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CN108948194B - 一种新的ctla-4单克隆抗体 - Google Patents

一种新的ctla-4单克隆抗体 Download PDF

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CN108948194B CN201710359405.8A CN201710359405A CN108948194B CN 108948194 B CN108948194 B CN 108948194B CN 201710359405 A CN201710359405 A CN 201710359405A CN 108948194 B CN108948194 B CN 108948194B
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Abstract

本发明提供了CTLA‑4的单克隆抗体，特别是高亲和力的CTLA‑4人源化单克隆抗体。本发明还提供与人、食蟹猴和小鼠的CTLA‑4交叉反应的功能性单克隆抗体。本发明进一步提供了本发明的抗体的氨基酸序列、克隆或表达载体、宿主细胞和用于表达或分离抗体的方法、鉴定抗体的表位。还提供包含本发明抗体的治疗组合物。本发明还提供了用抗CTLA‑4抗体治疗癌症和其它疾病的方法。

Description

一种新的CTLA-4单克隆抗体
技术领域
本发明主要涉及抗CTLA-4抗体及其组合物，以及使用抗CTLA-4抗体对癌症、感染或其他人类疾病的免疫治疗。
背景技术
癌症免疫治疗已成为治疗癌症的热点研究领域。细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)是免疫检查点的验证靶点之一。在T细胞活化后，CTLA-4通常在抗原与TCR接合的1小时内，在T细胞上快速表达。CTLA-4可以通过与CD28竞争来抑制T细胞信号传导。CD28介导其中一个表征良好的T细胞共刺激信号：CD28与抗原呈递细胞上的配体CD80(B7-1)和CD86(B7-2)结合导致T细胞增殖，诱导产生白细胞介素-2和抗凋亡因子。由于CTLA-4对CD80和CD86的亲和力高于CD28，因此CTLA-4可以与CD80和CD86上的CD28竞争结合，导致T细胞活化的抑制。除了在活化的T细胞上的诱导表达外，CTLA-4在调节性T细胞(Treg)的表面上持续性表达，这表明CTLA-4可能是接触介导的抑制所必需的，并且与免疫抑制细胞因子诸如转化生长因子β和白细胞介素-10的Treg产生相关。
在许多临床前和临床研究中证明CTLA-4阻断可以诱导肿瘤消退。两种针对CTLA-4的抗体正在临床开发中。Ipilimumab(MDX-010，BMS-734016)是IgG1-κ型的全人抗CTLA-4单克隆抗体，是已被批准用于治疗晚期黑色素瘤的单一疗法的免疫调节剂。所提出的Ipilimumab的作用机制是干扰在激活的T细胞亚群上表达的CTLA-4与在专业抗原呈递细胞上的CD80/CD86分子之间的相互作用。由于CTLA-4和CD80/CD86间相互作用而促进的T细胞活化抑制性调节被阻断，这导致T细胞功能增强。由此产生的T细胞活化、增殖和淋巴细胞浸润到肿瘤中，导致肿瘤细胞死亡。商业剂型为5mg/mL用于输液的浓缩液。Ipilimumab也用于其他肿瘤类型的临床研究中，包括前列腺癌和肺癌。另一种抗CTLA-4抗体Tremelimumab做为治疗黑素瘤和恶性间皮瘤中的疗法也在研究之中。
发明内容
本发明提供了分离的抗体，特别是单克隆抗体或人源化的单克隆抗体。
一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合于人、猴、小鼠CTLA-4。
如上所述的抗体或抗原结合片段抑制CTLA-4结合于CD80或CD86。
在如上所述的抗体或抗原结合片段中，所述抗体或抗原结合片段的结合抗原表位包括CTLA-4的N145或N145的糖基化修饰。
一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段结合于人、猴CTLA-4，其中所述抗体或抗原结合片段的结合抗原表位包括CTLA-4的P138。
一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段
a)结合于人CTLA-4，KD of 4.77E-10M以下；并且
b)结合于小鼠CTLA-4，KD of 1.39E-09M以下。
如前所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段具有下列性质中的至少一种：
a)结合于人CTLA-4，KD为4.77E-10M至2.08E-10M，并且结合于小鼠CTLA-4，KD为1.39E-09M至9.06E-10；
b)增加来自受刺激的PBMCs的白细胞介素-2分泌；
c)大体上不结合凝血因子VIII、FGFR、PD-1、CD22、VEGF、CD3、HER3、OX40、和4-1BB等蛋白。
本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含一个氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自由SEQ ID NOs﹕1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、和14所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％或95％的同源性，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含一个氨基酸序列，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NOs﹕1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、和14所组成的组中的序列，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，包含：
a)重链可变区，其具有的氨基酸序列与选自由SEQ ID NOs﹕1、2、3、4、5、6、和7所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％或95％的同源性；以及
b)轻链可变区，其具有的氨基酸序列与选自由SEQ ID NOs﹕8、9、10、11、12、13、和14所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％或95％的同源性，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，包含：
a)重链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO﹕1、2、3、4、5、6、和7所组成的组中所序列；以及
b)轻链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NOs﹕8、9、10、11、12、13、和14所组成的组中的序列，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段，包含：
a)重链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO﹕1所组成的组中所序列；以及
b)轻链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NOs﹕8所组成的组中的序列，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合CTLA-4；
或所述抗体或其抗原结合片段，包含：
a)重链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO﹕2所组成的组中所序列；以及
b)轻链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NOs﹕9所组成的组中的序列，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合CTLA-4；
或所述抗体或其抗原结合片段，包含：
a)重链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO﹕3所组成的组中所序列；以及
b)轻链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NOs﹕10所组成的组中的序列，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合CTLA-4；
或所述抗体或其抗原结合片段，包含：
a)重链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO﹕4所组成的组中所序列；以及
b)轻链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NOs﹕11所组成的组中的序列，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合CTLA-4；
或所述抗体或其抗原结合片段，包含：
a)重链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO﹕5所组成的组中所序列；以及
b)轻链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NOs﹕12所组成的组中的序列，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合CTLA-4；
或所述抗体或其抗原结合片段，包含：
a)重链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO﹕6所组成的组中所序列；以及
b)轻链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NOs﹕13所组成的组中的序列，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合CTLA-4；
或所述抗体或其抗原结合片段，包含：
a)重链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO﹕7所组成的组中所序列；以及
b)轻链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NOs﹕14所组成的组中的序列，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
具体序列详见表1和序列表信息：
表1.推导的抗体氨基酸序列
Figure BDA0001299958940000051
Figure BDA0001299958940000061
另一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，包含互补决定区(CDR)，其氨基酸序列选自由SEQ ID NOs﹕15-41所组成的组中的序列，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
另一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，包含：
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；以及
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，
其中重链可变区CDR3序列包含选自由SEQ ID NO﹕15、16、17、和18所组成的组中的氨基酸序列及其保守性修饰，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
优选地，其中所述的抗体或其抗原结合片段中抗体轻链可变区CDR3序列包含选自由SEQ ID NOs﹕19、20、21、和22所组成的组中的氨基酸序列及其保守性修饰。
优选地，其中所述的抗体或其抗原结合片中重链可变区CDR2序列包含选自由SEQID NO﹕23、24、25、26、27、和28所组成的组中的氨基酸序列及其保守性修饰。
优选地，其中所述的抗体或其抗原结合片中轻链可变区CDR2序列包含选自由SEQID NO﹕29、30、31、和32所组成的组中的氨基酸序列及其保守性修饰。
优选地，其中所述的抗体或其抗原结合片中重链可变区CDR1序列包含选自由SEQID NO﹕33、34、35、和36所组成的组中的氨基酸序列及其保守性修饰。
优选地，其中所述的抗体或其抗原结合片中轻链可变区CDR1序列包含选自由SEQID NO﹕37、38、39、40、和41所组成的组中的氨基酸序列及其保守性修饰。
在一些具体实施方案中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合于CTLA-4，并包含：
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；以及
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中
a)重链可变区CDR1，序列包含选自由SEQ ID NO﹕33、34、35、和36所组成的组中所示的氨基酸序列，
重链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕23、24、25、26、27、和28所组成的组中所示的氨基酸序列，
重链可变区CDR3，序列包含选自由SEQ ID NO﹕15、16、17、和18所组成的组中所示的氨基酸序列，
b)和轻链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕37、38、39、40、和41所组成的组中所示的氨基酸序列，
轻链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕29、30、31、和32所组成的组中所示的氨基酸序列，
轻链可变区CDR3，序列包含选自由SEQ ID NO﹕19、20、21、和22所组成的组中所示的氨基酸序列，
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
在一些具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含：
a)重链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕15所示的氨基酸序列，
b)重链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕23所示的氨基酸序列，
c)重链可变区CDR3，序列包含选自SEQ ID NO﹕33所示的氨基酸序列，
d)轻链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕19所示的氨基酸序列，
e)轻链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕29所示的氨基酸序列，
f)轻链可变区CDR3，序列包含选自SEQ ID NO﹕37所示的氨基酸序列，
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
在一些具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含：
a)重链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕16所示的氨基酸序列，
b)重链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕24所示的氨基酸序列，
c)重链可变区CDR3，序列包含选自SEQ ID NO﹕34所示的氨基酸序列，
d)轻链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕20所示的氨基酸序列，
e)轻链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕30所示的氨基酸序列，
f)轻链可变区CDR3，序列包含选自SEQ ID NO﹕38所示的氨基酸序列，
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
在一些具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含：
a)重链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕17所示的氨基酸序列，
b)重链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕25所示的氨基酸序列，
c)重链可变区CDR3，序列包含选自SEQ ID NO﹕35所示的氨基酸序列，
d)轻链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕19所示的氨基酸序列，
e)轻链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕31所示的氨基酸序列，
f)轻链可变区CDR3，序列包含选自SEQ ID NO﹕39所示的氨基酸序列，
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
在一些具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含：
a)重链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕18所示的氨基酸序列，
b)重链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕26所示的氨基酸序列，
c)重链可变区CDR3，序列包含选自SEQ ID NO﹕36所示的氨基酸序列，
d)轻链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕22所示的氨基酸序列，
e)轻链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕32所示的氨基酸序列，
f)轻链可变区CDR3，序列包含选自SEQ ID NO﹕40所示的氨基酸序列，
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
在一些具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含：
a)重链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕16所示的氨基酸序列，
b)重链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕27所示的氨基酸序列，
c)重链可变区CDR3，序列包含选自SEQ ID NO﹕34所示的氨基酸序列，
d)轻链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕20所示的氨基酸序列，
e)轻链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕30所示的氨基酸序列，
f)轻链可变区CDR3，序列包含选自SEQ ID NO﹕38所示的氨基酸序列，
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
在一些具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含：
a)重链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕17所示的氨基酸序列，
b)重链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕25所示的氨基酸序列，
c)重链可变区CDR3，序列包含选自SEQ ID NO﹕35所示的氨基酸序列，
d)轻链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕21所示的氨基酸序列，
e)轻链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕31所示的氨基酸序列，
f)轻链可变区CDR3，序列包含选自SEQ ID NO﹕39所示的氨基酸序列，
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
在一些具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含：
a)重链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕18所示的氨基酸序列，
b)重链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕28所示的氨基酸序列，
c)重链可变区CDR3，序列包含选自SEQ ID NO﹕36所示的氨基酸序列，
d)轻链可变区CDR1，序列包含选自SEQ ID NO﹕22所示的氨基酸序列，
e)轻链可变区CDR2，序列包含选自SEQ ID NO﹕32所示的氨基酸序列，
f)轻链可变区CDR3，序列包含选自SEQ ID NO﹕41所示的氨基酸序列，
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CTLA-4。
具体CDR序列详见表2和序列表信息：
表2.抗体的CDR序列
Figure BDA0001299958940000111
Figure BDA0001299958940000121
本发明的抗体可以是嵌合抗体。
本发明的抗体可以是人源化抗体。
本发明的抗体可以是全人抗体。
本发明的抗体可以是大鼠抗体。
本发明的所述抗体或抗原结合片段具有下列性质中的至少一种：
a)结合于人CTLA-4，KD为2.08E-09M以下，和/或结合于小鼠CTLA-4，KD为1.39E-09M以下；
b)增加来自受刺激的PBMCs的白细胞介素-2分泌。
再一方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码如本发明中所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明提供了一种克隆或表达载体，其包含本发明所述的编码抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
本发明提供了一种宿主细胞，其包含如一个以上上述克隆或表达载体。
在另一个方面，本发明提供了一种用于生产本发明中任一种抗体的方法，包括培养本发明中所述的宿主细胞，并且分离抗体。
所述抗体是通过将人类CTLA-4的细胞外结构域和小鼠CTLA-4的细胞外结构域免疫接种SD大鼠而制备的。
本发明提供了一种诸如大鼠的转基因动物，包含人免疫球蛋白重链和轻链转基因，其中所述大鼠表达本发明中所述的任一抗体。
本发明提供了一种从上述大鼠中获得的杂交瘤，其特征在于，所述杂交瘤产生所述抗体。
再一方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包含本发明中所述的任一抗体或其抗原结合片段，以及一种以上药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明还提供了一种免疫偶联物，包含连接至治疗剂的本发明中所述的任一抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含上述免疫偶联物和一种以上药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明还提供了一种用于制备抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
(a)提供：
(i)一个重链可变区的抗体序列，其包含选自由SEQ ID NO﹕33-36所组成的组中的CDR1序列，选自由SEQ ID NO﹕23-28所组成的组中的CDR2序列以及选自由SEQ ID NO﹕15-18所组成的组中的CDR3序列；和/或
(ii)一个轻链可变区的抗体序列，其包含选自由SEQ ID NOs﹕37-41所组成的组中的CDR1序列，选自由SEQ ID﹕29-32所组成的组中的CDR2序列以及选自由SEQ ID NOs﹕19-22所组成的组中的CDR3序列；并且
(b)将改变的抗体序列表达为蛋白质。
本发明还提供了一种调节受试者的免疫应答的方法，包括给受试者施用本发明中所述的任一抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了如本发明中所述的任一种抗体或其抗原结合片段在制备治疗或预防免疫病症或癌症的药物中的应用。
本发明还提供了一种抑制受试者中肿瘤细胞的生长的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明中所述的任一抗体或其抗原结合片段，以抑制肿瘤细胞生长。
在本发明中，上述肿瘤细胞选自由黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌和直肠癌所组成的组中的癌症。
在本发明中，上述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、或大鼠抗体。
发明的有益效果
本发明人利用专有杂交瘤技术产生针对CTLA-4的人源化抗体，其中抗体抑制CTLA-4与其配体CD80和CD86的结合。本发明公开的抗体具有高结合亲和力，特异性结合人和猴CTLA-4蛋白；并有效调节免疫应答和增加白细胞介素2的产生。
抗体之一不仅结合人和猴CTLA-4，而且与鼠CTLA-4结合，这可以极大地促进临床前验证其在小鼠肿瘤模型中的功效。
附图说明
图1示出在ELISA中嵌合抗体与人CTLA-4结合的图。
图2示出在ELISA中嵌合抗体与食蟹猴CTLA-4结合的图。
图3示出在ELISA中嵌合抗体与小鼠CTLA-4结合的图。
图4示出通过FACS嵌合抗体与在细胞上人CTLA-4结合的图。
图5示出通过SPR嵌合抗体与人CTLA-4结合的结果。
图6示出嵌合抗体阻断CTLA-4与配体结合的结果。
图7示出嵌合抗体抑制表达CD80或CD86的细胞与CTLA-4结合的的图。
图8示出嵌合抗体增强SEB刺激的PBMCs释放细胞因子的结果。
图9示出在ELISA中人源化抗体与人、食蟹猴和小鼠CT LA-4结合的图。
图10a示出人源化抗体与细胞上CTLA-4结合的图(FACS)。
图10b示出通过FACS检测的人源化抗体的亲和力图。
图11示出通过ELISA检测人源化抗体阻断CTLA-4与配体结合。
图12示出通过FACS检测人源化抗体阻断CTLA-4与其配体的结合。
图13示出人源化抗体增强SEB测试中细胞因子释放。
图14示出不同条件下W3162-1.146.19-Z12或W3162-1.154.8-Z35的SEC曲线。
图15示出抗体W3162-146.19-z12的体内抗肿瘤药效。
图16示出W3162抗体特异性结合于CTLA-4。
图17示出抗CTLA4抗体与人CTLA-4/CTLA-4突变体的结合活性。(A)Ipilimumab，(B)W3162-1.146.19-z12和(C)W3162-1.154.8-z35抗体用2μg/mL山羊抗人IgG抗体捕捉后，与稀释的hCTLA4-His(WT)或其突变蛋白(N113Q和N145Q)一起孵育，然后加入HRP标记抗6XHis标签抗体进行检测。
图18示出定位到人CTLA-4上的结合残基或表位：(A)CD80(PDB：1I8L)，(B)CD86(PDB：1I85)，(C)tremelimumab(PDB：5GGV)，(D)Ipilimumab，(E)W3162-1.146.19-z12和(F)W3162-1.154.8-z35。将IAH1用于CTLA-4结构D-F以显示糖基化的结构。
具体实施方式
下面通过具体实施方式及实验数据对本发明作进一步的说明。尽管为了清楚的目的，在下文中使用了专用术语，但这些术语并不意味着定义或限制本发明的范围。
如本文中所使用，术语“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4”、“蛋白CTLA-4”、“CTLA-4”、“CTLA4”、“CD152”可互换使用，并且包括人CTLA-4的变体、亚型、物种同源物或其他物种的CTLA-4和具有CTLA-4的至少一个共同表位的类似物。
如本文中所使用，术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”是指包含至少两条重链(H)和两条轻链(L)并通过二硫键相互连接的，或其抗原结合部分的蛋白质。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域，CH1，CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区的。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成：称为互补决定区(CDR)的高变区，以及穿插分布的称为构架区(FR)的更保守区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端以下面的顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。
术语“抗体”，在本申请中所用的是指免疫球蛋白或其片段或它们的衍生物，并且包括其包含的抗原结合位点的任何多肽，而不管其是否是在体外或体内产生。该术语包括但不限于，多克隆、单克隆、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、嫁接的抗体。术语“抗体”还包括抗体片段例如Fab、F(ab')2、FV、scFv、Fd、dAb和其它保留抗原结合功能的抗体片段，即，能够与CTLA-4的特异性结合。通常情况下，这样的片段将包括抗原结合片段。
术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”和“结合片段”是指一种抗体分子，其包含负责抗体和抗原之间特异结合的氨基酸。例如，在抗原较大的情况下，抗原结合片段可能只结合抗原的一部分。抗原分子中负责与抗原结合片段特异性相互作用的部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。
抗原结合片段通常包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，然而，它不一定必须包括两者。例如，一个所谓的Fd抗体片段仅由VH结构域组成，但仍保留了完整抗体的一些抗原结合功能。
上述术语“表位”定义为抗原决定簇，其特异性结合/识别结合片段。结合片段可以特异性与针对靶结构独特的构象或连续表位进行结合/相互作用，例如人类CTLA-4和鼠源CTLA-4。构象或不连续表位的特征在于多肽抗原在一级序列中是分离的两个或多个离散的氨基酸残基，但多肽折叠成天然蛋白/抗原时是一起聚集在在分子的表面上的。构成表位的两个或多个离散的氨基酸残基存在于一个或多个多肽链的独立部分。当多肽链折叠成三维结构，这些残基聚集在分子表面以构成表位。与此相反，由两个或多个离散的氨基酸残基组成的连续或线性表位，其存在于多肽链的单个线性区段。
术语“结合CTLA-4的表位”是指抗体特异性结合CTLA-4的特定表位，其可通过直链氨基酸序列或部分CTLA-4的三维结构来定义结合。结合是指，对于CTLA-4的部分的抗体亲和力比其对其他相关多肽的亲和力显着更大。术语“基本上更大的亲和力”是指与其他相关多肽的亲和力相比，在对CTLA-4的部分的亲和性呈可测量的增加。优选地，对CTLA-4的特定部分的亲和力相比其他蛋白质至少是1.5倍、2倍、5倍10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍或更大。优选地，结合亲和力是通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，或通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或表面等离子体共振(SPR)测定的。更优选地，结合特异性由荧光激活细胞分选(FACS)分析得到。
本文中所描述的术语“交叉反应性”指的对人类、猴、和/或鼠源(小鼠或大鼠)相同靶分子的抗原片段的结合。因此，“交叉反应性”应被理解为与在不同物种中表达的相同分子X的种属间反应。识别人CTLA-4、猴、和/或鼠CTLA-4(小鼠或大鼠)的单克隆抗体的交叉反应特异性可通过FACS分析确定。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非特别指出，术语“患者”或“受试者”可以互换使用。
术语“治疗”和“治疗方法”是指治疗性治疗和预防性/预防措施。那些需要治疗者包括已具有特定医学病症，以及那些可能最终获得该病症的个体。
术语“保守性修饰”，即，不显著影响或改变由该核苷酸序列编码或包含该氨基酸序列的抗体结合特性的核苷酸和氨基酸序列修饰物。这类保守性序列修饰物包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如定点突变和PCR介导的突变将修饰引入序列。保守性氨基酸取代包括这种取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域进行定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)，β分支的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例：
实施例1实验材料准备
1.可溶性CTLA-4的表达和纯化
将带有六聚组氨酸(6×His)或Fc-标签的人和小鼠CTLA-4细胞外结构域(ECD)基因克隆到表达载体中，然后使用Expi293表达系统试剂盒转染Expi293细胞。在含有8％CO2的加湿环境的37℃培养箱中，细胞在Expi293表达培养基中，在振荡器平台以135rpm旋转培养。收集的上清液用于蛋白质纯化。使用Ni-NTA柱纯化六聚组氨酸标记的蛋白质，并使用蛋白A柱纯化Fc标记的蛋白质。
2.细胞系的建立
将全长人CTLA-4的基因克隆到用于稳定细胞系生成的表达载体中。使用Plasfect试剂，将30μg DNA转染到密度为1×106/mL、体积为30mL的293F细胞。将转染的细胞置于37℃、8％CO2和振荡速度为100rpm的培养箱中。转染24-48小时后，使用终浓度为4μg/mL至6μg/mL的杀稻瘟菌素来选择稳定的克隆。使用抗CTLA-4抗体通过FACS测试选择的克隆。
为了获得表达食蟹猴CTLA-4的细胞，将全长食蟹猴CTLA-4的基因克隆到用于细胞池(Cell pool)产生的表达载体中。使用Plasfect试剂(Life Technology)，将30μg DNA转染至密度为1×106/mL、体积为30mL的293F细胞。将转染的细胞置于37℃、8％CO2和振荡速度为100rpm的培养箱中。转染24小时后，使用终浓度为4μg/mL的杀稻瘟素来选择细胞池。使用抗CTLA-4抗体通过FACS测试所选择的细胞池。
实施例2抗体杂交瘤的产生
1.免疫
人CTLA-4和鼠CTLA-4用于SD大鼠的免疫。具体来说，用含30μg/只的人和小鼠CTLA-4ECD蛋白的佐剂免疫3只SD大鼠。佐剂包括Titer-Max，Adju-Phos和CpG-ODN。大鼠每周从脚垫和皮下注射一次。每隔一个月通过ELISA测定血清中的抗体滴度。当抗体滴度足够高时，在没有佐剂的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中，使用人和小鼠CTLA-4ECD蛋白在最高滴度的大鼠中进行最终加强。几天后，从大鼠中取出脾脏和淋巴结，分离淋巴细胞进行融合。
2.细胞融合
细胞融合如下进行：骨髓瘤细胞SP2/0细胞在融合前一周复苏，每天以1:2传代直到融合前一天以保持对数生长。来自免疫大鼠淋巴结的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞分别用胰蛋白酶处理，加入FBS中止反应。B淋巴细胞以1:1的比例与骨髓瘤细胞融合。然后将细胞混合物洗涤并以2×106个细胞/mL再次悬浮于含有0.3M蔗糖、0.1mM乙酸镁和0.1mM乙酸钙的电熔解溶液中。按照制造商的标准方案，使用Btx Electro Cell Manipulator(Ecm 2001)进行电融合。然后将来自融合室的细胞悬浮液立即转移到含有新鲜培养基的无菌瓶中，并在37℃培养箱中孵育2小时。然后将细胞悬浮液混合并转移到96孔板中的60个(1×104个细胞/孔)孔中。96孔板在37℃和5％CO2下进行定期监测。当克隆足够大(7-10天后)时，取出180μL/孔的上清液，每孔加入200μL新鲜培养基。72小时后，将100μL上清液从组织培养板转移至96孔分析板进行筛选。
3.杂交瘤的筛选
筛选结合人、鼠和猴CTLA-4蛋白以及工程化的人CTLA-4表达细胞的大量杂交瘤克隆。一旦通过第一次和第二次筛选验证了特异性结合CTLA-4和阻断活性，则将阳性杂交瘤系经过有限稀释亚克隆到96孔板中。将板在37℃、5％CO2条件下培养，直到阳性克隆与配体CD80和CD86竞争结合CTLA-4，做进一步筛选。收集所选阳性克隆的培养上清液用于抗体纯化和进一步表征分析。选择先导候选者进行VH和VL测序。
4.杂交瘤VH和VL序列的确定
通过RT-PCR或5'RACE分离选择的杂交瘤克隆的抗体的VH和VL基因。具体地，使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen)从杂交瘤细胞中分离总RNA。使用oligo dT逆转录第一链cDNA。使用3'-恒定区简并引物和5'-简并引物组从cDNA扩增抗体的VH和VL基因。基于Ig可变序列的上游信号序列编码区设计5'简并引物。然后将PCR产物连接到pMD18-T载体中，将10μL连接产物转化到Top10感受态细胞中。将转化的细胞接种在具有羧苄青霉素的2xYT平板上，并在37℃下孵育过夜。随机挑选15个阳性菌落，由Biosune进行DNA测序。或者，使用5'RACE鉴定所选杂交瘤克隆的VH和VL序列。首先，使用5'-RACE试剂盒(Takara-28001488)先将RNA逆转录成cDNA，然后使用3'-简并引物和3'-接头引物(ExTaq：Takara-RR001B)进行PCR。将PCR片段插入pMD18-T载体(Takara-D101C)中，并送去测序(Biosune，上海)。
实施例3:嵌合抗体的产生和表征
1.嵌合抗体的产生
推导的VH和VL的氨基酸序列列于表3中。下划线的序列是由Kabat系统定义的CDR。将这些大鼠抗体的可变区与人抗体的恒定区融合，并从Expi293细胞中表达嵌合抗体，并使用蛋白A色谱纯化。
表3大鼠抗CTLA-4抗体的轻链、重链的氨基酸序列
Figure BDA0001299958940000211
Figure BDA0001299958940000221
2.嵌合抗体的表征
2.1结合人、猴和鼠CTLA-4的抗体(ELISA、FACS和SPR)
用哺乳动物细胞表达具有大鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体，并使用蛋白A亲和层析进行纯化。
在ELISA中测试抗体结合CTLA-4。如图1、2和3所示，与人和猴CTLA-4结合的四种抗体具有与Ipilimumab(WBP316-BMK1)相当的EC50，但仅有一种抗体W3162-1.146.19也与鼠CTLA-4结合，EC50为0.01nM。为了证实抗体能够在细胞表面上结合CTLA-4，在FACS测定中使用CTLA-4表达细胞系。这些抗体也结合细胞表面上的CTLA-4(图4)，EC50范围为1.14nM至9.42nM。W3162-1.146.19与细胞表面的CTLA-4结合，EC50为3.25nM，以及W3162-1.154.8与细胞表面上的CTLA-4结合，EC50为1.26nM。
使用SPR测量四种抗体的结合动力学。在固定的山羊抗人Fc上捕获抗体，然后依次注射不同浓度的人CTLA-4ECD。从测试传感图中减去参考通道和缓冲通道的传感图。数据用于1:1结合分析。如图5和表4所示，所有四种抗体与Ipilimumab(WBP316-BMK1)相比，对人CTLA-4ECD结构域具有更高亲和力，其KD范围为2.08E-09nM至6.80E-11nM。
表4.抗体结合人CTLA-4ECD的动力学
Figure BDA0001299958940000231
2.2与嵌合抗体的配体竞争
据发现，CTLA-4与CD80和CD86的结合，相比CD28具有20至50倍的亲和力(Krummel，1996)。因此，检测抗CTLA-4抗体是否与CD80和CD86在CTLA-4上的结合存在竞争。ELISA和FACS均用作竞争分析。在基于ELISA的竞争测定中，将人CTLA-4包被在板上，并将与生物素化配体混合的抗体加入板中。通过HRP偶联的链霉抗生物素蛋白检测结合的配体。如图6a和6b所示，所有四种抗体与CTLA-4结合中的配体CD80(B7-1，L1)和CD86(B7-2，L2)竞争，除了W3162-1.101.2之外，其中三种抗体具有与Ipilimumab(WBP316-BMK1)相当的EC50。在FACS测定中，将抗体和生物素化的人CTLA-4的混合物加入到CD80或CD86表达细胞中，并通过PE偶联的链霉亲和素检测结合的人CTLA-4。如图7a(上图)和7b(下图)所示，所有这四种抗体均可有效阻断CTLA-4与配体表达细胞的结合。除了W3162-1.154.8之外的三种抗体可以完全阻断CD80细胞上的CTLA-4结合，而即使采用最高浓度200nM时Ipilimumab WBP316-BMK也只能部分阻断该结合(图7a)。在CD86细胞上阻断CTLA-4结合的FACS测定(图7b)中，所有的四种抗体都可以完全阻断CD86细胞上的CTLA-4结合，而即使采用最高浓度200nM时Ipilimumab也只能部分阻断该结合。W3162-1.101.2的动力学表现不同：在低浓度下，比Ipilimumab低效，而高浓度下，Ipilimumab更有效。在所有浓度测试下，其他三种抗体比Ipilimumab在阻断CTLA-4上更有效。
2.3嵌合抗体在SEB测试中的功能
在修饰的T细胞刺激测定(SEB测定)中测试了具有1.34nM、3.35nM、8.71nM、21.4nM、53.6nM、134nM的不同浓度的抗CTLA-4抗体的功能。葡萄球菌肠毒素B(SEB)被用作人类T细胞激活的刺激物，其中CTLA-4被报道为重要的参与者。通过IL-2的分泌来测量T细胞活化。如图8所示，所有四种抗体以剂量依赖性方式促进IL-2分泌，与Ipilimumab相当或优于Ipilimumab。
实施例4:人源化抗体表征
1.人源化
“最佳适应算法(Best Fit)”方法用于人源化抗体轻链和重链。
选择三种抗CTLA-4抗体(除了W3162-1.101.2，因为其结合活性在ELISA和FACS中相对低)进行人源化，使用CDR移植技术。使用Kabat系统定义抗体的CDR(表5中下划线表示)和可变区的FR。基于序列同源性和结构相似性，大鼠区域FR1-3的基因被人源化区域FR1-3替代，而大鼠基因的区域FR4被具有最相似结构的源于JH和JK基因的人源化FR4区域替代。改变可变区域的翻译后修饰(PTM)的热点，以降低PTM风险。验证模板序列和密码子优化后，合成重链可变区和轻链可变区，克隆到表达载体中，然后用于人源化抗体的表达。使用蛋白A色谱纯化人源化抗体，并使用SPR法测定人、猴和鼠CTLA-4的动力学结合。
表5.人源化抗CTLA-4抗体的轻链、重链的氨基酸序列
Figure BDA0001299958940000251
表6.人源化抗CTLA-4抗体的轻链、重链的基因序列
Figure BDA0001299958940000252
Figure BDA0001299958940000261
2.人源化抗体的表征
2.1结合人、猴和鼠CTLA-4的抗体
2.1.1CTLA-4-结合ELISA
人源化抗体由哺乳动物细胞表达，并使用蛋白A亲和层析纯化。Ipilimumab来自商业来源。药明生物制备同型对照抗体、具有不同标签(hFc或6xHis)的人CTLA-4ECD和小鼠CTLA-4.ECD-hFc。小鼠CTLA-4.ECD-6xHis和食蟹猴CTLA-4ECD-6xHis购自SinoBiological。HRP偶联的山羊抗人IgG Fc购自Bethyl(目录号：A80-304P)。
ELISA用于测试抗人CTLA-4抗体与人、鼠和食蟹猴CTLA-4蛋白的结合。用人CTLA-4.ECD-6xHis(1.0μg/mL)、食蟹猴CTLA-4.ECD-6xHis(0.5μg/mL)或小鼠CTLA-4.ECD-6xHis(0.5μg/mL)包被96孔板，在4℃下反应16-20小时。用含2％BSA的DBPS封闭1小时后，将测试抗体以及阳性和阴性对照抗体加入板中，并在室温下温育1小时。通过HRP偶联的山羊抗人IgG抗体(1:5000稀释)1小时孵育来检测与平板结合的抗体。用100μL TMB底物显影8分钟来显色，然后用100μL 2N HCl中止。使用微板分光光度计测量450nM的吸光度。
如图9所示，分别与人CTLA-4结合的两种抗体W3162-1.146.19-z12-IgGk和W3162-1.154.8-z35-IgGk的EC50为0.03nM和0.04nM，略高于EC50为的0.01nM Ipilimumab(WBP316-BMK1)(图9A)。两个抗体也结合到猴CTLA-4，EC50值为0.05nM(图9B)，但是仅有W3162-1.146.19-z12-IgG结合鼠CTLA-4，其EC50为0.19nM。W3162-1.154.8-z35-IgGk和Ipilimumab都不与鼠CTLA-4结合(图9C)。
2.1.2CTLA-4结合FACS
人CTLA4表达293F细胞株由药明生物开发。PE偶联的山羊抗人IgG Fc片段购自Jackson(目录号109-115-098)。加入1×105个细胞每孔至96孔板，4℃离心5分钟，取出上清液。将试验抗体、阳性和阴性对照的系列稀释液加入重悬细胞中，并在4℃下孵育1小时。细胞用含有1％BSA的200μL DPBS洗涤两次。将含有1％BSA的DPBS中稀释的PE偶联的山羊抗人IgG(1:100)加入细胞中，在4℃下孵育1小时。用200μL含有1％BSA的DPBS进行额外洗涤步骤两次，然后在4℃下以1500rpm离心4分钟。最后，将细胞重新悬浮于含有1％BSA的100μLDPBS中，并通过流式细胞术测量荧光值，并通过FlowJo进行分析。
这些抗体还能够在FACS测定中与细胞表面上的人CTLA-4结合。如图11(图10a和图10b)所示，W3162-1.146.19-z12-IgG、W3162-1.154.8-z35-IgGk和Ipilimumab的EC50略有不同，分别为1.58nM、0.66nM和0.83nM。
2.2抗体的结合动力学
2.2.1使用SPR测量这些抗体的结合动力学
该实验是基于SPR技术测量CTLA-4ECD的抗体的速率常数(ka)和解离常数(kd)。从而确定亲和常数(KD)。
Biacore T200S系列传感器芯片CM5，胺偶联试剂盒和10×HBS-EP购自GEHealthcare。山羊抗人IgG Fc抗体购自Jackson ImmunoResearch Lab(目录号109-005-098)。在固定步骤中，在注射前立即混合400mM EDC和100mM NHS来制备活化缓冲液，CM5传感器芯片通过激活缓冲液激活420秒，然后以5μL/分钟的流速将在10mM NaAc(pH4.5)中的30μg/mL山羊抗人IgG Fcγ抗体注射到Fc1-Fc4通道中200秒，该芯片由1M乙醇胺-HCl(GE)去活化，然后将抗体捕获在芯片上。将运行缓冲液(HBS-EP+)中的4μg/mL抗体以10μL/分钟的流速分别注射到Fc3通道30秒。八种不同浓度(20nM、10nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM、0.3125nM和0.15625nM)的分析物CTLA-4(WBP316.hCTLA-4.ECD-6xHis)和空白运行缓冲液以30μL/分钟的流速对Fc1-Fc4通道有序地进行120秒的结合阶段，随后是2400秒的解离阶段。在每个解离阶段之后，以10μL/分钟的速度注入再生缓冲液(10mM甘氨酸pH1.5)30秒。
使用SPR测量这些抗体的结合动力学。将抗体捕获在固定化的抗人Fc上，并依次注射不同浓度的CTLA-4-ECD。从测试传感图中减去参考通道和缓冲通道的传感图。该数据用于人、猴和小鼠CTLA-4.ECD-6xHis的1:1结合分析。如表7所示，人源化抗体W3162-1.146.19-Z12、W145和W3162-1.154.8-Z35分别以0.477nM、1.84nM和0.0968nM的亲和力结合人CTLA-4-ECD结构域。与大鼠抗体相比，人源化抗体具有相似的亲和力。W3162-1.146.19-Z12和W3162-1.154.8-Z35具有比Ipilimumab显著更高的亲和力(KD＝3.68nM)。抗体W3162-1.146.19-Z12还可以结合鼠CTLA-4，并且其人源化之前和之后的亲和力显示在表9中。人源化后，其亲和力1.39nM略低于亲本抗体的亲和力0.906nM。
W3162-1.146.19-Z12、W3162-1.145.10-z7和W3162-1.154.8-Z35与食蟹猴CTLA-4-ECD的亲和力分别为1.92nM、0.598nM、0.131n M(表8)。
表7.抗体结合于人CTLA-4ECD的动力学
Figure BDA0001299958940000281
Figure BDA0001299958940000291
表8.抗体结合于猴CTLA-4ECD的动力学
Figure BDA0001299958940000292
表9.抗体结合于鼠CTLA-4ECD的动力学
Figure BDA0001299958940000293
2.2.2FACS检测亲和力
FITC偶联的山羊抗人IgG Fc购自Jackson免疫研究实验室(目录号109-095-098)，BD CantoII用于该测定。将表达人CTLA-4的HEK293细胞以5×104个细胞/孔的密度转移到96孔U底板(BD)中。测试抗体在1％BSA的PBS中连续稀释1:2倍，并与细胞在4℃孵育1小时。在1500rpm离心4分钟后，弃去上清液。加入第二抗体，FITC偶联的山羊抗人IgG Fc(每个IgG有3.2FITC，Jackson免疫研究实验室)，将细胞重新悬浮至终浓度为14μg/mL，并在4℃避光孵育30分钟。然后将细胞洗涤一次，并重悬于1％BSA的PBS中，并通过流式细胞术(BD)进行分析。基于定量珠(QuantumTM MESF Kits，Bangs Laboratories)将荧光强度转化为结合分子/细胞。使用Graphpad Prism5计算KD。
通过流式细胞术测定人源化抗体与细胞表面CTLA-4结合的亲和力，采用Benedict方法[Benedict 1997 JIM]进行修饰。测量结合CTLA-4表达CHO细胞的抗体荧光后，分析结合抗体和游离抗体并拟合到如图5所示的方程中，如图5所示。基于数据和公式，计算的亲和常数KD显示在表10中。人源化抗体W3162-1.146.19-Z12和W3162-1.154.8-Z35具有高亲和力，亲和力分别为5.05和0.35nM，而Ipilimumab的亲和力为0.97nM。
表10.亲和力测试(FACS)
Figure BDA0001299958940000301
2.3与配体的竞争
为了测试人源化抗体是否保持其阻断CTLA-4与CD80和CD86结合的能力，ELISA和FACS均用于竞争测定。两种CTLA-4配体CD80和CD86购自Sino Biological(目录号10698-H08H和10699-H08H)。生物素化的抗His标签抗体购自Genscript(目录号A00613)。HRP偶联的链霉亲和素购自Invitrogen(目录号SNN1004)。
2.3.1基于ELISA的竞争测定
ELISA用于检测抗体是否可以抑制人CTLA-4与其配体人CD80和CD86的结合。用人CTLA-4.ECD.hFc(0.5μg/mL)在4℃下包被板16-20小时。在用含2％BSA的DBPS封闭1小时后，将测试抗体以及阳性和阴性对照抗体与0.25μg/mL的CD80-6xHis或CD86-6xHis预混合，然后加入板中并在室温孵育1小时。用含有0.05％吐温20的PBS洗涤3次后，将生物素化的抗His标签抗体稀释1:2000并加入。将板在室温下孵育1小时。通过HRP偶联的链霉抗生物素蛋白检测结合的配体(1:20000)。用100μLTMB底物显影8分钟来显色，然后用100μL2N HCl中止。使用微板分光光度计测量450nM的吸光度。
如图11所示，W3162-1.146.19-z12-IgGg和W3162-1.154.8-z35-IgGk在阻断配体与包被的CTLA-4结合上具有与Ipilimumab相似的作用，对于CD80，IC50为0.87nM、0.63nM和0.40nM；对于CD86，IC50为0.71nM、0.50nM和0.42nM。
2.3.2FACS测定
为了测试抗体是否可以阻断CTLA-4与细胞表面CD80和CD86的结合，我们使用FACS来测试这一竞争。表达CD80和CD86的CHO细胞株由药明生物开发。生物素化CTLA-4.ECD.hFc由药明生物制造。PE偶联的链霉亲和素购自eBioscience(目录号12-4317)。
将CD80-或CD86-表达细胞以1×105/孔加入96孔板的每个孔中，并在4℃下以1500rpm离心4分钟，然后除去上清液。将测试抗体、阳性和阴性对照的系列稀释液与生物素化的人CTLA4.ECD.hFc混合。由于细胞表面上配体的密度不同，对于人CD80细胞，使用0.02μg/mL的hCTLA-4.ECD.hFc-生物素，对于人CD86细胞，使用0.08μg/mL的hCTLA-4.ECD.hFc-生物素。然后将抗体和CTLA-4的混合物加入到细胞中，并在4℃下孵育1小时。用200μL的FACS缓冲液(含有1％BSA的DPBS)将细胞洗涤两次。将在FACS缓冲液中以1:333稀释的链霉亲和素PE加入细胞中，4℃孵育1小时。用200μL的FACS缓冲液进行另外的洗涤步骤两次，然后在4℃下以1500rpm离心4分钟。最后，将细胞重悬于100μL的FACS缓冲液中，用流式细胞仪检测荧光值，并用FlowJo进行分析。
结果示于图12中。两种人源化抗体可比Ipilimumab更有效地阻断CTLA-4/配体结合。在使用最高浓度下，Ipilimumab仅阻断32％的CTLA-4与CD80的结合和40％的结合CD86的CTLA-4。相比之下，抗体W3162-1.146.19-Z12阻断了71％的CTLA-4与CD80结合和73％的CTLA-4与CD86结合，而抗体W3162-1.154.8-Z35阻断了89％的CTLA-4与CD80结合和98％的CTLA-4与CD86结合。对于CD80，Ipilimumab、W3162-1.146.19-Z12和W3162-1.154.8-Z35的IC50分别为3.23nM、6.60nM和0.07nM。对于CD86，Ipilimumab、W3162-1.146.19-Z12和W3162-1.154.8-Z35的IC50，的分别为2.52nM、5.15nM和0.28nM。
2.4SEB刺激的PBMC的细胞因子释放
测试抗CTLA4抗体是否可以增强SEB(来自第二军医大学)刺激后人PBMC的细胞因子释放。获得健康供体的外周血，并通过Ficoll(GE Healthcare，17-1440-02)密度梯度离心分离细胞。除去浮力层后，用介质多次洗涤血小板。向96孔板的每个孔中加入1×105个的人PBMC细胞。将试验抗体、阳性和阴性对照的系列稀释液与SEB(10ng/mL)混合，然后加入到沉淀的细胞中，37℃孵育3天。收集上清液以测量人IL-2浓度。
为了检测人IL-2，将微孔板在4℃用1.0μg/mL人IL-2抗体(R&D System MAB602)预包被16-20小时。在用2％BSA(BovoGen)的DBPS封闭1小时后，将含有IL-2的上清液加入到平板中，并在室温下孵育2小时。用PBST(含有0.05％吐温20)洗涤3次后，加入浓度为0.5μg/mL的稀释的生物素化的人IL-2抗体(R&D系统，BAF202)。将板在室温下孵育1小时。通过1:20000稀释的HRP偶联的链霉亲和素(Invitrogen，SNN1004)检测结合的生物素化抗体。孵育1小时后，通过100μL的TMB底物显色，然后用100μL的2M HCl中止。使用微板分光光度计测量450nm和540nm处的吸光度。
在基于细胞的测定中，测试人源化抗体(8.60nM、21.4nM、53.6nM、134nM、335nM)是否可以增强超抗原SEB刺激的人PBMC。刺激3天后，使用ELISA测量来自PBMC的IL-2。与同型对照抗体相比，两种人源化抗体(W3162-1.146.19-Z12、W3162-1.154.8-Z35)和Ipilimumab都可以呈剂量依赖性增强从PBMCs的IL-2释放(图13)。
2.5热稳定性
在不同温度下测试先导抗体的稳定性。将100μL各抗体样品吸取到各个管中，样品在4℃或37℃下孵育20小时，或45℃或50℃孵育2小时。然后将样品以12,000rpm离心10分钟。观察这些样品以发现可能的沉淀，并通过SEC-HPLC分析样品的纯度和洗脱时间。
在不同条件下的W3162-1.146.19-Z12的SEC曲线如图14a-d所示。与低温(92.24％)相比，高温条件下，稀释时间和主峰百分比(92.39％至92.48％)均无显著变化。在不同的高温条件下，W3162-1.154.8-Z35的SEC曲线如图14e-h所示。与低温(96.84％)相比，稀释时间和主峰百分比(97.14％至97.17％)均无显著变化。这组数据表明抗体在测试的高温条件下是稳定的。
2.6非特异性结合
FACS和ELISA被用来测试抗体是否与其他靶标结合。在FACS测定中，不同的细胞系(Ramos、Raji、MDA-MB-453、BT474、Jurkat、Hut78、A431、A204、CaLu-6、A375、HepG2、BxPC-3、HT29、FaDu、293F、CHO-K1)在每孔中调整为1×105个细胞。将测试抗体和同型对照抗体在含有1％BSA的PBS中稀释至10μg/mL，并在4℃下与细胞孵育1小时。细胞用含有1％BSA的180μL的PBS洗涤两次。将PE偶联的山羊抗人IgG Fc片段(Jackson，目录号109-115-098)在含有1％BSA的PBS中稀释至终浓度为5μg/mL，然后加入以重新悬浮细胞，并在4℃避光孵育30分钟。用含有1％BSA的180μL的PBS进行额外洗涤步骤两次，然后在4℃下以1500rpm离心4分钟。最后，将细胞重新悬浮于含有1％BSA的100μL的PBS中，并通过流式细胞仪(BD CantoII)测量荧光值，并通过FlowJo进行分析。
在ELISA测定中，待测抗体、同型对照抗体以及包括因子VIII、FGFR-ECD、PD-1、CTLA-4.ECD、VEGF、HER3ECD，OX40.ECD、1BB.ECD、CD22.ECD、CD3e.ECD在内的10种不同的靶抗原。在4℃下将96孔板用各抗原(2μg/mL)包被过夜。用2％BSA的PBS封闭1小时后，用300μL的PBST洗涤3次。将测试抗体以及同型对照抗体在含有2％BSA的PBS中稀释至10μg/mL，然后加入板中并在室温下孵育2小时。用300μL的PBST洗涤3次后，将HRP耦合的山羊抗人IgG抗体(在2％BSA中1:5000稀释)加入板中并在室温下孵育1小时。最后，将板用300μL的PBST洗涤6次。用100μL的TMB底物显影12分钟来显色，然后用100μL 2M HCl中止。使用微板分光光度计测量450nM的吸光度。
除CTLA-4外，还使用其他不相关的蛋白质来测试抗体W3162-1.146.19-Z12和W3162-1.154.8-Z35是否能够结合这些抗原。如图16所示，在抗原组中，两种抗体仅检测到CTLA-4。其他抗原在该ELISA测定中没有产生信号。相比之下，抗OX40抗体确实结合OX40，表明该抗原包被在板上。
在FACS测定中，还在一组不同细胞系上测试了两种抗体的特异性。抗体不产生任何这些细胞系的可检测信号(数据未显示)。
2.7体内药效实验
由于抗体W3162-1.146.19-Z12与人和鼠CTLA-4都交叉反应，在同基因小鼠模型中测试了该抗体的抗肿瘤有效性。使用小鼠癌细胞系CT26建立异种移植小鼠模型，测试抗CTLA-4抗体W3162-1.146.19-Z12。使用购自BioXCell的抗鼠CTLA-4抗体作为阳性对照(BioXCell-BE0131)。在5％CO2、37℃条件下，在添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，将肿瘤细胞作为单层培养物维持。通过胰蛋白酶-EDTA处理分离细胞后，每周将肿瘤细胞定期传代培养两次。收集以指数生长期生长的细胞并计数接种。雌性Balb/C小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司，对年龄6-8周龄、体重约18-22克的小鼠进行研究。将在混有50μL基质胶的0.1mL PBS中的1×105个肿瘤细胞皮下接种于每只小鼠的右腋窝。当平均肿瘤体积达到60-80mm3时，动物随机分组。抗CTLA-4抗体和同型对照用于治疗：每周静脉内注射两次。使用游标卡尺每周两次测量肿瘤大小，通过公式a×b2×π/6计算肿瘤体积，其中a是长度，b是宽度(a>b)。
当平均肿瘤体积达到约70mm3时，每周两次注射W3162-1.146.19-Z12(1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg)和对照抗体(10mg/kg)持续两周。随着时间的推移监测动物的肿瘤生长和体重。如图15所示，W3162-1.146.19-Z12呈剂量依赖性显著抑制肿瘤生长。与对照组相比，在1mg/kg剂量下，W3162-1.146.19-Z12抑制肿瘤生长。在3mg/kg剂量下，W3162-1.146.19-Z12在第19天抑制肿瘤体积至160mm3，而在研究期结束时，10mg/kg W3162-1.146.19-Z12诱导的肿瘤消退。
2.8表位定位(mapping)
丙氨酸扫描用于鉴定抗体的CTLA-4表位。在该实验中，hCTLA4上的丙氨酸残基突变为甘氨酸残基，所有其他残基突变为丙氨酸。对于人CTLA4细胞外结构域(ECD)的每个残基，使用两个连续PCR步骤进行点氨基酸置换。使用编码人CTLA4和C末端His标签的ECD的pcDNA3.3-hCTLA4_ECD.His质粒作为模板，并使用
Figure BDA0001299958940000351
多位点定向诱变试剂盒(安捷伦科技公司，帕洛阿尔托，加州)将一组突变引物用于第一步PCR。在突变体链合成反应后，使用Dpn I核酸内切酶消化亲本模板。在第二步PCR中，在HEK293F细胞(LifeTechnologies，盖瑟斯堡，马里兰州)中扩增并瞬时表达由CMV启动子、CTLA4的突变ECD、His-标签和单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)多腺苷酸化组成的线性DNA表达盒，盖瑟斯堡，马里兰州)。此外，构建了三个质粒载体，以测试聚糖表位：pcDNA3.3-hCTLA4_ECD.His(N113Q)、pcDNA3.3-hCTLA4_ECD.His(N145Q)和pcDNA3.3-hCTLA4_ECD.His(N113Q，N145Q)。这三种突变蛋白在HEK293F细胞(Life Technologies，盖瑟斯堡，马里兰州)中瞬时表达。
为了测试突变如何影响抗体结合，进行了ELISA。通过用2μg/mL山羊抗人IgG Fc(Bethyl Laboratories，蒙哥马利，德克萨斯州)预包被的方法捕获Ipilimumab、W3162-1.146.19-z12和W3162-1.154.8-z35(2μg/mL)。在与含有定量的CTLA4突变蛋白的上清液相互作用后，加入HRP偶联的抗His抗体(1:5000，Rockland Immunochemicals，Pottstown，PA)作为检测抗体。TMB被用作HRP的底物。根据对照突变体的平均值对吸光度进行归一化。在设定结合倍数变化(<0.55)的附加截点后，确定最终确定的表位残基。
进行抗体W3162-1.146.19-z12、W3162-1.154.8-z35和Ipilimumab(W316-BMK1)对人CTLA4的结合活性，发现所有三种抗体都与人CTLA4结合(图17)。
影响抗体结合CTLA-4的测试点突变显示在表11中。根据人类CTLA4晶体结构(PDB代码1AH1)，一些氨基酸残基(如Met38、Val40、Tyr60、Val71、Val73、Arg75、Val84、Cys85、Cys129、Ile149)不太可能直接接触任何抗体。观察到的结合减少最可能是由于丙氨酸取代后CTLA4结构的不稳定性或甚至崩溃引起的。最终确定的表位残基列于表12中并标记在图18上。
如图18D和E所示，Ipilimumab和W3162-1.146.19-z12的表位彼此重叠，除了少数残基如N145和P138。相比之下，W3162-1.154.8-z35与其他两种抗体相比结合在一较小的CTLA-4区域(图18F)。所有三种抗体结合表位均涉及CTLA-4与配体结合的结构域(图18A和B)，并涉及MYPPPY模体。
Ipilimumab和W3162-1.146.19-z12的重叠表位无法解释抗体W3162-1.146.19-z12的独特的跨物种结合能力。由于CTLA-4上的N145突变仅影响结合CTLA-4的W3162-1.146.19-z12，不影响其他两种抗体，我们将N-糖基化位点视为潜在的表位并做了进一步的研究。在CTLA4的两个糖基化位点上的突变对抗体结合活性的影响如图17所示。Ipilimumab或W3162-1.154.8-z35与突变CTLA-4的结合没有显著变化(图17A和C)。相反，W3162-1.146.19-z12与突变的CTLA-4N145Q的结合显著降低，而该抗体与具有N113Q的CTLA-4的结合没有变化。这组数据表明CTLA-4N145上的聚糖(图18E)可以是W3162-1.146.19-z12的表位。而N145残基在食蟹猴和小鼠的CTLA-4中是保守的。
以上通过实例对本发明进行了说明。然而，本领域技术人员应当理解，本发明不限于这些实例。本发明可以以其他具体形式实施，而不脱离其形式或其基本特征。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是前面的描述来指示，并且包含所附权利要求的等同物和其范围内的所有变化。
表11.CTLA4点突变对抗体结合的影响
Figure BDA0001299958940000381
a结合作用改变倍数为多个丙氨酸沉默替代的相对值
表12.三个抗体抗原表位的发现
Figure BDA0001299958940000391
序列表
<110> 上海药明生物技术有限公司
<120> 一种新的CTLA-4单克隆抗体
<130> PCTF1701
<160> 47
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Glu Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Ser
20 25 30
Ala Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Asp Ala Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Met Glu Arg Ile Pro Thr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 2
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Leu Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Asn Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Leu Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Gln Met Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu His Leu Asn Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Ala Gly Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Val Asp Pro Glu Asn Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Lys Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Thr Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Leu Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Leu Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
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115
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly Met Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Ile Asn Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Gln Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asp Pro
65 70 75 80
Val Gln Ala Asp Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Glu
85 90 95
Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Leu Ile Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Pro Met Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr His Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Asp Tyr His Cys Leu Gln Tyr Lys Gln Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Thr Ser Ser Ala Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Ser Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Glu Ile Met Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ala Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Leu Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Val His
35 40 45
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Tyr Leu Thr Ile Asn Thr Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Leu Ile Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Met Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr His Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Lys Gln Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 14
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 14
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His
35 40 45
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 15
Met Glu Arg Ile Pro Thr
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 16
His Leu Trp Phe Ala Tyr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 17
Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 18
Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 19
Gln Gln Ser Arg Glu Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 20
Leu Gln Tyr Lys Gln Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 21
Val Gln Gly Thr His Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 22
His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 23
Phe Ile Ser Ser Gly Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 24
Ser Ile Ser Pro Asn Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 25
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 26
Arg Val Asp Pro Glu Asn Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Lys
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 27
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 28
Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Lys
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 29
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 30
Tyr Ala Thr His Leu Ala Asp
1 5
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 31
Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 32
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 33
Ser Ser Ala Met His
1 5
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 34
Asn Tyr Asp Met Ala
1 5
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 35
Ser Gly Tyr Asp Trp Thr
1 5
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 36
Asn Tyr Phe Met Asn
1 5
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 37
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Ser Ile Asn Leu Ile His
1 5 10 15
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 38
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Asn Leu Ile
1 5 10
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 39
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 40
Ser Ala Asn Ser Ser Leu Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 41
Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 42
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 42
gaggtgcagc tggtggagag cggcggagga ctggtgcaac ctggcggaag cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcgacct gaccttcagc aactacgaca tggcctgggt gagacaggcc 120
cctggcaagg gactggagtg ggtggccagc atcagcccca gcggcggcaa cacctactac 180
agggacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggcacctg 300
tggttcgcct actggggcca gggcacactg gtgaccgtga gcagc 345
<210> 43
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
caggtgcagc tgcaggagag cggacccgga ctggtgaagc cctccgagac cctgagcctg 60
acctgcagcg tgacctacca caccatcacc agcggctacg actggacctg gatcagaaag 120
ccccccggca aaggcatgga gtggatcggc tacatcagct acagcggcaa caccaactac 180
aaccccagcc tgaagagcag ggtgaccatc agcagggaca ccagcaagaa ccagttcttc 240
ctgaagctga gcagcgtgac agccgccgat accgccgtgt actactgcgc cagcatgatg 300
gtgccccact actacgtgat ggacgcctgg ggacagggca ccctggtgac agtgagcagc 360
<210> 44
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ccggcagcag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacttca tgaactgggt gaggcaggcc 120
cctggacaag gcctggagtg gatgggcaga gtggatcccg agcagggcag ggccgactac 180
gccgagaagt tcaagaagag ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc caggagagcc 300
atggacaact acggcttcgc ctactggggc cagggaaccc tggtgaccgt gagcagc 357
<210> 45
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 45
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga tagggtgacc 60
atcacctgcc aggccagcca ggacatcggc agcaacctga tctggttcca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagcctat gatctactac gccacccacc tggccgatgg cgtgcctagc 180
agattcagcg gcagcagaag cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag tacaagcagt accccagaac cttcggcggc 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 46
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 46
gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcccgccagc 60
atcagctgca ggtccagcca gagcctgctg aacagcgacg gcaacaccta cctgtactgg 120
tacctgcaga agcctggcca gagcccccag ctgctgatct acctggtgtc caagctgggc 180
agcggcgtgc ctaacaggtt tagcggcagc ggcagcggca ccgatttcac cctgaagatc 240
agcagggtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactactgcg tgcagggcac ccacgatcct 300
tggaccttcg gcggcggaac caaggtggag atcaag 336
<210> 47
<211> 318
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 47
gagatcgtgc tgacccagag ccccgacttc cagagcgtga cccccaagga gaaggtgacc 60
atcacctgca gcgccaacag cgccctgagc tacatgtact ggtaccagca gaagcccgac 120
cagagcccca agctgtgggt gcacggcacc agcaatctgg ccagcggcgt gcctagcaga 180
tttagcggca gcggcagcgg caccgatttc accctgacca tcaacagcct ggaggccgag 240
gacgccgcta cctactactg ccaccactgg agcaacaccc agtggacctt cggcggcggc 300
accaaggtgg agatcaag 318

Claims (18)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合CTLA-4并包含重链可变区和轻链可变区：
a.所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 36所示的CDR1序列、如SEQ ID NO: 28所示的CDR2序列和如SEQ ID NO: 18所示的CDR3序列，和
b.所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 41所示的CDR1序列、 如SEQ ID NO: 32所示的CDR2序列和如SEQ ID NO: 22所示的CDR3序列。
2. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含如SEQ IDNO: 7所示的氨基酸序列。
3. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含如SEQ IDNO: 14所示的氨基酸序列。
4. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含如SEQ IDNO: 14所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段抑制CTLA-4结合于CD80或CD86。
6.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段的结合抗原表位包括CTLA-4的P138。
7. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合于人和猴CTLA-4。
8. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段
a）结合于人CTLA-4，KD为4.77E-10 M以下；并且
b）结合于小鼠CTLA-4，KD为1.39E-09 M以下。
9.如权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
10.一种核酸分子，其编码如权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
11.一种克隆或表达载体，其包含如权利要求10所述的核酸分子。
12.一种宿主细胞，其包含一个以上如权利要求11所述的克隆或表达载体。
13.一种用于生产如权利要求1至9中任一项所述的抗体的方法，包括培养如权利要求12所述的宿主细胞，并且分离所述抗体。
14.一种药物组合物，包含如权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及一种以上药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
15.一种免疫偶联物，包含连接至治疗剂的如权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
16.如权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
17.如权利要求16所述的应用，其中所述癌症是黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、肺癌、头颈部癌症、直肠癌、结肠癌、胰腺癌或乳腺癌。
18.如权利要求17所述的应用，其中所述黑色素瘤是皮肤或眼内恶性黑色素瘤。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018209701A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel monoclonal antibodies to cytotoxic t-lymphocyte-associated protein 4 (ctla-4)
WO2020057610A1 (en) * 2018-09-20 2020-03-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel bispecific anti-ctla-4/pd-1 polypeptide complexes
US20220064301A1 (en) * 2018-12-26 2022-03-03 Xilio Development, Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of use thereof
KR20220003567A (ko) * 2019-04-26 2022-01-10 우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드 Pd-1 및 lag-3에 대한 이중특이적 항체
EP4041767A1 (en) * 2019-09-26 2022-08-17 StCube & Co. Antibodies specific to glycosylated ctla-4 and methods of use thereof
CN110655579B (zh) * 2019-10-25 2020-07-24 北京东方百泰生物科技有限公司 一种新型抗ctla-4单克隆抗体及其应用
CN115010810A (zh) * 2021-03-05 2022-09-06 南京圣和药业股份有限公司 抗ctla-4抗体及其应用
CN113896793B (zh) * 2021-09-30 2023-05-26 港科鹏禾生物(苏州)有限公司 一种抗人il-17rc的单克隆抗体及其应用
CN116836282B (zh) * 2023-02-13 2024-03-29 北京艺妙神州医药科技有限公司 抗体、嵌合抗原受体及其用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1328571A (zh) * 1998-12-23 2001-12-26 辉瑞大药厂 抗ctla－4的人单克隆抗体
EP2418278A2 (en) * 2005-05-09 2012-02-15 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
CN103547595A (zh) * 2011-03-09 2014-01-29 安迪拓普有限公司 人源化ctla-4抗体
CN104292334A (zh) * 2014-04-25 2015-01-21 河南省健康伟业生物医药研究股份有限公司 一种全人源抗ctla-4单克隆抗体、制备方法及应用
CN105296433A (zh) * 2014-08-01 2016-02-03 中山康方生物医药有限公司 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20180672A1 (es) * 2015-05-29 2018-04-19 Agenus Inc Anticuerpos anti-ctla-4 y metodos de uso de los mismos

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1328571A (zh) * 1998-12-23 2001-12-26 辉瑞大药厂 抗ctla－4的人单克隆抗体
EP2418278A2 (en) * 2005-05-09 2012-02-15 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
CN103547595A (zh) * 2011-03-09 2014-01-29 安迪拓普有限公司 人源化ctla-4抗体
CN104292334A (zh) * 2014-04-25 2015-01-21 河南省健康伟业生物医药研究股份有限公司 一种全人源抗ctla-4单克隆抗体、制备方法及应用
CN105296433A (zh) * 2014-08-01 2016-02-03 中山康方生物医药有限公司 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genetic basis for clinical response to CTLA-4 blockade in melanoma;Alexandra Snyder等;《N Engl J Med》;20141204;第371卷(第23期);全文 *
Immune checkpoint blockade in cancer therapy;Michael A Postow等;《J Clin Oncol》;20150610;第33卷(第17期);全文 *

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