MD4795C1 - Anticorp monoclonal anti-CTLA4 sau fragment de legare a acestuia la antigen, compoziţie farmaceutică şi utilizarea lor - Google Patents
Anticorp monoclonal anti-CTLA4 sau fragment de legare a acestuia la antigen, compoziţie farmaceutică şi utilizarea lor Download PDFInfo
- Publication number
- MD4795C1 MD4795C1 MDA20170022A MD20170022A MD4795C1 MD 4795 C1 MD4795 C1 MD 4795C1 MD A20170022 A MDA20170022 A MD A20170022A MD 20170022 A MD20170022 A MD 20170022A MD 4795 C1 MD4795 C1 MD 4795C1
- Authority
- MD
- Moldova
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- ctla4
- seq
- binding fragment
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 139
- 238000009739 binding Methods 0.000 title claims abstract description 139
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 120
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 120
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 120
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 63
- 102000043321 human CTLA4 Human genes 0.000 claims description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 23
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 11
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 11
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 238000001994 activation Methods 0.000 claims description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 7
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 7
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 5
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 11
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 abstract 2
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 116
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 116
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 77
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 65
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 60
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 41
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 41
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 40
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 26
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 17
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 17
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 11
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 11
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 208000024558 digestive system cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 201000010231 gastrointestinal system cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- 101150091887 Ctla4 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- -1 carbohydrate compounds Chemical class 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 108010045673 endodeoxyribonuclease XBAI Proteins 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
- G01N2333/70521—CD28, CD152
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Invenţia se referă la domeniile terapiei tumorilor şi imunologiei moleculare, şi anume la un anticorp monoclonal anti-CTLA4 sau la un fragment de legare a acestuia la antigen, la o compoziţie farmaceutică şi la utilizarea acestora. Anticorpul monoclonal, conform invenţiei, poate bloca legarea CTLA4 cu B7, îndepărta imunosupresia organismului de către CTLA4 şi activa limfocitele T.Secvenţe: 34
Description
Prezenta invenţie se referă la domeniile terapiei tumorale şi imunologiei moleculare. Prezenta invenţie se referă la un anticorp monoclonal anti-CTLA4 sau un fragment al acestuia de legare la antigen, la compoziţia lor farmaceutică, secvenţele lor de codificare şi utilizarea acestora în metode de diagnostic, profilaxie, terapie şi/sau terapie adjuvantă.
Antigenul 4 (abreviat CTLA4), asociat cu limfocitele T citotoxice, are un grad înalt de similaritate cu molecula CD28 după structura genei, localizarea cromozomială, homologia secvenţei şi expresia genică. Ambele molecule constituie receptori pentru molecula co-stimulatoare B7, exprimată în principal pe suprafaţa limfocitelor T activate. Cu toate acestea, în calitate de semnal co-stimulator pentru activarea limfocitelor, CTLA4 îndeplineşte funcţia opusă CD28. După legarea sa cu B7, CTLA4 poate inhiba activarea limfocitelor T murine şi umane, îndeplinind un rol regulator negativ în activarea limfocitelor T.
CTLA4 (mAbs) sau liganzii CTLA4 pot preveni legarea CTLA4 la liganzii săi nativi, blocând astfel transmiterea semnalului reglator negativ limfocitelor T prin intermediul CTLA4 şi îmbunătăţind sensibilitatea limfocitelor T faţă de diferiţi antigeni. Sub acest aspect, rezultatele studiilor in vivo şi in vitro în mare măsură se conformează. În prezent, au fost obţinuţi câţiva CTLA4 (mAbs) (10D1, 11.2.2) care se află în proces de testare clinică în tratamentul cancerului de prostată, cancerului de vezică urinară, cancerului colorectal, cancerului tractului gastrontestinal, cancerului de ficat, melanomului malign etc. [1, 2, 3]. Printre aceşti anticorpi, anticorpii 10D1 şi 11.2.2 sunt consideraţi ca anticorpi monoclonali anti-CTLA4 care demonstrează cel mai bun efect.
Interleukina-2 (IL-2) este produsă de către limfocitele T. Aceasta reprezintă un factor de creştere care reglementează subgrupul limfocitelor T. De asemenea, aceasta constituie un factor important de modulare a răspunsului imun. Ea poate stimula şi activa expresia limfocitelor B şi participă în răspunsul umoral, în hematopoieză şi în supravieţuirea tumorilor. IL-2 uman recombinat a fost aprobat de către Departamentul SUA privind controlul asupra calităţii produselor alimentare şi preparatelor farmaceutice pentru tratamentul tumorilor maligne (inclusiv a melanomului, tumorilor renale etc.). În plus, efectul său a fost cercetat în studiile clinice consacrate tratamentului infecţiei virale cronice (Pharmacologic administration of interleukin-2 Chavez, A.R., şi colab., Ann. N- Y Acad. Sci., 2009, 1182: 14-27).
Ca factori importanţi care afectează funcţia limfocitelor T, CTLA4 şi CTLA4 mAbs pot avea un efect terapeutic specific asupra bolilor prin tulburarea micromediului imun al organismului. Acestea au o eficienţă ridicată şi elimină deficienţele preparatelor medicamentoase tradiţionale, deschizând o nouă cale pentru terapia genică. CTLA4 şi CTLA4 mAbs sunt testate în cadrul unor experimente la diferite etape ale studiilor clinice. De exemplu, în bolile autoimune acestea au inhibat în mod eficient hipersensibilitatea cailor respiratorii în modelele animale de astm, au prevenit dezvoltarea bolilor reumatice, au mediat toleranţa imună la allo-transplant în organism şi a.m.d. Pe de altă parte, cu toate că terapia genică biologică nu a demonstrat nici un efect secundar nedorit în studiile clinice pe termen scurt, trebuie să se acorde atenţie unor posibile efecte în cazul utilizării sale prelungite. De exemplu, blocarea excesivă a semnalizării prin intermediul CTLA4 folosind CTLA4 mAbs poate conduce la dezvoltarea bolilor autoimune. Deoarece anticorpii se pot lega în mod specific cu antigenii lor şi pot induce liza celulelor ţintă sau pot bloca mersul procesului patologic, dezvoltarea şi utilizarea medicamentelor pe bază de anticorpi, în special de anticorpi umanizaţi, au o mare importanţă în tratamentul clinic al tumorilor maligne şi al altor afecţiuni imune la om.
În timpul de faţă există încă necesitatea de a dezvolta noi anticorpi, care să blocheze legarea CTLA4 cu B7, şi variante umanizate ale acestora.
După cercetări intensive şi eforturi creative, folosind sistemul de expresie în celulele de mamifer, autorii prezentei invenţii au obţinut un CTLA4 recombinant care a fost folosit în calitate de imunogen pentru imunizarea şoarecilor. Celulele hibridoma au fost obţinute prin fuziunea celulelor splenice murine cu celule de mielom. După screeningul unui mare număr de probe, autorii prezentei invenţii au obţinut o linie de celule hibridoma, capabilă să secrete şi să producă un anticorp monoclonal concret, care se leagă în mod specific la CTLA4 şi poate bloca cu o eficienţă înaltă legarea CTLA4 cu B7. De asemenea, au fost obţinuţi anticorpi umanizaţi. Astfel, se propun următoarele invenţii.
Într-un aspect al său prezenta invenţie se referă la un anticorp sau la un fragment al acestuia de legare la antigen, care se leagă cu CTLA4 uman, selectat din grupa constând din:
a) anticorp sau fragment al acestuia de legare la antigen, care cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu SECV. ID NO: 14 şi regiunea variabilă a lanţului uşor SECV. ID NO: 16; şi
b) anticorp sau fragment al acestuia de legare la antigen care cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu SECV. ID NO: 14 şi regiunea variabilă a lanţului uşor SECV. ID NO: 16, în care în secvenţa SECV. ID NO: 14 metionina din poziţia 18 poate fi substituită cu un aminoacid selectat din grupa constând din: leucină, valină, izoleucină şi alanină.
O variantă de realizare a prezentei invenţii este anticorpul menţionat anterior sau un fragment al acestuia de legare la antigen, în care metionina din poziţia 18 în SECV. ID Nr. 14 este substituită cu leucină şi regiunea variabilă a lanţului uşor SECV. ID Nr. 16.
O altă variantă de realizare a prezentei invenţii este anticorpul sau un fragment al acestuia de legare la antigen, care reprezintă un anticorp umanizat sau un fragment al acestuia de legare la antigen.
O altă variantă de realizare a prezentei invenţii este anticorpul sau un fragment al acestuia de legare la antigen, care se leagă la CTLA4 uman cu un KD mai mic de aproximativ 10-5 M, după cum a fost determinat prin rezonanţă plasmatică de suprafaţă.
O altă variantă de realizare a prezentei invenţii este anticorpul sau un fragment al acestuia de legare la antigen, în care anticorpul sau fragmentul acestuia de legare la antigen:
(a) blochează legarea CTLA4 uman cu B7 uman;
(b) reglează activitatea CTLA4 uman;
(c) înlătură imunosupresia organismului de către CTLA4 uman;
(d) activează limfocitele T; şi/sau
(e) sporeşte nivelul de expresie al IL-2 în limfocitele T.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la una sau mai multe molecule de acizi nucleici izolate, care codifică anticorpul sau fragmentul acestuia de legare la antigen.
O variantă de realizare a prezentei invenţii este una sau mai multe molecule de acizi nucleici izolate, în care una sau mai multe molecule de acizi nucleici izolate conţin secvenţa nucleotidă, reprezentată de secvenţa SECV. ID NO: 13 sau SECV. ID NO: 15.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la un vector, care conţine o moleculă de acid nucleic izolată.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o celulă gazdă care conţine vectorul menţionat mai sus.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la un procedeu de obţinere a unui anticorp sau a unui fragment al acestuia de legare la antigen, care cuprinde etapele de cultivare a celulei gazdă, conform invenţiei, în condiţii adecvate şi de izolare a anticorpului sau a fragmentului acestuia de legare la antigen din cultura celulară.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o compoziţie farmaceutică cu conţinut de un anticorp sau un fragment al acestuia de legare la antigen şi un purtător farmaceutic acceptabil şi/sau un adjuvant.
O altă variantă a prezentei invenţii este anticorpul menţionat mai sus sau un fragment al acestuia de legare la antigen pentru utilizare într-un procedeu de tratare a unui subiect, care este o fiinţă umană, suferindă de tumoare, cum ar fi melanom, tumoare renală/cancer renal, cancer de prostată, cancer de vezică urinară, cancer colorectal, cancer al tractului gastro-intestinal şi/sau tumoare hepatică/cancer hepatic.
O altă variantă a prezentei invenţii este anticorpul menţionat sau un fragment al acestuia de legare la antigen pentru utilizare în procedeul de tratare a limfomului.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la un procedeu in vitro, care cuprinde etapa de introducere în celule a unei cantităţi eficiente de anticorp menţionat mai sus sau dintr-un fragment al acestuia de legare la antigen, în care acest procedeu este selectat dintre următoarele procedee:
(a) procedeu de detectare a nivelului de CTLA4 uman într-o probă,
(b) procedeu de blocare a legării CTLA4 uman cu B7 uman,
(c) procedeu de reglare a activităţii CTLA4 uman sau a nivelului de CTLA4 uman,
(d) procedeu de înlăturare a imunosupresiei organismului de către CTLA4 uman,
(e) procedeu de activare a limfocitelor T, sau
(f) procedeu de creştere a nivelului de exprimare a IL-2 în limfocitele T.
Într-un aspect prezenta dezvăluire se referă la un anticorp monoclonal sau un fragment al acestuia de legare la antigen, în care respectivul anticorp monoclonal cuprinde regiuni de determinare a complementarităţii (CDR-uri), selectate dintre următoarele:
HCDR1, care cuprinde secvenţa de aminoacizi SECV. ID Nr. 27,
HCDR2, care cuprinde secvenţa de aminoacizi SECV. ID Nr. 28, şi
HCDR3, care cuprinde secvenţa de aminoacizi SECV. ID Nr. 29;
şi/sau
LCDR1, care cuprinde secvenţa de aminoacizi SECV. ID Nr. 30,
LCDR2, care cuprinde secvenţa de aminoacizi SECV. ID Nr. 31, şi
LCDR3, care cuprinde secvenţa de aminoacizi, selectată dintre SECV. ID Nr. 32, SECV. ID Nr. 33 şi SECV. ID Nr. 34.
Anticorp monoclonal sau un fragment al acestuia de legare la antigen conform oricăreia dintre aspectele ale prezentei dezvăluiri, în care secvenţa de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu (VH) a acestui anticorp monoclonal este selectată dintre SECV. ID Nr. 6, SECV. ID Nr. 10, SECV. ID Nr. 14 şi SECV. ID Nr. 18;
şi/sau
secvenţa de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului uşor (VL) a acestui anticorp monoclonal este selectată dintre SECV. ID Nr. 8, SECV. ID Nr. 12, SECV. ID Nr. 16, SECV. ID Nr. 20, SECV. ID Nr. 22 şi SECV. ID Nr. 24.
Anticorp monoclonal sau un fragment al acestuia de legare la antigen în conformitate cu oricare din aspectele ale prezentei dezvăluiri, în care acest anticorp monoclonal cuprinde:
(1) VH, prezentată în SECV. ID Nr. 6 şi VL, prezentată în SECV. ID Nr. 8;
(2) VH, prezentată în SECV. ID Nr. 10 şi VL, prezentată în SECV. ID Nr. 12;
(3) VH, prezentată în SECV. ID Nr. 14 şi VL, prezentată în SECV. ID Nr. 16;
(4) VH, prezentată în SECV. ID Nr. 18 şi VL, prezentată în SECV. ID Nr. 20;
(5) VH, prezentată în SECV. ID Nr. 14 şi VL, prezentată în SECV. ID Nr. 22; sau
(6) VH, prezentată în SECV. ID Nr. 14 şi VL, prezentată în SECV. ID Nr. 24.
În prezenta dezvăluire, grupurile menţionate mai sus (1)-(6) conţin secvenţele de aminoacizi ale regiunii variabile a lanţului greu şi ale regiunii variabile a lanţului uşor ale anticorpilor 8D2/8D2(Re), 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17, respectiv.
În particular, metionina (Met) din poziţia 18 SECV. ID Nr. 6, SECV. ID Nr. 10 şi SECV. ID Nr. 14 este înlocuită în mod independent cu un aminoacid selectat dintre următorii aminoacizi: leucină (Leu), valină (Val), izoleucină (Ile) sau alanină (Ala).
Preparatele terapeutice pe bază de anticorpi, în special pe anticorpi monoclonali (MAB), au demonstrat o eficacitate excelentă în tratamentul unor anumite boli. Procedeul standard de obţinere a unor astfel de anticorpi terapeutici constă în imunizarea animalului cu un antigen, obţinerea de la acest animal imunizat a anticorpilor pentru acest antigen, sau îmbunătăţirea anticorpilor care au o afinitate scăzută faţă de antigen folosind maturarea afinităţii. Cu toate acestea, un astfel de procedeu consumă mult timp, necesită o muncă intensă şi, de asemenea, adesea prin intermediul acestuia nu pot fi obţinuţi anticorpi specifici pentru un anumit epitop al antigenului.
Legarea la antigen depinde de regiunile variabile ale lanţului uşor şi lanţului greu; regiunea variabilă a fiecărui lanţ cuprinde trei porţiuni hipervariabile, denumite şi regiune de determinare a complementarităţii (CDR) (lanţul greu (H) cuprinde HCDR1, HCDR2 şi HCDR3, iar lanţul uşor (L) cuprinde LCDR1, LCDR2 şi LCDR3; vezi definiţia la Kabat şi colab., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (1991), Vol. 1-3, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md).
Secvenţele de aminoacizi ale CDR-urilor din secvenţele anticorpilor monoclonali ale aspectelor menţionate mai sus (1)-(6) au fost analizate prin procedee tehnice bine cunoscute specialiştilor în domeniul respectiv al tehnicii, de exemplu, prin intermediul analizei bazei de date VBASE2. Rezultatele sunt prezentate în continuare.
(1) Secvenţele de aminoacizi a 3 CDR-uri ale regiunii variabile a lanţului greu sunt prezentate mai jos:
HCDR1: GFTFSDNW (SECV. ID Nr. 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SECV. ID Nr. 28),
HCDR3: TAQFAY (SECV. ID Nr. 29).
Secvenţele de aminoacizi a 3 CDR-uri ale regiunii variabile a lanţului uşor sunt prezentate mai jos:
LCDR1: ENIYGG (SECV. ID Nr. 30),
LCDR2: GAT (SECV. ID Nr. 31),
LCDR3: QNVLRSPFT (SECV. ID Nr. 32).
(2) Secvenţele de aminoacizi a 3 CDR-uri ale regiunii variabile a lanţului greu sunt prezentate mai jos:
HCDR1: GFTFSDNW (SECV. ID Nr. 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SECV. ID Nr. 28),
HCDR3: TAQFAY (SECV. ID Nr. 29).
Secvenţele de aminoacizi a 3 CDR-uri ale regiunii variabile a lanţului uşor sunt prezentate mai jos:
LCDR1: ENIYGG (SECV. ID Nr. 30)
LCDR2: GAT (SECV. ID Nr. 31),
LCDR3: QNVLRSPFT (SECV. ID Nr. 32).
(3) Secvenţele de aminoacizi a 3 CDR-uri ale regiunii variabile a lanţului greu sunt prezentate mai jos:
HCDR1: GFTFSDNW (SECV. ID Nr. 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SECV. ID Nr. 28),
HCDR3: TAQFAY (SECV. ID Nr. 29).
Secvenţele de aminoacizi a 3 CDR-uri ale regiunii variabile a lanţului uşor sunt prezentate mai jos:
LCDR1: ENIYGG (SECV. ID Nr. 30),
LCDR2: GAT (SECV. ID Nr. 31),
LCDR3: QNVLRSPFT (SECV. ID Nr. 32).
(4) Secvenţele de aminoacizi a 3 CDR-uri ale regiunii variabile a lanţului greu sunt prezentate mai jos:
HCDR1: GFTFSDNW (SECV. ID Nr. 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SECV. ID Nr. 28),
HCDR3: TAQFAY (SECV. ID Nr. 29).
Secvenţele de aminoacizi a 3 CDR-uri ale regiunii variabile a lanţului uşor sunt prezentate mai jos:
LCDR1: ENIYGG (SECV. ID Nr. 30),
LCDR2: GAT (SECV. ID Nr. 31),
LCDR3: QNVLRSPFT (SECV. ID Nr. 32).
(5) Secvenţele de aminoacizi a 3 CDR-uri ale regiunii variabile a lanţului greu sunt prezentate mai jos:
HCDR1: GFTFSDNW (SECV. ID Nr. 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SECV. ID Nr. 28),
HCDR3: TAQFAY (SECV. ID Nr. 29).
Secvenţele de aminoacizi a 3 CDR-uri ale regiunii variabile a lanţului uşor sunt prezentate mai jos:
LCDR1: ENIYGG (SECV. ID Nr. 30),
LCDR2: GAT (SECV. ID Nr. 31),
LCDR3: QNVLSRHPG (SECV. ID Nr. 33).
(6) Secvenţele de aminoacizi a 3 CDR-uri ale regiunii variabile a lanţului greu sunt prezentate mai jos:
HCDR1: GFTFSDNW (SECV. ID Nr. 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SECV. ID Nr. 28),
HCDR3: TAQFAY (SECV. ID Nr. 29).
Secvenţele de aminoacizi a 3 CDR-uri ale regiunii variabile a lanţului uşor sunt prezentate mai jos:
LCDR1: ENIYGG (SECV. ID Nr. 30),
LCDR2: GAT (SECV. ID Nr. 31),
LCDR3: QNVLSSRPG (SECV. ID Nr. 34).
Anticorp monoclonal sau un fragment al acestuia de legare la antigen în conformitate cu oricare dintre variantele de realizare a prezentei invenţii, în care acest anticorp monoclonal sau fragmentul acestuia de legare la antigen este selectat dintre Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, dintre un fragment al regiunii de determinare a complementarităţii, un anticorp monocatenar (de exemplu, scFv), un anticorp umanizat, un anticorp hibrid sau un diacorp.
Anticorp monoclonal sau un fragment al acestuia de legare la antigen în conformitate cu oricare variantă de realizare a prezentei invenţii, în care acest anticorp monoclonal se leagă la proteina CTLA4 cu un KD mai mic de aproximativ 10-5 M, cum ar fi mai puţin de aproximativ 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M sau 10-10 M, sau mai puţin.
Anticorp monoclonal sau un fragment al acestuia de legare la antigen în conformitate cu oricare dintre variantele de realizare a prezentei invenţii, în care acest anticorp monoclonal cuprinde regiuni care nu sunt CDR, şi aceste regiuni non-CDR sunt obţinute din anticorpii unei specii diferite de cea a şoarecelui, de exemplu, din anticorpi umani.
Anticorp monoclonal sau un fragment al acestuia de legare la antigen conform prezentei invenţii reprezintă un anticorp monoclonal anti-CTLA4 sau un fragment al acestuia de legare la antigen, care se poate lega în mod specific la CTLA4.
Anticorp monoclonal sau un fragment al acestuia de legare la antigen în conformitate cu oricare dintre aspectele ale prezentei dezvăluiri pentru utilizare în prevenirea şi/sau tratamentul şi/sau terapia adjuvantă şi/sau diagnosticarea tumorii; în special, a tumorii selectate dintre un melanom, o tumoare renală/cancer de rinichi, un cancer de prostată, un cancer de vezică urinară, un cancer colorectal, un cancer al tractului gastrointestinal şi o tumoare hepatică/cancer de ficat.
Anticorp monoclonal conform oricăreia dintre variantele de realizare a prezentei invenţii pentru utilizare în:
blocarea legării CTLA4 cu B7,
reglarea (de exemplu, suprimarea) activităţii CTLA4 sau nivelului de CTLA4,
îndepărtarea imunosupresiei organismului prin CTLA4 sau
activarea limfocitelor T sau creşterea nivelul de expresie a IL-2 în limfocitele T.
Într-un alt aspect, prezenta dezvăluire se referă la o moleculă de acid nucleic izolată cuprinzând o secvenţă nucleotidică capabilă să codifice regiunea variabilă a lanţului greu de anticorp, în care această regiune variabilă a lanţului greu de anticorp cuprinde CDR-uri având secvenţe de aminoacizi SECV. ID Nr. 27-29; în special, regiunea variabilă a lanţului greu de anticorp are o secvenţă de aminoacizi, prezentată în SECV. ID Nr. 6, SECV. ID Nr. 10, SECV. ID Nr. 14 sau SECV. ID Nr. 18; mai concret, molecula de acid nucleic include o secvenţă de nucleotide, prezentată în SECV. ID Nr. 5, SECV. ID Nr. 9, SECV. ID Nr. 13 sau SECV. ID Nr. 17.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la molecule de acid nucleic izolate care codifică anticorpul monoclonal sau un fragment al acestuia de legare la antigen conform prezentei invenţii. Astfel de molecule de acid nucleic pot fi izolate din celulele hibridoma sau preparate prin tehnici recombinante de inginerie genetică sau prin procedee de sinteză chimică.
În următorul său aspect, prezenta dezvăluire se referă la o moleculă de acid nucleic izolată cuprinzând o secvenţă nucleotidică capabilă să codifice regiunea variabilă a lanţului uşor de anticorp, în care această regiune variabilă a lanţului uşor de anticorp cuprinde:
1) CDR-uri având secvenţele de aminoacizi din SECV. ID Nr. 30-32;
2) CDR-uri având secvenţele de aminoacizi din SECV. ID Nr. 30, SECV. ID Nr. 31 şi SECV. ID Nr. 33; sau
3) CDR-uri având secvenţele de aminoacizi din SECV. ID Nr. 30, SECV. ID Nr. 31 şi SECV. ID Nr. 34;
în particular, regiunea variabilă a lanţului uşor de anticorp cuprinde secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV. ID Nr. 8, SECV. ID Nr. 12, SECV. ID Nr. 16, SECV. ID Nr. 20, SECV. ID Nr. 22 sau SECV. ID Nr. 24;
mai concret, molecula de acid nucleic conţine secvenţa de nucleotide prezentată în SECV. ID Nr. SECV. ID Nr. 7, SECV. ID Nr. 11, SECV. ID Nr. 15, SECV. ID Nr. 19, SECV. ID Nr. 21 sau SECV. ID Nr. 23.
În următorul său aspect, prezenta invenţie se referă la un vector care conţine o moleculă de acid nucleic izolată în conformitate cu oricare dintre variantele de realizare ale prezentei invenţii. Vectorul conform prezentei invenţii poate fi un vector de clonare sau un vector de expresie. Într-o variantă preferabilă de realizare a invenţiei, vectorul conform prezentei invenţii constituie, de exemplu, o plasmidă, o cosmidă, un bacteriofag sau altele similare.
În următorul său aspect, prezenta invenţie se referă la o celulă gazdă care cuprinde o moleculă de acid nucleic izolată în conformitate cu oricare dintre variantele de realizare ale prezentei invenţii sau un vector conform prezentei invenţii. Astfel de celule gazdă includ, fără a se limita la acestea, celule procariote, cum ar fi celulele E. coli, şi celule eucariote, cum ar fi celulele de drojdie, celulele de insecte, celulele vegetale şi celulele animale (de exemplu, celulele de mamifere, inclusiv celulele murine, celulele umane sau altele similare). Celulele conform prezentei invenţii pot reprezenta, de asemenea, o linie de celule, cum ar fi linia de celule 293T.
În următorul său aspect, prezenta invenţie se referă la un procedeu de preparare a unui anticorp monoclonal sau a unui fragment al acestuia de legare la antigen în conformitate cu oricare variantă de realizare a prezentei invenţii, procedeul în cauză cuprinde etapele de cultivare a celulei gazdă în condiţii adecvate conform prezentei invenţii şi izolarea din cultură celulară a anticorpului monoclonal sau a fragmentului acestuia de legare la antigen.
În următorul său aspect, prezenta dezvăluire se referă la un conjugat care cuprinde un anticorp monoclonal sau un fragment al acestuia de legare la antigen şi molecula conjugată, în care anticorpul monoclonal reprezintă un anticorp monoclonal sau un fragment al acestuia de legare la antigen în conformitate cu oricare variantă de realizare a prezentei invenţii, şi molecula conjugată constituie un marker detectabil. În particular, molecula conjugată reprezintă un radioizotop, o substanţă fluorescentă, o substanţă luminiscentă, o substanţă cromogenă sau o enzimă (de exemplu, peroxidază din hrean).
În următorul său aspect, prezenta dezvăluire se referă la un kit de reactivi care cuprinde un anticorp monoclonal sau un fragment al acestuia de legare la antigen în conformitate cu oricare variantă de realizare a prezentei invenţii, sau un conjugat al prezentei invenţii; în particular, kitul de reactivi cuprinde suplimentar un al doilea anticorp care recunoaşte în mod specific respectivul anticorp monoclonal sau fragmentul acestuia de legare la antigen; la necesitate, al doilea anticorp suplimentar menţionat cuprinde un marker detectabil, de exemplu, un radioizotop, o substanţă fluorescentă, o substanţă luminescente, o substanţă cromogenă sau o enzimă (de exemplu, peroxidază din hrean).
În următorul său aspect, prezenta dezvăluire se referă la utilizarea unui anticorp monoclonal sau a unui fragment al acestuia de legare la antigen, în conformitate cu oricare dintre variantele de realizare a prezentei invenţii, la prepararea kitului de reactivi, care este utilizat la detectarea prezenţei sau a nivelului de CTLA4 într-o probă.
Un alt aspect se referă la o compoziţie farmaceutică care cuprinde un anticorp monoclonal sau un fragment al acestuia de legare la antigen în conformitate cu oricare dintre variantele de realizare a prezentei invenţii, sau un conjugat conform prezentei invenţii; dacă este necesar, compoziţia farmaceutică menţionată mai cuprinde suplimentar un purtător acceptabil farmaceutic şi/sau un excipient.
Un alt aspect se referă la utilizarea unui anticorp monoclonal sau a unui fragment al acestuia de legare la antigen, în conformitate cu oricare dintre variantele de realizare a prezentei invenţii, sau a unui conjugat în conformitate cu prezenta invenţie, la prepararea unui medicament pentru aplicare în prevenirea şi/sau tratamentul şi/sau terapia adjuvantă şi/sau diagnosticarea tumorii; în particular, a tumorii selectate dintre un melanom, o tumoare renală/cancer de rinichi, un cancer de prostată, un cancer de vezică urinară, un cancer colorectal, un cancer al tractului gastrointestinal şi o tumoare hepatică/cancer la ficat.
Un alt aspect se referă la utilizarea unui anticorp monoclonal sau a unui fragment al acestuia de legare la antigen, în conformitate cu oricare dintre variantele de realizare a prezentei invenţii, sau a unui conjugat conform prezentei invenţii, la prepararea următorului agent:
agentului care detectează prezenţa sau nivelul de CTLA4 într-o probă,
agentului care blochează legarea CTLA4 cu B7,
agentului care reglează (de exemplu, inhibă) activitatea CTLA4 sau nivelul de CTLA4,
agentului care înlătură imunosupresia organismului de către CTLA4,
agentului care activează limfocitelele T, sau
agentului care creşte nivelul de expresie al IL-2 în limfocitele T.
Un alt aspect se referă la un procedeu in vivo sau in vitro care cuprinde etapa de administrare în celule a unei cantităţi eficiente dintr-un anticorp monoclonal sau dintr-un fragment al acestuia de legare la antigen în conformitate cu oricare dintre variantele de realizare a prezentei invenţii, sau a unui conjugat conform prezentei invenţii, în care procedeul dat este selectat dintre următoarele procedee:
procedeu de detectare a prezenţei sau a nivelului de CTLA4 într-o probă,
procedeu de blocare a legarii CTLA4 cu B7,
procedeu de reglare (de exemplu, suprimare) a activităţii CTLA4 sau a nivelului de CTLA4,
procedeu de eliminare a imunosupresiei organismului de către CTLA4,
procedeu de activare a limfocitelor T, sau
procedeu de creştere a nivelului de expresie a IL-2 în limfocitele T.
Asemenea procedee pot fi utilizate în scopuri diagnostice sau terapeutice sau în scopuri non-diagnostice sau non-terapeutice (de exemplu, în cazure în care proba este o probă de celule, şi nu o probă obţinută de la un pacient).
Un alt aspect se referă la un procedeu de profilaxie şi/sau tratament şi/sau tratament adjuvant şi/sau diagnosticare a unei tumori cuprinzând administrarea la subiect a unei cantităţi eficiente dintr-un anticorp monoclonal sau dintr-un fragment al acestuia de legare la antigen în conformitate cu oricare aspect al prezentei dezvăluiri, sau dintr-un conjugat al prezentei invenţii; în particular, a unei tumori selectate dint-un melanom, o tumoare renală/un cancer de rinichi, un cancer de prostată, un cancer de vezică urinară, un cancer colorectal, un cancer al tractului gastrointestinal şi o tumoare hepatică/cancer de ficat.
În prezenta invenţie, dacă nu se specifică altfel, termenii ştiinţifici şi tehnici utilizaţi aici au aceeaşi semnificaţie care este înţeleasă în general de către specialiştii în domeniu. De asemenea, procedeele de cultură celulară, genetică moleculară, chimie a acizilor nucleici, imunologie care sunt utilizate aici constituie metodici folosite pe scară largă în domeniul corespunzător al tehnicii. În acelaşi timp, pentru o mai bună înţelegere a prezentei invenţii, în continuare sunt prezentate definiţiile şi explicaţiile termenilor relevanţi.
În prezenta descriere, atunci când se face referire la secvenţa de aminoacizi a proteinei CTLA4 (antigenul 4 asociat limfocitelor citotoxice T), acest termin include proteina CTLA4 completă sau o porţiune extracelulară CTLA4ECD de CTLA4 (SECV. ID Nr. 2), sau un fragment care conţine CTLA4ECD; acesta include, de asemenea, proteina de fuziune CTLA4ECD, de exemplu, un fragment fuzionat cu fragmentul Fc-proteină al IgG (mFc) murin (SECV. ID Nr.3). Cu toate acestea, după cum pot aprecia specialiştii în domeniul respectiv al tehnicii, o mutaţie sau o modificare (incluzând, fără limitare la aceasta, substituirea, distrugerea şi/sau adăugarea) pot apărea în mod firesc sau pot fi introduse în mod artificial în secvenţa de aminoacizi a proteinei CTLA4, fără a afecta funcţiile sale biologice. Astfel, în prezenta invenţie termenul de „proteină CTLA4” include toate aceste secvenţe, inclusiv secvenţa prezentată în SECV. ID Nr. 2, precum şi variantele sale nativă sau artificială. De asemenea, atunci când se face referinţă la un fragment de secvenţă a proteinei CTLA4, termenul în cauză include nu doar fragmentul secvenţei SECV. ID Nr. 2, ci şi fragmentele corespunzătoare ale secvenţei din variantele nativă sau artificială.
Termenul «B7», aşa cum este utilizat în prezenta invenţie, dacă nu se specifică altfel, se referă la B7-1 şi/sau B7-2; secvenţele lor proteice specifice ţin de secvenţele cunoscute în stadiul actual al tehnicii. Se poate face referire la secvenţele descrise în literatura de specialitate din stadiul anterior al tehnicii sau în baza de date GenBank, de exemplu, B7-1 (CD80, NCBI Gene ID: 941), B7-2 (CD86, NCBI Gene ID: 942).
Termenul «CE50», aşa cum este utilizat în invenţia de faţă, se referă la o concentraţie care are 50% din efectul maxim, adică concentraţie asigurând 50% din efectul maxim.
Termenul „anticorp”, aşa cum este utilizat în prezenta invenţie, se referă la o moleculă de imunoglobulină, care este formată, de regulă, din două perechi de lanţuri polipeptidice (fiecare pereche având lanţul „uşor” (L) şi lanţul „greu” (H)). Lanţurile uşoare ale anticorpului pot fi clasificate ca κ şi λ lanţ uşor. Lanţurile grele pot fi clasificate ca µ, δ, γ, α sau ε, şi izotipele anticorpilor sunt definite ca IgM, IgD, IgG, IgA şi IgE, respectiv. În interiorul lanţului uşor şi al lanţului greu regiunea variabilă şi regiunea constantă se leagă prin regiunea „J”, formată din aproximativ 12 sau mai mulţi aminoacizi, iar lanţul greu cuprinde suplimentar regiunea „D” constând din aproximativ 3 sau mai mulţi aminoacizi. Fiecare lanţ greu constă dintr-o regiune variabilă a lanţului greu (VH) şi o regiune constantă a lanţului greu (CH). Regiunea constantă a lanţului greu este compusă din trei domenii (CH1, CH2 şi CH3). Fiecare lanţ uşor este format dintr-o regiune variabilă a lanţului uşor (VL) şi o regiune constantă a lanţului uşor (CL). Regiunea constantă a lanţului uşor constă din domeniul CL. Regiunea constantă a anticorpului poate intermedia legarea imunoglobulinei cu ţesuturile sau factorii organismului gazdă, inclusiv cu diferite celule ale sistemului imunitar (de exemplu, cu celulele efectoare) şi cu prima componentă a sistemului complement clasic (C1q). Regiunile VH şi VL pot fi divizate suplimentar în regiuni cu o variabilitate mare (denumite regiuni de determinare a complementarităţii (CDR-uri)), în regiuni separate, denumite regiuni cadru (FR), care sunt relativ conservative. Fiecare VH sau VL este compus din 3 CDR-uri şi 4 FR, aranjate în următoarea ordine începând de la capătul amino-terminal spre capătul carboxi-terminal: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Regiunile variabile (VH şi VL) ale fiecărei perechi de lanţ greu/lanţ uşor formează situsul de legare la antigen, respectiv. Atribuirea aminoacizilor la fiecare regiune sau domeniu se efectuează în conformitate cu definiţia dată de către Kabat - Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 şi 1991)), sau de către Chothia & Lesk (1987) J. Mol . Biol. 196: 901-917; Chothia şi colab. (1989) Nature 342: 878-883. Termenul „anticorp” nu se limitează la vreun procedeu concret de obţinere a anticorpului. De exemplu, acesta include, în particular, anticorpi recombinanţi, anticorpi monoclonali şi anticorpi policlonali. Anticorpii pot reprezenta anticorpi de diferite izotipe, cum sunt anticorpii IgG (de exemplu, subtipurile IgG1, IgG2, IgG3 sau IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE sau IgM.
Termenul „fragment de legare la antigen” a unui anticorp, aşa cum este utilizat aici, se referă la o polipeptidă cuprinzând un fragment de anticorp cu dimensiunea completă, care păstrează capacitatea de a se lega în mod specific la un antigen cu care se leagă acest anticorp cu dimensiunea completă şi/sau de a concura cu acest anticorp de dimensiune completă pentru legarea specifică la antigen. De asemenea, acest fragment este denumit „porţiune de legare la antigen”. Descrierea generală a se vedea în cartea Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., Second Edition, Raven Press, N.Y. (1989)). Fragmentele de anticorpi de legare la antigen pot fi obţinute prin intermediul tehnologiei ADN recombinante sau prin scindarea enzimatică sau chimică a anticorpilor intacţi. În unele cazuri, fragmentele de legare la antigen includ fragmentele Fab, Fab′, F(ab′)2, Fd, Fv, dAb, fragmentul regiunii de determinare a complementarităţii, anticorpul cu un singur lanţ (de exemplu, scFv), anticorpul himeric, diacorpul şi astfel de polipeptide care conţin cel puţin o porţiune dintr-un anticorp, suficientă pentru a conferi acestei polipeptide capacitatea de a se lega în mod specific la antigen.
Termenul „Fd-fragment”, aşa cum este utilizat aici, se referă la un fragment de anticorp care constă din domeniul VH şi domeniul CH1; termenul „Fv-fragment” se referă la un fragment de anticorp care constă din domeniul VL şi domeniul VH ale unui singur braţ al unui anticorp; termenul „dAb-fragment” se referă la un fragment de anticorp care constă din domeniul VH (Ward şi colab., Nature 341: 544-546 (1989)); termenul „Fab-fragment” se referă la un fragment de anticorp care constă din domeniile VL, VH, CL şi CH1; şi termenul „F(ab′)2-fragment” se referă la un fragment de anticorp constând din două Fab-fragmente, asociate prin punţi disulfurice la regiunea „balama”.
În unele cazuri, fragmentul de legare la antigen al anticorpului reprezintă un anticorp cu un singur lanţ (de exemplu, scFv), în care domeniile VL şi VH sunt asociate între ele printr-un element de legare (linker), care asigură obţinerea unui singur lanţ polipeptidic cu formarea unei molecule monovalente (a se vedea, de exemplu, Bird şi colab., Science 242: 423-426 (1988) şi Huston şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)). Asemenea molecule scFv pot avea o structură comună NH2-VL-linker-VH-COOH sau NH2-VH-linker-VL-COOH. Linkerii indicaţi, cunoscuţi din stadiul tehnicii, constau din secvenţa de aminoacizi repetitivă GGGGS sau din variantele acesteia. De exemplu, poate fi utilizat un agent de legare având secvenţa de aminoacizi (GGGGS)4, însă, de asemenea, pot fi utilizate şi variantele sale (Holliger şi colab. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Alţi linkeri adecvaţi pentru a fi utilizaţi în prezenta invenţie sunt descrişi în Alfthan şi colab. (1995) Protein Eng. 8: 725-731; Choi şi colab. (2001) Eur. J. Immunol. 31: 94-106; Hu şi colab. (1996) Cancer Res. 56: 3055-3061; Kipriyanov şi colab. (1999) J. Mol. Biol. 293: 41-56 şi Roovers şi colab. (2001) Cancer Immunol.
În unele cazuri, fragmentul de legare la antigen al anticorpului este un diacorp (anticorp bivalent), în care domeniile VH şi VL sunt exprimate pe un singur lanţ polipeptidic. Cu toate acestea, linkerul utilizat este prea scurt şi aceste două domenii nu pot forma pe acelaşi lanţ o pereche unul cu celălalt, fiind forţate să se imperecheze cu un domeniu complementar pe un alt lanţ. Datorită acestui fapt, se formează doua situsuri de legare la antigen (vezi, de exemplu, Holliger P. şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) şi Poljak R.J. şi colab., Structure 2: 1121-1123 (1994)).
Fragmentele de legare la antigen ale anticorpilor (de exemplu, fragmentele de anticorpi indicate mai sus) pot fi derivate din anticorpii menţionaţi (de exemplu, anticorpul monoclonal 8D2, descris în invenţia de faţă), folosind metode standard, cunoscute specialiştilor în domeniu (de exemplu, prin tehnologii ADN recombinante sau procedee de clivaj enzimatic sau chimic), şi pot fi supuse testării la specificitate prin aceleaşi procedee ca şi anticorpii intacţi.
În prezenta invenţie, dacă din ontext nu reiese în mod clar altceva, termenul „anticorp” include nu doar anticorpii intacţi, dar şi fragmentele de legare la antigen ale anticorpilor.
Termenul „mAb” sau „anticorp monoclonal”, aşa cum este utilizat în invenţia de faţă, se referă la un anticorp sau la un fragment de anticorp dintr-un grup de molecule de anticorpi în cel mai înalt grad omogene, şi anume, anticorpii separaţi, care constituie grupul, sunt identici, cu excepţia unor posibile mutaţii apărute în mod natural. Anticorpii monoclonali sunt înalt specifici în raport cu un epitop al antigenului. Spre deosebire de anticorpii monoclonali, preparatele anticorpilor policlonali includ, de regulă, cel puţin două sau mai multe tipuri de diferiţi anticorpi care recunosc diferiţi epitopi ai antigenului. De regulă, anticorpii monoclonali pot fi preparaţi utilizând tehnologia hibridoma, descrisă pentru prima dată în Kohler şi colab. (Nature, 256: 495, 1975), sau pot fi obţinuţi folosind tehnologia ADN recombinanţi (vezi, de exemplu, brevetul US Nr. 4816567).
În prezenta invenţie, anticorpul monoclonal numerotat este identic cu anticorpul monoclonal obţinut din hibridomul cu acelaşi număr. De exemplu, anticorpul monoclonal 8D2 este identic cu anticorpul obţinut din linia de celule hibridoma 8D2 sau din subclonele sale, sau din celule fiice.
Termenul „anticorp hibrid”, aşa cum este utilizat în această invenţie, se referă la un asemenea anticorp, în care o porţiune a lanţului uşor şi/sau a lanţului greu este obţinută dintr-un singur anticorp (care poate fi preparat dintr-o anumită specie sau aparţine unei clase sau subclase concrete de anticorpi), în timp ce cealaltă parte a lanţului uşor şi/sau a lanţului greu este obţinută dintr-un alt anticorp (care poate fi derivată dintr-o specie identică sau diferită, sau aparţinând unei clase sau subclase identice sau diferite de anticorpi), cu condiţia că acesta îşi păstrează capacitatea de legare la antigenul ţintă (Brevetul US Nr. 4816567, eliberat pe numele Cabilly şi colab.; Morrison şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)).
Termenul „anticorp umanizat”, utilizat în prezenta invenţie, se referă la un anticorp sau un fragment de anticorp obţinut după înlocuirea tuturor sau a câtorva CDR-uri ale unei imunoglobuline umane (anticorp recipient) cu CDR-uri ale unui anticorp non-uman (anticorp donor), în care anticorpul donor poate reprezenta un anticorp non-uman (de exemplu, de şoarece, de şobolan sau de iepure) cu specificitatea, afinitatea sau reactivitatea dorite. În afară de aceasta, unele resturi de aminoacizi ale regiunilor cadru (FR) ale anticorpului recipient pot fi înlocuite cu resturi aminoacide respective de anticorp non-uman sau cu resturi de aminoacizi ale altor anticorpi, cu scopul de a îmbunătăţi în continuare sau de a optimiza caracteristicile anticorpului. Mai multe informaţii despre anticorpii umanizaţi a se vedea, de exemplu, la Jones şi colab., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann şi colab., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992); şi Clark, Immunol. Today 21: 397-402 (2000).
Termenul „anticorp de neutralizare”, aşa cum este utilizat în invenţia propusă, se referă la un anticorp sau la un fragment de anticorp care este capabil de a elimina sau de a reduce în mod semnificativ virulenţa virusului ţintă (de exemplu, capacitatea sa de a infecta celulele).
Termenul „epitop”, aşa cum este utilizat în această descriere, se referă la o porţiune de antigen care se leagă într-un mod specific cu o imunoglobulină sau cu un anticorp. În domeniul de referinţă al tehnicii, „epitopul” mai este denumit şi „determinant antigenic”. De regulă, epitopul sau determinantul antigenic constă din grupuri de suprafaţă ale moleculei chimic active, cum ar fi, de exemplu, din aminoacizi sau compuşi de carbohidraţi sau din catene laterale de carbohidraţi şi, de regulă, deţine caracteristici specifice de structură tridimensională şi caracteristici specifice de sarcină. De exemplu, în mod obişnuit epitopul include cel puţin 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 sau 15 aminoacizi consecutivi sau neconsecutivi într-o conformaţie spaţială determinată de către distanţa dintre ei. Acesta poate fi un epitop „liniar” sau „conformaţional”. A se vedea, de exemplu, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996). Într-un epitop liniar, toate punctele de interacţiune dintre proteină şi molecula care interacţionează (de exemplu, un anticorp) sunt amplasate în mod liniar pe secvenţa primară de aminoacizi a proteinei. În epitopul conformaţional punctele care interacţionează sunt formate din punţi asociate de resturi aminoacide de proteine, îndepărtate una faţă de cealaltă.
Termenul „izolat”, aşa cum este utilizat în invenţia propusă, înseamnă obţinut din stare nativă pe cale artificială. În cazul în care substanţa sau componentul „izolat” se regăseşte în natură, este posibil ca mediul său natural să fi fost modificat sau substanţa să fi fost izolată din mediul său natural, sau şi una, şi alta. De exemplu, polinucleotidele neizolate sau polipeptidele se regăsesc în natură în organismele vii in vivo, iar polinucleotidele şi polipeptidele identice de o puritate înaltă, derivate din astfel de stare naturală, sunt descrise ca fiind „izolate”. Termenul „izolat” nu exclude existenţa unui amestec de substanţe artificiale sau sintetice, precum şi prezenţa altor impurităţi care nu afectează activitatea substanţei.
Termenul „sistem de expresie E. coli”, aşa cum este utilizat în invenţia de faţă, se referă la un sistem de expresie care constă din E. coli (tulpină) şi un vector în care E. coli (tulpină) a fost obţinută, de exemplu, din tulpinile disponibile comercial, dar fără a se limita la acestea, GI698, ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3) şi BLR (DE3).
Termenul „vector”, aşa cum este utilizat în invenţia propusă, se referă la un sistem purtător de acid nucleic în care poate fi încorporată o polinucleotidă. Atunci când vectorul permite exprimarea proteinei codificate de polinucleotida integrată, vectorul în cauză este denumit vector de expresie. Vectorul poate fi introdus în celula gazdă prin transformare, transducţie sau transfecţie în aşa mod, încât componenta genetică care se conţine în acest vector se exprimă în celula gazdă. Vectorii bine cunoscuţi specialiştilor în domeniul de referinţă includ, fără a se limita la acestea, plasmidă, fagemidă, cosmidă, cromozomul artificial, cum ar fi cromozomul artificial al drojdiei (YAC), cromozomul artificial bacterian (BAC) sau cromozomul artificial pe bază de P1-plasmidă bacteriană (PAC); bacteriofag, cum ar fi fagul λ sau fagul M13, precum şi virusul animal şi altele similare. Virusurile animale care pot fi utilizate în calitate de vector includ, fără a se limita la acestea, retrovirusul (inclusiv lentivirusul), adenovirusul, virusul adeno-asociat, virusul herpetic (de exemplu, virusul herpes simplex), poxvirusul, baculovirusul, virusul papiloma, papovavirusul (de exemplu, SV40). Vectorul poate conţine mai multe componente pentru controlul expresiei, incluzând, fără a se limita la acestea, secvenţa-promotor, secvenţa de iniţiere a transcripţiei, secvenţa amplificatoare, componenta de reproducţie şi gena reporter. În plus, vectorul poate cuprinde, de asemenea, situsul de iniţiere a replicării.
Aşa cum este utilizat aici, termenul „celula gazdă” se referă la celulele care pot fi utilizate pentru introducerea vectorului. Celulele în cauză includ, fara a se limita la acestea, celule procariote, cum ar fi E. coli sau Bacillus subtilis, celule de fungi, cum ar fi celulele de drojdie sau Aspergillus, celule de insecte, cum ar fi celulele Drosophila S2 sau Sf9, sau celule animale, cum ar fi fibroblastele, celulele CHO, celulele COS, celulele NSO, celulele HeLa, celulele BHK, celulele HEK 293 sau celulele umane.
Termenul „identitate”, aşa cum este utilizat în invenţia de faţă, este folosit pentru a descrie coincidenţa secvenţei dintre două polipeptide sau dintre doi acizi nucleici. Atunci când poziţiile corespunzătoare din cele două secvenţe comparate sunt ocupate de către subunităţi monomerice similare (aminoacizi sau baze) (de exemplu, ambele poziţii corespunzătoare din cele două molecule de ADN sunt ocupate de către adenină sau ambele poziţii corespunzătoare din cele două polipeptide sunt ocupate de către lizină), moleculele în cauză aflate în această poziţie sunt identice. „Identitatea procentuală” dintre două secvenţe reprezintă următoarea funcţie: numărul de poziţii care coincid pentru cele două secvenţe, împărţit la numărul de poziţii comparate, înmulţit cu 100. De exemplu, dacă 6 din 10 poziţii în două secvenţe coincid, atunci aceste două secvenţe au o identitate de 60%. De exemplu, ADN-ul secvenţelor CTGACT şi CAGGTT au identitatea de 50% (un total coincid trei din şase poziţii). De regulă, două secvenţe sunt comparate după nivelare, pentru a obţine o identitate maximă. De exemplu, este convenabil ca o astfel de nivelare să fie efectuată cu ajutorul unui program de calculator, de exemplu, cu programul ALIGN (DNAstar, Inc.), prin procedeul descris în Needleman şi colab. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453. Totodată, algoritmul E. Meyers şi W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)), încorporat în programul ALIGN (versiunea 2.0) poate fi utilizat pentru a determina identitatea procentuală dintre două secvenţe de aminoacizi folosind tabelul de greutăţi pentru substituirea resturilor PAM120, penalizarea pentru extinderea decalajului 12 şi penalizarea pentru extinderea decalajului 4. În afară de aceasta, algoritmul Needleman şi Wunsch (J. MoI Biol. 48: 444-453 (1970)), încorporat în programul GAP din pachetul GCG (disponibil pe site-ul www.gcg.com), poate fi utilizat pentru a determina identitatea procentuală dintre două secvenţe de aminoacizi folosind matricea Blossum 62 sau matricea PAM250, greutatea decalajului 16, 14, 12, 10, 8, 6 sau 4 şi greutatea continuării decalajului 1, 2, 3, 4, 5 sau 6.
Termenul de „substituţie conservatoare”, aşa cum este folosit în prezenta invenţie, se referă la substituţiile de aminoacizi care nu afectează în mod negativ sau nu modifică proprietăţile esenţiale ale proteinei/polipeptidei ce cuprinde secvenţa dată de aminoacizi. De exemplu, substituţiile conservatoare pot fi administrate prin intermediul unor tehnici standard, cunoscute din stadiul tehnicii, cum ar fi mutageneza situs-direcţionată, mutageneză mediată prin tehnologia PCR. Substituţiile conservatoare de aminoacizi includ substituţiile în care restul de aminoacid este înlocuit cu un rest de aminoacid având o catenă laterală similară, de exemplu, cu un rest analogic cu restul de aminoacid corespunzător din punctul de vedere al proprietăţilor fizice sau al funcţiei (de exemplu, având dimensiunea, forma, încărcătura, proprietăţile chimice similare, inclusiv capacitatea de a forma o legătură covalentă sau o legătură de hidrogen, sau altele de acest gen). Familiile de resturi de aminoacizi având catene laterale similare sunt definite în stadiul relevant al tehnicii. Aceste familii includ aminoacizi cu catenă laterală bazică (de exemplu, lizina, arginina şi histidina), catenă laterală acidă (de exemplu, acidul aspartic şi acidul glutamic), catenă laterală polară neîncărcată (de exemplu, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirozina, cisteina şi triptofanul), catenă laterală nepolară (de exemplu, alanina, valina, leucina, izoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), catenă laterală beta ramificată (de exemplu, treonina, valina şi izoleucina) şi catenă laterală aromatică (de exemplu, tirozina, fenilalanina, triptofanul, histidina). Astfel, este preferabilă substituţia restului de aminoacid corespunzător cu un alt rest de aminoacid din aceeaşi familie a catenei laterale. Procedeele de identificare a substituţiilor conservatoare de aminoacizi sunt bine cunoscute în stadiul tehnicii (de văzut, de exemplu, Brummell şi colab., Biochem., 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi şi colab., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); şi Burks şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 412-417 (1997) care sunt încorporate în invenţia de faţă prin referinţă).
Termenul „imunogenitate”, aşa cum este utilizat aici, se referă la capacitatea de a stimula organismul să producă anticorpi specifici sau să sensibilizeze limfocitele. Acesta se referă nu numai la proprietăţile antigenului, care poate stimula celulele imune concrete în asemenea mod, încât să inducă activarea, proliferarea şi diferenţierea celulelor imune şi în cele din urmă - producerea de substanţe efectoare imune, cum ar fi anticorpii, şi care poate sensibiliza limfocitele, referindu-se, de asemenea, şi la reacţiile specifice imune ale sistemului imunitar al organismului, care induc producerea de anticorpi sau de limfocite T sensibilizate, ca rezultat al stimulării organismului de către antigen. Imunogenitatea constituie cea mai importantă proprietate a antigenului. Capacitatea antigenului de a induce cu succes un răspuns imun în organismul gazdă depinde de trei factori: natura antigenului, reactivitatea organismului gazdă şi procedeul de imunizare.
Termenul „legare specifică”, aşa cum este folosit în prezenta invenţie, se referă la o reacţie nealeatoare de legare dintre două molecule, cum ar fi reacţia dintre anticorp şi antigenul ţintă. În unele variante de realizare a invenţiei, legarea specifică a anticorpului la antigen (sau anticorpul este specific în raport cu antigenul) înseamnă că anticorpul se leagă la antigen cu o afinitate (KD) de mai puţin de aproximativ 10-5 M, de exemplu, mai puţin de aproximativ 10-6 М, 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М sau 10-10 М, sau mai puţin.
Termenul „KD”, utilizat în lucrarea de faţă, se referă la constanta echilibrului de disociere a unei interacţiuni particulare anticorp-antigen care este folosit pentru a descrie afinitatea legării dintre anticorp şi antigen. Cu cât e mai mică constanta echilibrului de disociere, cu atât este mai puternică legarea anticorpului la antigen şi cu atât este mai înaltă afinitatea dintre anticorp şi antigen. De regulă, anticorpul (de exemplu, anticorpul monoclonal 8D2 conform invenţiei de faţă) se leagă la antigen (de exemplu, la proteina L1) cu constantă echilibrului de disociere (KD) mai mică de aproximativ 10-5 M, de exemplu, mai mică de aproximativ 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M sau 10-10 M, sau şi mai mică, de exemplu, aşa cum este determinat prin intermediul rezonanţei plasmonice de suprafaţă (SPR) pe un dispozitiv BIACORE.
Termenii „anticorp monoclonal” şi „mAb”, aşa cum sunt utilizaţi în invenţia de faţă, au unul şi aceeaşi semnificaţie şi pot fi folosiţi în mod interşanjabil. De asemenea, termenii „anticorp policlonal” şi „pAb” au una şi aceeaşi semnificaţie şi pot fi folosiţi în mod interşanjabil. De asemenea, termenii „polipeptidă” şi „proteină” au unul şi aceeaşi semnificaţie şi pot fi folosiţi în mod interşanjabil. În afară de aceasta, în prezenta invenţie aminoacizii sunt marcaţi, de regulă, prin abrevieri formate dintr-o singură literă sau din trei litere, bine cunoscute în domeniul respectiv al tehnicii. De exemplu, o alanină poate fi notată ca A sau ca Ala.
Termenii „hibridoma” şi „linie celulară hibridoma”, aşa cum sunt utilizaţi aici, pot fi folosiţi în mod interşanjabil. De asemenea, atunci când se face referire la termenul „hibridoma” sau la termenul „linie celulară hibridoma”, acesta include, de asemenea, subclone şi celule fiice ale liniei celulare hibridoma 4B3.
Termenul „vector acceptabil farmaceutic şi/sau excipient”, aşa cum este utilizat în invenţia propusă, se referă la vectorul şi/sau la excipientul compatibil cu subiectul şi cu componenta activă în farmaccologie şi/sau fiziologie, fiind bine cunoscute în stadiul respectiv al tehnicii (a se vedea, de exemplu, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), şi include, fără a se limita la acestea, un agent de ajustare a pH-ului, un agent activ de suprafaţă, un adjuvant, un amplificator de intensitate ionică. De exemplu, agentul de ajustare a pH-ului include, fără a se limita la acesta, un tampon fosfat; agentul activ de suprafaţă include, fără a se limita la acesta, un agent activ de suprafaţă cationic, anionic sau neionic, cum ar fi, de exemplu, Tween 80; şi un un amplificator de intensitate ionică include, fără a se limita la aceasta, clorură de sodiu.
Termenul „adjuvant”, aşa cum este utilizat în invenţia de faţă, se referă la un amplificator nespecific de imunitate care poate spori răspunsul imun al organismului la un antigen sau poate schimba tipul de răspuns imun atunci când este administrat în organism împreună cu un antigen sau înainte de administrarea unui antigen. Există mai mulţi adjuvanţi incluzând, fără limitare la aceştia, adjuvanţii de aluminiu (de exemplu, hidroxidul de aluminiu), adjuvantul Freund (de exemplu, adjuvantul Freund complet şi adjuvantul Freund incomplet), lipopolizaharidul Corynebacterium parvum, citokina şi altele asemenea. În prezent, adjuvantul Freund este utilizat cel mai frecvent în experimentele pe animale, iar hidroxidul de aluminiu este folosit pe scară largă în cadrul studiilor clinice.
Termenul „cantitate eficientă”, aşa cum este utilizat aici, se referă la o cantitate suficientă pentru a realiza sau, cel puţin, pentru a atinge parţial efectele dorite. De exemplu, termenul „cantitate eficientă din punct de vedere profilactic” pentru o afecţiune (de exemplu, pentru o boală asociată cu legarea excesivă a CTLA4 la B7 sau cu activitatea CTLA4, cum ar fi o tumoare) se referă la o cantitate suficientă pentru prevenirea, suprimarea sau încetinirea progresiei bolii (de exemplu, a unei boli asociate cu excesul activităţii de legare a CTLA4 la B7 sau a activităţii CTLA4, cum ar fi o tumoare); iar termenul „cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic” pentru o boală se referă la o cantitate suficientă pentru a vindeca sau a stopa, cel puţin parţial, boala şi complicaţiile sale la un pacient care suferă de această boală. Determinarea unei asemenea cantităţi eficiente ţine de competenţa specialiştilor din domeniul respectiv al tehnicii. De exemplu, o cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic va depinde de severitatea bolii care este tratată, starea generală a sistemului imunitar al pacientului, starea generală a pacientului, cum ar fi vârsta, greutatea corporală şi sexul, calea de administrare a agentului, precum şi de alte tipuri de terapie, realizate simultan, şi altele asemenea.
Efectul util al invenţiei
Anticorpul monoclonal 8D2 şi anticorpii săi umanizaţi conform prezentei invenţii se pot lega foarte bine şi în mod specific la CTLA4. Dintre aceştia, anticorpii 8D2 şi 8D2(Re) se leagă la antigenul CTLA4 murin cu un randament de legare mai bun decât cel al anticorpilor de control 10D1 (Alan J. Korman, Edward L. Halk, şi colab., HUMAN CTLA-4 ANTIBODIES, US Patent No. US6984720B1) şi 11.2.1 (Douglas Charles Hanson, Mark Joseph Neveu, şi colab., Human monoclonal antibodies to CTLA-4, US Patent No. US682736B1). Anticorpul umanizat 8D2H1L1 se leagă la antigenul murin CTLA4 cu o eficienţă de legare mai bună decât cea a anticorpului de control 10D1 şi comparabilă cu cea a anticorpului 11.2.1. Anticorpul umanizat 8D2H2L2 se leagă la antigenul CTLA4 uman cu o eficienţă comparabilă cu cea a anticorpului 10D1. Anticorpii umanizaţi 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 se leagă la antigenul CTLA4 simian cu o eficienţă de legare comparabilă cu cea a anticorpului 10D1. Anticorpii 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 se leagă la antigenul uman CTLA4 cu o eficienţă mai bună decât cea a anticorpilor de control 10D1 şi 11.2.1.
Anticorpii 8D2, 8D2(Re) şi anticorpii umanizaţi 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 pot concura cu B7 pentru legarea la antigenul CTLA4. Dintre aceştia, 8D2, 8D2 (Re), 8D2H1L1 şi 8D2H2L2 concurează cu B7-2 mai puternic decât 10D1 pentru legarea la CTLA4; şi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 concurează mai puternic cu B7-1 şi B7-2 decât anticorpii 10D1 şi 11.2.1 pentru legarea la CTLA4.
Anticorpul monoclonal 8D2 şi anticorpii săi umanizaţi conform prezentei invenţii pot bloca legarea CLTA4 la B7, în particular, facilitând imunosupresia organismului de către CTLA4 şi activând limfocitele T cu un grad înal de eficienţă. Dintre aceştia, 8D2H2L2 şi 8D2H2L15 activează limfocitele T mai puternic decât anticorpii de control 10D1 şi 11.2.1.
Descrierea succintă a figurilor
Figura 1. Rezultatele electroforezei SDS-PAGE a proteinei de fuziune CTLA4ECD-mFc. Probele şi cantităţile acestora încărcate în 4 benzi de la stânga la dreapta: M, marker, 10 µl; proteină de fuziune CTLA4ECD-mFc, 1 µg ; proteină de fuziune CTLA4ECD-M mFc, 2 µg; proteină de fuziune CTLA4ECD-mFc, 3 µg.
Figura 2. Rezultatele electroforezei SDS-PAGE a anticorpului 8D2. Probele şi cantităţile încărcate ale acestora în 4 benzi de la stânga la dreapta: M, marker, 10 µl; probă de anticorp în tamponul reducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 0,3 µg; tampon nereducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 2 µl; probă de anticorp în tamponul reducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 0,3 µg.
Figura 3. Rezultatele electroforezei SDS-PAGE a anticorpului recombinant 8D2 (8D2(Re)). Probele şi cantităţile încărcate ale acestora în 4 benzi de la stânga la dreapta: M, marker 10 µl; probă de anticorp în tamponul reducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 1 µg; tampon nereducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 2 µl; probă de anticorp în tamponul nereducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 1 µg.
Figura 4. Rezultatele electroforezei SDS-PAGE anticorpului recombinant 8D2, 8D2H1L1. Probele şi cantităţile acestora încărcate în 4 benzi de la stânga la dreapta: M, marker, 10 µl; probă de anticorp în tamponul reducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 1 µg; tampon nereducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 2 µl; probă de anticorp în tamponul nereducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 1 µg.
Figura 5. Rezultatele electroforezei SDS-PAGE a anticorpului recombinant 8D2, 8D2H2L2. Probele şi cantităţile acestora încărcate în 4 benzi de la stânga la dreapta: M, marker, 10 µl; probă de anticorp în tamponul reducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 1 µg; tampon reducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 2 µl; probă de anticorp în tamponul nereducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 1 µg.
Figura 6. Rezultatele electroforezei SDS-PAGE a anticorpului recombinant 8D2, 8D2H3L3. Probele şi cantităţile acestora încărcate în 4 benzi de la stânga la dreapta: M, marker, 10 µl; probă de anticorp în tamponul reducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 1 µg; tampon nereducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 2 µl; probă de anticorp în tamponul nereducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 1 µg.
Figura 7. Rezultatele electroforezei SDS-PAGE a anticorpului recombinant 8D2, 8D2H2L15. Probele şi cantităţile încărcate ale acestora: M, marker, 10 µl; probă de anticorp în tamponul nereducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 1 µg; probă de anticorp în tamponul reducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 1 µg.
Figura 8. Rezultatele electroforezei SDS-PAGE a anticorpului recombinant 8D2, 8D2H2L17. Probele şi cantităţile aplicate ale acestora: M, marker, 10 µl; probă de anticorp în tamponul nereducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 1 µg; probă de anticorp în tamponul reducător de încărcare pentru electroforeza proteinei, 1 µg.
Figura 9. Rezultatele determinării parametrilor dinamici caracteristici ai mAb 8D2.
Figura 10. Rezultatele determinării parametrilor dinamici caracteristici ai 8D2H1L1.
Figura 11. Rezultatele determinării parametrilor dinamici caracteristici ai 8D2H2L2.
Figura 12. Rezultatele determinării parametrilor dinamici caracteristici ai 8D2H3L3.
Figura 13. Rezultatele determinării parametrilor dinamici caracteristici ai 8D2H2L15.
Figura 14. Rezultatele determinării parametrilor dinamici caracteristici ai 8D2H2L17.
Figura 15. Histograma care indică expresia CTLA4 pe celulele nemarcate 293F, în controlul izotipic şi celulele 293F-CTLA4, după cum s-a stabilit prin intemediul citometriei în flux continuu (numărul de celule - fluorescenţa (FITC)).
Figura 16. Intensitatea medie a fluorescenţei (MFI) a expresiei CTLA4 pe celulele nemarcate 293F, pe controalele izotipice şi celulele 293F-CTLA4, după cum s-a stabilit prin intermediul citometriei în flux continuu.
Figura 17. Rezultatele EC50 de legare a anticorpului mAb 8D2 la celulele marcate 293F-CTLA4.
Figura 18. Rezultatele EC50 de legare a anticorpului 8D2 (Re) la celulele marcate 293F-CTLA4.
Figura 19. Rezultatele EC50 de legare a anticorpului 8D2H1L1 la celulele marcate 293F-CTLA4.
Figura 20. Rezultatele EC50 de legare a anticorpului 8D2H2L2 la celulele marcate 293F-CTLA4.
Figura 21. Rezultatele EC50 de legare a anticorpului 8D2H3L3 la celulele marcate 293F-CTLA4.
Figura 22. Determinarea legării anticorpilor 8D2, 8D2H1L1 şi 8D2(Re) la CTLA4 folosind testul ELISA.
Figura 23. Determinarea legării anticorpilor recombinanţi 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 la CTLA4 uman folosind testul ELISA.
Figura 24. Determinarea legării anticorpilor recombinanţi 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 la CTLA4 simian folosind testul ELISA.
Figura 25. Determinarea legării anticorpilor recombinanţi 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 la CTLA4 simian folosind testul ELISA.
Figura 26. Rezultatele testului ELISA la determinarea concurenţei anticorpilor 8D2, 8D2H1L1 şi 8D2(Re) cu B7-1.
Figura 27. Rezultatele testului ELISA la determinarea concurenţei anticorpilor 8D2, 8D2H1L1 şi 8D2(Re) cu B7-2.
Figura 28. Rezultatele testului ELISA la determinarea concurenţei anticorpilor 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 cu B7-1.
Figura 29. Rezultatele testului ELISA la determinarea concurenţei anticorpilor 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 cu B7-2.
Figura 30. Rezultatele testului ELISA la determinarea concurenţei anticorpilor 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 cu B7-1.
Figura 31. Rezultatele testului ELISA la determinarea concurenţei anticorpilor 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 cu B7-2.
Figura 32. Influenţa asupra nivelului secreţiei de IL-2 de către limfocitele T, determinată prin intermediul testului ELISA, după co-cultivarea timp de 72 de ore cu celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC), celulele Raji şi anticorpii umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2 sau 8D2H3L3, respectiv. Rezultatele demonstrează faptul că anticorpii umanizaţi mAb 8D2 sporesc secreţia de IL-2 de către limfocitele T prin blocarea receptorului CTLA4.
Figura 33. Influenţa asupra nivelului secreţiei de IL-2 de către limfocitele T, determinată prin intermediul testului ELISA, după co-cultivarea timp de 72 de ore cu celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC), celulele Raji şi anticorpii umanizaţi 8D2H2L15 sau 8D2H2L17, respectiv. Rezultatele demonstrează faptul că anticorpii umanizaţi mAb 8D2 sporesc secreţia de IL-2 de către limfocitele T prin blocarea receptorului CTLA4.
Figura 34. Curba creşterii tumorii, a probei transplantate subcutanat hu-SCID-Raji, care a primit tratament cu 8D2H2L2.
Exemple concrete de realizare a invenţiei
Variantele de realizare a prezentei invenţii vor fi descrise în continuare în mod detaliat, cu referinţă la Exemple. Specialiştii în domeniul respectiv al tehnicii vor aprecia faptul că următoarele Exemple sunt destinate ca să ilustreze prezenta invenţie. Exemplele, pentru care nu sunt descrise procedee sau condiţii concrete, au fost realizate prin utilizarea procedeelor şi condiţiilor descrise în literatura din domeniul respectiv al tehnicii (de exemplu, J. Sambrook şi colab., tradus de către Peitang HUANG şi colab., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Science Press) sau în conformitate cu instrucţiunile produselor. Reactivii şi instrumentele, ai căror furnizori nu sunt indicaţi, reprezintă produse convenţionale, disponibile în comerţ.
În următoarele Exemple ale prezentei invenţii şoarecii liniei BALB/C au fost achiziţionaţi de la Guangdong Medical Laboratory Animal Center.
În următoarele Exemple ale prezentei invenţii limfocitele T au fost primite de la Akeso Biopharma Inc., Zhongshan.
Anticorpul de control 10D1 a fost obţinut după cum este descris în brevetul US Nr.6984720B1; şi anticorpul 11.2.1 a fost obţinut după cum este descris în brevetul US Nr.6682736B1.
Exemplul 1. Obţinerea CTLA4-8D2 al liniei de celule hibridoma LT001 şi obţinerea anticorpului monoclonal 8D2
CTLA4 recombinant a fost exprimat în sistemul de expresie a celulelor de mamifere pentru imunizarea cu ajutorul acestuia a şoarecilor în calitate de antigen, iar celulele hibridoma au fost preparate prin fuziunea celulelor splenice de şoarece cu celule de mielom. Linia de celule hibridoma (CTLA4-8D2 linie de celule hibridoma LT001) a fost obţinută în urma screeningului unui număr mare de probe. Respectiva linie de celule putea secreta anticorpul monoclonal 8D2, care se leagă în mod specific la CTLA4. Procedeele specifice sunt descrise în continuare.
1. Sinteza genei CTLA4ECD-mFc
În conformitate cu schema structurii proteinei de fuziune (SECV. ID Nr. 3), secvenţa de aminoacizi (SECV. ID Nr. 2), care corespunde fragmentului extracelular al genei CTLA4 (antigenul 4 NCBI asociat cu T-limfocitele citotoxice al genei ID 1493, SECV. ID Nr. 1) (CTLA4ECD) a fost fuzionat cu fragmentul de Fc-proteină de IgG (mFc) murin, în care mFc constituie un fragment de Fc-proteină a IgG murin cu secvenţa de aminoacizi prezentată sub formă de parte accentuată a SECV. ID Nr. 3.
Pentru a spori eficienţa expresiei genei ţintă în sistemul de expresie celulară 293f, secvenţa de nucleotide, care codifică secvenţa de proteină din SECV. ID Nr. 3, a fost optimizată în Genscript Co., luându-se în considerare, în principal, asemenea factori cum ar fi codonii preferinţiali, conţinutul de GC, structura secundară a mARN şi secvenţele repetitive. Gena finală optimizată, care codifică proteina de fuziune CTLA4ECD-mFc, a avut următoarea secvenţă (SECV. ID Nr. 4) şi a fost sintetizată în Genscript Co.
Secvenţa genei CTLA4ECD (375 bp):
Secvenţa proteinei, codificată de către CTLA4ECD (125 aa):
Secvenţa proteinei de fuziune CTLA4ECD-mFc (364 aa), în care o porţiune a CTLA4ECD este evidenţiată printr-o linie ondulată, iar o porţiune a mFc este evidenţiată cu o linie aldină.
Secvenţa de codificare a genei, corespunzătoare proteinei de fuziune CTLA4ECD-mFc (1092 bp), în care o porţiune a CTLA4ECD este evidenţiată cu o linie ondulată, iar o porţiune a mFc este evidenţiată cu o linie aldină.
2. Prepararea plasmidului pUC57simple-CTLA4ECD-mFc
Gena de fuziune CTLA4ECD-mFc sintetizată (SECV. ID Nr. 4) a fost clonată în vectorul de expresie pUC57simple (furnizat de către Genscript Co.) în cadrul Genscript Co., obţinând plasmidul pUC57simple-CTLA4ECD-mFc.
3. Construirea plasmidului recombinant pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc
Plasmidul pUC57simple-CTLA4ECD-mFc a fost scindat cu ajutorul endonucleazelor XbaI şi BamHI. Un fragment al proteinei de fuziune CTLA4ECD-mFc a fost izolat prin intermediul electroforezei şi ligat în vectorul de expresie pcDNA3.1 (achiziţionat de la Invitrogen Co.). Plasmidul obţinut pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc a fost utilizat pentru a transfecta celulele competente E. coli ale tulpinii DH5a (achiziţionate de la TIANGEN Co.). Transfecţia şi cultivarea au fost efectuate în conformitate cu instrucţiunile respective. Coloniile E. coli, pozitive conform pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc, au fost selectate şi replicate prin mijloace convenţionale. Apoi, plasmidul recombinant a fost extras cu ajutorul unui kit de reactivi (procurat de la Tiangen Biotech (Beijing) Co. LTD, DP103-03) în conformitate cu instrucţiunile ataşate la kitul în cauză.
4. Celulele 293F (achiziţionate de la Invitrogen Co.) au fost transfectate prin intermediul plasmidului recombinant pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc folosind kitul de reactivi pentru transfecţia Lipofectamine (achiziţionat de la Invitrogen Co.).
5. Peste şapte zile după transfecţia celulelor 293F cu plasmidul recombinant pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc, proteina de fuziune CTLA4ECD-mFc a fost izolată din lichidul de cultură prin intermediul centrifugării de mare viteză, filtrării în vid printr-o membrană microporoasă de filtrare şi cu cromatografie pe o coloană de HiTrap cu proteina A CP. După purificare, probele au fost colectate, apoi încărcate în tamponul reducător pentru electroforeza proteinei şi analizate prin intermediul electroforezei SDS-PAGE. După cum se demonstrează în Figura 1, proteina ţintă este vizibilă sub forma unei zone de mobilitate electroforetică cu o masă de aproximativ 45 kDa.
6. Prepararea CTLA4-8D2 al liniei de celule hibridoma LT001
Utilizând proteina de fuziune CTLA4ECD-mFc în calitate de imunogen, celulele hibridoma au fost obţinute prin fuzionarea celulelor splenice de soareci imunizaţi ce ţin de linia BALB/C (achiziţionaţi de la Guangdong Medical Laboratory Animal Center) cu celule de mielom murine conform unui protocol standard (de exemplu, Stewart, S.J., „Monoclonal Antibody Production”, în Basic Methods in antibody Production and Characterization, Eds G.C. Howard si D.R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000). CTLA4 a fost folosit în calitate de antigen pentru acoperirea plăcii ELISA, iar celulele hibridoma, care secretă noi anticorpi ce se leagă în mod specific la CTLA4, erau obţinute prin screening cu ajutorul metodei indirecte ELISA. Liniile de celule hibridoma, care secretă anticorpi monoclonali şi concurează cu ligandul B7-1 (CD80, NCBI Gene ID 941) sau cu ligandul B7-2 (CD86, NCBI Gene ID 942) pentru legarea la CTLA4, au fost obţinute prin screening, folosind metoda competitivă ELISA, din celule hibridoma, obţinute la etapa de screening cu ajutorul metodei indirecte ELISA. Linia celulară hibridoma stabilă a fost preparată prin diluţie limitativă. Linia de celule hibridoma a fost denumită linie de celule hibridoma CTLA4-8D2 şi această linie celulară stabilă CTLA4-8D2 a fost preparată prin diluţie limitativă (desemnată în invenţia de faţă şi ca LT001; anticorpul monoclonal, secretat de această linie, a fost desemnat ca 8D2).
7. Prepararea anticorpului 8G2
Linia de celule CTLA4-8D2 (LT001) din prezenta invenţie a fost cultivată într-un mediu suplimentat cu ser bovin fetal de 10% cu un nivel scăzut de IgG. După şapte zile, supernatantul de cultură celulară a fost colectat pentru purificarea anticorpului 8G2.
8. Determinarea anticorpilor 8G2 prin electroforeză SDS-PAGE
Probele purificate au fost adăugate în tamponul reducător de încărcare pentru electroforeza proteică şi în tamponul nereducător de încărcare pentru electroforeza proteică. După fierbere, a fost efectuată detectarea. Rezultatele demonstrează că proteina ţintă este vizibilă sub forma a două zone de mobilitate electroforetică cu masa de aproximativ 50 kDa şi 25 kDa pentru proba de proteină din tamponul reducător, sau sub forma unei zone de mobilitate electroforetică cu masa de aproximativ 150 kDa pentru proba de proteină din tamponul nereducător (Figura 2).
Exemplul 2. Determinarea secvenţelor lanţului uşor şi lanţului greu ale anticorpului monoclonal 8D2
Urmând instrucţiunile referitoare la kitul de reactivi pentru RT-PCR al sistemului de sinteză a primului lanţ SuperScript® III (Invitrogen), a fost sintetizat ADNc, amplificat cu ajutorul PCR. Produsul de amplificare PCR a fost supus imediat TA-clonării în conformitate cu instrucţiunile referitoare la kitul de reactivi pentru clonare pEASY-T1 (TransGen, Cat. No. CT101). Produsele TA-clonării au fost imediat secvenţiate, rezultatele secvenţierii fiind prezentate în continuare.
Rezultatele secvenţierii ADN-ului regiunii variabile a lanţului greu (345 pb):
Secvenţa de proteină codificată de aceasta (115 aa):
Rezultatele secvenţierii ADN-ului regiunii variabile a lanţului uşor (318 pb):
Secvenţa de proteină codificată de aceasta (106 aa):
Exemplul 3. Designul secvenţelor lanţului uşor şi lanţului greu ale anticorpilor umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17
În baza structurii cristaline tridimensionale a proteinei CTLA4 (Nat. Struct. Biol. (1997) 4, p. 527) şi a secvenţelor anticorpului 8D2, obţinut în Exemplul 2, structura anticorpului a fost modelată pe calculator. Secvenţele regiunii variabile a anticorpilor 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 au fost construite pe baza secvenţelor anticorpului şi modelului structural (secvenţele regiunii constante a anticorpului au fost luate din baza de date NCBI). Secvenţele regiunii variabile sunt prezentate în continuare.
1. Secvenţele lanţului uşor şi lanţului greu ale anticorpului monoclonal 8D2H1L1
Secvenţa de ADN a regiunii variabile a lanţului greu (345 bp):
Secvenţa de proteină codificată de aceasta(115 aa):
Secvenţa de ADN a regiunii variabile a lanţului uşor (321 bp):
Secvenţa de proteină codificată de aceasta (107 aa):
2. Secvenţele lanţului uşor şi lanţului greu 8D2 ale anticorpului monoclonal umanizat 8D2H2L2
Secvenţa de ADN a regiunii variabile a lanţului greu (345 bp):
Secvenţa de proteină codificată de aceasta (115 aa):
Secvenţa de ADN a regiunii variabile a lanţului uşor (321 bp):
Secvenţa de proteină codificată de aceasta (107 aa):
3. Secvenţele lanţului uşor şi lanţul greu ale 8D2 anticorpului monoclonal umanizat 8D2H3L3
Secvenţa de ADN a regiunii variabile a lanţului greu (345 bp):
Secvenţa de proteină codificată de aceasta (115 aa):
Secvenţa de ADN a regiunii variabile a lanţului uşor (321 bp):
Secvenţa de proteină codificată de aceasta (107 aa):
4. Secvenţele lanţului uşor şi lanţului greu ale 8D2 anticorpului monoclonal umanizat 8D2H2L15
Secvenţa de ADN a regiunii variabile a lanţului greu (345 bp):
Secvenţa de proteină codificată de aceasta (115 aa):
Secvenţa de ADN a regiunii variabile a lanţului uşor (321 bp):
Secvenţa de proteină codificată de aceasta (107 aa):
5. Secvenţele lanţului uşor şi lanţului greu ale 8D2 anticorpului monoclonal umanizat 8D2H2L17
Secvenţa de ADN a regiunii variabile a lanţului greu (345 bp):
Secvenţa de proteină codificată de aceasta (115 aa):
Secvenţa de ADN a regiunii variabile a lanţului uşor (321 bp):
Secvenţa de proteină codificată de aceasta (107 aa):
Exemplul 4. Prepararea anticorpului recombinant 8D2, 8D2(Re) şi 8D2 anticorpilor umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 şi detectarea lor prin intermediul electroforezei SDS-PAGE
1. Prepararea 8D2 anticorpului recombinant, 8D2(Re) şi detectarea lor prin intermediul electroforezei SDS-PAGE
Secvenţa de ADNc a lanţului greu (secvenţa regiunii sale variabile este prezentată în SECV. ID Nr. 5) şi secvenţa de ADNc a lanţului uşor (secvenţa regiunii sale variabile este prezentată în SECV. ID Nr. 7) a anticorpului 8D2 au fost clonate în vectorul pUC57simple (furnizat de către Genscript Co.), respectiv, obţinând plasmidul pUC57simple-8D2H şi plasmidul pUC57simple-8D2L.
Plasmidele pUC57simple-8D2H şi pUC57simple-8D2L au fost scindate cu endonucleaze (HindIII şi EcoRI), respectiv. Fragmentele care codifică lanţul greu şi lanţul uşor, izolate prin intermediul electroforezei, au fost subclonate în mod individual în vectorul pcDNA3.1. Plasmidele recombinante au fost extrase şi cu ajutorul lor au fost co-transfectate celulele 293F. După şapte zile de cultivare a celulelor, lichidul de cultură a fost supus procesului de ultracentrifugare, filtrare în vid printr-un filtru cu membrană microporoasă şi purificare pe o coloană HiTrap cu proteină A HP. Probele purificate au fost adăugate într-un tampon reducător de încărcare pentru electroforeza proteinei şi într-un tampon nereducător de încărcare pentru electroforeza proteinei. După fierbere, a fost realizată detectarea prin intermediul electroforezei SDS-PAGE. După cum se arată în Figura 3, proteina ţintă este vizibilă sub forma a două benzi de mobilitate electroforetică cu masa de aproximativ 50 kDa şi 25 kDa pentru proba de proteină din tamponul reducător, sau în sub formă de zone de mobilitate electroforetică cu masa de aproximativ 150 kDa pentru proba de proteină din tamponul nereducător.
2. Prepararea 8D2 anticorpilor umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2 şi 8D2H3L3, şi detectarea lor prin electroforeza SDS-PAGE
Secvenţele de ADNc ale lanţului greu (secvenţele regiunilor lor variabile sunt prezentate în SECV. ID Nr. 9, SECV. ID Nr. 13, SECV. ID Nr. 17, SECV. ID Nr. 13, SECV. ID Nr. 13, respectiv) şi secvenţele de ADNc ale lanţului uşor (secvenţele regiunilor lor variabile sunt prezentate în SECV. ID Nr. 11, SECV. ID Nr. 15, SECV. ID Nr. 19, SECV. ID Nr. 21, SECV. ID Nr. 23, respectiv) ale anticorpilor 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 au fost clonate în vectorul pUC57simple (furnizat de către Genscript Co.), respectiv, fiind obţinute plasmidele pUC57simple-8D2H1L1, pUC57simple-8D2H2L2, pUC57simple-8D2H3L3, pUC57simple-8D2H2L15 şi pUC57simple-8D2H2L17. Aceste plasmide au fost subclonate separat în vectorul pcDNA3.1 utilizând procedeul descris mai sus pentru 8D2(Re).
Prin intermediul plasmidelor recombinante au fost co-transfectate celulele 293F. Lichidul de cultură de la celulele 293F a fost supus detectării după purificarea sa prin procedeul descris mai sus pentru 8D2(Re). Rezultatele sunt prezentate în Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7 şi Figura 8. Proteina ţintă este vizibilă sub forma a două benzi de mobilitate electroforetică cu masa de aproximativ 50 kDa şi 25 kDa pentru probele de proteină din tamponul reducător, sau sub formă de zonă de mobilitate electroforetică cu masa de aproximativ 150 kDa pentru probele de proteină din tamponul nereducător.
Anticorpul recombinant 8D2, 8D2(Re) şi 8D2 anticorpii umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17, utilizaţi în exemplele care urmează, au fost preparaţi în conformitate cu procedeul descris în acest exemplu.
Exemplul 5: Determinarea parametrilor dinamici ai anticorpilor
Parametrii dinamici de legare a anticorpului 8D2 şi anticorpilor umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 la antigenul CTLA4 (NCBI Gene ID: 1493 cu secvenţa nucleotidică de codificare, prezentată în SECV. ID Nr. 25, şi cu secvenţa de aminoacizi codificată, prezentată în SECV. ID Nr. 26) au fost determinate folosind analizorul de interacţiune moleculară ForteBio.
1. Proteina CTLA4-mFc (CTLA4-mFc a fost preparată în acelaşi mod ca cel descris în Exemplul 1 pentru sinteza CTLA4ECD-mFc) a fost scindată cu protează TEV, iar antigenul CTLA4 a fost obţinut prin purificare pe coloană.
Secvenţa genei CTLA4 (636 bp):
Secvenţa corespunzătoare de aminoacizi codificată cu aceasta (212 aa):
2. Anticorpul 8D2 şi anticorpii săi umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 au fost imobilizaţi pe suprafaţa senzorului AR2G prin legarea aminoacizilor, fiind blocaţi cu etanolamină. După echilibrare, în PBS (tampon fosfat salin) a fost adăugat antigenul CTLA4 pentru legare. CTLA4 a fost diluat de 2 ori în serie în PBS, după care s-au obţinut următoarele concentraţii: 300, 150, 75, 37,5, 18,75, 9,38, 4,69, 0 nM. Disocierea a avut loc în TFS. Detectarea anticorpilor umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 a fost efectuată după acelaşi procedeu ca şi 8D2, şi concentraţiile de antigen au constituit 180, 90, 45, 22,5, 11,25, 5,625, 2,813, 0 nM.
Parametrii dinamici ai anticorpului 8D2 şi anticorpilor săi umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 sunt prezentaţi în Tabelul 1, iar rezultatele determinării parametrilor caracteristicilor dinamice sunt prezentate în Figurile 9-14, respectiv.
Tabelul 1
Parametrii dinamici ai anticorpilor 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17
Denumirea anticorpului KD (M) kon (1/Mс) kon Eroare kdis (1/с) kdis Eroare 8D2 1,66E-10 1,42E+05 1,22E+03 2,36E-05 2,09E-06 8D2H1L1 6,08E-10 3,40E+05 1,17E+04 2,07E-04 1,81E-05 8D2H2L2 9,55E-10 4,07E+05 1,59E+04 3,88E-04 1,60E-05 8D2H3L3 1,05E-09 3,12E+05 1,01E+04 3,27E-04 1,41E-05 8D2H2L15 1,02E-09 4,54E+05 8,18E+03 4,65E-04 9,50E-06 8D2H2L17 7,66E-10 4,59E+05 8,21E+03 3,52E-04 8,30E-06 10D1 1,21E-09 4,67E+05 1,15E+04 5,65E-04 1,51E-05 11.2.1 9,03E-10 3,87E+05 5,46E+03 3,49E-04 7,32E-06
KD, constanta de afinitate; kon, viteza de asociere antigen-anticorp; kdis, viteza de disociere antigen-anticorp; KD=kdis/Kon.
Aceste rezultate demonstrează că toţi cei şase anticorpi au o bună afinitate la antigen, comparabilă sau chiar mai mare decât afinitatea anticorpilor de control 10D1 şi 11.2.1.
Exemplul 6. Determinarea activităţii anticorpilor privind legarea antigenului CTLA4 pe suprafaţa liniei celulare hibridoma cu ajutorul citometriei în flux continuu
În primul rând, au fost preparate celulele gazdă 293F, care exprimă antigenul CTLA4, şi au fost marcate cu anticorpul monoclonal 8D2 (Exemplul 1), cu 8D2(Re) şi cu 8D2 anticorpii umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 (Exemplul 4), obţinute în cadrul prezentei invenţii, respectiv. În continuare, capacitatea anticorpilor de a se lega în mod specific la un antigen cu conformaţie nativă a fost evaluată pe suprafaţa celulelor prin citometrie în flux continuu.
Etapele specifice sunt prezentate în continuare.
1. Prepararea celulelor gazdă 293F, care exprimă antigenul CTLA4
Celulele 293F au fost transfectate cu plasmidul pLenti6.3-CTLA4 pentru CTLA4 (vectorul pLenti6.3 a fost achiziţionat de la Invitrogen Co.) folosind un kit de reactivi pentru transfecţia Lipofectamine (achiziţionat de la Invitrogen Co.). După efectuarea screeningului a fost obţinută o populaţie clonală de celule care exprimă în mod stabil CTLA4 (293F-CTLA4).
2. Marcarea anticorpilor şi detectarea lor folosind un citometru în flux continuu
Celulele gazdă 293F, care exprimă antigenul CTLA4, obţinute la etapele precedente, au fost tratate cu tripsină prin metoda obişnuită şi un număr de 2x105 celule au fost adăugate în fiecare tub de colectare. Soluţiile diluate ale anticorpului 8D2 în PBS, conţinând 1% BSA, au fost preparate pentru a obţine o concentraţie de 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM şi 0 nM, respectiv. După incubarea pe un pat de gheaţă timp de 2 ore a celulelor 293F, care exprimă CTLA4, în fiecare tub s-au adăugat 100 µl de FITC-ser de capră-antişoarece IgG (1:500) şi aceste tuburi au fost incubate pe patul de gheaţă timp de 1 oră. După adăugarea a 300 µl de PBS, semnalul fluorescent a fost înregistrat folosindu-se canalul FITC al citometrului în flux continuu. Detectarea altor anticorpi a fost realizată în acelaşi mod ca şi detectarea anticorpului 8D2.
3. Rezultate
Rezultatele privind evaluarea exprimării CTLA4 pe celulele 293F-CTLA4 sunt prezentate în Figura 15 şi Figura 16, respectiv. Rezultatele legării anticorpilor 8D2, 8D2(Re) şi a trei anticorpi umanizaţi la celulele 293F sunt prezentate în figurile 17-21, respectiv. După cum se demonstrează în aceste figuri, anticorpul 8D2 şi anticorpii săi umanizaţi se pot lega în mod eficient la proteina ţintă CTLA4 de pe suprafaţa celulelor gazdă 293F, eficacitate de legare a acestora având un caracter dependent de doză. Valorile intensităţii fluorescenţei pentru fiecare doză sunt prezentate în Tabelul 2.
Eficacitatea de legare EC50 a anticorpului 8D2 şi a anticorpilor săi umanizaţi a fost obţinută utilizându-se curba de simulare în analiza cantitativă a fluorescenţei anticorpului legat 8D2 şi a anticorpilor săi umanizaţi, care este prezentată în Tabelul 3.
Tabelul 2
Analiza intensităţii fluorescenţei, care determină legarea anticorpilor 8D2, 8D2(Re) şi 8D2 anticorpilor umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 la antigenul CTLA4 pe suprafaţa celulelor gazdă 293F-CTLA4, cu ajutorul citometriei în flux continuu.
8D2 8D2(Re) 8D2H1L1 8D2H2L2 8D2H3L3 Concentraţia (нМ) Intensitatea fluorescenţei 0,001 7,60 24,62 10,84 10,85 10,85 0,01 7,70 24,72 10,85 32,48 25,14 0,1 9,10 66,72 21,25 124,03 108,29 1 25,50 321,27 103,04 624,65 623,25 5 182,60 713,87 558,75 972,03 970,80 10 638,60 897,63 943,84 1159,24 1084,74 25 721,80 873,24 1170,64 1132,39 1091,77
Tabelul 3
Eficacitatea de legare EC50 a anticorpilor 8D2, 8D2(Re) şi 8D2 anticorpilor umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 la antigenul CTLA4 pe suprafata celulelor gazdă 293F-CTLA4, obţinută utilizând curba de simulare în analiza cu citometrie în flux continuu
8D2 8D2(Re) 8D2H1L1 8D2H2L2 8D2H3L3 EC50 (нМ) 3,84 1,38 5,06 4,37 4,54
Aceste rezultate indică faptul că anticorpii 8D2, 8D2(Re) şi 8D2 anticorpii umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 cu toţii au o capacitate foarte puternică de a se lega la antigenul CTLA4 de pe suprafaţa celulelor gazdă 293F-CTLA4.
Exemplul 7. Determinarea activităţii anticorpilor privind legarea antigenului CTLA4 cu ajutorul metodei ELISA
Placa ELISA a fost acoperită cu CTLA4 la temperatura de 4°C pe parcursul unei nopţi. După blocarea cu BSA de 1% la temperatura de 37°C timp de 2 ore, s-a adăugat CTLA4 al anticorpului 8D2, 8D2(Re) şi 8D2 anticorpii umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17, şi anticorpii de control 10D1 (Alan J. Korman, Edward L. Halk, şi colab., HUMAN CTLA-4 ANTIBODIES, Brevetul SUA Nr. US6984720B1) şi 11.2.1 (Douglas Charles Hanson, Mark Joseph Neveu, şi colab., Human monoclonal antibodies to CTLA-4, Brevetul SUA Nr.US682736B1) pentru reacţionare timp de 30 minute. Anticorpul secundar conjugat cu enzimă a fost adăugat pentru incubare timp de 30 de minute. Apoi a fost determinată absorbanţa la lungimea de undă de 450 nm pe cititorul pentru plăcile ELISA.
Rezultatele privind detectarea legării anticorpului 8D2 şi a anticorpilor săi umanizaţi la antigenul CTLA4 sunt prezentate în Figurile 22-25, respectiv. După cum se demonstrează în aceste figuri, anticorpii 8D2, 8D2(Re) şi 8D2 anticorpii umanizaţi cu toţii se pot lega în mod eficient la proteina CTLA4, eficacitatea de legare a acestora fiind dependentă de doză. Valorile intensităţii fluorescenţei pentru fiecare doză sunt prezentate în Tabelele 4-8. Eficacitatea de legare EC50 a anticorpilor 8D2, 8D2(Re) şi anticorpilor umanizaţi a fost obţinută folosind curba de simulare în analiza cantitativă a fluorescenţei anticorpului legat 8D2, 8D2(Re) şi anticorpilor umanizaţi (Tabelul 9).
Tabelul 4
Legarea 8D2 şi 8D2(Re) la CTLA4 murină (ELISA)
Concentraţia de anticorp (µg/ml) Antigenul de acoperire: CTLA4 murin, 0,5 µg/ml 8D2 8D2(Re) 10D1 1 2,823 2,682 2,672 2,769 2,995 2,975 0,3 2,806 2,763 2,690 2,735 2,852 2,900 0,1 2,754 2,718 2,796 2,685 2,429 2,538 0,03 2,336 2,381 2,305 2,259 1,507 1,704 0,01 1,614 1,560 1,397 1,446 0,673 0,794 0,003 0,784 0,760 0,662 0,674 0,292 0,328 0,001 0,358 0,355 0,315 0,321 0,136 0,142 0 0,063 0,052 0,053 0,046 0,046 0,050 Anticorpul secundar Capră anti-murin Anticorp secundar Capră anti-uman Anticorp secundar
Tabelul 5
Legarea 8D2, 8D2H1L1 şi 8D2(Re) la CTLA4 umană (ELISA)
Concentraţia de anticorp (µg/ml) Antigenul de acoperire: CTLA4 umană, 0,5 µg/ml 10D1 11.2.1 8D2H1L1 8D2 8D2(Re) 1 3,479 3,432 3,584 3,547 3,016 3,031 3,029 3,107 3,058 3,085 1:3 3,323 3,155 3,499 3,479 2,834 2,904 3,076 3,074 2,930 3,072 1:9 2,506 2,293 3,211 3,187 2,610 2,670 2,878 2,988 2,805 2,868 1:27 1,331 1,194 2,337 2,293 1,834 1,944 2,265 2,287 2,052 2,064 1:81 0,552 0,528 1,254 1,267 0,969 0,996 1,335 1,479 1,398 1,271 1:243 0,202 0,222 0,536 0,552 0,450 0,515 0,666 0,770 0,634 0,649 1:729 0,141 0,115 0,253 0,263 0,204 0,206 0,277 0,351 0,307 0,309 0 0,090 0,086 0,072 0,064 0,067 0,067 0,064 0,067 0,071 0,086 Anticorpul secundar IgG capră anti-uman Anticorp secundar IgG capră anti-murin Anticorp secundar
Tabelul 6
Legarea anticorpilor 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 la CTLA4 umană (ELISA)
Concentraţia de anticorp (µg/ml) Antigenul de acoperire: CTLA4 umană, 0,5 µg/ml 8D2H2L2 8D2H3L3 10D1 11.2.1 1 1,489 1,411 1,631 1,601 1,775 2,069 2,206 2,150 1:3 1,178 1,262 1,192 1,455 1,527 1,480 1,825 2,047 1:9 0,710 0,872 0,943 1,007 1,073 1,204 1,292 1,409 1:27 0,336 0,370 0,642 0,658 0,663 0,585 0,893 0,682 1:81 0,192 0,195 0,415 0,374 0,349 0,323 0,499 0,426 1:243 0,097 0,109 0,230 0,214 0,132 0,146 0,223 0,219 1:729 0,075 0,083 0,100 0,130 0,099 0,099 0,127 0,136 0 0,052 0,055 0,052 0,057 0,056 0,053 0,057 0,061 Anticorpul secundar IgG capră anti-uman conjugat cu HRP Anticorp secundar
Tabelul 7
Legarea anticorpilor 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 la CTLA4 simiană (ELISA)
Concentraţia de anticorp (µg/ml) Antigenul de acoperire: CTLA4-hFc simiană, 0,25 µg/ml 8D2H2L2 8D2H3L3 10D1 11.2.1 1 1,576 1,624 1,235 1,321 1,788 1,846 1,718 1,632 1:3 1,223 1,199 0,921 0,873 1,250 1,344 1,540 1,460 1:9 0,793 0,775 0,654 0,724 0,845 0,868 1,114 1,054 1:27 0,471 0,426 0,441 0,403 0,429 0,402 0,625 0,665 1:81 0,220 0,230 0,239 0,218 0,190 0,191 0,297 0,313 1:243 0,114 0,117 0,123 0,119 0,104 0,108 0,130 0,172 1:729 0,071 0,076 0,088 0,096 0,063 0,067 0,082 0,094 0 0,048 0,048 0,048 0,050 0,049 0,053 0,048 0,051 Anticorpul secundar IgG capră anti-uman conjugat cu HRP, F(ab')2 Anticorp secundar
Tabelul 8
Legarea anticorpilor 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 cu CTLA4 umană (ELISA)
Concentraţia de anticorp (µg/ml) Antigenul de acoperire: CTLA4, la 0,5 µg/ml 8D2H2L2 20150327 8D2H2L15 8D2H2L17 10D1 11.2.1 8D2H2L2 20140422 1 2,34 2,37 2,58 2,55 2,61 2,81 2,56 2,74 2,75 2,69 2,23 2,40 1:3 2,22 2,09 2,65 2,72 2,73 2,78 2,42 2,44 2,56 2,66 2,09 2,07 1:9 2,03 1,87 2,79 2,45 2,59 2,73 2,20 2,20 2,69 2,44 1,92 1,95 1:27 1,82 1,93 2,43 2,21 2,41 2,28 1,81 1,70 2,13 2,28 1,47 1,63 1:81 1,10 1,17 1,95 1,83 1,80 1,68 1,03 1,09 1,37 1,53 1,10 1,01 1:243 0,65 0,58 1,05 1,02 1,14 1,19 0,51 0,53 0,75 0,79 0,49 0,50 1:729 0,26 0,21 0,53 0,44 0,57 0,50 0,21 0,24 0,32 0,31 0,23 0,20 0 0,04 0,05 0,05 0,04 0,04 0,05 0,04 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 Anticorp secundar: IgG capră anti-uman conjugat cu HRP (1:5000)
Tabelul 9
Eficacitatea de legare EC50 a anticorpilor 8D2, 8D2(Re) şi 8D2 anticorpilor umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 la antigenul CTLA4, obţinută prin intermediul curbei de simulare în analiza efectuată prin metoda ELISA
Sursa de antigen CTLA4 Anticorpul EC50 (нМ) 10D1 EC50 (нМ) 11.2.1 EC50 (нМ) 8D2 Şoarece 0,015 0,062 0,023 0,071 0,24 8D2(Re) Şoarece 0,015 0,062 0,023 0,085 0,24 8D2H1L1 Şoarece 0,025 0,062 0,023 8D2H2L2 Om 0,12 0,125 0,09 8D2H2L2 Om 0,082 0,125 0,09 8D2H2L2 Om 0,118 0,125 0,09 8D2H3L3 Om 0,129 0,125 0,09 8D2H2L2 Maimuţă 0,227 0,258 0,075 8D2H3L3 Maimuţă 0,385 0,258 0,075 8D2H2L15 Om 0,042 0,138 0,075 8D2H2L17 Om 0,047 0,138 0,075
Notă: Anticorpul 8D2H2L2 a fost măsurat în trei repetitivităţi.
Rezultatele prezentate mai sus arată că anticorpii 8D2 şi 8D2(Re) se leagă la antigenul murin CTLA4 cu o eficienţă mai bună în comparaţie cu anticorpii de control 10D1 şi 11.2.1. Anticorpul umanizat 8D2H1L1 se leagă la antigenul murin CTLA4 cu o eficienţă mai mare în comparaţie cu anticorpul de control 10D1 şi cu o eficienţă comparabilă cu 11.2.1.
Anticorpul umanizat 8D2H2L2 se leagă la antigenul uman CTLA4 cu o eficienţă comparabilă cu cea a eficienţei de legare a 10D1. Anticorpii umanizaţi 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 se leagă la antigenul uman CTLA4 cu o eficienţă comparabilă cu eficienţa legării 10D1. Anticorpii umanizaţi 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 se leagă la antigenul uman CTLA4 cu o eficienţă care depăşeşte cu mult eficienţa legării anticorpilor de control 10D1 şi 11.2.1.
Exemplul 8. Determinarea activităţii anticorpilor privind concurenţa lor cu B7-1/2 pentru legarea la antigenul CTLA4 folosind testul de competitivitate ELISA
1. Determinarea activităţii anticorpilor privind concurenţa lor cu B7-1 pentru legarea la antigenul CTLA4 folosind testul ELISA
Plăcile ELISA au fost acoperite cu B7-1 la temperatura de 4°C pe parcursul unei nopţi. După blocarea cu BSA de 1% la temperatura de 37°C timp de 2 ore, au fost adăugaţi anticorpii anti-CTLA4, adică anticorpii monoclonali 8D2, 8D2(Re) şi 8D2 anticorpii umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17, precum şi anticorpii de control 10D1 şi 11.2.1. După incubarea timp de 10 minute, a fost adăugat CTLA4-mFc. După incubarea la temperatura de 370C timp de 40 de minute, a fost adăugat anticorpul secundar conjugat cu enzimă. După incubarea la temperatura de 370C timp de 30 minute, a fost determinată absorbanţa la lungimea de undă de 450 nm pe cititorul plăcilor ELISA.
2. Determinarea activităţii anticorpilor privind concurenţa lor cu B7-2 pentru legarea la antigenul CTLA4 cu ajutorul testului ELISA
Plăcile ELISA au fost acoperite cu CTLA4-mFc la temperatura de 40C pe parcursul unei nopţi. După blocarea cu BSA de 1% la temperatura de 370C timp de 2 ore, au fost adăugaţi anticorpii anti-CTLA4, adică anticorpii monoclonalii 8D2, 8D2(Re) şi 8D2 anticorpii umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17, precum şi anticorpii de control 10D1 şi 11.2.1. După incubarea timp de 10 minute, a fost adăugat B7-2. După incubarea la temperatura de 370C timp de 40 minute, a fost adăugat anticorpul secundar conjugat cu enzimă. După incubarea la temperatura de 370C timp de 30 minute, a fost determinată absorbanţa la lungimea de undă de 450 nm pe cititorul plăcii ELISA. Rezultatele privind detectarea legării 8D2, 8D2(Re) şi anticorpilor umanizaţi la antigenul CTLA4 sunt prezentate în Figurile 26-31, respectiv. După cum se demonstrează în aceste figuri, anticorpii 8D2, 8D2(Re) şi 8D2 anticorpii umanizaţi se pot lega în mod eficient la proteina CTLA4, eficienţa de legare a acestora fiind dependentă de doză. Valorile intensităţii fluorescenţei pentru fiecare doză sunt prezentate în Tabelele 10-16. Eficacitate de legare EC50 a anticorpilor 8D2, 8D2(Re) şi a anticorpilor umanizaţi a fost obţinută folosindu-se curba de simulare în analiza cantitativă a fluorescenţei anticorpului legat 8D2, 8D2(Re) şi anticorpilor umanizaţi (Tabelul 17).
Tabelul 10
Anticorpii 8D2 şi 8D2(Re) concurează cu B7-1, testul ELISA
Concentraţia de anticorp (µg/ml) Antigenul de acoperire: CTLA4-mFc, 0,2 µg/ml 8D2 8D2(Re) 3 0,163 0,149 0,176 0,215 1 0,208 0,188 0,200 0,214 0,3 0,354 0,347 0,355 0,390 0,1 0,680 0,695 0,668 0,721 0,03 1,378 1,262 1,430 1,708 0,01 1,758 1,612 1,630 1,824 0,003 1,982 1,711 1,890 1,937 0 2,228 1,766 1,805 1,779 B7/1-hFc (0,3 µg/ml) Anticorpul secundar Anticorp secundar capră anti-uman
Tabelul 11
Anticorpii 8D2, 8D2H1L1 şi 8D2(Re) concurează cu B7-1, testul ELISA
Concentraţia de anticorp (µg/ml) Proteina de acoperire: B7/1- hFc, 0,2 µg/ml 10D1 11.2.1 8D2 H1L1 CTLA4-mFc (0,6 µg/ml) 1:2 3 0,168 0,158 0,101 0,105 0,123 0,138 0,824 0,791 1:3 0,258 0,232 0,119 0,133 0,206 0,231 0,640 0,768 1:9 0,515 0,466 0,381 0,485 0,445 0,529 0,750 0,717 1:27 0,577 0,508 0,597 0,579 0,509 0,659 0,653 0,626 1:81 0,801 0,730 0,650 0,613 0,669 0,723 0,571 0,522 1:243 0,814 0,848 0,900 0,520 0,841 0,821 0,459 0,327 1:729 0,854 0,732 0,993 0,841 0,848 0,822 0,312 0,232 0 0,856 0,812 0,826 0,550 0,672 0,600 0,071 0,074 Antigenul CTLA4-mFc 0,3 µg/ml Controlul Anticorpul secundar IgG capră anti-murin conjugat cu HRP Anticorp secundar
Tabelul 12
Anticorpii 8D2, 8D2H1L1 şi 8D2(Re) concurează cu B7-2, testul ELISA
Concentraţia de anticorp (µg/ml) Antigenul de acoperire: CTLA4- mFc, 0,5 µg/ml 10D1 11.2.1 8D2H1L1 8D2 8D2(Re) 3 0,569 0,550 0,492 0,442 0,450 0,384 0,407 0,336 0,367 0,375 1:3 0,500 0,466 0,387 0,402 0,404 0,332 0,359 0,306 0,331 0,289 1:9 0,736 0,782 0,412 0,482 0,467 0,371 0,456 0,355 0,384 0,315 1:27 0,982 1,137 0,676 0,585 0,671 0,633 0,675 0,675 0,464 0,443 1:81 1,196 1,355 1,120 0,965 1,038 1,007 1,091 1,050 0,713 0,622 1:243 1,171 1,380 1,237 1,214 1,215 1,069 1,154 1,172 0,862 0,766 1:729 1,307 1,388 1,362 1,229 1,231 1,253 1,242 1,264 0,826 0,725 0 1,030 1,171 1,187 1,100 1,130 1,076 1,034 1,183 0,915 0,861 Receptorul B7/2-His, 1 µg/ml Anticorpul secundar Anti-His murin conjugat cu HRP Anticorp secundar
Tabelul 13
Anticorpii 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 concurează cu B7-1, testul ELISA
Concentraţia de anticorp (µg/ml) Proteina de acoperire: B7/1- hFc, 0,3 µg/ml 8D2 H2L2 8D2 H3L3 10D1 11.2.1 5 0,207 0,232 0,187 0,202 0,166 0,172 0,080 0,089 1:3 0,346 0,267 0,286 0,327 0,210 0,194 0,090 0,097 1:9 0,625 0,702 0,416 0,388 0,486 0,548 0,160 0,138 1:27 0,577 0,727 0,590 0,503 0,673 0,621 0,488 0,369 1:81 0,830 0,743 0,747 0,617 0,663 0,647 0,698 0,660 1:243 0,707 0,760 0,673 0,768 0,652 0,775 0,755 0,900 1:729 0,780 0,882 0,840 0,842 0,705 0,691 0,909 0,793 0 0,577 0,752 0,632 0,745 0,732 0,909 0,683 0,735 Antigenul CTLA4-mFc 0,3 µg/ml Anticorpul secundar IgG capră anti-murin conjugat cu HRP Anticorp secundar
Tabelul 14
Anticorpii 8D2H2L2 şi 8D2H3L3 concurează cu B7-2 pentru legarea la CTLA4, testul ELISA
Concentraţia de anticorp (µg/ml) Antigenul de acoperire: CTLA4- mFc, 0,5 µg/ml 8D2 H2L2 8D2 H3L3 10D1 11.2.1 1.5 0,377 0,376 0,417 0,432 0,449 0,408 0,372 0,494 1:3 0,616 0,537 0,540 0,511 0,553 0,602 0,437 0,348 1:9 0,988 0,927 0,548 0,614 0,806 0,788 0,479 0,412 1:27 1,085 1,038 0,717 0,728 0,969 0,890 0,622 0,529 1:81 1,227 1,059 1,010 0,951 0,974 0,916 0,805 0,649 1:243 1,136 1,066 1,255 1,160 0,935 0,921 0,930 0,754 1:729 1,218 1,158 1,239 1,162 1,108 1,045 0,981 0,746 0 1,094 1,068 1,198 1,214 1,082 1,047 0,987 0,819 Ligandul B7/2-His, 1 µg/ml Anticorpul secundar Anti-His murin conjugat cu HRP Anticorp secundar
Tabelul 15
Anticorpii 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 concurează cu B7-1 pentru legarea la CTLA4, testul ELISA
Reproduc ţie anticorp Antigenul de acoperire: B7/1- hFc, 0,5 µg/ml 8D2 H2L2 (20150327) 8D2 H2L15 8D2 H2L17 10D1 11.2.1 8D2 H2L2 (20140422) 5 µg/ml 0,09 0,10 0,07 0,07 0,06 0,07 0,08 0,11 0,06 0,06 0,12 0,14 1:3 0,13 0,14 0,07 0,07 0,06 0,07 0,33 0,24 0,09 0,08 0,26 0,24 1:9 0,29 0,26 0,07 0,09 0,08 0,08 0,71 0,78 0,33 0,30 0,45 0,49 1:27 0,66 0,58 0,70 1,03 0,89 0,93 1,11 1,17 1,14 1,19 1,06 1,10 1:81 0,69 0,62 0,68 1,18 0,97 0,79 1,16 1,35 1,17 1,20 1,09 1,09 1:243 0,66 0,64 0,75 1,13 1,05 0,99 1,27 1,48 1,30 1,31 1,19 0,99 1:729 0,69 0,64 0,74 1,07 1,25 1,35 1,33 1,56 1,32 1,31 1,16 1,12 0 0,59 0,66 0,53 1,09 1,18 1,18 1,33 1,29 1,28 1,30 1,11 1,04 Ligandul CTLA4-mFc, 0,3 µg/ml Anticorpul secundar Anti-His murin conjugat cu HRP Anticorp secundar
Tabelul 16
Anticorpii 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 concurează cu B7-2 pentru legarea la CTLA4, testul ELISA
Reproducţia anticorpului CTLA4-mFc, 2 µg/ml 8D2H2L2 20140422 8D2H2L15 8D2H2L17 10D1 11.2.1 8D2H2L2 20150327 1 µg/ml 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,04 0,04 0,05 0,05 1:3 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,07 0,07 0,05 0,05 0,47 0,37 1:9 0,15 0,16 0,17 0,19 0,06 0,12 0,44 0,35 0,17 0,16 0,65 0,58 1:27 0,55 0,59 0,42 0,48 0,50 0,57 0,73 0,70 0,57 0,57 0,79 0,70 1:81 0,76 0,84 0,75 0,75 0,77 0,81 0,85 0,86 0,84 0,76 0,86 0,77 1:243 0,84 0,79 0,83 0,84 0,82 0,87 0,86 0,89 0,84 0,85 0,83 0,84 1:729 0,77 0,76 0,94 1,00 0,97 0,98 0,99 0,91 0,87 0,85 0,82 0,80 0 0,77 0,78 0,92 0,97 0,81 0,82 0,76 0,96 0,91 0,80 0,80 0,76 Ligandul B7/2-His, 0,5 µg/ml Anticorpul secundar Anti-His murin conjugat cu HRP Anticorp secundar (1:4000)
Tabelul 17
Eficacitatea de legare EC50 a anticorpilor 8D2, 8D2(Re) şi 8D2 anticorpilor umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 la antigenul CTLA4 în concurenţă cu B7, obţinută cu ajutorul curbei de simulare în procesul de analiză, folosind testul competitiv ELISA
Anticorpul EC50 (нМ) 10D1 EC50 (нМ) 11.2.1 EC50 (нМ) B7-1 B7-2 B7-1 B7-2 B7-1 B7-2 8D2 0,44 0,208 - 0,464 - 0,15 8D2(Re) 0,514 0,153 - 0,464 - 0,15 8D2H1L1 2,478 0,178 1,91 0,464 1,691 0,15 8D2H2L2 5,932 1,643 5,15 2,056 1,073 0,172 8D2H2L2 2,973 0,368 - - - - 8D2H2L2 3,118 0,301 - - - - 8D2H3L3 2,144 0,167 5,15 2,056 1,073 0,172 8D2H2L15 1,973 0,227 4,586 0,629 2,606 0,349 8D2H2L17 1,787 0,296 4,586 0,629 2,606 0,349
Notă: 8D2H2L2 a fost măsurat în trei repetitivităţi.
Rezultatele prezentate mai sus arată că anticorpii 8D2, 8D2(Re) şi 8D2 anticorpii umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 cu toţii pot concura cu B7 pentru legarea la antigenul CTLA4. În particular, anticorpii 8D2, 8D2(Re), 8D2H1L1 şi 8D2H2L2 concurează cu B7-2 mai puternic decât 10D1 pentru legarea la CTLA4, în timp ce 8D2H2L17 concurează mai puternic decât anticorpii 10D1 şi 11.2.1 atât cu B7-1, cât şi cu B7-2 pentru legarea la CTLA4.
Exemplul 9. Analiza activităţii biologice a anticorpului monoclonal 8D2 şi a anticorpilor umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 în celule
Pentru a determina influenţa anticorpului monoclonal 8D2 şi a anticorpilor umanizaţi 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15, 8D2H2L17 şi a anticorpilor de control 10D1 şi 11.2.1 asupra exprimării IL-2 de către celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC), sângele periferic a fost colectat de la donatori sănătoşi în tuburi pentru colectare conţinând heparină de sodium. PBMC a fost preparat sub formă de suspensie de celule după diluare în PBS şi centrifugare în mediul de separare (la 2550 rot/min, timp de 20 minute). În suspensia de celule a fost adăugat SEB (1 µg/ml)/PHA (30 µg/ml), fiind apoi plasată într-un incubator la o temperatură de 370C şi o atmosferă saturată de umiditate, conţinând 5% CO2, pentru cultivare ulterioară. S-au adăugat, de asemenea, limfocitele Raji şi anticorpul. După co-incubare timp de 48 de ore, PBMC a fost spălat de două ori cu PBS şi adăugat în plăci cu 96 de godeuri, câte 10.000 de celule per godeu. Apoi au fost adăugaţi anticorpii cu un gradient adecvat de concentraţie. După incubare timp de 20 minute, celulele Raji tratate cu PBS timp de 1 oră au fost adăugate în număr de 10.000 celule per godeu pentru co-cultivare timp de 72 ore. După co-cultivarea timp de 72 h, cultura de celule a fost colectată pentru a obţine supernatantul şi profilul expresiei IL-2 din supernatantul co-culturii de celule a fost determinat folosind kitul de reactivi pentru testul ELISA conform instrucţiunilor ataşate la acest kit (Dakewe Co., DKW12-1020-096).
După efectuarea analizei statistice, rezultatele experimentelor au fost prezentate în Figurile 32 şi 33. În comparaţie cu grupul de limfocite T şi grupul de celule Raji în cazul anticorpului monoclonal 8D2, toţi anticorpii umanizaţi ai acestuia 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 pot bloca în mod efectiv legarea CTLA4 la B7 şi îmbunătăţi expresia IL-2 de către limfocitele T (Figurile 32 şi 33). În particular, autorii invenţiei de faţă au descoperit în mod surprinzător faptul că anticorpii 8D2H2L2, 8D2H2L15 şi 8D2H2L17 depăşesc semnificativ anticorpii de control 10D1 şi 11.2.1. La o concentraţie de 10 nM, aceştia asigură un nivel de IL-2 comparabil sau chiar mai mare decât nivelul pe care îl asigură 10D1 sau 11.2.1 la o concentraţie de 100 nM. Astfel, anticorpii din prezenta invenţie au capacitatea de a spori nivelul de IL-2 la concentraţii mai scăzute, de exemplu, de circa 10 nM.
Exemplul 10. Activitatea anti-tumorală a anticorpului monoclonal 8D2H2L2 in vivo
Activitatea antitumorală a anticorpului monoclonal 8D2H2L2 in vivo a fost evaluată utilizând modelul animal hu-SCID-Raji. Celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) uman a fost izolat cu ajutorul reactivului Ficoll şi activat folosind SEB într-o concentraţie de 1 µg/ml, timp de 3 zile. Apoi, un număr de 1,25x106 PBMC activate au fost amestecate cu un număr de 5x106 celule Raji din limfomul Burkitt şi cu 8D2H2L2 (20 mg/kg), fiind injectat subcutanat în şoldul şoarecilor SCID cu absenţă congenitală a celulelor natural-killer (NK). În paralel, a fost format un grup de control izotipic cu 5 animale în grup. În continuare, acestor animale le-a fost administrată o doză de 20 mg/kg prin injecţie intravenoasă o dată pe săptămână, timp de trei săptămâni consecutive. Volumul tumorii a fost măsurat de două ori pe săptămână până la sfârşitul experimentului sau până în momentul când volumul tumorii a atins 1000 mm3.
După cum se demonstrează în Figura 34, anticorpul 8D2H2L2 poate suprima în mod semnificativ creşterea tumorii în modelul hu-SCID-Raji. Acest rezultat indică asupra faptului că anticorpul în cauză poate fi utilizat în condiţii clinice pentru tratamentul limfomului.
Deşi exemplele specifice de realizare a prezentei invenţii au fost descrise în detaliu, în lumina informaţiei dezvăluite în descriere specialiştii din domeniul dat al tehnicii vor putea aprecia că pot fi făcute diferite schimbări şi modificări în cazul unor anumite detalii. Volumul complet al invenţiei de faţă este determinat de către revendicările anexate.
1. Grosso JF., Jure-Kunkel MN. CTLA-4 blockade in tumor models: an overview of preclinical and translational research. Cancer Immun., 2013; v. 13:5, Online, URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3559193/
2. US 6984720 B1 2006.01.10
3. US 6682736 B1 2004.10.27
Claims (14)
1. Anticorp sau fragment al acestuia de legare la antigen, care se leagă cu CTLA4 uman, selectat din grupa constând din:
a) anticorp sau fragment al acestuia de legare la antigen, care cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu SECV. ID NO: 14 şi regiunea variabilă a lanţului uşor SECV. ID NO: 16; şi
b) anticorp sau fragment al acestuia de legare la antigen care cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu SECV. ID NO: 14 şi regiunea variabilă a lanţului uşor SECV. ID NO: 16, în care în secvenţa SECV. ID NO: 14 metionina din poziţia 18 poate fi substituită cu un aminoacid selectat din grupa constând din: leucină, valină, izoleucină şi alanină.
2. Anticorp sau un fragment al acestuia de legare la antigen, conform revendicării 1, în care metionina din poziţia 18 în SECV. ID Nr. 14 este substituită cu leucină şi regiunea variabilă a lanţului uşor SECV. ID Nr. 16.
3. Anticorp sau un fragment al acestuia de legare la antigen, conform revendicării 1 sau 2, care reprezintă un anticorp umanizat sau un fragment al acestuia de legare la antigen.
4. Anticorp sau un fragment al acestuia de legare la antigen, conform oricăreia dintre revendicările 1-3, care se leagă la CTLA4 uman cu un KD mai mic de aproximativ 10-5 M, după cum a fost determinat prin rezonanţă plasmatică de suprafaţă.
5. Anticorp sau un fragment al acestuia de legare la antigen, conform oricăreia dintre revendicările 1-4, în care anticorpul sau fragmentul acestuia de legare la antigen:
(a) blochează legarea CTLA4 uman cu B7 uman;
(b) reglează activitatea CTLA4 uman;
(c) înlătură imunosupresia organismului de către CTLA4 uman;
(d) activează limfocitele T; şi/sau
(e) sporeşte nivelul de expresie al IL-2 în limfocitele T.
6. Una sau mai multe molecule de acizi nucleici izolate, care codifică anticorpul sau fragmentul acestuia de legare la antigen, conform revendicării 1.
7. Una sau mai multe molecule de acizi nucleici izolate, conform revendicării 6, în care una sau mai multe molecule de acizi nucleici izolate conţine secvenţa nucleotidă, reprezentată de secvenţa SECV. ID NO: 13 sau SECV. ID NO: 15.
8. Vector, care conţine o moleculă de acid nucleic izolată, conform revendicării 6.
9. Celulă gazdă care conţine vectorul, conform revendicării 8.
10. Procedeu de obţinere a unui anticorp sau a unui fragment al acestuia de legare la antigen, conform oricăreia dintre revendicările 1-5, care cuprinde etapele de cultivare a celulei gazdă, conform revendicării 9, în condiţii adecvate şi de izolare a anticorpului sau a fragmentului acestuia de legare la antigen din cultura celulară.
11. Compoziţie farmaceutică cu conţinut de un anticorp sau un fragment al acestuia de legare la antigen, conform oricăreia dintre revendicările 1-5, şi un purtător farmaceutic acceptabil şi/sau un adjuvant.
12. Anticorp sau un fragment al acestuia de legare la antigen, conform oricăreia dintre revendicările 1-5, pentru utilizare într-un procedeu de tratare a unui subiect, care este o fiinţă umană, suferindă de tumoare, cum ar fi melanom, tumoare renală/cancer renal, cancer de prostată, cancer de vezică urinară, cancer colorectal, cancer al tractului gastro-intestinal şi/sau tumoare hepatică/cancer hepatic.
13. Anticorp sau un fragment al acestuia de legare la antigen, conform oricăreia dintre revendicările 1-5, pentru utilizare în procedeul de tratare a limfomului.
14. Procedeu in vitro, care cuprinde etapa de introducere în celule a unei cantităţi eficiente dintr-un anticorp sau dintr-un fragment al acestuia de legare la antigen, conform oricăreia dintre revendicările 1-5, în care acest procedeu este selectat dintre următoarele procedee:
(a) procedeu de detectare a nivelului de CTLA4 uman într-o probă,
(b) procedeu de blocare a legării CTLA4 uman cu B7 uman,
(c) procedeu de reglare a activităţii CTLA4 uman sau a nivelului de CTLA4 uman,
(d) procedeu de înlăturare a imunosupresiei organismului de către CTLA4 uman,
(e) procedeu de activare a limfocitelor T, sau
(f) procedeu de creştere a nivelului de exprimare a IL-2 în limfocitele T.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410377352.9A CN105296433B (zh) | 2014-08-01 | 2014-08-01 | 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途 |
| PCT/CN2015/085721 WO2016015675A1 (zh) | 2014-08-01 | 2015-07-31 | 抗ctla4的单克隆抗体或其抗原结合片段、药物组合物及用途 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MD20170022A2 MD20170022A2 (ro) | 2017-06-30 |
| MD4795B1 MD4795B1 (ro) | 2022-02-28 |
| MD4795C1 true MD4795C1 (ro) | 2022-09-30 |
Family
ID=55194268
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| MDA20170022A MD4795C1 (ro) | 2014-08-01 | 2015-07-31 | Anticorp monoclonal anti-CTLA4 sau fragment de legare a acestuia la antigen, compoziţie farmaceutică şi utilizarea lor |
Country Status (39)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10449251B2 (ro) |
| EP (2) | EP3858861A1 (ro) |
| JP (2) | JP6514774B2 (ro) |
| KR (1) | KR102017396B1 (ro) |
| CN (3) | CN105296433B (ro) |
| AP (1) | AP2017009762A0 (ro) |
| AU (2) | AU2015295936C1 (ro) |
| CA (1) | CA2956000C (ro) |
| CL (1) | CL2017000250A1 (ro) |
| CO (1) | CO2017000754A2 (ro) |
| CR (1) | CR20170033A (ro) |
| CY (1) | CY1124190T1 (ro) |
| DK (1) | DK3176181T3 (ro) |
| DO (1) | DOP2017000031A (ro) |
| EA (1) | EA036396B1 (ro) |
| EC (1) | ECSP17012781A (ro) |
| ES (1) | ES2857509T3 (ro) |
| GE (1) | GEP20207166B (ro) |
| HR (1) | HRP20210448T1 (ro) |
| HU (1) | HUE053719T2 (ro) |
| IL (1) | IL250321B (ro) |
| LT (1) | LT3176181T (ro) |
| MA (2) | MA40474B1 (ro) |
| MD (1) | MD4795C1 (ro) |
| MX (2) | MX2017001446A (ro) |
| MY (1) | MY192822A (ro) |
| NI (1) | NI201700008A (ro) |
| NZ (1) | NZ729158A (ro) |
| PE (1) | PE20170772A1 (ro) |
| PH (1) | PH12017500190B1 (ro) |
| PL (1) | PL3176181T3 (ro) |
| PT (1) | PT3176181T (ro) |
| RS (1) | RS61590B1 (ro) |
| SG (1) | SG11201700819QA (ro) |
| SI (1) | SI3176181T1 (ro) |
| TN (1) | TN2017000010A1 (ro) |
| UA (1) | UA119570C2 (ro) |
| WO (1) | WO2016015675A1 (ro) |
| ZA (1) | ZA201700528B (ro) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105296433B (zh) * | 2014-08-01 | 2018-02-09 | 中山康方生物医药有限公司 | 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途 |
| ES2803655T3 (es) | 2015-05-29 | 2021-01-28 | Agenus Inc | Aticuerpos anti-ctla-4 y métodos de uso de los mismos |
| MA48579A (fr) | 2015-09-01 | 2020-03-18 | Agenus Inc | Anticorps anti-pd1 et méthodes d'utilisation de ceux-ci |
| MA44483A (fr) | 2016-03-24 | 2019-01-30 | Millennium Pharm Inc | Procédés pour traiter des événements indésirables gastro-intestinaux d'origine immunitaire dans des traitements oncologiques immunitaires |
| WO2017165742A1 (en) | 2016-03-24 | 2017-09-28 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in anti-ctla4 anti-pd-1 combination treatments |
| CN107400166A (zh) | 2016-05-19 | 2017-11-28 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 针对ctla4的单域抗体及其衍生蛋白 |
| BR112018076281A2 (pt) | 2016-06-20 | 2019-03-26 | Kymab Limited | imunocitocina, uso de uma imunocitocina, método, composição farmacêutica, método para tratar uma doença proliferativa em um animal, ácido nucleico, vetor, hospedeiro e anticorpo ou fragmento do mesmo |
| CN106967172B (zh) * | 2016-08-23 | 2019-01-08 | 康方药业有限公司 | 抗ctla4-抗pd-1 双功能抗体、其药物组合物及其用途 |
| WO2018035710A1 (en) | 2016-08-23 | 2018-03-01 | Akeso Biopharma, Inc. | Anti-ctla4 antibodies |
| CN106977602B (zh) | 2016-08-23 | 2018-09-25 | 中山康方生物医药有限公司 | 一种抗pd1单克隆抗体、其药物组合物及其用途 |
| WO2018068182A1 (en) * | 2016-10-10 | 2018-04-19 | Crown Bioscience (Taicang) Inc. | Novel anti-ctla4 antibodies |
| TWI773694B (zh) | 2016-10-11 | 2022-08-11 | 美商艾吉納斯公司 | 抗ｌａｇ－３抗體及其使用方法 |
| EA201991383A1 (ru) | 2016-12-07 | 2019-12-30 | Эйдженус Инк. | Антитела против ctla-4 и способы их применения |
| EP3597735A4 (en) * | 2017-03-15 | 2020-11-25 | Suzhou Galaxy Biopharma, Co., Ltd. | CTLA4 ANTIBODIES, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USES THEREOF |
| EP3600426A4 (en) * | 2017-03-31 | 2021-01-20 | Merck Sharp & Dohme Corp. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF CANCER WITH A COMBINATION OF A PD-1 ANTAGONIST AND AN ANTI-CTLA4 ANTIBODY |
| JOP20190260A1 (ar) | 2017-05-02 | 2019-10-31 | Merck Sharp & Dohme | صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها |
| EP3618871A4 (en) | 2017-05-02 | 2021-01-06 | Merck Sharp & Dohme Corp. | ANTI-LAG3 ANTIBODIES ETCO-FORMULATIONS ANTI-LAG3 ANTIBODIES AND ANTI-PD-1 ANTIBODIES |
| CN110678199B (zh) * | 2017-05-02 | 2025-02-28 | 默沙东有限责任公司 | 单独的和与程序性死亡受体1(pd-1)抗体组合的抗ctla4抗体的稳定制剂及其使用方法 |
| CN108948194B (zh) * | 2017-05-19 | 2023-02-17 | 上海药明生物技术有限公司 | 一种新的ctla-4单克隆抗体 |
| KR20230053001A (ko) * | 2017-05-19 | 2023-04-20 | 우시 바이올로직스 (상하이) 컴퍼니 리미티드 | 세포독성 t-림프구-관련 단백질 4 (ctla-4)에 대한 신규의 단일클론 항체 |
| AR111760A1 (es) | 2017-05-19 | 2019-08-14 | Novartis Ag | Compuestos y composiciones para el tratamiento de tumores sólidos mediante administración intratumoral |
| CN107325181A (zh) * | 2017-07-05 | 2017-11-07 | 无锡傲锐东源生物科技有限公司 | 抗ctla4蛋白单克隆抗体及其用途 |
| WO2019036855A1 (en) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | Adagene Inc. | ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE |
| SG11202001604UA (en) * | 2017-09-21 | 2020-04-29 | Eucure Beijing Biopharma Co Ltd | Anti-ctla4 antibodies and uses thereof |
| WO2019148444A1 (en) | 2018-02-02 | 2019-08-08 | Adagene Inc. | Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same |
| WO2019148445A1 (en) | 2018-02-02 | 2019-08-08 | Adagene Inc. | Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same |
| MX2020008446A (es) * | 2018-02-13 | 2020-09-28 | Merck Sharp & Dohme | Metodos para el tratamiento contra el cancer mediante anticuerpos anti-pd-1 y anticuerpos anti-ctla4. |
| EP3768721A4 (en) * | 2018-03-19 | 2021-12-29 | Wuxi Biologics Ireland Limited. | Novel anti-ctla-4 antibody polypeptide |
| CN109336975B (zh) * | 2018-04-18 | 2022-05-13 | 中国科学院微生物研究所 | 一种靶向pd-1的肿瘤抑制性抗体及其应用 |
| EP3802613A4 (en) * | 2018-06-05 | 2022-03-09 | Jiangsu Alphamab Biopharmaceuticals Co., Ltd. | DIMERE AND ITS USE |
| KR20210035805A (ko) | 2018-06-15 | 2021-04-01 | 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. | 세포후 신호전달 인자의 조절을 통한 면역 활성의 증가 |
| CN110760002A (zh) * | 2018-07-25 | 2020-02-07 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 人源化抗人ctla4单克隆抗体及其制备方法和用途 |
| AU2019407814A1 (en) | 2018-12-21 | 2021-07-22 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Bifunctional anti-PD-1/IL-7 molecule |
| WO2020165374A1 (en) | 2019-02-14 | 2020-08-20 | Ose Immunotherapeutics | Bifunctional molecule comprising il-15ra |
| WO2020227159A2 (en) | 2019-05-03 | 2020-11-12 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Methods of modulating immune activity |
| CN110256561B (zh) * | 2019-06-13 | 2021-04-16 | 东大生物技术(苏州)有限公司 | 一组ctla-4单克隆抗体及其医药用途 |
| CN110256563A (zh) * | 2019-07-05 | 2019-09-20 | 石河子大学 | Ctla-4纳米抗体、制备方法及其应用 |
| JP2023509359A (ja) | 2019-12-17 | 2023-03-08 | フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド | 鉄依存性細胞分解の誘導物質との併用抗癌療法 |
| WO2021122866A1 (en) | 2019-12-17 | 2021-06-24 | Ose Immunotherapeutics | Bifunctional molecules comprising an il-7 variant |
| EP4114863A4 (en) * | 2020-03-05 | 2024-04-24 | Merck Sharp & Dohme LLC | METHODS OF TREATING CANCER OR INFECTION USING A COMBINATION OF AN ANTI-PD-1 ANTIBODY, AN ANTI-CTLA4 ANTIBODY AND AN ANTI-TIGIT ANTIBODY |
| JP7440724B2 (ja) * | 2020-04-13 | 2024-02-29 | ビオシオン インコーポレイテッド | Ｃｔｌａ４に結合する抗体及びその使用 |
| EP4172323A1 (en) | 2020-06-29 | 2023-05-03 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer |
| CN113980130B (zh) * | 2020-07-27 | 2023-07-21 | 湖南远泰生物技术有限公司 | 人源化cd37和双特异性cd19-人源化cd37 car-t细胞 |
| CN112079926A (zh) * | 2020-09-17 | 2020-12-15 | 北京华大蛋白质研发中心有限公司 | 抗人ctla4单克隆抗体及其应用 |
| WO2022112198A1 (en) | 2020-11-24 | 2022-06-02 | Worldwide Innovative Network | Method to select the optimal immune checkpoint therapies |
| CA3214085A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-10-06 | Darby Rye Schmidt | Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer |
| MX2023011964A (es) | 2021-04-09 | 2024-01-08 | Ose Immunotherapeutics | Nuevo andamio para moléculas bifuncionales con propiedades mejoradas. |
| US20240182572A1 (en) | 2021-04-09 | 2024-06-06 | Ose Immunotherapeutics | Scaffold for bifunctional molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains |
| WO2023278641A1 (en) | 2021-06-29 | 2023-01-05 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof |
| CN114316053B (zh) * | 2021-12-20 | 2023-09-29 | 南京诺唯赞检测技术有限公司 | 一种vce的单克隆抗体及其制备方法 |
| WO2023143597A1 (en) * | 2022-01-30 | 2023-08-03 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Anti-ctla4/ox40 bispecific antibodies and uses thereof |
| WO2024003360A1 (en) | 2022-07-01 | 2024-01-04 | Institut Curie | Biomarkers and uses thereof for the treatment of neuroblastoma |
| WO2024028386A1 (en) | 2022-08-02 | 2024-02-08 | Ose Immunotherapeutics | Multifunctional molecule directed against cd28 |
| TW202426499A (zh) * | 2022-09-16 | 2024-07-01 | 大陸商同潤生物醫藥(上海)有限公司 | 具有pH依賴性的抗CTLA4抗體或抗原結合片段 |
| WO2024077191A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-11 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer |
| WO2024151687A1 (en) | 2023-01-09 | 2024-07-18 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Genetic switches and their use in treating cancer |
| WO2024200826A1 (en) | 2023-03-30 | 2024-10-03 | Ose Immunotherapeutics | Lipid-based nanoparticle targeted at activated immune cells for the expression of immune cell inhibiting molecule and use thereof |
| WO2024200823A1 (en) | 2023-03-30 | 2024-10-03 | Ose Immunotherapeutics | Lipid-based nanoparticle targeted at activated immune cells for the expression of immune cell enhancing molecule and use thereof |
Family Cites Families (52)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US682736A (en) | 1900-08-02 | 1901-09-17 | James C Owen | Oil-can. |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US5851795A (en) | 1991-06-27 | 1998-12-22 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble CTLA4 molecules and uses thereof |
| US6719972B1 (en) | 1994-06-03 | 2004-04-13 | Repligen Corporation | Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies |
| WO1996034090A1 (en) | 1995-04-27 | 1996-10-31 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Apparatus and method for sterilizing, seeding, culturing, storing, shipping and testing tissue, synthetic or native vascular grafts |
| US5811097A (en) | 1995-07-25 | 1998-09-22 | The Regents Of The University Of California | Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling |
| US6051227A (en) | 1995-07-25 | 2000-04-18 | The Regents Of The University Of California, Office Of Technology Transfer | Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling |
| US5855887A (en) | 1995-07-25 | 1999-01-05 | The Regents Of The University Of California | Blockade of lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling |
| JP2001523958A (ja) | 1997-03-21 | 2001-11-27 | ブライハム アンド ウィミンズ ホスピタル，インコーポレイテッド | 免疫療法のｃｔｌａ−４結合ペプチド |
| US7122615B1 (en) | 1998-09-10 | 2006-10-17 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Polyanhydrides with therapeutically useful degradation products |
| BR9916853A (pt) | 1998-12-23 | 2001-11-20 | Pfizer | Anticorpos monoclonais humanos ao ctla-4 |
| US6682736B1 (en) | 1998-12-23 | 2004-01-27 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to CTLA-4 |
| US7109003B2 (en) | 1998-12-23 | 2006-09-19 | Abgenix, Inc. | Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4 |
| CA2589418A1 (en) | 1999-08-24 | 2001-03-01 | Medarex, Inc. | Human ctla-4 antibodies and their uses |
| US7605238B2 (en) | 1999-08-24 | 2009-10-20 | Medarex, Inc. | Human CTLA-4 antibodies and their uses |
| AU2001233027A1 (en) | 2000-01-27 | 2001-08-07 | Genetics Institute, Llc | Antibodies against ctla4 (cd152), conjugates comprising same, and uses thereof |
| IL149701A0 (en) | 2001-05-23 | 2002-11-10 | Pfizer Prod Inc | Use of anti-ctla-4 antibodies |
| US7452535B2 (en) | 2002-04-12 | 2008-11-18 | Medarex, Inc. | Methods of treatment using CTLA-4 antibodies |
| BR0304876A (pt) | 2002-05-24 | 2004-10-19 | Castrol Ltd | Produto de reação, composição de óleo lubrificante, monÈmero, copolìmero de enxerto e incrementador do ìndice de viscosidade de um dispersante e respectivos métodos de produção |
| PT1537878E (pt) | 2002-07-03 | 2010-11-18 | Ono Pharmaceutical Co | Composições de imunopotenciação |
| AU2003260871A1 (en) | 2002-09-30 | 2004-04-19 | Pfizer Products Inc. | Hybridomas producing high levels of human sequence antibody |
| US8168170B2 (en) | 2002-10-03 | 2012-05-01 | The Procter And Gamble Company | Compositions having an inner core and at least three surrounding layers |
| US7465446B2 (en) | 2003-05-30 | 2008-12-16 | Medarex, Inc. | Surrogate therapeutic endpoint for anti-CTLA4-based immunotherapy of disease |
| BRPI0509274A (pt) | 2004-03-26 | 2007-09-04 | Pfizer Prod Inc | usos de anticorpos anti-ctla-4 |
| DE102004063494A1 (de) * | 2004-12-23 | 2006-07-13 | Tegenero Ag | Antikörper |
| AR054233A1 (es) * | 2005-03-08 | 2007-06-13 | Pharmacia & Upjohn Co Llc | Composiciones de anticuerpos igg2 |
| EP1869067A1 (en) | 2005-04-11 | 2007-12-26 | Medarex, Inc. | Protein purification using hcic amd ion exchange chromatography |
| US8008449B2 (en) | 2005-05-09 | 2011-08-30 | Medarex, Inc. | Human monoclonal antibodies to programmed death 1 (PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics |
| WO2007113648A2 (en) | 2006-04-05 | 2007-10-11 | Pfizer Products Inc. | Ctla4 antibody combination therapy |
| CN101074264B (zh) * | 2006-05-17 | 2011-08-17 | 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 | 一种重组抗ctla4单克隆抗体及其制备方法和用途 |
| EP2240204A1 (en) | 2008-02-04 | 2010-10-20 | Medarex, Inc. | Anti-clta-4 antibodies with reduced blocking of binding of ctla-4 to b7 and uses thereof |
| US9540426B2 (en) | 2009-10-06 | 2017-01-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Mammalian cell culture processes for protein production |
| BR112012008665A2 (pt) | 2009-10-12 | 2016-11-22 | Pfizer | tratamento de câncer |
| ES2642629T3 (es) | 2009-11-17 | 2017-11-17 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Métodos para la producción mejorada de proteínas |
| CN102134276A (zh) * | 2010-01-22 | 2011-07-27 | 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 | 一种抗ctla-4嵌合抗体 |
| WO2012038606A1 (en) * | 2010-09-24 | 2012-03-29 | Oncos Therapeutics Oy | Oncolytic adenoviral vectors coding for monoclonal anti - ctla - 4 antibodies |
| GB201103955D0 (en) | 2011-03-09 | 2011-04-20 | Antitope Ltd | Antibodies |
| KR20140058532A (ko) | 2011-06-30 | 2014-05-14 | 겐자임 코포레이션 | Ｔ-세포 활성화 억제제 |
| US20150079100A1 (en) | 2012-03-23 | 2015-03-19 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of treatments using ctla-4 antibodies |
| EA037351B8 (ru) | 2012-05-15 | 2021-04-29 | Бристол-Майерс Сквибб Компани | Способ лечения злокачественных опухолей с использованием комбинации антител против pd-1 и ctla-4 |
| US8844207B2 (en) | 2012-06-04 | 2014-09-30 | Mity-Lite, Inc. | Portable dance floor panel with floating magnet retention system |
| CN102801616B (zh) | 2012-08-02 | 2015-04-15 | 华为技术有限公司 | 报文发送和接收的方法、装置和系统 |
| EP2759305A1 (en) | 2013-01-24 | 2014-07-30 | Thrombotargets Europe, S.L. | Hemostatic compositions |
| EP3049442A4 (en) | 2013-09-26 | 2017-06-28 | Costim Pharmaceuticals Inc. | Methods for treating hematologic cancers |
| CN106255510A (zh) | 2014-03-05 | 2016-12-21 | 百时美施贵宝公司 | 使用抗pd‑1抗体与另一抗癌剂的组合治疗肾癌 |
| CN106714839A (zh) | 2014-05-15 | 2017-05-24 | 百时美施贵宝公司 | 使用抗pd‑1抗体和另一种抗癌剂的组合治疗肺癌 |
| CN105296433B (zh) * | 2014-08-01 | 2018-02-09 | 中山康方生物医药有限公司 | 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途 |
| US20180133313A1 (en) | 2014-12-16 | 2018-05-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Use of immune checkpoint inhibitors in central nervous systems neoplasms |
| CN104479019B (zh) | 2014-12-26 | 2020-07-21 | 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 | 一种抗ctla-4人源抗体 |
| EP3878861A1 (en) | 2015-02-16 | 2021-09-15 | Lonza Ltd. | Cl and/or ch1 mutated antibodies for drug conjugation |
| WO2016183469A1 (en) | 2015-05-13 | 2016-11-17 | Robert Kirken | Anti-ctla-4 blockade |
| CN108602892A (zh) | 2016-01-27 | 2018-09-28 | 百时美施贵宝公司 | 使用抗-pd-1抗体和另一种抗癌剂的组合治疗肺癌 |
-
2014
- 2014-08-01 CN CN201410377352.9A patent/CN105296433B/zh active Active
-
2015
- 2015-07-31 US US15/500,744 patent/US10449251B2/en active Active
- 2015-07-31 HU HUE15827441A patent/HUE053719T2/hu unknown
- 2015-07-31 SI SI201531555T patent/SI3176181T1/sl unknown
- 2015-07-31 MD MDA20170022A patent/MD4795C1/ro active IP Right Grant
- 2015-07-31 MX MX2017001446A patent/MX2017001446A/es unknown
- 2015-07-31 SG SG11201700819QA patent/SG11201700819QA/en unknown
- 2015-07-31 MA MA40474A patent/MA40474B1/fr unknown
- 2015-07-31 ES ES15827441T patent/ES2857509T3/es active Active
- 2015-07-31 EP EP20216429.9A patent/EP3858861A1/en active Pending
- 2015-07-31 EA EA201790288A patent/EA036396B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2015-07-31 JP JP2017525666A patent/JP6514774B2/ja active Active
- 2015-07-31 CN CN201580040171.XA patent/CN106687479B/zh active Active
- 2015-07-31 WO PCT/CN2015/085721 patent/WO2016015675A1/zh active Application Filing
- 2015-07-31 MA MA055868A patent/MA55868A/fr unknown
- 2015-07-31 NZ NZ729158A patent/NZ729158A/en unknown
- 2015-07-31 AU AU2015295936A patent/AU2015295936C1/en active Active
- 2015-07-31 PH PH1/2017/500190A patent/PH12017500190B1/en unknown
- 2015-07-31 AP AP2017009762A patent/AP2017009762A0/en unknown
- 2015-07-31 EP EP15827441.5A patent/EP3176181B1/en active Active
- 2015-07-31 LT LTEP15827441.5T patent/LT3176181T/lt unknown
- 2015-07-31 KR KR1020177005688A patent/KR102017396B1/ko active IP Right Grant
- 2015-07-31 PL PL15827441T patent/PL3176181T3/pl unknown
- 2015-07-31 CA CA2956000A patent/CA2956000C/en active Active
- 2015-07-31 PE PE2017000155A patent/PE20170772A1/es unknown
- 2015-07-31 RS RS20210312A patent/RS61590B1/sr unknown
- 2015-07-31 PT PT158274415T patent/PT3176181T/pt unknown
- 2015-07-31 GE GEAP201514437A patent/GEP20207166B/en unknown
- 2015-07-31 DK DK15827441.5T patent/DK3176181T3/da active
- 2015-07-31 UA UAA201701943A patent/UA119570C2/uk unknown
- 2015-07-31 TN TN2017000010A patent/TN2017000010A1/en unknown
- 2015-07-31 CN CN202211206595.7A patent/CN115960232A/zh active Pending
- 2015-07-31 MY MYPI2017000162A patent/MY192822A/en unknown
- 2015-08-31 CR CR20170033A patent/CR20170033A/es unknown
-
2017
- 2017-01-23 ZA ZA2017/00528A patent/ZA201700528B/en unknown
- 2017-01-26 IL IL250321A patent/IL250321B/en active IP Right Grant
- 2017-01-27 CO CONC2017/0000754A patent/CO2017000754A2/es unknown
- 2017-01-31 MX MX2021013586A patent/MX2021013586A/es unknown
- 2017-01-31 NI NI201700008A patent/NI201700008A/es unknown
- 2017-01-31 CL CL2017000250A patent/CL2017000250A1/es unknown
- 2017-02-01 DO DO2017000031A patent/DOP2017000031A/es unknown
- 2017-03-01 EC ECIEPI201712781A patent/ECSP17012781A/es unknown
-
2018
- 2018-10-11 AU AU2018247270A patent/AU2018247270A1/en not_active Abandoned
-
2019
- 2019-02-28 JP JP2019036646A patent/JP6783886B2/ja active Active
- 2019-09-05 US US16/562,236 patent/US11291720B2/en active Active
-
2021
- 2021-03-08 CY CY20211100197T patent/CY1124190T1/el unknown
- 2021-03-17 HR HRP20210448TT patent/HRP20210448T1/hr unknown
-
2022
- 2022-03-15 US US17/695,592 patent/US20230064544A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230064544A1 (en) | Anti-ctla4 monoclonal antibody or its antigen binding fragments, pharmaceutical compositions and uses | |
| US20240010728A1 (en) | Anti-ctla4 and anti-pd-1 bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof | |
| KR102469286B1 (ko) | 항-pd1 단일클론 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도 | |
| RU2739610C1 (ru) | Антитело против PD-1 и его применение | |
| KR102522693B1 (ko) | 세포독성 t-림프구-관련 단백질 4 (ctla-4)에 대한 신규의 단일클론 항체 | |
| JP2021536242A (ja) | 抗ｐｄ−１／抗ｖｅｇｆａ二官能性抗体、その医薬組成物およびその使用 | |
| CN114478769B (zh) | 抗tigit抗体、其药物组合物及用途 | |
| CN114106182A (zh) | 抗tigit的抗体及其用途 | |
| EA042365B1 (ru) | Бифункциональное антитело против ctla4 и против pd-1, его фармацевтическая композиция и их применение | |
| NZ791623A (en) | Anti-CTLA4 and anti-PD-1 bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG4A | Patent for invention issued |