ES2312649T3 - Inmunizacion frente a chlamydia trachomatis. - Google Patents
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Abstract
El uso de una proteína en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección debida a Chlamydia trachomatis, en el que la proteína es: (a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 61; (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene el 50% o más de identidad de secuencia con SEC ID NO: 61; o (c) una proteína que comprende un fragmento de al menos 7 aminoácidos consecutivos de SEC ID NO: 61.
Description
Inmunización frente a Chlamydia
trachomatis.
Esta invención está en el campo de la
inmunización frente a una infección por clamidias, en particular
frente a una infección por Chlamydia trachomatis.
Chlamydiae son parásitos intracelulares
estrictos de células eucariotas que son responsables de infecciones
endémicas transmitidas sexualmente y otros diversos síndromes
patológicos. Ocupan una rama filogénica eubacteriana exclusiva, no
teniendo ninguna relación estrecha con ningún otro microorganismo
conocido - se clasifican en su propio orden (Chlamydiales)
que contiene una única familia (Chlamydiaceae) que a su vez
contiene un único género (Chlamydia, también denominado
Chlamydophila). Una característica particular de las
Chlamydiae es su ciclo de vida único, en el que la bacteria
alterna entre dos formas morfológicamente distintas: una forma
infectiva extracelular (cuerpos elementales, CE) y una forma no
infectiva intracelular (cuerpos reticulados, CR). El ciclo de vida
se completa con la reorganización de CR en CE, lo que deja la
célula huésped perturbada lista para infectar otras células.
En la actualidad se conocen cuatro especies de
clamidia - C. trachomatis, C. pneumoniae, C.
pecorum y C. psittaci {por ejemplo referencias 1, 2} - y
las secuencias genómicas están disponibles {referencias 3 a 9}.
Las serovariantes ("serovars") humanas de
C. trachomatis se dividen en dos biovariantes
("biovars"). Las serovars AK provocan infecciones epiteliales
principalmente en el tejido ocular (A-C) o tracto
genitourinario (D-K). Las serovars L1, L2 y L3 son
los agentes del linfogranuloma venéreo (LGV) invasivo.
Aunque la propia infección por clamidias provoca
una enfermedad, se cree que, en algunos pacientes, la gravedad de
los síntomas se debe, en realidad, a una respuesta inmunitaria del
huésped anómala. El fracaso a la hora de eliminar la infección da
como resultado una estimulación inmunitaria persistente y, en vez de
ayudar al huésped, esto da como resultado una infección crónica con
consecuencias graves, incluyendo esterilidad y ceguera {10}.
Además, la protección conferida por la infección por clamidias
natural, es normalmente incompleta, transitoria y específica de la
cepa.
Debido a la naturaleza grave de la enfermedad,
existe el deseo de proporcionar vacunas adecuadas. Éstas pueden ser
útiles (a) para la inmunización frente a una infección por clamidias
o frente a una enfermedad inducida por clamidias (vacunación
profiláctica) o (b) para la erradicación de una infección por
clamidias crónica establecida (vacunación terapéutica). Sin
embargo, al ser un parásito intracelular, la bacteria puede eludir
las respuestas inmunitarias mediadas por anticuerpos.
Se han descrito diversas proteínas antigénicas
para C. trachomatis, y la superficie celular en particular
ha sido el objetivo de una investigación detallada {por ejemplo 1,
11}. Éstas incluyen, por ejemplo, pgp3 {12, 13, 14}, MOMP {15},
Hsp60 (GroEL) {16} y Hsp70 (similar a DnaK) {17}. No todas éstas han
demostrado ser vacunas eficaces, sin embargo, es un objetivo de la
invención identificar antígenos de C. trachomatis que
provocan una respuesta inmunitaria durante una infección natural,
con el fin de proporcionar antígenos e inmunógenos adecuados para
su uso en el desarrollo de vacunas. Otro objetivo es identificar
antígenos útiles para el diagnóstico (por ejemplo
inmunodiagnóstico) de C. trachomatis.
Las secuencias de proteínas del genoma de C.
trachomatis se han descrito en entradas de bases de datos tales
como AE001283, que facilita la secuencia de C. trachomatis
DIUW-3/CX sección 10 de 87 del genoma completo.
También se han descrito vacunas que comprenden diversas proteínas de
Chlamydia. Por ejemplo, el documento WO 95/12411 da a
conocer una vacuna que comprende la proteína principal de membrana
externa (MOMP) de clamidia y un lipopolisacárido (LPS) de clamidia
para el tratamiento de un microorganismo de de clamidia. El
documento WO 00/34483 se refiere a vacunas que comprenden
inmunoestimulantes y polipéptidos de clamidia.
La referencia 18 da a conocer diversas proteínas
de C. pneumoniae, las cuales se verificó empíricamente que
eran inmunorreactivas, inmunoaccesibles y/o estaban presentes en
cuerpos elementales. Estas propiedades de las proteínas no podían
deducirse de la información de la secuencia genómica. La referencia
18 da a conocer que estas proteínas pueden usarse en el tratamiento
o la prevención de una infección debida a bacterias
Chlamydia, siendo C. pneumoniae el centro principal.
Las proteínas de C. pneumoniae también puede usarse para
tratar o prevenir una infección por otras especies de
Chlamydia, debido a la reactividad cruzada entre
especies.
C. pneumoniae está relacionada
estrechamente con C. trachomatis, tal como se muestra
mediante comparaciones del genoma completo {3,4,5}.
La presente invención se refiere al uso de la
proteína CTO89 de C. trachomatis que tiene la SEC ID NO:61
en el tratamiento o la prevención de una infección debida a
Chlamydia trachomatis.
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Se describen proteínas que comprenden una o más
de las secuencias de aminoácidos de número impar SEC ID
1-261.
También se describen proteínas que comprenden
secuencias que comparten al menos el x% de identidad de secuencia
con una o más de las secuencias de aminoácidos de número impar SEC
ID 1-261. Dependiendo de la secuencia particular, x
es preferiblemente el 50% o más (por ejemplo el 60%, 70%, 80%, 90%,
95%, 99% o más). Éstas incluyen mutantes y variantes alélicas.
Normalmente, se considera que el 50% de identidad o más entre dos
proteínas es una indicación de equivalencia funcional. La identidad
entre proteínas se determina preferiblemente mediante el algoritmo
de búsqueda de homología de Smith-Waterman tal como
se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando una
búsqueda de huecos afines con los parámetros penalización por
apertura de hueco =12 y penalización por extensión de
hueco =1.
Se describen además proteínas que comprenden
fragmentos de las secuencias de aminoácidos de número impar SEC ID
1-261. Los fragmentos deben comprender al menos n
aminoácidos consecutivos de las secuencias y, dependiendo de la
secuencia particular, n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16,
18, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200 o más). Preferiblemente los
fragmentos comprenden uno o más epítopo(s) de la secuencia.
Otros fragmentos preferidos omiten un péptido señal.
Las proteínas de la invención pueden prepararse
mediante diversos medios por ejemplo mediante síntesis química (al
menos en parte), digiriendo polipéptidos más largos usando
proteasas, mediante traducción a partir de ARN, mediante
purificación a partir de un cultivo celular (por ejemplo a partir de
expresión recombinante o a partir de un cultivo de C.
trachomatis) etc. La expresión heteróloga en E. coli es
una ruta preparativa preferida.
Las proteínas de la invención pueden adoptar
diversas formas por ejemplo nativa, de fusión, glicosilada, no
glicosilada, lipidada, etc.).
Las proteínas de la invención se preparan
preferiblemente en forma sustancialmente pura (es decir
sustancialmente libres de otras proteínas de C. trachomatis
o de la célula huésped).
Las proteínas de la invención pueden unirse a un
soporte sólido. Pueden comprender un marcador detectable (por
ejemplo un marcador radiactivo o fluorescente, o un marcador de
biotina).
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Se describen ácidos nucleicos que comprenden una
o más de las secuencias de nucleótidos de número par SEC ID
2-262.
También se describen secuencias de ácido
nucleico que comparten al menos el x% de identidad de secuencia con
las secuencias de nucleótidos de número par SEC ID
2-262. Dependiendo de la secuencia particular, x es
preferiblemente el 50% o más (por ejemplo el 60%, 70%, 80%, 90%,
95%, 99% o más).
Además, se describe un ácido nucleico que puede
hibridar para dar ácido nucleico que comprende las secuencias de
nucleótidos de número par SEC ID 2-262. Las
reacciones de hibridación pueden realizarse en condiciones de
"rigurosidad" diferentes. Las condiciones que aumentan la
rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente
conocidas y están publicadas en la técnica. Los ejemplos de
condiciones relevantes incluyen (en orden de rigurosidad
creciente): temperaturas de incubación de 25ºC, 37ºC, 50ºC, 55ºC y
68ºC; concentraciones de tampón de 10 X SSC, 6 X SSC, 1 X SSC, 0,1
X SSC y sus equivalentes usando otros sistemas de tampón;
concentraciones de formamida del 0%, 25%, 50% y 75%; tiempos de
incubación desde 5 minutos hasta 24 horas; 1, 2 o más etapas de
lavado; tiempos de incubación con lavado de 1, 2 ó 15 minutos; y
disoluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC, o agua
desionizada. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado de
la invención hibrida de manera selectiva en condiciones de
rigurosidad baja; en otras realizaciones hibrida de manera selectiva
en condiciones de rigurosidad intermedia; en otras realizaciones,
hibrida de manera selectiva en condiciones de rigurosidad alta. Un
conjunto a modo de ejemplo de condiciones de hibridación de
rigurosidad baja es 50ºC y 10xSSC. Un conjunto a modo de ejemplo de
condiciones de hibridación de rigurosidad intermedia es 55ºC y
1xSSC. Un conjunto a modo de ejemplo de condiciones de hibridación
de rigurosidad alta es 68ºC y 0,1 x SSC.
También se proporciona ácido nucleico que
proporciona fragmentos de las secuencias de nucleótidos de número
par SEC ID 2-262. Éstos deben comprender al menos n
nucleótidos consecutivos de las secuencias de C. trachomatis
y, dependiendo de la secuencia particular, n es 7 o más (por ejemplo
10, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 200, 300 o
más).
Según otro aspecto, la invención proporciona
ácido nucleico que codifica las proteínas y los fragmentos de
proteína de la invención.
La invención proporciona ácido nucleico que
comprende secuencias complementarias a las descritas anteriormente
(por ejemplo para fines de sondeo o antisentido).
El ácido nucleico de la invención puede
prepararse, por supuesto, de muchas maneras por ejemplo mediante
síntesis química (al menos en parte), mediante digestión de
polinucleótidos más largos usando enzimas de restricción, a partir
de bibliotecas de ADNc o genómicas, a partir del propio
microorganismo, etc.
El ácido nucleico de la invención puede adoptar
diversas formas (por ejemplo monocatenario, bicatenario, lineal,
circular, vectores, cebadores, sondas, etc.).
Los ácidos nucleicos de la invención pueden
unirse a un soporte sólido (por ejemplo una perla, placa, filtro,
película, portaobjetos, resina, etc.). Los ácidos nucleicos de la
invención pueden incluir un marcador detectable (por ejemplo un
marcador radiactivo o fluorescente, o un marcador de biotina). Esto
es particularmente útil cuando el polinucleótido va a usarse en
técnicas de detección de ácido nucleico por ejemplo cuando el ácido
nucleico es un cebador o una sonda para su uso en técnicas tales
como PCR, LCR, TMA, NASBA, bDNA, etc.
La expresión "ácido nucleico" incluye ADN,
ARN, híbridos de ADN/ARN y análogos de ADN o ARN, tales como los
que contienen bases o estructuras principales modificadas, y también
ácidos nucleicos peptídicos (ANP), etc.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden
aislarse y obtenerse en pureza sustancial, generalmente como una
distinta de un cromosoma intacto. Habitualmente, los polinucleótidos
se obtendrán sustancialmente libres de otras secuencias de ácido
nucleico que se producen de manera natural, siendo generalmente al
menos aproximadamente un 50% (en peso) puros, habitualmente al
menos aproximadamente un 90% puros.
Los ácidos nucleicos pueden usarse, por ejemplo:
para producir polipéptidos; como sondas para la detección de ácido
nucleico en muestras biológicas; para generar copias adicionales de
los polinucleótidos; para generar ribozimas u oligonucleótidos
antisentido; y como sondas de ADN monocatenario o como
oligonucleótidos que forman cadena triple, etc.
La invención proporciona vectores que comprenden
secuencias de nucleótidos de la invención (por ejemplo vectores de
clonación o de expresión) y células huésped transformadas con los
mismos.
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Según otro aspecto, la invención proporciona
composiciones que comprenden proteína y/o ácido nucleico según la
invención. Estas composiciones son preferiblemente composiciones
inmunogénicas, tales como vacunas, y son adecuadas para fines de
inmunización y vacunación. Las vacunas de la invención pueden ser
profilácticas o terapéuticas, y comprenderán normalmente un
antígeno que puede inducir anticuerpos que pueden inhibir (a) la
adhesión de clamidias, (b) la entrada de clamidias, y/o (c) la
replicación satisfactoria dentro de la célula huésped. Las vacunas
inducen preferiblemente cualquier respuesta de células T mediada por
células que sea necesaria para el aclaramiento de clamidias del
huésped.
La invención proporciona también ácido nucleico
o proteína según la invención para su uso como medicamentos (por
ejemplo como vacunas).
La invención proporciona también el uso de ácido
nucleico o proteína según la invención en la fabricación de un
medicamento (por ejemplo una vacuna o una composición inmunogénica)
para tratar o prevenir una infección debida a una Chlamydia.
Ésta será generalmente C. trachomatis pero, debido a la
reactividad cruzada entre especies, puede ser también C.
pneumoniae, C. pecorum o C. psittaci. Para la
prevención, el medicamento provoca preferiblemente una respuesta
inmunitaria que es específica frente a la forma de CE de
Chlamydia; para el tratamiento, el medicamento provoca
preferiblemente una respuesta inmunitaria que es específica frente
a la forma de CR de Chlamydia.
La invención proporciona también el uso de ácido
nucleico o proteína según la invención en la fabricación de un
medicamento (por ejemplo una vacuna o una composición inmunogénica)
para neutralizar cuerpos elementales de Chlamydia
trachomatis.
La invención proporciona también un
procedimiento de tratamiento (por ejemplo inmunización) de un
paciente (por ejemplo un ser humano), que comprende administrar al
paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de ácido nucleico o
proteína según la invención.
La invención proporciona también un
procedimiento de producir una respuesta inmunitaria en un paciente,
que comprende administrar al paciente una cantidad
inmunológicamente eficaz de ácido nucleico o proteína según la
invención. La respuesta inmunitaria puede implicar producir
anticuerpos en el paciente y/o producir una respuesta inmunitaria
celular (por ejemplo una respuesta LTC). La respuesta inmunitaria
puede ser específica para un CE o una proteína de CR, o para una
proteína que se expresa en el citoplasma huésped. Una respuesta de
anticuerpo es preferiblemente específica para un CE, mientras que
una respuesta inmunitaria celular es preferiblemente específica
para una proteína citoplasmática o, preferiblemente, para una
proteína de CR.
La invención proporciona también un
procedimiento de producción de anticuerpos que reconoce una proteína
de la invención, que comprende la etapa de administrar a un
paciente un cuerpo reticulado o cuerpo elemental de
Chlamydia. Los anticuerpos son preferiblemente específicos
para un CE.
La invención proporciona también un
procedimiento de neutralización de la infectividad de C.
trachomatis, que comprende la etapa de administrar a un
paciente una proteína, ácido nucleico o anticuerpo de la invención.
El procedimiento neutraliza preferiblemente la infectividad de los
CE.
La invención proporciona también un
procedimiento para detectar un CR o CE de Chlamydia en una
muestra biológica, que comprende la etapa de poner en contacto un
anticuerpo de la invención con la muestra. La muestra puede ser una
muestra de sangre, otro fluido corporal o una muestra de tejido. El
procedimiento puede usarse para diagnosticar una infección por
clamidias.
Las composiciones inmunogénicas de la invención
también pueden incluir uno o más de los siguientes antígenos:
- -
- un antígeno de proteína de Helicobacter pylori tal como VacA, CagA, NAP, HopX, HopY {por ejemplo documento WO98/04702} y/o ureasa.
- -
- Un antígeno de proteína del serogrupo B de N. meningitidis, tal como en los de los documentos WO99/ 24578, WO99/36544, WO99/57280, WO00/22430, Tettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815, Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820 y el documento WO96/29412, prefiriéndose particularmente la proteína "287" y derivados.
- -
- Una preparación de vesícula de membrana externa (OMV) del serogrupo B de N. meningitidis, tal como las dadas a conocer en el documento WO01/52885; Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775):1093-1096; Fukasawa et al. (1999) Vaccine 17:2951-2958; Rosenqvist et al. (1998) Dev. Biol. Stand. 92:323-333 etc.
- -
- Un antígeno de sacárido del serogrupo A, C, W135 y/o Y de N. meningitidis, tal como el oligosacárido dado a conocer en Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698 del serogrupo C {véase también Costantino et al. (1999) Vaccine 17: 1251-1263}.
- -
- Un antígeno de sacárido de Streptococcus pneumoniae {por ejemplo Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332; Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v; Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207}.
- -
- Un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como un virus inactivado {por ejemplo Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188; Iwarson (1995) APMIS 103:321-326}.
- -
- Un antígeno del virus de la hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o de núcleo {por ejemplo Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Sup. 1:S63-68 y 79-80}.
- -
- Un antígeno del virus de la hepatitis C {por ejemplo Hsu et al. (1999) Clin Liver Dis 3:901-915}.
- -
- Un antígeno de Bordetella pertussis, tal como holotoxina de la tos ferina (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 {por ejemplo Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349-355; Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238}.
- -
- Un antígeno de la difteria, tal como un toxoide de la difteria {por ejemplo capítulo 3 de Vaccines (1988) eds. Plotkin y Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0} por ejemplo el mutante CRM_{197} {por ejemplo Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70}.
- -
- Un antígeno del tétanos, tal como un toxoide del tétanos {por ejemplo capítulo 4 de Plotkin y Mortimer}.
- -
- Un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae B.
- -
- Un antígeno de N. gonorrhoeae {por ejemplo documentos WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280}.
- -
- Un antígeno de Chlamydia pneumoniae {por ejemplo documento PCT/IB01/01445; Kalman et al. (1999) Nature Genetics 21:385-389; Read et al. (2000) Nucleic Acids Res 28:1397-406; Shirai et al. (2000) J. Infect. Dis. 181 (Supl. 3):S524-S527; documentos WO99/27105; WO00/27994; WO00/37494}.
- -
- Un antígeno de Chlamydia trachomatis {por ejemplo documento WO99/28475}.
- -
- Un antígeno de Porphyromonas gingivalis {por ejemplo Ross et al. (2001) Vaccine 19:4135-4142}.
- -
- Antígeno(s) de la polio {por ejemplo Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308; Zimmerman y Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126} tal(es) como IPV u OPV.
- -
- Antígeno(s) de la rabia {por ejemplo Dreesen (1997) Vaccine 15 Supl.: S2-6} tal(es) como un virus inactivado liofilizado {por ejemplo MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998 Jan 16;47(1):12, 19; RabAvert^{TM}}.
- -
- Antígenos del sarampión, las paperas y/o la rubéola {por ejemplo capítulos 9, 10 y 11 de Plotkin y Mortimer}.
- -
- Antígeno(s) de la gripe {por ejemplo capítulo 19 de Plotkin y Mortimer}, tal(es) como las proteínas de superficie de neuraminidasa y/o hemaglutinina.
- -
- Un antígeno de Moraxella catarrhalis {por ejemplo McMichael (2000) Vaccine 19 Supl. 1: S101-107}.
- -
- Un antígeno de Staphylococcus aureus {por ejemplo Kuroda et al. (2001) Lancet 357(9264):1225-1240; véanse también las páginas 1218-1219}.
- -
- Un antígeno de Streptococcus agalactiae {por ejemplo véase el documento WO02/34771}.
- -
- Un antígeno de Streptococcus pyogenes {por ejemplo véase el documento WO02/34771}.
Cuando se incluye antígeno de hidrato de carbono
o sacárido, está conjugado preferiblemente a una proteína portadora
con el fin de mejorar la inmunogenicidad {por ejemplo Ramsay et
al. (2001) Lancet 357(9251):195-196;
Lindberg (1999) Vaccine 17 Supl. 2:S28-36; Conjugate
Vaccines (eds. Cruse et al.) ISBN 3805549326, particularmente
vol. 10:48-114, etc.}. Las proteínas portadoras
preferidas son toxoides o toxinas bacterianos, tales como toxoides
de la difteria o del tétanos. Se prefiere particularmente el toxoide
de la difteria CRM_{197}. Otras proteínas portadoras adecuadas
incluyen la proteína de membrana externa de N. meningitidis
{por ejemplo documento EP-0372501}, péptidos
sintéticos {por ejemplo documentos EP-0378881,
EP-0427347}, proteínas de choque térmico {por
ejemplo documento WO93/17712}, proteínas de la tos ferina {por
ejemplo documentos WO98/58668; EP-0471177},
proteína D de H. influenzae {por ejemplo documento
WO00/56360}, toxina A o B de C. difficile {por ejemplo
documento WO00/61761}, etc. Puede usarse cualquier reacción de
conjugación adecuada, con cualquier ligador adecuado cuando sea
necesario.
Puede eliminarse la toxicidad de los antígenos
de proteína tóxica cuando sea necesario (por ejemplo eliminación de
la toxicidad de la toxina de la tos ferina mediante medios químicos
y/o genéticos).
Cuando se incluye un antígeno de la difteria en
la composición se prefiere también incluir un antígeno del tétanos
y antígenos de la tos ferina. De manera similar, cuando se incluye
un antígeno del tétanos, se prefiere también incluir antígenos de
la difteria y de la tos ferina. De manera similar, cuando se incluye
un antígeno de la tos ferina, se prefiere incluir también antígeno
de la difteria y del tétanos.
Los antígenos se adsorben preferiblemente en una
sal de aluminio.
Los antígenos en la composición estarán
presentes normalmente a una concentración de al menos 1 \mug/ml
cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado
será suficiente para provocar una respuesta inmunitaria frente a
ese antígeno.
La invención proporciona también composiciones
que comprenden dos o más proteínas de la presente invención.
La invención proporciona un procedimiento para
producir proteínas de la invención, que comprende la etapa de
cultivar una célula huésped según la invención en condiciones que
inducen la expresión de proteínas.
La invención proporciona un procedimiento para
producir proteína o ácido nucleico de la invención, en el que la
proteína o el ácido nucleico se sintetiza en parte o en su totalidad
usando medios químicos.
La invención proporciona un procedimiento para
detectar C. trachomatis en una muestra, en el que la muestra
se pone en contacto con un anticuerpo que se une a una proteína de
la invención.
A continuación se facilita un resumen de los
procedimientos y las técnicas convencionales que pueden emplearse
con el fin de realizar la invención (por ejemplo para utilizar las
secuencias dadas a conocer para inmunización). Este resumen no es
una limitación para la invención sino que, más bien, facilita
ejemplos que pueden usarse, pero no se requieren.
La práctica de la presente invención empleará, a
menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de
biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología,
que están dentro del conocimiento de la técnica. Tales técnicas se
explican completamente en la bibliografía por ejemplo Sambrook
Molecular Cloning; A Laboratory Manual, segunda edición (1989) y
tercera edición (2001); ADN Cloning, volúmenes I y ii (D.N Glover
ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic
Acid Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins eds. 1984);
Transcription and Translation (B.D. Hames y S.J. Higgins eds. 1984);
Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and
Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular
Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press,
Inc.), especialmente los volúmenes 154 y 155; Gene Transfer Vectors
for Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring
Harbor Laboratory); Mayer y Walker, eds. (1987), Immunochemical
Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londres);
Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice,
segunda edición (Springer-Verlag, N.Y.) y Handbook
of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (D.M.
Weir y C. C. Blackwell eds 1986).
En esta memoria descriptiva se usan las
abreviaturas convencionales para nucleótidos y aminoácidos.
Una composición que contiene X está
"sustancialmente libre de" Y cuando al menos el 85% en peso del
total de X+Y en la composición es X. Preferiblemente, X comprende
al menos aproximadamente el 90% en peso del total de X+Y en la
composición, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% o
incluso el 99% en peso.
La expresión "que comprende" significa
"que incluye" así como "que consiste en" por ejemplo una
composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente
en X o puede incluir algo adicional a X, tal como X+Y.
El término "heterólogo" se refiere a dos
componentes biológicos que no se encuentran juntos en la naturaleza.
Los componentes pueden ser células huésped, genes o regiones
reguladoras, tales como promotores. Aunque los componentes
heterólogos no se encuentran juntos en la naturaleza, pueden actuar
conjuntamente, tal como cuando un promotor heterólogo con respecto
a un gen se une operativamente con el gen. Otro ejemplo es cuando
una secuencia de clamidia es heteróloga con respecto a una célula
huésped de ratón. Un ejemplo adicional serían dos epítopos de la
misma o diferentes proteínas que se han ensamblado en una única
proteína en una disposición que no se encuentra en la
naturaleza.
Un "origen de replicación" es una secuencia
de polinucleótidos que inicia y regula la replicación de
polinucleótidos, tal como un vector de expresión. El origen de
replicación se comporta como una unidad autónoma de replicación de
polinucleótidos dentro de una célula, que puede llevar a cabo la
replicación bajo su propio control. Un origen de replicación puede
ser necesario para que un vector se replique en una célula huésped
particular. Con ciertos orígenes de replicación, un vector de
expresión puede reproducirse con un número alto de copias en
presencia de las proteínas apropiadas dentro de la célula. Los
ejemplos de orígenes son las secuencias que se replican de manera
autónoma, que son eficaces en la levadura; y el antígeno T viral,
eficaz en células COS-7.
Una secuencia "mutante" se define como una
secuencia de ADN, ARN o aminoácidos que difiere pero tiene identidad
de secuencia con la secuencia nativa o dada a conocer. Dependiendo
de la secuencia particular, el grado de identidad de secuencia
entre la secuencia nativa o dada a conocer y la secuencia mutante es
preferiblemente superior al 50% (por ejemplo el 60%, 70%, 80%, 90%,
95%, 99% o más, calculada usando el algoritmo de
Smith-Waterman tal como se describió
anteriormente). Tal como se usa en el presente documento, una
"variante alélica" de una molécula de ácido nucleico, o
región, para la que se proporciona una secuencia de ácido nucleico
en el presente documento es una molécula de ácido nucleico, o una
región, que aparece esencialmente en el mismo locus en el genoma de
otro o un segundo aislado, y que, debido a la variación natural
provocada por, por ejemplo, mutación o recombinación, tiene una
secuencia de ácido nucleico similar pero no idéntica. Una variante
alélica de la región codificante codifica normalmente una proteína
que tiene una actividad similar a la de la proteína codificada por
el gen con el que se compara. Una variante alélica puede comprender
también una alteración en las regiones no traducidas 5' o 3' del
gen, tal como en regiones de control reguladoras (por ejemplo véase
la patente estadounidense 5.753.235).
Las secuencias de nucleótidos de clamidia pueden
expresarse en una variedad de sistemas de expresión diferentes; por
ejemplo los usados con células de mamífero, baculovirus, plantas,
bacterias y levadura.
Los sistemas de expresión de mamífero se conocen
en la técnica. Un promotor de mamífero es cualquier secuencia de
ADN que pueda unirse a la ARN polimerasa de mamífero e iniciar la
transcripción en sentido 3' (3') de una secuencia codificante (por
ejemplo gen estructural) para dar ARNm. Un promotor tendrá una
región de inicio de la transcripción, que se sitúa habitualmente
próxima al extremo 5' de la secuencia codificante, y una caja TATA,
situada habitualmente 25-30 pares de bases (pb) en
el sentido de 5' del sitio de inicio de la transcripción. Se cree
que la caja TATA dirige la ARN polimerasa II para que comience la
síntesis de ARN en el sitio correcto. Un promotor de mamífero
contendrá también un elemento de promotor en el sentido de 5',
situado habitualmente dentro de 100 a 200 pb en el sentido de 5' de
la caja TATA. Un elemento de promotor en el sentido de 5' determina
la velocidad a la que se inicia la transcripción y pueden actuar en
cualquier orientación {Sambrook et al. (1989) "Expression
of Cloned Genes in Mammalian Cells". En Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª ed.}.
Los genes virales de mamífero se expresan
enormemente a menudo y tienen una amplia gama de huéspedes; por
tanto las secuencias que codifican genes virales de mamífero
proporcionan secuencias de promotor particularmente útiles. Los
ejemplos incluyen el promotor temprano de SV40, promotor LTR de
virus de tumor mamario de ratón, promotor tardío principal de
adenovirus (Ad MLP) y promotor del virus herpes simple. Además, las
secuencias derivadas de genes no virales, tales como el gen de la
metaloteioneína murino, proporcionan también secuencias promotoras
útiles. La expresión puede ser constitutiva o bien regulada
(inducible), dependiendo del promotor puede inducirse con
glucocorticoide en células sensibles a hormonas.
La presencia de un elemento potenciador
(potenciador), combinado con los elementos promotores descritos
anteriormente, aumentará habitualmente los niveles de expresión. Un
potenciador es una secuencia de ADN reguladora que puede estimular
la transcripción hasta 1000 veces cuando está ligada a promotores
homólogos o heterólogos, comenzando la síntesis en el sitio de
inicio de ARN normal. Los potenciadores son también activos cuando
están ubicados en el sentido de 5' o en el sentido de 3' desde el
sitio de iniciación de la transcripción, en una orientación normal
o bien inversa, o a una distancia de más de 1000 nucleótidos desde
el promotor {Maniatis et al. (1987) Science 236:1237;
Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2ª ed.}.
Los elementos potenciadores derivados de virus pueden ser
particularmente útiles, porque habitualmente tiene una gama de
huéspedes más amplia. Los ejemplos incluyen el potenciador de gen
temprano de SV40 {Dijkema et al (1985) EMBO J. 4:761} y el
potenciador/los promotores derivado(s) de la repetición
terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous {Gorman et
al. (1982) PNAS USA 79:6777} y del citomegalovirus humano
{Boshart et al. (1985) Cell 41:521}. Adicionalmente, algunos
potenciadores son regulables y se vuelven activos sólo en presencia
de un inductor, tal como una hormona o un ión metálico
{Sassone-Corsi y Borelli (1986) Trends Genet. 2:215;
Maniatis et al. (1987) Science 236:1237}.
Una molécula de ADN puede expresarse
intracelularmente en células de mamífero. Una secuencia promotora
puede estar ligada directamente con la molécula de ADN, en cuyo
caso el primer aminoácido en el extremo N-terminal
de la proteína recombinante siempre será una metionina, que se
codifica mediante el codón de iniciación ATG. Si se desea, el
extremo N-terminal puede romperse a partir de la
proteína mediante incubación in vitro con bromuro de
cianógeno.
Como alternativa, las proteínas foráneas también
pueden secretarse desde la célula hacia los medios de crecimiento
creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de
fusión compuesta por un fragmento de secuencia líder que provee la
secreción de la proteína foránea en células de mamífero.
Preferiblemente, hay sitios de procesamiento codificados entre el
fragmento líder y el gen foráneo que puede romperse in vivo o
bien in vitro. El fragmento de secuencia líder codifica
habitualmente un péptido señal compuesto por aminoácidos hidrófobos
que dirigen la secreción de la proteína desde la célula. La
secuencia líder triparental de adenovirus es un ejemplo de una
secuencia líder que provee la secreción de una proteína foránea en
células de mamífero.
Habitualmente, las secuencias de poliadenilación
y de terminación de la transcripción reconocidas por las células de
mamífero son regiones reguladoras ubicadas en 3' con respecto al
codón de terminación de la traducción y por tanto, junto con los
elementos promotores, flanquean la secuencia codificante. El extremo
3'-terminal del ARNm maduro se forma mediante
poliadenilación y rotura postranscripcional específica de sitio
{Birnstiel et al. (1985) Cell 41:349; Proudfoot y Whitelaw
(1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA".
En Transcription and splicing (ed. B.D. Hames y D.M. Glover);
Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105}. Estas secuencias
dirigen la transcripción de un ARNm que puede traducirse en el
polipéptido codificado por el ADN. Los ejemplos de señales de
poliadenilación/terminador de la transcripción incluyen los
derivados de SV40 {Sambrook et al (1989) "Expression of
cloned genes in cultured mammalian cells". En Molecular Cloning:
A Laboratory Manual}.
Habitualmente, los componentes descritos
anteriormente, que comprenden un promotor, una señal de
poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción
se colocan juntos en constructos de expresión. Los potenciadores,
intrones con sitios aceptores y donadores de corte y empalme
funcionales, y secuencias líder también pueden incluirse en un
constructo de expresión, si se desea. Los constructos de expresión
se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento
extracromosómico (por ejemplo plásmidos) que pueden mantenerse de
manera estable en un huésped, tal como células de mamífero o
bacterias. Los sistemas de replicación de mamífero incluyen los
derivados de virus de animales, que requieren factores de actuación
en trans para replicarse. Por ejemplo, los plásmidos que contienen
los sistemas de replicación de papovavirus, tales como SV40 {Gluzman
(1981) Cell 23:175} o poliomavirus, se replican en un número de
copias extremadamente alto en presencia del antígeno T viral
apropiado. Los ejemplos adicionales de replicones de mamífero
incluyen los derivados del virus del papiloma bovino y virus de
Epstein-Barr. Adicionalmente, el replicón puede
tener dos sistemas de replicación, permitiendo así que se mantenga,
por ejemplo, en células de mamífero para su expresión y en un
huésped procariota para clonación y amplificación. Los ejemplos de
tales vectores lanzadera de mamífero-bacteria
incluyen pMT2 {Kaufinan et al. (1989) Mol. Cell. Biol.
9:946} y pHEBO {Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol.
6:1074}.
El procedimiento de transformación usado depende
del huésped que va a transformarse. Los procedimientos para la
introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero
se conocen en la técnica e incluyen transfección mediada por
dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada
por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación,
encapsulación de polinucleótido(s) en liposomas,
microinyección directa del ADN en los núcleos.
Las líneas celulares de mamífero disponibles
como huéspedes para la expresión se conocen en la técnica e incluyen
muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección
Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluyendo, pero sin limitarse
a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células
de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS),
células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo Hep G2) y
otras diversas líneas celulares.
El polinucleótido que codifica la proteína
también puede insertarse en un vector de expresión de insecto
adecuado, y está unido operativamente a los elementos de control
dentro de ese vector. La construcción de vectores emplea técnicas
que se conocen en la técnica. Generalmente, los componentes del
sistema de expresión incluyen un vector de transferencia,
habitualmente un plásmido bacteriano, que contiene ambos, un
fragmento del genoma de baculovirus y un sitio de restricción
conveniente para la inserción del gen o genes heterólogos que han
de expresarse; un baculovirus de tipo natural con una secuencia
homóloga al fragmento específico de baculovirus en el vector de
transferencia (esto permite la recombinación homóloga del gen
heterólogo en el genoma de baculovirus); y células huésped de
insecto apropiadas y medios de crecimiento.
Tras insertar la secuencia de ADN que codifica
la proteína en el vector de transferencia, el vector y el genoma
viral de tipo natural se transfectan a una célula huésped de insecto
en la que el vector y el genoma viral se dejan que recombinen. El
virus recombinante empaquetado se expresa y placas recombinantes se
identifican y se purifican. Los materiales y procedimientos para
sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto están
disponibles comercialmente en forma de kit de, entre otros,
Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac"). Estas técnicas se
conocen generalmente por los expertos en la técnica y se describen
completamente en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment
Station Bulletin No. 1555 (1987) (en lo sucesivo en el presente
documento "Summers y Smith").
Antes de insertar la secuencia de ADN que
codifica la proteína en el genoma de baculovirus, los componentes
descritos anteriormente, que comprenden un promotor, secuencia líder
(si se desea), secuencia codificante de interés y secuencia de
terminación de la transcripción, se ensamblan habitualmente en un
constructo de traslado intermedio (vector de transferencia). Este
constructo puede contener un único gen y elementos reguladores
unidos operativamente; múltiples genes, cada uno con su propio
conjunto de elementos reguladores unidos operativamente; o
múltiples genes, regulados por el mismo conjunto de elementos
reguladores. Los constructos de traslado intermedios se mantienen a
menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por
ejemplo plásmidos) que pueden mantenerse estables en un huésped,
tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación,
permitiendo así que se mantenga en un huésped adecuado para
clonación y amplificación.
Actualmente, el vector de transferencia más
comúnmente usado para introducir genes foráneos en AcNPV es pAc373.
También se han diseñado muchos otros vectores, conocidos por los
expertos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, pVL985 (que
altera el codón de iniciación de polihedrina desde ATG hasta ATT, y
que introduce un sitio de clonación BamHI alejado 32 pares de bases
en el sentido de 3' desde el ATT; véase Luckow y Summers, Virology
(1989) 17:31.
El plásmido contiene también habitualmente la
señal de poliadenilación de polihedrina (Miller et al. (1988)
Ann. Rev. Microbiol., 42:177) y un gen procariota de resistencia a
la ampicilina (amp) y un origen de replicación para la selección y
propagación en E. coli.
Los vectores de transferencia de baculovirus
contienen habitualmente un promotor de baculovirus. Un promotor de
baculovirus es cualquier secuencia de ADN que pueda unirse a la ARN
polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción en el sentido
de 3' (de 5' a 3') de una secuencia codificante (por ejemplo gen
estructural) en el ARNm. Un promotor tendrá una región de
iniciación de la transcripción que está ubicada habitualmente
próxima al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de
iniciación de la transcripción incluye habitualmente un sitio de
unión a ARN polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción.
Un vector de transferencia de baculovirus también puede tener un
segundo dominio denominado un potenciador, que, si está presente, es
habitualmente distal con respecto al gen estructural. La expresión
puede ser regulada o bien constitutiva.
Los genes estructurales, transcritos
abundantemente en momentos tardíos en un ciclo de infección viral,
proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los
ejemplos incluyen secuencias derivadas del gen que codifica la
proteína poliédrica viral, Friesen et al., (1986) "The
Regulation of Baculovirus Gene Expression", en: The Molecular
Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); publicaciones de la
OEP nº 127 839 y 155 476; y el gen que codifica la proteína p10,
Vlak et al., (1988), J. Gen. Virol. 69:765.
El ADN que codifica secuencias señal adecuadas
puede derivarse de genes para proteínas de baculovirus o insecto
secretadas, tales como el gen de la polihedrina de baculovirus
(Carbonell et al. (1988) Gene, 73:409). Como alternativa,
dado que las señales para las modificaciones postraduccionales de
células de mamífero (tales como rotura de péptido señal, rotura
proteolítica y fosforilación) parecen reconocerse por parte de las
células de insecto, y las señales requeridas para la secreción y la
acumulación nuclear también parecen conservarse entre las células
de invertebrado y las células de vertebrado, las secuencias líder de
origen distinto de insecto, tal como los derivados de genes que
codifican el \alpha-interferón humano, Maeda et
al., (1985), Nature 315:592; el péptido de liberación de
gastrina humana, Lebacq-Verheyden et al.,
(1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; la IL-2 humana,
Smith et al., (1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82:8404; la
IL-3 de ratón, (Miyajima et al., (1987) Gene
58:273; y la glucocerebrosidasa humana, Martin et al. (1988)
ADN, 7:99, también pueden usarse para proporcionar la secreción en
insectos.
Una poliproteína o polipéptido recombinante
puede expresarse intracelularmente o, si se expresa con las
secuencias reguladoras apropiadas, puede secretarse. La buena
expresión intracelular de proteínas foráneas no fusionadas requiere
habitualmente genes heterólogos que de manera ideal tienen una
secuencia líder corta que contiene señales de iniciación de la
traducción adecuadas que preceden a una señal de iniciación ATG. Si
se desea, la metionina en el extremo N-terminal
puede romperse a partir de la proteína madura mediante incubación
in vitro con bromuro de cianógeno.
Como alternativa, las proteínas o poliproteínas
recombinantes que no se secretan de manera natural pueden
secretarse a partir de la célula de insecto creando moléculas de ADN
quiméricas que codifican un proteína de fusión compuesta por un
fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción de la
proteína foránea en insectos. El fragmento de secuencia líder
habitualmente codifica un péptido señal compuesto por aminoácidos
hidrófobos que dirigen la translocación de la proteína hacia el
interior del retículo endoplasmático.
Tras la inserción de la secuencia de ADN y/o el
gen que codifica el precursor del producto de expresión de la
proteína, se cotransforma un huésped de célula de insecto con el ADN
heterólogo del vector de transferencia y el ADN genómico de
baculovirus de tipo natural - - habitualmente mediante
cotransfección. La secuencia de terminación de la transcripción y
de promotor del constructo comprenderá habitualmente una sección de
2-5 kb del genoma de baculovirus. Los
procedimientos para introducir ADN heterólogo en el sitio deseado en
el virus de baculovirus se conocen en la técnica. (Véase Summers y
Smith citado anteriormente; Ju et al. (1987); Smith et
al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; y Luckow y Summers (1989)).
Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen tal como el gen de la
polihedrina, mediante recombinación de entrecruzamiento doble
homóloga; la inserción puede ser también en un sitio de enzima de
restricción modificado mediante ingeniería genética para dar el gen
de baculovirus
deseado.
deseado.
Miller et al., (1989), Bioessays 4:91. La
secuencia de ADN, cuando se clona en el lugar del gen de la
polihedrina en el vector de expresión, está flanqueado tanto en 5' y
3' por secuencias específicas de polihedrina y está colocado en el
sentido de 3' del promotor de la polihedrina.
El vector de expresión de baculovirus recién
formado se empaqueta posteriormente en un baculovirus recombinante
infeccioso. La recombinación homóloga se produce a baja frecuencia
(entre \sim el 1% y \sim el 5%); por tanto, la mayoría del
virus producido tras la cotransfección es todavía un virus de tipo
natural. Por tanto, es necesario un procedimiento para identificar
virus recombinantes. Una ventaja del sistema de expresión es un
examen visual que permite distinguir los virus recombinantes. La
proteína de la polihedrina, que la produce el virus nativo, se
produce a niveles muy altos en los núcleos de células infectadas en
momentos tardíos tras la infección viral. La proteína de la
polihedrina acumulada forma cuerpos de oclusión que contienen
también partículas incrustadas. Estos cuerpos de oclusión, de hasta
15 \mum de tamaño, son altamente refráctiles, dándoles un aspecto
radiante y brillante que se visualiza fácilmente bajo el microscopio
óptico. Las células infectadas con virus recombinantes carecen de
cuerpos de oclusión. Para distinguir un virus recombinante de un
virus de tipo natural, el sobrenadante de transfección se coloca en
placas sobre una monocapa de células de insecto mediante técnicas
conocidas por los expertos en la técnica. Concretamente, las placas
se examinan bajo el microscopio óptico para determinar la presencia
(indicativa de virus de tipo natural) o ausencia (indicativa de
virus recombinante) de cuerpos de oclusión. "Current Protocols in
Microbiology" vol. 2 (Ausubel et al. eds) en 16,8 (Sup.
10, 1990); Summers y Smith, citado anteriormente; Miller et
al.
(1989).
(1989).
Los vectores de expresión de baculovirus
recombinantes se han desarrollado para la infección en diversas
células de insecto. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus
recombinantes para, entre otros: Aedes aegypti,
Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila
melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia
ni (documento WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J.
Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al.,
(1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; y véase generalmente, Fraser, et
al. (1989) In vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).
Las células y los medios de cultivo celular
están disponibles comercialmente para ambas, expresión por fusión y
directa de polipéptidos heterólogos en un sistema de
expresión/baculovirus; la tecnología de cultivo celular se conoce
generalmente por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo
Summers y Smith citado anteriormente.
Las células de insecto modificadas pueden
hacerse crecer entonces en un medio nutriente apropiado, que permite
el mantenimiento estable del/de los plásmido(s) presentes en
el huésped de insecto modificado. Cuando el gen de producto de
expresión está bajo control inducible, el huésped puede crecer hasta
una alta densidad e inducirse la expresión. Como alternativa,
cuando la expresión es constitutiva, el producto se expresará de
manera continua en el medio y el medio nutriente debe hacerse
circular continuamente, mientras se retira el producto de interés y
se aumentan los nutrientes agotados. El producto puede purificarse
mediante técnicas tales como cromatografía, por ejemplo HPLC,
cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico,
etc.; electroforesis; centrifugación con gradiente de densidad;
extracción de disolvente o similares. Según sea apropiado, el
producto puede purificarse adicionalmente, según se requiera, de
modo que se retire sustancialmente cualquier proteína de insecto que
se secreta también en el medio o resulta de la lisis de células de
insecto, de modo que se proporciona un producto que está al menos
sustancialmente libre de residuo del huésped, por ejemplo proteínas,
lípidos y
polisacáridos.
polisacáridos.
Con el fin de obtener la expresión de proteínas,
se incuban células huésped recombinantes derivadas de los
transformantes en condiciones que permiten la expresión de la
secuencia que codifica proteína recombinante. Estas condiciones
variarán dependiendo de la célula huésped seleccionada. Sin embargo,
las condiciones pueden establecerse fácilmente por los expertos en
la técnica, basándose en lo que se conoce en la técnica.
Existen muchos cultivos de células vegetales y
sistemas de expresión genética vegetales completos conocidos en la
técnica. Los sistemas de expresión genética celular vegetales a modo
de ejemplo incluyen los descritos en las patentes, tales como: US
5.693.506; US 5.659.122; y US 5.608.143. Los ejemplos adicionales de
expresión genética en cultivo de células vegetales se ha descrito
por Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991). Pueden
encontrarse descripciones de péptidos señal de proteínas vegetales
además de las referencias descritas anteriormente en Vaulcombe
et al., Mol. Gen. Genet. 209:33-40 (1987);
Chandler et al., Plant Molecular Biology 3:
407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem.
260:3731-3738 (1985); Rothstein et al., Gene
55:353-356 (1987); Whittier et al., Nucleic
Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel et
al., Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu
et al., Gene 122:247-253 (1992). Una
descripción de la regulación de la expresión génica vegetal por la
fitohormona, ácido giberélico y enzimas secretadas inducidos por
ácido giberélico puede encontrarse en R.L. Jones y J. MacMillin,
Gibberellins: en: Advanced Plant Physiology,. Malcolm B. Wilkins,
ed., 1984 Pitman Publishing Limited, Londres, pág.
21-52. Las referencias que describen otros genes
regulados metabólicamente: Sheen, Plant Cell,
2:1027-1038(1990); Maas et al., EMBO
J. 9:3447-3452 (1990); Benkel y Hickey, Proc. Natl.
Acad. Sci. 84:1337-1339
(1987).
(1987).
Normalmente, usando técnicas conocidas en la
técnica, se inserta una secuencia de polinucleótidos deseada en un
casete de expresión que comprende elementos reguladores genéticos
diseñados para funcionar en vegetales. El casete de expresión se
inserta dentro de un vector de expresión deseado con secuencias de
compañía en el sentido de 5' y en el sentido de 3' a partir del
casete de expresión adecuado para la expresión en un huésped
vegetal. Las secuencias de compañía serán de origen plasmídico o
viral y proporcionarán las características necesarias al vector
para permitir que los vectores desplacen ADN desde un huésped de
clonación original, tal como bacterias, hacia el huésped vegetal
deseado. El constructo de vector vegetal/bacteriano básico
proporcionará preferiblemente una amplia gama de huéspedes de
origen de replicación procariota; un marcador seleccionable
procariota; y, para transformaciones de agrobacteria, secuencias de
ADN T para transferencia mediada por bacteria a cromosomas
vegetales. Cuando el gen heterólogo no está dispuesto fácilmente
para la detección, el constructo también tendrá preferiblemente un
gen marcador seleccionable adecuado para determinar si una célula
vegetal se ha transformado. Una revisión general de marcadores
adecuados, por ejemplo para los miembros de la familia de
herbáceas, se encuentra en Wilmink y Dons, 1993, Plant Mol. Biol.
Reptr, 11(2):165-185.
Se recomiendan también secuencias adecuadas para
permitir la integración de la secuencia heteróloga dentro del
genoma vegetal. Éstas pueden incluir secuencias de transposón y
similares para la recombinación homóloga así como secuencias de Ti
que permiten la inserción aleatoria de un casete de expresión
heterólogo dentro de un genoma vegetal. Los marcadores
seleccionables procariotas adecuados incluyen resistencia frente a
antibióticos tales como ampicilina o tetraciclina. Otras secuencias
de ADN que codifican funciones adicionales también pueden estar
presentes en el vector, según se conoce en la técnica.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
objeto pueden incluirse dentro de un casete de expresión para la
expresión de la(s) proteína(s) de interés.
Habitualmente, habrá sólo un casete de expresión, aunque dos o más
son viables. El casete de expresión recombinante contendrá además de
la secuencia que codifica proteína heteróloga los siguientes
elementos, una región de promotor, secuencias no traducidas en 5'
vegetales, codón de iniciación dependiendo de si el gen estructural
viene equipado o no con uno, y una secuencia de terminación de la
transcripción y traducción. Los sitios de enzimas de restricción
únicos en los extremos en 5' y 3' del casete permite la inserción
fácil dentro de un vector preexistente.
Una secuencia codificante heteróloga puede ser
para cualquier proteína relacionada con la presente invención. La
secuencia que codifica la proteína de interés codificará un péptido
señal que permite el procesamiento y la translocación de la
proteína, según sea apropiado, y habitualmente carecerá de cualquier
secuencia que pueda dar como resultado la unión de la proteína
deseada de la invención a una membrana. Puesto que, para la mayor
parte, la región de iniciación de la transcripción será para un gen
que se expresa y se transloca durante la germinación, empleando el
péptido señal que proporciona la translocación, también puede
proporcionarse la translocación de la proteína de interés. De este
modo, la(s) proteína(s) de interés se translocarán a
partir de las células en las que se expresan y pueden recogerse de
manera eficaz. Normalmente, la secreción en semillas es por toda la
capa del epitelio escutelar y la aleurona dentro del endospermo de
la semilla. Aunque no se requiere que la proteína se secrete a
partir de las células en las que se produce la proteína, esto
facilita el aislamiento y la purificación de la proteína
recombinante.
Puesto que la expresión final del producto
génico deseado será en una célula eucariota, es deseable determinar
si cualquier parte del gen clonado contiene secuencias que se
procesarán como intrones por la maquinaria de espliceosomas del
huésped. Si es así, puede realizarse la mutagénesis dirigida al
sitio de la región del "intrón" para evitar que se pierda una
parte del mensaje genético como un código de intrón falso, Reed y
Maniatis, Cell 41:95-105, 1985.
El vector puede microinyectarse directamente
dentro de células vegetales mediante el uso de micropipetas para
transferir mecánicamente el ADN recombinante. Crossway, Mol. Gen.
Genet, 202:179-185, 1985. El material genético
también puede transferirse dentro de la célula vegetal usando
polietilenglicol, Krens, et al., Nature, 296,
72-74, 1982. Otro procedimiento de introducción de
segmentos de ácido nucleico es la penetración balística de alta
velocidad por partículas pequeñas con el ácido nucleico dentro de la
matriz de partículas o perlas pequeñas, o bien en la superficie,
Klein, et al., Nature, 327, 70-73, 1987 y
Knudsen y Muller, 1991, Planta, 185:330-336 que
enseña el bombardeo de partículas del endospermo de cebada para
crear cebada transgénica. Aún otro procedimiento de introducción
sería la fusión de protoplastos con otras entidades, minicélulas,
células, lisosomas o bien otros cuerpos con superficie lipídica que
pueden fusionarse, Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 79, 1859-1863, 1982.
El vector también puede introducirse dentro de
células vegetales mediante electroporación. (Fromm et al.,
Proc. Natl Acad. Sci. USA 82:5824, 1985). En esta técnica, se
electroporan los protoplastos vegetales en presencia de plásmidos
que contienen el constructo del gen. Los impulsos eléctricos de alta
intensidad de campo permeabilizan de manera reversible biomembranas
lo que permite la introducción de los plásmidos. Los protoplastos
vegetales electroporados reforman la pared celular, se dividen, y
forman callos vegetales.
Todas las plantas a partir de las que pueden
aislarse y cultivarse los protoplastos para dar plantas regeneradas
completas pueden transformarse mediante la presente invención de
modo que se recuperan las plantas completas que contienen el gen
transferido. Se sabe que prácticamente todas las plantas pueden
regenerarse a partir de tejidos o células cultivados, incluyendo
pero sin limitarse a todas las especies principales de caña de
azúcar, remolacha azucarera, algodón, fruta y otros árboles,
leguminosas y vegetales. Algunas plantas adecuadas incluyen, por
ejemplo, especies de los géneros Fragaria, Lotus,
Medicago, Onobrychis, Trifolium,
Trigonella, Vigna, Citrus, Linum,
Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis,
Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa,
Capsicum, Datura, Hyoscyamus,
Lycopersion, Nicotiana, Solanum,
Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium,
Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus,
Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia,
Pelargonium, Panicum, Pennisetum,
Ranunculus, Senecio, Salpiglossis,
Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium,
Zea, Triticum, Sorghum y Datura.
Los medios para la regeneración varían entre las
especies de plantas, pero generalmente se proporciona en primer
lugar una suspensión de protoplastos transformados que contienen
copias del gen heterólogo. Se forma el tejido calloso y pueden
inducirse los brotes a partir del callo y posteriormente puede
arraigarse. Como alternativa, la formación de embriones puede
inducirse a partir de la suspensión de protoplastos. Estos embriones
germinan como embriones naturales para formar plantas. Los medios
de cultivo generalmente contendrán diversos aminoácidos y hormonas,
tales como auxina y citoquininas. Es ventajoso también añadir ácido
glutámico y prolina al medio, especialmente para especies tales
como maíz y alfalfa. Normalmente, los brotes y raíces se desarrollan
simultáneamente. La regeneración eficaz dependerá del medio, del
genotipo y de la historia del cultivo. Si se controlan estas tres
variables, entonces la regeneración puede reproducirse y repetirse
completamente.
En algunos sistemas de cultivo de células
vegetales, la proteína deseada de la invención puede excretarse o
como alternativa, la proteína puede extraerse de la planta completa.
Cuando la proteína deseada de la invención se secreta en el medio,
puede recogerse. Como alternativa, los embriones y las
semi-semillas sin embriones u otros tejidos
vegetales pueden perturbarse mecánicamente para liberar cualquier
proteína secretada entre las células y los tejidos. La mezcla puede
suspenderse en una disolución tampón para recuperar las proteínas
solubles. Los procedimientos de aislamiento y purificación de
proteínas convencionales se usarán entonces para purificar la
proteína recombinante. Se ajustarán parámetros de tiempo,
temperatura, pH, oxígeno y volúmenes mediante procedimientos
rutinarios para optimizar la expresión y la recuperación de proteína
heteróloga.
Las técnicas de expresión bacteriana se conocen
en la técnica. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN
que puede unirse a la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la
transcripción en el sentido de 3' (3') de una secuencia codificante
(por ejemplo el gen estructural) dentro de ARNm. Un promotor tendrá
una región de iniciación de la transcripción que se ubica
habitualmente de proximal con respecto al extremo en 5' de la
secuencia codificante. Esta región de iniciación de la transcripción
habitualmente incluye un sitio de unión a ARN polimerasa y un sitio
de iniciación de la transcripción. Un promotor bacteriano también
puede tener un segundo dominio denominado un operador, que puede
solapar un sitio de unión a ARN polimerasa adyacente en el que
comienza la síntesis de ARN. El operador permite la transcripción
regulada (inducible) negativa, ya que una proteína represora de gen
puede unirse al operador e inhibir de ese modo la transcripción de
un gen específico. La expresión constitutiva puede producirse en
ausencia de elementos de regulación negativa, tales como el
operador. Además, la regulación positiva puede lograrse mediante una
secuencia de unión a proteína activadora de gen, que si está
presente, se encuentra habitualmente proximal (5') con respecto a la
secuencia de unión a ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína
activadora de gen es la proteína activadora de catabolitos (CAP),
que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en
Escherichia coli (E. coli) {Raibaud et al.
(1984) Annu. Rev. Genet. 18:173}. Por tanto, la expresión regulada
puede ser positiva o bien negativa, aumentando o bien reduciendo de
ese modo la transcripción.
Las secuencias que codifican enzimas de rutas
metabólicas proporcionan secuencias de promotor particularmente
útiles. Los ejemplos incluyen secuencias de promotor derivadas de
enzimas que metabolizan azúcares, tales como galactosa, lactosa
(lac) {Chang et al. (1977) Nature 198:1056} y maltosa.
Los ejemplos adicionales incluyen secuencias de promotor derivadas
de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) {Goeddel
et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton et
al. (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; patente estadounidense
4.738.921; EP-A-0036776 y
EP-A-0121775}. El sistema de
promotor g-lactamasa (bla) {Weissmann (1981)
"The cloning of interferon and other mistakes". En Interferon
3 (ed. I. Gresser)}, sistemas de promotor bacteriófago lambda PL
{Shimatake et al. (1981) Nature 292:128} y T5 {patente
estadounidense 4.689.406} también proporcionan secuencias de
promotor
útiles.
útiles.
Además, los promotores sintéticos que no se
producen en la naturaleza también actúan como promotores
bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de la
transcripción de un promotor bacteriano o de bacteriófago pueden
unirse con las secuencias de operón de otro promotor bacteriano o de
bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético {patente
estadounidense 4.551.433}. Por ejemplo, el promotor tac es un
promotor híbrido trp-lac compuesto por ambas, las
secuencias de promotor trp y de operón lac que está
regulado por el represor lac {Amann et al. (1983)
Gene 25:167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci.
80:21}. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores que
se producen de manera natural de origen no bacteriano que tienen la
capacidad de unirse a ARN polimerasa bacteriana e iniciar la
transcripción. Un promotor que se produce de manera natural de
origen no bacteriano también puede acoplarse con una ARN polimerasa
compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes
en procariotas. El sistema ARN polimerasa de T7/promotor es un
ejemplo de un sistema de promotor acoplado {Studier et al.
(1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985) Proc Natl.
Acad. Sci. 82:1074}. Además, un promotor híbrido también puede estar
compuesto por un promotor de bacteriófago y una región de operador
de E. coli (documento EPO-A-0
267 851).
Además de una secuencia de promotor en
funcionamiento, también es útil un sitio de unión a ribosoma eficaz
para la expresión de genes foráneos en procariotas. En E.
coli, el sitio de unión a ribosoma se denomina la secuencia
Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de iniciación
(ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de
longitud ubicada 3-11 nucleótidos en el sentido de
5' del codón de iniciación {Shine et al. (1975) Nature
254:34}. Se cree que la secuencia SD promueve la unión de ARNm al
ribosoma mediante el apareamiento de bases entre la secuencia SD y
el extremo 3' de ARNr 16S de E. coli {Steitz et al.
(1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger
RNA". En Biological Regulation and Development: Gene Expression
(ed. R.F. Goldberger)}, para expresar genes eucariotas y genes
procariotas con sitio de unión a ribosoma débil {Sambrook et
al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia
coli". En Molecular Cloning: A Laboratory Manual}.
Una molécula de ADN puede expresarse
intracelularmente. Una secuencia de promotor puede ligarse
directamente con la molécula de ADN, caso en el que el primer
aminoácido en el extremo N-terminal será siempre una
metionina, que está codificada por el codón de iniciación ATG. Si
se desea, la metionina en el extremo N-terminal
puede romperse de la proteína mediante incubación in vitro
con bromuro de cianógeno o mediante incubación in vivo o
bien in vitro con una metionina N-terminal
peptidasa bacteriana (documento
EPO-A-0 219 237).
Las proteínas de fusión proporcionan una
alternativa para dirigir la expresión. Habitualmente, una secuencia
de ADN que codifica la parte N-terminal de una
proteína bacteriana endógena, u otra proteína estable, se fusiona
al extremo 5' de las secuencias codificantes heterólogas. Tras la
expresión, este constructo proporcionará una fusión de las dos
secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen de célula de
bacteriófago lambda puede ligarse en el extremo 5' terminal de un
gen foráneo y expresarse en bacterias. La proteína de fusión
resultante conserva preferiblemente un sitio para una enzima de
procesamiento (factor Xa) para romper la proteína de bacteriófago
del gen foráneo {Nagai et al. (1984) Nature 309:810}. Las
proteínas de fusión también pueden prepararse con secuencias a
partir de los genes lacZ {Jia et al. (1987) Gene
60:197}, trpE {Allen et al. (1987) J. Biotechnol.
5:93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Microbiol. 135:11}, y Chey
{documento EP-A-0 324 647}. La
secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos
puede o no codificar un sitio que puede romperse. Otro ejemplo es
una proteína de fusión de ubiquitina. Una proteína de fusión de
este tipo se prepara con la región de ubiquitina que conserva
preferiblemente un sitio para una enzima de procesamiento (por
ejemplo proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para
romper la ubiquitina de la proteína foránea. Mediante este
procedimiento, puede aislarse la proteína foránea {Miller et
al. (1989) BiolTechnology 7:698}.
Como alternativa, las proteínas foráneas también
pueden secretarse a partir de la célula creando moléculas de ADN
quiméricas que codifican una proteína de fusión compuesta por un
fragmento de secuencia de péptido señal que proporciona la
secreción de la proteína foránea en bacterias {patente
estadounidense 4.336.336}. El fragmento de secuencia señal
habitualmente codifica un péptido señal compuesto por aminoácidos
hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína a partir de la
célula. La proteína se secreta en los medios de crecimiento
(bacterias Gram positivas) o bien en el espacio periplásmico,
ubicado entre la membrana interna y externa de la célula (bacterias
Gram negativas). Preferiblemente existen sitios de procesamiento,
que pueden romperse in vivo o bien in vitro
codificados entre el fragmento de péptido señal y el gen
foráneo.
El ADN que codifica las secuencias señal
adecuadas puede derivarse de genes para dar proteínas bacterianas
secretadas, tales como el gen de la proteína de membrana externa de
E. coli (ompA) {Masui et al. (1983), en:
Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al.
(1984) EMBO J. 3:2437} y la secuencia señal de fosfatasa alcalina
de E. coli (phoA) {Oka et al. (1985) Proc.
Natl. Acad. Sci. 82:7212}. Como ejemplo adicional, la secuencia
señal del gen de alfa-amilasa de diversas cepas de
Bacillus puede usarse para secretar proteínas heterólogas a partir
de B. subtilis {Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 79:5582; documento EP-A-0
244 042}.
Habitualmente, las secuencias de terminación de
la transcripción reconocidas por bacterias son regiones reguladoras
ubicadas en 3' con respecto al codón de terminación de la
traducción, y por tanto junto con el promotor flanquean la
secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de
un ARNm que puede traducirse en el polipéptido codificado por el
ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen
frecuentemente secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos
que pueden formar estructuras de bucle tallo que ayudan para
terminar la transcripción. Los ejemplos incluyen secuencias de
terminación de la transcripción derivadas de los genes con
promotores fuertes, tales como el gen trp en E.coli
así como otros genes biosintéticos.
Habitualmente, los componentes descritos
anteriormente, que comprenden un promotor, una secuencia señal (si
se desea), la secuencia codificante de interés y la secuencia de
terminación de la transcripción, se colocan juntos en constructos
de expresión. Los constructos de expresión a menudo se mantienen en
un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo,
plásmidos) que pueden mantenerse de manera estable en un huésped,
tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación,
permitiendo así que se mantenga en un huésped procariota para la
expresión o bien para la clonación y la amplificación. Además, un
replicón puede ser un plásmido con un número de copias alto o bien
bajo. Un plásmido con número de copias alto generalmente tendrá un
número de copias que oscila entre aproximadamente 5 y
aproximadamente 200, y habitualmente de aproximadamente 10 a
aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido con número
de copias alto preferiblemente contendrá al menos aproximadamente
10, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20 plásmidos.
Puede seleccionarse un vector con número de copias alto o bien
bajo, dependiendo del efecto del vector y de la proteína foránea en
el huésped.
Como alternativa, los constructos de expresión
pueden integrarse en el genoma bacteriano con un vector de
integración. Los vectores de integración habitualmente contienen al
menos una secuencia homóloga al cromosoma bacteriano que permite
que se integre el vector. Las integraciones parecen resultar de las
recombinaciones entre el ADN homólogo en el vector y el cromosoma
bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos
con ADN de diversas cepas de Bacillus se integran en el
cromosoma de Bacillus (documento EP-A- 0 127
328). Los vectores de integración también pueden comprender
secuencias de bacteriófago o transposón.
Habitualmente, los constructos de expresión de
integración y extracromosómicos pueden contener marcadores
seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que
se han transformado. Los marcadores seleccionables pueden
expresarse en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que
producen bacterias resistentes a fármacos tales como ampicilina,
cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina) y tetraciclina
{Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469}. Los
marcadores seleccionables también pueden incluir genes
biosintéticos, tales como los de las rutas biosintéticas de la
histidina, triptófano y leucina.
Como alternativa, algunos de los componentes
descritos anteriormente pueden colocarse juntos en vectores de
transformación. Los vectores de transformación están compuestos
habitualmente por un marcador seleccionable que se mantiene en un
replicón o bien se desarrolla en un vector de integración, tal como
se describió anteriormente.
Se han desarrollado vectores de transformación y
expresión, replicones extracromosómicos o bien vectores de
integración, para la transformación en muchas bacterias. Por
ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para, entre
otras, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis {Palva
et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; documentos
EP-A-0 036 259 y EPA- 0 063 953;
documento WO 84/04541}, Escherichia coli {Shimatake et
al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:
183; Studier et al. (1986) J. Mod. Biol. 189:113; documentos
EP-A-0 036 776,
EP-A-0 136 829 y
EP-A-0 136 907}, Streptococcus
cremoris {Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbial.
54:655}; Streptococcus lividans {Powell et al. (1988)
Appl. Environ. Microbiol. 54:655}, Streptomyces lividans
{patente estadounidense 4.745.056}.
Los métodos para introducir ADN exógeno en
huéspedes bacterianos se conocen bien en la técnica, y habitualmente
incluyen la transformación de las bacterias tratadas con CaCl_{2}
o bien otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. El ADN
también puede introducirse en las células bacterianas mediante
electroporación. Los procedimientos de transformación habitualmente
varían con las especies de bacterias que van a transformarse.
Véanse por ejemplo, {Masson et al. (1989) FEMS Microbiol.
Lett. 60:273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
79:5582; documentos EP-A-0 036 259 y
EP-A-0 063 953; documento WO
84/04541, Bacillus}, {Miller et al. (1988) Proc.
Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol.
172:949, Campylobacter}, {Cohen et al. (1973) Proc.
Natl. Acad. Sci. 69: 2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids
Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for
transformation of Escherichia coli with
ColE1-derived plasmids". En Genetic Engineering:
Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering
(eds. H.W. Boyer y S. Nicosia); Mandel et al. (1970) J. Mol.
Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318;
Escherichia}, {Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol.
Lett. 44:173 Lactobacillus}; {Fiedler et al. (1988) Anal.
Biochem 170:38, Pseudomonas}; {Augustin et al. (1990)
FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus}, {Barany et
al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987)
"Transformation of Streptococcus lactis by
electroporation", en: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti y
R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun. 32:1295;
Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655;
Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology
1:412, Streptococcus}.
Los sistemas de expresión en levaduras también
se conocen por el experto en la técnica. Un promotor de levadura es
cualquier secuencia de ADN que puede unirse a ARN polimerasa de
levadura e iniciar la transcripción en el sentido de 3' de una
secuencia codificante (por ejemplo, gen estructural) en el ARNm. Un
promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que
habitualmente está situada próxima al extremo 5' de la secuencia
codificante. Esta región de iniciación de la transcripción
habitualmente incluye un sitio de unión a la ARN polimerasa (la
"caja TATA") y un sitio de iniciación de la transcripción. Un
promotor de levadura también puede tener un segundo dominio
denominado una secuencia activadora en el sentido de 5' (UAS), que,
si está presente, habitualmente es distal al gen estructural. La
UAS permite la expresión regulada (inducible). La expresión
constitutiva se produce en ausencia de una UAS. La expresión
regulada puede ser positiva o bien negativa, aumentando o bien
reduciendo de esta manera la transcripción.
La levadura es un microorganismo de fermentación
con ruta metabólica activa, por lo que las secuencias que codifican
enzimas en la ruta metabólica proporcionan secuencias de promotor
particularmente útiles. Los ejemplos incluyen alcohol
deshidrogenasa (ADH) (documento
EP-A-0 284 044), enolasa,
glucoquinasa, glucosa-6-fosfatasa,
isomerasa,
gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa
(GAP o GAPDH), hexoquinasa, fosfofructoquinasa,
3-fosfoglicerato mutasa y piruvato quinasa (PyK)
(documento EPO-A- 0 329 203). El gen PHO5 de
levadura, que codifica la fosfatasa ácida, también proporciona
secuencias de promotor útiles {Myanohara et al. (1983) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80:1}.
Además, los promotores sintéticos que no se
producen en la naturaleza también funcionan como promotores de
levadura. Por ejemplo, las secuencias UAS de un promotor de levadura
pueden unirse con la región de activación de la transcripción de
otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético.
Los ejemplos de tales promotores híbridos incluyen la secuencia
reguladora de ADH unida a la región de activación de la
transcripción de GAP (patentes estadounidenses números 4.876.197 y
4.880.734). Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen
promotores que están constituidos por secuencias reguladoras de los
genes ADH2, GAL4, GAL10, o PHO5, combinadas con la
región de activación de la transcripción de un gen de enzima
glicolítica tal como GAP o PyK (documento
EP-A-0 164 556). Además, un promotor
de levadura puede incluir promotores que se producen de manera
natural de origen distinto a levaduras que tienen la capacidad de
unirse a la ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción.
Los ejemplos de tales promotores incluyen, entre otros, {Cohen et
al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1078; Henikoff et
al. (1981) Nature 283:835; Hollenberg et al. (1981)
Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg et al.
(1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes
in the Yeast Saccharomyces cerevisiae", en: Plasmids of
Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis
y A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980)
Gene 11:163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet.
2:109;}.
Una molécula de ADN puede expresarse
intracelularmente en levaduras. Una secuencia de promotor puede
unirse directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer
aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína
recombinante siempre será una metionina, que se codifica por el
codón de iniciación ATG. Si se desea, la metionina en el extremo
N-terminal puede romperse de la proteína mediante
incubación in vitro con bromuro de cianógeno.
Las proteínas de fusión proporcionan una
alternativa para los sistemas de expresión en levaduras, así como
en sistemas de expresión de mamíferos, baculovirus y bacterias.
Habitualmente, se fusiona una secuencia de ADN que codifica la
parte N-terminal de una proteína de levadura
endógena, u otra proteína estable, con el extremo 5' de secuencias
codificantes heterólogas. Con la expresión, este constructo
proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por
ejemplo, el gen de la superóxido dismutasa (SOD) de levadura o ser
humano, puede unirse en el extremo terminal 5' de un gen foráneo y
expresarse en levaduras. La secuencia de ADN en la unión de las dos
secuencias de aminoácidos puede codificar o no un sitio que puede
romperse. Véase, por ejemplo, el documento
EP-A-0 196 056. Otro ejemplo es una
proteína de fusión a ubiquitina. Una proteína de fusión de este
tipo se obtiene con la región de ubiquitina que conserva
preferiblemente un sitio para una enzima de procesamiento (por
ejemplo, proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para
romper la ubiquitina de la proteína foránea. Por tanto, mediante
este procedimiento, puede aislarse proteína foránea nativa (por
ejemplo, documento WO88/024066).
Como alternativa, también pueden secretarse
proteínas foráneas de la célula hacia el medio de crecimiento
creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de
fusión que comprende un fragmento de secuencia líder que
proporciona la secreción en levaduras de la proteína foránea.
Preferiblemente, hay sitios de procesamiento codificados entre el
fragmento líder y el gen foráneo que pueden romperse in vivo
o bien in vitro. El fragmento de secuencia líder
habitualmente codifica un péptido señal compuesto por aminoácidos
hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína desde la
célula.
El ADN que codifica secuencias señal adecuadas
puede derivarse de genes para proteínas de levadura secretadas,
tales como los genes para invertasa (documentos
EP-A-0012873; JPO 62.096.086) y
factor A (patente estadounidense 4.588.684). Como alternativa, las
secuencias líder de salida de origen de levadura, tal como una
secuencia líder de interferón, también proporcionan secreción en
levaduras (documento
EP-A-0060057).
Una clase preferida de secuencias líderes de
secreción son aquellas que emplean un fragmento del gen del factor
alfa de levaduras, que contiene ambas una "pre"-secuencia señal
y una "pro"-región. Los tipos de fragmentos de factor alfa que
pueden emplearse incluyen la secuencia líder del factor alfa
pre-pro de longitud completa (aproximadamente 83
residuos de aminoácidos) así como las secuencias líder del factor
alfa truncadas (habitualmente de aproximadamente 25 a
aproximadamente 50 residuos de aminoácidos) (patentes
estadounidenses 4.546.083 y 4.870.008; documento
EP-A-0 324 274). Las secuencias
líder adicionales que emplean un fragmento líder del factor alfa
que proporciona secreción incluyen secuencias líder del factor alfa
híbridas obtenidas con una pre-secuencia de una
primera levadura, pero una pro-región de un segundo
factor alfa de levadura. (Por ejemplo, véase el documento WO
89/02463.)
Habitualmente, las secuencias de terminación de
la transcripción reconocidas por levaduras son regiones reguladoras
situadas en la posición 3' con respecto al codón de terminación de
la traducción y, por tanto, junto con el promotor flanquean la
secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de
un ARNm que puede traducirse en el polipéptido codificado por el
ADN. Los ejemplos de la secuencia de terminación de la transcripción
y de otras secuencias de terminación reconocidas por levaduras,
tales como las que codifican enzimas glicolíticas.
Habitualmente, los componentes descritos
anteriormente, que comprenden un promotor, secuencia líder (si se
desea), secuencia codificante de interés y secuencia de terminación
de la transcripción, se colocan juntos en constructos de expresión.
Los constructos de expresión a menudo se mantienen en un replicón,
tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) que
puede lograr el mantenimiento estable en un huésped, tal como una
levadura o bacteria. El replicón puede tener dos sistemas de
replicación, permitiendo así mantenerse, por ejemplo, en levaduras
para la expresión y en un huésped procariota para la clonación y la
amplificación. Los ejemplos de tales vectores lanzadera de
levaduras-bacterias incluyen YEp24 {Botstein et
al. (1979) Gene 8:17-24}, pCl/1 {Brake et
al. (1984) Proc. Natl. Acad Sci USA
81:4642-4646} y YRpl7 {Stinchcomb et al.
(1982) J. Mol. Biol. 158:157}. Además, un replicón puede ser un
plásmido con número de copias alto o bien bajo. Un plásmido con
número de copias alto generalmente tendrá un número de copias que
oscila desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 200, y
habitualmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un
huésped que contiene un plásmido con número de copias alto
preferiblemente tendrá al menos aproximadamente 10, y más
preferiblemente al menos aproximadamente 20. Puede seleccionarse
introducir un vector con número de copias alto o bajo dependiendo
del efecto del vector y de la proteína foránea en el huésped. Véase
por ejemplo, Brake et al., citado anteriormente.
Como alternativa, los constructos de expresión
pueden integrarse en el genoma de levadura con un vector de
integración. Los vectores de integración habitualmente contienen al
menos una secuencia homóloga a un cromosoma de levadura para
permitir integrar el vector, y preferiblemente contienen dos
secuencias homólogas que flanquean el constructo de expresión. La
integración parece resultar de las recombinaciones entre el ADN
homólogo en el vector y el cromosoma de levadura
{Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol.
101:228-245}. Un vector de integración puede
dirigirse a un locus específico en la levadura seleccionando la
secuencia homóloga apropiada para la inclusión en el vector. Véase
Orr-Weaver et al., citado anteriormente.
Pueden integrarse uno o más constructos de expresión, afectando
posiblemente a los niveles de proteína recombinante producidos {Rine
et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6750}. Las
secuencias cromosómicas incluidas en el vector pueden producirse
como un único segmento en el vector, lo que da como resultado la
integración de todo el vector, o bien como dos segmentos homólogos
a segmentos adyacentes en el cromosoma y que flanquean el constructo
de expresión en el vector, lo que puede dar como resultado la
integración estable sólo del constructo de expresión.
Habitualmente, los constructos de expresión de
integración y extracromosómicos pueden contener marcadores
seleccionables para permitir la selección de las cepas de levadura
que se han transformado. Los marcadores seleccionables pueden
incluir genes biosintéticos que pueden expresarse en el huésped de
levadura, tales como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 y ALG7, y
el gen de resistencia G418, que confiere resistencia en
células de levadura a tunicamicina y G418, respectivamente.
Además, un marcador seleccionable adecuado también puede
proporcionar levaduras con la capacidad de crecer en presencia de
compuestos tóxicos, tales como metal. Por ejemplo, la presencia de
CUP1 permite que la levadura crezca en presencia de iones
cobre {Butt et al. (1987) Microbiol, Rev. 51:351}.
Como alternativa, pueden colocarse juntos
algunos de los componentes descritos anteriormente en vectores de
transformación. Los vectores de transformación normalmente
comprenden un marcador seleccionable que se mantiene en un replicón
o se desarrolla en un vector de integración, tal como se describió
anteriormente.
Se han desarrollado vectores de expresión y
transformación, los replicones extracromosómicos o bien los vectores
de integración, para la transformación en muchas levaduras. Por
ejemplo, se han desarrollado vectores expresión para, entre otras,
las siguientes levaduras: Candida albicans {Kurtz, et
al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142}, Candida maltosa
{Kunze, et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141}.
Hansenula polymorpha {Gleeson, et al. (1986) J. Gen.
Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen.
Genet. 202:302}, Kluyveromyces fragilis {Das, et al.
(1984) J. Bacteriol. 158:1165}, Kluyveromyces lactis {De
Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:737; Van den
Berg et al. (1990) BiolTechnology 8:135}, Pichia
guillerimondii {Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol.
25:141}, Pichia pastoris {Cregg, et al. (1985) Mol.
Cell. Biol. 5: 3376; patentes estadounidenses números 4.837.148 y
4.929.555}, Saccharomyces cerevisiae {Hinnen et al.
(1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al. (1983)
J. Bacteriol. 153:163}, Schizosaccharomyces pombe {Beach y
Nurse (1981) Nature 300:706} y Yarrowia lipolytica {Davidow,
et al. (1985) Curr. Genet. 10:380471 Gaillardin, et
al. (1985) Curr. Genet. 10:49}.
Los procedimientos para introducir ADN exógeno
en huéspedes de levaduras se conocen bien en la técnica, y
habitualmente incluyen la transformación de esferoplastos o bien de
células de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. Los
procedimientos de transformación habitualmente varían con las
especies de levadura que van a transformarse. Véanse por ejemplo,
{Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze et
al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Candida};
{Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459;
Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302;
Hansenula}; {Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165;
De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den
Berg et al. (1990) BiolTechnology 8:135;
Kluyveromyces}; {Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol.
5: 3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141;
patentes estadounidenses 4.837.148 y 4.929.555; Pichia};
{Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75;1929;
Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163
Saccharomyces}; {Beach & Nurse (1981) Nature 300:706;
Schizosaccharomyces}; {Davidow et al. (1985) Curr.
Genet. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49;
Yarrowia}.
Las composiciones farmacéuticas pueden
comprender polipéptidos y/o el ácido nucleico de la invención. Las
composiciones farmacéuticas comprenderán una cantidad
terapéuticamente eficaz de polipéptidos, anticuerpos o bien
polinucleótidos de la invención reivindicada.
La expresión "cantidad terapéuticamente
eficaz" tal como se usa en el presente documento se refiere a una
cantidad de un agente terapéutico para tratar, mejorar o prevenir
una enfermedad o afección deseada, o para mostrar un efecto
terapéutico o preventivo detectable. El efecto puede detectarse
mediante, por ejemplo, niveles de antígeno o marcadores químicos.
Los efectos terapéuticos también incluyen reducción en síntomas
físicos, tales como disminución de la temperatura corporal. La
cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá del tamaño y la
salud del sujeto, de la naturaleza y el grado de la afección, y de
los agentes terapéuticos o la combinación de agentes terapéuticos
seleccionados para su administración. Por tanto, no resulta útil
especificar una cantidad eficaz exacta de antemano. Sin embargo,
puede determinarse la cantidad eficaz para una situación dada
mediante experimentación de rutina y depende del criterio del
médico.
Para los fines de la presente invención, una
dosis eficaz será desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta 50 mg/kg o
de 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de los constructos de ADN
en el individuo al que se administran.
Una composición farmacéutica también puede
contener un portador farmacéuticamente aceptable. La expresión
"portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador
para la administración de un agente terapéutico, tal como
anticuerpos o un polipéptido, genes y otros agentes terapéuticos. La
expresión se refiere a cualquier portador farmacéutico que por sí
mismo no induce la producción de anticuerpos dañinos para el
individuo que recibe la composición, y que puede administrarse sin
toxicidad excesiva. Los portadores adecuados pueden ser grandes
macromoléculas metabolizadas lentamente, tal como proteínas,
polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos),
aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de
virus inactivos. Tales portadores se conocen bien por los expertos
en la técnica.
Pueden usarse en ellas sales farmacéuticamente
aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como
clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las
sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos,
malonatos, benzoatos y similares. Una discusión rigurosa de los
excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en
Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
Los portadores farmacéuticamente aceptables en
las composiciones terapéuticas pueden contener líquidos tales como
agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, pueden
estar presentes en tales vehículos sustancias auxiliares, tales
como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes de
pH y similares. Normalmente, las composiciones terapéuticas se
preparan como inyectables, como disoluciones líquidas o bien como
suspensiones; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas
para disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la
inyección. Los liposomas están incluidos dentro de la definición de
un portador farmacéuticamente aceptable.
Una vez formuladas, las composiciones de la
invención pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos
que van a tratarse pueden ser animales; en particular, pueden
tratarse sujetos humanos.
La administración directa de las composiciones
se llevará a cabo generalmente mediante inyección, por vía
subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o bien intramuscular o se
administrarán en el espacio intersticial de un tejido. Las
composiciones también pueden administrarse en una lesión. Otros
modos de administración incluyen la administración oral y pulmonar,
supositorios y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas (por
ejemplo, véase el documento WO98/20734), agujas y pistolas génicas o
inyectores a presión ("hyposprays"). El tratamiento de
dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de
múltiples dosis.
Las vacunas según la invención pueden ser
profilácticas (es decir, para prevenir una infección) o bien
terapéuticas (es decir, para tratar una enfermedad tras una
infección).
Tales vacunas comprenden antígeno(s),
inmunógeno(s), polipéptido(s), proteína(s) o
ácido nucleico de inmunización, habitualmente en combinación con
"portadores farmacéuticamente aceptables", que incluyen
cualquier vehículo que por sí mismo no induce la producción de
anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición.
Los portadores adecuados normalmente son grandes macromoléculas
metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos,
poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos
poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tales
como gotitas de aceite o liposomas) y partículas de virus inactivos.
Tales portadores se conocen bien por los expertos en la técnica.
Adicionalmente, estos portadores pueden funcionar como agentes
inmunoestimuladores ("adyuvantes"). Además, el antígeno o el
inmunógeno pueden conjugarse con un toxoide bacteriano, tal como un
toxoide de patógenos de difteria, tétanos, cólera, H. pylori,
etc.
Los adyuvantes preferidos para mejorar la
eficacia de la composición incluyen, pero no se limitan a: (1) sales
de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de
aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsión
de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimuladores
específicos, tales como péptidos de muramilo (véase más adelante) o
componentes de la pared celular bacteriana), tales como por ejemplo
(a) MF59^{TM} (documento WO 90/14837; capítulo 10 en Vaccine
design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell &
Newman, Plenum Press 1995), que contiene un 5% de escualeno, un 0,5%
de Tween 80 y un 0,5% de Span 85 (conteniendo opcionalmente
diversas cantidades de MTP-PE (véase más adelante),
aunque no se requiere) formulado en partículas de submicrómetros
que usan un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo
110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene un 10% de
escualeno, un 0,4% de Tween 80, un 5% de polímero de bloque con
Pluronic L121 y thr-MDP (véase más adelante)
microfluidizado en una emulsión de submicrómetros o bien agitado
con vórtex para generar una emulsión de tamaño de partícula mayor, y
(c) el sistema adyuvante Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Immunochem,
Hamilton, MT) que contiene un 2% de escualeno, un 0,2% de Tween 80 y
uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo
constituido por monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de
trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS), preferiblemente
MPL + CWS (Detox^{TM}); (3) pueden usarse adyuvantes de saponina,
tales como Stimulon^{TM} (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o
partículas generadas a partir de los mismos, tales como ISCOM
(complejos inmunoestimuladores); (4) adyuvante completo de Freund
(CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (5) citocinas, tales
como interleucinas (por ejemplo, IL-1,
IL-2, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-12,
etc.), interferones (por ejemplo, interferón gamma), factor
estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF),
factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; y (6) otras sustancias que
actúan como agentes inmunoestimuladores para mejorar la eficacia de
la composición. Se prefieren el alumbre y MF59^{TM}.
Tal como se ha mencionado anteriormente, los
péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a,
N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina
(thr-MDP),
N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina
(nor-MDP),
N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina
(MTP-PE), etc.
Las composiciones inmunogénicas (por ejemplo, el
antígeno/inmunógeno/polipéptido/proteína/ácido nucleico, portador
farmacéuticamente aceptable y adyuvante de inmunización) normalmente
contendrán diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol,
etanol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes en tales
vehículos sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o
emulsionantes, sustancias tamponantes de pH y similares.
Normalmente, las composiciones inmunogénicas se
preparan como inyectables, como disoluciones líquidas o bien como
suspensiones; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas
para disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la
inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse
en liposomas para un efecto de adyuvante mejorado, tal como se
trató anteriormente en portadores farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones inmunogénicas usadas como
vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de los
polipéptidos antigénicos o inmunogénicos, así como cualquier otro de
los componentes mencionados anteriormente, según sea necesario. Por
"cantidad inmunológicamente eficaz" se quiere decir que la
administración de esa cantidad a un individuo, en una dosis única o
bien como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la
prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y el estado
físico del individuo que va a tratarse, del grupo taxonómico del
individuo que va a tratarse (por ejemplo, primate no humano,
primate, etc.), de la capacidad del sistema inmunitario del
individuo para sintetizar anticuerpos, del grado de protección
deseado, de la formulación de la vacuna, de la evaluación de la
situación médica por parte del médico encargado y de otros factores
relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo
relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos de
rutina.
Las composiciones inmunogénicas se administran
convencionalmente por vía parenteral, por ejemplo, mediante
inyección, por vía subcutánea, intramuscular o bien
transdérmica/transcutánea (por ejemplo, documento WO98/20734). Las
formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de
administración incluyen formulaciones orales y pulmonares,
supositorios y aplicaciones transdérmicas. El tratamiento de
dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de
múltiples dosis. La vacuna puede administrarse junto con otros
agentes inmunorreguladores.
Como alternativa a las vacunas a base de
proteínas, puede emplearse la vacunación con ADN {por ejemplo,
Robinson y Torres (1997) Seminars in Immunology
9:271-283; Donnelly et al. (1997) Annu Rev
Immunol 15:617-648; véase más adelante en el
presente documento}.
Los vehículos de terapia génica para la
administración de constructos que incluyen una secuencia codificante
de un agente terapéutico de la invención, que van a administrarse
al mamífero para su expresión en el mamífero, pueden administrarse
local o bien sistémicamente. Estos constructos pueden utilizar
enfoques de vectores virales o no virales en una modalidad in
vivo o ex vivo. La expresión de una secuencia codificante
de este tipo puede inducirse usando promotores heterólogos o de
mamífero endógenos. La expresión de la secuencia codificante in
vivo puede ser constitutiva o bien estar regulada.
La invención incluye vehículos para
administración génica que pueden expresar las secuencias de ácido
nucleico contempladas. El vehículo para administración génica es
preferiblemente un vector viral y, más preferiblemente, un vector
de retrovirus, de adenovirus, de virus adenoasociados (AAV), de
virus herpes o de alfavirus. El vector viral también puede ser un
vector viral de astrovirus, coronavirus, ortomixovirus, papovavirus,
paramixovirus, parvovirus, picornavirus, poxvirus o togavirus.
Véase generalmente, Jolly (1994) Cancer Gene Therapy
1:51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy
5:845-852; Connelly (1995) Human Gene Therapy
6:185-193; y Kaplitt (1994) Nature Genetics
6:148-153.
Los vectores retrovirales se conocen bien en la
técnica y se contempla que en la invención puede emplearse
cualquier vector retroviral de terapia génica, incluyendo retrovirus
de tipo B, C y D, retrovirus xenotrópicos (por ejemplo,
NZB-X1, NZB-X2 y
NZB9-1 (véase O'Neill (1985) J. Virol. 53:160),
retrovirus politrópicos por ejemplo, MCF y MCF-MLV
(véase Kelly (1983) J. Virol. 45:291), espumavirus y lentivirus.
Véase RNA Tumor Viruses, segunda edición, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1985.
Las partes del vector retroviral de terapia
génica pueden derivarse de diferentes retrovirus. Por ejemplo, las
LTR de retrovectores pueden derivarse del virus del sarcoma murino,
un sitio de unión al ARNt del virus del sarcoma de Rous, una señal
de empaquetamiento de un virus de la leucemia murina y un origen de
síntesis de segunda cadena de un virus de la leucosis aviar.
Estos vectores retrovirales recombinantes pueden
usarse para generar partículas de vector retroviral competentes
para la transducción introduciéndoles en líneas celulares de
empaquetamiento adecuadas (véase la patente estadounidense
5.591.624). Los vectores de retrovirus pueden construirse para su
integración específica de sitio en el ADN de la célula huésped
mediante la incorporación de una enzima integrasa quimérica en la
partícula retroviral (véase el documento WO96/37626). Es preferible
que el vector viral recombinante sea un virus recombinante con
replicación defectuosa.
Las líneas celulares de empaquetamiento
adecuadas para su uso con los vectores de retrovirus descritos
anteriormente se conocen bien en la técnica, se preparan fácilmente
(véanse los documentos WO95/30763 y WO92/05266) y pueden usarse
para crear líneas celulares productoras (también denominadas líneas
celulares de vector o "VCL") para la producción de partículas
de vector recombinantes. Preferiblemente, las líneas celulares de
empaquetamiento se preparan a partir de células parentales humanas
(por ejemplo, células HT1080) o líneas celulares parentales de
visón, lo que elimina la inactivación en el suero humano.
Los retrovirus preferidos para la construcción
de vectores retrovirales de terapia génica incluyen virus de la
leucosis aviar, virus de la leucemia bovina, virus de la leucemia
murina, virus inductores de focos en células de visón, virus del
sarcoma murino, virus de la reticuloendoteliosis y virus del sarcoma
de Rous. Los virus de la leucemia murina particularmente preferidos
incluyen el virus de la leucemia murina de Moloney (ATCC Nº
VR-190) y Rauscher (ATCC Nº VR-998),
virus del sarcoma de Harvey, Kirsten, Gross, Graffi (ATCC Nº
VR-590), Friend (ATCC Nº VR-245),
Abelson (ATCC Nº VR-999), 4070A y 1504A (Hartley y
Rowe (1976) J Virol 19:19-25). Tales retrovirus
pueden obtenerse de depositarios o colecciones tales como la
Colección Americana de Cultivos Tipo ("ATCC") en Rockville,
Maryland o aislarse de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente
disponibles.
Los vectores retrovirales de terapia génica
conocidos a modo de ejemplo que pueden emplearse en esta invención
incluyen los descritos en las solicitudes de patente GB2200651,
EP0415731, EP0345242, EP0334301, WO89/02468; WO89/05349,
WO89/09271, WO90/02806, WO90/07936, WO94/03622, WO93/25698,
WO93/25234, WO93/11230, WO93/10218, WO91/02805, WO91/02825,
WO95/07994, US 5.219.740, US 4.405.712, US 4.861.719, US 4.980.289,
US 4.777.127, US 5.591.624. Véanse también Vile (1993) Cancer Res
53:3860-3864; Vile (1993) Cancer Res
53:962-967; Ram (1993) Cancer Res 53 (1993)
83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res
33:493-503; Baba (1993) J Neurosurg
79:729-735; Mann (1983) Cell 33:153; Cane (1984)
Proc Natl Acad Sci 81:6349; y Miller (1990) Human Gene Therapy
1.
Los vectores adenovirales humanos de terapia
génica también se conocen en la técnica y pueden emplearse en esta
invención. Véanse, por ejemplo, Berkner (1988) Biotechniques 6:616 y
Rosenfeld (1991) Science 252:431, y los documentos WO93/07283,
WO93/06223 y WO93/07282. Los vectores adenovirales de terapia génica
conocidos a modo de ejemplo que pueden emplearse en esta invención
incluyen los descritos en los documentos de referencia anteriores y
en los documentos WO94/12649, WO93/03769, WO93/19191, WO94/28938,
WO95/11984, WO95/00655, WO95/27071, WO95/29993, WO95/34671,
WO96/05320, WO94/08026, WO94/11506, WO93/06223, WO94/24299,
WO95/14102, WO95/24297, WO95/02697, WO94/28152, WO94/24299,
WO95/09241, WO95/25807, WO95/05835, WO94/18922 y WO95/09654. Como
alternativa, puede emplearse la administración de ADN unido a
adenovirus inactivado tal como se describe en Curiel (1992) Hum.
Gene Ther. 3:147-154. Los vehículos para
administración génica de la invención también incluyen vectores de
virus adenoasociados (AAV). Los ejemplos destacados y preferidos de
tales vectores para su uso en esta invención son los vectores
basados en AAV-2 dados a conocer en Srivastava,
documento WO93/09239. Los vectores de AAV más preferidos comprenden
las dos repeticiones terminales invertidas de AAV en las que las
secuencias D nativas están modificadas mediante la sustitución de
nucleótidos, de manera que se conserven al menos 5 nucleótidos
nativos y hasta 18 nucleótidos nativos, preferiblemente al menos 10
nucleótidos nativos y hasta 18 nucleótidos nativos, lo más
preferiblemente se retengan 10 nucleótidos nativos y se eliminen o
se sustituyan los nucleótidos restantes de la secuencia D por
nucleótidos no nativos. Las secuencias D nativas de las repeticiones
terminales invertidas de AAV son secuencias de 20 nucleótidos
consecutivos en cada repetición terminal invertida de AAV (es
decir, hay una secuencia en cada extremo) que no están implicados en
la formación de HP. El nucleótido de sustitución no nativo puede
ser cualquier nucleótido distinto del nucleótido encontrado en la
secuencia D nativa en la misma posición. Otros vectores de AAV a
modo de ejemplo que pueden emplearse son pWP-19,
pWN-1, dándose a conocer ambos en Nahreini (1993)
Gene 124:257-262. Otro ejemplo de un vector de AAV
de este tipo es psub201 (véase Samulski (1987) J. Virol. 61:3096).
Otro vector de AAV a modo de ejemplo es el vector de IRT
doble-D. La construcción del vector de ITR
doble-D se da a conocer en la patente estadounidense
5.478.745. Todavía otros vectores son los dados a conocer en la
patente estadounidense de Carter 4.797.368 y en la patente
estadounidense de Muzyczka 5,139,941, la patente estadounidense de
Chartejee 5.474.935 y el documento WO94/288157 de Kotin. Aún otro
ejemplo de un vector de AAV que puede emplearse en esta invención es
SSV9AFABTKneo, que contiene el potenciador de AFP y promotor de
albúmina y dirige la expresión predominantemente en el hígado. Su
estructura y construcción se dan a conocer en Su (1996) Human Gene
Therapy 7:463-470. Los vectores de AAV de terapia
génica adicionales se describen en los documentos US 5.354.678, US
5.173.414, US 5.139.941 y
US 5.252.479.
US 5.252.479.
Los vectores de terapia génica de la invención
también incluyen vectores del virus herpes. Los ejemplos destacados
y preferidos son vectores de virus herpes simple que contienen una
secuencia que codifica un polipéptido de timidina quinasa tal como
los dados a conocer en los documentos US 5.288.641 y EP0176170
(Roizman). Los vectores de virus herpes simple a modo de ejemplo
adicionales incluyen HFEM/ICP6-LacZ dado a conocer
en el documento WO95/04139 (Wistar), pHSVlac descrito en Geller
(1988) Science 241:1667-1669 y en los documentos
WO90/09441 y WO92/07945, Us3::pgC-lacZ de VHS
descrito en Fink (1992) Human Gene Therapy 3:11-19 y
7134, 2 RH 105 y GAL4 de VHS descritos en el documento EP 0453242
(Breakefield) y los depositados con los números de acceso de ATCC
VR-977 y ATCC VR-260.
También se contemplan los vectores de alfavirus
de terapia génica que pueden emplearse en esta invención. Los
vectores de alfavirus preferidos son los vectores de los virus
Sindbis, togavirus, virus del bosque Semliki (ATCC
VR-67; ATCC VR-1247), virus de
Middleberg (ATCC VR-370), virus del río Ross (ATCC
VR-373; ATCC VR-1246), virus de la
encefalitis equina venezolana (ATCC VR923; ATCC
VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC
VR-532) y los descritos en las patentes
estadounidenses 5.091.309, 5.217.879 y en el documento WO92/10578.
Más particularmente, pueden emplearse los vectores de alfavirus
descritos en el documento estadounidense con número de serie
08/405,627, presentado el 15 de marzo de 1995 y en los documentos
WO94/21792, WO92/10578, WO95/07994, US 5.091.309 y US 5.217.879.
Tales alfavirus pueden obtenerse a partir de depositarios o
colecciones tales como la ATCC en Rockville, Maryland o aislarse de
fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles.
Preferiblemente, se usan vectores de alfavirus con citotoxicidad
reducida (véase el documento USSN 08/679640).
Los sistemas de vectores de ADN tales como los
sistemas de expresión estratificados eucariotas también son útiles
para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Véase el
documento WO95/07994 para una descripción detallada de los sistemas
de expresión estratificados eucariotas. Preferiblemente, los
sistemas de expresión estratificados eucariotas de la invención se
derivan de vectores de alfavirus y lo más preferiblemente de
vectores del virus
Sindbis.
Sindbis.
Otros vectores virales adecuados para su uso en
la presente invención incluyen los derivados de poliovirus, por
ejemplo ATCC VR-58 y los descritos en Evans, Nature
339 (1989) 385 y Sabin (1973) J. Biol. Standardization 1:115;
rinovirus, por ejemplo ATCC VR-1110 y los descritos
en Arnold (1990) J Cell Biochem L401; virus de la viruela tal como
el virus de la viruela del canario o el virus vaccinia, por ejemplo
ATCC VR-111 y ATCC VR-2010 y los
descritos en Fisher-Hoch (1989) Proc Natl Acad Sci
86:317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569:86, Flexner (1990)
Vaccine 8:17; en los documentos US 4.603.112 y US 4.769.330 y
WO89/01973; virus SV40, por ejemplo ATCC VR-305 y
los descritos en Mulligan (1979) Nature 277:108 y Madzak (1992) J
Gen Virol 73:1533; virus influenza, por ejemplo ATCC
VR-797 y virus influenza recombinantes obtenidos
empleando técnicas genéticas inversas tal como se describe en el
documento US 5.166.057 y en Enami (1990) Proc Natl Acad Sci
87:3802-3805; Enami & Palese (1991) J Virol
65:2711-2713 y Luytjes (1989) Cell 59:110, (véase
también McMichael (1983) NEJ Med 309:13, y Yap (1978) Nature
273:238 y Nature (1979) 277:108); virus de la inmunodeficiencia
humana tal como se describe en el documento
EP-0386882 y en Buchschacher (1992) J. Virol.
66:2731; virus del sarampión, por ejemplo ATCC
VR-67 y VR-1247 y los descritos en
el documento EP-0440219; virus Aura, por ejemplo
ATCC VR-368; virus Bebaru, por ejemplo ATCC
VR-600 y ATCC VR-1240; virus
Cabassou, por ejemplo ATCC VR-922; virus
Chikungunya, por ejemplo ATCC VR-64 y ATCC
VR-1241; virus Fort Morgan, por ejemplo ATCC
VR-924; virus Getah, por ejemplo ATCC
VR-369 y ATCC VR-1243; virus
Kyzylagach, por ejemplo ATCC VR-927; virus Mayaro,
por ejemplo ATCC VR-66; virus Mucambo, por ejemplo
ATCC VR-580 y ATCC VR-1244; virus
Ndumu, por ejemplo ATCC VR-371; virus Pixuna, por
ejemplo ATCC VR-372 y ATCC VR-1245;
virus Tonate, por ejemplo ATCC VR-925; virus
Triniti, por ejemplo ATCC VR-469; virus Una, por
ejemplo ATCC VR-374; virus Whataroa, por ejemplo
ATCC VR-926; virus
Y-62-33, por ejemplo ATCC
VR-375; virus ONyong, virus de la encefalitis del
este, por ejemplo ATCC VR-65 y ATCC
VR-1242; virus de la encefalitis del oeste, por
ejemplo ATCC VR-70, ATCC VR-1251,
ATCC VR-622 y ATCC VR-1252; y
coronavirus, por ejemplo ATCC VR-740 y los
descritos en Hamre (1966) Proc Soc Exp Biol Med 121:190.
\newpage
La administración de las composiciones de esta
invención en células no se limita a los vectores virales mencionados
anteriormente. Pueden emplearse otros procedimientos y medios de
administración tales como, por ejemplo, vectores de expresión de
ácido nucleico, ADN condensado policatiónico unido o no unido a
adenovirus inactivados solos, por ejemplo véase la patente
estadounidense con número de serie 08/366.787, presentada el 30 de
diciembre de 1994 y Curiel (1992) Hum Gene Ther
3:147-154, ADN unido a ligando, por ejemplo véase Wu
(1989) J Biol Chem 264: 16985-16987, células de
vehículos de administración en células eucariotas, por ejemplo véase
la patente estadounidense con número de serie 08/240.030,
presentada el 9 de mayo de 1994 y la patente estadounidense con
número de serie 08/404.796, deposición de materiales de hidrogel
fotopolimerizados, pistola de partículas para transferencia génica
portátil, tal como se describe en la patente estadounidense
5.149.655, radiación ionizante tal como se describe en el documento
US 5.206.152 y en el documento WO92/11033, neutralización de carga
nucleica o fusión con membranas celulares. Los enfoques adicionales
se describen en Philip (1994) Mol Cell Biol 14:
2411-2618 y en Woffendin (1994) Proc Natl Acad Sci
91:1581-1585.
Puede emplearse transferencia génica mediada por
partículas, por ejemplo véase la patente estadounidense con número
de serie 60/023.867. Brevemente, puede insertarse la secuencia en
vectores convencionales que contienen secuencias control
convencionales para expresión de alto nivel y luego incubarse con
moléculas de transferencia génica sintéticas tales como cationes
poliméricos de unión a ADN como polilisina, protamina y albúmina,
unidos a ligandos que tienen como diana células tales como
asialoorosomucoide, tal como se describe en Wu & Wu (1987) J.
Biol. Chem. 262:4429-4432, insulina tal como se
describe en Hucked (1990) Biochem Pharmacol
40:253-263, galactosa tal como se describe en Plank
(1992) Bioconjugate Chem 3:533-539, lactosa o
transferrina.
También puede emplearse ADN desnudo. Los
procedimientos de introducción de ADN desnudo a modo de ejemplo se
describen en los documentos WO90/11092 y US 5.580.859. Puede
mejorarse la eficacia de la captación usando perlas de látex
biodegradables. Las perlas de látex recubiertas con ADN se
transportan eficazmente a las células tras el inicio de la
endocitosis por las perlas. El procedimiento puede mejorarse
adicionalmente mediante el tratamiento de las perlas para aumentar
la hidrofobicidad y facilitar así la ruptura del endosoma y la
liberación del ADN en el citoplasma.
Los liposomas que pueden actuar como vehículos
para administración génica se describen en los documentos US
5.422.120, WO95/13796, WO94/23697, WO91/14445 y
EP-524.968. Tal como se describe en el documento
USSN 60/023,867, sobre la administración no viral, pueden
insertarse moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido
en vectores convencionales que contienen secuencias control
convencionales para la expresión de alto nivel y luego incubarse
con moléculas de transferencia génica sintéticas tales como cationes
poliméricos de unión a ADN como polilisina, protamina y albúmina,
unidos a ligandos que tienen como diana células tales como
asialoorosomucoide, insulina, galactosa, lactosa o transferrina.
Otros sistemas de administración incluyen el uso de liposomas para
ADN encapsulado que comprende el gen bajo el control de una variedad
de promotores activos ubicuos o específicos de tejido. Otra
administración no viral adecuada para su uso incluye sistemas de
administración mecánicos tal como el enfoque descrito en Woffendin
et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91(24):11581-11585. Además, la secuencia
codificante y el producto de expresión de la misma pueden
administrarse mediante la deposición de materiales de hidrogel
fotopolimerizados. Otros procedimientos convencionales para la
administración génica que pueden usarse para la administración de
la secuencia codificante incluyen, por ejemplo, el uso de una
pistola de partículas para transferencia génica portátil, tal como
se describe en el documento US 5.149.655; el uso de radiación
ionizante para activar genes transferidos, tal como se describe en
los documentos US 5.206.152 y WO92/11033.
Los vehículos para administración génica
policatiónicos y de liposomas a modo de ejemplo son los descritos
en los documentos US 5.422.120 y 4.762.915; en los documentos WO
95/13796; WO94/23697; y WO91/14445; en el documento
EP-0524968; y en Stryer, Biochemistry, páginas
236-240 (1975) W.H. Freeman, San Francisco; Szoka
(1980) Biochem Biophys Acta 600:1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta
550:464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149:119; Wang (1987) Proc Natl
Acad Sci 84:7851; Plant (1989) Anal Biochem 176:420.
Una composición de polinucleótido puede
comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un vehículo de
terapia génica, tal como se definió la expresión anteriormente. Para
los fines de la presente invención, una dosis eficaz será desde
aproximadamente 0,01 mg/kg hasta 50 mg/kg o de 0,05 mg/kg a
aproximadamente 10 mg/kg de los constructos de ADN en el individuo
al que se administran.
Una vez formuladas, las composiciones de
polinucleótido de la invención pueden administrarse (1) directamente
al sujeto; (2) administrarse ex vivo, a células derivadas
del sujeto; o (3) in vitro para expresión de proteínas
recombinantes. Los sujetos pueden ser mamíferos o aves. Además,
también pueden tratarse sujetos humanos.
La administración directa de las composiciones
generalmente se llevará a cabo mediante inyección, por vía
subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o bien intramuscular, o se
administrarán en el espacio intersticial de un tejido. Las
composiciones también pueden administrarse en una lesión. Otros
modos de administración incluyen la administración oral y pulmonar,
supositorios y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas (por
ejemplo, véase el documento WO98/20734), agujas y pistolas génicas o
inyectores a presión ("hyposprays"). El tratamiento de
dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de
múltiples dosis.
Los procedimientos para la administración ex
vivo y el reimplante de células transformadas en un sujeto se
conocen en la técnica y se describen en por ejemplo, el documento
WO93/14778. Los ejemplos de células útiles en aplicaciones ex
vivo incluyen, por ejemplo, células madre, particularmente
células hematopoyéticas, linfocitos, macrófagos, células
dendríticas o células tumorales.
Generalmente, la administración de ácidos
nucleicos para ambas aplicaciones ex vivo e in vitro
puede llevarse a cabo mediante los procedimientos siguientes, por
ejemplo, transfección mediada por dextrano, precipitación con
fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de
protoplastos, electroporación, encapsulación del/de los
polinucleótido(s) en liposomas y microinyección directa del
ADN en núcleos, todas ellas bien conocidas en la técnica.
Además de los portadores y las sales
farmacéuticamente aceptables descritos anteriormente, pueden usarse
los siguientes agentes adicionales con composiciones de
polinucleótido y/o polipéptido.
Un ejemplo son polipéptidos que incluyen, sin
limitación: asioloorosomucoide (ASOR); transferrina;
asialoglicoproteínas; anticuerpos; fragmentos de anticuerpo;
ferritina; interleucinas; interferones, factor estimulador de
colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF),
factor estimulador de colonias de granulocitos
(G-CSF), factor estimulador de colonias de
macrófagos (MCSF), factor de células madre y eritropoyetina. También
pueden usarse antígenos virales, tales como proteínas de la
envuelta. Además, proteínas de otros microorganismos invasivos,
tales como el péptido de 17 aminoácidos de la proteína de
circumsporozoíto de Plasmodium falciparum conocida como
RII.
Otros grupos que pueden incluirse son, por
ejemplo: hormonas, esteroides, andrógenos, estrógenos, hormona
tiroidea o vitaminas, ácido fólico.
Además, puede incluirse polialquilenglicol con
los polinucleótidos/polipéptidos deseados. En una realización
preferida, el polialquilenglicol es polietilenglicol. Además, pueden
incluirse, mono-, di-, o polisacáridos. En una realización
preferida de este aspecto, el polisacárido es dextrano o
DEAE-dextrano. Además, quitosano y
poli(lactida-co-glicolida).
El polinucleótido/polipéptido deseado también
puede encapsularse en lípidos o empaquetarse en liposomas antes de
su administración al sujeto o a las células derivadas del mismo.
La encapsulación en lípidos generalmente se
lleva a cabo usando liposomas que pueden unirse de manera estable a
o atrapar y retener ácido nucleico. La proporción de polinucleótido
condensado a preparación lipídica puede variar, pero generalmente
será de aproximadamente 1:1 (mg de ADN:micromoles de lípido), o más
de lípido. Para una revisión del uso de liposomas como portadores
para administrar de ácidos nucleicos, véase, Hug y Sleight (1991)
Biochim. Biophys. Acta. 1097:1-17; Straubinger
(1983) Meth. Enzymol. 101:512-527.
Las preparaciones de liposomas para su uso en la
presente invención incluyen preparaciones catiónicas (cargadas
positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras. Se ha
demostrado que los liposomas catiónicos median la administración
intracelular de ADN de plásmido (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84:7413-7416); ARNm (Malone (1989) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86: 6077-6081); y factores de
transcripción purificados (Debs (1990) J Biol. Chem.
265:10189-10192), en forma funcional.
Los liposomas catiónicos están fácilmente
disponibles. Por ejemplo, los liposomas de
N{1-2,3-dioleiloxi)propil}-N,N,N-trietilamonio
(DOTMA) están disponibles con la marca comercial Lipofectin, de
GIBCO BRL, Grand Island, NY. (véase también, Felgner citado
anteriormente). Otros liposomas disponibles comercialmente incluyen
Transfectace (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boerhinger). Otros liposomas
catiónicos pueden prepararse a partir de materiales fácilmente
disponibles usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véanse,
por ejemplo, Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
75:4194-4198; el documento WO90/11092 para una
descripción de la síntesis de liposomas de DOTAP
(1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano).
De manera similar, los liposomas aniónicos y
neutros están fácilmente disponibles, tal como de Avanti Polar
Lipids (Birmingham, AL), o pueden prepararse fácilmente usando
materiales fácilmente disponibles. Tales materiales incluyen
fosfatidilcolina, colesterol, fosfatidiletanolamina,
dioleilfosfatidilcolina (DOPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG),
dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), entre otros. Estos materiales
también pueden mezclarse con los materiales de partida de DOTMA y
DOTAP en proporciones apropiadas. Los procedimientos para obtener
liposomas usando estos materiales se conocen bien en la
técnica.
Los liposomas pueden comprender vesículas
multilamelares (MLV), pequeñas vesículas unilamelares (SUV) o
grandes vesículas unilamelares (LUV). Los diversos complejos de
liposoma-ácido nucleico se preparan usando procedimientos conocidos
en la técnica. Véase por ejemplo, Straubinger (1983) Meth. Immunol.
101:512-527; Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 75:4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim.
Biophys. Acta 394:483; Wilson (1979) Cell 17:77); Deamer &
Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443:629; Ostro (1977) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 76:836; Fraley (1979) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 76:3348); Enoch & Strittmatter (1979) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 76:145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka
& Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:145; y
Schaefer-Ridder (1982) Science 215:166.
Además, pueden incluirse lipoproteínas con el
polinucleótido/polipéptido que va a administrarse. Ejemplos de
lipoproteínas que van a utilizarse incluyen: quilomicrones, HDL,
IDL, LDL y VLDL. También pueden usarse mutantes, fragmentos o
fusiones de estas proteínas. Además, también pueden usarse
modificaciones de lipoproteínas que se producen de manera natural,
tal como LDL acetilado. Estas lipoproteínas pueden dirigir la
administración de los polinucleótidos a células que expresan
receptores de lipoproteínas. Preferiblemente, si se están incluyendo
lipoproteínas con el polinucleótido que va a administrarse, no se
incluyen otros ligandos de transporte dirigido en la
composición.
composición.
Las lipoproteínas que se producen de manera
natural comprenden una parte lipídica y una proteica. La parte
proteica se conoce como apoproteína. En la actualidad se han aislado
e identificado las apoproteínas A, B, C, D, y E. Al menos dos de
éstas contienen varias proteínas, designadas por los números
romanos, AI, AII, AIV; CI, CII, CIII.
Una lipoproteína puede comprender más de una
apoproteína. Por ejemplo, los quilomicrones que se producen de
manera natural comprenden A, B, C y E. Con el tiempo, estas
lipoproteínas pierden la apoproteína A y adquieren las C y E. VLDL
comprende las apoproteínas A, B, C y E, LDL comprende la apoproteína
B; HDL comprende las apoproteínas A, C y E.
Se conocen los aminoácidos de estas apoproteínas
y se describen en, por ejemplo, Breslow (1985) Annu Rev. Biochem
54:699; Law (1986) Adv. Exp Med. Biol. 151:162; Chen (1986) J Biol
Chem 261:12918; Kane (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77:2465; y
Utermann (1984) Hum Genet 65:232.
Las lipoproteínas contienen una variedad de
lípidos que incluyen, triglicéridos, colesterol (libre y ésteres) y
fosfolípidos. La composición de los lípidos varía en las
lipoproteínas que se producen de manera natural. Por ejemplo, los
quilomicrones comprenden principalmente triglicéridos. Puede
encontrarse una descripción más detallada del contenido en lípidos
de las lipoproteínas que se producen de manera natural, por ejemplo,
en Meth. Enzymol. 128 (1986). La composición de los lípidos se
escoge para ayudar en la conformación de la apoproteína para la
actividad de unión al receptor. La composición de lípidos también
puede escogerse para facilitar la interacción hidrófoba y la
asociación con la molécula de unión al polinucleótido.
Las lipoproteínas que se producen de manera
natural pueden aislarse del suero mediante ultracentrifugación, por
ejemplo. Tales procedimientos se describen en Meth. Enzymol. (citado
anteriormente); Pitas (1980) J. Biochem.
255:5454-5460 y Mahey (1979) J Clin. Invest 64:
743-750. Las lipoproteínas también pueden producirse
mediante procedimientos in vitro o recombinantes mediante la
expresión de los genes de la apoproteína en una célula huésped
deseada. Véase, por ejemplo, Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem
15:403 y Radding (1958) Biochim Biophys Acta 30: 443. Las
lipoproteínas también pueden adquirirse de proveedores comerciales,
tales como Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachusetts,
EE.UU.. Puede encontrarse otra descripción de las lipoproteínas en
Zuckermann et al. documento PCT/US97/14465.
Los agentes policatiónicos pueden incluirse, con
o sin lipoproteínas, en una composición con el
polinucleótido/polipéptido deseado que va a administrarse.
Los agentes policatiónicos, normalmente,
muestran una carga positiva neta a pH fisiológicamente relevante y
pueden neutralizar la carga eléctrica de los ácidos nucleicos para
facilitar la administración a una ubicación deseada. Estos agentes
tienen aplicaciones in vitro, ex vivo e in
vivo. Los agentes policatiónicos pueden usarse para administrar
ácidos nucleicos a un sujeto vivo por vía intramuscular, subcutánea,
etc.
Los siguientes son ejemplos de polipéptidos
útiles como agentes policatiónicos: polilisina, poliarginina,
poliomitina y protamina. Otros ejemplos incluyen histonas,
protaminas, albúmina sérica humana, proteínas de unión a ADN,
proteínas cromosómicas no histonas, proteínas de recubrimiento de
virus de ADN, tales como (X174, los factores de transcripción
también contienen dominios que se unen al ADN y por tanto, pueden
ser útiles como agentes de condensación de ácidos nucleicos.
Brevemente, los factores de transcripción tales como C/CEBP,
c-jun, c-fos, AP-1,
AP-2, AP-3, CPF,
Prot-1, Sp-1, Oct-1,
Oct-2, CREP y TFIID contienen dominios básicos que
se unen a secuencias de ADN.
Los agentes policatiónicos orgánicos incluyen:
espermina, espermidina y purtrescina.
Las dimensiones y las propiedades físicas de un
agente policatiónico pueden extrapolarse de la lista anterior, para
construir otros agentes polipeptídicos policatiónicos o para
producir agentes policatiónicos sintéticos.
Los agentes policatiónicos sintéticos que son
útiles incluyen, por ejemplo, DEAE-dextrano,
polibreno, Lipofectin^{TM} y lipofectAMINE^{TM} son monómeros
que forman complejos policatiónicos cuando se combinan con
polinucleótidos/polipéptidos.
La "hibridación" se refiere a la asociación
de dos secuencias de ácido nucleico con otra mediante puentes de
hidrógeno. Normalmente, una secuencia se fijará a un soporte sólido
y la otra estará libre en disolución. Entonces, las dos secuencias
se colocarán en contacto entre sí en condiciones que favorecen la
formación de puentes de hidrógeno. Los factores que afectan a esta
unión incluyen: el tipo y el volumen de disolvente; la temperatura
de reacción; el tiempo de hibridación; la agitación; los agentes
para bloquear la unión no específica de la secuencia en fase
líquida al soporte sólido (reactivo de Denhardt o BLOTTO); la
concentración de las secuencias; el uso de compuestos para aumentar
la tasa de asociación de las secuencias (sulfato de dextrano o
polietilenglicol); y la rigurosidad de las condiciones de lavado
tras la hibridación. Véase Sambrook et al. {citado
anteriormente} vol.2, capítulo 9, págs. 9.47 a
9.57.
9.57.
La "rigurosidad" se refiere a las
condiciones en una reacción de hibridación que favorecen la
asociación de secuencias muy similares con respecto a las
secuencias que difieren. Por ejemplo, debe escogerse la combinación
de temperatura y concentración salina para que sea aproximadamente
de 120ºC a 200ºC inferior a la Tf calculada del híbrido en estudio.
La temperatura y las concentraciones salinas a menudo pueden
determinarse empíricamente en experimentos preliminares en los que
se hibridan muestras de ADN genómico inmovilizados en filtros con
la secuencia de interés y luego se lavan en condiciones de
rigurosidad diferentes. Véase Sambrook et al. en la
página
9.50.
9.50.
Las variables que han de considerarse cuando se
realiza, por ejemplo, una transferencia de tipo Southern son (1) la
complejidad del ADN que está sometiéndose a transferencia y (2) la
homología que está detectándose entre la sonda y las secuencias. La
cantidad total del/de los fragmento(s) que va(n) a
estudiarse puede variar en una magnitud de 10, desde 0,1 a 1 \mug
para un digesto de fago o plásmido hasta 10^{-9} a 10^{-8} g
para un gen de copia única en un genoma eucariota altamente
complejo. Para los polinucleótidos de menor complejidad, pueden
usarse tiempos de exposición, hibridación y transferencia
sustancialmente más cortos, una menor cantidad de polinucleótidos
de partida y menor actividad específica de las sondas. Por ejemplo,
puede detectarse un gen de levadura de copia única con un tiempo de
exposición de sólo 1 hora comenzando con 1 \mug de ADN de
levadura, transferencia durante dos horas e hibridación durante
4-8 horas con una sonda de 10^{8} cpm/\mug.
Para un gen de mamífero de copia única, un enfoque conservativo
comenzaría con 10 \mug de ADN, transferencia durante la noche e
hibridación durante la noche en presencia de sulfato de dextrano al
10% usando una sonda superior a 10^{8} cpm/\mug, dando como
resultado un tiempo de exposición de \sim24 horas.
Varios factores pueden afectar a la temperatura
de fusión (Tf) de un híbrido ADN-ADN entre la sonda
y el fragmento de interés y, en consecuencia, a las condiciones
apropiadas de hibridación y lavado. En muchos casos, la sonda no es
homóloga en un 100% al fragmento. Otras variables encontradas
comúnmente incluyen la longitud y el contenido en G+C total de las
secuencias de hibridación y la fuerza iónica y el contenido en
formamida del tampón de hibridación. Los efectos de todos estos
factores pueden aproximarse mediante la ecuación única:
Tf = 81 +
16.6\ (log_{10}Ci) + 0.4\ \{%\ de\ (G + C)\} - 0.6\ (%\ de\
formamida) - 600/n - 1.5\ (%\ de\ apareamiento\
erróneo)
en la que Ci es la concentración
salina (iones monovalentes) y n es la longitud del híbrido en pares
de bases (ligeramente modificada a partir de Meinkoth & Wahl
(1984) Anal. Biochem. 138:
267-284).
Al diseñar un experimento de hibridación, pueden
modificarse convenientemente algunos factores que afectan a la
hibridación de ácidos nucleicos. La temperatura de la hibridación y
los lavados y la concentración salina durante los lavados son los
parámetros más simples de ajustar. A medida que aumenta la
temperatura de hibridación (es decir, la rigurosidad), se hace
menos probable que se produzca la hibridación entre las cadenas que
no son homólogas, y como resultado, disminuye el ruido. Si la sonda
radiomarcada no es completamente homóloga con el fragmento
inmovilizado (como es el caso frecuentemente en los experimentos de
hibridación entre especies y familias de genes) debe reducirse la
temperatura de hibridación y aumentará el ruido. La temperatura y
los lavados afectan a la intensidad de la banda de hibridación y al
grado de ruido de una manera similar. La rigurosidad de los lavados
también aumenta con la disminución de las concentraciones
salinas.
En general, las temperaturas de hibridación
convenientes en presencia del 50% de formamida son 42ºC para una
sonda con homólogas del 95% al 100% con el fragmento objetivo, 37ºC
para una homología del 90% al 95% y 32ºC para una homología del 85%
al 90%. Para homologías inferiores, debe reducirse el contenido en
formamida y debe ajustarse la temperatura en consecuencia, usando
la ecuación anterior. Si se desconoce la homología entre la sonda y
el fragmento objetivo, el enfoque más simple es comenzar con
condiciones de ambas hibridación y lavado que no sean rigurosas. Si
se observan bandas no específicas o alto ruido tras la
autorradiografía, puede lavarse el filtro con alta rigurosidad y
volver a exponerse. Si el tiempo requerido para la exposición hace
que este enfoque no sea práctico, deben someterse a prueba varias
rigurosidades de hibridación y/o lavado en paralelo.
Los procedimientos tales como PCR, ensayos con
sonda de ADN ramificada o técnicas de transferencia que utilizan
sondas de ácido nucleico según la invención, pueden determinar la
presencia de ADNc o ARNm. Se dice que una sonda "hibrida" con
una secuencia de la invención si puede formar un complejo de cadena
doble o dúplex, que es suficientemente estable como para
detectarse.
Las sondas de ácido nucleico hibridarán con las
secuencias de nucleótido de clamidia de la invención (incluyendo
ambas cadenas sentido y antisentido). Aunque muchas secuencias de
nucleótido diferentes codificarán la secuencia de aminoácidos, se
prefiere la secuencia nativa de clamidia porque es la secuencia real
presente en las células. El ARNm representa una secuencia
codificante y por tanto, una sonda debe ser complementaria a la
secuencia codificante; el ADNc de cadena sencilla es complementario
al ARNm y, por tanto, una sonda de ADNc debe ser complementaria a
la secuencia no codificante.
No es necesario que la secuencia de la sonda sea
idéntica a la secuencia de clamidia (o su complementaria) (cierta
variación en la secuencia y la longitud pueden conducir a un aumento
de la sensibilidad del ensayo si la sonda de ácido nucleico puede
formar un dúplex con los nucleótidos diana, que pueden detectarse.
Además, la sonda de ácido nucleico puede incluir nucleótidos
adicionales para estabilizar el dúplex formado. La secuencia
adicional de clamidia también puede ser útil como marcador para
detectar el dúplex formado. Por ejemplo, puede unirse una secuencia
de nucleótido no complementaria al extremo 5' de la sonda, siendo
complementaria el resto de la secuencia de la sonda a la secuencia
de clamidia. Como alternativa, pueden intercalarse en la sonda
bases no complementarias o secuencias más largas, siempre que la
secuencia de la sonda tenga complementariedad suficiente con la
secuencia de clamidia con el fin de hibridar entre ellas y formar
así un dúplex que puede detectarse.
La longitud y la secuencia exactas de la sonda
dependerá de las condiciones de hibridación, tales como temperatura,
condición salina y similares. Por ejemplo, para aplicaciones de
diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia de
analito, la sonda de ácido nucleico normalmente contiene al menos 10
- 20 nucleótidos, preferiblemente 15 - 25 y más preferiblemente
\geq 30 nucleótidos, aunque puede ser más corta. Los cebadores
cortos generalmente requieren temperaturas más frías para formar
complejos de híbridos suficientemente estables con el molde.
Las sondas pueden producirse mediante
procedimientos sintéticos, tales como el procedimiento de triéster
de Matteucci et al. {J. Am. Chem. Soc. (1981) 103:3185}, o
según Urdea et al. {Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:
7461}, o usando sintetizadores de oligonucleótidos automatizados
disponibles comercialmente.
La naturaleza química de la sonda puede
seleccionarse según preferencia. Para ciertas aplicaciones, son
apropiados el ADN o el ARN. Para otras aplicaciones, pueden
incorporarse modificaciones, por ejemplo, modificaciones de la
estructura principal, tal como fosforotioatos y metilfosfonatos, que
pueden usarse para aumentar la semivida in vivo, para
modificar la afinidad del ARN, para aumentar la resistencia de la
nucleasa, etc. {por ejemplo, véase Agrawal & Iyer (1995) Curr
Opin Biotechnol 6:12-19; Agrawal (1996) TIBTECH
14:376-387}; también pueden usarse análogos tales
como ácidos nucleicos de péptidos {por ejemplo, véase Corey (1997)
TIBTECH 15:224-229; Buchardt et al. (1993)
TIBTECH 11:384-386}.
Como alternativa, la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) es otro medio bien conocido para detectar pequeñas
cantidades de ácidos nucleicos diana. El ensayo se describe en:
Mullis et al. {Meth. Enzymol. (1987) 155:
335-350}; patentes estadounidenses 4.683.195 y
4.683.202. Dos "cebadores" hibridan con los ácidos nucleicos
diana y se usan para cebar la reacción. Los cebadores pueden
comprender una secuencia que no hibrida con la secuencia de la
diana de amplificación (o con su complementaria) para ayudar en la
estabilidad del dúplex o, por ejemplo, para incorporar un sitio de
restricción conveniente. Normalmente, una secuencia de este tipo
flanqueará la secuencia de clamidia
deseada.
deseada.
Una polimerasa termoestable crea copias de
ácidos nucleicos diana a partir de los cebadores utilizando los
ácidos nucleicos diana originales como molde. Una vez generada una
cantidad umbral de ácidos nucleicos diana mediante la polimerasa,
pueden detectarse mediante procedimientos más tradicionales, tales
como transferencias de tipo Southern. Cuando se usa el
procedimiento de transferencia de tipo Southern, la sonda marcada
hibridará con la secuencia de clamidia (o con su
complementaria).
Además, el ARNm o el ADNc pueden detectarse
mediante técnicas de transferencia tradicionales descritas en
Sambrook et al {citado anteriormente}. El ARNm, o el ADNc
generado a partir del ARNm usando una enzima polimerasa, puede
purificarse y separarse usando electroforesis en gel. Los ácidos
nucleicos en el gel se someten entonces a transferencia sobre un
soporte sólido, tal como nitrocelulosa. El soporte sólido se expone
a una sonda marcada y entonces se lava para eliminar cualquier sonda
no hibridada. A continuación, se detectan los dúplex que contienen
la sonda marcada. Normalmente, la sonda se marca con un resto
radiactivo.
Las figuras 1 a 44 muestran los datos de los
ejemplos 1 a 44. Cuando una figura es de un gel, el carril 1 está a
la izquierda de la figura.
Para las inmunotransferencias de tipo Western se
sometieron a prueba dos muestras para cada proteína. El carril de
la izquierda en un par usó tiras de membrana teñidas con sueros
inmunizados previamente mientras que el carril derecho usó tiras de
membrana teñidas con sueros inmunizados. En las inmunotransferencias
de tipo Western en las figuras 1 a 5, 35B, 37B, 38B y 39, los
marcadores están a 66, 45, 30, 20,1 y 14,4 kDa. En las
inmunotransferencias de tipo Western en las figuras 6 a 16, 20B,
23C, 24D, 27E, 38A, 40, 41, 42 y 43 los marcadores están a 172,6,
111,4, 79,6, 61,3, 49,0, 36,4, 24,7, 19,2 y 13,1 kDa.
En las inmunotransferencias de tipo Western en
las figuras 1 a 5, los carriles 2 y 3 muestran sueros control
producidos frente a antígenos control de fusión a GST. En las
inmunotransferencias de tipo Western en las figuras 1 a 5, los
carriles 4 y 5 contienen sueros control producidos frente a
antígenos control con etiqueta de His.
Los marcadores de bajo peso molecular se hacen
pasar en el carril 1 de los geles de purificación.
La tabla I proporciona los nombres de proteínas
de C. pneumoniae a partir de la referencia 18, los títulos y
números de acceso de GenBank para aquéllas proteínas, los títulos y
números de acceso de GenBank para las correspondientes proteínas de
C. trachomatis descritas en el presente documento y los
números de SEC ID (SEC ID 1-262, siendo los números
impares las secuencias de aminoácidos y siendo los números pares las
secuencias de nucleótidos) para estas proteínas de C.
trachomatis. Éstas pueden expresarse y usarse de los mismos
modos que los descritos en la referencia 18 para las
correspondientes proteínas de C. pneumoniae. Las proteínas
de C. trachomatis son útiles para fines de diagnóstico e
inmunogénicos. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia
sola.
sola.
Pueden usarse diversas pruebas para evaluar la
inmunogenicidad in vivo de las proteínas de la invención.
Por ejemplo, las proteínas pueden expresarse de manera recombinante
y usarse para explorar sueros de pacientes mediante
inmunotransferencia. Una reacción positiva entre la proteína y el
suero del paciente indica que el paciente ha preparado previamente
una respuesta inmunitaria frente a la proteína en cuestión, es decir
la proteína es un inmu-
nogéno.
nogéno.
Este procedimiento también puede usarse para
identificar proteínas inmunodominantes.
La proteína recombinante también puede usarse de
manera conveniente para preparar anticuerpos por ejemplo en un
ratón. Éstos pueden usarse para confirmar directamente que una
proteína está ubicada sobre la superficie celular de C.
trachomatis (por ejemplo usando los anticuerpos en una
inmunotransferencia de tipo Western frente a Chlamydia
intacta). El anticuerpo marcado (por ejemplo, marcaje fluorescente
para FACS) puede incubarse con bacterias intactas y la presencia
del marcador sobre la superficie bacteriana confirma la ubicación
de la proteína. Las figuras de FACS muestran un perfil de dispersión
de la preparación de Chlamydia usada en el ensayo, el
desplazamiento de pico obtenido cuando los anticuerpos frente al
antígeno recombinante se unen a las células de Chlamydia
(área abierta = muestra control; área rellena = muestra de
anticuerpo que ha reaccionado), análisis estadístico de
Kolmogorov-Smirnov (K-S)
cuantitativo y rendimiento del software de análisis FACS.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se expresó CT242 (SEC ID 57 y SEC ID 58) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como ambas, una
proteína de fusión a GST (figura 1A; carriles 4 y 5, fracciones de
cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 42,4 kDa) y una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 1B; carriles
2-4, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso
molecular esperado de 16,4 kDa).
Se usó la proteína recombinante para inmunizar
ratones, cuyos sueros se usaron en una inmunotransferencia de tipo
Western (figura 1C: con etiqueta de His: carriles 12 y 13; fusión a
GST: carriles 20 y 21). El carril 12 muestra tiras de membrana
teñidas con sueros inmunizados previamente para CT242 con etiqueta
de His mientras que el carril 13 muestra tiras de membrana teñidas
con sueros inmunizados para CT242 con etiqueta de His. El carril 20
muestra tiras de membrana teñidas con sueros inmunizados previamente
para CT242 de fusión a GST mientras que el carril 21 muestra tiras
de membrana teñidas con sueros inmunizados para CT242 de fusión a
GST.
Estos experimentos muestran que CT242 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\newpage
Ejemplo
2
Se expresó CT045 (SEC ID 71 y SEC ID 72) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 2A; carriles
4-6, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso
molecular esperado de 55,8 kDa). Se usó la proteína recombinante
para inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron en una
inmunotransferencia de tipo Western (figura 2B, carriles 8 y 9) y
para análisis FACS (figura 2C, valor K-S de
16,81).
Estos experimentos muestran que CT045 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se expresó CT381 (SEC ID 105 y SEC ID 106) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como ambas,
una proteína de fusión a GST (figura 3A; carriles 2 y 3, fracciones
de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 52,7 kDa) y una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 3A; carriles
7-9, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso
molecular esperado de 26,7 kDa). Se usó la proteína recombinante
para inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron en una
inmunotransferencia de tipo Western (figura 3B: con etiqueta de His:
carriles 6 y 7; fusión a GST: carriles 16 y 17) y para análisis
FACS (figura 3C: etiqueta de GST, valor K-S de
35,98; figura 3D: con etiqueta de His, valor K-S de
32,54).
Estos experimentos muestran que CT381 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se expresó CT396 (SEC ID 107 y SEC ID 108) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como ambas,
una proteína de fusión a GST (figura 4A; carriles 6 y 7, fracciones
de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 99,5 kDa) y una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 4B; carriles
5-7, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso
molecular esperado de 73,5 kDa). Se usó la proteína recombinante con
etiqueta de His para inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron en
una inmunotransferencia de tipo Western (figura 4C, carriles 14 y
15). También se usaron la proteína recombinante con etiqueta de His
y la proteína de fusión a GST para análisis FACS (figura 4D: con
etiqueta de His, valor K-S de 34,50; figura 4E:
fusión a GST, valor K-S de 32,76).
Estos experimentos muestran que CT396 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se expresó CT398 (SEC ID 111 y SEC ID 112) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como ambas,
una proteína de fusión a GST (figura 5A; carriles 8 y 9, fracciones
de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 54,8 kDa) y una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 5B; carriles
8-10, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso
molecular esperado de 28,8 kDa). Se usó la proteína recombinante
para inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron en una
inmunotransferencia de tipo Western (figura 5C: con etiqueta de His:
carriles 10 y 11; fusión a GST: carriles 18 y 19) y para análisis
FACS (figura 5D: fusión a GST, valor K-S de 31,24;
figura 5E: con etiqueta de His, valor K-S de
26,10).
Estos experimentos muestran que CT398 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se expresó CT089 (SEC ID 61 y SEC ID 62) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como ambas, una
proteína de fusión a GST (figura 6C: carril 2, fracción de
cromatografía 1, peso molecular esperado de 70,8 kDa) y una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 6C: carriles 3, 4 y
5, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado de
44,8 kDa). Se usaron las proteínas recombinantes para inmunizar
ratones, cuyos sueros se usaron en una inmunotransferencia de tipo
Western (figura 6A: fusión a GST: carriles 14 y 15; con etiqueta de
His: carriles 16 y 17) y para análisis FACS (figura 6B: con etiqueta
de His, valor K-S de 26,59).
Estos experimentos muestran que CT089 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\newpage
Ejemplo
7
Se expresó CT443 (SEC ID 125 y SEC ID 126) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His. Se usó la proteína
recombinante para inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron en una
inmunotransferencia de tipo Western (figura 7A: carriles 10 y 11) y
para análisis FACS (figura 7B: valor K-S de
21,28).
21,28).
Estos experimentos muestran que CT443 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se expresó CT541 (SEC ID 149 y SEC ID 150) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión a GST (figura 8C: carriles 2 y 3, fracciones de
cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 51,6 kDa). Se usó
la proteína recombinante para inmunizar ratones, cuyos sueros se
usaron en una inmunotransferencia de tipo Western (figura 8A:
carriles 6 y 7) y para análisis FACS (figura 8B: valor
K-S de 9,94).
Estos experimentos muestran que CT541 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Se expresó CT547 (SEC ID 151 y SEC ID 152) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como ambas,
una proteína de fusión a GST (figura 9D: carriles 4 y 5, fracciones
de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 58,3 kDa) y una
proteína de fusión con etiqueta de His. Se usó la proteína
recombinante para inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron en una
inmunotransferencia de tipo Western (figura 9A: con etiqueta de His:
carriles 20 y 21) y para análisis FACS (figura 9B: fusión a GST,
valor K-S des 14,60 y 15,57; figura 9C: con
etiqueta de His, valor K-S de 28,21).
Estos experimentos muestran que CT547 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se expresó CT587 (SEC ID 189 y SEC ID 190) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 10C: carriles 5, 6 y
7, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado de
47,5 kDa). Se usó la proteína recombinante para inmunizar ratones,
cuyos sueros se usaron en una inmunotransferencia de tipo Western
(figura 10A: carriles 12 y 13) y para análisis FACS (figura 10B: con
etiqueta de His, valor K-S de 20,85).
Estos experimentos muestran que CT587 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Se expresó CT266 (SEC ID 77 y SEC ID 78) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 11C: carriles 11 y
12, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de
44,1 kDa). Se usó la proteína recombinante para inmunizar ratones,
cuyos sueros se usaron en una inmunotransferencia de tipo Western
(figura 11A: carriles 4 y 5) y para análisis FACS (figura 11B: valor
K-S de
21,29).
21,29).
Estos experimentos muestran que CT266 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Se expresó CT444 (SEC ID 127 y SEC ID 128) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión a GST (figura 12B: carriles 2 y 3, fracciones de
cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 87,3 kDa) y como
una proteína de fusión con etiqueta de His (figura 12C: carriles 3 y
4, fracciones de cromatografía 2 y 3, peso molecular esperado de
9,0 kDa). Se usó la proteína recombinante para inmunizar ratones,
cuyos sueros se usaron en una inmunotransferencia de tipo Western
(figura 12A: carriles 16 y 17) y para análisis FACS (figura 12D:
etiqueta de GST: valor K-S de 14,98; figura 12E: con
etiqueta de His: valor K-S de 13,28).
Estos experimentos muestran que CT444 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Se expresó CT559 (SEC ID 199 y SEC ID 200) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína con etiqueta de His (figura 13C: carriles 2, 3 y 4,
fracciones de cromatografía 1, 2 y 3. peso molecular esperado de
34,9 kDa). Se usó la proteína recombinante para inmunizar ratones,
cuyos sueros se usaron en una inmunotransferencia de tipo Western
(figura 13A: carriles 6 y 7) y para análisis FACS (figura 13B: valor
K-S de
23,21).
23,21).
Estos experimentos muestran que CT559 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
Se expresó CT681 (SEC ID 155 y SEC ID 156) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 14C: carriles 5 y 6,
fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 41,8
kDa). Se usó la proteína recombinante para inmunizar ratones, cuyos
sueros se usaron en una inmunotransferencia de tipo Western (figura
14A: carriles 10 y 11) y para análisis FACS (figura 14B: valor
K-S de
34,66).
34,66).
Estos experimentos muestran que CT681 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
Se expresó CT713 (SEC ID 201 y SEC ID 202) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 15B: carriles 4, 5 y
6; fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado de
35,4 kDa). Se usó la proteína recombinante para inmunizar ratones,
cuyos sueros se usaron en una inmunotransferencia de tipo Western
(figura 15A: carriles 12 y 13) y para análisis FACS (figura 15C:
valor K-S de 25,82).
Estos experimentos muestran que CT713 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
Se expresó CT823 (SEC ID 229 y SEC ID 230) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 16C: carriles 7, 8 y
9, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado de
53,9 kDa). Se usó la proteína recombinante para inmunizar ratones,
cuyos sueros se usaron en una inmunotransferencia de tipo Western
(figura 16A: carriles 14 y 15) y para análisis FACS (figura 16B:
valor K-S de 26,62).
Estos experimentos muestran que CT823 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
17
Se expresó CT114 (SEC ID 243 y SEC ID 244) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 17; carriles 6 y 7,
fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 48,5
kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
18
Se expresó CT198 (SEC ID 43 y SEC ID 44) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 18A; carril 6,
fracción de cromatografía 1, peso molecular esperado de 56,3 kDa).
Se usó las proteína recombinante con etiqueta de His para inmunizar
ratones, cuyos sueros se usaron para análisis FACS (figura
18B).
\newpage
Estos experimentos muestran que CT198 está
presente sólo en parte de una población heterogénea de CE (como
habitualmente están las preparaciones de clamidia). Cuando está
presente, es una proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible.
Estas propiedades no son evidentes a partir de la secuencia
sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
19
Se expresó CT241 (SEC ID 55 y SEC ID 56) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 19: carril 4,
fracción de cromatografía 3, peso molecular esperado de 85,3
kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
20
Se expresó CT350 (SEC ID 27 y SEC ID 28) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como ambas, una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 20A: carriles 2, 3 y
4, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado de
61,3 kDa) y una proteína de fusión con etiqueta de GST. (Figura 20A:
carriles 7, 8 y 9, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso
molecular esperado de 87,3 kDa). Se usaron las proteínas
recombinantes para inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron en una
inmunotransferencia de tipo Western (figura 20B: con etiqueta de
His, carriles 4 y 5; con etiqueta de GST, carriles 8 y 9).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
21
Se expresó CT351 (SEC ID 25 y SEC ID 26) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 21: carriles 2 y 3,
fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 76,1
kDa)
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
22
Se expresó CT391 (SEC ID 251 y SEC ID 252) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 22: carriles 8 y 9,
fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 32,6
kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
23
Se expresó CT077 (SEC ID 65 y SEC ID 66) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de GST (figura 23: carriles 2 y 3,
fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 59,7
kDa) y como una proteína de fusión con etiqueta de His. Se usó la
proteína recombinante para inmunizar ratones, cuyos sueros se
usaron en una inmunotransferencia de tipo Western (figura 23C:
carriles 6 y 7) y para análisis FACS (figura 23B, con etiqueta de
His: valor K-S de 9,17).
Estos experimentos muestran que CT077 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
24
Se expresó CT181 (SEC ID 245 y SEC ID 246) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como ambas,
una proteína de fusión con etiqueta de GST (figura 24A: carril 4,
fracción de cromatografía 1, peso molecular esperado de 50,1 kDa) y
una proteína de fusión con etiqueta de His (figura 24B: carriles 2,
3 y 4, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular
esperado de 32,0 kDa). Se usó la proteína recombinante con etiqueta
de GST para inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron en una
inmunotransferencia de tipo Western (figura 24D, carriles 4 y 5
(indicados por flecha)) y para análisis FACS (figura 24C, valor
K-S de 7,62).
Estos experimentos muestran que CT181 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
25
Se expresó CT589 (SEC ID 185 y SEC ID 186) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como ambas,
una proteína de fusión con etiqueta de GST (figura 25A: carriles 4 y
5, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de
89,4 kDa) y una proteína de fusión con etiqueta de His (figura 25B:
carriles 2 y 3, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular
esperado de 63,4 kDa). Se usó la proteína recombinante con etiqueta
de His para inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron para análisis
FACS (figura 25C).
Estos experimentos muestran que CT589 está
presente sólo en parte de una población heterogénea de CE (como
habitualmente están las preparaciones de clamidia). Cuando está
presente, es una proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible.
Estas propiedades no son evidentes a partir de la secuencia
sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
26
Se expresó CT597 (SEC ID 179 y SEC ID 180) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como ambas,
una proteína de fusión con etiqueta de GST (figura 26A: carriles 5 y
6, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de
36,0 kDa) y una proteína de fusión con etiqueta de His (figura 26B:
carriles 2, 3 y 4, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso
molecular esperado de 10,3 kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
27
Se expresó CT623 (SEC ID 163 y SEC ID 164) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como ambas,
una proteína de fusión con etiqueta de GST (figura 27A: carriles 3 y
4, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de
71,8 kDa) y una proteína de fusión con etiqueta de His (figura 27B:
carriles 2, 3 y 4, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso
molecular esperado de 45,8 kDa). Se usó la proteína recombinante
para inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron en una
inmunotransferencia de tipo Western (figura 27E: con etiqueta de
GST, carril 4 (indicados por flecha); con etiqueta de His, carril 13
(indicados por flecha)) y para análisis FACS (figura 27C: con
etiqueta de GST: valor K-S de 15,89; figura 27D: con
etiqueta de His: valor K-S de 20,27).
Estos experimentos muestran que CT623 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
28
Se expresó CT700 (SEC ID 261 y SEC ID 262) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de GST (figura 28A: carriles 5, 6 y
7, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado de
73,7 kDa). Se usó la proteína recombinante para inmunizar ratones,
cuyos sueros se usaron para análisis FACS (figura 28B: valor
K-S de 8,72).
Estos experimentos muestran que CT700 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
29
Se expresó CT761 (SEC ID 217 y SEC ID 218) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de GST (figura 29A: carriles 6 y 7,
fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 63,9
kDa). Se usó la proteína recombinante para inmunizar ratones, cuyos
sueros se usaron para análisis FACS (figura 29B, valor
K-S de 11,45).
Estos experimentos muestran que CT761 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
30
Se expresó CT415 (SEC ID 117 y SEC ID 118) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de GST (figura 30: carriles 3 y 4,
fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 55,4
kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
31
Se expresó CT454 (SEC ID 253 y SEC ID 254) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 31: carriles 2 y 3,
fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 56,2
kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
32
Se expresó CT467 (SEC ID 129 y SEC ID 130) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de GST (figura 32: carriles 3 y 4,
fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 65,6
kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
33
Se expresó CT551 (SEC ID 257 y SEC ID 258) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como ambas,
una proteína de fusión con etiqueta de His (figura 33A: carriles 5,
6 y 7, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular
esperado de 34,1 kDa) y una proteína de fusión con etiqueta de GST
(figura 33B: carriles 4 y 5, fracciones de cromatografía 1 y 2,
peso molecular esperado de 60,1 kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
34
Se expresó CT567 (SEC ID 195 y SEC ID 196) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como ambas,
una proteína de fusión con etiqueta de GST (figura 34A: carriles 8 y
9, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de
44,0 kDa) y una proteína de fusión con etiqueta de His (figura 34B:
carriles 7 y 8, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular
esperado de 18,3 kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
35
Se expresó CT569 (SEC ID 193 y SEC ID 194) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 35A: carriles 2, 3 y
4, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado de
11,2 kDa). Se usó la proteína recombinante para inmunizar ratones,
cuyos sueros se usaron en una inmunotransferencia de tipo Western
(figura 35B: carriles 8 y 9, indicados con una flecha).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
36
Se expresó CT647 (SEC ID 169 y SEC ID 170) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de GST (figura 36: carriles 6 y 7,
fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado de 45,7
kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
37
Se expresó CT600 (SEC ID 173 y SEC ID 174) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His (figura 37A: carriles 5, 6 y
7, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado de
19,5 kDa). Se usó la proteína recombinante para inmunizar ratones,
cuyos sueros se usaron en una inmunotransferencia de tipo Western
(figura 37B, carriles 10 y 11, indicados por flecha) y para análisis
FACS (figura 37C, valor K-S de 10,46).
Estos experimentos muestran que CT600 es una
proteína expuesta en superficie e inmunoaccesible, y que es un
inmunógeno útil. Estas propiedades no son evidentes a partir de la
secuencia sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
38
Se expresó CT279 (SEC ID 247 y SEC ID 248) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de GST y como una proteína de
fusión con etiqueta de His. Se usaron la proteína recombinante con
etiqueta de His y la proteína recombinante con etiqueta de GST para
inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron en inmunotransferencias
de tipo Western (figura 38A: con etiqueta de His: carril 5 (indicado
por una flecha); figura 38B: con etiqueta de GST: carriles 12 y 13
(indicados por una flecha)).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
39
Se expresó CT560 (SEC ID 259 y SEC ID 260) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His. Se usó la proteína
recombinante con etiqueta de His para inmunizar ratones, cuyos
sueros se usaron en una inmunotransferencia de tipo Western (figura
39: carriles 6 y 7 (indicados por una
flecha)).
flecha)).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
40
Se expresó CT389 (SEC ID 249 y SEC ID 250) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de GST. Se usó la proteína
recombinante para inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron en una
inmunotransferencia de tipo Western (figura 40: carriles 16 y 17
(indicados por una flecha)).
\newpage
Ejemplo
41
Se expresó CT456 (SEC ID 255 y SEC ID 256) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de GST. Se usó la proteína
recombinante para inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron en una
inmunotransferencia de tipo Western (figura 41: carriles 2 y 3
(indicados por una flecha)).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
42
Se expresó CT622 (SEC ID 161 y SEC ID 162) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His. Se usó la proteína
recombinante para inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron en una
inmunotransferencia de tipo Western (figura 42: carril 9 (indicados
por una flecha)).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
43
Se expresó CT759 (SEC ID 213 y SEC ID 214) en
E. coli. Se purificó el producto recombinante como una
proteína de fusión con etiqueta de His. Se usó la proteína
recombinante para inmunizar ratones, cuyos sueros se usaron en una
inmunotransferencia de tipo Western (figura 43: carriles 8 y 9
(indicados por una flecha)).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
44
Se realizaron ensayos de neutralización in
vitro, que muestran la capacidad de los sueros obtenidos de los
ratones que se inmunizaron con diferentes proteínas recombinantes de
la presente invención para inhibir la infectividad por C.
trachomatis para las células eucariotas en cultivo, usando
células LLCMK2 (de epitelio de riñón de mono Rhesus). Se prepararon
diluciones cuádruples en serie de sueros policlonales de ratón en
tampón SP (Sacarosa-Fosfato). Se usaron los
antisueros de ratón frente a CE completos como control positivo, y
se usaron sueros inmunizados previamente y tampón SP solo como
controles negativos. Se diluyeron los CE purificados de C.
trachomatis (serovar D) en tampón SP para contener 3x10^{5}
UFI/ml, y se añadieron 10 \mul de esta suspensión a cada dilución
de suero en un volumen final de 100 \mul. Se dejó proceder la
interacción anticuerpo-CE durante 30 min. a 37ºC.
Entonces se añadieron 100 \mul de la mezcla de reacción de cada
muestra en la parte superior de monocapas de células LLCMK2 lavadas
con PBS, en una placa de microtitulación de 96 pocillos, y se
centrifugó a 805 x g durante 1 hora a 37ºC. Se examinaron todos los
sueros y controles en muestras por duplicado. Tras la eliminación
del inóculo en exceso, se enjuagaron las células una vez con PBS,
se reabastecieron con 200 \mul de medio DMEM complementado con FCS
al 20% y 1 \mug/ml de cicloheximida, y se incubaron a 37ºC
durante 48 horas. Se fijaron las células con metanol y se tiñeron
las inclusiones citoplasmáticas típicas generadas por la infección
por clamidia intracelular en curso, con un anticuerpo monoclonal
conjugado con fluoresceína anti-clamidia (Meridian
Diagnostics). A las diluciones y las proporciones CE a células
huésped adecuadas, se considera que el número de inclusiones
observado es igual al número de clamidias viable que inicialmente
pudo establecer satisfactoriamente una infección en la célula
huésped (éstas se llaman unidades formadores de inclusión, UFI). Se
contaron las inclusiones marcadas con fluoresceína en cuatro campos
microscópicos por pocillo en un aumento de 40X. Se calculó la
inhibición de la infectividad debido a la interacción con
anticuerpo como el porcentaje de reducción en UFI media en
comparación con el control SP (sólo tampón). Según la práctica
común, los sueros se marcaron como "neutralizantes" si podían
provocar una reducción del 50% o mayor en la infectividad, sin
embargo, considerando la complejidad del ensayo de exploración
completo (por ejemplo, un cambio de célula huésped, o aislado de
clamidias, o una variación en las condiciones del entorno en la
preparación del inóculo infeccioso), los sueros que pueden inhibir
la infectividad por CE hasta un grado inferior también deben
considerarse como candidatos de vacuna para estudio adicional. La
figura 44A muestra un ejemplo de un resultado obtenido a partir de
un suero positivo para neutralización mientras que la figura 44B
muestra un ejemplo de un resultado obtenido a partir de un suero
negativo para neutralización.
Se llevaron a cabo ensayos de neutralización
in vitro usando sueros obtenidos de ratones inmunizados con
las proteínas recombinantes mencionadas en los ejemplos 1 a 10,
13-22, 24-26 y
29-37. Los resultados se presentan en la tabla II.
Estos resultados indican que CT045, CT242, CT381, CT396, CT398,
CT467, CT547, CT587 y CT681 son todos candidatos particularmente
buenos para obtener vacunas para prevenir la infección por C.
trachomatis. Estas propiedades no son evidentes a partir de las
secuencias solas.
En experimentos adicionales, los sueros
producidos frente a C. trachomatis se sometieron a prueba
frente a CE de C. pneumoniae para determinar la actividad de
neutralización cruzada. El procedimiento era según se describió
anteriormente, pero los CE de C. pneumoniae se diluyeron en
tampón SP para contener 3x10^{6} UFI/ml, y se añadieron 10 \mul
de esta suspensión a cada dilución de suero en un volumen final de
100 \mul. Los sueros obtenidos usando CT242 y CT467 pudieron
neutralizar de manera cruzada CE de C. pneumoniae.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (8)
1. El uso de una proteína en la fabricación de
un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección
debida a Chlamydia trachomatis, en el que la proteína es: (a)
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO:
61; (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene el 50% o más de identidad de secuencia con SEC ID NO: 61; o
(c) una proteína que comprende un fragmento de al menos 7
aminoácidos consecutivos de SEC ID NO: 61.
2. El uso de un ácido nucleico en la fabricación
de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una
infección debida a Chlamydia trachomatis, en el que el ácido
nucleico es: (a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de
nucleótidos SEC ID NO: 62; (b) un ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que tiene el 50% o más de identidad de
secuencia con SEC ID NO: 62; o (c) un ácido nucleico que comprende
un fragmento de al menos 10 nucleótidos consecutivos de SEC ID NO:
62.
3. El uso de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que la infección se trata o se previene
mediante el medicamento que provoca una respuesta inmunitaria que
es específica frente a un cuerpo elemental de Chlamydia.
4. El uso de una proteína según lo definido en
la reivindicación 1, o un ácido nucleico según lo definido en la
reivindicación 2, en la fabricación de un medicamento para
neutralizar cuerpos elementales de Chlamydia
trachomatis.
5. Una composición inmunogénica que comprende
una proteína y un adyuvante, en el que la proteína es: (a) una
proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 61;
(b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene el 50% o más de identidad de secuencia con SEC ID NO: 61; o
(c) una proteína que comprende un fragmento de al menos 7
aminoácidos consecutivos de SEC ID NO: 61.
6. Una composición inmunogénica que comprende un
ácido nucleico y un adyuvante, en la que el ácido nucleico es: (a)
un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID
NO: 62; (b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que tiene el 50% o más de identidad de secuencia con SEC
ID NO: 62; o (c) un ácido nucleico que comprende un fragmento de al
menos 10 nucleótidos consecutivos de SEC ID NO: 62.
7. La composición según la reivindicación 5 o la
reivindicación 6, para su uso como producto farmacéutico.
8. Un procedimiento para detectar un cuerpo
elemental de Chlamydia trachomatis en una muestra biológica,
que comprende la etapa de poner en contacto la muestra con un
anticuerpo que reconoce una proteína según lo definido en la
reivindicación 1.
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