MX2007012108A

MX2007012108A - Vacunas contra infeccion por chlamydia.

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Publication number: MX2007012108A
Application number: MX2007012108A
Authority: MX
Inventors: Martine Marchand; Yves Lobet; Brenda Barth; Ajay Bhatia; Mark Alderson; Jean-Francois L Maisonneuve; Florence Bernadette Nozay; Pascal Mettens; Yasir A Skeiky; Peter Probst
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2005-03-31
Filing date: 2006-03-24
Publication date: 2007-12-05
Also published as: AU2006229968A1; JP2012180367A; MA30250B1; US20090022755A1; EA200701825A1; WO2006104890A3; EP2392347A2; CA2602637A1; EP2392348A2; EP2392348A3; SG158145A1; EP2392349A3; EA014527B1; EP2392349A2; CN101184504A; EA201001322A1; IL186264A0; UA97943C2; EP2386314A1; EP2392347A3

Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones que comprenden proteinas o polinucleotidos de Chlamydia sp., en particular a combinaciones de proteinas o polinucleotidos que los codifican, y a metodos para el uso de las proteinas o polinucleotidos en el tratamiento, la prevencion, y el diagnostico de infeccion por Chlamydia.

Description

VACUNAS CONTRA INFECCIÓN POR CHLAMYDIA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general al tratamiento o a la prevención de infección por Chlamydia. En particular, la invención se refiere a composiciones de polipéptidos que comprenden un antígeno de Chlamydia y combinaciones del mismo, y a composiciones de polinucleótidos que codifican un antígeno de Chlamydia y combinaciones del mismo, y al uso de estas composiciones para el tratamiento profiláctico o terapéutico de infección por Chlamydia. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las Chlamydiae son los patógenos bacterianos intracelulares que son responsables de una amplia variedad de infecciones humanas y animales importantes. Chlamydia trachomatis se transmite entre los seres humanos a través del contacto social o sexual. Existen un número de serotipos de Chlamydia trachomatis, y, aunque continúa evolucionando la identificación y clasificación de los serotipos, se han reportado cuando menos 18 hasta la fecha. Los serotipos A a C están primordialmente asociados con tracoma ocular, los serotipos D a K con enfermedad oculogenítal, y los serotipos L1 a L3 con linfogranuloma venéreo (LGV) (Brunham, R. C. y colaboradores, J. Nat. Rev. Immunol. 20055:149-161). Chlamydia trachomatis es una de las causas más comunes de las enfermedades sexualmente transmitidas, y puede conducir a enfermedad inflamatoria pélvica (PID), dando como resultado obstrucción tubal e infertilidad. Chlamydia trachomatis también puede tener un papel en la infertilidad masculina. En 1990, se estimó que el costo de tratar la enfermedad inflamatoria pélvica en los Estados Unidos fue de $4 miles de millones de dólares. La Organización Mundial de la Salud estimó que en 1999, se presentaron más de 90 millones de casos nuevos de Chlamydia trachomatis sexualmente transmitida en todo el mundo (Global Prevalence and Incidence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections, Organización Mundial de la Salud, Ginebra, 2001). Adicionalmente, las enfermedades ulcerativas sexualmente transmitidas, tales como la infección por Chlamydia trachomatis, son un importante factor de riesgo para la adquisición de VIH (Brunham, R. C. y colaboradores, J. Nat. Rev. Immunol. 2005 5:149-161; Igietseme, J. U. y colaboradores, Expert Rev. Vaccines 2003 2(1):129-146). El tracoma, debido a la infección ocular con Chlamydia trachomatis, es la principal causa de ceguera que se puede prevenir en todo el mundo, y se estima que afecta a 300 a 500 millones de personas (West, S. K. Prog. Ret. Eye Res. 2004 23:381-401). El tratamiento actual involucra el uso de antibióticos, tales como tetraciclina (diariamente durante un período de 4 a 6 semanas) o azitromicina (una sola dosis). Aunque es efectivo para combatir la infección, en general se presenta una re-infección debido a la naturaleza endémica de la infección. La infección repetida durante muchos años conduce a formación de tejido fibroso en el párpado, distorsión del margen del párpado, y frotamiento de las pestañas del ojo contra la córnea (triquíasis). El trauma constante a la córnea es tanto doloroso como conduce a opacidad de la córnea y ceguera (Mabey, D. C. W. y colaboradores, The Lancet 2003362:223-229) Chlamydia pneumoniae es una importante causa de las infecciones agudas del tracto respiratorio en los seres humanos, y también se cree que tiene un papel en la patogénesis de la ateroesclerosis, y en particular, en la enfermedad cardíaca coronaria. Se ha demostrado que los individuos con una alta titulación de anticuerpos para Chlamydia pneumoniae tienen el doble de probabilidades de sufrir de enfermedad cardíaca coronaria que los individuos seronegativos. Con frecuencia, la infección por Chlamydia es asintomátíca y subclínica, de tal manera que se pueden presentar complicaciones severas y con frecuencia irreversibles como los primeros síntomas de la infección genital. Los bebés nacidos de una madre con una infección por Chlamydia genital pueden desarrollar neumonía, y se considera que la Chlamydia trachomatis es el agente causativo más común de neumonía durante los primeros seis meses de vida (de la Maza, L. M. y colaboradores, Curr. Opin. Investig. Drugs 2002 3(7):980-986). Por consiguiente, las infecciones por Chlamydia constituyen un problema de salud significativo, tanto en los países desarrollados como en desarrollo. A la luz de las preocupaciones por la salud pública, y al hecho de que el costo de los tratamientos actuales es excesivo en muchos países en desarrollo, el desarrollo de vacunas para las especies de Chlamydia ha sido un objetivo de investigación importante. Debido a que la formación genómica de Chlamydia trachomatis es relativamente estable, y debido a que la presencia de depósitos animales es negligible, inclusive las vacunas con una eficacia limitada pueden tener un impacto significativo sobre la prevalencia de las infecciones. Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad en la técnica de mejores vacunas y composiciones farmacéuticas para la prevención y el tratamiento de infecciones por Chlamydia. También sigue existiendo una necesidad en la técnica de vacunas multivalentes para la prevención y el tratamiento de infecciones por Chlamydia trachomatis que sean efectivas contra un rango de serotipos. La presente invención satisface estas necesidades, y además proporciona otras ventajas relacionadas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones que comprenden antígenos de patógenos bacterianos de Chlamydia. Estos patógenos bacterianos incluyen Chlamydia trachomatis, Chlamydia psitacci, Chlamydia pneumonía, y Chlamydia muridarum. Los antígenos de Chlamydia pueden derivarse a partir de cualquier número de serotipos dentro de una especie de Chlamydia. Se debe observar que la Chlamydia muridarum previamente se conocía como la cepa de neumonitis de ratón de Chlamydia trachomatis (MoPn), y ambos nombres todavía están en uso común, aunque se refieren a la misma bacteria. Para mayor consistencia, en la presente solamente se utiliza el nombre de Chlamydia muridarum. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de los inventores de que los polipéptidos de Chlamydia poseen propiedades inmunogénicas y antigénicas, y pueden ofrecer protección contra la infección por Chlamydia cuando se administran como vacunas profilácticas. Se puede ver algún nivel de reactividad cruzada entre los antígenos de diferentes serotipos y especies, y por consiguiente, se predice que los antígenos de Chlamydia proporcionarán una respuesta inmune protectora contra una especie o serotipo diferente de aquélla a partir de la cual se obtenga el antígeno. De una manera más específica, los inventores han descubierto que ciertas combinaciones de polipéptidos de Chlamydia proporcionan una buena respuesta inmune. Se ha demostrado que ciertas combinaciones de polipéptidos de Chlamydia proporcionan protección contra la infección por Chlamydia en modelos de ratón. En una modalidad específica, los polipéptidos de Chlamydia aislados o purificados de la invención se pueden formular como composiciones farmacéuticas para su administración a un sujeto en la prevención y/o el tratamiento de infección por Chlamydia. La inmunogenicidad de la composición de proteína se puede mejorar medíante la inclusión de un adyuvante. En una modalidad específica, los polipéptidos de Chlamydia aislados o purificados se administran como combinaciones de antígenos individuales, opcionalmente en combinación con un adyuvante. De una manera alternativa, los polipéptidos de Chlamydia se administran en la forma de una proteína de fusión, opcionalmente en combinación con un adyuvante. En otro aspecto de la invención, se utilizan polinucleótídos aislados o purificados para producir antígenos de polipéptidos recombinantes in vitro. De una manera alternativa, los polinucleótidos se pueden administrar a un sujeto como vacunas de polinucleótidos para provocar la expresión del antígeno en el sujeto, y la subsiguiente inducción de una respuesta inmune an\\-Chlamydia.

En un aspecto adicional de la invención, ciertas combinaciones de polipéptidos de Chlamydia de acuerdo con la presente invención, fragmentos inmunogénicos de los mismos, o polinucleótidos que los codifican, que se derivan a partir de un primer serotipo de Chlamydia trachomatis, se pueden administrar a un sujeto para el tratamiento o la prevención de infección por Chlamydia a partir de un segundo serotipo de Chlamydia trachomatis. También es un objeto de la invención que se utilicen los polipéptidos en ensayos in vitro para detectar anticuerpos humorales o inmunidad mediada por células contra Chlamydia para el diagnóstico de la infección o el monitoreo del progreso de la enfermedad. De una manera alternativa, los polipéptidos se pueden utilizar como inmunógenos para generar anticuerpos a n ti- Chlamydia en un animal no humano. Los anticuerpos se pueden utilizar para detectar los antígenos objetivo in vivo e in vitro. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra los datos de dispersión bacteriana en el Día 7 en ratones Balb/c, que representan los datos de tres experimentos en donde se inmunizaron grupos de cinco ratones Balb/c con las combinaciones indicadas de antígenos en AS01B. La gráfica representa datos de tres experimentos en donde se inmunizaron grupos de cinco ratones Balb/c con la combinación indicada de antígenos en el adyuvante AS01B. UVEB del serotipo E formulado con AS01B sirvió como un control positivo de protección, y se utilizaron ratones falsamente inmunizados con AS01B como el control positivo de la infección. Los ratones tratados con progesterona se estimularon con una dosis ¡ntra-vaginal de 5x105 IFU del serotipo K. La dispersión bacteriana se cuantificó tomando absorciones en el Día 7 después de la infección, y determinando la IFU utilizando células McCoy. Se reservaron los datos de un experimento respaldo con respaldo. La Figura 2 muestra la dispersión de Chlamydia en LGT, y el estímulo posterior de carga de Chlamydia con Chlamydia trachomatis serotipo K en el UGT de ratones Balb/c inmunizados con combinaciones de antígenos. Las gráficas representan los datos de los experimentos respaldo con respaldo, en donde se inmunizaron grupos de 8 ratones Balb/c con la combinación indicada de antígenos en el adyuvante AS01B. El UVEB del serotipo E formulado con AS01B sirvió como un control positivo de protección, y se utilizaron ratones falsamente inmunizados con AS01B como el control de la infección. Los ratones tratados con progesterona se estimularon con una dosis intra-vaginal de 5x105 IFU del serotipo K. La dispersión bacteriana se cuantificó tomando absorciones en el Día 7 después del estímulo, y determinando las IFU utilizando células McCoy. Los ratones se sacrificaron 10 días después de la infección para determinar la carga de Chlamydia en el tracto genital superior medíante la homogeneización de la mitad del tracto genital superior, y determinando las IFU utilizando células McCoy. Se debe observar que el límite de detección fue de 10 con respecto a las dos gráficas anteriores. La Figura 3 muestra los datos de dispersión bacteriana en el Día 7 en ratones C57BI/6 inmunizados con las combinaciones indicadas de antígenos en AS01B. Las gráficas representan los datos de los experimentos respaldo con respaldo, en donde se inmunizaron grupos de 8 ratones C57BI/6 con la combinación indicada de antígenos en AS01B. El UVEB del serotipo E formulado con AS01B sirvió como un control positivo de protección, y se utilizaron ratones falsamente inmunizados con AS01B como el control de infección. Los ratones tratados con progesterona se estimularon con una dosis intra-vaginal de 5x105 IFU del serotipo K. La dispersión bacteriana se cuantificó tomando absorciones en el Día 7 después del estímulo, y determinando las IFU utilizando células McCoy. La Figura 4 muestra los datos de dispersión bacteriana en el Día 7 en ratones Balb/c inmunizados con las combinaciones indicadas de antígenos en AS01B. Las gráficas representan los datos reservados de cinco experimentos, en donde se inmunizaron grupos de 5 a 8 ratones Balb/c con la combinación indicada de antígenos en AS01B. El UVEB del serotipo E formulado con AS01B sirvió como un control positivo de protección, y se utilizaron ratones falsamente inmunizados con AS01B como el control de la infección. Los ratones tratados con progesterona se estimularon con una dosis intravagínal de 5x105 IFU del serotipo K. La dispersión bacteriana se cuantificó tomando absorciones en el Día 7 después del estímulo, y determinando las IFU utilizando células McCoy. La Figura 5 muestra los datos de dispersión bacteriana en el Día 7 en ratones C57BI/6 inmunizados con las combinaciones indicadas de antígenos en AS01B. Las gráficas representan los datos reservados de tres experimentos en donde se inmunizaron grupos de 5 a 8 ratones C57BI/6 con la combinación indicada de antígenos en AS01B. El UVEB del serotipo E formulado con AS01B sirvió como un control positivo de protección, y se utilizaron ratones falsamente inmunizados con AS01B como el control de la infección. Los ratones tratados con progesterona se estimularon con una dosis intra-vaginal de 5x105 IFU del serotipo K. La dispersión bacteriana se cuantíficó tomando absorciones en el Día 7 después del estímulo, y determinando las IFU utilizando células McCoy. La Figura 6 muestra la alineación de secuencias para Ct-089 de Chlamydia trachomatis serotipo E, con Ct-089 de un rango de otros serotipos de Chlamydia trachomatis.

Las Figuras 7a y 7b muestran la alineación de secuencias para Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo E, con Ct-858 de un rango de otros serotipos de Chlamydia trachomatis. Las Figuras 8a y 8b muestran la alineación de secuencias para Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo E, con Ct-875 de un rango de otros serotipos de Chlamydia trachomatis. La Figura 9 muestra los resultados de una comparación de identidades de secuencias de aminoácidos de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotípo E, con Ct-089 de un rango de otros serotipos de Chlamydia trachomatis. La Figura 10 muestra los resultados de una comparación de identidades de secuencias de aminoácidos de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo E, con Ct-858 de un rango de otros serotipos de Chlamydia trachomatis. La Figura 11 muestra los resultados de una comparación de identidades de secuencias de aminoácidos de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo E, con Ct-875 de un rango de otros serotipos de Chlamydia trachomatis. La Figura 12 muestra la alineación de secuencias para Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo E, con proteínas equivalentes de otros serotipos de Chlamydia trachomatis y especies de Chlamydia.

La Figura 13 muestra la alineación de secuencias para Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo E, con proteínas equivalentes de otros serotipos de Chlamydia trachomatis y especies de Chlamydia. La Figura 14 muestra la alineación de secuencias para Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo E, con proteínas equivalentes de otros serotipos de Chlamydia trachomatis y especies de Chlamydia. La Figura 15 muestra los resultados de la absorción tomada de ratones inmunizados con Ct-089, Ct-858, y Ct-875 del serotipo E de Chlamydia trachomatis, 4 días después del estímulo con Chlamydia trachomatis, serotipos D, K, ó J. Los UVEB en cada caso se derivan del mismo serotipo utilizado para el estímulo (es decir, J, D, y K, respectivamente). Ambos UVEB y el tratamiento de combinación se llevan a cabo en la presencia del adyuvante (es decir, AS01B). La Figura 16 muestra los resultados de la absorción tomada de los ratones inmunizados con Ct-089, Ct-858, y Ct-875 del serotipo E de Chlamydia trachomatís, 7 días después del estímulo con Chlamydia trachomatis, serotipos D, K, ó J. Los UVEB en cada caso se derivan a partir del mismo serotipo utilizado para el estímulo (es decir, J, D, y K, respectivamente). Ambos UVEB y el tratamiento de combinación se llevan a cabo en la presencia del adyuvante (es decir, AS01B). La Figura 17 muestra la colonización del tracto genital superior de los ratones inmunizados con Ct-089, Ct-858, y Ct-875 del serotipo E de Chlamydia trachomatis, 10 días después del estímulo con Chlamydia trachomatis, serotipos D, K, ó J. Los UVEB en cada caso se derivan a partir del mismo serotipo utilizado para el estímulo (es decir, J, D, y K, respectivamente). Ambos UVEB y el tratamiento de combinación se llevan a cabo en la presencia del adyuvante (es decir, AS01B).

La Figura 18 muestra los resultados de la absorción tomada de los ratones inmunizados con Ct-089, Ct-858, y Ct-875 del serotipo E de Chlamydia trachomatis, 4 días después del estímulo con Chlamydia trachomatis, serotipos K ó J. Los UVEB en cada caso se derivan a partir del mismo serotipo utilizado para el estímulo (es decir, J y K, respectivamente). Ambos UVEB y el tratamiento de combinación se llevan a cabo en la presencia del adyuvante (es decir, AS01B). La Figura 19 muestra los resultados de la absorción tomada de los ratones inmunizados con Ct-089, Ct-858, y Ct-875 del serotipo E de Chlamydia trachomatis, 7 días después del estímulo con Chlamydia trachomatis, serotipos K ó J. Los UVEB en cada caso se derivan a partir del mismo serotipo utilizado para el estímulo (es decir, J y K, respectivamente). Ambos UVEB y el tratamiento de combinación se llevan a cabo en la presencia del adyuvante (es decir, AS01B). La Figura 20 muestra la colonización del tracto genital superior de los ratones inmunizados con Ct-089, Ct-858, y Ct-875 del serotipo E de Chlamydia trachomatis, 10 días después del estímulo con Chlamydia trachomatis, serotípos K ó J. Los UVEB en cada caso se derivan a partir del mismo serotipo utilizado para el estímulo (es decir, J y K, respectivamente). Ambos UVEB y el tratamiento de combinación se llevan a cabo en la presencia del adyuvante (es decir, AS01B). La Figura 21 muestra la proporción de respondentes de CD4 (para un corte de la señal al ruido S/N de cuando menos 2:1) al estímulo con un rango de antígenos para un número de grupos de sujetos seropositivos. La Figura 22 muestra la proporción de respondentes de CD4 (para un corte de la señal al ruido de cuando menos 3:1) al estímulo con un rango de antígenos para un número de grupos de sujetos seropositivos. La Figura 23 muestra la proporción de respondentes de CD4 (para un corte de la señal al ruido de cuando menos 2:1) al estímulo con un rango de antígenos y combinaciones de los mismos para un número de grupos de sujetos seropositivos. DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES ESPECÍFICAS La presente invención se refiere a composiciones que comprenden combinaciones de antígenos útiles para el diagnóstico, la prevención, y el tratamiento de infección por Chlamydia, a polinucleótidos que codifican estos antígenos, y a métodos para su uso. Los antígenos de la presente invención son polipéptidos de antígenos de Chlamydia y fragmentos inmunogénicos de los mismos.

En particular, las composiciones de la presente invención pueden comprender una combinación de dos o más proteínas de Chlamydia o fragmentos inmunogénicos de las mismas. Estas proteínas se pueden seleccionar a partir de Swib (también conocida como Ct-460), Momp (proteína de membrana externa mayor, también conocida como Ct-681), Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089 (también conocidas como CopN), dominio de pasajero de PmpG (PmpGpd, también conocida como Ct-871), y dominio de pasajero de PmpD (PmpDpd, también conocida como Ct-812). Por ejemplo, la composición de la presente invención puede comprender Ct-089 y Ct-858 o fragmentos inmunogénicos de los mismos, y opcionalmente antígenos adicionales, los cuales se pueden seleccionar, por ejemplo, a partir de Momp, Ct-875, Ct-622, PmpGpd, y PmpDpd. En un ejemplo adicional, la composición de la presente invención puede comprender Ct-875 y Ct-858, o fragmentos ¡nmunogénicos de los mismos, y opcionalmente antígenos adicionales, los cuales se pueden seleccionar, por ejemplo, a partir de Momp, Ct-622, Ct-089, PmpGpd, y PmpDpd. Por ejemplo, la composición de la presente invención puede comprender una de las siguientes combinaciones de polipéptidos de Chlamydia o fragmentos inmunogénicos de los mismos: 1. Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-089, Swib V. PmpDpd, Ct-858, Ct-089, Swib 2. Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-622, Ct-089, Swib 3. Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, Ct-622, Ct-089 4. Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089 5. Ct-858, Ct-875, Ct-089 51. PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Ct-089 6. Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd, Ct-089 Todas las combinaciones anteriores comprenden Ct-089 y Ct-858. En un conjunto adicional de ejemplos, la composición de la presente invención comprende una de las siguientes combinaciones, en el entendido de que todas las combinaciones comprenden Ct-089 y Ct-858: 1a. Los cinco de: Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, y Ct-089. 1'a. Tres de: PmpDpd, Ct-858, Ct-089, Swib 2a. Cinco de: Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-622, Ct-089, y Swib 3a. Cinco de: Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, Ct-622, y Ct-089 4a. Tres de: Ct-858, Ct-875, Ct-622, y Ct-089 5a. Dos de: Ct-858, Ct-875, y Ct-089 5'a. Tres de: PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Ct-089 6a. Cuatro de: Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd, y Ct-089 o de una manera alternativa: 1a". Cinco de: Swib, Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, y Ct-089. Otras composiciones de ejemplo de la presente invención pueden comprender una de las siguientes combinaciones de polipéptidos de Chlamydia, o fragmentos inmunogénicos de los mismos: 1b. Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Swib, Ct-089 1b'. PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Swib, Ct-089 2b. Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-622, Ct-875, Swib, Ct-089 3b. Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, Ct-622, Ct-875, Ct-089 4b. Ct-858, Ct-875 5b. Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-089 5b'. Momp, Ct-858, Ct-875 6b. Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd, Ct-875, Ct-089 Todas las combinaciones anteriores comprenden Ct-875 y Ct-858. En un conjunto adicional de ejemplos, la composición de la presente invención comprende una de las siguientes combinaciones, en el entendido de que todas las combinaciones comprenden Ct-875 y Ct-858: 1c. Cinco de: Swíb, Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, y Ct-875 1c'. Tres de: PmpDpd, Ct-858, Ct-0875, Swib 2c. Cinco de: Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-622, Ct-875, y Swib 3c. Cinco de: Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, Ct-622, y Ct-875 4c. Tres de: Ct-858, Ct-875, Ct-622, y Ct-089 5c'. Tres de: PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Ct-089 6c. Cuatro de: Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd, y Ct-875. Las composiciones de acuerdo con la invención comprenden dos o más proteínas de Chlamydia o fragmentos ¡nmunogénicos, por ejemplo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 proteínas o fragmentos ¡nmunogénicos. Para una composición que comprenda cada una de las combinaciones enlistadas anteriormente bajo los números 1-6, 1a-6a, 1b-6b, y 1c-6c (por ejemplo, 1-6 y 1a-6a), la combinación puede incluir otros antígenos de Chlamydia, por ejemplo un antígeno adicional de Chlamydia, o puede no contener más antígenos de Chlamydia que los enlistados. Por ejemplo, la composición 1a" puede contener solamente cinco antígenos que sean una combinación de los antígenos de Chlamydia enlistados y ningún otro antígeno, o la composición 1a" puede comprender una combinación de cinco de los antígenos de Chlamydia enlistados (tales como los seis antígenos enlistados, o cinco de los seis antígenos enlistados más otro antígeno de Chlamydia), y así sucesivamente para las composiciones 2-6, 2a-6a, 1 b-6b, y 1c-6c (por ejemplo, 2-6 y 2a-6a). Será evidente que, en el caso de los dominios pasajeros de PmpD y PmpG, éstos pueden estar presentes en el contexto de una porción más grande del antígeno o polinucleótido de PmpD ó PmpG, por ejemplo PmpD ó PmpG de longitud completa, o un fragmento de los mismos, en el entendido de que el fragmento comprenda al dominio pasajero. Las proteínas o fragmentos inmunogénicos de Momp y Swib pueden ser, por ejemplo, de Chlamydia trachomatis, o pueden ser de otras especies de Chlamydia. Los antígenos anteriormente designados como "Ct" pueden ser proteínas o fragmentos inmunogénicos de Chlamydia, o, donde sea posible, pueden ser las proteínas equivalentes de diferentes especies de Chlamydia (es decir, una especie de Chlamydia diferente de Chlamydia trachomatis). En un ejemplo, todos los antígenos de la composición de acuerdo con la invención son de Chlamydia trachomatis. Las composiciones de la presente invención pueden comprender alternativamente polmucleótidos que codifiquen la combinación de dos o más proteínas o fragmentos inmunogénicos de Chlamydia, los cuales se pueden seleccionar a partir de Swib (también conocido como Ct-460), Momp (proteína de membrana externa mayor, también conocida como Ct-681), Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, dominio pasajero de PmpG (PmpGpd, también conocido como Ct-871), y dominio pasajero de PmpD (PmpDpd, también conocido como Ct-812), por ejemplo las combinaciones de antígenos enlistadas anteriormente como 1-6, 1a-6a, y 1c-6c (por ejemplo, 1-6). Las composiciones de polinucleótidos de acuerdo con la invención incluyen aquéllas que codifiquen las combinaciones de antígenos de acuerdo con la invención, como se describen en la presente (por ejemplo, Ct-858 y Ct-875). Los polínucleótidos que codifiquen los diferentes antígenos pueden estar presentes como ácidos nucleicos separados, o pueden estar presentes juntos en un solo ácido nucleico, o una combinación de ácidos nucleicos separados y combinados. Lo siguiente proporciona secuencias de polinucleótidos y polipéptídos para algunos de los antígenos, que se pueden utilizar en las composiciones de la invención, y que se han enlistado anteriormente. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS IDENTIFICADORES DE SECUENCIAS SEQ ID NO:1 es la secuencia de ADNc de Ct-460, también conocido como Swib de Chlamydia trachomatis, serotípo LGVII (el serotipo LGVII también es referido como el serotipo Lll). SEQ ID NO:2 es la secuencia de proteína de Ct-460, también conocida como Swib de Chlamydia trachomatis, serotipo LGVII, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:3 es la secuencia de ADNc del antígeno de Chlamydia conocido como Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp) de Chlamydia trachomatis, serotipo F. SEQ ID NO:4 es la secuencia de proteína del antígeno de Chlamydia conocido como Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp) de Chlamydia trachomatis, serotipo F, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:3. SEQ ID NO:5 es la secuencia de ADNc de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo E. SEQ ID NO:6 es la secuencia de proteína de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotípo E, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:5. SEQ ID NO:7 es la secuencia de ADNc de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo E. SEQ ID NO:8 es la secuencia de proteína de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo E, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:7. SEQ ID NO:9 es la secuencia de ADNc de Ct-622 de Chlamydia trachomatis, serotipo E. SEQ ID NO:10 es la secuencia de proteína de Ct-622 de Chlamydia trachomatis, serotipo E, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:9. SEQ ID NO:11 es la secuencia de ADNc del dominio pasajero de PmpG, también conocido como Ct-871 de Chlamydia trachomatis, serotipo LGVII. SEQ ID NO:12 es la secuencia de proteína del dominio pasajero de PmpG, también conocido como Ct-871 de Chlamydia trachomatis, serotípo LGVII, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:11. SEQ ID NO:13 es la secuencia de ADNc del dominio pasajero de PmpD, también conocido como Ct-812, de Chlamydia trachomatis, serotipo LGVII. SEQ ID NO:14 es la secuencia de proteína del dominio pasajero de PmpD, también conocido como Ct-812, de Chlamydia trachomatis, serotipo LGVII, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:13. SEQ ID NO:15 es la secuencia de ADNc del Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo E. SEQ ID NO:16 es la secuencia de proteína de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo E, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:15. SEQ ID NO:17 es la secuencia de ADNc del antígeno de Chlamydia conocido como la Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp) de Chlamydia psitacci. SEQ ID NO:18 es la secuencia de proteína del antígeno de Chlamydia conocido como Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp) de Chlamydia psitacci, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:17.

SEQ ID NO:19 es la secuencia de ADNc del antígeno de Chlamydia conocido como Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp) de Chlamydia pneumoniae. SEQ ID NO:20 es la secuencia de proteína del antígeno de Chlamydia conocido como Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp) de Chlamydia pneumoniae, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:19. SEQ ID NO:21 es la secuencia de ADNc de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo D. SEQ ID NO:22 es la secuencia de proteína de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo D, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:21. SEQ ID NO:23 es la secuencia de ADNc de Ct-875 de Chlamydia muridarum. SEQ ID NO:24 es la secuencia de proteína de Ct-875 de Chlamydia muridarum, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:23. SEQ ID NO:25 es la secuencia de ADNc de Ct-875 de Chlamydia psitacci. SEQ ID NO:26 es la secuencia de proteína de Ct-875 de Chlamydia psitacci, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:25. SEQ ID NO:27 es la secuencia de ADNc de PmpG, también conocido como Ct-871, de Chlamydia trachomatis, serotipo D. SEQ ID NO:28 es la secuencia de proteína de PmpG, también conocido como Ct-871 de Chlamydia trachomatis, serotipo D, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:27. SEQ ID NO:29 es la secuencia de ADNc de PmpG, también conocido como Ct-871, de Chlamydia muridarum. SEQ ID NO:30 es la secuencia de proteína de PmpG, también conocido como Ct-871 de Chlamydia muridarum, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:29. SEQ ID NO:31 es la secuencia de ADNc de PmpG, también conocido como Ct-871 de Chlamydia psitacci. SEQ ID NO:32 es la secuencia de proteína de PmpG, también conocido como Ct-871 de Chlamydia psitacci, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:31. SEQ ID NO:33 es la secuencia de ADNc de Ct-871 de Chlamydia trachomatis, serotipo D. SEQ ID NO:34 es la secuencia de proteína de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo D, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:33. SEQ ID NO:35 es la secuencia de ADNc de Ct-858 de Chlamydia muridarum. SEQ ID NO:36 es la secuencia de proteína de Ct-858 de Chlamydia muridarum, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:35. SEQ ID NO:37 es la secuencia de ADNc de Ct-858 de Chlamydia psitacci. SEQ ID NO:38 es la secuencia de proteína de Ct-858 de Chlamydia psitacci, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:37. SEQ ID NO:39 es la secuencia de ADNc de Ct-858 de Chlamydia pneumoniae. SEQ ID NO:40 es la secuencia de proteína de Ct-858 de Chlamydia pneumoniae, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:39. SEQ ID NO:41 es la secuencia de ADNc de PmpD, también conocido como Ct-812, de Chlamydia trachomatis, serotipo D. SEQ ID NO:42 es la secuencia de proteína de PmpD, también conocido como Ct-812, de Chlamydia trachomatis, serotipo D, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:41. El dominio pasajero se extiende en los aminoácidos 31 a 1,203. SEQ ID NO:43 es la secuencia de ADNc de PmpD, también conocido como Ct-812, de Chlamydia muridarum. SEQ ID NO:44 es la secuencia de proteína de PmpD, también conocido como Ct-812, de Chlamydia muridarum, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:43. SEQ ID NO:45 es la secuencia de ADNc de PmpD, también conocido como Ct-812, de Chlamydia psitacci. SEQ ID NO:46 es la secuencia de proteína de PmpD, también conocido como Ct-812, de Chlamydia psitacci, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:45. SEQ ID NO:47 es la secuencia de ADNc del antígeno de Chlamydia conocido como Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp), también conocido como Ct-681 de Chlamydia trachomatis, serotipo LGVII. SEQ ID NO:48 es la secuencia de proteína del antígeno de Chlamydia conocido como Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp), también conocido como Ct-681 de Chlamydia trachomatis, serotipo LGVII, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:47. SEQ ID NO:49 es la secuencia de ADNc del antígeno de Chlamydia conocido como Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp), también conocido como Ct-681 de Chlamydia trachomatis, serotipo J. SEQ ID NO:50 es la secuencia de proteína del antígeno de Chlamydia conocido como proteína de membrana externa mayor (Momp), también conocido como Ct-681 de Chlamydia trachomatis, serotipo J, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:49. SEQ ID NO:51 es la secuencia de ADNc del antígeno de Chlamydia conocido como Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp), también conocido como Ct-681 de Chlamydia trachomatis, serotipo H. SEQ ID NO:52 es la secuencia de proteína del antígeno de Chlamydia conocido como Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp), también conocido como Ct-681 de Chlamydia trachomatis, serotipo H, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:51. SEQ ID NO:53 es la secuencia de ADNc del antígeno de Chlamydia conocido como Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp), también conocido como Ct-681 de Chlamydia trachomatis, serotipo E . SEQ ID NO :54 es la secuencia de proteína del antígeno de Chlamydia conocido como Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp) , también conocido como Ct-681 de Chlamydia trachomatis, serotipo E, cuya proteína es codificada por la SEQ I D NO.53. SEQ ID NO:55 es la secuencia de ADNc del antígeno de Chlamydia conocido como Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp), también conocido como Ct-681 de Chlamydia trachomatis, serotipo D. SEQ I D NO :56 es la secuencia de proteína del antígeno de Chlamydia conocido como Proteína de Membrana Externa Mayor (Momp) , también conocido como Ct-681 de Chlamydia trachomatis, serotipo D, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:55. SEQ I D NO :57 es la secuencia de ADNc de Ct-622 de Chlamydia trachomatis, serotipo D. SEQ ID NO:58 es la secuencia de proteína de Ct-622 de Chlamydia trachomatis, serotipo D, cuya proteína es codificada por la SEQ I D NO:57. SEQ I D NO:59 es la secuencia de ADNc de Ct-622 de Chlamydia psitacci. SEQ I D NO:60 es la secuencia de proteína de Ct-622 de Chlamydia psitacci, cuya proteína es codificada por la SEQ I D NO:59. SEQ I D NO :61 es la secuencia de ADNc de Ct-622 de Chlamydia pneumoniae.

SEQ ID NO:62 es la secuencia de proteína de Ct-622 de Chlamydia pneumoniae, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:61. SEQ ID NO:63 es la secuencia de ADNc de Ct-460, también conocido como Swib de Chlamydia trachomatis, serotipo D. SEQ ID NO:64 es la secuencia de proteína de Ct-460, también conocido como Swib de Chlamydia trachomatis, serotipo D, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:63. SEQ ID NO:65 es la secuencia de ADNc de Ct-460, también conocido como Swib de Chlamydia muridarum. SEQ ID NO:66 es la secuencia de proteína de Ct-460, también conocido como Swib de Chlamydia muridarum, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:65. SEQ ID NO:67 es la secuencia de ADNc de Ct-460, también conocido como Swíb de Chlamydia psitacci. SEQ ID NO:68 es la secuencia de proteína de Ct-460, también conocido como Swib de Chlamydia psitacci, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:67. SEQ ID NO:69 es la secuencia de ADNc de Ct-460, también conocido como Swib de Chlamydia pneumoniae. SEQ ID NO:70 es la secuencia de proteína de Ct-460, también conocido como Swib de Chlamydia pneumoniae, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:69. SEQ ID NO:71 es la secuencia de ADNc de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo D.

SEQ ID NO:72 es la secuencia de proteína de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo D, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:71. SEQ ID NO:73 es la secuencia de ADNc de Ct-089 de Chlamydia muridarum. SEQ ID NO:74 es la secuencia de proteína de Ct-089 de Chlamydia muridarum, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:73. SEQ ID NO:75 es la secuencia de ADNc de Ct-089 de Chlamydia psitacci. SEQ ID NO:76 es la secuencia de proteína de Ct-089 de Chlamydia psitacci, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:75. SEQ ID NO:77 es la secuencia de ADNc de Ct-089 de Chlamydia pneumoniae. SEQ ID NO:78 es la secuencia de proteína de Ct-089 de Chlamydia pneumoniae, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:77. SEQ ID NO:79 es la secuencia de ADNc de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotípo A. SEQ ID NO:80 es la secuencia de proteína de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo A, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:79. SEQ ID NO:81 es la secuencia de ADNc de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo B.

SEQ ID NO:82 es la secuencia de proteína de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo B, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:81. SEQ ID NO:83 es la secuencia de ADNc de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo G. SEQ ID NO:84 es la secuencia de proteína de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo G, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:83. SEQ ID NO:85 es la secuencia de ADNc de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo H. SEQ ID NO:86 es la secuencia de proteína de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo H, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:85. SEQ ID NO:87 es la secuencia de ADNc de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo I. SEQ ID NO:88 es la secuencia de proteína de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo I, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:87. SEQ ID NO:89 es la secuencia de ADNc de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo J. SEQ ID NO:90 es la secuencia de proteína de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo J, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:89. SEQ ID NO:91 es la secuencia de ADNc de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo K.

SEQ ID NO:92 es la secuencia de proteína de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo K, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:91. SEQ ID NO:93 es la secuencia de ADNc de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo L2. SEQ ID NO:94 es la secuencia de proteína de Ct-089 de Chlamydia trachomatis, serotipo L2, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:93. SEQ ID NO:95 es la secuencia de ADNc de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo A. SEQ ID NO:96 es la secuencia de proteína de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo A, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:95. SEQ ID NO:97 es la secuencia de ADNc de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo B. SEQ ID NO:98 es la secuencia de proteína de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo B, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:97. SEQ ID NO:99 es la secuencia de ADNc de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo G. SEQ ID NO:100 es la secuencia de proteína de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotípo G, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:99. SEQ ID NO:101 es la secuencia de ADNc de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotípo H.

SEQ ID NO:102 es la secuencia de proteína de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo H, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:101. SEQ ID NO:103 es la secuencia de ADNc de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo I. SEQ ID NO:104 es la secuencia de proteína de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotípo I, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:103. SEQ ID NO:105 es la secuencia de ADNc de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo J. SEQ ID NO:106 es la secuencia de proteína de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo J, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:105. SEQ ID NO:107 es la secuencia de ADNc de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo K. SEQ ID NO:108 es la secuencia de proteína de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotípo K, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:107. SEQ ID NO:109 es la secuencia de ADNc de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo L2. SEQ ID NO:110 es la secuencia de proteína de Ct-858 de Chlamydia trachomatis, serotipo L2, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:109. SEQ ID NO:111 es la secuencia de ADNc de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo A.

SEQ ID NO:112 es la secuencia de proteína de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo A, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:111. SEQ ID NO:113 es la secuencia de ADNc de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo B. SEQ ID NO:114 es la secuencia de proteína de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo B, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:113. SEQ ID NO:115 es la secuencia de ADNc de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo G. SEQ ID NO:116 es la secuencia de proteína de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo G, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:115. SEQ ID NO:117 es la secuencia de ADNc de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo H. SEQ ID NO:118 es la secuencia de proteína de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo H, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:117. SEQ ID NO:119 es la secuencia de ADNc de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo I. SEQ ID NO:120 es la secuencia de proteína de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo I, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:119. SEQ ID NO:121 es la secuencia de ADNc de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo J.

SEQ ID NO:122 es la secuencia de proteína de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo J, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:121. SEQ ID NO:123 es la secuencia de ADNc de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo K. SEQ ID NO:124 es la secuencia de proteína de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotípo K, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:123. SEQ ID NO:125 es la secuencia de ADNc de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotipo L2. SEQ ID NO:126 es la secuencia de proteína de Ct-875 de Chlamydia trachomatis, serotípo L2, cuya proteína es codificada por la SEQ ID NO:125. Algunas de las secuencias anteriores y otros polipéptidos y polinucleótidos de Chlamydia relacionados a partir de un número de serotipos, son conocidos y están disponibles en este campo. Otras secuencias relacionadas se pueden encontrar en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica expedidas Números 6,447,779; 6,166,177; 6,565,856; 6,555,115; 6,432,916; y 6,448,234, y también se dan a conocer en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 10/197,220, 10/762,058, y 10/872,155, cada una de las cuales se incorpora a la presente como referencia. La secuencia de Ct-089 del serotipo D, y la aplicación potencial de esta proteína como un antígeno, se ha dado a conocer públicamente, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO02/08267 (Corixa Corporation). La secuencia de Ct-089 del serotipo L2 se dio a conocer en la Publicación Internacional Número WO99/28475 (Genset). El papel de CopN (también conocido como Ct-089) como un regulador exportado supuesto de los sistemas de secreción de proteínas tipo lll, se discute en Fields, K. A. y Hackstadt, T Mol. Microbiol.200038(5): 1048-1060. Las secuencias de Ct-0858 y Ct-875 del serotipo D están disponibles en la base de datos Swiss-Prot, con números de acceso primarios 084866 y O84883, respectivamente. Para mayor información véase Stephens, R. S. y colaboradores, Science 1998 282:754-759. El uso de Ct-858 como un antígeno, se da a conocer, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO02/08267 (Corixa Corporation). La secuencia de Ct-875 del serotipo E (que incorpora una marca His) y su uso como un antígeno, se da a conocer, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 20040137007. Sin embargo, el documento se refiere de una manera incorrecta a la Secuencia 139 como Ct-875, cuando de hecho es la Secuencia 140 de la misma. Los individuos que se han expuesto a Chlamydia trachomatis han demostrado desarrollar algún grado de inmunidad natural a la reinfección, cuando menos en el caso del mismo serotipo (Katz, B. P. y colaboradores, Sex Transm. Dis. 1987 14:160-164), aunque el grado de protección puede depender del tiempo transcurrido desde que se presentó la infección anterior. También se ha demostrado que la edad es importante en la duración de la infección, demostrando los individuos más viejos una duración más corta de la infección por la Chlamydia trachomatis ocular (Bailey, R. y colaboradores, Epidemiol. Infecí. 1999 123:479-486), sugiriendo nuevamente la existencia de una protección inmunológica adaptable. Se ha sugerido que el uso de antibióticos de hecho puede impedir el desarrollo de la inmunidad natural a Chlamydia trachomatis (Brunham, R. C. y colaboradores, J. Nat. Rev. Immunol. 20055:149-161). La proteína de membrana externa mayor (Momp) constituye aproximadamente el 60 por ciento de la masa de proteína de la membrana externa bacteriana, y se cree que es importante en la determinación de la especificidad del serotipo. La secuencia de aminoácidos contiene cuatro regiones que están externamente expuestas, y en donde se presentan la mayoría de las variaciones de secuencia. De los aproximadamente 400 aminoácidos de la secuencia de Momp, hasta 70 aminoácidos difieren entre Momp de diferentes serotipos. Es particularmente sorprendente el descubrimiento de que la agrupación de serotipos basada en la identidad de secuencias de aminoácidos no corresponde a la agrupación de serotipos basada en el estado de la enfermedad (es decir, ocular, oculogenital, y linfogranuloma venéreo) (Stothard, D. R. y colaboradores, Infect. Immun. 1998 66(8):3618-3625). De una manera similar, las comparaciones de identidades de secuencias de nucleótidos para el gen ompA que codifica Momp no corresponden a los estados de la enfermedad (Meijer, A. y colaboradores, J. Bateriol. 1999 181 (15):4469-4475; Lysen, M. y colaboradores, J. Clin.

Microbiol. 2004 42(4):1641-1647). Los anticuerpos monoclonales para Momp son efectivos en cultivo y en algunos modelos animales; sin embargo, la protección puede estar limitada y en general es específica del serotipo. Los ratones inmunizados subcutáneamente u oralmente con un anticuerpo monoclonal antí-idiotípico para el antígeno de exoglicolípido desarrollaron una respuesta protectora al serotipo C, aunque siguieron siendo susceptibles a la agresión con el serotipo K (Whittum-Hudson, J. A. y colaboradores, Nat. Med. 1996 2(10):1116- 1121). Una proteína que se ha dado a conocer hasta la fecha y que muestra un alto nivel de homología de secuencias entre diferentes serotipos, es decir, la proteína-1 accesible clase I (referida como Capí ó Ct-529), tiene un uso potencial en el desarrollo de vacunas que estimulen protección contra más de un serotipo (Fling, S. P. y colaboradores, PNAS 2001 98(3):1160-1165). Sin embargo, en adición al requerimiento de altos niveles de homología de secuencias entre los serotipos, las proteínas de uso en vacunas también deben provocar suficiente respuesta inmune. De una manera sorprendente, se ha encontrado que las proteínas Ct-089, Ct-858, y Ct-875 de Chlamydia trachomatis, son en particular tanto altamente antigénicas como tienen un alto grado de identidad de secuencias a través de los diferentes serotipos de Chlamydia trachomatis. Existe una conservación particularmente alta en la región de los epítopos predichos. A la luz de este descubrimiento, existe la posibilidad del desarrollo de vacunas de Chlamydia que sean efectivas contra un amplio rango de serotipos de Chlamydia trachomatis (es decir, que pueden ser útiles en la protección cruzada). De conformidad con este aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una o más proteínas de Chlamydia, fragmentos ¡nmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifican, seleccionadas a partir de la lista que consiste en Ct-089, Ct-858, y Ct-875, y que se derivan a partir de un primer serotipo de Chlamydia trachomatis, en la fabricación de una vacuna para el tratamiento o la prevención de infección por Chlamydia por un segundo serotipo de Chlamydia trachomatis. En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para el tratamiento o la prevención de infección por Chlamydia, por un segundo serotipo de Chlamydia trachomatis, el cual comprende la administración de una vacuna que comprenda una o más proteínas de Chlamydia, fragmentos ¡nmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifiquen, seleccionadas a partir de la lista que consiste en Ct-089, Ct-858, y Ct-875, y que se deriven a partir de un primer serotipo de Chlamydia trachomatis. En una modalidad de la invención, la vacuna de protección cruzada comprende una proteína, un fragmento inmunogénico de la misma, o un polinucleótido que la codifique, seleccionada a partir de la lista que consiste en Ct-089, Ct-858, y Ct-875. Las vacunas que comprendan solamente una proteína, fragmento inmunogénico de la misma, o polinucleótído que la codifique, seleccionadas a partir de la lista que consiste en Ct-089, Ct-858, y Ct-875, adecuadamente comprenderá además cuando menos un antígeno de Chlamydia adicional (por ejemplo, 1 ó 2 antígenos adicionales). En una segunda modalidad de la invención, la vacuna de protección cruzada comprende dos proteínas, fragmentos ¡nmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifiquen, seleccionadas a partir de la lista que consiste en Ct-089, Ct-858, y Ct-875. Por ejemplo: Ct-089 y Ct-858; Ct-089 y Ct-875; ó Ct-858 y Ct-875. En una tercera modalidad de la invención, la vacuna de protección cruzada comprende Ct-089, Ct-858, y Ct-875, fragmentos ¡nmunogénicos de los mismos, o polinucleótidos que los codifican. El primer serotipo de Chlamydia trachomatis puede ser cualquier serotípo de Chlamydia trachomatis. El segundo serotipo de Chlamydia trachomatis puede ser cualquier serotipo de Chlamydia trachomatis, excluyendo al primer serotipo de Chlamydia trachomatis. En una modalidad de la invención, el primer serotípo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de la lista que consiste en los serotípos de Chlamydia trachomatis A, B, Ba, C, D, Da, E, F, G, H, I, la, J, Ja, K, L1, L2, y L3. En una segunda modalidad de la invención, el primer serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de los serotipos oculares de Chlamydia trachomatis (por ejemplo, A, B, Ba, y C). En otra modalidad de la invención, el primer serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de los serotipos oculogenitales de Chlamydia trachomatis (por ejemplo, D, Da, E, F, G, H, I, la, J, Ja, y K). En una modalidad adicional de la invención, el primer serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de los serotipos de linfogranuloma venéreo de Chlamydia trachomatis (por ejemplo, L1, L2, y L3). En una modalidad de la invención, el segundo serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de la lista que consiste en los serotipos de Chlamydia trachomatis A, B, Ba, C, D, Da, E, F, G, H, I, la, J, Ja, K, L1, L2, y L3. En una segunda modalidad de la invención, el segundo serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de los serotipos oculares de Chlamydia trachomatis (por ejemplo, A, B, Ba, y C). En otra modalidad de la invención, el segundo serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de los serotípos oculogenitales de Chlamydia trachomatis (por ejemplo, D, Da, E, F, G, H, I, la, J, Ja, y K). En una modalidad adicional de la invención, el segundo serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de los serotipos de linfogranuloma venéreo de Chlamydia trachomatis (por ejemplo, L1, L2, y L3). Con el objeto de maximizar la amplitud de acción del método y uso de la presente invención, puede ser deseable que el primer serotípo de Chlamydia trachomatis se seleccione de tal manera que haya un alto nivel de identidad de secuencias (por ejemplo, una identidad de secuencia de cuando menos el 90 por ciento, en especial del 95 por ciento, en particular del 98 por ciento, más particularmente del 99 por ciento) con la mayoría de los otros serotipos de Chlamydia trachomatis (por ejemplo, cuando menos el 50 por ciento, en especial el 70 por ciento, en particular el 80 por ciento, más particularmente el 90 por ciento de otros serotipos de Chlamydia trachomatis). Con el objeto de maximizar la aplicación práctica del método y uso de la presente invención, puede ser deseable que el primer serotipo de Chlamydia trachomatis se seleccione de tal manera que haya un alto nivel de identidad de secuencias (por ejemplo, una identidad de secuencia de cuando menos el 90 por ciento, en especial del 95 por ciento, en particular del 98 por ciento, más particularmente del 99 por ciento) con la mayoría (por ejemplo, cuando menos el 50 por ciento, en especial el 70 por ciento, en particular el 80 por ciento, más particularmente el 90 por ciento) de los serotipos comunes de Chlamydia trachomatis (tales como los serotipos oculares comunes, los serotipos oculogenitales comunes, los serotipos de linfogranuloma venéreo comunes, o una combinación de cualesquiera dos de estos grupos de serotipos, por ejemplo, los serotipos oculares y oculogenitales comunes). Los serotipos oculares comunes de Chlamydia trachomatis incluyen A y B. Los serotipos oculogenitales comunes de Chlamydia trachomatis incluyen D, E, F, e I (Lan, J. y colaboradores, J. Clin. Microbiol. 1995 33(12):3194-3197; Singh, V. y colaboradores, J. Clin. Microbiol. 200341(6):2700-2702). Los serotípos de linfogranuloma venéreo comunes de Chlamydia trachomatis incluyen L2. En una modalidad de la presente invención, el primer serotipo de Chlamydia trachomatis es el serotipo E de Chlamydia trachomatis. En una segunda modalidad de la invención, el primer serotipo de Chlamydia trachomatis es el serotipo K de Chlamydia trachomatis. En una modalidad de la invención, el segundo serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de los serotipos D, J, y K de Chlamydia trachomatis (por ejemplo, serotipos K ó J de Chlamydia trachomatis). En otra modalidad de la invención, el primer serotipo de Chlamydia trachomatis es el serotipo E de Chlamydia trachomatis, y el segundo serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de los serotipos D, J, y K de Chlamydia trachomatis (por ejemplo, los serotipos K ó J de Chlamydia trachomatis). En un ejemplo de la presente invención, cuando la vacuna comprende Ct-089, un fragmento inmunogénico del mismo, o un polinucleótido que lo codifique, derivado a partir del serotipo E de Chlamydia trachomatis, la vacuna se puede utilizar en el tratamiento o en la profilaxis de infecciones que se presenten de los serotipos A, B, D, G, H, I, J, K, ó L2 de Chlamydia trachomatis; en particular A, B, D, G, H, I, ó K; en especial A ó B.

En un segundo ejemplo de la presente invención, cuando la vacuna comprende Ct-858, un fragmento ¡nmunogénico del mismo, o un polinucleótido que lo codifique, derivado a partir del serotipo E de Chlamydia trachomatis, la vacuna se puede utilizar en el tratamiento o en la profilaxis de infecciones que se presenten de los serotipos A, B, D, G, H, I, J, K, ó L2 de Chlamydia trachomatis; en particular J ó L2. En un ejemplo adicional de la presente invención, cuando la vacuna comprende Ct-875, un fragmento inmunogénico del mismo, o un polinucleótído que lo codifique, derivado a partir del serotipo E de Chlamydia trachomatis, la vacuna se puede utilizar en el tratamiento o la profilaxis de infecciones que se presenten de los serotipos A, B, D, G, H, I, J, K ó L2 de Chlamydia trachomatis; en particular A, B, D, G, H, I ó K. Los primero y segundo serotipos de Chlamydia trachomatis pueden estar asociados con el mismo estado de enfermedad (por ejemplo, pueden ser ambos serotipos oculares o ambos serotipos oculogenitales), o los primero y segundos serotípos de Chlamydia trachomatis pueden estar asociados con diferentes estados de enfermedad (por ejemplo, el primer serotipo de Chlamydia trachomatis puede ser un serotipo oculogenital, y el segundo serotipo de Chlamydia trachomatis puede ser un serotipo ocular, o viceversa). En el caso de que la vacuna utilizada en la presente invención comprenda más de una proteína, fragmento inmunogénico de la misma, o polinucleótido que la codifique, seleccionada a partir de la lista que consiste en Ct-089, Ct-858, y Ct-875, se debe observar que cada proteína, fragmento inmunogénico de la misma, o polinucleótido que la codifique, se puede derivar opcionalmente a partir de un primer serotipo de Chlamydia trachomatis diferente, el cual se puede seleccionar de una manera independiente. Las vacunas de protección cruzada útiles en la presente invención también pueden comprender antígenos adicionales de Chlamydia (es decir, antígenos diferentes de las proteínas Ct-089, Ct-858, y Ct-875, fragmentos inmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifiquen), por ejemplo, 1, 2, 3, 4, ó 5 antígenos diferentes (seleccionados, por ejemplo, a partir de Momp, Ct-622, PmpGpd, y PmpDpd). Los antígenos adicionales en las vacunas de protección cruzada también pueden incluir las proteínas Ct-089, Ct-858, y Ct-875, fragmentos inmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifiquen, que se deriven a partir del segundo serotipo. En una modalidad adicional de la invención, los polipéptidos y polinucleótídos de Chlamydia que se pueden utilizar de acuerdo con la invención incluyen aquéllos de los serotipos asociados con tracoma, tales como los serotipos A, B, Ba, y C. Por consiguiente, las composiciones de acuerdo con la invención pueden emplear las secuencias de polipéptidos dadas anteriormente, o fragmentos ¡nmunogénicos de los mismos, o las secuencias de polinucleótidos que los codifiquen, que pueden ser, por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos dadas anteriormente, o fragmentos de estos fragmentos inmunogénicos codificantes de los polipéptidos. En las modalidades particulares: (i) Los componentes Ct-089 y Ct-858 de la composición de acuerdo con la invención pueden ser un polípéptído que tenga cuando menos una homología del 95 por ciento con el polipéptido de la SEQ ID NO:16 (C. trachomatis, serotipo E), o un fragmento inmunogénico del mismo, o un polipéptido que tenga cuando menos una homología del 95 por ciento con el polipéptido de la SEQ ID NO:6 (C. trachomatis, serotipo E), o un fragmento ¡nmunogénico del mismo, respectivamente, o los polinucleótidos que los codifiquen. De una manera alternativa, los componentes Ct-089 y Ct-858 de la composición pueden mostrar una homología de cuando menos el 95 por ciento con cualquiera de las secuencias de polipéptidos y polinucleótidos de Ct-089 y Ct-858 de otros serotipos de C. trachomatis que se describan en la presente. (ii) Un componente Ct-875 puede ser un polipéptído que tenga una homología de cuando menos el 95 por ciento con el polipéptído de la SEQ ID NO:8 (C. trachomatis, serotípo E), o un fragmento inmunogénico del mismo, o polinucleótidos que los codifiquen. De una manera alternativa, el componente Ct-875 de la composición puede mostrar una homología de cuando menos el 95 por ciento con cualquiera de las secuencias de polipéptidos y polinucleótidos de Ct-875 de otros serotipos de C. trachomatis que se describan en la presente. (iii) Un componente PmpDpd puede ser un polipéptido que tenga una homología de cuando menos el 95 por ciento con el polípéptido de la SEQ ID NO:14 (C. trachomatis, serotipo Lll), o un fragmento inmunogénico del mismo, o polinucleótidos que los codifiquen. (iv) Un componente PmpGpd puede ser un polipéptido que tenga una homología de cuando menos el 95 por ciento con el polipéptido de la SEQ ID NO:12 (C. trachomatis, serotipo Lll), o un fragmento ¡nmunogénico del mismo, o polinucleótidos que los codifiquen. (v) Un componente Momp puede ser un polipéptido que tenga una homología de cuando menos el 95 por ciento con el polipéptido de la SEQ ID NO:4 (C. trachomatis, serotipo F), o un fragmento inmunogénico del mismo, o polínucleótidos que los codifiquen. (vi) Un componente Swib puede ser un polipéptido que tenga una homología de cuando menos el 95 por ciento con el polipéptido de la SEQ ID NO:8 (C. trachomatis, serotipo Lll), o un fragmento ¡nmunogénico del mismo, o polinucleótidos que los codifiquen. Los antígenos descritos en la presente incluyen las variantes polimórfícas y las variaciones conservadoramente modificadas, así como los homólogos de Chlamydia ínter-cepas e inter-especies. En adición, los antígenos descritos en la presente incluyen sub-secuencias o secuencias truncadas. Los antígenos descritos en la presente pueden estar en la forma de proteínas de fusión. Las proteínas de fusión también pueden contener polipéptidos adicionales, opcionalmente péptidos heterólogos de Chlamydia u otras fuentes. Estos antígenos se pueden modificar, por ejemplo, mediante la adición de secuencias peptídicas enlazadoras, como se describen más adelante. Estos péptidos enlazadores se pueden insertar entre uno o más polipéptidos que formen cada una de las proteínas de fusión. Los antígenos descritos en la presente también pueden estar en la forma de conjugados químicos. La invención se refiere además a composiciones inmunogénicas y a composiciones de vacuna que comprenden a las composiciones de antígenos de Chlamydia de acuerdo con la invención, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente un inmunoestimulante. Las composiciones de la presente invención pueden comprender además otros componentes diseñados para mejorar la antigenicidad de los antígenos, o para mejorar estos antígenos en otros aspectos, por ejemplo, el aislamiento de estos antígenos a través de la adición de un estiramiento de residuos de histidina en un extremo del antígeno. La adición de un estiramiento de residuos de histidína en un extremo del antígeno también puede mejorar la expresión. Las composiciones de la invención pueden comprender copias adicionales de antígenos, o polipéptidos o polinucleótidos adicionales de Chlamydia sp.. Las composiciones de la invención también pueden comprender polipéptidos o polinucleótidos heterólogos adicionales de otras fuentes que no sean de Chlamydia. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden incluir polipéptidos o ácidos nucleicos que codifiquen polipéptidos, en donde el polipéptido mejore la expresión del antígeno, por ejemplo NS1, una proteína de virus de influenza, o una porción inmunogénica de la misma (véase, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Números WO99/40188 y WO93/04175). Los ácidos nucleicos de la invención se pueden diseñar basándose en la preferencia de codones en una especie de elección, por ejemplo en seres humanos. Las composiciones de la invención pueden comprender además adyuvantes, por ejemplo MPL, 3D-MPL, IFA, ENHANZYN (Detox), QS21, CWS, TDM, AGP, CPG, Leif, saponina, y mimétícos de saponina, y derivados de los mismos. De una manera alternativa o en adición, las composiciones de la invención pueden comprender BCG ó Pvac como un adyuvante. DEFINICIONES "Polipéptido de fusión" o "proteína de fusión" se refiere a una proteína que tiene cuando menos dos polipéptidos de Chlamydia (que pueden ser iguales o pueden ser diferentes) covalentemente enlazados, ya sea directamente o por medio de un enlazador de aminoácidos. Los polipéptidos que forman la proteína de fusión típicamente son el término C enlazado al término N, aunque también pueden ser el término C enlazado al término C, el término N enlazado al término N, o el término N enlazado al término C. Los polipéptidos de las proteínas de fusión pueden estar en cualquier orden. Este término también se refiere a las variantes conservadoramente modificadas, las variantes polimórficas, alelos, mutantes, sub-secuencias, homólogos inter-especies, y fragmentos inmunogénicos de los antígenos que formen la proteína de fusión. Las proteínas de fusión de la invención también pueden comprender copias adicionales de un antígeno componente o un fragmento inmunogénico del mismo. Una secuencia de polinucleótido que codifique una proteína de fusión de la invención, se hibrida bajo condiciones restringentes con cuando menos dos secuencias de nucleótidos, cada una codificando un polipéptido de antígeno seleccionado a partir del grupo que consiste en Ct-681 (Momp) o un fragmento inmunogénico del mismo, Ct-871 (PmpG) o un fragmento ¡nmunogénico del mismo, Ct-812 (PmpD) o un fragmento inmunogénico del mismo, Ct-089 ó un fragmento inmunogénico del mismo, Ct-858 ó un fragmento inmunogénico del mismo, Ct-875 ó un fragmento ¡nmunogénico del mismo, Ct-460 (swib) o un fragmento inmunogénico del mismo, y Ct-622 ó un fragmento ¡nmunogénico del mismo. Las secuencias de polinucleótidos que codifican los antígenos individuales del polipéptido de fusión, por consiguiente, incluyen variantes conservadoramente modificadas, variantes polimórficas, alelos, mutantes, sub-secuencias, fragmentos inmunogénicos, y homólogos inter-especies de Ct-681 (Momp), Ct-871 (PmpG), Ct-812 (PmpD), Ct-089, Ct-858, Ct-875, Ct-460 (swib), y Ct-622. Las secuencias de polinucleótidos que codifican los polipéptidos individuales de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden. En algunas modalidades, los polipéptidos individuales de la proteína de fusión están en orden (término N a C) desde grandes hasta pequeños. Los antígenos grandes son de un tamaño de aproximadamente 30 a 150 kD, los antígenos medianos son de un tamaño de aproximadamente 10 a 30 kD, y los antígenos pequeños son de un tamaño de aproximadamente menos de 10 kD. La secuencia que codifique el polipéptido individual puede ser tan pequeña como, por ejemplo, un fragmento inmunogénico, tal como un epítopo CTL individual que codifique de aproximadamente 8 a 9 aminoácidos, o, por ejemplo, un epítopo de HTL ó de células-B. El fragmento también puede incluir múltiples epítopos. Una proteína de fusión de la invención se enlaza específicamente con los anticuerpos reproducidos contra cuando menos dos polipéptídos de antígeno seleccionados a partir de Ct-681 (Momp) o un fragmento ínmunogéníco del mismo, Ct-871 (PmpG) o un fragmento inmunogénico del mismo, Ct-812 (PmpD) o un fragmento ¡nmunogénico del mismo, Ct-089 ó un fragmento inmunogéníco del mismo, Ct-858 ó un fragmento inmunogénico del mismo, Ct-875 ó un fragmento inmunogénico del mismo, Ct-460 (swib) o un fragmento inmunogéníco del mismo, y Ct-622 ó un fragmento inmunogénico del mismo. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Opcíonalmente, el polipéptido de fusión se enlaza específicamente con los anticuerpos reproducidos contra la unión de fusión de los antígenos, cuyos anticuerpos no se enlazan con los antígenos individualmente, es decir, cuando no son parte de una proteína de fusión. Los polipéptidos de fusión opcionalmente comprenden polipéptidos adicionales, por ejemplo 3,4, 5, 6, o más polipéptídos, y hasta aproximadamente 25 polipéptidos, opcionalmente polipéptidos heterólogos o polipéptidos homólogos repetidos, fusionados a cuando menos dos antígenos. Los polípéptídos adicionales de la proteína de fusión se derivan opcionalmente a partir de Chlamydia, así como de otras fuentes, tales como otras fuentes bacterianas, virales, o de invertebrados, vertebrados, o mamíferos. Los polipéptidos individuales de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden. Como se describe en la presente, la proteína de fusión también se puede enlazar a otras moléculas, incluyendo polipéptídos adicionales. Las composiciones de la invención también pueden comprender polipéptidos adicionales que no se enlacen con las proteínas de fusión de la invención. Estos polipéptidos adicionales pueden ser polipéptidos heterólogos u homólogos. El término "fusionado" se refiere al enlace covalente entre dos polipéptidos en una proteína de fusión. Los polipéptidos típicamente se unen mediante un enlace peptídíco, ya sea directamente unos con otros, o por medio de un enlazador de aminoácidos. Opcionalmente, los péptidos se pueden unir por medio de enlaces covalentes no peptídicos conocidos por los expertos en este campo. "FL" se refiere a longitud completa, es decir, un polipéptido que es de la misma longitud que el polipéptido de tipo silvestre.

El término "fragmento inmunogénico del mismo" se refiere a un polipéptido que comprende un epítopo que es reconocido por los linfocitos-T citotóxicos, los linfocitos-T auxiliares, o las células-B. Los métodos para determinar las regiones de epítopos de una secuencia se describen en cualquier otra parte de la presente. Adecuadamente, el fragmento inmunogénico comprenderá cuando menos el 30 por ciento, adecuadamente cuando menos el 50 por ciento, en especial cuando menos el 75 por ciento, y en particular cuando menos el 90 por ciento (por ejemplo, el 95 por ciento o el 98 por ciento) de los aminoácidos de la secuencia de referencia. El fragmento inmunogénico adecuadamente comprenderá todas las regiones de epítopos de la secuencia de referencia. Un adyuvante se refiere a los componentes en una vacuna o composición terapéutica que aumentan la respuesta inmune específica al antígeno (véase, por ejemplo, Edelman, AIDS Res. Hum Retroviruses 8:1409-1411 (1992)). Los adyuvantes inducen respuestas inmunes del tipo Th1 y del tipo Th2. Las citoquinas del tipo Th1 (por ejemplo, IFN-?, IL-2, e IL-12) tienden a favorecer la inducción de la respuesta inmune mediada por células a un antígeno administrado, mientras que las citoquinas tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, I L-5, IL-6, IL-10, y TNFß) tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmunes humorales. Se puede emplear cualquiera de una variedad de adyuvantes en las vacunas de esta invención para mejorar la respuesta inmune. Algunos adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger al antígeno del catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulante específico o no específico de las respuestas inmunes, tal como lípido A, Bortadella pertusis ó Mycobacterium tuberculosis. Los adyuvantes adecuados están comercialmente disponibles e incluyen, por ejemplo, Adyuvante Incompleto de Freund y Adyuvante Completo de Freund (Difco Laboratories), y Adyuvante Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N. J.). Otros adyuvantes adecuados incluyen alum, mícroesferas biodegradables, monofosforíl-lípido A, quil A, SBASIc, SBAS2 (Ling y colaboradores, 1997, Vaccine 15:1562-1567), SBAS7, AI(OH)3, y oligonucleótído CpG (Publicación Internacional Número WO96/02555). Los adyuvantes adecuados para utilizarse en la invención se discuten con mayor detalle más adelante. "Ácido nucleico" se refiere a los desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos ya sea en forma de una sola cadena o de doble cadena. El término abarca los ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos de estructura base modificados o enlaces, que son sintéticos, que se presentan naturalmente, y que no se presentan naturalmente, que tienen propiedades de enlace similares a las del ácido nucleico de referencia, y que se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de estos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, ribonucleótidos de 2-O-metilo, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs).

A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente las variantes conservadoramente modificadas de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. De una manera específica, se pueden lograr sustituciones de codones degenerados mediante la generación de secuencias en donde la tercera posición de uno o más seleccionados (o todos) está sustituida con residuos de bases mixtas y/o de desoxi-inosina (Batzer y colaboradores, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka y colaboradores, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini y colaboradores, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). El término "ácido nucleico" se utiliza de una manera intercambiable con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido, y polinucleótido. Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína", se utilizan de una manera intercambiable en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos también se aplican a los polímeros de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido que se presente naturalmente correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos que se presenten naturalmente y a los polímeros de aminoácidos que no se presenten naturalmente. El término "aminoácido" se refiere a los aminoácidos que se presentan naturalmente y sintéticos, así como a los análogos de aminoácidos y a los miméticos de aminoácidos que funcionen de una manera similar a los aminoácidos que se presenten naturalmente. Los aminoácidos que se presentan naturalmente son aquéllos codificados por el código genético, así como los aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo hidroxi-prolina, ?-carboxi-glutamato, y O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se refieren a los compuestos que tienen la misma estructura química básica que el aminoácido que se presenta naturalmente, es decir, un átomo de carbono-a que se enlaza con un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo homoserina, norleucina, sulfóxido de metíonina, metionina-metil-sulfonio. Estos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras base peptídicas modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que el aminoácido que se presenta naturalmente. Los miméticos de aminoácidos se refieren a los compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de una manera similar a un aminoácido que se presenta naturalmente. Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos, o bien por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB. De la misma manera, los nucleótidos pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. "Variantes conservadoramente modificadas" se aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes conservadoramente modificadas se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, hasta las secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG, y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por consiguiente, en cada posición en donde una alanina sea especificada por un codón, el codón se puede alterar hasta cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", las cuales son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente que codifique un polipéptido, también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que ordinariamente es el único codón para metionina, y TGG, que ordinariamente es el único codón para triptófano) se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica. De conformidad con lo anterior, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifique un polipéptido es implícita en cada secuencia descrita. Un polinucleótido de la invención puede contener un número de variaciones silenciosas (por ejemplo, se pueden alterar de 1-5, en particular 1 ó 2, y en especial un codón), al compararse con la secuencia de referencia. Un polinucleótido de la invención puede contener un número de variaciones conservadoras no silenciosas (por ejemplo, se pueden alterar de 1 a 5, en particular 1 ó 2, y en especial un codón) al compararse con la secuencia de referencia. Los expertos en este campo reconocerán que una secuencia de polinucleótido particular puede contener variaciones conservadoras tanto silenciosas como no silenciosas. Con respecto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, supresiones, o adiciones individuales a un ácido nucleico, péptido, polipéptido, o secuencia de proteína, que alteren, agreguen, o supriman un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada, son una "variante conservadoramente modificada", en donde la alteración dé como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la materia. Estas variantes conservadoramente modificadas son en adición a, y no excluyen, las variantes polimórficas, los homólogos inter-especies, y los alelos de la invención. Un polipéptido de la invención puede contener un número de variaciones conservadoras (por ejemplo, se pueden alterar de 1 a 5, en particular 1 ó 2, y en especial un residuo de aminoácido), al compararse con la secuencia de referencia. En general, estas sustituciones conservadoras caerán dentro de una de las agrupaciones de aminoácidos especificadas en seguida, aunque, en algunas circunstancias, son posibles otras sustituciones sin afectar sustancialmente las propiedades inmunogénicas del antígeno. Los siguientes ocho grupos contienen cada uno los aminoácidos que son sustituciones conservadoras unos por otros: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). Adecuadamente, las sustituciones de aminoácidos están restringidas a las regiones que no son epítopos de un antígeno. Las variantes de secuencias de polipéptidos también pueden incluir aquéllas en donde se inserten aminoácidos adicionales, comparándose con la secuencia de referencia, por ejemplo, estas inserciones pueden presentarse en una o dos localizaciones (adecuadamente una), y pueden involucrar la adición de 50 o menos aminoácidos (tal como 20 ó menos, en particular 10 ó menos, en especial 5 ó menos) en cada localización. Adecuadamente, estas inserciones no se presentan en la región de un epítopo, y por consiguiente, no tienen un impacto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno. Un ejemplo de inserciones incluye un estiramiento corto de residuos de histidina (por ejemplo, de 1 a 6 residuos), para ayudar a la expresión y/o purificación del antígeno en cuestión. Otras variantes de polipéptidos incluyen aquéllas en donde se han suprimido aminoácidos, comparándose con la secuencia de referencia, por ejemplo, estas supresiones pueden presentarse en una o dos localizaciones (adecuadamente una), y, por ejemplo, pueden involucrar la supresión de 50 ó menos aminoácidos (tal como 20 ó menos, en particular 10 ó menos, en especial 5 ó menos) en cada localización. Adecuadamente, estas inserciones no se presentan en la región de un epítopo, y por consiguiente, no tienen un impacto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno. Los métodos para determinar las regiones de epítopos de un antígeno se describen y se ejemplifican en cualquier otra parte de la presente. El término "heterólogo", cuando se utiliza con referencia a porciones de un ácido nucleico, indica que el ácido nucleico comprende dos o más sub-secuencias que no se encuentran en la misma relación una con la otra en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico típicamente se produce de una manera recombinante, teniendo dos o más secuencias a partir de genes no relacionados configurados para formar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo un promotor a partir de una fuente, y una región codificante a partir de otra fuente. De una manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación una con la otra en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión). La frase "se hibrida selectivamente (o específicamente) a", se refiere al enlace, duplexión, o hibridación de una molécula solamente a una secuencia de nucleótidos particular bajo condiciones de hibridación restringentes, cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, ADN ó ARN celular total o de biblioteca). La frase "condiciones de hibridación restringentes" se refiere a las condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará a su subsecuencia objetivo, típicamente en una mezcla compleja de ácido nucleico, pero no a otras secuencias. Las condiciones restringentes dependen de la secuencia, y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridarán específicamente a temperaturas más altas. Se encuentra una guía extensa de la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acíd assays" (1993). En términos generales, las condiciones restringentes se seleccionan para ser de aproximadamente 5 a 10°C más bajos que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a un pH de concentración iónica definida. La Tm es la temperatura (bajo una concentración iónica, pH, y concentración de ácido nucleico definidos) a la cual el 50 por ciento de las sondas complementarias para el objetivo se hibridan a la secuencia objetivo en equilibrio (debido a que las secuencias objetivo están presentes en exceso, a la Tm, el 50 por ciento de las sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones restringentes serán aquéllas en donde la concentración de sal es menor de aproximadamente 1.0M de ion de sodio, típicamente de aproximadamente 0.01 a 1.0M de concentración de ion de sodio (o de otras sales) a un pH de 7.0 a 8.3, y la temperatura es de cuando menos aproximadamente 30°C para las sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos), y de cuando menos aproximadamente 60°C para las sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). También se pueden lograr las condiciones restringentes con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es cuando menos de dos veces el fondo, opcionalmente una hibridación de 10 veces el fondo. Las condiciones de hibridación restringentes de ejemplo pueden ser como sigue: 50 por ciento de formamida, SSC 5x, y SDS al 1 por ciento, incubación a 42°C, ó SSC 5x, SDS al 1 por ciento, incubación a 65°C, con lavado en SSC 0.2x, y SDS al 0.1 por ciento a 65°C. Los ácidos nucleicos que no se hibríden unos a otros bajo condiciones restringentes, todavía son sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético. En estos casos, los ácidos nucleicos típicamente se híbridan bajo condiciones de hibridación moderadamente restringentes. Las "condiciones de hibridación moderadamente restringentes" incluyen una hibridación en un regulador de formamida al 40 por ciento, NaCI 1M, SDS al 1 por ciento, a 37°C, y un lavado en SSC 1X a 45°C. Una hibridación positiva es cuando menos el doble del fondo. Los expertos ordinarios reconocerán fácilmente que se pueden utilizar condiciones de hibridación y de lavado alternativas para proporcionar condiciones de restringencia similar. "Anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una región de estructura a partir de un gen de inmunoglobulina o fragmentos del mismo, que se enlace específicamente con, y reconozca, un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon, y mu, así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, que a su vez define las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, respectivamente. Una unidad estructural de inmunoglobulina de ejemplo (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada par una cadena "ligera" de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50 a 70 kDa). El término N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 ó más aminoácidos primordialmente responsables del reconocimiento del antígeno. Los términos "cadena ligera variable" (VL) y "cadena pesada variable" (VH) se refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente. Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas, o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos por la digestión con diferentes peptidasas. Por consiguiente, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo debajo de los enlaces de disulfuro en la región de articulación para producir F(ab)'2l un dímero de Fab que por sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CH1 por un enlace de disulfuro. El F(ab)'2 se puede reducir bajo condiciones ligeras para romper el enlace de disulfuro en la región de articulación, convirtiendo de esta manera el dímero de F(ab)'2 en un monómero de Fab'. El monómero de Fab' es esencialmente Fab con parte de la región de articulación (véase Fundamental Immunology (Paul, editor, Tercera Edición, 1993)). Aunque se definen diferentes fragmentos de anticuerpos en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que estos fragmentos se pueden sintetizar de novo, ya sea químicamente, o bien utilizando metodología de ADN recombinante. Por consiguiente, el término "anticuerpo", como se utiliza en la presente, también incluye fragmentos de anticuerpos, ya sea producidos mediante la modificación de anticuerpos enteros, o aquéllos sintetizados de novo utilizando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv de una sola cadena), o aquéllos identificados utilizando bibliotecas de exhibición de fagos (véase, por ejemplo, McCafferty y colaboradores, Nature 348:552-554 (1990)). Para la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales, se puede emplear cualquier técnica conocida en este campo (véase, por ejemplo, Kohler y Mílstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor y colaboradores, Immunology Today 4:72 (1983); Colé y colaboradores, páginas 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy (1985)). Las técnicas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos para los polipéptidos de esta invención. También, se pueden utilizar ratones transgénicos u otros organismos, tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados. De una manera alternativa, se puede emplear la tecnología de exhibición de fagos para identificar los anticuerpos y los fragmentos Fab heteroméricos que se enlacen específicamente con antígenos seleccionados (véase, por ejemplo, McCafferty y colaboradores, Nature 348:552-554 (1990); Marks y colaboradores, Biotechnology 10:779-783 (1992)). La frase "se enlaza específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo, o "es específicamente (o selectivamente) inmuno-reactivo con", cuando se refiere a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de enlace que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por consiguiente, bajo las condiciones del inmunoensayo diseñadas, los anticuerpos especificados se enlazan con una proteína particular cuando menos dos veces el fondo, y no se enlazan sustancialmente en una cantidad significativa con otras proteínas presentes en la muestra. El enlace específico con un anticuerpo bajo estas condiciones puede requerir que un anticuerpo se seleccione por su especificidad para una proteína particular. Por ejemplo, se pueden seleccionar los anticuerpos policlonales reproducidos para proteínas de fusión con el fin de obtener solamente los anticuerpos policlonales que sean específicamente inmuno-reactivos con la proteína de fusión y no con los componentes individuales de las proteínas de fusión. Esta selección se puede lograr sustrayendo los anticuerpos que reaccionen cruzadamente con los antígenos individuales. Se pueden utilizar una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar los anticuerpos específicamente inmuno-reactivos con una proteína particular. Por ejemplo, se utilizan rutinariamente los inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar los anticuerpos específicamente inmuno-reactivos con una proteína (véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), para una descripción de los formatos y condiciones de inmunoensayo que se pueden utilizar para determinar la inmuno-reactividad específica). Típicamente, una reacción específica o selectiva será cuando menos el doble de la señal de fondo o ruido, y más típicamente será más de 10 a 100 veces el fondo.

Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifique un antígeno individual o una porción del mismo), o pueden comprender una variante de esta secuencia. Las variantes de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, supresiones, y/o inserciones, de tal manera que no se disminuya la actividad biológica del polipéptido de fusión codificado, en relación con un polipéptido de fusión que comprenda antígenos nativos. Las variantes de preferencia exhiben una identidad de cuando menos aproximadamente el 70 por ciento, más preferiblemente una identidad de cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, y muy preferiblemente una identidad de cuando menos aproximadamente el 90 por ciento con una secuencia de polinucleótído que codifique un polipéptido nativo o una porción del mismo. Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o sub-secuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, identidad del 70 por ciento, opcionalmente identidad del 75 por ciento, del 80 por ciento, del 85 por ciento, del 90 por ciento, o del 95 por ciento (por ejemplo, del 98 por ciento) sobre una región especificada), al compararse y alinearse para una máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o una región diseñada como se mida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias, o mediante alineación manual e inspección visual. Entonces se dice que estas secuencias son "sustancialmente idénticas". Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que sea de cuando menos aproximadamente 25 a aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud, u opcionalmente sobre una región que sea de 75 a 100 aminoácidos o nucleótidos de longitud. Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, se designan las coordenadas de la sub-secuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Se pueden utilizar los parámetros del programa por omisión, o se pueden designar parámetros alternativos. Entonces el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencias para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", como se utiliza en la presente, incluye la referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas a partir del grupo que consiste en 25 a 500, usualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en donde se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo numero de posiciones contiguas después de que se alinean óptimamente las dos secuencias Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica La alineación óptima de secuencias para comparación se puede conducir, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv Appl Math 2482 (1981 ), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J Mol Biol 48443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, Proc Nat'l Acad Sci EUA 852444 (1988), mediante implementaciones computapzadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsm Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr , Madison, Wl), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols m Molecular Biology (Ausubel y colaboradores, editores, suplemento 1995)) Un ejemplo de un algoritmo útil es el PILEUP PILEUP crea una alineación de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas, utilizando alineaciones progresivas por pares, para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencias También gráfica un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agrupación utilizadas para crear la alineación PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doohttle, J Mol Evol 35351-360 (1987) El método empleado es similar al método descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5,000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple empieza con la alineación por pares de las dos secuencias más similares, produciendo un racimo de dos secuencias alineadas. Este racimo se alinea entonces con la siguiente secuencia más relacionada o racimo de secuencias alineadas. Dos racimos de secuencias se alinean mediante una extensión simple de la alineación por pares de dos secuencias individuales. La alineación final se logra mediante una serie de alineaciones progresivas por pares. El programa se ejecuta mediante la designación de secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para las regiones de comparación de secuencias, y mediante la designación de los parámetros del programa. Utilizando PILEUP, se compara una secuencia de referencia con otras secuencias de prueba para determinar la relación del porcentaje de identidad de secuencias, utilizando los siguientes parámetros: peso de hueco por omisión (3.00), peso de longitud de hueco por omisión (0.10), y huecos de extremo ponderados. PILEUP se puede obtener del paquete de software de análisis de secuencias GCG, por ejemplo, versión 7.0 (Devereaux y colaboradores, Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984)). Otro ejemplo de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y de similitud de secuencias, son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y colaboradores, Nuc. Acids Res. 25:3389- 3402 (1977), y Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. El software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra identificar primeramente los pares de secuencias de alto puntaje (HSPs), mediante la identificación de palabras cortas de una longitud W en la secuencia requerida, que concuerden o satisfagan algún puntaje umbral de valor positivo T al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. T es referido como el umbral de puntaje de palabra vecina (Altschul y colaboradores, supra). Estos impactos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas con el fin de encontrar HSPs más largos que las contengan. Los impactos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia por tanto como se pueda aumentar el puntaje de alineación acumulativo. Los puntajes acumulativos se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntaje de recompensa para un par de residuos emparejados; siempre >0) y N (puntaje de multa para los residuos mal emparejados; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntaje para calcular el puntaje acumulativo. La extensión de los impactos de palabra en cada dirección se detienen cuando: el puntaje de alineación acumulativo cae fuera por la cantidad X desde su máximo valor alcanzado; el puntaje acumulativo llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntaje negativo; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T, y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por omisión una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por omisión una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntaje BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:10915 (1989)), alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas. El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual ocurriría un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos por azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0.2, más preferiblemente menor de aproximadamente 0.01 y de una manera muy preferible menor de aproximadamente 0.001.

COMPOSICIONES DE POLINUCLEOTIDOS Como se utilizan en la presente, los términos "segmento de ADN" y "polinucleótído" se refieren a una molécula de ADN que se ha aislado para liberarse del ADN genómico total de una especie particular. Por consiguiente, un segmento de ADN que codifique un polipéptido se refiere a un segmento de ADN que contiene una o más secuencias de codificación, y no obstante, está sustancialmente aislado de, o purificado para liberarse de, el ADN genómico total de la especie a partir de la cual se obtenga el segmento de ADN. Dentro de los términos "segmento de ADN" y "polinucleótido" se incluyen los segmentos de ADN y los fragmentos más pequeños de estos segmentos, y también vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagémidos, fagos, virus, y similares. Como será entendido por los expertos en este campo, los segmentos de ADN de esta invención pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extra-genómicas y codificadas por plásmidos, y segmentos genéticos diseñados más pequeños que expresen, o que se puedan adaptar para expresar, proteínas, polipéptidos, péptidos, y similares. Estos segmentos se pueden aislar naturalmente, o pueden ser modificados sintéticamente por la mano del hombre. Los términos "aislado", "purificado", o "biológicamente puro", por consiguiente, se refieren al material que está sustancialmente o esencialmente libre de los componentes que lo acompañan normalmente como se encuentra en su estado nativo. Desde luego, esto se refiere al segmento de ADN como se aisla originalmente, y no excluye a otras proteínas aisladas, genes, o regiones codificantes posteriormente agregadas a la composición por la mano del hombre. La pureza y homogeneidad se determinan típicamente utilizando técnicas de química analítica, tales como electroforesis en gel de poliacrílamida o cromatografía de líquidos de alto rendimiento. Una proteína que sea la especie predominante presente en una preparación, está sustancialmente purificada. Un ácido nucleico aislado se separa de otros marcos de lectura abierta que flanqueen el gen, y que codifiquen proteínas diferentes del gen. Como será reconocido por el experto, los polinucleótidos pueden ser de una sola cadena (codificantes o anti-sentido) o de doble cadena, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc, o sintético) o de ARN. Las moléculas de ARN incluyen las moléculas de ARNHn, que contienen intrones, y corresponden a una molécula de ADN de una manera de uno a uno, y moléculas de ARNm, que no contienen ¡ntrones. Puede haber presentes, aunque no necesitan estar, secuencias codificantes o no codificantes adicionales dentro de un polinucleótido de la presente invención, y un polínucleótído se puede enlazar, pero no necesita enlazarse, a otras moléculas y/o materiales de soporte. Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifique un antígeno de Chlamydia o una porción del mismo), o pueden comprender una variante, o un equivalente funcional biológico o antigénico de esta secuencia. Las variantes de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, supresiones, y/o inserciones, como se describe adicionalmente más adelante, de preferencia de tal manera que no se disminuya la inmunogenicidad del polipéptido codificado, en relación con una proteína de tumor nativa. El efecto sobre la inmunogenicidad del polipéptido codificado se puede evaluar en general como se describe en la presente. El término "variantes" también abarca los genes homólogos de origen xenogénico. En las modalidades adicionales, la presente invención proporciona polinucleótidos y polipéptidos aislados que comprenden diferentes longitudes de estiramientos contiguos de secuencias idénticas a, o complementarias para, una o más de las secuencias dadas a conocer en la presente. Por ejemplo, la presente invención proporciona polinucleótidos que comprenden cuando menos aproximadamente 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 ó 1,000 o más nucleótidos contiguos de una o más de las secuencias dadas a conocer en la presente, así como todas las longitudes intermedias entre los mismos. Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias", en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores citados, tales como 16, 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 102, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluyendo todos los enteros hasta 200-500; 500-1,000, y similares. Los polinucleótidos de la presente invención, o fragmentos de los mismos, independientemente de la longitud de la secuencia de codificación misma, se pueden combinar con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes, y similares, de tal manera que su longitud total puede variar considerablemente. Por consiguiente, se contempla que se puede emplear un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, estando la longitud total de preferencia limitada por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido. Por ejemplo, los segmentos de ADN ilustrativos con longitudes totales de aproximadamente 10,000, de aproximadamente 5,000, de aproximadamente 3,000, de aproximadamente 2,000, de aproximadamente 1,000, de aproximadamente 500, de aproximadamente 200, de aproximadamente 100, de aproximadamente 50 pares de bases de longitud, y similares (incluyendo todas las longitudes intermedias) son contemplados como útiles en muchas implementacíones de esta invención. Más aún, será apreciado por los expertos ordinarios en este campo que, como resultado de la degeneración del código genético, puede haber muchas secuencias de nucleótidos que codifiquen un polipéptido como se describe en la presente. Algunos de estos polinucleótidos llevan una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, la presente invención contempla específicamente polinucleótidos que varíen debido a las diferencias en el uso de codones, por ejemplo polinucleótidos que se optimicen para la selección de codones humanos y/o de primates. Además, los alelos de los genes que comprendan las secuencias de polmucleótidos proporcionadas en la presente, están dentro del alcance de la presente invención. Los alelos son genes endógenos que se alteran como un resultado de una o más mutaciones, tales como supresiones, adiciones, y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultante puede tener, pero no necesita tener, una estructura o función alterada. Los alelos se pueden identificar empleando técnicas convencionales (tales como hibridación, amplificación, y/o comparación de secuencias de bases de datos). IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE POLINUCLEÓTIDOS Los polinucleótidos se pueden identificar, preparar, y/o manipular empleando cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas. Por ejemplo, un polinucleótído se puede identificar, como se describe con mayor detalle más adelante, mediante el rastreo de un microarreglo de ADNcs. Estos rastreos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, utilizando un microarreglo Synteni (Palo Alto, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (y esencialmente como es descrito por Schena y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 93:10614-10619 (1996), y Heller y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 94:2150-2155 (1997)). De una manera alternativa, los polinucleótidos se pueden amplificar a partir del ADNc preparado a partir de células que expresen las proteínas descritas en la presente, tales como células de C. trachomatis. Estos polinucleótidos se pueden amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para este planteamiento, se pueden diseñar cebadores específicos de la secuencia basándose en las secuencias proporcionadas en la presente, y se pueden adquirir o sintetizar. Se puede utilizar una porción amplificada de un polinucleótido de la presente invención para aislar un gen de longitud completa a partir de una biblioteca adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de C. trachomatis), empleando técnicas bien conocidas. Dentro de estas técnicas, se rastrea una biblioteca (ADNc o genómica) utilizando una o más sondas de polinucleótidos o cebadores adecuados para la amplificación. De preferencia, una biblioteca se selecciona por tamaño para incluir moléculas más grandes. También se pueden preferir las bibliotecas de cebado aleatorio para identificar las regiones 5' y corriente arriba de los genes. Se prefieren las bibliotecas genómicas para obtener ¡ntrones y para extender las secuencias 5'. Para las técnicas de hibridación, una secuencia parcial se puede marcar (por ejemplo, mediante traducción de apriete o marca de extremo con 32P) empleando técnicas bien conocidas. Entonces se rastrea generalmente una biblioteca bacteriana o de bacteriófagos mediante la hibridación de filtros que contengan colonias bacterianas desnaturalizadas (o pistas que contengan placas de fagos) con la sonda marcada (véase Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)). Las colonias o placas de hibridación se seleccionan y se expanden, y se aisla el ADN para un análisis adicional. Los clones de ADNc se pueden analizar para determinar la cantidad de secuencia adicional mediante, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, utilizando un cebador a partir de la secuencia parcial, y un cebador a partir del vector. Se pueden generar mapas de restricción y secuencias parciales para identificar uno o más clones traslapados. Entonces se puede determinar la secuencia completa empleando técnicas convencionales, que pueden involucrar la generación de una serie de clones de supresión. Las secuencias traslapadas resultantes se pueden ensamblar entonces en una sola secuencia contigua. Se puede generar una molécula de ADNc de longitud completa mediante el ligamiento de fragmentos adecuados, utilizando técnicas bien conocidas. De una manera alternativa, existen numerosas técnicas de amplificación para obtener una secuencia de codificación de longitud completa a partir de una secuencia de ADNc parcial. Dentro de estas técnicas, la amplificación se lleva a cabo en general por medio de reacción en cadena de la polímerasa. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de los kits comercialmente disponibles para llevar a cabo el paso de amplificación. Se pueden diseñar cebadores utilizando, por ejemplo, el software bien conocido en este campo. Los cebadores son de preferencia de 22 a 30 nucleótídos de longitud, y tienen un contenido de GC de cuando menos el 50 por ciento, y se templan a la secuencia objetivo a temperaturas de aproximadamente 68°C a 72°C. La región amplificada se puede secuencíar como se describe anteriormente, y se ensamblan las secuencias traslapadas en una secuencia contigua. Una de estas técnicas de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa inversa (véase Triglía y colaboradores, Nucí. Acids Res. 16:8186 (1988)), la cual utiliza enzimas de restricción para generar un fragmento en la región conocida del gen. Entonces se circulariza el fragmento mediante ligamiento intramolecular, y se utiliza como una plantilla para la reacción en cadena de la polimerasa, con cebadores divergentes derivados a partir de la región conocida. Dentro de un planteamiento alternativo, se pueden recuperar las secuencias adyacentes a una secuencia parcial mediante amplificación con un cebador para una secuencia enlazadora, y un cebador específico para una región conocida. Las secuencias amplificadas típicamente se someten a una segunda ronda de amplificación con el mismo cebador enlazador y un segundo cebador específico para la región conocida. Una variación de este procedimiento, que emplea dos cebadores que inician la extensión en direcciones opuestas desde la secuencia conocida, se describe en la Publicación Internacional Número WO 96/38591. Otra de estas técnicas se conoce como "amplificación rápida de extremos de ADNc" o "RACE". Esta técnica involucra el uso de un cebador interno y un cebador externo, que se hibrida a una región poliA o secuencia de vector, para identificar secuencias que estén a 5' y 3' de una secuencia conocida. Las técnicas adicionales incluyen reacción en cadena de la polimerasa de captura (Lagerstrom y colaboradores, PCR Methods Applic. 1:111-19 (1991)), y reacción en cadena de la polimerasa encaminada (Parker y colaboradores, Nucí. Acids. Res. 19:3055-60 (1991)). También se pueden emplear otros métodos que empleen amplificación para obtener una secuencia de ADNc de longitud completa. En ciertas instancias, es posible obtener una secuencia de ADNc de longitud completa mediante el análisis de las secuencias proporcionadas en una base de datos de marca de secuencia expresada (EST), tal como la que está disponible en GenBank. Las búsquedas de las ESTs traslapadas se pueden llevar en general a cabo empleando programas bien conocidos (por ejemplo, búsquedas de NCBI BLAST), y estas ESTs se pueden utilizar para generar una secuencia de longitud completa contigua. También se pueden obtener secuencias de ADN de longitud completa mediante el análisis de fragmentos genómicos. EXPRESIÓN DE POLINUCLEÓTIDOS EN CÉLULAS HUÉSPED En otras modalidades de la invención, se pueden utilizar secuencias de polinucleótidos o fragmentos de las mismas que codifiquen los polipéptidos de la invención, o proteínas de fusión o sus equivalentes funcionales, en las moléculas de ADN recombinantes, para dirigir la expresión de un polipéptido en células huésped apropiadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, se pueden producir otras secuencias de ADN que codifiquen sustancialmente la misma, o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente, y estas secuencias se pueden utilizar para clonar y expresar un polipéptido dado. Como será entendido por los expertos en la materia, puede ser conveniente, en algunos casos, producir secuencias de nucle?tidos que codifiquen el polipéptido que posean codones que no se presenten naturalmente. Por ejemplo, los codones preferidos por un huésped procariótico o eucariótico particular se pueden seleccionar para aumentar el índice de expresión de proteína, o para producir una transcripción de ARN recombinante que tenga las propiedades deseables, tales como una vida medía que sea más larga que aquélla de una transcripción generada a partir de la secuencia que se presente naturalmente. Más aún, las secuencias de polinucleótidos de la presente invención se pueden diseñar empleando métodos generalmente conocidos en la técnica, con el objeto de alterar las secuencias de codificación del polipéptido por una variedad de razones, incluyendo, pero no limitándose a, alteraciones que modifiquen la clonación, procesamiento, y/o expresión del producto genético. Por ejemplo, se puede emplear mezcla de ADN mediante fragmento aleatoria y reensamble con reacción en cadena de la polímerasa de los fragmentos genéticos y los olígonucleótídos sintéticos, para diseñar las secuencias de nucleótidos. En adición, se puede emplear mutagénesis dirigida al sitio para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glicosilación, cambiar la preferencia de codones, producir variantes de empalme, o introducir mutaciones, y así sucesivamente.

En otra modalidad de la invención, se pueden ligar secuencias de ácidos nucleicos naturales, modificadas, o recombinantes, a una secuencia heteróloga, para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, con el fin de rastrear bibliotecas de péptidos para determinar inhibidores de actividad de polipéptído, puede ser útil codificar una proteína quimérica que pueda ser reconocida por un anticuerpo comercialmente disponible. También se puede diseñar una proteína de fusión para que contenga un sitio de disociación localizado entre la secuencia que codifique el polipéptido y la secuencia de proteína heteróloga, de tal manera que se pueda disociar el polipéptído y se pueda purificar para separarse de la fracción heteróloga. Se pueden sintetizar secuencias que codifiquen un polipéptido deseado, del todo o en parte, empleando métodos químicos bien conocidos en este campo (véase Caruthers, M. H. y colaboradores, Nucí. Acids Res. Symp. Ser. páginas 215-223 (1980), Horn y colaboradores, Nucí. Acids Res. Symp. Ser. páginas 225-232 (1980)). De una manera alternativa, la proteína misma se puede producir empleando métodos químicos para sintetizar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, o una porción de la misma. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la síntesis del péptido empleando diferentes técnicas en fase sólida (Roberge y colaboradores, Science 269:202-204 (1995)), y se puede lograr la síntesis automatizada, por ejemplo, utilizando el Sintetízador de Péptidos ABI 431A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).

Un péptido recién sintetizado se puede purificar sustancialmente mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento de preparación (por ejemplo, Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principies (1983)), u otras técnicas comparables disponibles en la materia. La composición de los péptidos sintéticos se puede confirmar mediante análisis de aminoácidos o secuenciación (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman). Adicionalmente, se puede alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, o cualquier parte de la misma, durante la síntesis directa, y/o se puede combinar empleando métodos químicos con secuencias de otras proteínas, o cualquier parte de las mismas, para producir un polipéptído variante. Con el objeto de expresar un polipéptido deseado, se pueden insertar las secuencias de nucleótidos que codifiquen el polipéptido, o equivalentes funcionales, en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contenga los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación insertada. Se pueden emplear los métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica, para construir los vectores de expresión que contengan secuencias que codifiquen un polipéptído de interés, y los elementos de control de transcripción y traducción apropiados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinacíón genética in vivo. Estas técnicas se describen en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), y en Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology (1989). Se pueden utilizar una variedad de vectores/sistemas huéspedes de expresión para contener y expresar secuencias de polinucleótidos. Éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, plásmidos, o vectores de expresión de ADN de cósmidos; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células de plantas transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV), o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti ó pBR322); o sistemas de células de animales. Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión, son las regiones no traducidas del vector - potenciadores, promotores, regiones no traducidas 5' y 3' - que interactúan con las proteínas celulares huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Estos elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y del huésped utilizado, se pueden emplear cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se hace la clonación en sistemas bacterianos, se pueden utilizar promotores inducíbles, tales como el promotor híbrido lacZ del fagémido PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.), o el plásmido PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), y similares. En los sistemas de células de mamífero, en general se prefieren promotores de genes de mamífero o de virus de mamífero. Es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de la secuencia que codifique un polipéptido, y convenientemente se pueden utilizar vectores basados en SV40 ó EBV con un marcador seleccionable apropiado. En los sistemas bacterianos, se pueden seleccionar un número de vectores de expresión, dependiendo del uso pretendido para el polipéptido expresado. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades, por ejemplo, para la inducción de anticuerpos, se pueden utilizar vectores que dirijan una expresión de alto nivel de las proteínas de fusión que se purifiquen fácilmente. Estos vectores incluyen, pero no se limitan a, los vectores de clonación y expresión de E. coli multifuncionales, tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en donde la secuencia que codifique el polipéptído de interés se puede ligar en el vector dentro del marco, con secuencias para el Met amino-terminal y los siguientes siete residuos de ß-galactosidasa, de tal manera que se produzca una proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989)); y similares. También se pueden utilizar los vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con S-transferasa de glutationa (GST). En general, estas proteínas de fusión son solubles, y se pueden purificar fácilmente a partir de las células Usadas mediante adsorción en perlas de glutationa-agarosa, seguida por elución en la presencia de glutatíona libre. Las proteínas hechas en estos sistemas se pueden diseñar para incluir heparina, trombína, o sitios de disociación de proteasa de factor XA, de tal manera que se pueda liberar el polipéptido clonado de interés a partir de la fracción GST al gusto. En la levadura, Saccharomyces cerevisiae, se pueden utilizar un número de vectores que contengan promotores constitutivos o inducibles, tales como el factor alfa, oxidasa de alcohol, y PGH. Otros vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles incluyen GAP, PGK, GAL, y ADH. Para las revisiones, véase Ausubel y colaboradores (supra), Grant y colaboradores, Methods Enzymol. 153:516-544 (1987), y Romas y colaboradores, Yeast 8 423-88 (1992). En los casos en donde se utilizan vectores de expresión de plantas, la expresión de las secuencias que codifiquen los polipéptidos se pueden impulsar mediante cualquiera de un número de promotores. Por ejemplo, se pueden utilizar los promotores virales, tales como los promotores 35S y 19S de CaMV solos o en combinación con la secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)). De una manera alternativa, los promotores de plantas, tales como la subunidad pequeña de RUBISCO, o promotores de choque por calor (Coruzzi y colaboradores, EMBO J. 3.1671-1680 (1984); Broglie y colaboradores, Science 224:838-843 (1984); y Winter y colaboradores, Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)). Estas construcciones se pueden introducir en las células de plantas mediante transformación de ADN directa o transfección mediada por patógeno. Estas técnicas se describen en un número de revisiones generalmente disponibles (véase, por ejemplo, Hobbs en McGraw Hill Yearbook of Science and Technology páginas 191-196 (1992)). También se puede utilizar un sistema de insecto para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en este sistema, se utiliza el virus de políhedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia larvae. Las secuencias que codifiquen el polipéptido se pueden clonar en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y se colocan bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción con éxito de la secuencia que codifique el polipéptido hará que el gen de polihedrina se inactive, y produzca el virus recombinante que carezca de la proteína de recubrimiento. Entonces se pueden utilizar los virus recombinantes para infectar, por ejemplo, las células de S. frugiperda o Trichoplusia larvae, en donde se puede expresar el polipéptido de interés (Engelhard y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 91:3224-3227 (1994)). En las células huésped de mamífero, en general se dispone de un número de sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en los casos en donde se utiliza un adenovirus como un vector de expresión, las secuencias que codifiquen un polipéptido de interés se pueden ligar en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus consistente en el promotor tardío y en la secuencia líder tripartita. Se puede utilizar la inserción en una región E1 ó E3 no esencial del genoma viral para obtener un virus viable que sea capaz de expresar el polipéptido en las células huésped infectadas (Logan y Shenk, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 81:3655-3659 (1984)). En adición, se pueden utilizar potenciadores de transcripción, tales como el potenciador de virus de sarcoma de Rous (RSV), para aumentar la expresión en células huésped de mamífero. También se pueden utilizar señales de inicio específicas para lograr una traducción más eficiente de las secuencias que codifiquen un polipéptido de interés. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en donde las secuencias que codifiquen el polipéptido, su codón de inicio, y las secuencias corriente arriba se insertan en el vector de expresión apropiado, pueden no necesitarse señales de control de transcripción o de traducción adicionales. Sin embargo, en los casos en donde solamente se inserte la secuencia de codificación, o una porción de la misma, se deben proporcionar señales de control de traducción exógenas, incluyendo el codón de inicio ATG. Adicionalmente, el codón de inicio debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción del inserto entero. Los elementos de traducción exógenos y los codones de inicio pueden ser de diferentes orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión se puede mejorar mediante la inclusión de potenciadores que sean apropiados para el sistema celular particular que se utilice, tales como los descritos en la literatura (Scharf y colaboradores, Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)). En adición, se puede seleccionar una cepa celular huésped por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas, o para procesar la proteína expresada en la forma deseada. Estas modificaciones del polipéptído incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. También se puede emplear el procesamiento posterior a la traducción que disocie una forma "prepro" de la proteína, para facilitar la inserción, pliegue, y/o función correctos. Se pueden seleccionar diferentes células huésped, tales como CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38, que tengan la maquinaria celular específica y los mecanismos característicos para estas actividades posteriores a la traducción, con el fin de asegurar la modificación y el procesamiento correcto de la proteína extraña. Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, en general se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresen establemente un polinucleótido de interés se pueden transformar utilizando los vectores de expresión que puedan contener orígenes de réplica virales y/o elementos de expresión endógena, y un marcador seleccionable sobre el mismo vector o sobre un vector separado. En seguida de la introducción del vector, se puede dejar que las células crezcan durante 1 a 2 días en un medio enriquecido antes de cambiarse al medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de las células, que expresan con éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células establemente transformadas pueden proliferar empleando técnicas de cultivo de tejido apropiadas para el tipo de célula. Se puede emplear cualquier número de sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Éstos incluyen, pero no se limitan a, los genes de cinasa de timidina de virus de herpes simplex (Wígler y colaboradores, Cell 11:223-32 (1977)), y la fosfo-ribosil-transferasa de adenina (Lowy y colaboradores, Cell 22:817-23 (1990)), los cuales se pueden emplear en células tk.sup.-ó aprt.sup.-, respectivamente. También, se puede utilizar resistencia a anti-metabolitos, antibióticos, o herbicidas como la base para la selección; por ejemplo, dhfr que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 77:3567-70 (1980)); npt, que confiere resistencia a los aminoglícósidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin y colaboradores, J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)); y ais ó pat, que confieren resistencia al clorsulfurón y a la acetil-transferasa de fosfinotricina, respectivamente (Murry, supra). Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano, ó hisD, que permite que las células utilicen histínol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 85:8047-51 (1988)). Recientemente, el uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con marcadores tales como antocianinas, ß-glucuronidasa, y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, utilizándose ampliamente no sólo para identificar transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión de proteína transitoria o estable atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes y colaboradores, Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)). Aunque la presencia/ausencia de expresión del gen marcador sugiere que el gen de interés también está presente, se puede necesitar confirmar su presencia y expresión. Por ejemplo, sí se inserta la secuencia que codifica un polipéptido dentro de una secuencia del gen marcador, se pueden identificar las células recombinantes que contengan las secuencias por la ausencia de la función del gen marcador. De una manera alternativa, se puede colocar un gen marcador en fila con una secuencia de codificación de polipéptído bajo el control de un solo promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o a la selección, usualmente indica la expresión del gen en fila también. De una manera alternativa, las células huésped que contengan y expresen una secuencia de polinucleótido deseada, se pueden identificar mediante una variedad de procedimientos conocidos por los expertos en este campo. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones de ADN-ADN ó de ADN-ARN, y técnicas de bioensayo de proteína o inmunoensayo que incluyan tecnologías basadas en membrana, solución, o chip para la detección y/o cuantificación del ácido nucleico o de la proteína.

En la técnica se conocen una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de los productos codificados por polinucleótidos, utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para el producto. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunosorbente enlazado con enzima (ELISA), el radioinmunoensayo (RÍA), y la selección de células activada por fluorescencia (FACS). Se puede preferir para algunas aplicaciones un inmunoensayo basado en monoclonal, de dos sitios, que utiliza anticuerpos monoclonales que reaccionan con dos epítopos no interferentes sobre un polipéptido dado, pero también se puede emplear un ensayo de enlace competitivo. Estos y otros ensayos se describen, entre otros lugares, en Hampton y colaboradores, Serological Methods, a Laboratory Manual (1990), y Maddox y colaboradores, J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983). Los expertos en la materia conocen una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación, y se pueden utilizar en diferentes ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir sondas de hibridación marcadas o de reacción en cadena de la polimerasa para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos incluyen olígomarcado, traducción de apriete, marcado de extremo, o amplificación con reacción en cadena de la polimerasa utilizando un nucleótído marcado. De una manera alternativa, las secuencias, o cualesquiera porciones de las mismas, se pueden clonar en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Estos vectores se conocen en la materia, están comercialmente disponibles, y se pueden utilizar para sintetizar sondas de ARN in vitro, mediante la adición de una polimerasa de ARN apropiada, tal como T7, T3, ó SP6, y nucleótidos marcados. Estos procedimientos se pueden conducir empleando una variedad de kits comercialmente disponibles. Las moléculas reporteras o marcas adecuadas que se pueden utilizar incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimiluminescentes, o cromogénicos, así como sustratos, co-factores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares. Las células huésped transformadas con una secuencia de polinucleótido de interés, se pueden cultivar bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante se puede secretar o puede estar contenida intracelularmente, dependiendo de la secuencia y/o del vector utilizado. Como será entendido por los expertos en la técnica, se pueden diseñar vectores de expresión que contengan los polinucleótidos de la invención, para contener secuencias de señales que dirijan la secreción del polipéptido codificado a través de una membrana celular procariótica o eucariótica. Se pueden utilizar otras construcciones recombinantes para unir las secuencias que codifiquen un polipéptido de interés a la secuencia de nucleótidos que codifique un dominio de polipéptido que facilite la purificación de las proteínas solubles. Estos dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metales, tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación por afinidad/extensión FLAGS (Immunex Corp., Seattie, Wash.). La inclusión de secuencias enlazadoras disociables, tales como aquéllas específicas para el factor XA o enterocinasa (Invitrogen, San Diego, Calif.) entre el dominio de purificación y el polipéptido codificado, se puede utilizar para facilitar la purificación. Uno de estos vectores de expresión proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido de interés, y un ácido nucleico que codifica seis residuos de histidina precedentes a una tio-redoxina o a un sitio de disociación de enterocinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación sobre IMIAC (cromatografía por afinidad de iones de metales inmovilizados), como se describe en Porath y colaboradores, Prot. Exp. P?rif. 3:263-281 (1992), mientras que el sitio de disociación de enterocinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido deseado a partir de la proteína de fusión. Una discusión de los vectores que contienen proteínas de fusión se proporciona en Kroll y colaboradores, DNA Cell Biol. 12:441-453 (1993)). En adición a los métodos de producción recombinantes, los polipéptidos de la invención, y los fragmentos de los mismos, se pueden producir mediante síntesis de péptidos directa, utilizando las técnicas en fase sólida Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). La síntesis de proteínas se puede llevar a cabo empleando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, utilizando el Sintetízador de Péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). De una manera alternativa, se pueden sintetizar químicamente diferentes fragmentos por separado, y se pueden combinar empleando los métodos químicos para producir la molécula de longitud completa. TÉCNICAS DE SUMINISTRO DE POLINUCLEÓTIDOS IN VIVO En las modalidades adicionales, se introducen las construcciones genéticas que comprendan a las composiciones de los polinucleótídos de la invención en las células in vivo. Esto se puede lograr empleando cualquiera de una variedad de planteamientos bien conocidos, varios de los cuales se ilustran en seguida para propósitos de ilustración. 1. Adenovirus Uno de los métodos preferidos para el suministro in vivo de una o más secuencias de ácidos nucleicos involucra el uso de un vector de expresión de adenovirus. "Vector de expresión de adenovirus" significa que incluye las construcciones que contienen secuencias de adenovirus suficientes para (a) soportar el empaque de la construcción, y (b) expresar un polínucleótido que se haya clonado en las mismas en una orientación en sentido o anti-sentido. Desde luego, en el contexto de una construcción anti-sentido, la expresión no requiere que se sintetice el producto genético. El vector de expresión comprende una forma genéticamente diseñada de un adenovirus. El conocimiento de la organización genética del adenovirus, un virus de ADN de doble cadena, lineal, de 36 kb, permite la sustitución de grandes pedazos del ADN adenoviral con secuencias extrañas de hasta 7 kb (Grunhaus y Horwitz, 1992). En contraste con los retrovirus, la infección adenoviral de las células huésped no da como resultado la integración cromosómica, debido a que el ADN adenoviral puede replicarse de una manera episomal sin una genotoxicidad potencial. También, los adenovirus son estructuralmente estables, y no se ha detectado ninguna reconfiguración del genoma después de una extensa amplificación. El adenovirus puede infectar virtualmente a todas las células epiteliales, independientemente de su etapa del ciclo celular. Hasta ahora, la infección adenoviral parece estar ligada solamente a la enfermedad leve, tal como una enfermedad respiratoria aguda en los seres humanos. El adenovirus es particularmente adecuado para utilizarse como un vector de transferencia de genes, debido a su genoma de tamaño medio, a su facilidad de manipulación, a su alta titulación, a su amplio rango de células objetivo, y a su alta infectividad. Ambos extremos del genoma viral contienen de 100 a 200 repeticiones invertidas de pares de bases (ITRs), que son los elementos cis necesarios para la réplica del ADN viral y su empaque. Las regiones temprana (E) y tardía (L) del genoma, contienen diferentes unidades de transcripción que se dividen mediante el establecimiento de la réplica del ADN viral. La región E1 (E1A y E1B), codifica las proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma viral y unos cuantos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) da como resultado la síntesis de las proteínas para la réplica del ADN viral. Estas proteínas están involucradas en la réplica del ADN, en la expresión genética tardía, y en la desactivación de la célula huésped (Renán, 1990). Los productos de los genes tardíos, incluyendo la mayoría de las proteínas de capsída virales, se expresan solamente después de un procesamiento significativo de una sola transcripción primaria emitida por el promotor tardío mayor (MLP). El MLP (localizado a 16.8 m.u.) es particularmente eficiente durante la fase tardía de la infección, y todos los ARNms emitidos desde este promotor poseen una secuencia líder 5µ-tripartita (TPL) que los convierte en los ARNms preferidos para la traducción. En un sistema actual, se genera el adenovirus recombinante a partir de recombinación homologa entre el vector de lanzamiento y el vector de pro-virus. Debido a la posible recombinación entre dos vectores pro-virales, se puede generar el adenovirus de tipo silvestre a partir de este proceso. Por consiguiente, es crítico aislar un solo clon del virus a partir de una placa individual, y examinar su estructura genómica. La generación y propagación de los vectores de adenovirus actuales, que son deficientes en réplica, dependen de una línea de células auxiliares única, designada como 293, que se transformó a partir de células de riñon embrionarias humanas mediante fragmentos de ADN Ad5, y expresa constitutivamente las proteínas E1 (Graham y colaboradores, 1977). Debido a que la región E3 es prescindible del genoma de adenovirus (Jones y Shenk, 1978), los vectores de adenovirus actuales, con la ayuda de las células 293, llevan ADN extraño ya sea en la región E1, en la D3, o en ambas regiones (Graham y Prevec, 1991). En la naturaleza, el adenovirus puede empacar aproximadamente el 105 por ciento del genoma de tipo silvestre (Ghosh-Choudhury y colaboradores, 1987), proporcionando la capacidad para aproximadamente 2 kB extra de ADN. Combinado con los Publicación Internacional Número WO 5.5 kB del ADN que es reemplazable en las regiones E1 y E3, la máxima capacidad del vector de adenovirus actual está debajo de 7.5 kB, o aproximadamente el 15 por ciento de la longitud total del vector. Más del 80 por ciento del genoma viral del adenovirus permanece en la estructura base del vector, y es la fuente de citotoxicídad del vector. También, la deficiencia en réplica del virus con E1 suprimido es incompleta. Por ejemplo, se ha observado una fuga de expresión genética viral con los vectores actualmente disponibles en altas multiplicidades de infección (MOI) (Mulligan, 1993). Las líneas celulares auxiliares se pueden derivar a partir de células humanas, tales como las células de riñon embrionario humano, células de músculo, células hematopoiéticas, u otras células mesenquimales o epiteliales embrionarias humanas. De una manera alternativa, las células auxiliares se pueden derivar a partir de las células de otras especies de mamífero, que sean permisivas para el adenovirus humano. Estas células incluyen, por ejemplo, las células Vero u otras células mesenquimales o epiteliales embrionarias de mono. Como se menciona anteriormente, la línea celular auxiliar actualmente preferida es la 293. Recientemente, Racher y colaboradores (1995) dieron a conocer mejores métodos para cultivar las células 293 y propagar el adenovirus. En un formato, se cultivan agregados de células naturales mediante la inoculación de las células individuales en matraces centrífugos siliconizados de 1 litro (Techne, Cambridge, Reino Unido) conteniendo de 100 a 200 mililitros del medio. En seguida de la agitación a 40 revoluciones por minuto, se estima la viabilidad celular con azul de tripano. En otro formato, se emplean micro-portadores Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, Reino Unido) (5 gramos/litro) como sigue. Se agrega un inoculo celular, resuspendido en 5 mililitros del medio, al portador (50 mililitros) en un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros, y se deja estacionario, con agitación ocasional, durante 1 a 4 horas. Entonces se reemplaza el medio con 50 mililitros de medio fresco, y se inicia la agitación. Para la producción del virus, se deja que las células crezcan hasta una confluencia de aproximadamente el 80 por ciento, después de cuyo tiempo, se reemplaza el medio (hasta el 25 por ciento del volumen final), y se agrega el adenovirus en una multiplicidad de infección de 0.05. Los cultivos se dejan estacionarios durante la noche, en seguida de lo cual, se aumenta el volumen hasta el 100 por ciento, y se comienza la agitación durante otras 72 horas. Otra cosa que no sea el requerimiento de que el vector de adenovirus sea defectuoso en réplica, o cuando menos condicionalmente defectuoso, no se cree que la naturaleza del vector de adenovirus sea crucial para la práctica con éxito de la invención. El adenovirus puede ser cualquiera de los 42 diferentes serotipos conocidos o subgrupos A-F. El adenovirus tipo 5 del subgrupo C es el material de partida preferido para obtener un vector de adenovirus defectuoso en réplica condicional para utilizarse en la presente invención, debido a que el Adenovirus tipo 5 es un adenovirus humano acerca del cual se conoce una gran cantidad de ¡nformación bioquímica y genética, y se ha utilizado históricamente para la mayoría de las construcciones que emplean adenovirus como un vector. Como se mencionó anteriormente, el vector típico de acuerdo con la presente invención es defectuoso en réplica, y no tendrá una región de adenovirus E1. Por consiguiente, será más conveniente introducir el polinucleótido que codifique el gen de interés en la posición a partir de la cual se hayan removido las secuencias de codificación de E1. Sin embargo, la posición de inserción de la construcción dentro de las secuencias de adenovirus no es crítica para la invención. El polinucleótido que codifique el gen de interés también se puede insertar en lugar de la región E3 suprimida, en vectores de reemplazo de E3, como es descrito por Karlsson y colaboradores (1986), o en la región E4, en donde una línea celular auxiliar o un virus auxiliar complemente el defecto de E4. El adenovirus es fácil de cultivar y manipular, y exhibe un amplio rango de huéspedes in vitro e in vivo. Este grupo de virus se puede obtener en altas titulaciones, por ejemplo, 109-1011 unidades formadoras de placas por mililitro, y son altamente infecciosos. El ciclo de vida del adenovirus no requiere de integración en el genoma de la célula huésped. Los genes extraños suministrados mediante vectores de adenovirus son episomales, y por consiguiente, tienen una baja genotoxicidad para las células huésped. No se han reportado efectos secundarios en los estudios de vacunación con adenovirus de tipo silvestre (Couch y colaboradores, 1963; Top y colaboradores, 1971), demostrando su seguridad y su potencial terapéutico como vectores de transferencia genética in vivo. Los vectores de adenovirus se han utilizado en la expresión genética eucariótica (Lavrero y colaboradores, 1991; Gomez-Foix y colaboradores, 1992), y en el desarrollo de vacunas (Grunhaus y Horwitz, 1992; Graham y Prevec, 1992). Recientemente, los estudios con animales sugirieron que se podría utilizar el adenovirus recombinante para terapia genética (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet y colaboradores, 1990; Rich y colaboradores, 1993). Los estudios en la administración de adenovirus recombinante a diferentes tejidos incluyen instilación en la tráquea (Rosenfeld y colaboradores, 1991; Rosenfeld y colaboradores, 1992), inyección muscular (Ragot y colaboradores, 1993), inyecciones intravenosas periféricas (Herz y Gerard, 1993), e inoculación estereotáctica en el cerebro (Le Gal La Salle y colaboradores, 1993). 2. Retrovirus Los retrovirus son un grupo de virus de ARN de una sola cadena caracterizados por una capacidad para convertir su ARN hasta ADN de doble cadena en las células infectadas, mediante un proceso de transcripción inversa (Coffin, 1990). Entonces el ADN resultante se integra establemente en los cromosomas celulares como un pro-virus, y dirige la síntesis de las proteínas virales. La integración da como resultado la retención de las secuencias genéticas virales en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes, gag, pol, y env, que codifican para las proteínas de capsida, la enzima polimerasa, y los componentes de envoltura, respectivamente. Una secuencia que se encuentra corriente arriba desde el gen gag contiene una señal para empacar el genoma en viriones. Dos secuencias de repetición terminal larga (LTR) están presentes en los extremos 5' y 3' del genoma viral. Éstas contienen secuencias promotoras y potenciadoras fuertes, y también se requieren para la integración en el genoma de la célula huésped (Coffin, 1990). Con el objeto de construir un vector retroviral, se inserta un ácido nucleico que codifique una o más secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos de interés, en el genoma viral, en el lugar de ciertas secuencias virales, para producir un virus que sea defectuoso en réplica. Con el objeto de producir viriones, se construye una línea celular de empaque que contenga los genes gag, pol, y env, pero sin la repetición terminal larga y los componentes de empaque (Mann y colaboradores, 1983). Cuando se introduce un plásmido recombinante que contenga un ADNc, junto con las secuencias de repetición terminal larga retroviral y de empaque en esta línea celular (mediante precipitación en fosfato de calcio, por ejemplo), la secuencia de empaque permite la transcripción del ARN del plásmido recombinante para empacarse en las partículas virales, que luego se secretan hacia el medio de cultivo (Nicolás y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann y colaboradores, 1983). Entonces se recolecta el medio que contiene los retrovirus recombinantes, opcionalmente se concentra, y se utiliza para la transferencia genética. Los vectores retrovirales son capaces de infectar una amplia variedad de tipos de células. Sin embargo, la integración y expresión estable requieren de la división de las células huésped (Paskind y colaboradores, 1975). Recientemente se desarrolló un planteamiento novedoso diseñado para permitir la dirección específica de vectores de retrovirus, basado en la modificación química de un retrovirus mediante la adición química de residuos de lactosa a la envoltura viral. Esta modificación podría permitir la infección específica de los hepatocitos por medio de los receptores de sialoglicoproteína. Se diseñó un planteamiento diferente para dirigir los retrovirus recombinantes, en donde se utilizaron anticuerpos biotinilados contra una proteína de envoltura retroviral y contra un receptor celular específico. Los anticuerpos se acoplaron por medio de los componentes de biotina utilizando estreptavidina (Roux y colaboradores, 1989). Utilizando anticuerpos contra los antígenos del complejo de histocompatibilidad mayor clase I y clase II, demostraron la infección de una variedad de células humanas que llevan estos antígenos superficiales con un virus ecotrópico ín vitro (Roux y colaboradores, 1989). 3. Virus Adeno-asociados. AAV ((Ridgeway, 1988; Hermonat y Muzycska, 1984) es un parvovirus, descubierto como una contaminación de los suministros adenovirales. Es un virus ubicuito (hay anticuerpos presentes en el 85 por ciento de la población humana de los Estados Unidos) que se no se ha ligado a ninguna enfermedad. También se clasifica como un dependovirus, debido a que sus réplicas dependen de la presencia de un virus auxiliar, tal como el adenovirus. Se han aislado cinco serotipos, de los cuales AAV-2 es el mejor caracterizado. AAV tiene un ADN lineal de una sola cadena que está encapsidado en las proteínas de capsida VP1, VP2, y VP3, para formar un viríón icosahédrico de 20 a 24 nanómetros de diámetro ((Muzyczka y McLaughlin, 1988). El ADN de AAV es de aproximadamente 4.7 kilobases de largo. Contiene dos marcos de lectura abierta, y está flanqueado por dos ITRs. Hay dos genes mayores en el genoma de AAV: rep y cap. El gen rep codifica para las proteínas responsables de las réplicas virales, mientras que cap codifica para la proteína de capsida VP1-3. Cada ITR forma una estructura de horquilla en forma de T. Estas repeticiones terminales son los únicos componentes cis esenciales del AAV para la integración cromosómica. Por consiguiente, el AAV puede utilizarse como un vector con todas las secuencias de codificación viral removidas y reemplazadas por el cásete de los genes para suministro. Se han identificado tres promotores virales, y se denominan como p5, p19, y p40, de acuerdo con su posición en el mapa. La transcripción desde p5 y p19 da como resultado la producción de las proteínas rep, y la transcripción desde p40 produce las proteínas de capsida (Hermonat y Muzyczka, 1984). Existen varios factores que motivaron a los investigadores a estudiar la posibilidad de utilizar rAAV como un vector de expresión. Uno es que los requerimientos para suministrar un gen con el fin de integrarse en el cromosoma huésped son sorprendentemente pocos. Es necesario tener las ITRs de 145 pares de bases, que son solamente el 6 por ciento del genoma de AAV. Esto deja espacio en el vector para ensamblar una inserción de ADN de 4.5 kb. Aunque esta capacidad portadora puede impedir que el AAV suministre genes grandes, es ampliamente adecuada para suministrar las construcciones anti-sentido de la presente invención. AAV también es una buena elección para suministrar vehículos, debido a su seguridad. Existe un mecanismo de rescate relativamente complicado: no solamente se requiere el adenovirus de tipo silvestre, sino también los genes de AAV para movilizar el rAAV. De la misma manera, AAV no es patogénico y no está asociado con ninguna enfermedad. La remoción de las secuencias de codificación viral minimiza las reacciones inmunes a la expresión genética viral, y por consiguiente, rAAV no provoca una respuesta inflamatoria. 4. Otros Vectores Virales Como Construcciones de Expresión. Se pueden emplear otros vectores virales con construcciones de expresión en la presente invención para el suministro de secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos a una célula huésped. Se pueden emplear vectores derivados de virus, tales como el virus de vacuna (Ridgeway, 1988; Coupar y colaboradores, 1988), los lentivirus, los poliovirus, y los virus de herpes. Ofrecen varias características atractivas para diferentes células de mamífero (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar y colaboradores, 1988; Horwích y colaboradores 1990). Con el reciente reconocimiento de los virus de hepatitis B defectuosos, se obtuvo un nuevo panorama sobre la relación de estructura-función de diferentes secuencias virales. Los estudios in vitro mostraron que el virus podría retener la capacidad para el empaque dependiente del auxiliar y la transcripción inversa, a pesar de la supresión de hasta el 80 por ciento de su genoma (Horwich y colaboradores, 1990). Esto sugirió que se podrían reemplazar porciones grandes del genoma con material genético extraño. El hepatotropismo y la persistencia (integración) eran propiedades particularmente atractivas para la transferencia genética dirigida al hígado. Chang y colaboradores (1991) introdujeron el gen de acetiltransferasa de cloranfenicol (CAT) en el genoma de virus de hepatitis B de pato en el lugar de las secuencias de codificación de polimerasa, superficiales y pre-superficiales. Se co-transfectó con el virus de tipo silvestre en una línea celular de hepatoma de ave. Se utilizaron medios de cultivo conteniendo altas titulaciones del virus recombinante para infectar los hepatocitos de pato primarios. La expresión del gen CAT estable se detectó durante cuando menos 24 días después de la transfección (Chang y colaboradores, 1991). Los vectores "virales" adicionales incluyen las partículas tipo virus (VLPs) y los fagos. 5. Vectores No Virales. Con el objeto de efectuar la expresión de las secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos de la presente invención, se debe suministrar la construcción de expresión a una célula. Este suministro se puede llevar a cabo in vitro, como en los procedimientos de laboratorio para transformar líneas celulares, o in vivo ó ex vivo, como en el tratamiento de ciertos estados de enfermedad. Como se describe anteriormente, un mecanismo preferido para el suministro es mediante la infección viral, en donde se encapsula la construcción de expresión en una partícula viral infecciosa. Una vez que se ha suministrado la construcción de expresión a la célula, se puede posicionar el ácido nucleico que codifique las secuencias de olígonucleótidos o polinucleótidos deseadas, y se puede expresar en diferentes sitios. En ciertas modalidades, el ácido nucleico que codifique la construcción se puede integrar establemente en el genoma de la célula. Esta integración puede ser en la localización y orientación específicas por medio de recombinación homologa (reemplazo de genes), o se puede integrar en la localización no específica aleatoria (aumento de genes). En todavía otras modalidades, el ácido nucleico se puede mantener establemente en la célula como un segmento episomal separado del ADN. Estos segmentos de ácidos nucleicos o "episomas" codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la réplica, independientemente de, o en sincronización con, el ciclo de la célula huésped. La manera en que se suministra la construcción de expresión a una célula, y en dónde en la célula permanece el ácido nucleico, dependen del tipo de construcción de expresión empleada.

En ciertas modalidades de la invención, la construcción de expresión que comprenda una o más secuencias de oligonucleótídos o polinucleótidos, simplemente puede consistir en ADN recombinante desnudo o en plásmidos. La transferencia de la construcción se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, que permeabilicen físicamente o químicamente la membrana celular. Esto es particularmente aplicable para la transferencia in vitro, pero se puede aplicar para utilizarse in vivo también. Dubensky y colaboradores (1984) inyectaron con éxito ADN de poliomavirus en la forma de precipitados en formato de calcio en hígado y bazo de ratones adultos y recién nacidos, demostrando la réplica viral activa y la infección aguda. Benvenisty y Reshef (1986) también demostraron que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados en fosfato de calcio, da como resultado la expresión de los genes transfectados. Se prevé que también se puede transferir un ADN que codifique un gen de interés de una manera similar in vivo, y expresar el producto genético. Otra modalidad de la invención para transferir una construcción de expresión de ADN desnudo a las células puede involucrar el bombardeo de partículas. Este método depende de la capacidad para acelerar los microproyectiles recubiertos con ADN a una alta velocidad, permitiéndoles perforar las membranas celulares y entrar a las células sin aniquilarlas (Klein y colaboradores, 1987). Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar las partículas pequeñas. Uno de estos dispositivos se apoya en una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica, que a su vez proporciona la fuerza motriz (Yang y colaboradores, 1990). Los microproyectíles utilizados han consistido en sustancias biológicamente inertes, tales como perlas de tungsteno o de oro. Los órganos seleccionados, incluyendo el hígado, piel, y tejido muscular de ratas y ratones, se han bombardeo in vivo (Yang y colaboradores, 1990; Zelenin y colaboradores, 1991). Esto puede requerir de la exposición quirúrgica del tejido o de las células, para eliminar cualquier tejido que intervenga entre la pistola y el órgano objetivo, es decir, el tratamiento ex vivo. Nuevamente, se puede suministrar ADN que codifique un gen particular por medio de este método, y todavía se puede incorporar en la presente invención. COMPOSICIONES DE POLIPÉPTIDOS La presente invención proporciona composiciones de polipéptidos como se describen en la presente. En términos generales, una composición de polipéptido de la invención será una combinación de polipéptidos aislados o fragmentos ¡nmunogénicos de los mismos. De una manera alternativa, algunos o todos los antígenos de polipéptido en una composición de la invención, pueden estar dentro de una proteína de fusión. Por ejemplo, en una composición de la invención que comprende tres antígenos: (i) los antígenos se pueden proporcionar en la forma de tres polipéptidos aislados, (ii) los tres antígenos de polipéptido se pueden proporcionar en una sola proteína de fusión, (iii) dos de los antígenos se pueden proporcionar en una proteína de fusión, proporcionándose el tercero en una forma aislada. Los polipéptidos de la combinación se pueden codificar mediante una secuencia o secuencias de polinucleótidos dadas a conocer en la presente, o mediante una secuencia o secuencias que se hibriden bajo condiciones moderadamente restringentes a una secuencia o secuencias de polinucleótidos dadas a conocer en la presente. De una manera alternativa, los polipéptidos se pueden definir como polipéptidos, cada uno comprendiendo una secuencia de aminoácidos contigua desde una secuencia de aminoácidos dada a conocer en la presente, o cuyos polipéptidos cada uno comprenden una secuencia de aminoácidos entera dada a conocer en la presente.

En general se pueden identificar porciones inmunogénicas utilizando técnicas bien conocidas, tales como las que se resumen en Paul, Fundamental Immunology, 3a Edición, 243-247 (1993) y las referencias citadas en el mismo. Estas técnicas incluyen rastreo de polipéptidos para determinar su capacidad para reaccionar con anticuerpos específicos del antígeno, antisueros y/o líneas de células-T o clones. Como se utilizan en la presente, antisueros y anticuerpos son "específicos del antígeno" si se enlazan específicamente con un antígeno (es decir, reaccionan con la proteína en un ELISA u otro inmunoensayo, y no reaccionan de una manera detectable con proteínas no relacionadas). Estos antisueros y anticuerpos se pueden preparar como se describe en la presente, y empleando técnicas bien conocidas. Una porción inmunogénica de una proteína de Chlamydia sp. es una porción que reacciona con estos antisueros y/o células-T a un nivel que no sea sustancialmente menor que la reactividad del polipéptido de longitud completa (por ejemplo, en un ELISA y/o en un ensayo de reactividad de células-T). Estas porciones inmunogénicas pueden reaccionar dentro de estos ensayos a un nivel que sea similar a, o mayor que, la reactividad del polipéptido de longitud completa. Estos rastreos se pueden llevar a cabo en general empleando métodos bien conocidos por los expertos ordinarios en este campo, tales como los descritos en Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual (1988). Por ejemplo, un polipéptido se puede inmovilizar sobre un soporte sólido, y se puede poner en contacto con el suero del paciente para permitir el enlace de los anticuerpos dentro del suero con el polipéptido inmovilizado. El suero no enlazado se puede remover entonces, y se detectan los anticuerpos enlazados utilizando, por ejemplo, proteína A marcada con 25l.

Los polipéptidos se pueden preparar utilizando cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas. Los polipéptídos recombinantes codificados por secuencias de ADN como se describen anteriormente, se pueden preparar fácilmente a partir de las secuencias de ADN, empleando cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos por los expertos ordinarios en la materia. La expresión se puede lograr en cualquier célula huésped apropiada que se haya transformado o transfectado con un vector de expresión que contenga una molécula de ADN que codifique un polipéptido recombinante. Las células huésped adecuadas incluyen células de procariotes, levadura, y de eucariotes superiores, tales como células de mamífero y células de plantas. De preferencia, las células huésped empleadas son E. coli, levadura, o una línea celular de mamífero tal como COS ó CHO. Los sobrenadantes de los sistemas huéspedes/de vector adecuados que secreten la proteína o el polipéptido recombinante en el medio de cultivo, se pueden concentrar primero utilizando un filtro comercialmente disponible. En seguida de la concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada, tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio de iones. Finalmente, se pueden emplear uno o más pasos de cromatografía de líquidos de alto rendimiento en fase inversa para purificar adicionalmente un polipéptido recombinante. Los polipéptidos de la invención, los fragmentos inmunogénícos de los mismos que puedan tener, por ejemplo, menos de aproximadamente 100 aminoácidos, o menos de aproximadamente 50 aminoácidos, también se pueden generar por medios sintéticos, empleando técnicas bien conocidas por los expertos ordinarios en este campo. Por ejemplo, estos polipéptidos se pueden sintetizar utilizando cualquiera de las técnicas de fase sólida comercialmente disponibles, tales como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en donde se agregan en secuencia los aminoácidos a una cadena de aminoácidos creciente. Ver Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146 (1963). El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está comercialmente disponible con los proveedores, tales como Perkin Elmer/Applied BioSystems División (Foster City, CA), y puede ser operado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dentro de ciertas modalidades específicas, un polipéptido puede ser una proteína de fusión que comprenda múltiples polipéptidos, como se describen en la presente, o que comprenda cuando menos un polipéptído como se describe en la presente, y una secuencia no relacionada, tal como una proteína conocida. Este componente de fusión, por ejemplo, puede ayudar a proporcionar epítopos auxiliares T (un componente de fusión inmunológica), de preferencia epítopos auxiliares T reconocidos por los seres humanos, o puede ayudar a expresar la proteína (un potenciador de expresión) en rendimiento más altos que la proteína recombinante nativa. Ciertos componentes de fusión preferidos son los componentes de fusión tanto inmunológicos como potenciádores de la expresión. Se pueden seleccionar otros componentes de fusión para aumentar la solubilidad de la proteína, o para hacer posible que la proteína se dirija hacia los compartimientos intracelulares deseados. Todavía otros componentes de fusión incluyen marcas de afinidad, que facilitan la purificación de la proteína. Las proteínas de fusión se pueden preparar en general empleando técnicas convencionales, incluyendo conjugación química. Por consiguiente, una proteína de fusión se puede expresar como una proteína recombínante, permitiendo la producción de mayores niveles, en relación con la proteína no fusionada, en un sistema de expresión. Dicho de una manera breve, las secuencias de ADN que codifiquen los componentes del polipéptido se pueden ensamblar por separado, y se pueden ligar en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifique el componente de polipéptido se liga, con o sin un enlazador peptídico, al extremo 5' de la secuencia de ADN que codifique el segundo componente de polipéptido, de tal manera que los marcos de lectura de las secuencias estén en fase. Esto permite la traducción a una sola proteína de fusión que retiene la actividad biológica de ambos polipéptidos componentes. Típicamente, las proteínas de fusión que comprendan dos o más antígenos, pueden omitir el codón de inicio (Met) del segundo y siguientes antígenos. Se puede emplear una secuencia enlazadora de péptidos para separar los primero y segundo componentes del polipéptido por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundaria y terciaria. Esta secuencia enlazadora de péptidos se incorpora en la proteína de fusión empleando técnicas convencionales bien conocidas en este campo. Las secuencias enlazadoras de péptidos adecuadas se pueden seleccionar basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su capacidad para adoptar una estructura secundaria que pueda interactuar con los epítopos funcionales sobre los primero y segundo polipéptidos; y (3) la falta de residuos hidrofóbicos o cargados que pudieran reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias enlazadoras de péptidos preferidas contienen los residuos Gly, Asn, y Ser. También se pueden utilizar otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, en la secuencia enlazadora. Las secuencias de aminoácidos que se pueden emplear útilmente como enlazadoras incluyen las que se dan a conocer en Maratea y colaboradores, Gene 40:39-46 (1985); Murphy y colaboradores Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 83:8258-8262 (1986); Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,935,233, y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,751,180. La secuencia enlazadora en general puede ser de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Las secuencias enlazadoras no se requieren cuando el primero y segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales, que se pueden utilizar para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia estérica. Las secuencias de ADN ligadas se enlazan operativamente con los elementos reguladores de transcripción o de traducción adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión del ADN se localizan solamente a 5' para la secuencia de ADN que codifique los primeros polípéptidos. De una manera similar, los codones de paro requeridos para finalizar las señales de terminación de traducción y transcripción solamente están presentes a 3' para la secuencia de ADN que codifique el segundo polípéptído. Por lo tanto, las composiciones de acuerdo con la invención pueden comprender una o más proteínas de fusión. Estas proteínas comprenden un componente de polipéptido de la composición como se describe en la presente, junto con una proteína ¡nmunogénica no relacionada. La proteína ¡nmunogénica, por ejemplo, puede ser capaz de provocar una respuesta de recordatorio. Los ejemplos de estas proteínas incluyen las proteínas de tétanos, tuberculosis, y hepatitis (véase, por ejemplo, Stoute y colaboradores, New Engl. J. Med. 336:86-91 (1997)). Dentro de ciertas modalidades, un componente de fusión inmunológíco se deriva a partir de la proteína D, una proteína superficial de la bacteria gram-negativa Haemophilus influenza B (Publicación Internacional Número WO 91/18926). Un derivado de la proteína D puede comprender aproximadamente la primera tercera parte de la proteína (por ejemplo, los primeros 100-110 aminoácidos N-terminales), y un derivado de proteína D puede estar lipidado. Dentro de ciertas modalidades, los primeros 109 residuos de un componente de fusión de lipoproteína D se incluyen en el término N para proporcionar al polipéptido epítopos de células-T exógenos adicionales, y para aumentar el nivel de expresión en E. coli (funcionando de esta manera como un potencíador de expresión). La cola del lípido asegura la presentación óptima del antígeno ante las células presentadoras de antígeno. Otros componentes de fusión incluyen la proteína no estructural del virus de influenza, NS1 (hemaglutínina). Típicamente, se utilizan los 81 aminoácidos N-terminales, aunque se pueden utilizar diferentes fragmentos que incluyan a los epítopos auxiliares-T. En otra modalidad, el componente de fusión ¡nmunológico es la proteína conocida como LYTA, o una porción de la misma (de preferencia una porción C-terminal). LYTA se deriva a partir de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una amidasa de N-acetil-L-alanina conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gene 43:265-292 (1986)). LYTA es una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la estructura base del peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad con la colina o con algunos análogos de colina, tales como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. La purificación de las proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en el término amino ya se ha descrito (véase Biotechnology 10:795-798 (1992)). Dentro de una modalidad preferida, se puede incorporar una porción de repetición de LYTA en una proteína de fusión. Una porción de repetición se encuentra en la región C-terminal que empieza en el residuo 178. Una porción de repetición particularmente preferida incorpora los residuos 188-305. En general, los polipéptidos (incluyendo las proteínas de fusión) y los polinucleótidos descritos en la presente, se aislan. Un polipéptido o polinucleótido "aislado" es uno que se remueve de su medio ambiente original. Por ejemplo, una proteína que se presenta naturalmente se aisla sí se separa de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. De preferencia, estos polipéptidos son cuando menos aproximadamente el 90 por ciento puros, más preferiblemente cuando menos aproximadamente el 95 por ciento puros, y de una manera muy preferible cuando menos aproximadamente el 99 por ciento puros. Un polinucleótido se considera como aislado si, por ejemplo, se clona en un vector que no sea una parte del medio ambiente natural. CÉLULAS-T Las composiciones inmunoterapéuticas también, o alternativamente, pueden comprender células-T específicas para un antígeno de Chlamydia. Estas células se pueden preparar en general in vitro ó ex vivo, empleando procedimientos convencionales. Por ejemplo, las células-T se pueden aislar de médula ósea, sangre periférica, o una fracción de médula ósea o de sangre periférica de un paciente, utilizando un sistema de separación de células comercialmente disponible, tal como el Sistema lsolex R, disponible en Nexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA; véase también la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,240,856; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,215,926; la Publicación Internacional Número WO 89/06280; la Publicación Internacional Número WO 91/16116, y la Publicación Internacional Número WO 92/07243). De una manera alternativa, las células-T se pueden derivar a partir de seres humanos, mamíferos no humanos, líneas celulares, o cultivos relacionados o no relacionados. Las células-T se pueden estimular con un polipéptido de la invención, un polinucleótido que codifique este polipéptido, y/o una célula presentadora de antígeno (APC) que exprese este polipéptido. Este estímulo se puede llevar a cabo bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la generación de células-T que sean específicas para el polipéptido. De preferencia, el polipéptido o el polinucleótido está presente dentro de un vehículo de suministro, tal como una microesfera, para facilitar la generación de células-T específicas. Las células-T se consideran específicas para un polipéptido de la invención si las células-T proliferan específicamente, secretan citoquínas, o aniquilan células objetivo recubiertas con el polipéptido, o expresan un gen que codifique el polipéptído. La especificidad de las células-T se puede evaluar empleando cualquiera de una variedad de técnicas convencionales. Por ejemplo, dentro de un ensayo de liberación de cromo o un ensayo de proliferación, un índice de estímulo de más de dos veces de aumento en la lisis y/o en la proliferación, comparándose con los controles negativos, indica especificidad de las células-T. Estos ensayos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, como se describe en Cheng y colaboradores, Cáncer Res. 54:1065-1070 (1994). De una manera alternativa, la detección de la proliferación de las células-T se puede llevar a cabo mediante una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferación de células-T se puede detectar midiendo un mayor índice de síntesis de ADN (por ejemplo, mediante cultivos marcadores de impulsos de células-T con timidina tritiada, y midiendo la cantidad de timídina tritiada incorporada en el ADN). El contacto con un polipéptído de la invención (de 100 nanogramos/mililitro a 100 microgramos/mililitro, de preferencia de 200 nanogramos/mililitro a 25 microgramos/mílilitro) durante 3 a 7 días, debe dar como resultado cuando menos un incremento del doble en la proliferación de las células-T. El contacto como se describe anteriormente durante 2 a 3 horas, debe dar como resultado la activación de las células-T, medida utilizando ensayos de cítoquína convencionales, en donde un aumento del doble en el nivel de liberación de cítoquina (por ejemplo, TNF ó IFN-?) indica la activación de las células-T (véase Coligan y colaboradores, Current Protocols in Immunology, Volumen 1 (1998)). Las células-T que se han activado en respuesta a un polipéptido, polinucleótido, APC que exprese el polipéptido, pueden ser CD4+ y/o CD8 + . Las células-T específicas de proteína se pueden expandir utilizando técnicas convencionales. Dentro de las modalidades preferidas, las células-T se derivan a partir de un paciente, un donador relacionado, o un donador no relacionado, y se administran al paciente en seguida del estímulo o de la expansión. Para propósitos terapéuticos, las células-T CD4+ ó CD8+ que proliferen en respuesta a un polipéptido, polinucleótido, o APC, se pueden expandir en número, ya sea in vitro ó in vivo. La proliferación de estas células-T in vitro se puede llevar a cabo en una variedad de maneras. Por ejemplo, las células-T se pueden volver a exponer a un polipéptido, o a un péptido corto correspondiente a una porción ¡nmunogénica de este polipéptido, con o sin la adición de factores de crecimiento de células-T, tales como interleucina-2 y/o células estimulantes que sinteticen el polipéptido. De una manera alternativa, una o más células-T que proliferen en la presencia de la proteína se pueden expandir en número mediante clonación. Los métodos para la clonación de células son bien conocidos en la técnica, e incluyen la dilución limitante. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Antes de la infección de un individuo por Chlamydia, con frecuencia será detectable medíante ELISA. Los individuos que llevan anticuerpos específicos de Chlamydia ("seropositivos"), han sido infectados previamente. Sin embargo, no es extraño que los individuos que hayan sido infectados por Chlamydia previamente se encuentren como seronegativos en la prueba, es decir, pueden no detectarse anticuerpos específicos de Chlamydia. Como un resultado de la infección anterior, a pesar de la prueba seronegativa, estos individuos responden fuertemente al re-estímulo por antígenos de Chlamydia (en relación con los individuos seronegativos que no han sido infectados previamente), en particular a las diferentes combinaciones de antígenos de Chlamydia que se han descrito anteriormente en la presente. Por consiguiente, en un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para determinar la infección previa por Chlamydia en un individuo, el cual comprende: (i) obtener una muestra del individuo; (ii) poner en contacto esta muestra con una combinación de dos o más proteínas de Chlamydia o fragmentos ¡nmunogénicos de las mismas, o con un polinucleótido o polinucleótidos que las codifiquen, seleccionándose estas dos o más proteínas o fragmentos ¡nmunogénicos a partir de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, dominio pasajero de PmpG (PmpGpd), y dominio pasajero de PmpD (PmpDpd); (i¡¡) cuantificar la respuesta de la muestra. Por ejemplo, la muestra puede ser sangre entera o células purificadas. Adecuadamente, la muestra contendrá células mononucleadas de sangre periférica (PBMC). En una modalidad de la invención, el individuo será seropositivo. En una segunda modalidad de la invención, el individuo será seronegativo. La respuesta de la muestra se puede cuantificar mediante un rango de medios conocidos por los expertos en la materia, incluyendo el monitoreo de la proliferación de linfocitos, o la producción de citoquinas o anticuerpos específicos en la presencia de la combinación de los antígenos de Chlamydia. Por ejemplo, se puede utilizar el ELISPOT de células-T para monitorear las citoquinas, tales como interferón-gamma (IFN?), interleucina-2 (IL2), e interleucina-5 (IL5). El ELISPOT de células-B se puede utilizar para monitorear el estímulo de los antígenos específicos de Chlamydia. Los métodos para cuantificar la respuesta de la muestra se ilustran en los Ejemplos de la presente (específicamente en el Ejemplo 9). Cuando se emplea este método, se puede definir una respuesta positiva a un antígeno mediante una proporción de la señal al ruido (proporción S/N) de cuando menos 2:1 (por ejemplo, cuando 3:1 ). En un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan métodos para utilizar una o más de las combinaciones de antígenos (o fragmentos ¡nmunogénicos de los mismos, o nucleótídos que los codifican) descritos anteriormente para diagnosticar la infección previa por Chlamydia, utilizando una prueba de piel. Como se utiliza en la presente, una "prueba de piel" es cualquier ensayo que se lleve a cabo directamente en un paciente en donde se mide la reacción de hipersensibilidad de tipo demorado (DTH) (tal como hinchamiento, enrojecimiento, o dermatitis) en seguida de la inyección intradérmica de una combinación de antígeno (o fragmentos inmunogénicos del mismo, o nucleótidos que los codifiquen) como se describe anteriormente. Esta inyección se puede lograr utilizando cualquier dispositivo adecuado suficiente para poner en contacto las combinaciones de antígeno con las células dérmicas del paciente, tal como una jeringa de tuberculina o una jeringa de 1 mililitro. La reacción se mide después de un período de tiempo, por ejemplo cuando menos 48 horas después de la inyección, en especial de 48 a 72 horas. La reacción de hipersensibilidad de tipo demorado es una respuesta inmune mediada por células, que es mayor en los pacientes que se han expuesto previamente al antígeno de prueba. La respuesta se puede medir visualmente, utilizando una regla. En general, una respuesta que sea mayor de aproximadamente 0.5 centímetros de diámetro, en especial mayor de aproximadamente 1.0 centímetros de diámetro, es una respuesta positiva, que indica la infección previa por Chlamydia, que puede o no manifestarse como una enfermedad activa. Para utilizarse en una prueba de piel, las combinaciones de esta invención se formulan adecuadamente como composiciones farmacéuticas conteniendo un vehículo fisiológicamente aceptable. De una manera adecuada, el vehículo empleado en estas composiciones farmacéuticas es una solución salina con conservadores apropiados, tales como fenol y/o Tween 80 R. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS En las modalidades adicionales, la presente invención se refiere a la formulación de las composiciones de polinucleótídos, polipéptídos, células-T, y/o anticuerpos dadas a conocer en la presente, en soluciones farmacéuticamente aceptable o fisiológicamente aceptables para administrarse a una célula o a un animal, ya sea solas, o en combinación con una o más modalidades diferentes de terapia. Estas composiciones también son útiles para usos de diagnóstico. También se entenderá que, si se desea, los segmentos de ácidos nucleicos, ARN, ADN, o composiciones de PNA que expresen una composición de los polipéptídos como se dan a conocer en la presente, se pueden administrar en combinación con otros agentes también, tales como, por ejemplo, otras proteínas o polipéptidos, o diferentes agentes farmacéuticamente activos. De hecho, virtualmente no hay límite para otros componentes que también se pueden incluir, dado que los agentes adicionales no provocan un efecto adverso significativo después del contacto con las células objetivo o los tejidos del huésped. Las composiciones, por lo tanto, se pueden suministrar junto con otros diferentes agentes como sean requeridos en el caso particular. Estas composiciones se pueden purificar de las células huésped o de otras fuentes biológicas, o alternativamente se pueden sintetizar químicamente como se describe en la presente. De la misma manera, estas composiciones pueden comprender además composiciones de ARN ó ADN sustituidos o derivados. La formulación de excipientes farmacéuticamente aceptables y soluciones de vehículo es bien conocida por los expertos en la técnica, así como el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para utilizar las composiciones particulares descritas en la presente en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal, e intramuscular. Otras vías de administración incluyen por medio de las superficies mucosas, por ejemplo administración intravaginal. 1. Suministro Oral. En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente se pueden suministrar mediante administración oral a un animal. Como tales, estas composiciones se pueden formular con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o se pueden encerrar en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, o se pueden comprimir en tabletas, o se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta. Los compuestos activos inclusive se pueden incorporar con excipientes, y se pueden utilizar en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares (Mathiowitz y colaboradores, 1997; Hwang y colaboradores, 1998; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,641,515; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,580,579, y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,792,451, cada uno incorporado específicamente a la presente como referencia en su totalidad). Las tabletas, trociscos, pildoras, cápsulas, y similares, también pueden contener lo siguiente: se puede agregar un aglutinante, como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz, o gelatina; excipientes, tales como difosfato de calcio; un agente desintegrante, tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algíníco, y similares; un lubricante, tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante, tal como sacarosa, lactosa, o sacarina, o un agente saborizante, tal como menta, aceite de hierbabuena, o saborízante de cereza. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, en adición a los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Puede haber otros diferentes materiales presentes como recubrimientos o para modificar de otra manera la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, las tabletas, pildoras, o cápsulas se pueden recubrir con shellac, azúcar, o ambos. Un jarabe o elíxir puede contener el compuesto activo de sacarosa como un agente edulcorante, metil- y propil-parabenos como conservadores, un tinte y un saborizante, tales como sabor de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma unitaria de dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. En adición, los compuestos activos se pueden incorporar en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida. Típicamente, estas formulaciones pueden contener cuando menos aproximadamente el 0.1 por ciento del compuesto activo o más, aunque el porcentaje de los ingredientes activos, desde luego, se puede variar y puede ser convenientemente de entre aproximadamente el 1 ó el 2 por ciento y aproximadamente el 60 ó 70 por ciento o más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad de los compuestos activos en cada composición terapéuticamente útil se puede preparar de tal manera que se obtenga una dosificación adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Un experto en la técnica de la preparación de estas formulaciones farmacéuticas contemplará factores tales como la solubilidad, biodisponibilídad, vida media biológica, vía de administración, vida de anaquel del producto, así como otras consideraciones farmacológicas, y como tales, pueden ser deseables una variedad de dosificaciones y regímenes de tratamiento. Para la administración oral, las composiciones de la presente invención alternativamente se pueden incorporar con uno o más excipientes en la forma de un enjuague bucal, dentífrico, tableta bucal, aerosol oral, o formulación sublingual oralmente administrada. Por ejemplo, un enjuague bucal se puede preparar incorporando al ingrediente activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado, tal como una solución de borato de sodio (Solución de Dobell). De una manera alternativa, el ingrediente activo se puede incorporar en una solución oral, tal como una que contenga borato de sodio, glicerina, y bicarbonato de potasio, o se puede dispersar en un dentífrico, o se puede agregar en una cantidad terapéuticamente efectiva a una composición que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, agentes saborizantes, agentes espumantes, y humectantes. Alternativamente, las composiciones se pueden configurar en una forma de tableta o solución, que se puede colocar debajo de la lengua o se puede disolver de otra manera en la boca. 2. Suministro Inyectable. En ciertas circunstancias, será deseable suministrar las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, o inclusive intraperitonealmente, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,543,158; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,641,515, y en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,399,363 (cada una específicamente incorporada a la presente como referencia en su totalidad). Las soluciones de los compuestos activos como la base libre o como sales farmacéuticamente aceptables se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un tensoactivo, tal como hidroxi-propil-celulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para impedir el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,466,468, específicamente incorporada a la presente como referencia en su totalidad). En todos los casos, la forma debe ser estéril, y debe ser fluida hasta el grado en que exista un fácil paso por la jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe conservar contra la acción contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o un medio de dispersión conteniendo, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propílenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión, y mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede facilitar mediante diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares o cloruro de sodio. Se puede provocar una absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que demoren la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina. Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe regularse adecuadamente, si es necesario, y el díluyente líquido primero se hace isotónico con suficiente suero o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, e intraperitoneal. En conexión con esto, se puede emplear un medio acuoso estéril bien conocido por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación se puede disolver en 1 mililitro de una solución ¡sotónica de NaCI, y se agrega a 100 mililitros de fluidos de hipodermoclisis, o se inyecta en el sitio propuesto de infusión (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente se presentará alguna variación en la dosificación, dependiendo de la condición del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis adecuada para el sujeto individual. Más aún, para administración a seres humanos, la preparación debe satisfacer las normas de esterilidad, pirogenicidad, y de seguridad y pureza generales requeridas por la Oficina de Normas Biológicas de la FDA. Las soluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación de los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado, con otros diferentes ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización filtrada. En general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los diferentes ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y secado por congelación, que produzcan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo. Las composiciones dadas a conocer en la presente se pueden formular en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína), y las cuales se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o con ácidos orgánicos, tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar a partir de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férricos, y a partir de bases orgánicas como ¡sopropil-amina, trimetil-amina, histidina, procaína, y similares. Después de la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal como sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco, y similares. Como se utiliza en la presente, "vehículo" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y demoradores de absorción, reguladores del pH, soluciones portadoras, suspensiones, coloides, y similares. El uso de estos medios y agentes para las sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto hasta donde cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar ingredientes activos complementarios en las composiciones. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a las entidades moleculares y composiciones que no produzcan una reacción alérgica o similar indeseada cuando se administren a seres humanos. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como un ingrediente activo, es bien entendida en este campo. Típicamente, estas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, un líquido antes de su inyección. La preparación también se puede emulsionar. 3. Suministro Mucoso. (i) Suministro Nasal. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas se pueden suministrar mediante aerosoles intranasales, inhalación, y/u otros vehículos de suministro en aerosol. Los métodos para el suministro de genes, ácidos nucleicos, y composiciones peptídicas directamente a los pulmones medíante rocíos en aerosol nasal, ya se han descrito, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,756,353 y en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,804,212 (cada una específicamente incorporada a la presente como referencia en su totalidad). De la misma manera, el suministro de fármacos utilizando resinas de micropartículas intranasales (Takenaga y colaboradores, 1998) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,725,871, específicamente incorporada a la presente como referencia en su totalidad) es también bien conocido en la técnica farmacéutica. De la misma manera, el suministro transmucoso de fármacos en la forma de una matriz de soporte de poli-tetra-fluoro-etileno, se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,780,045 (específicamente incorporada a la presente como referencia en su totalidad). (ii) Suministro Intravaginal. En otras modalidades de la invención, las composiciones farmacéuticas se pueden formular para suministro intravaginal. Estas formulaciones se pueden preparar como líquidos, semi-sólidos, o sólidos (incluyendo, por ejemplo, cremas, ungüentos, geles, etc.), o pueden estar contenidas dentro de un sistema de suministro físico, tal como un pesarío, esponja, anillo vaginal, o película. (iii) Suministro Ocular. En las modalidades adicionales de la invención, las composiciones farmacéuticas se pueden formular para suministro ocular. Estas formulaciones deseablemente serán transparentes e incoloras. 4. Suministro Mediado por Liposomas, NamopartícuOas, y Micropartículas. En ciertas modalidades, los inventores contemplan el uso de liposomas, nanopartículas, micropartículas, microesferas, partículas de lípido, vesículas, y similares, para la introducción de las composiciones de la presente invención en células huésped adecuadas. En particular, las composiciones de la presente invención se pueden formular para suministrarse ya sea encapsuladas en una partícula de lípido, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, o una nanopartícula, o similares. Estas formulaciones se pueden preferir para la introducción de formulaciones farmacéuticamente aceptables de los ácidos nucleicos o de las construcciones dadas a conocer en la presente. La formación y uso de liposomas es en general conocida por los expertos en este campo (véase, por ejemplo, Couvreur y colaboradores, 1977; Couvreur, 1988; Lasic, 1998; que describe el uso de liposomas y nanopartículas en la terapia de antibióticos dirigidos para infecciones y enfermedades bacterianas intracelulares). Recientemente, se desarrollaron liposomas con una mejor estabilidad en suero y vida media en la circulación (Gabizon y Papahadjopoulos, 1988; Alien y Choun, 1987; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,741,516, específicamente incorporada a la presente como referencia en su totalidad). Además, se han revisado diferentes métodos de liposomas y preparaciones tipo liposomas como vehículos de fármacos potenciales (Takakura, 1998; Chandran y colaboradores, 1997; Margalit, 1995; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,567,434; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,552,157; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,565,213; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,738,868, y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,795,587, cada una incorporada específicamente a la presente como referencia en su totalidad). Los liposomas se han utilizado con éxito con un número de tipos de células que normalmente son resistentes a la transfección mediante otros procedimientos, incluyendo suspensiones de células-T, cultivos de hepatocitos primarios, y células PC 12 (Renneisen y colaboradores, 1990; Muller y colaboradores, 1990). En adición, los liposomas están libres de las limitaciones de la longitud del ADN, que son típicas de los sistemas de suministro basados en virus. Los liposomas se han utilizado efectivamente para introducir genes, fármacos (Heath y Martin, 1986; Heath y colaboradores, 1986; Balazsovits y colaboradores, 1989; Fresta y Puglisi, 1996), agentes radioterapéuticos (Pikul y colaboradores, 1987), enzimas (Imaízumi y colaboradores, 1990a; Imaizumi y colaboradores, 1990b), virus (Faller y Baltimore, 1984), factores de transcripción y efectores aloestéricos (Nícolau y Gersonde, 1979) en una variedad de líneas celulares cultivadas y animales. En adición, se han contemplado varios estudios clínicos de éxito que examinan la efectividad del suministro de fármacos mediado por liposomas (Lopez-Berestein y colaboradores, 1985a; 1985b; Coune, 1988; Soulier y colaboradores, 1988). Adicionalmente, varios estudios sugieren que el uso de liposomas no está asociado con las respuestas autoinmunes, la toxicidad, o la localización gonadal después del suministro sistémico (Morí y Fukatsu, 1992). Los liposomas se forman a partir de fosfolípídos, y se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de dos capas concéntricas multilamelares (también denominadas como vesículas multílamelares (MLVs)). Las vesículas multilamelares generalmente tienen diámetros de 25 nanómetros a 4 mieras. La sonicación de las vesículas multilamelares da como resultado la formación de pequeñas vesículas unílamelares (SUVs) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 A, conteniendo una solución acuosa en el núcleo. Los liposomas tienen parecido con las membranas celulares, y se contemplan para utilizarse en relación con la presente invención como vehículos para las composiciones peptídicas. Son ampliamente adecuados, debido a que se pueden atrapar sustancias tanto solubles en agua como solubles en lípido, es decir, en los espacios acuosos y dentro de la bicapa misma, respectivamente. Es posible que los liposomas que llevan fármacos se puedan incluso emplear para el suministro específico del sitio de los agentes activos medíante la modificación selectiva de la formulación liposomal. En adición a las enseñanzas de Couvreur y colaboradores (1977; 1988), se puede utilizar la siguiente información en la generación de las formulaciones liposomales. Los fosfolípidos pueden formar una variedad de estructuras diferentes de liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la proporción molar del lípido al agua. En bajas proporciones, el liposoma es la estructura preferida. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, de la concentración iónica, y de la presencia de cationes dívalentes. Los liposomas pueden mostrar una baja permeabilidad a las sustancias iónicas y polares, pero a temperaturas elevadas, sufren transición de fases que alteran notoriamente su permeabilidad. La transición de fases involucra un cambio desde una estructura ordenada estrechamente empacada, conocida como el estado de gel, hasta una estructura menos ordenada y flojamente empacada, conocida como el estado fluido. Esto ocurre a una temperatura de transición de fase característica, y da como resultado un aumento en la permeabilidad a los iones, azúcares, y fármacos. En adición a la temperatura, la exposición a proteínas puede alterar la permeabilidad de los liposomas. Ciertas proteínas solubles, tales como el citocromo C, se enlazan, deforman, y penetran en la bicapa, provocando de esta manera cambios en la permeabilidad. El colesterol inhibe esta penetración de proteínas, aparentemente por el empaque de los fosfolípidos más estrechamente. Se contempla que las formaciones de liposomas más útiles para el suministro de antibióticos e inhibidores, contendrán colesterol.

La capacidad para atrapar solutos varía entre diferentes tipos de liposomas. Por ejemplo, las vesículas multilamelares son moderadamente eficientes para atrapar solutos, pero las vesículas unilamelares son extremadamente ineficientes. Las vesículas unílamelares ofrecen la ventaja de la homogeneidad y reproducibilidad en la distribución de tamaños; sin embargo, se ofrece un compromiso entre el tamaño y la eficiencia de atrape por las vesículas unilamelares grandes (LUVs). Éstas se preparan mediante evaporación de éter, y son de 3 a 4 veces más eficientes en el atrape del soluto que las vesículas multilamelares. En adición a las características de los liposomas, un determinante importante en el atrape de los compuestos es el de las propiedades fisicoquímicas del compuesto mismo. Los compuestos polares se atrapan en los espacios acuosos, y los compuestos no polares se enlazan con la bicapa de lípido de la vesícula. Los compuestos polares se liberan a través de la permeación, o cuando se rompe la bicapa, pero los compuestos no polares permanecen afiliados con la bicapa, a menos que se altere por la temperatura o la exposición a lipoproteínas. Ambos tipos muestran máximas velocidades de eflujo a la temperatura de transición de fases. Los liposomas interactúan con las células por medio de cuatro mecanismos diferentes: endocitosis por las células fagocítícas del sistema reticuloendotelial, tales como macrófagos y neutrófilos; adsorción a la superficie celular, ya sea mediante las fuerzas hídrofóbicas débiles o electrostáticas no específicas, o mediante interacciones específicas con los componentes de superficie celular; fusión con la membrana celular del plasma mediante inserción de la bicapa de lípído del liposoma en la membrana de plasma, con liberación simultánea del contenido líposomal hacia el citoplasma; y medíante transferencia de los lípidos liposomales a las membranas celulares o subcelulares, o viceversa, sin asociación alguna del contenido del liposoma. Con frecuencia es difícil determinar cuál mecanismo es operativo, y más de uno pueden operar al mismo tiempo. El destino y la disposición de los liposomas intravenosamente inyectados dependen de sus propiedades físicas, tales como tamaño, fluidez, y carga superficial. Pueden persistir en los tejidos durante horas o días, dependiendo de su composición, y las vidas medías en la sangre están en el intervalo desde minutos hasta varias horas. Los liposomas más grandes, tales como las vesículas multilamelares y las vesículas unílamelares grandes, son rápidamente absorbidas por las células fagocíticas del sistema reticuloendotelial, pero la fisiología del sistema circulatorio restringe la salida de estas especies grandes en la mayoría de los sitios. Pueden salir solamente en lugares en donde existan aberturas grandes o poros en el endotelio capilar, tales como los sinusoides del hígado o del bazo. Por consiguiente, estos órganos son el sitio predominante de absorción. Por otra parte, las vesículas unilamelares muestran una distribución de tejido más amplia, pero todavía son secuestradas altamente en el hígado y en el bazo. En general, este comportamiento in vivo limita la dirección potencial de los liposomas hacia solamente estos órganos y tejidos accesibles para su gran tamaño. Éstos incluyen la sangre, hígado, bazo, médula ósea, y órganos linfoides. La dirección en general no es una limitación en términos de la presente invención. Sin embargo, si se desea una dirección específica, existen métodos disponibles para que se lleve a cabo esto. Se pueden utilizar anticuerpos para enlazarse con la superficie del liposoma, y para dirigir el anticuerpo y su contenido de fármaco hacia receptores antigénicos específicos localizados sobre la superficie de tipo célula particular. También se pueden utilizar determinantes de carbohidratos (componentes de superficie celular de glicoproteína o glicol ípido que tienen un papel en el reconocimiento, interacción, y adhesión de célula-célula) como sitios de reconocimiento, debido a que tienen potencial para dirigir los liposomas hacia tipos de células particulares. En su mayor parte, se contempla que se podría emplear la inyección intravenosa de preparaciones liposomales, pero también son concebibles otras vías de administración. De una manera alternativa, la invención proporciona formulaciones de nanocápsulas farmacéuticamente aceptables de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas pueden atrapar en general a los compuestos de una manera estable y reproducible ((Henry-Michelland y colaboradores, 1987; Quintanar-Guerrero y colaboradores, 1998; Douglas y colaboradores, 1987).

Para evitar los efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, estas partículas ultrafinas (de un tamaño de alrededor de 0.1 mieras) se deben diseñar utilizando polímeros capaces de ser degradados in vivo. Se contemplan las nanopartículas de cianoacrilato de polialquilo biodegradables que satisfagan estos requerimientos para utilizarse en la presente invención. Estas partículas se pueden hacer fácilmente, como se describe (Couvreur y colaboradores, 1980; 1988; zur Muhlen y colaboradores, 1998; Zambaux y colaboradores, 1998; Pinto-Alphandry y colaboradores, 1995, y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,145,684, específicamente incorporada a la presente como referencia en su totalidad). VACUNAS En ciertas modalidades preferidas de la presente invención se proporcionan vacunas. Las vacunas generalmente comprenden una o más composiciones farmacéuticas, tales como las mencionadas anteriormente, en combinación con un inmunoestimulante. Un inmunoestímulante puede ser cualquier sustancia que aumente o potencie una respuesta inmune (incluyendo mediada por anticuerpo y/o célula) a un antígeno exógeno. Los ejemplos de inmunoestimulantes incluyen adyuvantes, microesferas biodegradables (por ejemplo, galactida poliláctica) y líposomas (en los cuales se incorpora el compuesto; véase por ejemplo, Fullerton, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,235,877). La preparación de las vacunas en general se describe en, por ejemplo, Powell y Newman, eds., Vaccine Design (The Subunit and Adjuvant Approach) (1995). Las composiciones farmacéuticas y las vacunas dentro del alcance de la presente invención también pueden contener otros compuestos, que pueden ser biológicamente activos o inactivos. Por ejemplo, una o más porciones inmunogénicas de otros antígenos de tumor pueden estar presentes, ya sea incorporadas en un polipéptido de fusión o como un compuesto separado, dentro de la composición o vacuna. Las vacunas ilustrativas pueden contener ADN que codifique dos o más de los polipéptidos como se describe anteriormente, de manera que los polipéptidos se generan en el sitio. Como se hace notar anteriormente, el ADN puede estar presente dentro de cualquiera de una variedad de sistemas de administración conocidos para los expertos en la técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácido nucleico, sistemas de expresión de bacterias y de virus. Son muy conocidas en el campo numerosas técnicas de administración de genes, tales como las descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198 (1998), y en las referencias citadas en el mismo. Los sistemas de expresión de ácido nucleico apropiados contienen la secuencias de ADN necesarias para la expresión en el paciente (tales como un promotor y una señal de terminación convenientes). Los sistemas de administración bacteriana incluyen la administración de una bacteria (tal como Bacillus-Calmette-Guerrin) que expresa una porción ¡nmunogénica de polipéptido en su superficie celular o secreta un epítopo. En una modalidad preferida, el ADN puede ser introducido usando un sistema de expresión viral (por ejemplo, vacuna u otro poxvirus, retrovirus o adenovirus), el cual puede incluir el uso de un virus competente en réplica no patógeno (defectuoso). Se describen sistemas convenientes, por ejemplo, en Fisher-Hoch y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86: 317-321 (1989); Flexner y colaboradores, Ann. N.Y. Acad. Sci. 569: 86-103 (1989); Flexner y colaboradores, Vaccine 8: 17-21 (1990); Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,603,112, 4,769,330 y 5,017,487; Publicación Internacional Número WO 89/01973; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,777,127; Patente Británica Número GB 2,200,651; Patente Europea Número EP 0,345,242; Publicación Internacional Número WO 91/02805; Bekner, Biotechniques 6: 616-627 (1988); Rosenfeld y colaboradores, Science 252: 431-434 (1991); Kolls y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91: 215-219 (1994); Kass-Eísler y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 11498-11502 (1993); Guzman y colaboradores, Circulation 88: 2838-2848 (1993); y Guzman y colaboradores, Cir. Res. 73: 1202-1207 (1993). Las técnicas para incorporar ADN en estos sistemas de expresión son muy conocidas por los expertos en la técnica. El ADN también puede ser "desnudo", como se describe, por ejemplo, en Ulmer y colaboradores, Science 259:1745-1749 (1993) y revisado por Cohén, Science 259:1691-1692 (1993). La absorción de ADN desnudo se puede incrementar recubriendo el ADN sobre perlas biodegradables, las cuales se transportan eficientemente hacia las células. Será aparente que una vacuna puede comprender tanto un polinucleótido como un componente de polipéptido. Estas vacunas pueden proporcionar una respuesta inmune aumentada. Será aparente que una vacuna puede contener sales farmacéuticamente aceptables de los polinucleótidos y los polipéptidos proporcionados en la presente. Estas sales se pueden preparar a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, incluyendo bases orgánicas (por ejemplo, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias y aminoácidos básicos) y bases inorgánicas (por ejemplo, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y de magnesio). Aunque se puede emplear cualquier vehículo conveniente conocido por los expertos en la técnica en las composiciones de vacuna de esta invención, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración. Las composiciones de la presente invención se pueden formular para cualquier manera de administración apropiada, incluyendo por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral, tal como para la inyección subcutánea, el vehículo de preferencia comprende agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un regulador. Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. También se pueden emplear microesferas biodegradables (por ejemplo, poliglicolato de polilactato) como vehículos para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Las microesferas biodegradables convenientes se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344 y 5,942,252. También se puede emplear un vehículo que comprenda los complejos de partículas-proteínas descritos en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,928,647, que son capaces de inducir las respuestas de linfocitos T citotóxicos restringidos clase I en un huésped. Estas composiciones también pueden comprender reguladores (por ejemplo, solución salina regulada neutra o solución salina regulada de fosfato), carbohidratos (por ejemplo, glucosa, mañosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostatos, agentes quelantes, tales como EDTA o glutationa, adyuvantes (por ejemplo, hidróxído de aluminio), solutos que vuelven la formulación isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservadores. De manera alternativa, las composiciones de la presente invención se pueden formular como un liofilizado. Los compuestos también se pueden encapsular dentro de liposomas usando tecnología muy conocida. Cualquiera entre una variedad de inmunoestimulantes se puede emplear en las vacunas de esta invención, por ejemplo, se puede incluir un adyuvante. La mayoría de los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger al antígeno del catabolismo rápido tal como el hidróxido de aluminio o el aceite mineral y un estimulante de las respuestas inmunes, tal como el lípido A, Bortadella pertussis o Microbacterium species o proteínas derivadas de Microbacterium. Por ejemplo, se puede usar M. vaccae, deslipidada, desglicolipidada ("pVac"). En otra modalidad, se usa BCG como un adyuvante. Además, la vacuna se puede administrar a un sujeto previamente expuesto a la BCG. Los adyuvantes convenientes están disponibles comercialmente como, por ejemplo, el adyuvante incompleto de Freund y el adyuvante completo de Freund (Difco, Laboratories, Detroit, Ml); Adyuvante 65 de Merck (Merck and Company Inc., Rahway, NJ); CWS, TDM, Leif, sales de aluminio tales como el gel de hidróxido de aluminio (alum) o el fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o zinc; una suspensión insoluble de tirosína acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivados catiónícamente o aniónicamente; polifosfazenos; microesferas biodegradables; monofosforilo-lípido A y quil A. También se pueden usar como adyuvantes las citoquinas, tales como GM-CSF o interleucina-2, -7, ó -12. Dentro de las vacunas proporcionadas en la presente, la composición adyuvante se puede diseñar para inducir una respuesta inmune predominantemente del tipo Th1. Los niveles altos de las citoquinas tipo Th1 (por ejemplo, IFN-?, TNFa, I L-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células a un antígeno administrado. En cambio, altos niveles de citoquinas tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmunes humorales. Después de la aplicación de una vacuna como se dispone en la presente, un paciente soportará una respuesta inmune que incluye respuestas tipo Th1 y Th2. Dentro de una modalidad, en la cual una respuesta es predominantemente del tipo Th1, el nivel de citoquinas tipo Th1 aumentará mucho más que el nivel de las citoquinas tipo Th2. Los niveles de estas citoquinas se pueden valorar fácilmente usando ensayos normales. Para una revisión de las familias de citoquínas véase Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173 (1989). Los adyuvantes convenientes para su uso para provocar una respuesta predominantemente del tipo Th1, incluyen, por ejemplo una combinación de monofosforilo-lípído A, por ejemplo monofosforilo-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), junto con una sal de aluminio. Los adyuvantes MPL están disponibles en Corixa Corporation (Seattie, WA; véanse las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 y 4,912,094). Los olinonucleótidos que contienen CpG (en los cuales el nucleótído CpG es no metilado) también inducen una respuesta predominantemente Th1. Estos olingonucleótidos son muy conocidos y se describen, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO 96/02555, la Publicación Internacional Número WO 99/33488 y en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,008,200 y 5,856,462. También se describen secuencias de ADN inmunoestimulantes, por ejemplo, por Sato y colaboradores, Science 273:352 (1996). Otro adyuvante conveniente comprende una saponina, tal como Quil A, o derivados de la misma, incluyendo QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc. Framingham, MA); Escina; Digitonina; o saponinas Gypsophila o Chenopodium quinoa. Otras formulaciones convenientes incluyen más de una saponina en las combinaciones de adyuvantes en la presente invención, por ejemplo, combinaciones de cuando menos dos del siguiente grupo que comprenden QS21, QS7, Quil A, ß-escina, o digitonina. De manera alternativa las formulaciones de saponina se pueden combinar con vehículos de vacuna compuestos de quitosano u otros polímeros policatiónicos, partículas de poliláctidos y poliláctido-co-glicólidos, matriz de polímero basado en poli-N-acetil-glucosamina, partículas compuestas de polisacáridos o polisacáridos modificados químicamente, liposomas y partículas basadas en lípidos, partículas compuestas de monoésteres de glicerol, etcétera. Las saponinas también se pueden formular en la presencia de colesterol para formar estructuras en partículas tales como liposomas o ISCOMs. Aún más, las saponinas se pueden formular junto con un éter o éster polioxietilénico, en una solución o suspensión no en partículas, o en una estructura en partículas tal como un liposoma paucilamelar o ISCOM. Las saponinas también se pueden formular con excipientes tales como Carbopol® para aumentar la viscosidad, o se pueden formular en forma de polvo seco con un excipiente en polvo tal como lactosa. En una modalidad, el sistema adyuvante incluye la combinación de un monofosforilo-lípido A y un derivado de saponina, tal como la combinación del adyuvante QS21 y 3D-MPL®, como se describe en la Publicación Internacional Número WO 94/00153 o una combinación menos reactogénica en donde el QS21 se amortigua con liposomas que contienen colesterol, como se describe en la Publicación Internacional Número WO 96/33739. Otras formulaciones convenientes comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Otra formulación de adyuvante conveniente que emplea el adyuvante QS21, 3D-MPL® y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en la Publicación Internacional Número WO 95/17210. Otro sistema de adyuvante aumentado incluye la combinación de un oligonucleótido que contiene CpG y un derivado de saponina, particularmente la combinación de CpG y QS21 como se describe en la Publicación Internacional Número WO 00/09159. De preferencia la formulación adícionalmente comprende una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Otros adyuvantes convenientes incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), la serie de adyuvantes SBAS (SmithKIíne Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) y otros glucosaminida-4-fosfatos aminoalquílicos (AGPs) tales como los descritos en las solicitudes pendientes de Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica con Números de Serie 08/853,826 y 09/074,720, cuyas inscripciones se incorporan a la presente como referencia por entero, y adyuvantes de éter de polioxietileno tales como los descritos en la Publicación Internacional Número WO 99/52549A1. Otros adyuvantes convenientes incluyen moléculas adyuvantes de la fórmula general (I): HO(CH2 CH2 O)n -A-R Donde n es de 1 a 50, A es un enlace ó -C(O)-, R es alquilo con de 1 a 50 átomos de carbono o fenil-alquilo de 1 a 50 átomos de carbono. Otro adyuvante de interés es la cadena de toxina b shiga, usada por ejemplo como se describe en la Publicación Internacional Número WO 2005/112991. Una modalidad de la presente invención consiste en una formulación de vacunas que comprende un éter de polioxiletileno de la fórmula general (I), en donde n está entre 1 y 50, preferiblemente entre 4 y 24, más preferiblemente 9; el componente R es alquilo con de 1 a 50 átomos de carbono, de preferencia alquilo con de 4 a 20 átomos de carbono y todavía más preferiblemente alquilo con 12 átomos de carbono, y A es un enlace. La concentración de los éteres de polioxietileno deberá estar en un intervalo entre el 0.1 y el 20 por ciento, de preferencia entre el 0.1 y el 10 por ciento, y todavía más preferiblemente en el intervalo del 0.1 al 1 por ciento. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan a partir del siguiente grupo: 9-lauril-éter de políoxietileno, 9-estearoil-éter de polioxietileno, 8-estearoil-éter de polioxietileno, 4-lauril-éter de polioxietileno, 35-lauril-éter de polioxietileno, y 23-lau ril-éter de polioxietileno. Los éteres de polioxietileno, tales como el lauril-éter de polioxíetileno se describen en Merck Index (12a edición: entrada 7717). Estas moléculas adyuvantes se describen en la Publicación Internacional Número WO 99/52549. Cualquier vacuna proporcionada en la presente se puede preparar usando métodos muy conocidos que den como resultado una combinación de antígeno, un potenciador de la respuesta inmune y un vehículo o excipiente conveniente. Las composiciones descritas en la presente se pueden administrar como parte de una formulación de liberación sostenida, es decir, una formulación como una cápsula, esponja o gel (compuesta de polísacárídos, por ejemplo) que efectúe una liberación lenta del compuesto después de la administración. Estas formulaciones generalmente se preparan usando tecnología muy conocida (véase, por ejemplo, Coombes y colaboradores, Vaccine 14: 1429-1438 (1996) y se administran mediante, por ejemplo, administración oral, rectal o implantación subcutánea, o mediante implantación en el sitio objetivo deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo disperso en una matriz portadora y/o contenido dentro de un recipiente rodeado por una membrana que controle la velocidad. Los vehículos para su uso en estas formulaciones son biocompatibles y pueden también ser biodegradables; de preferencia la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del componente activo. Estos vehículos incluyen micropartículas de poli-(láctido-co-glicólido), poliacrilato, látex, almidón, celulosa, dextrano y similares. Otros vehículos de liberación retardada incluyen biovectores supramoleculares, los cuales comprenden un núcleo hidrofílíco no líquido (por ejemplo, un polisacárido u oligosacárido reticulado) y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfifílico, tal como un fosfolípido (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,151,254 y las solicitudes de Patentes Internacionales Números WO 94/20078, WO 94/23701, y WO 96/06638). La cantidad de compuesto activo contenido dentro de una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación, de la velocidad y de la duración esperada de liberación y de la naturaleza de la condición que se vaya a tratar o a prevenir.

Se puede emplear cualquiera de una variedad de vehículos de administración dentro de las composiciones farmacéuticas y vacunas para facilitar la producción de una respuesta inmune específica al antígeno que se dirige a las células tumorales. Los vehículos de administración incluyen células presentadoras de antígenos (APCs), tales como células dendríticas, macrófagos, células C, monocitos y otras células que se pueden diseñar genéticamente para que sean APCs eficientes. Estas células se pueden modificar, pero no necesariamente, genéticamente, para aumentar la capacidad de presentar el antígeno, para mejorar la activación y/o el mantenimiento de la respuesta de las células T, para tener efectos antitumorales por sí mismas y/o para ser inmunológicamente compatibles con el receptor (es decir, haplotipo HLA coincidente). Las células presentadoras de antígenos generalmente se pueden aislar a partir de cualquiera de una variedad de fluidos y órganos biológicos, incluyendo tumores y tejidos peritumorales, y pueden ser células autónomas, alogénicas, singénicas o xenogénicas. Ciertas modalidades de la presente invención usan células dendrítícas o progenitoras de las mismas como las células presentadoras de antígenos. Las células dendríticas son células presentadoras de antígenos, muy potentes (Banchereau y Steinman, Nature 392: 245-251 (1998) y se ha demostrado que son efectivas como adyuvantes fisiológicos para provocar inmunidad antitumoral profiláctica o terapéutica (véase Tímmerman y Levy, Ann. Rev. Med. 50: 507-529 (1999). En general, las células dendríticas se pueden identificar basándose en su forma típica (stellate en el sitio, con procesos citoplásmicos marcados (dendritas) visibles in vitro. La capacidad de absorber, procesar y presentar antígenos con alta eficiencia y su capacidad para activar respuestas de células T naturales. Las células dendríticas, desde luego se pueden diseñar genéticamente para expresar receptores de superficie celular específicos o ligandos que no se encuentran comúnmente sobre las células dendríticas in vivo o ex vivo, y estas células dendríticas modificadas son consideradas por la presente invención. Como una alternativa a las células dendríticas, las células dendríticas cargadas de antígeno de vesículas secretadas (llamadas exosomas) se pueden usar dentro de una vacuna (véase Zitvogel y colaboradores, Nature Med. 4: 594-600 (1998). Las células dendríticas y las progenitoras se pueden obtener de sangre periférica, médula ósea, células que infiltran tumores, células que infiltran tejidos peritumorales, ganglios linfáticos, el bazo, la piel, sangre del cordón umbilical o cualquier otro tejido o fluido conveniente. Por ejemplo, se pueden diferenciar las células dendríticas ex vivo añadiendo una combinación de citoquinas tales como GM-CSF, IL-4, IL-13 y/o TNFa, a cultivos de monocitos cosechados de la sangre periférica. Alternativamente, las células positivas para CD34 cosechadas de la sangre periférica, de la sangre del cordón umbilical o de la médula ósea, se pueden diferenciar en células dendríticas añadiendo al medio de cultivo combinaciones de GM-CSF, IL-3, TNFa, ligando CD40, LPS, ligando flt3 y/u otros compuestos que induzcan la diferenciación, maduración y proliferación de las células dendrítícas. Las células dendríticas se categorizan convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", lo cual permite una manera simple de discriminar entre dos fenotipos muy bien caracterizados. Sin embargo, esta nomenclatura no deberá considerarse que excluya todas las etapas intermedias posibles de diferenciación. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan como células presentadoras de antígeno con una gran capacidad para la absorción de antígeno y su procesamiento, lo cual se correlaciona con la alta expresión del receptor Fcy y el receptor de mañosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una expresión más baja de estos marcadores, pero una alta expresión de las moléculas de la superficie celular responsables de la activación de las células T tales como las MHC clase I y clase II, las moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y las moléculas coestimulantes (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1BB). Las células presentadoras de antígeno generalmente se pueden transfectar con polinucleótidos que codifiquen una proteína (o porción u otra variante de la misma) tal como el polipéptido, o una porción ¡nmunogénica del mismo se expresa sobre la superficie celular. Esta transfección se puede llevar a cabo ex vivo, y se puede usar entonces una composición o vacuna que comprenda estas células transfectadas para propósitos terapéuticos, como se describe en la presente. De una manera alternativa, se puede administrar a un paciente un vehículo de administración de genes que se dirija a una célula dendrítica u otra célula presentadora de antígeno, dando como resultado la transfección que se presenta in vivo. La transfección in vivo y ex vivo de las células dendríticas, por ejemplo, en general se puede realizar usando cualquier método conocido en la técnica, tales como los descritos en la Publicación Internacional Número WO 97/24447, o en el enfoque de pistola de genes descrito por Mahvi y colaboradores, Immunology and Cell Biology 75:456-460 (1997). La carga de antígenos de las células dendríticas se puede lograr incubando células dendríticas o células progenitores con el polipéptido, ADN (desnudo o dentro de un vector de plásmído) o ARN; o con bacterias o virus recombinantes que expresen antígeno (por ejemplo, vacuna, viruela de aves, adenovirus o vectores lentivirus). Antes de cargarse, el polípéptído se puede conjugar covalentemente a un compañero inmunológico que proporcione auxiliares de células T (por ejemplo, una molécula portadora). De una manera alternativa, una célula dendrítíca puede ser impulsada por un compañero ¡nmunológico no conjugado, por separado o en la presencia del polipéptido. Se pueden presentar las vacunas y las composiciones farmacéuticas en dosis unitarias o en recipientes de dosis múltiples, tales como ampolletas o frascos sellados. Estos recipientes de preferencia se sellan herméticamente para conservar la esterilidad de la formulación hasta su uso. En general, las formulaciones se pueden almacenar como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos. De una manera alternativa, se puede almacenar una vacuna o una composición farmacéutica en una condición secada por congelación, requiriendo solamente de la adición de un portador líquido estéril inmediatamente antes de su uso. KITS DE DIAGNOSTICO La presente invención también proporciona kits para su uso dentro de cualquiera de los métodos de diagnóstico anteriores. Estos kits típicamente comprenden dos o más componentes necesarios para realizar una prueba de diagnóstico. Los componentes pueden ser compuestos, reactivos, recipientes y/o equipo. Por ejemplo, un recipiente dentro de un kit puede contener un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que específicamente se enlace a una proteína. Estos anticuerpos o fragmentos se pueden proporcionar unidos a un material de soporte, como se describe anteriormente. Uno o más recipientes adicionales pueden contener elementos, tales como reactivos o reguladores, para usarse en la prueba. Estos kits pueden contener también o alternativamente, un reactivo de detección como se describe anteriormente, que contenga un grupo reportero conveniente para la detección directa o indirecta del enlace de anticuerpos. De una manera alternativa, se puede diseñar un kit para detectar el nivel de ARNm que codifique una proteína en una muestra biológica. Estos kits generalmente comprenden cuando menos una sonda o cebador de olígonucleótido como se describe anteriormente, que se hibrida a un polinucleótído que codifique una proteína. Un olígonucleótido así se puede usar, por ejemplo, dentro de una reacción en cadena de la polimerasa o una prueba de hibridación. Los componentes adicionales que pueden estar presentes dentro de estos kits incluyen un segundo oligonucleótido y/o un reactivo de diagnóstico o recipiente para facilitar la detección de un polinucleótido que codifique una proteína de la invención. Otros kits de diagnóstico incluyen los diseñados para la detección de respuestas mediadas por células (las cuales, por ejemplo, se pueden usar en los métodos de diagnóstico de la presente invención). Estos kits típicamente comprenden: (i) un aparato para obtener una muestra celular adecuada a partir de un sujeto. (ii) elementos para estimular esa muestra de células con una combinación de antígenos de Chlamydia de acuerdo con la presente invención (o fragmentos inmunogénicos de los mismos o ADN que codifique antígenos o fragmentos). (iii) elementos para detectar o cuantificar la respuesta celular al estímulo. Los elementos convenientes para cuantificar la respuesta celular incluyen un kit ELISPOT de células B o de manera alternativa un kit ELISPOT de células T, los cuales son conocidos para los expertos en la técnica. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes citadas en esta memoria descriptiva se incorporan a la presente como referencia, como si cada publicación individual o solicitud de patente se indicara específicamente y de manera individual como incorporada mediante referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, fácilmente será aparente para un experto que, a la luz de las enseñanzas de esta invención, se pueden hacer a la misma ciertos cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan a manera de ilustración solamente y no a manera de limitación. Los expertos en la técnica fácilmente reconocerán una variedad de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse para producir finalmente los mismos resultados. Ejemplo 1: Expresión y purificación de proteínas recombinantes de Chlamydia trachomatis Se clonaron genes de Chlamydia trachomatis en plásmido que incorpora una marca de histidina 6X en el término N para permitir la expresión y la purificación de proteína recombinante. Se expresaron dos proteínas recombinantes de longitud completa, Ct-622 y Ct-875 en E. coli. Ambos de estos genes se identificaron usando análisis de expresión de CtL2 y CtE y se expresaron los homólogos del serotipo E. Los cebadores usados para amplificar estos genes se basaron en secuencias de serotipos L2/E. Los genes se amplificaron usando ADN genómico del serotipo E como la plantilla. En cuanto se amplificaron, se clonaron los fragmentos en pET-17b con una marca His-6X N-termínal. Después de transformar el plásmido recombinante en células azules XL-I, se preparó el ADN y se secuenciaron completamente los clones. El ADN se transformó en el huésped de expresión BL21-pLysS (Novagen) para la producción de proteínas recombinantes. Las proteínas se indujeron con IPTG y se modificaron y purificaron en agarosa Ni-NTA usando métodos convencionales. Las secuencias de ADN para CTE622 y CTE875 se describen en las SEQ ID NOs: 9 y 7, respectivamente y sus secuencias de aminoácidos se describen en las SEQ ID NOs: 10 y 8, respectivamente. Una proteína recombinante de longitud completa, Ct-089, se expresó en E. coli. El gen se identificó usando análisis de expresión de CtL2, pero se expresó el homólogo del serotipo E. Los cebadores usados para amplificar este gen se basaron en la secuencia del serotipo L2. El gen se amplificó usando el ADN genómico del serotipo E como la plantilla. En cuanto se amplificó, el fragmento se clonó en pET-17b con una marca His-6X N-terminal. Después de transformar el plásmido recombinante en células azules XL-I, se preparó el ADN y se secuenció completamente el clon. El ADN se transformó entonces en las células huésped de expresión de BL21-pLysS (Novagen) para la producción de proteínas recombinantes. La proteína se indujo con IPTG y se purificó en agarosa Ni-NTA usando métodos convencionales. Se expresó una proteína recombinante de longitud completa Ct-460 en E. coli. El gen se identificó usando análisis de expresión de CtL2 y CTE, pero se expresó el homólogo del serotipo L2. Los cebadores usados para amplificar este gen se basaron en la secuencia del serotipo L2. Los genes se amplificaron usando el ADN genómico del serotipo L2 como la plantilla. En cuanto se amplificó, el fragmento se clonó en pET-17b con una marca 6X-His N-terminal. Después de transformar el plásmido recombinante en células azules XL-I, se preparó el ADN y se secuenció completamente el clon. El ADN se transformó entonces en las células huésped de expresión de BL21-pLysE (Novagen) para la producción de las proteínas recombinantes. La proteína se indujo con IPTG y se purificó en agarosa Ni-NTA usando métodos convencionales. Una proteína recombinante de longitud completa, Ct-858 se expresó en E. coli. El gen se identificó usando análisis de expresión de CtL2 y CTE, pero se expresó el homólogo del serotípo E. Los cebadores usados para amplificar este gen se basaron en la secuencia del serotipo L2/E. Los genes se amplificaron usando el ADN genómico del serotipo E como la plantilla. En cuanto se amplificó, el fragmento se clonó en pCRX2 con una marca 6X-His N-terminal. Después de transformar el plásmido recombinante en células azules XL-I, se preparó el ADN y se secuenció completamente el clon. El ADN se transformó entonces en las células de expresión Turner DE3 (Novagen) para la producción de proteínas recombinantes. La proteína se indujo con IPTG y se purificó en agarosa Ni-NTA usando métodos convencionales. Se expresó una proteína recombinante de longitud completa, Ct-681, en E. coli. El gen se identificó usando análisis de expresión de CtL2 y CTE, pero se expresó el homólogo del serotipo F. Se obtuvo la construcción del clon/pET-15 a partir de GSK (MompF). En cuanto se amplificó el fragmento se clonó en pET-15b con una marca 6X-His N-terminal. Después de transformar el plásmido recombinante en células azules XL-I, se preparó el ADN y se secuencíó completamente el clon. El ADN se transformó en las células huésped de expresión BL21-pLysS para la producción de las proteínas recombinantes. La proteína se indujo con IPTG y se purificó en agarosa Ni-NTA usando métodos convencionales. El dominio pasajero de dos proteínas recombinantes, Ct-812 y Ct-871, se expresó en E.coli. La Ct-812 se identificó usando análisis de expresión de CtL2 y CtE, y la Ct-871 se identificó usando análisis de expresión de CtE. Para ambos genes se expresaron los homólogos del serotípo L2. Los cebadores usados para amplificar estos genes se basaron en secuencias del serotipo L2. Los genes se amplificaron usando ADN genómico del serotípo L2 como la plantilla. En cuanto se amplificaron, los fragmentos se clonaron en pET-17b con una marca 6X-His N-termínal. Después de transformar el plásmido recombinante en células azules XL-I, se preparó el ADN y los clones se secuenciaron completamente. El ADN se transformó en las células huésped de expresión BL21-pLysS (Novagen) para la producción de proteínas recombinantes. Las proteínas se indujeron con IPTG y se purificaron en agarosa Ni-NTA usando métodos convencionales. Ejemplo 2: Formulación de diferentes combinaciones de antígenos de Chlamydia trachomatis con adyuvaníe. Las combinaciones de antígenos de la siguiente Tabla se prepararon como sigue. 5 microgramos de cada antígeno se combinaron en 50 microlitros de suero regulado con fosfato, y luego se mezclaron con 50 microlitros de adyuvante AS01B el cual comprende 3D-MPL y QS21 formulados con liposomas que contienen colesterol, a un volumen total por dosis de 100 microlitros. Después de mezclar con el antígeno la composición final del adyuvante es: 3D-MPL 100 µg/ml OS21 100 µg/ml DOPC 2 mg/ml Colesterol 0.5 mg/ml Ejemplo 3: Prueba de combinaciones de antígenos de Chlamydia trachomatis en un modelo de ratón - inmunización contra la infección de las vías genitales por Chlamydia Este ejemplo demuestra que la vacunación con combinaciones de antígenos de Chlamydia como se describe en el Ejemplo 2 puede proteger significativamente contra la infección por Chlamydia en los ratones. Se desarrolló un modelo de infección de vías genitales de murino con la cepa del serotipo K de Chlamydia trachomatis (Ct) que se parece mucho a la patología de infección en humanos. Este modelo se usó para evaluar la efectividad de inmunizar ratones con diferentes combinaciones de antígenos específicos de Ct para diferentes serotipos. Específicamente, se vacunaron ratones Balb/c y C57BI/6 con formulaciones de combinaciones de adyuvantes como se describe en el Ejemplo 2. Este modelo también se intentó con una tercera raza de ratón, DBA, pero este modelo no permitió la protección contra el estímulo de Ct que se demostraba ya sea en el control positivo (cuerpos elementales de Chlamydia irradiados con ultravioleta (UVEB) formulado en AS01B) o bien en ratones vacunados con combinaciones de antígenos. Se administraron dos inyecciones, separadas por un intervalo de tiempo de tres semanas, a los ratones en la base de la cola. Cuatro semanas después de la vacunación final, los animales fueron tratados con 1.25 miligramos de progesterona antes de ser infectados intravaginalmente con 5 x 105 unidades que forman inclusión (IFU) del serotipo K de Chlamydia trachomatis. Los ratones se inmunizaron con 10 microgramos de UVEB formulado en AS01B como un control positivo, y el adyuvante AS01B solo como el control negativo. Siete días después de la infección, se tomaron muestras de las vías genitales inferiores para determinar los valores de dispersión bacteriana determinando las IFU usando las células de McCoy. En algunos experimentos los ratones se sacrificaron en el día 10 después de la infección y se determinó la carga bacteriana en las vías genitales superiores homogenizando el UGT y determinando las IFU usando células de McCoy. Como se muestra en las Figuras 1 y 2, la vacunación de los ratones con las combinaciones 1, 11, 2, 3, 4, 5, 51, o 6, muestra el resultado sorprendente de ofrecer una protección significativa (p<0.01-p<0.001 ) contra la infección por Chlamydia en un modelo de ratón Balb/c. Además, como se muestra en las Figuras 2 y 5, los resultados de la protección se confirman en un segundo modelo de protección de ratón, C57BI/6, vacunado con las combinaciones 1,11, 5 y 51 y estimulados con el serotipo K. (p < 0.001 prueba de comparación múltiple de Dunnet). Para un mejor análisis estadístico, el día 7 se reunieron los datos de dispersión de tres experimentos en ratones Balb/c (Figural). La dispersión media bacteriana en los grupos inmunizados por UVEB se redujo en 1.8 log en comparación con la media del grupo de control AS01B. La dispersión media bacteriana en los grupos inmunizados por UVEB fue significativamente menor en comparación con todos los otros grupos probados (pruebas i de dos colas, p < 0.05). Todas las combinaciones de antígeno redujeron significativamente la media de dispersión bacteriana en aproximadamente 1 log (0.8-1.1) en comparación con el grupo de control AS01B (p < 0.01; prueba de comparación múltiple de Dunnett). El análisis estadístico no detectó ninguna diferencia en la protección inducida por las 6 combinaciones de antígenos (Tukey y prueba-t). De este modo, las inmunizaciones de ratones Balb/c con las combinaciones de antígenos probadas inducen una protección significativa contra la dispersión bacteriana en el modelo de agresión vaginal con el serotipo K. Enseguida, iniciamos un conjunto de experimentos de confirmación respaldo con respaldo en ratones Balb/c y C57BI/6 comparando las combinaciones 1 y 5 de las dos versiones modificadas de la combinación 1 y 5, la combinación 51 (añadiendo PmpD-pd a la combinación 5), y la combinación 11 (sacando MompF de la combinación 1). Grupos de 8 ratones Balb/c y C57BI/6 tratados con progesterona fueron agredidos con una dosis intravaginal de 5 x 105 IFU del serotipo K, 4 semanas después de la segunda inmunización. Los datos para los experimentos en los ratones Balb/c se muestran en la Figura 2. La dispersión bacteriana se determinó a partir de muestras frotadas tomadas el día 7 después de la agresión con Chlamydia. Los ratones se sacrificaron el día 10 para determinar la carga de Chlamydia en el UGT. Los datos de estos experimentos se han reunido para el análisis estadístico (Figura 2). La inmunización con UVEB protegió a 12 de cada 16 ratones completamente contra la dispersión bacteriana en las vías genitales inferiores (7 días después de la agresión) y no se detectó Chlamydia en el UGT de 11 de los 16 ratones en el día 10 después de la agresión. Las medias de ambas, la dispersión bacteriana en el LGT y la carga bacteriana en el UGT se redujeron cuando menos un log en los ratones inmunizados con la combinación 1 o con la combinación 5 en comparación con el control de solo AS01B. La modificación (aumento o reducción en el número de antígenos) de la composición de la combinación 1 y la combinación 5 (combinación 1' y combinación 5') no mejoró la protección. Hubo diferencias estadísticamente significativas entre las medias de la dispersión bacteriana de todos los grupos en comparación con la media del grupo de control AS01B usando la prueba de comparación múltiple de Dunnet con los siguientes valores de p: AS01B vs. UVEB p<0.001 AS01B vs. Combinación 5 p<0.001 AS01B vs. Combinación 5 p<0.001 AS01 B vs. Combinación 1 p<0.001 ASO1B vs. Combinación 1' p<0.05 Como en los anteriores experimentos de confirmación en ratones Balb/c, el análisis estadístico no ha permitido distinguir entre las combinaciones de antígenos. El análisis estadístico de la carga bacteriana en el UGT determinó que solamente la medía del grupo inmunizado con UVEB fue significativamente inferior a la media del grupo de control con AS01B. La dispersión bacteriana para los experimentos de respaldo con respaldo con las combinaciones 1 y 5 en los ratones C57BI/6 se muestran en la Figura 3. Los datos de los experimentos respaldo con respaldo se agruparon para su análisis estadístico. Los experimentos siguieron el protocolo de los Balb/c. La dispersión bacteriana se determinó a partir de cotonetes de absorción tomados en el día 7 después del estímulo con Chlamydia. La inmunización con la combinación de antígenos 1, 1', 5 y 5' indujo una protección significativa contra la dispersión por 1 a 2 logs, respectivamente (p < 0.001; prueba de comparación múltiple de Dunnet). El análisis estadístico no determinó ningún significado estadístico entre las medias de dispersión bacteriana de los ratones inmunizados con las combinaciones. Para un análisis estadístico final, se agruparon los datos de los cinco experimentos de confirmación en los ratones Balb/c (31 ratones por grupo) y tres experimentos de confirmación en ratones C57B1/6 (21 ratones por grupo) y se muestran en las Figuras 4 y 5. Los experimentos de confirmación demostraron que las combinaciones seleccionadas 1 y 5 inducen una protección significativa contra la dispersión bacteriana tanto en ratones Balb/c (p<0.001) como en ratones C57BI/6 (p<0.001). Los datos confirman que las combinaciones de antígenos identificadas en el experimento de diseño experimental en los ratones Balb/c también inducen la protección en los ratones C57BI/6. Los datos también muestran que las inmunizaciones con estas combinaciones, así como las inmunizaciones con UVEB, inducen niveles de protección más altos en los ratones C57BI/6 que en los ratones Balb/c. Ejemplo 4 - Comparaciones de secuencias de Ct 089, Ct-858 y Ct-875 Método La Chlamydia trachomatis serotipo E es un serotipo óculo-genital común y se eligió como una base con la cual se compararían las demás secuencias. Se llevó a cabo una alineación múltiple de secuencias de aminoácidos para su comparación usando el programa CLUSTAL W, disponible en el paquete de software Lasergene, versión 5.0 (vendido por DNASTAR, Inc., Madison, Wl)). El algoritmo de alineación múltiple básico incluye un procedimiento de tres pasos: todos los pares de secuencias se alinean por separado con el fin de calcular una matriz de distancia que da la divergencia de cada par de secuencias, luego se calcula un árbol guía a partir de la matriz de distancia, y finalmente se alinean las secuencias progresivamente de acuerdo con el árbol guía. El algoritmo CLUSTAL W se describe en Thompson y colaboradores, Nuc. Acids Res. 22: 4673-4680 (1994).

Las alineaciones se muestran en las Figuras 6, 7a/7b y 8a/8b. Los epítopos de las células auxiliares T son péptidos enlazados a las moléculas HLA de clase II y reconocidos por las células auxiliares T. La predicción de epítopos de células auxiliares T supuestas, presentes en los polipéptídos de Chlamydia trachomatis CT089, CT858 y CT875 del serotipo E, se basó en el método TEPITOPE descrito por Sturniolo y colaboradores, Nature Biotech. 17: 555-561 (1999). Los péptidos que comprenden epítopos de células T potencíales, buenos, se resaltan (cuadros grises) en las Figuras 6, 7a/7b y 8a/8b.

Resultados La Figura 9 muestra los resultados de la comparación de las secuencias de Ct-089. La Figura 10 muestra los resultados de la comparación de las secuencias de Ct-858. La Figura 11 muestra los resultados de la comparación de las secuencias de Ct-875. La Ct-089 de la Chlamydia trachomatis serotipo E muestra un alto nivel de identidad de secuencia con la Ct-089 de la Chlamydia trachomatis serotipos A, B, D, G, H, I, J, K y L2. El nivel mínimo de identidad fue del 97.4 por ciento, teniendo ocho de los 10 serotipos una identidad de cuando menos el 98 por ciento. Los serotipos oculares A y B muestran en particular alta identidad con el serotipo E, con valores del 99.5 por ciento y 99.8 por ciento, respectivamente.

La Ct-858 de Chlamydia trachomatis serotipo E muestra un alto nivel de identidad de secuencia con la Ct-858 de la Chlamydia trachomatis serotipos A, B, D, G, H, I, J, K y L2. El nivel mínimo de identidad fue del 99.7 por ciento, mostrando una completa identidad el serotipo ocular J y LGV serotipo L2. La Ct-875 de la Chlamydia trachomatis serotipo E muestra un alto nivel de identidad de secuencia con la Ct-089 de la Chlamydia trachomatis serotipos A, B, D, G, H, I, J, K y L2. El nivel mínimo de identidad fue del 94.9 por ciento, teniendo ocho de los 10 serotipos una identidad de cuando menos 98 por ciento. Para cada una de las tres proteínas Ct-089, Ct-858 y Ct-875, el porcentaje de epítopos predichos de HLA DRB1 (para el serotipo E) que se conservan completamente a través de todos los serotipos probados es muy alto y se estima en el 77 por ciento, el 95 por ciento y el 80 por ciento, respectivamente. Para fines comparativos, las Figuras 12, 13 y 14 muestran la alineación de secuencias para Ct-089, Ct-858 y Ct-875 del serotipo E, respectivamente, con sus equivalentes de otros serotipos de Chlamydia trachomatis y otras especies de Chlamydia. Cpn indica la secuencia correspondiente de Chlamydia pneumoniae, MoPn indica la secuencia correspondiente de Chlamydia muridarum.

Ct-089 (Serotipo E) identidad de aminoácidos Ct-858 (Serotipo E) identidad de aminoácidos Ct-875 (Serotipo E) identidad de aminoácidos Conclusión En resumen, cada una de las tres proteínas Ct-089, Ct-858 y Ct-875 tiene secuencias muy conservadas a través de las serotipos de Chlamydia trachomatis probadas. Además, los datos indican que no hay relación entre el grado de variación de secuencias y el estado de la enfermedad asociada con un serotipo particular. Por ejemplo, en el caso de Ct-089, el serotipo E óculo-genital muestra la mayor homología con los serotipos oculares A y B, mientras que en el caso de la Ct-858, el serotipo E muestra la mayor homología con el serotipo J óculo-genital y LGB serotipo L2. La homología de secuencias de las Ct-089, Ct-858 y Ct-875 con las proteínas equivalentes en otras especies de Chlamydia es relativamente baja. Las propiedades antigénicas de las Ct-089, Ct-858 y Ct-875 ya se han descrito en la técnica anterior. Sin embargo, contrariamente a lo que esperaría un experto en este campo, como resultado de la baja variación de secuencias, las vacunas que contienen Ct-089, Ct-858 y Ct-875, los fragmentos ¡nmunogénicos de las mismas o los polinucleótidos que las codifican, y las cuales se derivan de un cebador de serotipo de Chlamydia trachomatis, se puede esperar que sean útiles en el tratamiento o la prevención de la infección por Chlamydia por un segundo serotipo de Chlamydia trachomatis. Ejemplo 5 - Purificación de cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis a partir de los serotipos D, E, J y K. Se requirieron cuerpos elementales purificados para la estimulación de los sujetos de prueba de vacunas y para la preparación de cuerpos elementales irradiados con ultravioleta (UVEB) los cuales se usan como una vacuna de control positivo en ejemplos posteriores. Método Se prepararon cuerpos elementales (EB) de los serotipos de Chlamydia trachomatis. En resumen, todos los serotipos se sembraron por separado en monocapas celulares McCoy confluentes y se cultivaron en un medio RPMI (matraces de cultivo de 75 centímetros cuadrados) que se complementó con 1 microgramo/mílilitro de cicloheximida inmediatamente antes de la inoculación. Los matraces se inocularon con lisados no purificados de células infectadas que contenían de aproximadamente 106 a 107 Unidades que Forman Infecciosos en Sacarosa/Fosfato/Ácido Glutámico (SPG). Los matraces se centrifugaron a 2000 revoluciones por minuto durante 1 hora en una centrífuga de cultivo de células de mesa y luego se incubaron durante 48 o 72 horas a 37°C en una atmósfera de CO2. Este proceso se repitió hasta que había cuando menos 20 matraces de poblaciones celulares muy infectadas (>80 por ciento de las células infectadas) listas para su purificación. Los cuerpos elementales de Chlamydia se purificaron mediante ultracentrifugación sobre una serie de gradientes Hypaque (30 por ciento, 52 por ciento, 44 por ciento y 40 por ciento) con lavados de intervención en SPG. Resultados La titulación de cuerpos elementales purificados de cada serotipo de Chlamydia trachomatis se valoró usando la prueba de inefectividad de titulación de Chlamydia y microscopio de inmunofluorescencia (usando anticuerpo anti-C. trachomatis FITC-conjugado y Azul de Evan en suero regulado con fosfato) para calcular el número de Unidades IFU por mililitro. Las titulaciones para los cuerpos elementales purificados resultantes se encontró que varían entre 1.2 x 1 O6 a 2.6 x 109 I F U/mil i I itro Ejemplo 6 - Expresión y purificación de Das proteínas Ct-089, Ct-858 y Ct-875 Para preparar las vacunas de prueba, se prepararon caldos de Chlamydia trachomatis serotipo E para su uso en ejemplos posteriores de las proteínas Ct-089, Ct-858 y Ct-875 expresando sus genes en E. coli. Método Las cepas competentes de E. co/BaL21 plys E, Tuner (DE3) y BL21 plys S se transformaron con los plásmidos de expresión Ct-089, Ct-858 y Ct-875 respectivamente, y se sembraron en el medio de selección de antibiótico apropiado. Los clones de expresión resultantes se usaron en un protocolo de mini-inducción, y las proteínas resultantes se analizaron mediante SDS-PAGE. Si las células crecieron bien durante este proceso y las proteínas fueron inducidas por isopropil-beta-D-tiogalactopíranosida (IPTG) en cantidades suficientes para ser detectadas sobre geles de SDS manchados con azul Coomassíe, los clones se usaron en un experimento de inducción a gran escala (IPTG, 1mM). Después de la lísis de las células en una solución de CHAPS y centrifugación, se analizaron alícuotas del soluble y las fracciones aglomeradas mediante SDS-PAGE para determinar si la mayoría de la proteína de interés estaba en la fracción en granulo o soluble. La fracción que contenía la mayoría de cada antígeno se sometió a purificación en columna de Ni-NTA (después de la solubilización apropiada de las proteínas). Se analizaron alícuotas de las preparaciones, incluyendo el material de antes del enlace con Ni-NTA, flujo por la columna, lavados en columna, fracciones de elución en columna, mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contenían la proteína eluida se combinaron, se díalizaron contra TrislOmM, pH de 8 ó pH de 10, se esterilizaron filtrando, y se concentraron. Se usó el ensayo de proteína BCA sobre las fracciones de proteína CT concentradas, y se valoró la pureza mediante SDS-PAGE. Ejemplo 7 - Evaluación de la protección inducida por una vacuna que contiene Ct-089, Ct-858 y Ct-875 de Chlamydia trachomatis serotipo E, contra ia agresión con Chlamydia trachomatis serotipos D, K y J. Se probó la protección proporcionada por una vacuna que contiene antígenos Ct-089, Ct-858 y Ct-875 de Chlamydia trachomatis serotipo E en experimentos de estimulación vaginal con cuerpos elementales de serotipos de Chlamydia trachomatis heterólogos. Método El estudio se llevó a cabo con 63 ratones hembras C57BI/6 de seis semanas de edad. Estos ratones se dividieron en tres grupos de veintiún ratones cada grupo para ser agredidos por un serotipo diferente (Chlamydia trachomatis serotipo D, K. o J). Los grupos se separaron entonces en subgrupos de siete ratones cada uno. Estos tres subgrupos se inmunizaron intramuscularmente con 50 microlítros de diferentes preparaciones de vacunas inyectadas en cada tibia anterior (100 microlitros en total), y se repitió tres semanas después.

Los ratones se trataron además con progesterona, 1.25 miligramos dados en un volumen de 100 microlitros mediante inyección subcutánea diez y tres días antes de la agresión, para sincronizar sus ciclos. Las tres preparaciones de prueba fueron: (i) Adyuvante de control (AS01B) El adyuvante utilizado se basó en una formulación liposomal que contenía 3D-MPL, QS21 y colesterol. La composición final de la solución del adyuvante fue: 3D-MPL 100 microgramos/mililitro QS21 100 microgramos/mililitro DOPC 2 miligramos/mililitro Colesterol 0.5 miligramo/mililitro La solución salina regulada con fosfato se preparó a partir de 9 mM de Na2HPO4, 48 mM de KH2PO4 y 100 mM de NaCI a un pH de 6.1. Se preparó una mezcla de lípido, colesterol y 3D-MPL en solvente orgánico, y esto se secó luego al vacío. Se añadió entonces suero regulado con fosfato, y el recipiente se agitó hasta que se formó una suspensión. Esta suspensión se microfluidizó hasta que se obtuvo el tamaño de un liposoma de alrededor de 100 nanómetros (que se conoce como pequeñas vesículas unilamelares o SUV). Posteriormente, las SUV se esterilizaron pasándolas a través de un filtro de 0.2 mieras. Las SUV estériles se mezclaron con la cantidad apropiada de QS21 acuoso (a una concentración de 2 miligramos/mililitro) con la adición de solución salina regulada con fosfato para obtener las concentraciones finales deseadas. El pH se ajustó entonces a 6.1 (+/- 0.1) conforme fue necesario usando hidróxido de sodio o ácido clorhídrico. (ii) Cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis atenuados con ultravioleta con adyuvante AS01B. Una preparación que contenía 10 microgramos de cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis tratados con ultravioleta (UVEB) del serotipo E con adyuvante (como se describe anteriormente). (iii) Ct-089, Ct-858 y Ct-875 con adyuvante AS01B. Una preparación que contiene Ct-089 (5 microgramos), Ct-858 (5 microgramos) y Ct-875 (5 microgramos) de Chlamydia trachomatis serotipo E con adyuvante (como se describe anteriormente). Los ratones fueron agredidos, bajo anestesia (1:1 Ketaject y Xylaject), cuatro semanas después del refuerzo final con 1 x 106 IFU de serotipo D, K o J suspendido en 20 microlitros de sacarosa/fosfato/ ácido glutámico (SPG). Se dejó continuar la infección durante 10 días, tomando cotonetes de absorción genitales bajo anestesia el Día 4 y el Día 7. Los ratones fueron sacrificados el Día 10 y se cosecharon las trompas uterinas para histopatología y titulación. Para la titulación, se homogenizó la mitad del UGT, y se determinaron las IFU usando células de McCoy. Las muestras (cotonetes de absorción vaginales) recolectadas en los días 4, 7 y 10 después del estímulo fueron descongeladas a 37°C. Se agregó una pequeña cantidad de perlas de vidrio (Sigma) a cada muestra, y se centrifugaron durante cinco minutos en 1 mililitro de SPG. Se inocularon 100 microlitros de cada muestra sobre una monocapa de células de McCoy en un medio que contenía 1 mícrogramo/mililitro de ciclohexamida en una charola de 24 pozos. Las charolas se centrifugaron a 2000 revoluciones por minuto durante una hora antes de ser transferidas a una incubadora a 37°C. El tiempo de incubación es de 48-72 horas antes de la fijación. Después de la incubación, el metanol que había sido previamente enfriado a -20°C se usó para fijar las células. Cada pozo se llenó con metanol y se dejó a -20°C durante al menos 10 minutos. Las charolas se lavaron tres veces con suero regulado con fosfato, antes de mancharlas con anticuerpo policlonal FITC-conjugado anti-Chlamydia trachomatis de cabra (Chemicon) La solución de manchado consistió en Mancha Azul de Evan (Sigma), anticuerpo anti-C. trachomatis FITC-conjugado, y suero regulado con fosfato. La mancha Azul de Evan se diluyó a 1:200 en suero regulado con fosfato, y el anticuerpo anti-C. trachomatis FITC-conjugado se diluyó a 1:100. Se añadieron 500 microlítros de la solución de manchado a cada pozo. Las charolas se incubaron entonces a 37°C durante 1.5 a 2 horas. Después del periodo de incubación, la mancha se aspiró y las charolas se lavaron con suero regulado con fosfato cinco veces sobre una plataforma basculante, cada vez durante cuando menos 5 minutos. Después del lavado final, se añadió 1 mililitro de suero regulado con fosfato a cada pozo, y las placas quedaron listas para la titulación. Estos fueron tres métodos usados para calcular el número de IFU por cotonete de absorción. La manera primaria consistió en contar 10 campos al azar bajo el microscopio de fluorescencia y luego usar las siguientes fórmulas: n x 10 x 190 (usando el lente con objetivo 10 X) n x 10 x 283 (usando el lente con objetivo 20X) n x 10 x 1180 (usando el lente con objetivo 40X) en donde n = medía de los cuerpos de inclusión contados en 10 campos al azar, 10 es el factor de dilución, y 190, 283 y 1180 son los factores respectivos de conversión focal. Se usó el siguiente método cuando se vieron bajos números de cuerpos de inclusión en un pozo entero: s x 10 en donde s = número de cuerpos de inclusión contados en un pozo y 10 es el factor de dilución. Finalmente, cuando no se veían cuerpos de inclusión, se eligió un valor arbitrario de 7 para representar IFU/cotonete de absorción. Esto se basa en el supuesto de que aunque no se detectaron cuerpos de inclusión en una décima del cotonete de absorción, eso no necesariamente significa que no hubo cuerpos de inclusión en el cotonete de absorción entero. Resultados Las Figuras 15 a 17 ilustran los resultados del Ejemplo 7. La Figura 15 indica que cuatro días después del estímulo, los ratones inmunizados con Ct-089, Ct-858 y Ct-875 de acuerdo con la presente invención muestran niveles inferiores de dispersión en comparación con el control de adyuvante. Además, los niveles de dispersión generalmente son comparables a los logrados con inmunización por UVEB (se alcanzan niveles menores en el caso de estímulo con el serotipo K, y mayores niveles en el caso del estímulo con el serotipo D). Siete días después del estímulo, los ratones que reciben el control de adyuvante muestran niveles más altos de dispersión que los inmunizados con UVEB o con Ct-089, Ct-858 y Ct-875 (véase la Figura 16). Tanto los ratones inmunizados con UVEB como con Ct-089, Ct-858 y Ct-875 muestran niveles muy bajos de dispersión. La Figura 17 muestra que diez días después del estímulo el tracto genital superior de los ratones que reciben el control adyuvante está altamente colonizado por bacterias. Tanto los ratones inmunizados con UVEB como con Ct-089, Ct-858 y Ct-875 muestran niveles muy bajos de colonización del tracto genital superior; con el tratamiento de acuerdo con la invención generalmente muestran un nivel ligeramente inferior al tratamiento con UVEB. El análisis estadístico índica que el tratamiento usando los antígenos Ct-089, Ct-0858 y Ct-875 de Chlamydia trachomatis serotipo E da como resultado una protección significativa en los ratones agredidos con Chlamydia trachomatis serotipo J, en comparación con el control negativo (sólo adyuvante) con p < 0.01 por la prueba de comparación múltiple de Dunnett. No se ve diferencia significativa alguna entre el tratamiento con antígenos y el tratamiento con UVEB (p>0.05). El tratamiento usando los antígenos Ct-089, Ct-858 y Ct-875 de Chlamydia trachomatis serotipo E da como resultado una protección significativa en los ratones agredidos con Chlamydia trachomatis serotipo D en el Día 4 y el Día 7 en comparación con el control negativo (sólo adyuvante) con p < 0.05. No se ve diferencia significativa alguna entre el tratamiento con antígenos y el tratamiento con UVEB (p>0.05). El tratamiento usando los antígenos Ct-089, Ct-858 y Ct-875 de Chlamydia trachomatis serotípo E da como resultado una protección significativa en los ratones estimulados con Chlamydia trachomatis serotipo K en el Día 4 y el Día 10 en comparación con el control negativo (sólo adyuvante) con p < 0.05. No se ve diferencia significativa alguna entre el tratamiento con antígenos y el tratamiento con UVEB (p>0.05). Conclusiones Los experimentos realizados en el Ejemplo 7 confirman que la combinación de las tres proteínas, Ct-089, Ct-858 y Ct-875 de Chlamydia trachomatis serotípo E es capaz de provocar una respuesta protectora sustancial, la cual se ha demostrado que es estadísticamente significativa. Esta respuesta protectora es la que puede proporcionar protección general contra el estímulo de otros serotipos. En particular, deberá observarse que los serotipos E y K son los serotipos genéticamente más diversos de Chlamydia trachomatis y la protección cruzada observada entre estos dos serotipos de Chlamydia trachomatis sugiere que se puede esperar que una combinación de los antígenos Ct-089, Ct-858 y Ct-875 tenga amplío uso en el tratamiento o prevención de infección por Chlamydia. El nivel de protección presentado por la formulación de vacuna que contiene Ct-089, Ct-858 y Ct-875 se encuentra que es comparable al uso de UVEB, aunque claramente el uso de proteínas purificadas es deseable en vista del riesgo aunado al uso de cuerpos elementales enteros. Ejemplo 8 - Evaluación de la protección inducida por una vacuna que contiene Ct-089, Ct-858 y Ct-875 de Chlamydia trachomatis serotipo E contra la agresión con Dos serotipos K y J, en la raza de ratones altamente susceptibles C3M/HeN La protección proporcionada por una vacuna que contiene antígenos Ct-089, Ct-858 y Ct-875 de serotípo E se probó en experimentos de estimulación vaginal con cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis serotipos K y J heterólogos (es decir que no son serotípo E). Método El estudio se llevó a cabo con 41 ratones hembras C3H/HeN de quince semanas de edad, una raza conocida por su susceptibilidad a la infección por Chlamydia. Estos ratones se separaron en dos grupos, uno de los cuales fue agredido por Chlamydia trachomatis serotipo K y el otro por el serotipo J. Los grupos se separaron adicionalmente en tres subgrupos, y estos subgrupos fueron inmunizados intramuscularmente con 50 microlitros de diferentes preparaciones de vacunas inyectadas en cada tibia anterior (100 microlitros en total), y se repitió cuatro semanas después. Cada subgrupo contenía siete ratones, salvo por el grupo inmunizado con control de adyuvante y agredido con el serotipo K, que contenía 6 ratones. Los ratones se trataron adicionalmente con progesterona, 1.25 miligramos dados en un volumen de 100 microlitros mediante inyección subcutánea diez y tres días antes del estímulo para sincronizar sus cíelos. Las preparaciones de prueba fueron: (i) Adyuvante de control (AS01B) El adyuvante utilizado se basó en una formulación liposomal que contenía 3D-MPL, QS 21 y colesterol. La composición final de la solución adyuvante fue: 3D-MPL 100 microgramos/mililítro QS21 100 microgramos/mililitro DOPC 2 miligramos/mililitro Colesterol 0.5 miligramos/mililitro El adyuvante se preparó como se describe anteriormente en el Ejemplo 7. (ii) Cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis atenuados con ultravioleta con adyuvante AS01B. Una preparación que contenía 10 microgramos de cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis tratados con ultravioleta (UVEB) del serotipo E con adyuvante (como se describe anteriormente). (iíi) Ct-089, Ct-858 y Ct-875 con adyuvante AS01B. Una preparación que contiene Ct-089 (5 microgramos), Ct-858 (5 microgramos) y Ct-875 (5 microgramos) de Chlamydia trachomatis serotipo E con adyuvante (como se describe anteriormente). Los ratones fueron estimulados, bajo anestesia (1:1 Ketaject y Xylaject, 30 microlitros por ratón IP, 20 microlitros en cada muslo), cuatro semanas después del refuerzo final con 1 x 106 IFU de serotípo K o J suspendido en 20 microlitros de sacarosa/fosfato/ácido glutámico (SPG). Se dejó continuar la infección durante 10 días, tomando cotonetes de absorción genitales bajo anestesia el Día 4 y el Día 7. Los ratones fueron sacrificados el Día 10 y se cosecharon las tromps uterinas para histopatología y titulación. Para la titulación, se homogenizó la mitad del tracto genital superior, y se determinaron las IFU usando células de McCoy como se describe en el Ejemplo 7.

El límite de detección para la titulación es de 10 IFU, esto es, una inclusión por pozo se gráfica como 10 IFU. Se asignó un número arbitrario de 7 IFU donde el número de inclusiones observadas fue menor a 1. Resultados Las Figuras 18 a 20 ilustran los resultados del Ejemplo 8. La Figura 18 indica que cuatro días después del estímulo ya sea con Chlamydia trachomatis serotipo K o J, los ratones inmunizados con Ct-089, Ct-858 y Ct-875 de Chlamydia trachomatis serotípo E muestran niveles inferiores de dispersión en comparación con el control de adyuvante. Además, los niveles de dispersión son comparables a los logrados con inmunización por UVEB. Siete días después de la agresión, los ratones que reciben el control de adyuvante muestran niveles más altos de dispersión que los inmunizados con UVEB o con Ct-089, Ct-858 y Ct-875 (véase la Figura 19). Tanto los ratones inmunizados con UVEB como con Ct-089, Ct-858 y Ct-875 muestran niveles muy bajos de dispersión.

La Figura 20 muestra que diez días después de la agresión ya sea con Chlamydia trachomatis serotípo K o J, el tracto genital superior de los ratones que reciben el control de adyuvante es altamente colonizado por bacterias. Tanto los ratones inmunizados con UVEB como con Ct-089, Ct-858 y Ct-875 muestran niveles bajos de colonización del tracto genital superior. El análisis estadístico indica que el tratamiento usando los antígenos Ct-089, Ct-858 y Ct-875 de Chlamydia trachomatis serotípo E da como resultado una protección significativa en los ratones estimulados con Chlamydia trachomatis serotípo J, en comparación con el control negativo (sólo adyuvante) con p < 0.01. No se ve diferencia significativa alguna entre el tratamiento con antígenos y el tratamiento con UVEB (p>0.05). El tratamiento usando los antígenos Ct-089, Ct-858 y Ct-875 de Chlamydia trachomatis serotipo E da como resultado una protección significativa en los ratones estimulados con Chlamydia trachomatis serotipo K en el Día 7 y el Día 10 en comparación con el control negativo (sólo adyuvante) con p < 0.05 y p < 0.01 respectivamente. No se ve diferencia significativa alguna entre el tratamiento con antígenos y el tratamiento con UVEB (p>0.05). Conclusiones Los experimentos realizados en el Ejemplo 8 confirman que las tres proteínas, Ct-089, Ct-858 y Ct-875 de Chlamydia trachomatis serotipo E son capaces de provocar una respuesta inmune protectora sustancial, la cual se ha demostrado que es estadísticamente significativa. La protección provocada es la que proporciona protección general contra el estímulo de otros serotipos. El nivel de protección presentado por la formulación de vacuna que contiene Ct-089, Ct-858 y Ct-875 se encuentra que es comparable al uso de UVEB, aunque claramente el uso de proteínas purificadas es deseable en vista del riesgo inherente en el uso de cuerpos elementales enteros. Ejemplo 9 - Respuesta de individuos seropositivos a Da agresión por antígenos de Chlamydia Se examinó la respuesta de sujetos seroposítívos a varios antígenos de Chlamydia para investigar cuáles antígenos de Chlamydia trachomatis pueden ser de particular importancia en la respuesta inmune normal de los seres humanos a la infección por Chlamydia trachomatis. Método Tres grupos de sujetos de diferentes lugares participaron en el estudio: (i) 25 mujeres embarazadas que eran IgG positivas para Chlamydia trachomatis (llamadas BR) (ii) 19 mujeres que eran IgG o PCR positivas para Chlamydia trachomatis (llamadas AN) (iií) 16 individuos de diferentes sexos (llamados CR)- (a) siete pacientes que fueron tratados por infección de Chlamydia trachomatis identificada por reacción en cadena de la ligasa y titulación en suero. (b) nueve donantes sin-dispersión sin antecedentes de enfermedad por Chlamydia, identificados por respuestas de células T a antígenos de Chlamydia y que no estaban en dispersión en el momento del reclutamiento para el estudio. Se determinó la respuesta a Chlamydia trachomatis IFN-gamma y a Chlamydia pneumoniae IFN-gamma estimulando 0.3 x 106 células mononucleares de sangre periférica con 1 microgramo/mililitro del cuerpo elemental respectivo de Chlamydia. Se tomaron sobrenadantes 72 horas después y se analizaron mediante la prueba ELISA específica para IFN-gamma. La serología se realizó usando pruebas de enlace de complemento IgG e IgM suministradas por Viríon-Serion para los sujetos en el grupo BR, y los sujetos conocidos como AN se analizaron usando ya sea la misma prueba o usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (Cobas Amplicor®) en muestras de orina. Se realizó un ensayo in vitro para evaluar la respuesta de células T de los sujetos para varios antígenos de Chlamydia trachomatis y combinaciones de las mismas. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre entera heparinízada mediante centrifugación de gradiente de densidad Ficoll-Hypaque siguiendo procedimientos regulares. Las células se lavaron y se criopreservaron en nitrógeno líquido hasta hacerse las pruebas (para mayores detalles véase Lalvani A, Moris P y colaboradores, J. Infect. Dis. 1999180: 1656-1664).

Para los sujetos en el grupo CR, la respuesta inmune a cada antígeno de Chlamydia trachomatis se caracterizó realizando un análisis de proliferación de linfocitos usando timídina titulada. Esta técnica valoró la expansión celular después de la estimulación in vitro a un antígeno. En la práctica, la proliferación celular se determina estimando la incorporación de timidina titulada en el ADN, un proceso muy relacionado con los cambios subyacentes en el número de células. Para los sujetos en los grupos AN y BR, la respuesta inmune específica a cada antígeno de Chlamydia trachomatis se caracterizó realizando análisis de proliferación de linfocitos usando el éster de succinimidilo o diacetato de carboxi-fluoresceína (CFSE). El diacetato de carboxi-fluoresceína espontáneamente e irreversiblemente se acopla tanto a las proteínas ¡ntracelulares como a las de la superficie celular por la reacción con las cadenas laterales de lisína y otros grupos amino disponibles. Cuando las células de linfocítos se dividen, el mareaje con CFSE se distribuye igualmente entre las células hijas, las cuales por lo tanto son la mitad de fluorescentes que las progenitoras. Como resultado, bajando a la mitad la intensidad de la fluorescencia celular se marca cada generación sucesiva en una población de células proliferantes y fácilmente es seguida por citometría de flujo (para otros detalles véase Hodgkíns, PD y colaboradores J. Exp. Med. 1996 184: 277-281). Prácticamente, después de descongelarse, las células mononucleares de sangre periférica se lavaron y mancharon con CFSE antes de ser cultivadas (2 x 105 células) durante 72 horas con 10 microgramos/milílitro de antígeno en un medio de cultivo (RPMI-1640 complementado con glutamina, aminoácido no esencial, piruvato, y suero AB humano inactívado con calor). Las células se cosecharon entonces y su fenotipo se caracterizó usando manchado superficial para identificar la memoria de las Células T CD8 y CD4+. Posteriormente, el análisis de citometría de flujo indicó el grado de proliferación de linfocitos como respuesta a cada antígeno (proporción de células con intensidad CFSE disminuida bajo estimulación in vitro). Resultados La Figura 21 muestra la respuesta CD4 de los sujetos de prueba a antígenos específicos; los respondentes en este caso de los grupos BR y AN se definen como que tienen una proporción de la señal al ruido de cuando menos 2:1. Los respondentes en el grupo CR se definen como los que demuestran un S/N > 10 proliferativo y respuesta IFN-gamma de 500 microgramos/mililitro de las células T generadas de los sujetos donadores. La proporción de respondentes se puede ver que varía dependiendo tanto del antígeno particular que se está probando como del grupo de sujetos. El grupo AN generalmente muestra el mayor número de respondentes (en cinco de ocho casos), mostrando el grupo CR en general el menor número de respondentes (en seis de ocho casos) pero la respuesta celular específica se evaluó en otro escenario técnico. Los sujetos en los grupos BR y AN mostraron su mayor respuesta al antígeno Ct-875. La Figura 22 muestra la respuesta CD4 graficada a una proporción de la señal al ruido de cuando menos 3:1 para los grupos BR y AN. La Figura 23 muestra la respuesta de CD4 de los sujetos de prueba a ciertos antígenos, y también a combinaciones de esos antígenos (la respuesta a las combinaciones no fue examinada para el grupo de sujetos CR, indicado por la notación NE). En comparación con la respuesta observada para los antígenos individuales, la combinación de Ct-875 + Ct-858 o Ct-858 + Ct-089 dio como resultado una proporción más alta de respondentes en ambos grupos de sujetos. Puede verse que la combinación de Ct-875 + Ct-089 no es resultado de ningún mejoramiento en el número de respondentes comparándose con Ct-875 solo, y tampoco la combinación de Ct-875 + Ct-858 + Ct-089 da como resultado algún mejoramiento en el número de respondentes en comparación con la combinación de Ct-875 + Ct-858. La combinación de cuatro antígenos Ct-875 + Ct-858 +Ct-089 + PmpD da como resultado el mayor número de respondentes en el grupo de sujetos BR (100 por ciento de respuesta ya siendo observada en el grupo AN tanto para la combinación Ct-875 + Ct-858 como para la Ct-875 + Ct-858 + Ct-089). Conclusiones Aunque la frecuencia de respondentes no fue consistente entre los tres grupos de sujetos, posiblemente como un resultado del tamaño de la muestra o diferencias de población, Ct-858 y Ct-875 fueron bien reconocidos para los tres grupos.

En los sujetos seropositivos humanos examinados, la respuesta óptima para una combinación de dos antígenos la proporciona Ct-875 + Ct-858. Ct-089 solamente parece dar como resultado la respuesta mejorada cuando Ct-875 ya no está presente, aunque Ct-089 puede tener el beneficio sobre y arriba de Ct-875 + Ct-858 en otros grupos de poblaciones. La mayor respuesta se observó para la combinación de cuatro antígenos Ct-875 + Ct-858 +Ct-089 + PmpD. En vista de los resultados del Ejemplo 9, razonablemente se espera que las combinaciones de antígenos de la presente invención, ya sea en forma de proteínas enteras, fragmentos inmunogénicos de las mismas o polinucleótidos que codifican cualquiera de éstas, serán de valor particular en las vacunas de Chlamydia humanas y en los métodos de diagnóstico relacionados.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una composición que comprende una combinación de dos o más proteínas de Chlamydia o fragmentos inmunogénicos de las mismas, o un polínucleótido o polinucleótídos que las codifiquen, seleccionándose estas dos o más proteínas o fragmentos inmunogénicos a partir de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, dominio pasajero de PmpG (PmpGpd), y dominio pasajero de PmpD (PmpDpd).
2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, la cual comprende una proteína Ct-089 de Chlamydia ó un fragmento inmunogénico de la misma, y una proteína Ct-858 de Chlamydia ó un fragmento inmunogénico de la misma, o polinucleótidos que las codifican.
3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, la cual comprende 2, 3, 4,5, ó 6 proteínas de Chlamydia ó fragmentos ¡nmunogénicos o polinucleótidos que las codifican.
4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2 ó con la reivindicación 3, la cual comprende además una proteína Ct-875 de Chlamydia ó un fragmento inmunogénico de la misma o polinucleótidos que la codifica.
5. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, ó 4, la cual comprende una proteína PmpDpd de Chlamydia ó un fragmento ¡nmunogénico de la misma o polinucleótidos que las codifican.
6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5, la cual comprende además una proteína Swib de Chlamydia ó un fragmento inmunogénico de la misma o polinucleótidos que las codifican.
7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5 ó con la reivindicación 6, la cual comprende además una proteína Momp de Chlamydia ó un fragmento ¡nmunogénico de la misma o polinucleótidos que las codifican.
8. Una composición de acuerdo con la reivindicación 4 ó con la reivindicación 7, la cual comprende además una proteína Ct-622 de Chlamydia ó un fragmento ¡nmunogénico de la misma o polinucleótidos que las codifican.
9. Una composición de acuerdo con la reivindicación 7 ó con la reivindicación 8, la cual comprende además una proteína PmpGpd de Chlamydia ó un fragmento inmunogénico de la misma o polinucleótidos que las codifican.
10. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, la cual comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, la cual comprende además un adyuvante.
12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el adyuvante es un estimulante preferencial de una respuesta de TH1.
13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el adyuvante comprende 3D-MPL, QS21, o una combinación de 3D-MPL y QS21.
14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el adyuvante comprende además una emulsión de aceite en agua.
15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el adyuvante comprende además liposomas.
16. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde dos o más de las proteínas o fragmentos inmunogénicos se enlazan para formar una proteína de fusión, o el polínucleótido o los polinucleótidos que codifican la proteína o los fragmentos ¡nmunogénicos, codifican una fusión de dos o más de las proteínas o fragmentos inmunogénicos.
17. Una composición que comprende una de las siguientes combinaciones de polipéptidos de Chlamydia ó fragmentos inmunogénicos de los mismos, o polinucleótidos que los codifican: 1. Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-089, Swib V. PmpDpd, Ct-858, Ct-089, Swib 2. Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-622, Ct-089, Swib 3. Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, Ct-622, Ct-089 4. Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089 5. Ct-858, Ct-875, Ct-089 51. PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Ct-089 6. Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd, Ct-089 1a. Los cinco de: Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, y Ct-089 1'a. Tres de: PmpDpd, Ct-858, Ct-089, Swib 2a. Cinco de: Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-622, Ct-089, y Swib 3a. Cinco de: Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, Ct-622, y Ct-089 4a. Tres de: Ct-858, Ct-875, Ct-622, y Ct-089 5a. Dos de: Ct-858, Ct-875, y Ct-089 5'a. Tres de: PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Ct-089 6a. Cuatro de: Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd, y Ct-089 en el entendido de que, en todas las composiciones 1a a 6a, están presentes las proteínas Ct-089 y Ct-858, o derivados inmunogénicos o polinucleótidos que las codifican.
18. Una composición que comprende la siguiente combinación de polipéptidos de Chlamydia ó fragmentos inmunogénicos de los mismos o polinucleótidos que los codifican: 1a". Cinco de: Swib, Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, y Ct-089 en el entendido de que están presentes las proteínas Ct-089 y Ct-858, o derivados inmunogénicos o polinucleótidos que las codifican.
19. Una composición que comprende una de las siguientes combinaciones de polipéptidos de Chlamydia, o fragmentos inmunogénicos de los mismos o polinucleótidos que los codifican: 1b. Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Swib, Ct-089 1b'. PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Swib, Ct-089 2b. Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-622, Ct-875, Swib, Ct-089 3b. Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, Ct-622, Ct-875, Ct-089 4b. Ct-858, Ct-875 5b. Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-089 5b'. Momp, Ct-858, Ct-875 6b. Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd, Ct-875, Ct-089 1c. Cinco de: Swib Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, y Ct-875 1c'. Tres de: PmpDpd, Ct-858, Ct-0875, Swib 2c. Cinco de: Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-622, Ct-875, y Swib 3c. Cinco de: Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, Ct-622, y Ct-875 4c. Tres de: Ct-858, Ct-875, Ct-622, y Ct-089 5c'. Tres de: PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Ct-089 6c. Cuatro de: Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd, y Ct-875 en el entendido de que, en todas las composiciones 1b a 6c, están presentes las proteínas Ct-875 y Ct-858 ó derivados inmunogénicos o polinucleótídos que las codifican. 20. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, dominio pasajero de PmpG (PmpGpd), y dominio pasajero de PmpD (PmpDpd), o los fragmentos inmunogénicos de los mismos o polinucleótidos, cuando están presentes en la composición, son: i. Ct-089 - un polipéptido que tiene una homología de cuando menos el 95 por ciento con el polipéptido de la SEQ ID NO:16 (Ct-089 del serotipo E), o un fragmento inmunogénico del mismo, o un polinucleótido que los codifica; ii. Ct-858 - un polipéptido que tiene una homología de cuando menos el 95 por ciento con el polipéptído de la SEQ ID NO:6 (Ct-858 del serotípo E) o un fragmento inmunogénico del mismo, o un polinucleótido que los codifica; iíi. Ct-875 - un polipéptido que tiene una homología de cuando menos el 95 por ciento con el polipéptido de la SEQ ID NO:8 (Ct-858 del serotipo E) o un fragmento inmunogéníco del mismo, o un polinucleótido que los codifica; iv. dominio pasajero PmpD - un polipéptído que tiene una homología de cuando menos el 95 por ciento con el polipéptido de la SEQ ID NO:14 (PmpD del serotipo Lll) o un fragmento inmunogénico del mismo, o un polinucleótido que los codifica; v. Swib - un polipéptido que tiene una homología de cuando menos el 95 por ciento con el polipéptido de la SEQ ID NO:2 (Swib del serotipo Lll) o un fragmento inmunogéníco del mismo, o un polinucleótido que los codifica; vi. Momp - un polipéptido que tiene una homología de cuando menos el 95 por ciento con el polipéptido de la SEQ ID NO:4 (Momp del serotipo F) o un fragmento inmunogénico del mismo, o un polinucleótído que los codifica; vii. Ct-622 - un polipéptido que tiene una homología de cuando menos el 95 por ciento con el polipéptido de la SEQ ID NO:10 (Ct-622 del serotipo E) o un fragmento inmunogénico del mismo, o un polinucleótido que los codifica; viii. dominio pasajero PmpG - un polipéptido que tiene una homología de cuando menos el 95 por ciento con el polipéptido de la
SEQ ID NO:12 (PmpG del serotipo Lll) o un fragmento inmunogénico del mismo, o un polinucleótido que los codifica.
21. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde todas las proteínas de Chlamydia ó fragmentos ¡nmunogénicos de las mismas, o un polinucleótido o polínucleótidos que las codifica, en la composición, son de Chlamydia trachomatis.
22. El uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, como un medicamento.
23. El uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de infección por Chlamydia.
24. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la infección por Chlamydia es infección por Chlamydia trachomatis.
25. Un método para el tratamiento o la prevención de infección por Chlamydia, el cual comprende la administración de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.
26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde la infección por Chlamydia es infección por Chlamydia trachomatis.
27. La composición, el uso, o el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, en donde PmpDpd ó PmpGpd está presente como parte de PmpD ó PmpG de longitud completa, o un fragmento de los mismos.
28. El uso de una o más proteínas de Chlamydia, fragmentos inmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifican, seleccionadas a partir de la lista que consiste en Ct-089, Ct-858, y Ct-875, y que se derivan a partir de un primer serotipo de Chlamydia trachomatis, en la fabricación de una vacuna para el tratamiento o la prevención de infección por Chlamydia, por un segundo serotipo de Chlamydia trachomatis.
29. Un método para el tratamiento o la prevención de infección por Chlamydia por un segundo serotipo de Chlamydia trachomatis, el cual comprende la administración de una vacuna que comprende una o más proteínas de Chlamydia, fragmentos inmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifican, seleccionadas a partir de la lista que consiste en Ct-089, Ct-858, y Ct-875, y que se derivan a partir de un primer serotipo de Chlamydia trachomatis.
30. El uso o método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 y 29, en donde la vacuna comprende una proteína, un fragmento inmunogénico de la misma, o un polinucleótido que la codifica, seleccionada a partir de la lista que consiste en Ct-089, Ct-858, y Ct-875.
31. El uso o método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en donde la vacuna comprende dos proteínas, fragmentos ¡nmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifican, seleccionadas a partir de la lista que consiste en Ct-089, Ct-858, y Ct-875.
32. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde la vacuna comprende Ct-089 y Ct-858, fragmentos inmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifican.
33. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde la vacuna comprende Ct-089 y Ct-875, fragmentos inmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifican.
34. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde la vacuna comprende Ct-858 y Ct-875, fragmentos inmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifican.
35. El uso o método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34, en donde la vacuna comprende Ct-089, Ct-858, y Ct-875, fragmentos inmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifican.
36. El uso o método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, en donde el primer serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de la lista que consiste en los serotipos A, B, Ba, C, D, Da, E, F, G, H, I, la, J, Ja, K, L1, L2, y L3 de Chlamydia trachomatis.
37. El uso o método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 36, en donde el serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de los serotipos oculares de Chlamydia trachomatis.
38. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el primer serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de los serotipos oculares A, B, Ba, y C de Chlamydia trachomatis.
39. El uso o método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 36, en donde el primer serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de los serotipos oculogenitales de Chlamydia trachomatis.
40. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el primer serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de los serotipos oculogenitales D, Da, E, F, G, H, I, la, J, Ja, y K de Chlamydia trachomatis.
41. El uso o método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 36, en donde el primer serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de los serotipos de linfogranuloma venéreo de Chlamydia trachomatis.
42. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 41, en donde el primer serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona a partir de los serotipos de línfogranuloma venéreo L1, L2, y L3 de Chlamydia trachomatis.
43. El uso o método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 42, en donde el primer serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona de tal manera que es un serotipo de Chlamydia trachomatis que tiene un alto nivel de identidad de secuencia con la mayoría de los otros serotipos de Chlamydia trachomatis.
44. El uso o método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 42, en donde el serotipo de Chlamydia trachomatis se selecciona de tal manera que es un serotipo de Chlamydia trachomatis que tiene un alto nivel de identidad de secuencia con la mayoría de los serotipos comunes de Chlamydia trachomatis.
45. El uso o método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 44, en donde los primero y segundo serotipos de Chlamydia trachomatis son serotipos de Chlamydia trachomatis que están asociados con el mismo estado de enfermedad.
46. El uso o método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 44, en donde los primero y segundo serotipos de Chlamydia trachomatis son serotipos de Chlamydia trachomatis que están asociados con diferentes estados de enfermedad.
47. El uso o método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 46, en donde la vacuna comprende uno o más antígenos adicionales.
48. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el uno o más antígenos adicionales son antígenos de Chlamydia trachomatis.
49. El uso o método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 47 ó 48, en donde el uno o más antígenos adicionales se seleccionan a partir de la lista que consiste en Momp, Ct-622, PmpGpd, y PmpDpd.
50. El uso o método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 49, en donde la vacuna comprende además un adyuvante.
51. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 50, en donde el adyuvante es un estimulante preferencial de una respuesta de Th1.
52. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 51, en donde el adyuvante comprende 3D-MPL, QS21, o una combinación de 3D-MPL y QS21.
53. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 52, en donde el adyuvante comprende además una emulsión de aceite en agua.
54. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 52, en donde el adyuvante comprende además liposomas.
55. Un método para determinar la infección previa por Chlamydia en un individuo, el cual comprende: (i) obtener una muestra del individuo; (ii) poner en contacto esta muestra con una combinación de dos o más proteínas de Chlamydia ó fragmentos ¡nmunogénicos de las mismas, o un polinucleótido o polinucleótidos que las codifican, seleccionándose estas dos o más proteínas o fragmentos inmunogénicos a partir de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, dominio pasajero de PmpG (PmpGpd), y dominio pasajero de PmpD (PmpDpd); (iii) cuantificar la respuesta de la muestra.
56. El método de acuerdo con la reivindicación 55, en donde la combinación de proteínas de Chlamydia ó fragmentos inmunogénicos de las mismas, o un polinucleótido o polinucleótidos que las codifican, comprende una proteína, fragmento inmunogénico de la misma, o polinucleótido que la codifica, seleccionado a partir de la lista que consiste en Ct-089, Ct-858, y Ct-875.
57. El método de acuerdo con la reivindicación 56, en donde la combinación de proteínas de Chlamydia ó fragmentos inmunogénicos de las mismas, o un polinucleótido o polinucleótídos que las codifican, comprende dos proteína, fragmentos inmunogénicos de las mismas, o polinucleótídos que las codificas, seleccionadas a partir de la lista que consiste en Ct-089, Ct-858, y Ct-875.
58. El método de acuerdo con la reivindicación 57, en donde la vacuna que comprende dos proteínas de Chlamydia, fragmentos inmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifican, que son Ct-089 y Ct-858.
59. El método de acuerdo con la reivindicación 57, en donde la vacuna comprende dos proteínas de Chlamydia, fragmentos inmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifican, que son Ct-875 y Ct-858.
60. El método de acuerdo con la reivindicación 57, en donde la vacuna comprende dos proteínas de Chlamydia, fragmentos inmunogénicos de las mismas, o polinucleótidos que las codifican, que son Ct-089 y Ct-875.
61. El método de acuerdo con la reivindicación 57, en donde la combinación de proteínas de Chlamydia ó fragmentos inmunogénicos de las mismas o un polinucleótido o polinucleótidos que las codifican, comprende Ct-089, Ct-858, y Ct-875.
62. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 61, en donde la muestra es sangre entera.
63. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 61, en donde la muestra es de células purificadas.
64. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 63, en donde la respuesta se cuantifíca mediante el monitoreo de la proliferación de linfocitos.
65. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 63, en donde la respuesta se cuantifica mediante el monitoreo de la producción de citoquinas.
66. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 63, en donde la respuesta se cuantifica mediante el monitoreo de la producción de anticuerpos específicos.
67. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 66, en donde el individuo es seronegativo.
68. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 66, en donde el individuo es seropositivo.