CN106687479A - 抗ctla4的单克隆抗体或其抗原结合片段、药物组合物及用途 - Google Patents
抗ctla4的单克隆抗体或其抗原结合片段、药物组合物及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，提供了抗CTLA4的单克隆抗体或其抗原结合片段、其药物组合物及其用途。本发明的单克隆抗体能阻断CTLA4与B7的结合，解除CTLA4对机体的免疫抑制，激活T淋巴细胞。
Description
本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及抗CTLA4的单克隆抗体或其抗原结合片段、其药物组合物、编码它们的序列，以及应用它们进行诊断、预防、治疗和/或辅助治疗的方法和用途。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte sociated antigen 4，亦简称为CTLA4)与CD28分子在基因结构、染色体定位、序列的同源性及基因表达具有十分相近的关系，都是共刺激分子B7的受体，主要表达于被激活T细胞表面。但是作为淋巴细胞激活的共刺激信号，CTLA4与CD28分子的功能是相反的，CTLA4与B7结合后能抑制小鼠和人T细胞的激活，在T细胞活化中起负调节作用。
CTLA4 mAb或CTLA4配体可以阻止CTLA4与其天然配体结合，从而封闭CTLA4对T细胞负性调节信号的传导，增强T细胞对各种抗原的反应性，在这方面体内与体外研究结果基本一致。目前已有CTLA4 mAb(10D1，11.2.2)处于临床试验阶段用于治疗前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、恶性黑色素瘤等(Grosso JF.，Jure-Kunkel MN.，CTLA-4 blockade in tumor models：an overview of preclinical and translational research.Cancer Immun.2013；13：5.Epub 2013 Jan 22；US 6984720 B1以及US 6682736 B1)，其中10D1和11.2.2被视为目前效果最好的CTLA4单克隆抗体之一。
白细胞介素2(IL-2)由T细胞产生，是调节T细胞亚群的生长因子，也是调控免疫应答的重要因子，并可促进活化B细胞增殖，参与抗体反应、造血和肿瘤监视。重组的人IL-2已经被美国FDA批准用于治疗恶性肿瘤(包括黑色素瘤、肾肿瘤等)，同时正在进行治疗
慢性病毒感染的临床研究(Chavez，A.R.，et al.，Pharmacologic administration of interleukin-2.Ann N Y Acad Sci，2009.1182：p.14-27)。
CTLA4及CTLA4 mAb作为T细胞功能状况的重要影响因素，通过干预机体免疫微环境，可对疾病产生特异性治疗作用，并发挥较高疗效，补充传统用药的不足，由此开辟基因治疗的新途径。CTLA4及CTLA4 mAb应用于试验及临床各阶段：如在自身免疫性疾病中有效抑制哮喘动物模型的气道高反应性、阻止风湿性疾病的发展以及在同种异体移植中介导机体免疫耐受等。但同时，尽管生物基因治疗在短期临床试验研究中未发现不良反应，我们亦应注意到其长期应用所存在的潜在影响，如CTLA4 mAb过度阻断CTLA4-B7信号则可导致自身免疫性疾病的发生。由于抗体可以特异结合其配体并导致靶细胞溶解或阻断病理进程，所以抗体尤其人源性抗体药物的开发利用对人类恶性肿瘤及其他免疫性疾病临床治疗有重要意义。
目前，尚需要开发新的阻断CTLA4与B7的结合的抗体及其人源化抗体。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，利用哺乳动物细胞表达系统表达出重组的CTLA4作为抗原免疫小鼠，经小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。发明人通过进行对大量样本的筛选，得到了一种杂交瘤细胞株能够分泌产生与CTLA4特异性结合的特异性单克隆抗体，并且该单克隆抗体能够十分有效地阻断CTLA4与B7的结合。并进一步制得了人源化抗体。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述的单克隆抗体包括选自下列的互补决定区(CDR)：
包含氨基酸序列为SEQ ID NO：27的HCDR1，
包含氨基酸序列为SEQ ID NO：28的HCDR2，以及
包含氨基酸序列为SEQ ID NO：29的HCDR3；
和/或
包含氨基酸序列为SEQ ID NO：30的LCDR1，
包含氨基酸序列为SEQ ID NO：31的LCDR2，以及
包含氨基酸序列选自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的LCDR3。
根据本发明任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述单克隆抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：18；
和/或
所述单克隆抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24。
根据本发明任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述单克隆抗体包括：
(1)如SEQ ID NO：6所示的VH和如SEQ ID NO：8所示的VL；
(2)如SEQ ID NO：10所示的VH和如SEQ ID NO：12所示的VL；
(3)如SEQ ID NO：14所示的VH和如SEQ ID NO：16所示的VL；
(4)如SEQ ID NO：18所示的VH和如SEQ ID NO：20所示的VL；
(5)如SEQ ID NO：14所示的VH和如SEQ ID NO：22所示的VL；或
(6)如SEQ ID NO：14所示的VH和如SEQ ID NO：24所示的VL。
本发明中，上述(1)-(6)组单抗分别为8D2/8D2(Re)、8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15和8D2H2L17的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
具体地，SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14中的第18位的蛋氨酸(Met)独立地被选自如下的氨基酸所替代：
亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)或丙氨酸(Ala)。
抗体治疗药物，特别是单克隆抗体(MAB)已在多种疾病的治疗中取得了良好的疗效。获取这些治疗性抗体的传统实验方法是采用抗原免疫动物，在免疫动物体内获取靶向抗原的抗体，或通过亲和力成熟的方法来改进那些与抗原的亲和力较低的抗体。然而，这些方法需要大量时间和精力，大多数时候也并不能针对抗原上的特定表位。
轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；其由Kabat等人命名，见Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition(1991)，第1-3卷，NIH Publication 91-3242，Bethesda Md)。
通过本领域技术人员所熟知的技术手段，例如通过VBASE2数据库分析上面的(1)-(6)项中的单克隆抗体序列的CDR区的氨基酸序列，结果如下：
第(1)项：
其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
HCDR1：GFTFSDNW (SEQ ID NO：27)
HCDR2：IRNKPYNYET (SEQ ID NO：28)
HCDR3：TAQFAY (SEQ ID NO：29)
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1：ENIYGG (SEQ ID NO：30)
LCDR2：GAT (SEQ ID NO：31)
LCDR3：QNVLRSPFT (SEQ ID NO：32)
第(2)项：
其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
HCDR1：GFTFSDNW (SEQ ID NO：27)
HCDR2：IRNKPYNYET (SEQ ID NO：28)
HCDR3：TAQFAY (SEQ ID NO：29)
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1：ENIYGG (SEQ ID NO：30)
LCDR2：GAT (SEQ ID NO：31)
LCDR3：QNVLRSPFT (SEQ ID NO：32)
第(3)项：
其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
HCDR1：GFTFSDNW (SEQ ID NO：27)
HCDR2：IRNKPYNYET (SEQ ID NO：28)
HCDR3：TAQFAY (SEQ ID NO：29)
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1：ENIYGG (SEQ ID NO：30)
LCDR2：GAT (SEQ ID NO：31)
LCDR3：QNVLRSPFT (SEQ ID NO：32)
第(4)项：
其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
HCDR1：GFTFSDNW (SEQ ID NO：27)
HCDR2：IRNKPYNYET (SEQ ID NO：28)
HCDR3：TAQFAY (SEQ ID NO：29)
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1：ENIYGG (SEQ ID NO：30)
LCDR2：GAT (SEQ ID NO：31)
LCDR3：QNVLRSPFT (SEQ ID NO：32)
第(5)项：
其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
HCDR1：GFTFSDNW (SEQ ID NO：27)
HCDR2：IRNKPYNYET (SEQ ID NO：28)
HCDR3：TAQFAY (SEQ ID NO：29)
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1：ENIYGG (SEQ ID NO：30)
LCDR2：GAT (SEQ ID NO：31)
LCDR3：QNVLSRHPG (SEQ ID NO：33)
第(6)项：
其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
HCDR1：GFTFSDNW (SEQ ID NO：27)
HCDR2：IRNKPYNYET (SEQ ID NO：28)
HCDR3：TAQFAY (SEQ ID NO：29)
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1：ENIYGG (SEQ ID NO：30)
LCDR2：GAT (SEQ ID NO：31)
LCDR3：QNVLSSRPG (SEQ ID NO：34)
根据本发明任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
根据本发明任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的KD结合CTLA4蛋白。
根据本发明任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。
本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段为抗CTLA4的单克隆抗体或其抗原结合片段，其能够与CTLA4特异性结合。
根据本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其用于预防和/治疗和/或辅助治疗和/或诊断肿瘤；具体地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌和肝癌。
根据本发明中任一项所述的单克隆抗体，其用于：
阻断CTLA4与B7结合，
调节(例如下调)CTLA4活性或CTLA4水平，
解除CTLA4对机体免疫抑制的，或者
激活T淋巴细胞的药物或者提高T淋巴细胞中IL-2表达。
本发明的另一方面涉及分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，其中，
所述抗体重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：27-29的CDR；
具体地，所述抗体重链可变区具有SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；
更具体地，所述核酸分子具有SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。
本发明还提供了分离的核酸分子，其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。此类核酸分子可以从杂交瘤细胞中分离得到，也可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。
本发明的再一方面涉及分离的核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，其中，
所述抗体轻链可变区包含：
1)氨基酸序列为SEQ ID NO：30-32的CDR；
2)氨基酸序列为SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：33的CDR；或
3)氨基酸序列为SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：34的CDR；
具体地，所述抗体轻链可变区具有SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；
更具体地，所述核酸分子具有SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列。
本发明的再一方面涉及一种载体，其包含本发明任一项所述的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。
本发明的再一方面涉及一种宿主细胞，其包含本发明任一项所述的分离的核酸分子，或者本发明的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
本发明的再一方面涉及制备本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段的步骤。
本发明的再一方面涉及偶联物，其包括单克隆抗体或其抗原结合片段以及偶联部分，其中，所述单克隆抗体为本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为可检测的标记；具体地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶(例如辣根过氧化物酶)。
本发明的再一方面涉及试剂盒，其包括本发明中任一项所述的单
克隆抗体或其抗原结合片段，或者包括本发明的偶联物；
具体地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶(例如辣根过氧化物酶)。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CTLA4在样品中的存在或其水平。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物；可选地，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断肿瘤的药物中的用途；具体地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌和肝癌。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物在制备如下药物中的用途：
检测样品中的CTLA4存在或其水平的药物，
阻断CTLA4与B7结合的药物，
调节(例如下调)CTLA4活性或CTLA4水平的药物，
解除CTLA4对机体免疫抑制的药物，
激活T淋巴细胞的药物，或者
提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外方法，包括施加细胞
以有效量的本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物的步骤，所述方法选自如下：
检测样品中的CTLA4存在或其水平的方法，
阻断CTLA4与B7结合的方法，
调节(下调)CTLA4活性或CTLA4水平的方法物，
解除CTLA4对机体免疫抑制的方法，
激活T淋巴细胞的方法，或者
提高T淋巴细胞中IL-2表达的方法。
所述方法可以用于诊断或治疗目的，或者非诊断或治疗目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
本发明的再一方面涉及一种预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断肿瘤的方法，包括给予受试者有效量的本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的单克隆抗体偶联物的步骤；具体地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌和肝癌。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，当提及CTLA4蛋白(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4)的氨基酸序列时，其包括CTLA4蛋白的全长，或者CTLA4的胞外片段CTLA4ECD(SEQ ID NO：2)或者包含CTLA4ECD的片段；还包括CTLA4ECD的融合蛋白，例如与小鼠IgG的Fc蛋白片段(mFc)进行融合的片段(SEQ ID NO：3)。然而，本领域技术人员理解，在CTLA4蛋白的氨基酸序列中，可天
然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“CTLA4蛋白”应包括所有此类序列，包括SEQ ID NO：2所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述CTLA4蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：2的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。
如本文中所使用的，如果没有特别说明，所述B7为B7-1和/或B7-2；其具体蛋白序列为现有技术中已知序列，可以参考现有文献或者GenBank中公开的序列。例如，B7-1(CD80，NCBI Gene ID：941)；B7-2(CD86，NCBI Gene ID：942)。
如本文中所使用的，术语EC50是指半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect)，是指能引起50％最大效应的浓度。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat
Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人(1989)Nature 342：878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，ed.，第2版，Raven Press，N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人，Nature 341：544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab′)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如，scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如，Bird等人，Science 242：423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头
-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人，Structure 2：1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的单克隆抗体4B3、13A10、12B9或4H4)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature，256：495，1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。
如本文中所使用的，以编号提及的单克隆抗体与从相同编号的杂
交瘤获得的单克隆抗体相同。例如，单克隆抗体4B3(或13A10、12B9或4H4)分别是与从杂交瘤细胞株4B3(或13A10、12B9或4H4)或其亚克隆或后代细胞获得的抗体相同的抗体。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567to Cabilly et al.；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851 6855(1984))。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.，Nature，321：522 525(1986)；Reichmann et al.，Nature，332：323 329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593 596(1992)；和Clark，Immunol.Today 21：397 402(2000)。
如本文中所使用的，“中和抗体”是指，能清除或显著降低目标病毒的毒力(例如，感染细胞的能力)的抗体或抗体片段。
如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，Epitope Mapping
Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar，Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4：11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48：444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保
守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94：412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
如本文中使用的，术语“免疫原性(immunogenicity)”是指，能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的性质，一种抗原能否成功地诱导宿主产生免疫应答取决于三方面的因素：抗原的性质、宿主的反应性和免疫方式。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的
解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的单克隆抗体4B3、13A10、12B9或4H4)以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，L1蛋白)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如，当提及杂交瘤细胞株4B3时，其还指杂交瘤细胞株4B3的亚克隆和后代细胞。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR，19th ed.Pennsylvania：Mack Publishing Company，1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如CTLA4与B7结合或者CTLA4活性过高相关的疾病如肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如CTLA4与B7结合或者CTLA4活性过高相关的疾病如肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
发明的有益效果
本发明的单克隆抗体8D2及其人源化抗体能够很好地特异性与CTLA4结合，其中，抗体8D2，8D2(Re)与鼠源CTLA4抗原的结合效率强于对照抗体10D1(Alan J.Korman，Edward L.Halk，et al.，HUMAN CTLA-4 ANTIBODIES，United State Patent No.US 6984720 B1)和11.2.1(Douglas Charles Hanson，Mark Joseph Neveu，et al.，Human monoclonal antibodies to CTLA-4，United State Patent No.US 682736 B1)。人源化抗体8D2H1L1与鼠源CTLA4抗原的结合效率强于对照抗体10D1，与11.2.1相当。人源化抗体8D2H2L2与人CTLA4抗原的结合效率与10D1相当。人源化抗体8D2H2L2和8D2H3L3与猴CTLA4抗原的结合效率与10D1相当。抗体8D2H2L15和8D2H2L17与人CTLA4抗原的结合效率强于对照抗体10D1和11.2.1。
抗体8D2，8D2(Re)及8D2人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15、8D2H2L17能与B7竞争结合抗原CTLA4。其中，8D2，8D2(Re)，8D2H1L1、8D2H2L2与B7-2的竞争结合CTLA4强于10D1；8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3；8D2H2L15、8D2H2L17与B7-1，B7-2的竞争结合CTLA4均强于抗体10D1和11.2.1。
本发明的单克隆抗体8D2及其人源化抗体能够十分有效地阻断CLTA4与B7的结合，特异地解除CTLA4对机体免疫抑制，激活T淋巴细胞。其中，8D2H2L2、8D2H2L15对T淋巴细胞强于对照抗体10D1和11.2.1。
图1：CTLA4ECD-mFc融合蛋白的SDS-PAGE检测结果。从左至右的4个泳道的样品及其上样量依次为：M：marker 10μL；CTLA4ECD-mFc融合蛋白1μg；CTLA4ECD-mFc融合蛋白2μg；CTLA4ECD-mFc融合蛋白3μg。
图2：8D2抗体的SDS-PAGE检测结果。从左至右的4个泳道的样品及其上样量依次为：M：marker 10μL；还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体0.3μg；非还原型蛋白电泳上样缓冲液2μL；非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体0.3μg。
图3：8D2重组抗体(8D2(Re))的SDS-PAGE检测结果。从左至右的4个泳道的样品及其上样量依次为：M：marker 10μL；还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体1μg；非还原型蛋白电泳上样缓冲液2μL；非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体1μg。
图4：8D2的人源化抗体8D2H1L1的SDS-PAGE检测结果。从左至右的4个泳道的样品及其上样量依次为：M：marker 10μL；还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体1μg；非还原型蛋白电泳上样缓冲液2μL；非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体1μg。
图5：8D2的人源化抗体8D2H2L2的SDS-PAGE检测结果。从左至右的4个泳道的样品及其上样量依次为：M：marker 10μL；还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体1μg；非还原型蛋白电泳上样缓冲液2μL；非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体1μg。
图6：8D2的人源化抗体8D2H3L3的SDS-PAGE检测结果。从左至右的4个泳道的样品及其上样量依次为：M：marker 10μL；还
原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体1μg；非还原型蛋白电泳上样缓冲液2μL；非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体1μg。
图7：8D2的人源化抗体8D2H2L15的SDS-PAGE检测结果。样品及其上样量分别为：M：marker 10μL；1：非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体1μg；2：还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体1μg。
图8：8D2的人源化抗体8D2H2L17的SDS-PAGE检测结果。样品及其上样量分别为：M：marker 10μL；1：非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体1μg；2：还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体1μg。
图：9：单抗8D2的动力学特征参数检测结果。
图10：8D2H1L1的动力学特征参数检测结果。
图11：8D2H2L2的动力学特征参数检测结果。
图12：8D2H3L3的动力学特征参数检测结果。
图13：8D2H2L15的动力学特征参数检测结果。
图14：8D2H2L17的动力学特征参数检测结果。
图15：流式细胞仪检测293F细胞无标记，同型对照，293F-CTLA4细胞的CTLA4表达直方图(细胞数-荧光(FITC))。
图16：流式细胞仪检测293F细胞无标记，同型对照，293F-CTLA4细胞的CTLA4表达的平均荧光强度(MFI)。
图17：单抗8D2与标记的293F-CTLA4细胞的结合的EC50结果。
图18：8D2(Re)抗体与标记的293F-CTLA4细胞的结合的EC50结果。
图19：8D2H1L1与标记的293F-CTLA4细胞的结合的EC50结果。
图20：8D2H2L2与标记的293F-CTLA4细胞的结合的EC50结果。
图21：8D2H3L3与标记的293F-CTLA4细胞的结合的EC50结果。
图22：ELISA方法检测8D2、8D2H1L1、8D2重组抗体与CTLA4的结合。
图23：ELISA方法检测8D2H2L2、8D2H3L3重组抗体与人CTLA4结合。
图24：ELISA方法检测8D2H2L2、8D2H3L3重组抗体与猴CTLA4结合。
图25：ELISA方法检测8D2H2L15、8D2H2L17重组抗体与猴CTLA4结合。
图26：8D2、8D2H1L1、8D2重组抗体与B7-1竞争ELISA结果。
图27：8D2、8D2H1L1、8D2重组抗体与B7-2竞争ELISA结果。
图28：8D2H2L2、8D2H3L3抗体与B7-1竞争ELISA结果。
图29：8D2H2L2、8D2H3L3抗体与B7-2竞争ELISA结果。
图30：8D2H2L15、8D2H2L17抗体与B7-1竞争ELISA结果。
图31：8D2H2L15、8D2H2L17抗体与B7-2竞争ELISA结果。
图32：分别为外周血单核细胞(PBMC)，Raji细胞和人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3共培养72小时后采用ELISA方法检测T淋巴细胞IL-2分泌水平的影响。结果显示单抗8D2的人源化抗体通过阻止CTLA4的受体提高T淋巴细胞的IL-2的分泌。
图33：分别为外周血单核细胞(PBMC)，Raji细胞和人源化抗体8D2H2L15、8D2H2L17共培养72小时后采用ELISA方法检测T淋巴细胞IL-2分泌水平的影响。结果显示单抗8D2的人源化抗体通过阻止CTLA4的受体提高T淋巴细胞的IL-2的分泌。
图34：8D2H2L2在hu-SCID-raji模型中皮下移植肿瘤生长曲线。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买
获得的常规产品。
在本发明的下述实施例中，使用的BALB/C小鼠购自广东省医学实验动物中心。
在本发明的下述实施例中，使用的T细胞来自中山康方生物医药有限公司。
对照抗体10D1参照美国专利US 6984720 B1制备；11.2.1参照US 6682736 B1制备。
实施例1：CTLA4-8D2杂交瘤细胞株LT001的获得以及单克隆
抗体8D2的制备
利用哺乳动物细胞表达系统表达出重组的CTLA4作为抗原免疫小鼠，经小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。通过大量的样本筛选，得到了一种杂交瘤细胞株(CTLA4-8D2杂交瘤细胞株LT001)，该细胞株能够分泌产生与CTLA4特异性结合的单克隆抗体8D2。具体方法如下：
1.基因CTLA4ECD-mFc的合成：
对基因CTLA4的胞外片段CTLA4ECD(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4，NCBI Gene ID：1493，SEQ ID NO：1)所对应的氨基酸(SEQ ID NO：2)与小鼠IgG的Fc蛋白片段(mFc)进行融合设计(SEQ ID NO：3)，其中，mFc是指鼠IgG的Fc蛋白片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3的下划线部分所示。
为提高目的基因在293f细胞表达系统中的表达效率，委托金斯瑞公司对SEQ ID NO：3蛋白序列相对应的核酸序列进行优化，优化主要考虑密码子的偏好性、GC含量、mRNA的二级结构、重复序列等因素。最终CTLA4ECD-mFc融合蛋白基因优化后序列如下(SEQ ID NO：4)，并委托金斯瑞公司合成。
基因CTLA4ECD的序列：(375bp)
CTLA4ECD编码的蛋白序列：(125aa)
CTLA4ECD-mFc融合蛋白序列：(364aa)
其中，带波浪下划线的为CTLA4ECD部分，带实线下划线的为mFc部分。
CTLA4ECD-mFc融合蛋白相对应的基因编码序列：(1092bp)
其中，带波浪下划线的为CTLA4ECD部分，带实线下划线的为
mFc部分。
2.pUC57simple-CTLA4ECD-mFc质粒的获得：
由金斯瑞公司将合成的CTLA4ECD-mFc融合基因(SEQ ID NO：4)克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)表达载体中，获得pUC57simple-CTLA4ECD-mFc质粒。
3.pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc重组质粒的构建：
将质粒pUC57simple-CTLA4ECD-mFc进行酶切(Xba I和BamH I)，电泳回收得到的融合基因片段CTLA4ECD-mFc与pcDNA3.1表达载体(购自Invitrogen公司)进行连接反应，获得pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc，转染感受态大肠杆菌细胞DH5a(购自TIANGEN公司)，转染和培养按照说明书进行。筛选得到阳性的pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc克隆菌落，按照常规方法扩增大肠杆菌，然后采用试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，DP103-03)并按照试剂盒的说明书提取得到pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc重组质粒。
4.按照lipofectamin转染试剂盒(购自Invitrogen公司)方法将重组质粒pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc转染293F细胞(购自Invitrogen公司)。
5.将重组质粒pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc转染293F细胞7天后，将培养液通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤以及HiTrap protein A HP柱进行纯化CTLA4ECD-mFc融合蛋白，并取纯化后样品加入还原型蛋白电泳上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳检测。如图1所示，目标蛋白大约在45kD处。
6.CTLA4-8D2杂交瘤细胞株LT001的建立
用CTLA4ECD-mFc融合蛋白作为抗原，取免疫BALB/C小鼠(购自广东医学实验动物中心)的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，参照目前已确立的方法(e.g.，Stewart，S.J.，“Monoclonal Antibody Production”，in Basic Methods in antibody Production and Characterization，Eds.G.C.Howard and D.R.Bethell，Boca Raton：CRC Press，2000)。
用CTLA4作为抗原包被酶标板，进行间接ELISA法筛选，得
到分泌与CTLA4特异性结合的新的抗体的杂交瘤细胞。对间接ELISA筛选得到的杂交瘤细胞，通过竞争ELISA筛选出能够分泌与配体B7-1(CD80，NCBI Gene ID：941)、B7-2(CD86，NCBI Gene ID：942)竞争结合CTLA4的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并经过有限稀释法得到稳定的杂交瘤细胞株。将该杂交瘤细胞株命名为CTLA4-8D2杂交瘤细胞株，并经过有限稀释法得到CTLA4-8D2稳定细胞株(本发明中亦简称为LT001细胞，其分泌的单克隆抗体命名为8D2)。
7.抗体8D2的制备
用含10％的低IgG胎牛血清对本发明CTLA4-8D2(LT001)细胞株进行培养，7天后收集细胞培养上清进行纯化制备抗体8D2。
8.抗体8D2的SDS-PAGE电泳检测：
将纯化后的样品分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样缓冲液，煮沸后进行检测。检测结果显示，还原型蛋白样品目标蛋白大约在50kD和25kD处，非还原型蛋白样品目标蛋白大约在150kD处(图2)。
实施例2：单克隆抗体8D2的轻链和重链序列的获得
按照培养细胞细菌总RNA提取试剂盒(Tiangen，货号DP430)的方法，从实施例1制得的CTLA4-8D2杂交瘤细胞株(LT001细胞)中提取mRNA。
按照InvitrogenIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增。PCR扩增产物直接进行TA克隆，具体操作参照pEASY-T1Cloning Kit(Transgen CT101)试剂盒说明书进行。将TA克隆的产物直接进行测序，测序结果如下：
重链可变区的DNA测序结果：(345bp)
其编码的蛋白序列：(115aa)
轻链可变区的DNA测序结果：(318bp)
其编码的蛋白序列：(106aa)
实施例3：人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2，8D2H3L3，8D2H2L15
和8D2H2L17的轻链和重链序列的设计
根据CTLA4蛋白的三维晶体结构(Nat.Struct.Biol.(1997)4p.527)以及实施例2获得的抗体8D2的序列，通过计算机模拟抗体模型，根据抗体序列和结构模型设计得到抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15和8D2H2L17的可变区序列(抗体恒定区序列，来自NCBI的数据库)，可变区序列如下：
1.单克隆抗体8D2H1L1的轻链和重链序列
重链可变区的DNA序列：(345bp)
其编码的蛋白序列：(115aa)
轻链可变区的DNA序列：(321bp)
其编码的蛋白序列：(107aa)
2.8D2人源化单克隆抗体8D2H2L2的轻链和重链序列
重链可变区的DNA序列：(345bp)
其编码的蛋白序列：(115aa)
轻链可变区的DNA序列：(321bp)
其编码的蛋白序列：(107aa)
3.8D2人源化单克隆抗体8D2H3L3的轻链和重链序列
重链可变区的DNA序列：(345bp)
其编码的蛋白序列：(115aa)
轻链可变区的DNA序列：(321bp)
其编码的蛋白序列：(107aa)
4.8D2人源化单克隆抗体8D2H2L15的轻链和重链序列
重链可变区的DNA序列：(345bp)
其编码的蛋白序列：(115aa)
轻链可变区的DNA序列：(321bp)
其编码的蛋白序列：(107aa)
5.8D2人源化单克隆抗体8D2H2L17的轻链和重链序列
重链可变区的DNA序列：(345bp)
其编码的蛋白序列：(115aa)
轻链可变区的DNA序列：(321bp)
其编码的蛋白序列：(107aa)
实施例4：8D2重组抗体8D2(Re)以及8D2人源化抗体8D2H1L1、
8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15和8D2H2L17的制备和SDS-PAGE
电泳检测
1.8D2重组抗体即8D2(Re)的制备和SDS-PAGE电泳检测
将8D2的重链cDNA序列(其可变区序列如SEQ ID NO：5所示)和轻链的cDNA序列(其可变区序列如SEQ ID NO：7所示)分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-8D2H和pUC57simple-8D2L质粒。
分别将质粒pUC57simple-8D2H和pUC57simple-8D2L进行酶切(HindIII&EcoRI)，电泳回收得到的重链轻链分别亚克隆到pcDNA3.1载体中，提取重组质粒共转染293F细胞。细胞培养7天后，将培养液通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤以及HiTrap protein A HP柱进行纯化，并将纯化后的样品分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样缓冲液，煮沸后进行SDS-PAGE电泳检测。如图3所示，还原型蛋白样品目标蛋白大约在50kD和25KD处，非还原型蛋白样品目标蛋白大约在150kD处。
2.8D2人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2和8D2H3L3的制备和SDS-PAGE电泳检测
将8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15和8D2H2L17的重链cDNA(其可变区序列分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：13所示)和轻链的cDNA(其可变区序列分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23所示)分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，获得pUC57simple-8D2H1L1、pUC57simple-8D2H2L2、pUC57simple-8D2H3L3、pUC57simple-8D2H2L15、pUC57simple-8D2H2L17质粒，并分别亚克隆到pcDNA3.1载体中，方法同前述8D2(Re)。
将重组质粒转染293F细胞，将培养液纯化后进行检测(同上所述8D2(Re)的方法)，结果分别如图4、图5、图6、图7和图8所示，还原型蛋白样品目标蛋白大约在50kD和25KD处，非还原型蛋白样
品目标蛋白大约在150kD处。
下面的实施例中所用到的8D2重组抗体8D2(Re)以及8D2人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15和8D2H2L17均按照本实施例的方法制得。
实施例5：抗体的动力学参数测定
使用Fortebio分子相互作用仪测定抗体8D2及人源化8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3与抗原CTLA4(NCBI Gene ID：1493，编码核酸序列为SEQ ID NO：25，所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：26)结合的动力学参数。
1.用TEV蛋白酶酶切CTLA4-mFc蛋白(CTLA4-mFc合成方法同实施例1中所述CTLA4ECD-mFc的合成)，并过柱纯化获得CTLA4抗原。
基因CTLA4的序列：(636bp)
编码对应的氨基酸序列：(212aa)
2.分别将抗体8D2及其人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15、8D2H2L17采用氨基偶联的方式固定于AR2G传感器表面，经乙醇胺封闭，于PBST中平衡后，与抗原CTLA4结合，CTLA4用PBST两倍稀释，浓度为300、150、75、37.5、18.75、9.38、4.69、0nM，于PBST中解离。人源化8D2H1L1、H2L2、H3L3、H2L15、H2L17的检测方法与8D2相同，抗原浓度为180、90、45、22.5、11.25、5.625、2.813、0nM。
抗体8D2及其人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15、8D2H2L17的动力学参数见表1，动力学特征参数检测结果分别如图9-14所示。
表1：抗体8D2、8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15、8D2H2L17的动力学参数
KD为亲和力常数；kon为抗原抗体结合速率；kdis为抗原抗体解离速率；KD＝kdis/kon。
结果表明，六种抗体均与抗原有较好的亲和力，与对照抗体10D1和11.2.1相当甚至更优。
实施例6：流式细胞仪方法检测抗体与杂交瘤细胞株表面抗原
CTLA4的结合活性
首先构建表达CTLA4抗原的宿主细胞293F；然后用本发明中制备的单克隆抗体8D2(见实施例1)以及制备的8D2(Re)及8D2人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2和8D2H3L3(见实施例4)对改宿主细胞进行标记。然后采用流式细胞术分析验证抗体8D2，8D2(Re)及8D2人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2和8D2H3L3对细胞表面具有天然构象的抗原具有特异性的结合。
具体步骤如下：
1.表达CTLA4抗原的宿主细胞293F的构建
按照lipofectamin转染试剂盒(购自Invitrogen公司)方法将包含CTLA4的载体pLenti6.3-CTLA4(载体pLenti6.3购自Invitrogen公司)转染293F细胞，经筛选获得稳定表达CTLA4的克隆群体293F-CTLA4细胞。
2.抗体标记和流式细胞仪检测
采用常规胰酶消化方法上述步骤获得的表达CTLA4抗原的宿主细胞293F，并使每个收集管细胞数为2×105，用PBS(1％BSA)配制浓度分别为20nM，10nM，5nM，1nM，0.1nM，0.01nM，0nM的8D2抗体稀释液，冰上与表达CTLA4的293F细胞孵育2小时，
每管加入100μL FITC-Goat-Anti-Mouse IgG(1∶500)冰上孵育1小时并加入300μLPBS后，在流式细胞仪上用FITC通道检测荧光信号。其它抗体的检测参照8D2抗体。
3.实验结果
293F-CTLA4细胞的CTLA4表达验证结果如图15和图16所示。检测8D2，8D2(Re)抗体及3个人源化抗体与293F细胞的结合结果分别如图17-21所示。由图可见，8D2抗体及其人源化抗体能有效地结合宿主细胞293F表面的靶标CTLA蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系，各剂量的荧光强度见表2。
通过对结合的8D2及其人源化抗体进行荧光定量分析，曲线模拟8D2及其人源化抗体的结合效率EC50，如表3。
表2：流式细胞仪检测8D2，8D2(Re)及8D2人源化抗体8D2H1L1，8D2H2L2和8D2H3L3结合CTLA4宿主细胞293F表面抗原CTLA4后荧光强度分析
表3：流式细胞仪检测分析曲线模拟8D2，8D2(Re)及8D2人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3与CTLA4宿主细胞293F表面抗原CTLA4的结合效率EC50
| 8D2 | 8D2(Re) | 8D2H1L1 | 8D2H2L2 | 8D2H3L3 | |
| EC<sub>50</sub>(nM) | 3.84 | 1.38 | 5.06 | 4.37 | 4.54 |
结果表明，抗体8D2，8D2(Re)及8D2人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3均与CTLA4宿主细胞293F表面抗原CTLA4有很强的结合能力。
实施例7：ELISA方法检测抗体与抗原CTLA4的结合活性
用CTLA4包被酶标板4℃包被过夜，1％BSA 37℃封闭2h后，分别加入CTLA4抗体8D2，8D2(Re)及8D2人源化抗体8D2H1L1，8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15和8D2H2L17及对照抗体10D1(Alan J.Korman，Edward L.Halk，et al.，HUMAN CTLA-4ANTIBODIES，United State Patent No.US 6984720 B1)和11.2.1(Douglas Charles Hanson，Mark Joseph Neveu，et al.，Human monoclonal antibodies to CTLA-4，United State Patent No.US 682736 B1)反应30分钟，加入酶标二抗孵育30分钟后，在酶标仪上检测450nm的吸光值。
检测8D2抗体及其人源化抗体与抗原CTLA4结合结果分别如图22-25所示。由图可见，8D2，8D2(Re)抗体及8D2人源化抗体能有效地结合CTLA4蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系，各剂量的荧光强度见表4-表8。通过对结合的8D2，8D2(Re)及人源化抗体进行荧光定量分析，曲线模拟8D2，8D2(Re)及人源化抗体的结合效率EC50(表9)。
表4：8D2、8D2重组抗体与鼠CTLA4的结合(ELISA)
表5：8D2、8D2H1L1、8D2重组抗体与人CTLA4的结合(ELISA)
表6：8D2H2L2、8D2H3L3抗体与人CTLA4结合(ELISA)
表7：8D2H2L2、8D2H3L3抗体与猴CTLA4结合(ELISA)
表8：抗体8D2H2L15、8D2H2L17与人CTLA4结合(ELISA)
表9：ELISA分析曲线模拟8D2，8D2(Re)及8D2人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15、8D2H2L17与CTLA4抗原的结合效率EC50
注：8D2H2L2平行进行了3次实验。
以上结果表明，抗体8D2，8D2(Re)与鼠源CTLA4抗原的结合效率强于对照抗体10D1和11.2.1。人源化抗体8D2H1L1与鼠源CTLA4抗原的结合效率强于对照抗体10D1，与11.2.1相当。
人源化抗体8D2H2L2与人CTLA4抗原的结合效率与10D1相当。人源化抗体8D2H2L2和8D2H3L3与猴CTLA4抗原的结合效率与10D1相当。抗体8D2H2L15和8D2H2L17与人CTLA4抗原的结合效率显著强于对照抗体10D1和11.2.1。
实施例8：竞争ELISA方法检测抗体与B7-1/2竞争结合抗原
CTLA4的结合活性
1.ELISA检测抗体与B7-1竞争结合抗原CTLA4的结合活性
采用B7-1包被酶标板4℃过夜，1％BSA 37℃封闭2小时，加入抗CTLA4的抗体单克隆抗体8D2，8D2(Re)及8D2人源化抗体8D2H1L1，8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15和8D2H2L17及对照抗体10D1和11.2.1孵育10分钟后，加入CTLA4-mFc37℃孵育40min后，加入酶标二抗37℃孵育30min。在酶标仪上检测450nm的吸光值。
2.ELISA检测抗体与B7-2竞争结合抗原CTLA4的结合活性
采用CTLA4-mFc包被酶标板4℃过夜，1％BSA 37℃封闭2小时，加入抗CTLA4的抗体单克隆抗体8D2，8D2(Re)及8D2人源化抗体8D2H1L1，8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15和8D2H2L17
及对照抗体10D1和11.2.1孵育10分钟后，加入B7-2-his37℃孵育40min后，加入酶标二抗37℃孵育30min。在酶标仪上检测450nm的吸光值。检测8D2，8D2(Re)抗体及其人源化抗体与抗原CTLA4结合结果分别如图26-31所示。由图可见，8D2，8D2(Re)抗体及8D2人源化抗体能有效地结合CTLA蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系，各剂量的荧光强度见表10-表16。通过对结合的8D2，8D2(Re)及人源化抗体进行荧光定量分析，曲线模拟8D2，8D2(Re)及人源化抗体的结合效率EC50(表17)。
表10：8D2、8D2(Re)与B7-1竞争ELISA
表11：8D2、8D2H1L1、8D2(Re)与B7-1竞争ELISA
表12：8D2、8D2H1L1、8D2重组抗体与B7-2竞争ELISA
表13：8D2H2L2、8D2H3L3抗体与B7-1竞争ELISA
表14：8D2H2L2、8D2H3L3抗体与B7-2竞争结合CTLA4 ELISA
表15：8D2H2L15、8D2H2L17抗体与B7-1竞争结合CTLA4 ELISA
表16：8D2H2L15、8D2H2L17抗体与B7-2竞争结合CTLA4 ELISA
表17：竞争ELISA分析曲线模拟8D2，8D2(Re)及8D2人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15、8D2H2L17与B7竞争结合抗原CTLA4的结合效率EC50
注：8D2H2L2平行进行了3次实验。
以上结果表明，抗体8D2，8D2(Re)及8D2人源化抗体
8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15、8D2H2L17均能与B7竞争结合抗原CTLA4。其中，8D2，8D2(Re)，8D2H1L1、8D2H2L2与B7-2的竞争结合CTLA4强于10D1；8D2H2L17与B7-1，B7-2的竞争结合CTLA4均显著强于抗体10D1和11.2.1。
实施例9：单克隆抗体8D2及人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、
8D2H3L3、8D2H2L15和8D2H2L17的细胞生物学活性分析
为检测单克隆抗体8D2及人源化抗体8D2H1L1，8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15和8D2H2L17和对照抗体10D1、11.2.1对外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell：PBMC)的IL-2表达的影响，用含肝素钠的血液采集管采集健康者外周血，经PBS稀释和分离液离心(2550rpm，20分钟)后得到细胞悬液即PBMC，向细胞悬液加入SEB(1μg/mL)/PHA(30μl/ml)并置于饱和湿度37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，并加入淋巴细胞Raji细胞和抗体进行共孵育培养48小时。将PBMC用PBS洗两次后，加入10000/孔到96孔板，然后分别加入相应浓度梯度的抗体，孵育20min后加入经MMC处理1小时的Raji细胞10000/孔共培养72小时。共孵育培养72小时后收集细胞培养上清，采用ELISA方法(参照试剂盒说明书：DAKEW达科为，DKW12-1020-096)检测细胞共孵育培养上清IL-2表达情况。
实验结果经统计分析，如图32-33所示。与T cells和with Raji cells组相比，单克隆抗体8D2的人源化抗体8D2H1L1、8D2H2L2、8D2H3L3、8D2H2L15和8D2H2L17均能有效地阻断CTLA4与B7的结合并提高T淋巴细胞中IL-2的表达(图32-图33)，其中，本发明人惊奇地发现，8D2H2L2、8D2H2L15、8D2H2L17显著地优于对照抗体10D1和11.2.1，其在浓度为10nM时所实现的IL-2水平与10D1或11.2.1在100nM浓度时相当甚至更优，可见，本发明的抗体能够在较低浓度例如大约为10nM时提高IL-2水平。
实施例10：单克隆抗体8D2H2L2的体内抗肿瘤活性
采用hu-SCID-raji动物模型来评价8D2H2L2的体内抗肿瘤活性。Ficoll试剂分离人人外周血单个核细胞(PBMC)后，以SEB 1μg/ml活化PBMC 3天，然后将125万活化的PBMC与500万人Burkitt淋巴瘤细胞raji与8D2H2L2(20mg/kg)混合后，皮下接种与
SCID-beige小鼠背侧，同时设同型对照组，每组5只动物。之后每周静脉注射给药一次，给药剂量为20mg/kg，连续给药3次。每周测量2次肿瘤体积至实验结束或肿瘤体积达到1000mm3。
如图34所示，8D2H2L2在hu-SCID-raji模型中可以明显抑制肿瘤生长。这个结果显示本抗体可用于临床上治疗淋巴瘤。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (21)
- 单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体包括选自下列的互补决定区(CDR)：包含氨基酸序列为SEQ ID NO：27的HCDR1，包含氨基酸序列为SEQ ID NO：28的HCDR2，以及包含氨基酸序列为SEQ ID NO：29的HCDR3；和/或包含氨基酸序列为SEQ ID NO：30的LCDR1，包含氨基酸序列为SEQ ID NO：31的LCDR2，以及包含氨基酸序列选自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的LCDR3。
- 根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：18；和/或所述单克隆抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24。
- 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体包括：(1)如SEQ ID NO：6所示的VH和如SEQ ID NO：8所示的VL；(2)如SEQ ID NO：10所示的VH和如SEQ ID NO：12所示的VL；(3)如SEQ ID NO：14所示的VH和如SEQ ID NO：16所示的VL；(4)如SEQ ID NO：18所示的VH和如SEQ ID NO：20所示 的VL；(5)如SEQ ID NO：14所示的VH和如SEQ ID NO：22所示的VL；或(6)如SEQ ID NO：14所示的VH和如SEQ ID NO：24所示的VL；具体地，SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14中的第18位的蛋氨酸独立地被选自如下的氨基酸所替代：亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或丙氨酸。
- 根据权利要求1至3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
- 根据权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的KD结合CTLA4蛋白。
- 根据权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。
- 分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，其中，所述抗体重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：27-29的CDR；具体地，所述抗体重链可变区具有SEQ ID NO：6，SEQ ID NO： 10，SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；更具体地，所述核酸分子具有SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。
- 分离的核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，其中，所述抗体轻链可变区包含：1)氨基酸序列为SEQ ID NO：30-32的CDR；2)氨基酸序列为SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：33的CDR；或3)氨基酸序列为SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：34的CDR；具体地，所述抗体轻链可变区具有SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；更具体地，所述核酸分子具有SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列。
- 一种载体，其包含权利要求7和/或8所述的分离的核酸分子。
- 一种宿主细胞，其包含权利要求7和/或8所述的分离的核酸分子，或者权利要求9所述的载体。
- 制备权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在合适的条件下培养权利要求10的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段的步骤。
- 偶联物，其包括单克隆抗体或其抗原结合片段以及偶联部分， 其中，所述单克隆抗体为权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为可检测的标记；具体地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
- 试剂盒，其包括权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包括权利要求12所述的偶联物；具体地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
- 权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CTLA4在样品中的存在或其水平。
- 一种药物组合物，其包含权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求12所述的偶联物；可选地，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
- 权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求12所述的偶联物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断肿瘤的药物中的用途；具体地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌和肝癌。
- 权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求12所述的偶联物在制备如下药物中的用途：检测样品中的CTLA4水平的药物，阻断CTLA4与B7结合的药物，调节(例如下调)CTLA4活性或CTLA4水平的药物，解除CTLA4对机体免疫抑制的药物，激活T淋巴细胞的药物，或者提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物。
- 一种在体内或体外方法，包括施加细胞以有效量的权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求12所述的偶联物的步骤，所述方法选自如下：检测样品中的CTLA4水平的方法，阻断CTLA4与B7结合的方法，调节(下调)CTLA4活性或CTLA4水平的方法物，解除CTLA4对机体免疫抑制的方法，激活T淋巴细胞的方法，或者提高T淋巴细胞中IL-2表达的方法。
- 一种预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断肿瘤的方法，包括给予受试者有效量的权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求12所述的单克隆抗体偶联物的步骤；具体地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌和肝癌。
- 根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其用于预防和/治疗和/或辅助治疗和/或诊断肿瘤；具体地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌和肝癌。
- 根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体，其用于：阻断CTLA4与B7结合，调节(例如下调)CTLA4活性或CTLA4水平，解除CTLA4对机体免疫抑制的，或者激活T淋巴细胞的药物或者提高T淋巴细胞中IL-2表达。
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