0182]Várias formas de sal diferentes de Composto I foram preparadas e triadas, incluindo sais de cloridreto, hidrobrometo, hemissulfato, sódio, fosfato, nitrato, maleato, malonato e L-tartrato. Dentre eles, o sal de hidrobrometo (HBr) teve as mais vantajosas propriedades físico-químicas em termos de facilidade de preparação e higroscopicidade.

[0183]Os estudos detalhados da base livre de Composto I, assim como o sal de HCI deste composto foram realizados. Pelo menos cinco formas de cristal diferentes foram detectadas a partir da forma livre de Composto I durante a varredura de polimorfo preliminar usando XRD e DSC. Devido a alto grau de variabilidade observada durante a cristalização da forma livre, as formas de cristal de outros sais foram buscadas. Dos sais triados, as formas sal de mono-cloridreto, mono- hidrobrometo, hemissulfato, fosfato, maleato, L-tartarato e sódio foram cristalinas. Os sais de fosfato e maleato foram muito higroscópicos e L-tartarato teve cristalinidade deficiente.

[0184]Foi difícil obter alto grau de cristalinidade a partir do sal de HCI de Composto I. Uma mistura de material cristalino e amorfo foi obtida independentemente de condições de cristalização. Como mostrado na Figura 8, dados de DSC do sal de mono-cloridreto de Composto I indicam algum grau de não-cristalinidade com uma endotermia a 190,5 °C. Também, os dados de sorção de vapor dinâmico (DVS) para o sal de mono-cloridreto de Composto I foram obtidos para mostrar alguma higroscopicidade: entre 4 a 6 % de ganho de peso foi observado a 75 % de umidade relativa (RH) a 25°C (Figura 18B). Isto pode ser atribuído a uma certa quantidade de natureza não-cristalina do sal de mono-cloridreto. Veja, por exemplo, Figura 18A, que mostra um tricloridreto de Composto I amorfo. Como o nível de cristalinidade não foi controlável, o sal de HCI não foi considerado para outro desenvolvimento.

[0185]Como mostrado na Figura 6, a análise de DVS do sal de sódio de Composto I mostrou higroscopicidade significante: aproximadamente 15 % de ganho de peso foi observado a 75 % de umidade relativa (RH) a 25 °C. Como mostrado na Figura 7, o sal de hemissulfato de Composto I mostrou higroscopicidade moderadamente alta: entre 9 a 11 % de ganho de peso foi observado a 75 % de umidade relativa (RH) a 25°C. Isto pode ser atribuído à natureza altamente não-cristalina do composto, como os dados de DSC do sal de hemissulfato indicam grau muito alto de não- cristalinidade sem endotermia limpa.

[0186]Destes compostos cristalinos, o mono-hidrobrometo foi o mais cristalino e menos hidroscópico (veja, Figuras 1, 3, e 4). Além disso, o mono-hidrobrometo é altamente estável e, resiste a geração de impurezas (Figura 5 representa a análise de HPLC de Polimorfo A durante três dias em uma temperatura elevada. O Polimorfo A produziu impurezas mínimas durante três dias a 100 °C). Curiosamente, o sal de di-HBr de Composto I encontrou-se ser principalmente amorfo (Figura 2).

[0187]Duas formas de cristal diferentes do mono-hidrobrometo de Composto I (Polimorfos A e B) foram obtidas de sistemas de solvente diferentes e caracterizadas usando análises de XRD, DSC e TGA-DSC. Os dados de XRD e DSC para estas duas formas de cristal diferentes de lotes representativos de Composto I são mostrados na Figura 1, Figura 3 e Figura 10. O Polimorfo B é caracterizado por um padrão de XRD em pó com picos a 8,5, 10,9, 16,7, 17,4, 20,9, 22,1 e 25,7 ± 0,2 graus 2 teta (veja, Figura 10). Entre estes dois, o Polimorfo A encontrou-se ser mais cristalino em natureza. Estudos de adsorção de vapor dinâmico (DVS) mostraram que o polimorfo A é não-higroscópico (Figura 4). Nas análises térmicas, um único pico endotérmico foi observado com uma temperatura inicial de aproximadamente a 251 °C. Além disso, tornou-se evidente a partir da análise de DSC que a recristalização de polimorfo A, significantemente, aumenta a cristalinidade do material (veja, Figura 3).

[0188]Em várias rodadas em escala laboratorial, o Polimorfo A foi obtido de forma reprodutível, e as ligeiras alterações em condições de cristalização não resultaram nas formas de cristal diferentes.

Ensaios de Enzima PRC2 do Tipo Selvagem e Mutante

[0189]Materiais Gerais. S-adenosilmetionina (SAM), S-adenosilhomociteina (SAH), bicina, KCI, Tween20, dimetilsulfóxido (DMSO) e gelatina de pele de bovino (BSG) foram adquiridos a partir da Sigma-Aldrich no nível mais alto de pureza possível. Ditiotreitol (DTT) foi adquirido a partir da EMD. SAM de 3H foi adquirido a partir da American Radiolabeled Chemicals com uma atividade específica de 80 Ci/mmol. Flashplatesde estreptavidina de 384 poços foram adquiridos a partir da PerkinElmer.

[0190]Substratos. Os peptídeos representativos de resíduos 21 - 44 de histona H3 humana contendo uma lisina não modificada 27 (H3K27meO) ou lisina dimetilada 27 (H3K27me2) foram sintetizados com um marca de afinidade de ligante G(K-biotina) C-terminal motivo e um capamida C-terminal por 21st Century Biochemicals. Os peptídeos foram purificados por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para mais do que 95 % de pureza e confirmados por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). As sequências são listadas abaixo. H3K27meO: ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGGK(biotina)-amida (SEQ ID NO: 1) H3K27me2: ATKAARK(me2)SAPATGGVKKPHRYRPGGK(biotina)-amida (SEQ ID NO: 2)

[0191]Os oligonucleossomas de eritrócitos de frango foram purificados a partir do sangue do frango de acordo com procedimentos estabelecidos.

[0192]Complexos PRC2 Recombinantes. Os complexos PRC2 humanos foram purificados como complexos de enzima de 4-componentes co-expressados em células Spodoptera frugiperda (sf9) usando um sistema de expressão de baculovírus. As subunidades expressadas foram EZH2 do tipo selvagem (NM_004456) ou EZH2 Y641F, N, H, S ou C mutantes gerados a partir da construção de EZH2 do tipo selvagem, EED (NM_003797), Suz12 (NM_015355) e RbAp48 (NM_005610). A subunidade de EED continha uma marca FLAG N-terminal que foi usado para purificar todo o complexo 4-componente de lisatos de células sf9. A pureza dos complexos atingiu ou excedeu 95 % como determinada pela análise de SDS-PAGE e Agilent Bioanalyzer. As concentrações de concentrações de estoque de enzima (geralmente, 0,3 a 1,0 mg/mL) foram determinadas usando um ensaio de Bradford contra um padrão de albumina de soro de bovino (BSA).

[0193]Procedimento Geral para Ensaios de Enzima PRC2 em Substratos de Peptídeo. Os ensaios foram todos realizados em um tampão que consiste de bicina 20 mM (pH = 7,6), DTT 0,5 mM, BSG a 0,005 % e Tween20 a 0,002 %, preparado no dia de uso. Os compostos em DMSO a 100 % (1 pL) foram manchados em placas de fundo V de 384 poços de polipropileno (Greiner) usando um Platemate 2 X 3 equipado com uma cabeça de pipeta de 384 canais (Thermo). DMSO (1 pL) foi adicionado às colunas 11, 12, 23, 24, fileiras A - H para o máximo controle de sinal, e SAH, um produto e inibidor conhecidos de PRC2 (1 pL) foram adicionados às colunas 11,12, 23, 24, fileiras I - P para o mínimo controle de sinal. Um coquetel (40 pL) contendo a enzima PRC2 do tipo selvagem e peptídeo H3K27meO ou qualquer um de enzimas mutantes Y641 e peptídeo H3K27me2 foi adicionado por Multidrop Combi (Thermo). Os compostos foram deixados incubar com PRC2 por 30 min a 25 °C, em seguida, um coquetel (10 pL) contendo uma mistura de SAM não-radioativa e de 3H foi adicionada para iniciar a reação (volume final = 51 pL). Em todos os casos, as concentrações finais foram como seguem: enzima PRC2 do tipo selvagem ou mutante foi 4 nM, SAH nos poços de mínimo controle de sinal foi 1 mM e a concentração de DMSO foi de 1 %. As concentrações finais do restante dos componentes são indicadas na Tabela 2, abaixo. Os ensaios foram interrompidos pela adição de SAM não-radioativa (10 pL) a uma concentração final de 600 pM, que dilui a SAM de 3H a um nível onde sua incorporação no substrato de peptídeo deixa de ser detectável. 50 pL da reação na placa de polipropileno de 384 poços depois foram transferidos a uma Flashplatede 384 poços e os peptídeos biotinilados foram deixados a ligar-se à superfície da estreptavidina por pelo menos 1 h antes de serem lavados três vezes com Tween20 a 0,1 % em um lavador de placa ELx405 Biotek. As placas foram, em seguida, lidas em um leitor de placa TopCount PerkinElmer para medir a quantidade de peptídeo marcado com 3H limitada à superfície da Flashplate,medida como desintegrações por minuto (dpm) ou alternativamente, referida como contagem por minuto (cpm). Tabela 2: Concentrações finais de componentes para cada variação de ensaio com base na identidade de EZH2 (EZH2 do tipo selvagem ou Y641 mutante)

[0194]Procedimento Geral para Ensaio de Enzima PRC2 do Tipo Selvagem em Substrato de Oligonucleossoma. Os ensaios foram realizados em um tampão que consiste de bicina 20 mM (pH = 7,6), DTT 0,5 mM, BSG a 0,005 %, KCI a 100 mM e Tween20 a 0,002 %, preparado no dia de uso. Os compostos em DMSO a 100 % (1 pL) foram manchados em placas de fundo V de 384 poços de polipropileno (Greiner) usando um Platemate 2X3 equipado com uma cabeça de pipeta de 384 canais (Thermo). DMSO (1 pL) foi adicionado às colunas 11, 12, 23, 24, fileiras A - H para o máximo controle de sinal, e SAH, um produto e inibidor conhecidos de PRC2 (1 pL) foram adicionados às colunas 11,12, 23, 24, fileiras I - P para o mínimo controle de sinal. Um coquetel (40 pL) contendo a enzima PRC2 do tipo selvagem e oligonucleossoma de eritrócitos de frango foi adicionado por Multidrop Combi (Thermo). Os compostos foram deixados incubar com PRC2 por 30 min a 25 °C, em seguida, um coquetel (10 pL) contendo uma mistura de SAM não-radioativa e de 3H foi adicionado para iniciar a reação (volume final = 51 pL). As concentrações finais foram como seguem: enzima PRC2 do tipo selvagem foi 4 nM, SAM não-radioativa foi 430 nM, SAM de 3H foi 120 nM, olignonucleossoma de eritrócitos de frango foi 120 nM, SAH nos poços de mínimo controle de sinal foi 1 mM e a concentração de DMSO foi de 1 %. O ensaio foi interrompido pela adição de SAM não-radioativa (10 pL) a uma concentração final de 600 pM, que dilui a SAM de 3H a um nível onde sua incorporação no substrato de olignonucleossoma de eritrócitos de frango deixa de ser detectável. 50 pL da reação na placa de polipropileno de 384 poços depois foram transferidos a uma Flashplatede 384 poços e os nucleossomas de eritrócitos de frango foram imobilizados à superfície da placa, que depois foi lavada três vezes com Tween20 a 0,1 % em um lavador de placa ELx405 Biotek. As placas foram, em seguida, lidas em um leitor de placa TopCount PerkinElmer para medir a quantidade de oligonucleossoma de eritrócitos de frango marcados com 3H limitada à superfície da Flashplate,medida como desintegrações por minuto (dpm) ou alternativamente, referida como contagem por minuto (cpm).

[0195]Onde dpm = desintegrações por minuto, cmpd = sinal em poço de ensaio, e min e max são os controles de sinal mínimos e máximos respectivos. Ajuste da ICso de Quatro parâmetros

[0196]Onde 0 topo e fundo são os normalmente deixados flutuar, mas podem ser fixos a 100 ou 0 respectivamente em um ajuste de 3-parâmetros. O Coeficiente de Hill normalmente deixado flutuar, mas também pode ser fixo a 1 em um ajuste de 3- parâmetros. Y é a % de inibição e X é a concentração do composto.

[0197]Os valores da IC50 para os ensaios de enzima PRC2 em substrato de peptídeos (por exemplo, andY641 F do tipo selvagem de EZH2) são apresentados na Tabela 3 abaixo. Ensaio de Metilação de WSU-DLCL2

[0198] As células de suspensão WSU-DLCL2 foram adquiridas a partir da DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Alemanha). Meio de RPMI/Glutamax, Penicilina-Estreptomicina, Soro Fetal Bovino Inativado por Calor, e D-PBS foram adquiridos a partir da Life Technologies, Grand Island, NY, EUA. Tampão de Extração e Tampão de Neutralização (5X) foram adquiridos a partir da Motivo Ativo, Carlsbad, CA, EUA. Anticorpo de H3 anti-histona de coelho foi adquirido a partir da Abeam, Cambridge, MA, EUA. Anti-H3K27me3 de coelho e anti-coelho-lgG conjugado com HRP foram adquiridos a partir da Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA. Substrato de TMB “Supor sinsitive” foi originado a partir de BioFX Laboratories, Owings Mills, MD, EUA. Albumina de soro bovino livre de IgG foi adquirida a partir da Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EUA. PBS com Tween (10X PBST) foi adquirido a partir da KPL, Gaithersburg, MD, EUA. Ácido sulfúrico foi adquirido a partir da Ricca Chemical, Arlington, TX, EUA. As placas de ELISA Immulon foram adquiridas a partir da Thermo, Rochester, NY, EUA. As placas de cultura celular de fundo V foram adquiridas a partir da Corning Inc., Corning, NY, EUA. As placas de polipropileno de fundo V foram adquiridas a partir da Greiner Bio-one, Monroe, NC, EUA.

[0199]As células de suspensão WSU-DLCL2 foram mantidas no meio de crescimento (RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino inativado por calor a 10 % (v/v) e 100 unidades/mL de penicilina-estreptomicina) e cultivadas a 37 °C sob CO2 a 5 %. Sob as condições de ensaio, as células foram incubadas em Meio Ensaio (RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino inativado por calor a 20 % (v/v) e 100 unidades/mL de penicilina-estreptomicina) a 37 °C sob CO2 a 5 % em um agitador de placa.

[0200]As células WSU-DLCL2 foram semeadas em meio de ensaio em uma concentração de 50,000 células por mL a uma placa de cultura de célula de fundo V de 96 poços com 200 pL por poço. O composto (1 pL) de placas fonte de 96 poços incubadas em um agitador de placa de titulação a 37 °C, CO2 a 5 % para 96 horas. Depois de quatro dias de incubação, as placas foram giradas a 241 x g por cinco minutos e o meio foi aspirado suavemente para cada poço de placa de células sem perturbar o sedimento celular. A pelota foi recolocada em suspensão em DPBS 200 pL e as placas foram giradas novamente a 241 x g por cinco minutos. O sobrenadante foi aspirado e esfriado (4 qC), tampão de extração (100 pL) foi adicionado por poço. As placas foram incubadas a 4 °C em agitador orbital para duas horas. As placas foram giradas a 3427 x g x 10 minutos. O sobrenadante (80 pL por poço) foi transferido a seu poço respectivo em placa de polipropileno de fundo V de 96 poços. Tampão de Neutralização 5X (20 pL por poço) foi adicionado à placa de polipropileno de fundo V contendo sobrenadante. As placas de polipropileno de fundo V contendo preparação de histona bruta (CHP) foram incubadas em agitador orbital x cinco minutos. As Preparações de Histona Brutas foram adicionadas (2 pL por poço) a cada poço respectivo em duplicata de placas de ELISA de 96 poços contendo Tampão de Revestimento 100 pL (1X PBS + BSA a 0,05 % (p/v)). As placas foram seladas e incubadas durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, as placas foram lavadas três vezes com 1X PBST (300 pL por poço). Os poços foram bloqueados por duas horas com Diluente de ELISA (300 pL por poço) ((PBS (1X) BSA (2 % (p/v)) e Tween20 (0,05 % (v/v))). As placas foram lavadas três vezes com 1X PBST. Para a placa de detecção de Histona H3, 100 pL por poço foram adicionados de anticorpo anti-Histona-H3 (Abeam, ab1791) diluído 1:10,000 em Diluente de ELISA. Para a placa de detecção de trimetilação H3K27, 100 pL por poço foram adicionados de anti-H3K27me3 diluído 1:2000 em diluente de ELISA. As placas foram incubadas por 90 minutos na temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com 1X PBST (300 pL por poço). Para a detecção de Histona H3, 100 pL de anticorpo para IgG anti-coelho conjugado com HRP diluído a 1:6000 em diluente de ELISA foram adicionados por poço. Para a detecção de H3K27me3, 100 pL de anticorpo de IgG anti-coelho conjugado com HRP diluído a 1:4000 em diluente de ELISA foram adicionados por poço. As placas foram incubadas na temperatura ambiente por 90 minutos. As placas foram lavadas quatro vezes com 1X PBST (300 pL por poço). O substrato de TMB (100 pL) foi adicionado por poço. As placas de Histona H3 foram incubadas por cinco minutos na temperatura ambiente. As placas de H3K27me3 foram incubadas por 10 minutos na temperatura ambiente. A reação foi interrompida com ácido sulfúrico 1N (100 pL por poço). Absorvância para cada placa foi lida a 450 nm.

[0201]Primeiro, a razão para cada poço foi determinada por:

[0202]Cada placa incluiu oito poços controle de DMSO apenas para tratamento (Inibição Mínima), assim como oito poços controle para inibição máxima (poços de fundo).

[0203]A média dos valores de razão para cada tipo de controle foi calculada e usada para determinar a percentagem de inibição para cada poço de teste na placa. O composto de teste foi diluído em série, três vezes em DMSO para um total de dez concentrações de teste, começando a 25 pM. A percentagem de inibição foi determinada e as curvas da ICso foram geradas usando poços em duplicata por concentração de composto. Os valores da ICso para este ensaio são apresentados na Tabela 3 abaixo.

Análise de Proliferação Celular

[0204]As células de suspensão WSU-DLCL2 foram adquiridas a partir da DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Alemanha). Meio RPMI/Glutamax, Penicilina-Estreptomicina, Soro Fetal Bovino Inativado por Calor foram adquiridos a partir da Life Technologies, Grand Island, NY, EUA. As placas de 384 poços de polipropileno de fundo V foram adquiridas a partir da Greiner Bio-one, Monroe, NC, EUA. As placas opacas brancas de 384 poços de cultura de células foram adquiridas a partir da Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA. Cell-Titer Glo® foi adquirido a partir da Promega Corporation, Madison, Wl, EUA. Leitor de placa M5 SpectraMax foi adquirido a partir da Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, EUA.

[0205]As células de suspensão WSU-DLCL2 foram mantidas em meio de crescimento (RPMI 1640 suplementado com 10 % (v/v) soro fetal bovino inativado por calor e cultivado a 37 °C sob CO2 a 5 %. Sob condições de ensaio, as células foram incubadas em meio de ensaio (RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino inativado a 20 % (v/v) por calor e 100 unidades/mL de penicilina- estreptomicina) a 37 °C sob CO2 a 5 %.

[0206]Para a avaliação do efeito de compostos na proliferação da linhagem de células WSU-DLCL2, as células de crescimento exponencial foram plaqueadas em placas opacas brancas de 384 poços em uma densidade de 1250 células/ml em um volume final de 50 pl de meio de ensaio. Uma placa fonte de composto foi preparada efetuando diluições em série de 3 vezes em nove pontos em triplicata em DMSO, começando a 10 mM (concentração de topo final de composto no ensaio foi de 20 pM e do DMSO foi de 0,2 %). Uma alíquota de 100 nL da placa de estoque de composto foi adicionada a seu poço respectivo na placa de células. O controle de inibição a 100 % consistiu de células tratadas com destaurosporina de concentração final 200 nM e o controle de inibição a 0 % consistiu de células tratadas com DMSO. Depois da adição de compostos, as placas de ensaio foram incubadas por 6 dias a 37 °C, CO2 a 5 %, umidade relativa > 90 % por 6 dias. A viabilidade celular foi medida por quantização de ATP presente nas culturas de células, adicionando 35 pl de reagente Cell Titer Glo® às placas de células. A luminescência foi lida no M5 SpectraMax. A viabilidade de células que inibem a concentração por 50 % foi determinada usando um ajuste de 4-paramétricos das curvas de resposta de dose normalizadas. Os valores da IC50 para este ensaio são apresentados na Tabela 3 abaixo.

Estudo In Vivo - Linhagem Celular de Linfoma Humana SUDHL10 Camundongos

[0207]Camundongos Fox Chase SCID® fêmeas (CB17/\cr-Prkdcscid/\cr\c°Cr\, Beijing Vitalriver Laboratory Animal Co., LTD) de 6 a 8 semanas de idade e um peso corpóreo (BW) variando de 16,0 a 21,1 g no D1 do estudo. Os animais foram alimentados à vontade com água (estéril) e alimentos granulados secos esterilizados por irradiação. Os camundongos foram alojados em cama de espiga de milho em microisoladores estáticos em um ciclo de luz de 12 horas entre 20 a 22 °C (68 a 72 °F) e 40 a 60 % de umidade. Todos os procedimentos em conformidade com as recomendações do Guide for Care and Use of Laboratory Animals com respeito à restrição, criação, procedimentos cirúrgicos, regulação de alimentação e fluido, e cuidados veterinários. Cultura de Células Tumorais

[0208]A linhagem celular de linfoma humana SUDHL10 foi obtida a partir de DSMZ e mantida no CRO como culturas de suspensão em meio RPMI-1640 contendo 100 unidades/mL de sal de sódio de penicilina G, 100 g/mL de estreptomicina e 10 % de soro fetal bovino. As células foram cultivadas em frascos de cultura de tecido em uma incubadora umidificada a 37 °C, em uma atmosfera de CO2 a 5 % e ar a 95 %. Apenas as culturas abaixo da passagem 12 foram usadas para a implantação. Implantação de Tumor In Vivo

[0209]A linhagem celular de linfoma humana SUDHL10 foi colhida durante crescimento de fase de mid-log, e re-colocada em suspensão em PBS com Matrigel™ a 50 % (BD Biosciences). Cada camundongo recebeu 1 x 107células (0,2 mL de suspensão celular) subcutaneamente no flanco direito. Os tumores foram calibrados em duas dimensões para monitorar o crescimento como o volume médio aproximado da faixa de 80 a 120 mm3 desejada. O tamanho de tumor, em mm3, foi calculado de:

onde w = largura e / = comprimento, em mm, do tumor. O peso do tumor pode ser estimado com o pressuposto de que 1 mg é equivalente a 1 mm3 de volume de tumor. Depois de 10 dias, os camundongos com tumores de 72 a 256 mm3 foram divididos em quatro grupos (n = 16 por grupo) com volume médio de tumores de 173 a 179 mm3. Artigos de Teste

[0210]O hidrobrometo de Composto I foi armazenado na temperatura ambiente e protegido da luz. Em cada dia de tratamento, formulações de compostos recém- preparadas foram preparadas suspendendo o pó em 0,5 % de carboximetilcelulose de sódio (NaCMC) e 0,1 % de Tween® 80 em água deionizada. O veículo, 0,5 % de NaCMC e 0,1 % de Tween® 80 em água deionizada, foi usado para tratar o grupo controle no mesmo cronograma. As formulações foram armazenadas distantes da luz a 4 °C antes da administração. Plano de Tratamento

[0211]Os camundongos foram tratados com doses do hidrobrometo de Composto I variando de 125 a 500 mg/kg e em cronogramas de BID (duas vezes um dia a cada 12 h) por 28 dias por sonda oral. Cada dose foi liberada em um volume de 0,2 mL/20 g de camundongo (10 mL/kg), e ajustada para o último peso registrado de animais individuais. No dia 25, os 8 camundongos com os menores tumores por grupo foram escolhidos para um ponto de extremidade de atraso de crescimento de tumor (observação de 60 dias). Os animais remanescentes foram sacrificados no dia 28, 3 h após a última dose para a coleta de tumor. Análise de Volume Médio de Tumor (MTV) e Inibição de Crescimento de Tumor (TGI)

[0212]A eficácia do tratamento foi determinada no último dia de tratamento. MTV(n), o volume médio de tumor para o número de animais, n, avaliável no último dia, foi determinado para cada grupo. A percentagem de inibição de crescimento de tumor (% de TGI) pode ser definida de várias maneiras. Primeiro, a diferença entre o MTV(n) do grupo controle designado e o MTV(n) do grupo tratado com fármaco é expressada como uma percentagem do MTV(n) do grupo controle:

[0213]Uma outra maneira de calcular a % de TGI é tomando a mudança do tamanho de tumor do dia 1 ao dia n em conta com n sendo o último dia de tratamento.

[0214]Oito camundongos por grupo foram mantidos vivos após o último dia de tratamento para a análise de atraso de crescimento de tumor. Os tumores foram calibrados duas vezes por semana e cada animal de teste foi sacrificado quando o seu neoplasma atingiu o volume de ponto de extremidade de 2000 mm3 ou no último dia pré-especificado do estudo, o que ocorresse em primeiro lugar. A análise de sobrevivência de Kaplan Meier foi realizada. Toxicidade

[0215]Os animais foram pesados diariamente nos Dias 1 a 5, e, em seguida, duas vezes semanalmente até a conclusão do estudo. Os camundongos foram examinados frequentemente para sinais evidentes de quaisquer efeitos colaterais adversos, relacionados com o tratamento, que foram documentados. A toxicidade aceitável para a dose máxima tolerada (MTD) foi definida como uma perda média de BW de grupo de menos do que 20 % durante o teste, e não mais do que 10 % de mortalidade devido a mortes de TR. Uma morte era para ser classificada como TR se ela foi atribuível para os efeitos colaterais do tratamento como evidenciado por sinais e/ou necropsia clínicos, ou devido à causa desconhecida durante o período de dosagem. Uma morte era para ser classificada como NTR se havia evidência de que a morte não estava relacionada a efeitos colaterais do tratamento. As mortes de NTR durante o intervalo de dosagem seriam tipicamente categorizados como NTRa (devido a um acidente ou erro humano) ou NTRm (devido à disseminação de tumor confirmada necropsia por invasão e/ou metástase). Os animais tratados oralmente que morrem de causas desconhecidas durante o período de dosagem podem ser classificados como NTRu quando o desempenho do grupo não suporta uma classificação e necropsia de TR, para descartar um erro de dosagem, não é viável. Amostragem

[0216]No dia 28, oito camundongos com os maiores tumores foram experimentados em uma forma pré-especificada para avaliar a inibição alvo em tumores. Os tumores foram colhidos de camundongos especificados sob condições livres de RNAse e divididos. O peso total de tumor foi medido. Tecido tumoral congelado de cada animal foi congelado em N2 líquido e pulverizado com um almofariz. Análises Estatísticas e Gráficas

[0217]Todas as análises estatísticas e gráficas foram realizadas com Prism 3.03 (GraphPad) para Windows. Para testar a significância estatística entre os grupos controle e tratados ao longo de todo 0 curso do tratamento foi utilizado um teste ANOVA de medições repetidas seguido por teste pós múltipla comparação de Dunnets. O Prism relata resultados como não-significante (ns) em P> 0,05, significante (simbolizado por “*”) em 0,01 <P< 0,05, muito significante (“**”) em 0,001 <P < 0,01 e extremamente significante (“***”) em P< 0,001. Para o ramo de atraso de crescimento de tumor do estudo, a percentagem de animais em cada grupo remanescente no estudo versus o tempo foi apresentada em um lote de sobrevivência de Kaplan-Meier. Extração de Histona

[0218]Para o isolamento de histonas, 60 a 90 mg de tecido tumoral foram homogeneizados em 1,5 ml de tampão de extração nuclear (Tris-HCI 10 mM, MgCI2 10 mM, KCI 25 mM, Triton X-100 a 1 %, Sacarose a 8,6 %, mais um comprimido inibidor de protease Roche 1836145) e incubados em gelo por 5 minutos. Os núcleos foram coletados por centrifugação a 600 g por 5 minutos a 4o C e lavados uma vez em PBS. O sobrenadante foi removido e histonas extraídas por uma hora, com vórtex a cada 15 minutos, com ácido sulfúrico frio 0,4 N. Os extratos foram clarificados por centrifugação a 10000 g por 10 minutos a 4 °C e transferidos a um tubo microcentrifugador recém-preparado contendo 10x volume de acetona gelada. As histonas foram precipitadas a -20° C por 2 horas durante a noite, peletizadas por centrifugação a 10000 g por 10 minutos e recolocadas em suspensão em água. ELISA

[0219]As histonas foram preparadas em concentrações equivalentes em tampão de revestimento (PBS + BSA a 0,05 %) fornecendo 0,5 ng/ul de amostra, e 100 ul de amostra ou padrão foram adicionados em duplicata a 2 placas ELISA de 96 poços (Thermo Labsystems, Immulon 4HBX #3885). As placas foram seladas e incubadas durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, as placas foram lavadas 3x com PBST 300 ul/poço (PBS + Tween 20 a 0,05 %; 10X PBST, KPL #51-14-02) em um lavador de placa Bio Tek. As placas foram bloqueadas com 300 ul/poço de diluente (PBS + BSA a 2 % + Tween 20 a 0,05 %), incubadas na temperatura ambiente por 2 horas, e lavadas 3x com PBST. Todos os anticorpos foram diluídos em diluente. 100 ul/poço de anti-H3K27me3 (CST #9733, 50 % de estoque de glicerol 1:1,000) ou anti-H3 total (Abeam ab1791,50 % de glicerol 1:10,000) foram adicionados a cada placa. As placas foram incubadas por 90 min na temperatura ambiente e lavadas 3x com PBST. 100 ul/poço de anti-Rb-lgG-HRP (Cell Signaling Technology, 7074) foram adicionados 1:2,000 à placa de H3K27Me3 e 1:6,000 à placa de H3 e incubados por 90 min na temperatura ambiente. As placas foram lavadas 4X com PBST. Para a detecção, 100 ul/poço de substrato de TMB (BioFx Laboratories, #TMBS) foram adicionados e as placas incubadas no escuro na temperatura ambiente por 5 min. A reação foi interrompida com 100 ul/poço de H2SO4 1N. Absorvância a 450 nm foi lida em leitor SpectaMax M5 Microplate.

Resultados:

[0220]Os camundongos portadores de xenoenxertos tumorais SUDHL10 foram tratados com 0 hidrobrometo de Composto I na dose máxima tolerada de 500 mg/kg de BID e frações de MTD (1/2 e % de MTD). Todas as doses foram bem toleradas por 28 dias sem qualquer perda de peso corpóreo significante. Houve uma morte não relacionada ao tratamento no grupo de 500 mg/kg no dia 15 devido a um erro de dosagem. Todas as doses resultaram em inibição de crescimento de tumor quando em comparação com veículo no dia 28 (Tabela 4), e os grupos de BID 250 mg/kg e 500 mg/kg induziram as regressões (TGI > 100 %). Tabela 4: Sumário de valores de inibição de crescimento de tumor induzida por hidrobrometo de Composto I em xenoenxertos SUDHL10

[0221]A Figura 12A mostra 0 crescimento dos tumores de xenoenxerto SUDHL10 com 0 passar do tempo para os grupos de tratamento diferentes. O grupo de BID 125 mg/kg não foi significantemente diferente a partir do grupo veículo por teste ANOVA de medições repetidas e pós de Dunnett, mas o tamanho médio de tumor terminal no dia 28 foi significantemente menor do que um no grupo veículo (2 vias ANOVA com teste pós de Bonferroni, p < 0,0001). A dosagem de BID 250 mg/kg e BID 500 mg/kg do hidrobrometo de Composto I para 28 dias induziu respostas de regressão comparáveis como os pesos de tumor terminal no dia 28 foram similares para aqueles de 2 grupos (Figura 12B).

[0222]As histonas isoladas de tumores colhidos no dia 28 (3 h após a última dose) foram submetidas à análise ELISA para níveis globais de H3K27me3. A Figura 13 mostra uma clara sub-regulação dependente dose da marca metil H3K27me3 com tratamento pelo hidrobrometo de Composto I. Esta figura mostra a metilação global de H3K27me3 em tumores SUDHL10 de camundongos tratados com o hidrobrometo de Composto I para os 28 dias.

[0223]No dia 25, oito camundongos por grupo com tumores pequenos foram escolhidos para um estudo de atraso de crescimento de tumor para avaliar o recrescimento de tumores após a interrupção da dosagem no dia 28. Os camundongos foram sacrificados quando seus tumores atingiram um tamanho de 2000 mm3 ou no dia 60 (o que ocorrer primeiro). Estes dados foram usados para realizar uma análise de sobrevivência de Kaplan Meier. A Figura 14A mostra que recrescimento de tumor foi claramente dependente de dose, e todos os camundongos tratados com a dose mais alta de BID 500 mg/kg por 28 dias sobreviveram até o dia 60. Apenas 2 camundongos tiveram de ser sacrificados no grupo de 250 mg/kg antes do dia 60. Os camundongos no grupo de 125 mg/kg tiveram um claro benefícil de sobrevivência sobre os camundongos tratados com veículo com um aumento em médio de sobrevivência de 15,5 dias (Figura 14B).

Efeito anti-câncer do hidrobrometo de Composto I no modelo de xenoenxerto de camundongo de linfoma de grandes células B difundido humano Pfeiffer

[0224]O mono-hidrobrometo de Composto I foi testado quanto a sua atividade anti- câncer em modelo de xenoenxerto camundongo Pfeiffer, que é um modelo de xenoenxerto de linfoma de grandes células B difundido humano. Fêmeas de camundongos NSG de 5 semanas de idade (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) foram implantadas subcutaneamente com 20 a 25 mg de fragmentos de tumor. O tratamento foi iniciado aproximadamente 31 dias após a implantação do tumor, quando os tumores médios atingiram aproximadamente 365 mm3. O esquema de tratamento é descrito na Tabela 5.

§ Devido à questão de tolerabilidade de composto, apenas 12 doses diárias foram fornecidas a estes grupo.

[0225]O volume de tumor foi seguido ao longo do experimento. O volume de tumor foi medido duas vezes semanalmente após o início do tratamento. A carga tumoral (mg = mm3) foi calculada de medições calibradas pela fórmula para o volume de um elipsoide alongado (LxW2)/2 onde L e W são as medições de comprimento e largura ortogonais respectivas (mm).

[0226]O Dia 1 foi o dia do primeiro tratamento, e o Dia 28 foi o dia do último tratamento. Este estudo foi terminado 36 dias após a última dose, assim, o Dia 64 foi o dia da terminação do estudo. Os pontos de extremidade primários usados para avaliar a eficácia neste estudo foram regressões de tumor completas (CR), tamanhos de tumor entre os grupos, e percentagem de inibição tumoral no final do estudo. Uma resposta completa foi definida como uma diminuição em tamanho de tumor para um tamanho não detectável (< 20mm3) no final do estudo. Os valores para a percentagem de inibição tumoral foram calculados a partir da fórmula [1- (ΔT/ΔC)] x 100, onde ΔT e ΔC são alteração em volume médio de tumor (Δ crescimento) para cada grupo tratado (T) e controle (C). To e Co (urn dia antes da primeira dose) foram usados para o volume de tumor de partida. Adicionalmente, os volumes de tumor que foram tomados um dia após a última dose (T29 e C29) foram usados para 0 cálculo de ΔT e ΔC. Quando 0 valor foi maior do que 100 %, foi concluído como 100 %. A fórmula usada para 0 cálculo de percentagem de inibição tumoral é mostrada abaixo.

[0227]Durante 0 período de tratamento, verificou-se que os animais conseguem tolerar 0 tratamento diário de 1142 mg/kg do hidrobrometo de Composto I e três animais neste grupo (grupo E) necessitaram de ser sacrificados após a primeira semana de tratamento devido à perda de mais do que 20 % de peso corpóreo como valor de referência. Consequentemente, a administração de fármaco para este grupo foi interrompida após 12 doses. Os animais em outros três grupos de dosagem, exceto um animal no grupo D (342 mg/kg de hidrobrometo de Composto I), todos toleraram bem 0 tratamento de 28 dias com perda de peso corpóreo mínima. O peso corpóreo de camundongo relativo foi representado na Figura 15. O peso corpóreo de animal obtido no Dia 0 foi usado como 0 peso corpóreo como valor de referência no gráfico.

[0228]O hidrobrometo de Composto I mostrou atividade anti-câncer potente e de longa duração em modelo Pfeiffer com 100 % de taxa de CR em três dos quatro grupos de dosagem (Tabela 6). Além disso, 0 recrescimento de tumor não foi observado mesmo 36 dias após a cessação do tratamento. Isto sugere que todas as células tumorais foram mortas durante 0 tratamento. Embora 0 recrescimento de tumor foi observado no grupo com a dose mais baixa (grupo B, 34,2 mg/kg), clara atividade de estase tumoral foi observada durante 0 período de tratamento (Figura 16). O tumor apenas começou a crescer após a cessação do tratamento (Figura 16). Este resultado também sugere que a atividade de estase tumoral observada no grupo B é, de fato, atividade induzida pelo artigo de teste.

€ Uma análise de variância (ANOVA) seguido por teste de múltipla comparação de Dunnett (Prism, versão 5.02, Lake Forest, CA). £ 1 animal foi sacrificado no dia 36 por peso corpóreo baixo. ¥ 3 animais foram sacrificados no dia 7, 9, e 11, individualmente, por peso corpóreo baixo.

Claims

1. Composto CARACTERIZADO por ser hidrobrometo de N-((4,6-dimetil-2- oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’- (morfolinometil)-[1,1 ’-bifenil]-3-carboxamida.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é um mono-hidrobrometo.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto é cristalino.

4. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto é substancialmente livre de impurezas.

5. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto é um sólido cristalino substancialmente livre de hidrobrometo de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3- il)metil)-5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1 ’-bifenil]- 3-carboxamida amorfo.

6. Composição farmacêutica CARACTERIZADA por compreender o composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

7. Método para preparar o composto, conforme definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO por compreender a combinação de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di- hidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’- (morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-carboxamida com ácido bromídrico.

8. Polimorfo A CARACTERIZADO por ser de hidrobrometo de N-((4,6- dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4- metil-4’-(morfolinometil)-[1,1 ’-bifenil]-3-carboxamida.

9. Polimorfo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo um ou mais picos característicos expressos em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, cerca de 17,5 +/- 0,3 graus, e cerca de 22,0 +/- 0,3 graus 2-teta.

10. Polimorfo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo picos característicos expressos em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, cerca de 17,5 +/- 0,3 graus, e cerca de 22,0 +/- 0,3 graus 2-teta.

11. Polimorfo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo um ou mais picos característicos expressos em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, cerca de 14,3 +/- 0,3 graus, cerca de 18,7 +/- 0,3 graus, cerca de 23,3 +/- 0,3 graus, e cerca de 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta.

12. Polimorfo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo pelo menos 5 picos característicos expressos em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, 10,1 +/- 0,3 graus, 14,3 +/- 0,3 graus, 17,5 +/- 0,3 graus, 18,7 +/- 0,3 graus, 20,6 +/- 0,3 graus, 20,9 +/- 0,3 graus, 21,8 +/- 0,3 graus, 22,0 +/- 0,3 graus, 23,3 +/- 0,3 graus e 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta.

13. Polimorfo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo pelo menos 6 picos característicos expressos em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, 10,1 +/- 0,3 graus, 14,3 +/- 0,3 graus, 17,5 +/- 0,3 graus, 18,7 +/- 0,3 graus, 20,6 +/- 0,3 graus, 20,9 +/- 0,3 graus, 21,8 +/- 0,3 graus, 22,0 +/- 0,3 graus, 23,3 +/- 0,3 graus e 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta.

14. Polimorfo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo pelo menos 7 picos característicos expressos em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, 10,1 +/- 0,3 graus, 14,3 +/- 0,3 graus, 17,5 +/- 0,3 graus, 18,7 +/- 0,3 graus, 20,6 +/- 0,3 graus, 20,9 +/- 0,3 graus, 21,8 +/- 0,3 graus, 22,0 +/- 0,3 graus, 23,3 +/- 0,3 graus e 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta.

15. Polimorfo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo pelo menos 8 picos característicos expressos em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, 10,1 +/- 0,3 graus, 14,3 +/- 0,3 graus, 17,5 +/- 0,3 graus, 18,7 +/- 0,3 graus, 20,6 +/- 0,3 graus, 20,9 +/- 0,3 graus, 21,8 +/- 0,3 graus, 22,0 +/- 0,3 graus, 23,3 +/- 0,3 graus e 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta.

16. Polimorfo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo pelo menos 9 picos característicos expressos em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, 10,1 +/- 0,3 graus, 14,3 +/- 0,3 graus, 17,5 +/- 0,3 graus, 18,7 +/- 0,3 graus, 20,6 +/- 0,3 graus, 20,9 +/- 0,3 graus, 21,8 +/- 0,3 graus, 22,0 +/- 0,3 graus, 23,3 +/- 0,3 graus e 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta.

17. Polimorfo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo pelo menos 10 picos característicos expressos em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, 10,1 +/- 0,3 graus, 14,3 +/- 0,3 graus, 17,5 +/- 0,3 graus, 18,7 +/- 0,3 graus, 20,6 +/- 0,3 graus, 20,9 +/- 0,3 graus, 21,8 +/- 0,3 graus, 22,0 +/- 0,3 graus, 23,3 +/- 0,3 graus e 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta.

18. Polimorfo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X tendo picos característicos expressos em graus 2-teta a cerca de 3,9 +/- 0,3 graus, 10,1 +/- 0,3 graus, 14,3 +/- 0,3 graus, 17,5 +/- 0,3 graus, 18,7 +/- 0,3 graus, 20,6 +/- 0,3 graus, 20,9 +/- 0,3 graus, 21,8 +/- 0,3 graus, 22,0 +/- 0,3 graus, 23,3 +/- 0,3 graus e 23,6 +/- 0,3 graus 2-teta.

19. Polimorfo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X substancialmente de acordo com a Figura 1.

20. Polimorfo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimorfo exibe um padrão de difração em pó de raios X substancialmente de acordo com a Tabela 1.

21. Polimorfo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimorfo exibe um termograma de calorimetria diferencial de varredura tendo um pico característico expresso em unidades de °C em uma temperatura de 255 +/- 5 °C.

22. Polimorfo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimorfo exibe um termograma de calorimetria diferencial de varredura substancialmente de acordo com a Figura 3.

23. Método para preparar o polimorfo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 22, CARACTERIZADO por compreender a combinação de N- ((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4- il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1 ’-bifenil]-3-carboxamida com ácido bromídrico.

24. Método para recristalizar o polimorfo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 22, CARACTERIZADO por compreender as seguintes etapas: (a) dissolver o Polimorfo A em um primeiro solvente e (b) adicionar um segundo solvente, tal que o dito polimorfo é recristalizado.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro solvente é etanol e o segundo solvente é MTBE.

26. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO por compreender (a) dissolver o Polimorfo A em etanol, (b) aquecer a mistura, (c) adicionar MTBE à mistura, formando um precipitado compreendendo o dito polimorfo e filtrar o precipitado tal que o dito polimorfo é recristalizado.

27. Composição farmacêutica CARACTERIZADA por compreender o polimorfo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 22, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

28. Uso de um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, de um polimorfo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 22, ou de uma composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 6 ou 27, CARACTERIZADO por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer em um sujeito em necessidade deste.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é linfoma de não-Hodgkin ou câncer de mama.

30. Uso de um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou de um polimorfo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 22, CARACTERIZADO por ser na fabricação de um medicamento para inibir a atividade histona metiltransferase de EZH2 em um sujeito em necessidade deste.

31. Método para inibir a atividade histona metiltransferase de EZH2 in vitro CARACTERIZADO por compreender administrar um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou um polimorfo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 22.

32. Método para preparar N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)- 5-(etil(tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3- carboxamida CARACTERIZADO por compreender reagir ácido 5-(etil(tetra-hidro-2H- piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-carboxílico (5) com um sal de 3-(aminometil)-4,6-dimetil-di-hidro-piridin-2(1 H)-ona.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que (5) está na forma cristalina.