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WO2024056049A1 - 具有pH依赖性的抗CTLA4抗体或抗原结合片段 - Google Patents

具有pH依赖性的抗CTLA4抗体或抗原结合片段 Download PDF

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Publication number
WO2024056049A1
WO2024056049A1 PCT/CN2023/118987 CN2023118987W WO2024056049A1 WO 2024056049 A1 WO2024056049 A1 WO 2024056049A1 CN 2023118987 W CN2023118987 W CN 2023118987W WO 2024056049 A1 WO2024056049 A1 WO 2024056049A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
seq
acid sequence
sequence shown
variable region
Prior art date
Application number
PCT/CN2023/118987
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
崔东冰
顾津明
Original Assignee
同润生物医药(上海)有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 同润生物医药(上海)有限公司 filed Critical 同润生物医药(上海)有限公司
Publication of WO2024056049A1 publication Critical patent/WO2024056049A1/zh

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the invention belongs to the field of biomedicine, and specifically relates to a pH-dependent anti-CTLA4 antibody or antigen-binding fragment.
  • Immune checkpoints are a large class of immunosuppressive molecules, including Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 (CTLA-4). Under normal physiological conditions, immune checkpoints can regulate immune responses, prevent self-tissue damage, and are important in maintaining immune tolerance. However, during the occurrence and development of tumors, the activation and high expression of immune checkpoint molecules will inhibit the function of immune cells, weaken the ability of immune cells to kill tumor cells, and mediate tumor immune escape. Immune checkpoint blockers are treatments that improve anti-tumor immune responses by inhibiting negative regulatory signals and regulating immune cell activity.
  • CTL-4 Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4
  • CTLA-4 also known as CD152
  • CD152 is an immunosuppressive receptor expressed on T cells. It plays an inhibitory role in the proliferation of T cells and also affects related cell cycle processes and cytokines such as interleukin-2 (IL-2). ), the secretion of interferon ⁇ (IFN- ⁇ ) is also inhibited to varying degrees.
  • Ipilimumab which is already on the market, is an anti-CTLA-4 immunomodulatory monoclonal antibody (mAb). It is currently used as a single drug or in combination, in melanoma, lung cancer, kidney cancer, etc. It has been approved or conducted clinical trials for several tumor indications and achieved remarkable results.
  • ipilimumab still exhibits dose-limiting toxicities. This greatly limits the administration of higher doses for tumor treatment. Therefore, certain forms of modification of ipilimumab are needed in order to demonstrate enhanced anti-tumor activity while reducing side effects.
  • the invention provides an anti-CTLA4 antibody or antigen-binding fragment, wherein the antibody or fragment comprises a heavy chain variable region sequence of HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences and a light chain variable region sequence of LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences, in:
  • the HCDR1 has a histidine (H) residue
  • the HCDR2 has at least one histidine (H) residue
  • the HCDR3 has zero or 1 histidine (H) residue
  • the LCDR1 has at least one acidic amino acid residue
  • the LCDR2 has the same amino acid sequence as ipilimumab LCDR2;
  • the LCDR3 has the same amino acid sequence as ipilimumab LCDR3.
  • the heavy chain variable region HCDR1 contains any one of residues 31H and 32H, and the amino acid at position 35 is not H.
  • the heavy chain variable region HCDR1 includes 31H.
  • the heavy chain variable region HCDR1 includes 32H.
  • the 35th amino acid is not histidine (H).
  • the heavy chain variable region HCDR1 region includes 35A, 35G, 35V, 35L, 35I, 35F, 35W, 35Y, 35D, 35N, 35E, 35K, 35Q, 35M, Any residue among 35S, 35T, 35C, 35P, and 35R.
  • the heavy chain variable region HCDR1 region includes any one of residues 35A, 35V, 35L, 35I, 35F, 35Y, 35S, and 35N.
  • the heavy chain variable region includes 30H.
  • the heavy chain variable region wherein the heavy chain variable region HCDR1 region contains 35H.
  • the heavy chain variable region HCDR2 includes 56H residue.
  • the heavy chain variable region HCDR3 contains zero H residues.
  • the acidic amino acid residues in the light chain variable region LCDR1 are selected from aspartic acid (D) or glutamic acid (E).
  • the light chain variable region LCDR1 includes any one of the amino acid residues 24D, 26D, 28E, 31E, 33E, and 35D.
  • the antibody or fragment comprises a heavy chain variable region sequence of HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences and a light chain sequence of LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences.
  • Variable region sequence where:
  • the HCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7;
  • the HCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • the HCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the LCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
  • the LCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the LCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or fragment includes heavy chain variable region sequences of HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences and light chain variable region sequences of LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences, wherein:
  • the HCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;
  • the HCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • the HCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the LCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
  • the LCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the LCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or fragment includes heavy chain variable region sequences of HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences and light chain variable region sequences of LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences, wherein:
  • the HCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9;
  • the HCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • the HCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the LCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
  • the LCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the LCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or fragment includes heavy chain variable region sequences of HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences and light chain variable region sequences of LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences, wherein:
  • the HCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10;
  • the HCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • the HCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the LCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
  • the LCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the LCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or fragment includes heavy chain variable region sequences of HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences and light chain variable region sequences of LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences, wherein:
  • the HCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11;
  • the HCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • the HCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the LCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
  • the LCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the LCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or fragment includes heavy chain variable region sequences of HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences and light chain variable region sequences of LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences, wherein:
  • the HCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12;
  • the HCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • the HCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the LCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
  • the LCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the LCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or fragment includes heavy chain variable region sequences of HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences and light chain variable region sequences of LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences, wherein:
  • the HCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13;
  • the HCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • the HCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the LCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
  • the LCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the LCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or fragment includes heavy chain variable region sequences of HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences and light chain variable region sequences of LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences, wherein:
  • the HCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;
  • the HCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • the HCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the LCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
  • the LCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the LCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or fragment includes heavy chain variable region sequences of HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences and light chain variable region sequences of LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences, wherein:
  • the HCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15;
  • the HCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • the HCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the LCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
  • the LCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the LCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or fragment includes heavy chain variable region sequences of HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences and light chain variable region sequences of LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences, wherein:
  • the HCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16;
  • the HCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • the HCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the LCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
  • the LCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the LCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or fragment includes heavy chain variable region sequences of HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences and light chain variable region sequences of LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences, wherein:
  • the HCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16;
  • the HCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • the HCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the LCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17;
  • the LCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the LCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or fragment includes heavy chain variable region sequences of HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences and light chain variable region sequences of LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences, wherein:
  • the HCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16;
  • the HCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • the HCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the LCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18;
  • the LCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the LCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or fragment includes heavy chain variable region sequences of HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences and light chain variable region sequences of LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences, wherein:
  • the HCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16;
  • the HCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • the HCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the LCDR1 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19;
  • the LCDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • the LCDR3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or fragment comprises a heavy chain selected from the group consisting of: Variable region and light chain variable region sequence pairs:
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32;
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33;
  • the antibody or fragment comprises a heavy chain sequence and a light chain sequence selected from the following:
  • the antibody or antigen-binding fragment is a monoclonal antibody, a bispecific antibody, a multispecific antibody, a recombinant antibody, a chimeric antibody, a diavalent antibody, an anti-idiotypic antibody or a fusion protein .
  • the present invention also provides a nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment described in any of the above-mentioned items of the present invention.
  • the nucleic acid molecule of the invention is operably linked to a promoter.
  • the present invention also provides a recombinant expression vector containing the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the present invention also provides a plasmid containing the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the present invention also provides a host cell containing the nucleic acid molecule of the present invention, the recombinant expression vector of the present invention or the plasmid of the present invention.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition, including any of the above antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also provides a kit, including any of the above-mentioned antibodies of the present invention or antigen-binding fragments thereof.
  • the present invention also provides a method for treating cancer, which includes administering any of the above-mentioned antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention to a subject in need thereof.
  • Figure 1 shows the binding parameters at pH 6.0 and pH 7.4 for selected ipilimumab sequence variants of the invention.
  • the antibodies or antigen-binding fragments of the invention are preferably fully human.
  • fully human is meant that the antibody or antigen-binding fragment thereof is defined herein as being non-chimeric (eg, not “humanized”) and not derived (whether in whole or in part) from a non-human species.
  • Fully human antibodies or antigen-binding fragments thereof may be of human origin, or may be synthetic human antibodies.
  • Another example of a fully human antibody or antigen-binding fragment thereof is a human antibody encoded by a nucleic acid isolated from a library of antibody sequences of human origin (eg, such a library based on antibodies drawn from natural human sources).
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is a monoclonal antibody, bispecific antibody, multispecific antibody, recombinant antibody, chimeric antibody, diavalent antibody, anti-idiotype antibody or fusion protein.
  • the invention also provides antibodies or antigen-binding fragments capable of binding CTLA4, which are bispecific antibodies or bispecific antigen-binding fragments.
  • the bispecific antibodies or bispecific antigen-binding fragments can be isolated.
  • the term "bispecific” refers to the ability of an antigen-binding molecule to specifically bind at least two different antigenic determinants.
  • the bispecific antibodies and bispecific antigen-binding fragments comprise antigen-binding fragments according to the invention.
  • the bispecific antibodies and bispecific antigen-binding fragments comprise antigen-binding fragments capable of binding to CTLA4, wherein the antigen-binding fragments capable of binding to CTLA4 comprise antigen-binding fragments according to the invention.
  • the bispecific antibodies and bispecific antigen-binding fragments comprise an antigen-binding fragment capable of binding to CTLA4, and an antigen-binding fragment capable of binding to another target protein.
  • the bispecific antibody or antigen-binding fragment comprises an antigen-binding molecule capable of binding CTLA4 and an antigen-binding molecule capable of binding other than CTLA4.
  • the antigen other than CTLA4 is an immune cell surface molecule.
  • the antigen other than CTLA4 is a cancer cell antigen.
  • the antigen other than CTLA4 is a receptor molecule, such as a cell surface receptor.
  • the invention provides nucleic acids encoding said monoclonal antibodies or antigen-binding fragments or bispecific antibodies or chimeric antigen receptors.
  • the invention provides plasmids comprising the nucleic acids, optionally operably linked to regulatory sequences, such as promoters, enhancers, etc.
  • the invention provides host cells comprising the plasmid, and methods for producing and optionally recovering the monoclonal antibody or antigen-binding fragment or bispecific antibody or chimeric antigen receptor.
  • the host cell of the present invention can be any prokaryotic or eukaryotic cell, including but not limited to bacterial cells (such as Escherichia coli, Bacillus subtilis), insect cells (such as using baculovirus expression systems), yeast or mammalian cells (such as CHO or BHK cell lines). Other suitable host cells are known to those skilled in the art.
  • bacterial cells such as Escherichia coli, Bacillus subtilis
  • insect cells such as using baculovirus expression systems
  • yeast or mammalian cells such as CHO or BHK cell lines.
  • Other suitable host cells are known to those skilled in the art.
  • the disease described in the present invention is cancer, including but not limited to lymphoma, blastoma, sarcoma (including liposarcoma), neuroendocrine tumors, mesothelioma, schwannoma, meningioma, adenoma, and melanoma. and nonleukemic leukemias or lymphoid malignancies.
  • squamous cell carcinoma e.g., squamous cell carcinoma
  • lung cancer small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, and lung squamous cell carcinoma
  • peritoneal cancer hepatocellular carcinoma
  • gastric cancer e.g., gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, endometrial or uterine cancer, salivary gland cancer , kidney cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver cancer, anal cancer, penis cancer, testicular cancer, esophageal cancer, bile duct tumors, head cancer, neck cancer, bone marrow stromal tumor, osteoclastoma, multiple Myeloma, osteolytic bone cancers, central nervous system tumors, brain tumors (glioma, neuroblastoma,
  • the antibodies or antigen-binding fragments or bispecific antibodies or chimeric antigen receptors or nucleic acid molecules thereof, plasmids or cells expressing the chimeric antigen receptors, and pharmaceutical compositions of the present invention can be administered through various different routes of administration.
  • the route of administration will generally depend on the characteristics of the disease being treated.
  • the methods of the present invention may be carried out using any medically acceptable mode of administration, including oral, rectal, topical, intraocular, intracisternal, intracerebroventricular, intratracheal, intranasal instillation.
  • Infusion transdermal, subcutaneous, intrathecal, intramuscular, intraperitoneal, intraperitoneal, intracranial infusion or intravenous infusion.
  • Antibody as used herein means a protein consisting of one or more polypeptides encoded by substantially all or part of a recognized immunoglobulin gene.
  • the recognized immunoglobulin genes include the kappa ( ⁇ ), lambda ( ⁇ ) and heavy chain loci, which contain numerous variable region genes and encode IgM, IgD, IgG and IgE respectively. and IgA isotype constant region genes mu( ⁇ ), delta( ⁇ ), gamma ( ⁇ ), epsilon( ⁇ ), alpha( ⁇ ).
  • Antibodies as used herein are meant to include full-length antibodies and antibody fragments, as well as natural antibodies from any organism, engineered antibodies, or recombinantly produced antibodies for experimental, therapeutic purposes, or other purposes as further specified below.
  • the term “antibody” includes antibody fragments, as are known in the art, such as Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv or other antigen-binding subsequences of an antibody, or by modifying the intact antibody or using recombinant DNA technology Antibody fragments produced by de novo synthesis of those antibodies.
  • the term “antibody” includes monoclonal as well as polyclonal antibodies.
  • Antibodies can be antagonists, agonists, neutralizing antibodies, or inhibitory antibodies, or stimulatory antibodies.
  • the antibodies of the invention may be non-human antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies or fully human antibodies.
  • monoclonal antibody refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, i.e., the population comprising a single antibody is identical except for possible mutations (eg, natural mutations) that may be present in very small amounts. of. Therefore, the term “monoclonal” indicates the nature of the antibody, that is, it is not a mixture of discrete antibodies. In contrast to polyclonal antibody preparations, which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), monoclonal antibody preparations have each monoclonal antibody directed against a single determinant on the antigen.
  • monoclonal antibody preparations are generally not contaminated by other immunoglobulins.
  • the term "monoclonal” should not be understood as requiring that the antibody be produced by any particular method.
  • the term monoclonal antibody specifically includes fully human antibodies. (ref CN201280067865-anti-FGFR2 antibodies and their uses-approval authorization).
  • complementarity determining region refers to the amino acid residues of the variable region of an antibody, the presence of which is necessary for antigen binding.
  • the "antigen-binding region” of an antibody is typically found in one or more hypervariable regions of the antibody, such as the CDR regions of CDR1, CDR2, and CDR3.
  • Each complementarity-determining region may comprise amino acid residues from a "complementarity-determining region” as defined by Kabat, for example, residues 24-34 (L1), 50-56 (L2) and 89- in the light chain variable region.
  • the numbering of the CDR region in this article adopts Kabat numbering.
  • “31H”, “32H”, “amino acid at position 35", etc. described herein refer to the amino acid at position 31 according to Kabat numbering. Histidine, histidine at position 32, amino acid at position 35.
  • Variable regions and CDRs in antibody sequences can also be determined according to other general rules that have been developed in the art. (e.g. Chothia, IMGT, Contact numbering system, etc.) or by comparing the sequence to a database of known variable regions. Methods for identifying these regions are described in Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 and Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000.
  • Antigen as used herein means a compound, composition or substance that can stimulate antibody production or T cell response in an animal, including compositions injected or absorbed into the animal, which can be a protein, carbohydrate, lipid or other Pathogens.
  • a “functional fragment” or "antigen-binding fragment” of an antibody/immunoglobulin is defined herein as a fragment of an antibody/immunoglobulin that retains the antigen-binding region (eg, the variable region of an IgG).
  • the "antigen-binding region" of an antibody is typically found in one or more hypervariable regions of the antibody, such as the CDR1, -2, and/or -3 regions; however, variable “framework” regions can also play an important role in antigen binding , for example by providing a CDR scaffold.
  • the "antigen binding region” includes at least amino acid residues 4-103 of the variable light chain (VL) and amino acid residues 5-109 of the variable heavy chain (VH), more preferably amino acid residue 3 of the VL -107 and amino acid residues 4-111 of VH, and the complete VL and VH chains are particularly preferred (amino acid residues 1-109 of VL and amino acids 1-113 of VH; numbering according to WO97/08320).
  • Preferred immunoglobulins for use in the present invention are IgG.
  • amino acid means one of the 20 naturally occurring amino acids or any of the non-natural analogs, which may be at a specifically specified position.
  • Protein as used herein means at least two covalently linked amino acids, which includes proteins, polypeptides, oligopeptides and peptides. Proteins may be composed of naturally occurring amino acids and peptide bonds, or they may be composed of synthetic peptidomimetic structures, known as “analogs.”
  • Amino acid or “peptide residue” as used herein therefore means both naturally occurring and synthetic amino acids. For example, homophenylalanine, citrulline and norleucine are considered amino acids for the purposes of the present invention.
  • Amino acid also includes imino acid residues such as proline and hydroxyproline.
  • Side chains can be in the (R) or (S) configuration.
  • the amino acids are present in the (S) or L-configuration. If non-naturally occurring side chains are used, non-amino acid substitutions may be used, for example, to prevent or delay degradation in vivo.
  • Identity means similarity between nucleotide or amino acid sequences, otherwise known as sequence identity. Sequence identity is usually measured in terms of percent identity (or similarity or homology); the higher the percent, the more similar the two sequences are. Homologs or variants will have a relatively high degree of sequence identity when aligned using standard methods. Sequence alignment methods for comparison are well known in the art. various programs and Quasi-algorithms are described in: Smith and Waterman, Adv Appl. Math., 2:482, 1981; Needlema and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLASTTM) (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990.) is available from several sources, including the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, Md. ) and are available on the Internet for the sequence analysis programs blastp, blastn, blastx, tblastn and tblastx.
  • Nucleic acid as used herein means composed of nucleotide units (ribonucleotides, deoxyribonucleotides, related naturally occurring structural variants and their synthetic non-naturally occurring analogs) through phosphodiester bonds composed of polymers.
  • nucleotide polymers in which the nucleotides and the bonds between them include non-naturally occurring synthetic analogs such as, but not limited to, phosphorothioates, phosphoramidates, methyl phosphates, chiral Methyl phosphate, 2'-O-methylribonucleotide, peptide nucleic acid (PNA), etc.
  • these polynucleotides can be synthesized using an automated DNA synthesizer.
  • oligonucleotide generally refers to short polynucleotides, usually no greater than about 50 nucleotides. It will be understood that when a nucleotide sequence is represented by a DNA sequence (ie A, T, G, C), this also includes an RNA sequence in which "U” is substituted for "T” (ie A, U, G, C).
  • This article uses conventional symbols to describe nucleotide sequences: the left-hand 5' end of a single-stranded nucleotide sequence; the left-hand direction of a double-stranded nucleotide sequence is called the 5' direction.
  • the direction in which 5' to 3' nucleotides are added to the nascent RNA transcript is called the direction of transcription.
  • the DNA strand with the same sequence as the mRNA is called the coding strand.
  • coding means the inherent properties of a specific nucleotide sequence in a polynucleotide, such as a gene, cDNA, or mRNA, used in the synthesis of other polymers and macromolecules in biological processes with a defined nucleotide sequence.
  • the coding strand (whose nucleotide sequence is identical to the mRNA sequence and is usually provided in sequence listings) and the non-coding strand (used as a transcription template, gene or cDNA) can be referred to as coding proteins. or other products of the gene or cDNA.
  • a "nucleotide sequence encoding an amino acid sequence” includes all nucleotide sequences that are degenerate forms of each other and encode the same amino acid sequence. Nucleotide sequences encoding proteins and RNA may include introns.
  • Plasmid used in this article means human-made plasmids based on natural plasmids to adapt to laboratory operations. Artificially constructed plasmid. Nucleic acid molecules can be introduced into a host cell, thereby producing a transformed host cell.
  • the vector may include nucleic acid sequences that permit its replication in the host cell, such as an origin of replication, and may also include one or more selectable marker genes and other genetic elements known in the art.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” as used herein means conventional pharmaceutically acceptable carriers. Remington's Pharmaceutical Sciences, EW Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15th ed. (1975), describes compositions suitable for pharmaceutical delivery of one or more therapeutic compounds or molecules (e.g., one or more antibodies) and preparations, as well as additional pharmaceutical agents.
  • diagnosis means determining the patient's condition and its progression after examining the patient.
  • Preventing means inhibiting its complete progression.
  • Treatment means therapeutic intervention to ameliorate the signs or symptoms of a disease or pathological condition after it has begun to develop.
  • administering means selecting a suitable route to introduce the substance into the subject. For example, if the chosen route is intravenous, the composition is administered by introducing the substance into the subject's vein.
  • Effective prophylactic/therapeutic dose means an amount of a particular agent sufficient to achieve the desired effect in a subject treated with the agent.
  • the precise dosage will depend on the purpose of treatment and can be determined by one skilled in the art using well-known techniques.
  • the dosage range may be 0.01-100 mg/kg body weight or greater, such as 0.1, 1, 10 or 50 mg/kg body weight, preferably 1-10 mg/kg.
  • the effects of antibody or Fc fusion degradation, systemic or local delivery, and new protease synthesis rates as well as age, weight, general health, sex, diet, timing of administration, drug interactions, and disease The extent to which adjustments may be necessary can be determined by routine experimentation by those skilled in the art.
  • Such agents include monomeric Fc domain molecules described herein.
  • this may be an amount of HIV-specific monomeric Fc domain (or HIV-specific CH3 domain molecule) used to prevent, treat or ameliorate HIV infection.
  • a therapeutically effective amount of antibody is an amount sufficient to prevent, treat, or ameliorate an infection or disease, such as caused by HIV infection in a subject, without causing significant cytotoxic effects in the subject.
  • the therapeutically effective amount of the agent used to prevent, ameliorate and/or treat a subject will depend on the subject being treated, the type and severity of suffering, and the manner in which the therapeutic composition is administered.
  • Cancer refers to solid tumors or hematogenous cancers.
  • the solid tumor of the present invention is a sarcoma or carcinoma, such as fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteosarcoma, or another sarcoma, synovial tumour, mesothelioma, Ewing's tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon cancer, lymphoid malignancies, pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, hepatocellular carcinoma, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, Adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinoma, medullary carcinoma, bronchial carcinoma, renal cell carcinoma, hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma, choriocarcinoma, Wil
  • the blood-borne cancer described in the present invention is leukemia, such as acute leukemia (such as acute lymphoblastic leukemia, acute myeloid leukemia, acute myeloid leukemia and myeloblasts, promyelocytes, myelomonocytes, monocytes and erythroleukemia); chronic leukemias (such as chronic myelogenous (granulocytic) leukemia, chronic myelogenous leukemia, and chronic lymphocytic leukemia), polycythemia vera, lymphoma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma (indolent and advanced forms), multiple myeloma, Waldenstrom's macroglobulinemia, heavy chain disease, myelodysplastic syndrome, hairy cell leukemia, or myelodysplasia.
  • acute leukemia such as acute lymphoblastic leukemia, acute myeloid leukemia, acute myeloid leukemia and myeloblast
  • Antibodies herein include all classes of antibodies (i.e. IgA, IgD, IgE, IgG and IgM) and all subclasses (i.e. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2).
  • the antibodies may be chimeric, humanized or fully human monoclonal antibodies.
  • Antibodies usually contain a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL).
  • VH and VL regions can be further divided into hypervariable regions separated by relatively conserved regions called framework regions (FR). complementary decision designated area (CDR)).
  • FR framework regions
  • CDR complementary decision designated area
  • Each VH and VL consists of 3 CDRs and 4 FRs in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 from N-terminus to C-terminus.
  • the variable regions (VH and VL) of each heavy chain/light chain pair respectively form the antigen binding site.
  • CDRs are known to be responsible for antigen binding, however, it has been found that not all 6 CDRs are essential or unchangeable.
  • one or more CDRs can be replaced or altered or modified while still substantially retaining or even improving the specific binding affinity for CTLA4.
  • the heavy chain CDR3 region is located in the center of the antigen-binding site and is therefore thought to have the most contact with the antigen and provide the most free energy for the affinity of the antibody to the antigen. It is also believed that heavy chain CDR3 is by far the most diverse CDR among antigen-binding sites in terms of length, amino acid composition, and conformation through various diversification mechanisms (Tonegawa S. Nature. 302:575-81). Diversity in heavy chain CDR3 is sufficient to generate most antibody specificities (Xu JL, Davis MM. Immunity. 13:37-45) as well as the required antigen binding affinity (Schier R et al., J Mol Biol. 263:551-67 ).
  • the antibody, or antigen-binding portion thereof comprises a heavy chain CDR3 (HCDR3) that includes or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:3.
  • the antibody or antigen-binding portion thereof comprises: a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • the antibody or antigen-binding portion thereof comprises: a heavy chain CDR1 comprising an amino acid sequence selected from any one of SEQ ID NO: 7-16, an amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Heavy chain CDR2, heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3, light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5 and SEQ ID NO :6 amino acid sequence of light chain CDR3.
  • a heavy chain CDR1 comprising an amino acid sequence selected from any one of SEQ ID NO: 7-16, an amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • Heavy chain CDR2 heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3
  • light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4
  • light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5 and SEQ ID NO :6 amino acid sequence of light
  • the antibody or antigen-binding portion thereof comprises: a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • the antibody or antigen-binding portion thereof comprises: a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 :The heavy chain CDR3 of the amino acid sequence of 3, comprising any one selected from SEQ ID NO:4 and 17-19
  • the antibody, or antigen-binding portion thereof comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL):
  • the VH includes: (i) the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 22-31; or (ii) at least 85%, An amino acid sequence that is 90% or 95% identical and retains specific binding affinity for CTLA4 in combination with the VL region; and
  • the VL includes: (i) the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 21 and 32-35; or (ii) the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 21 and 32-35 Amino acid sequences that are at least 85%, 90%, or 95% identical and that in combination with the VH region retain specific binding affinity for CTLA4.
  • the above-described variants of at least 85%, 90% or 95% identical amino acid sequences comprise mutations that occur in the framework region rather than the CDR region, for example in the framework region there are one or more (e.g. 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10) addition, deletion and/or substitution of amino acids.
  • the substitutions are conservative substitutions.
  • conservative substitution refers to amino acid substitutions that do not adversely affect or alter the essential properties of the protein/polypeptide comprising the amino acid sequence.
  • conservative substitutions can be introduced by standard techniques known in the art, such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis.
  • Conservative amino acid substitutions include substitutions in which an amino acid residue is replaced by another amino acid residue with a similar side chain, such as a physically or functionally similar residue (e.g., having similar size, shape, charge, chemical properties, including formation of covalent bonds or hydrogen bonding ability, etc.) to the corresponding amino acid residue. Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art.
  • amino acids with basic side chains such as lysine, arginine, and histidine
  • amino acids with acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acids with non-polar side chains such as alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine
  • amino acids with ⁇ -branched side chains e.g., threonine, valine, isoleucine
  • amino acids with aromatic side chains e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine.
  • the corresponding amino acid residue is preferably replaced by another amino acid residue from the same side chain family.
  • Methods for identifying conservative substitutions of amino acids are well known in the art (see, eg, Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); and Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997), which are incorporated herein by reference).
  • the antibodies and antigen-binding fragments provided herein may further comprise a human IgG constant region comprising an Fc region and optionally a hinge region.
  • the human IgG constant region may be a human IgGl, IgG2, IgG3 or IgG4 constant region.
  • the antibody comprises a human IgGl or IgG4 Fc region.
  • the Fc region may be a wild-type Fc region, or the Fc region may contain one or more amino acid modifications (eg, Leu234Ala/Leu235Ala or LALA substitutions) that alter antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) or other effector function.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • the Fc modifications comprise LALA mutations, namely mutations according to EU numbering L234A and L235A of Kabat et al.
  • LALA mutations are probably the most commonly used mutations that disrupt antibody effector function, such as eliminating Fc binding to specific Fc ⁇ Rs and reducing ADCC activity mediated by PBMCs and monocytes.
  • Non-limiting examples of Fc modifications also include, for example, in the case involving the human IgG4 Fc region, mutation of serine (“S") at position 228 of the amino acid sequence to proline (“P").
  • S228P mutation reduces Fab arm exchange by stabilizing disulfide bonds in the core hinge of the IgG4 molecule and is therefore an IgG4 stabilizing mutation that helps prevent the formation of half-antibodies.
  • residue numbering system or "EU index” is typically used (eg, the EU index reported by Kabat et al., supra). Therefore, reference to residue numbering in an antibody constant domain refers to the residue numbering by the EU numbering system.
  • Antibody variable region amino acid sequence is amino acid sequence:
  • Example 1 Preparation of recombinant antibodies of the present invention
  • Dialysis Aspirate the high-concentration protein into the dialysis bag and place it in a beaker with 1XPBS for dialysis.
  • Preparation for the installation of the electrophoresis tank take out the glued glass clip and put it into the electrode holder. With the short glass facing the direction of the red electrode strip, put the electrode holder into the motor base and turn on the switch. Take out the glued glass clip and put it into the electrode holder. With the short glass facing the direction of the electrode's red adhesive strip, put the electrode holder into the motor base and turn on the switch. Place the base into the electrophoresis tank, and add electrophoresis buffer to the middle of the electrode frame until it is 1cm above the stacking gel. Then add electrophoresis buffer into the electrophoresis tank until the liquid level reaches the top of the stacking gel.
  • Samples of reducing gum are heated at 99°C for 6 minutes; samples of non-reducing gum are heated at 99°C for 3 minutes.
  • Electrophoresis conditions 180v, 45min
  • Protein staining instrument dyeing and destaining time is 15 minutes.
  • Gel imager Set the parameters to white light and take pictures.
  • sample positive control solution 2 times the concentration of the test solution + endotoxin standard (0.24EU/ml), mixed at 1:1
  • Example 2 pH dependence of binding parameters of ipilimumab variants of the invention
  • Figure 1 shows the pH-dependent binding parameters of various antibodies of the invention as a function of pH.
  • IPD52 is the control antibody ipilimumab
  • IPD53-IPD66 are ipilimumab variants.
  • the antibodies of the invention have higher binding (lower EC50 or higher OD450) under the acidic conditions of the tumor microenvironment than under neutral conditions.

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Abstract

提供了一种在不同pH条件下与CTLA4抗原具有不同结合常数的抗CTLA4抗体或抗原结合片段。与在中性条件下相比，在肿瘤微环境的酸性条件下，抗CTLA4抗体具有更高的结合常数。抗CTLA4抗体或抗原结合片段具有针对肿瘤增强的治疗效果。

Description

具有pH依赖性的抗CTLA4抗体或抗原结合片段
交叉引用
本申请要求2022年9月16日提交的中国专利申请号202211128540.9的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，涉及一种具有pH依赖性的抗CTLA4抗体或抗原结合片段。
背景技术
免疫检查点是一大类免疫抑制类分子，包括细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)。在正常的生理状态下，免疫检查点可以调节免疫应答、防止自身组织损伤，以及对于维持免疫耐受具有重要的意义。但是在肿瘤发生发展过程中，免疫检查点分子的活化和高表达会抑制免疫细胞的功能，减弱免疫细胞细胞对肿瘤细胞的杀伤能力从而介导肿瘤免疫逃逸。免疫检查点阻滞剂就是通过抑制负调节信号，调节免疫细胞活性来提高抗肿瘤免疫反应的治疗方法。
其中，CTLA-4又名CD152，是T细胞上表达的一种免疫抑制性受体，在T细胞增殖过程中起抑制作用，同时对相关细胞周期进程和细胞因子如白介素-2(IL-2)，干扰素γ(IFN-γ)的分泌也有不同程度的抑制。已上市的Ipilimumab(伊匹单抗)是一种抗CTLA-4免疫调节的单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)，目前以单药或联用的形式，在黑色素瘤，肺癌，肾癌等多个肿瘤适应症上获批或进行临床试验，并取得显著成效。
尽管在临床上取得了很好的效果，但伊匹单抗仍表现出剂量限制性毒性。这极大限制了肿瘤治疗的更高剂量给药。由此，需要对伊匹单抗进行一定的形式的改造，以期其展现出增强的抗肿瘤活性，同时减少副作用。
发明内容
本发明提供了一种抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
(1)所述的HCDR1具有一个组氨酸(H)残基；
(2)所述的HCDR2具有至少一个组氨酸(H)残基；
(3)所述的HCDR3具有零或1个组氨酸(H)残基；
(4)所述的LCDR1具有至少一个酸性氨基酸残基；
(5)所述的LCDR2具有与伊匹单抗LCDR2一致的氨基酸序列；
(6)所述的LCDR3具有与伊匹单抗LCDR3一致的氨基酸序列。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的重链可变区HCDR1包含31H、32H中的任意一种残基，并且第35位氨基酸不为H。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的重链可变区HCDR1包含31H。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的重链可变区HCDR1包含32H。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的重链可变区HCDR1区，其中第35位氨基酸不为组氨酸(H)。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的重链可变区HCDR1区包含35A、35G、35V、35L、35I、35F、35W、35Y、35D、35N、35E、35K、35Q、35M、35S、35T、35C、35P、35R中的任意一种残基。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的重链可变区HCDR1区包含35A、35V、35L、35I、35F、35Y、35S、35N中的任意一种残基。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的重链可变区包含30H。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的重链可变区，其中，所述的重链可变区HCDR1区包含35H。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的重链可变区HCDR2包含56H残基。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的重链可变区HCDR3包含零个H残基。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的轻链可变区LCDR1中的酸性氨基酸残基选自天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的轻链可变区LCDR1包含24D、26D、28E、31E、33E、35D中的任意一种氨基酸残基。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链 可变区序列，其中：
(1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；
(2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
(5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
(6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
(1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；
(2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
(5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
(6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
(1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；
(2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
(5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
(6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。在本发明的一些技术方案中，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
(1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；
(2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
(5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
(6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
(1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
(2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
(5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
(6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
(1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；
(2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
(5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
(6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
(1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；
(2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
(5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
(6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
(1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；
(2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
(5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
(6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
(1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；
(2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
(5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
(6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
(1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；
(2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
(5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
(6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
(1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；
(2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；
(5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
(6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
(1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；
(2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；
(5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
(6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
(1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；
(2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；
(5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
(6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述抗体或片段包含选自以下的重链可 变区和轻链可变区序列对：
(1)包含有SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(2)包含有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(3)包含有SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(4)包含有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(5)包含有SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(6)包含有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(7)包含有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(8)包含有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(9)包含有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(10)包含有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(11)包含有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(12)包含有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(13)包含有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(14)包含有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述抗体或片段包含选自以下的重链序列和轻链序列：
(1)包含有SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
(2)包含有SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
(3)包含有SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
(4)包含有SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
(5)包含有SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
(6)包含有SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
(7)包含有SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
(8)包含有SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
(9)包含有SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
(10)包含有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
(11)包含有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列的轻链；
(12)包含有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列的轻链；
(13)包含有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的轻链；
(14)包含有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO： 51所示的氨基酸序列的轻链。
在本发明的优选技术方案中，所述的抗体或抗原结合片段为单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、重组抗体、嵌合抗体、双价抗体、抗独特型抗体或融合蛋白。
除此之外，本发明还提供了一种核酸分子，其编码本发明上述任一项所述的抗体或抗原结合片段。
优选地，本发明所述的核酸分子，可操作地连接至启动子。
除此之外，本发明还提供了一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含有本发明所述的核酸分子。
除此之外，本发明还提供了一种质粒，含有本发明所述的核酸分子。
除此之外，本发明还提供了一种宿主细胞，含有本发明所述的核酸分子、本发明所述的重组表达载体或本发明所述的质粒。
除此之外，本发明还提供了一种药物组合物，包括本发明上述任一项的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
除此之外，本发明还提供了一种试剂盒，包括本发明上述的任一项的抗体或其抗原结合片段。
除此之外，本发明还提供了一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的对象施用本发明上述的任一项的抗体或其抗原结合片段。
附图说明：
图1显示了本发明的选择的伊匹单抗序列变体在pH 6.0和pH 7.4下的结合参数。
术语定义：
本发明所述的抗体或抗原结合片段优选是全人源的。所述全人源是指抗体或其抗原结合片段在本文中被定义为是非嵌合的(例如，非“人源化的”)并且不来自(无论是整体还是部分)非人物种。全人源抗体或其抗原结合片段可源自人，或者可以为合成的人抗体。全人源抗体或其抗原结合片段的另一个实例是从人来源的抗体序列的文库(例如，基于采自人天然来源的抗体的这种文库)中分离的核酸所编码的人抗体。
本发明的抗体或其抗原结合片段，其为单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、重组抗体、嵌合抗体、双价抗体、抗独特型抗体或融合蛋白。
本发明还提供了能够结合CTLA4的抗体或抗原结合片段，其是双特异性抗体或双特异性抗原结合片段。在一些实施方式中，所述双特异性抗体或双特异性抗原结合片段可以被分离。术语“双特异性”是指抗原结合分子能够特异性结合至少两个不同的抗原决定簇。在一些实施方式中，所述双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包含根据本发明的抗原结合片段。在一些实施方式中，所述双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包含能够与CTLA4结合的抗原结合片段，其中能够与CTLA4结合的抗原结合片段包含根据本发明的抗原结合片段。在一些实施方式中，所述双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包含能够与CTLA4结合的抗原结合片段，和能够与另一靶蛋白结合的抗原结合片段。在一些实施方式中，所述双特异性抗体或抗原结合片段包含能够结合CTLA4的抗原结合分子和能够结合CTLA4以外的抗原结合分子。在一些实施方式中，CTLA4以外的抗原是免疫细胞表面分子。在一些实施方式中，CTLA4以外的抗原是癌细胞抗原。在一些实施方式中，CTLA4以外的抗原是受体分子，例如细胞表面受体。
本发明提供了编码所述单克隆抗体或抗原结合片段或双特异性抗体或嵌合抗原受体的核酸。本发明提供了包含所述核酸的质粒，任选地，可操作地连接调控序列，如启动子、增强子等。本发明提供了包含该质粒的宿主细胞，以及用于生产和任选地回收该单克隆抗体或抗原结合片段或双特异性抗体或嵌合抗原受体的方法。本发明所述宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞，包括但不限于细菌细胞(例如大肠杆菌、枯草杆菌)、昆虫细胞(例如利用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞(例如CHO或BHK细胞系)。其它合适的宿主细胞为本领域技术人员所知。
优选的，本发明所述疾病为癌症，包括但不限于淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤(包括脂肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺瘤、黑素瘤以及非白血性白血病或淋巴恶性肿瘤。上述癌症更具体的实例包括鳞状细胞癌(如，鳞状上皮细胞癌)、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌以及肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆管肿瘤，头癌、颈癌、骨髓基质瘤、破骨细胞瘤、多发 性骨髓瘤、溶骨性癌(osteolytic bone cancers)、中枢神经系统肿瘤、脑肿瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜细胞瘤和视网膜成神经细胞瘤)、鼻咽癌、基底细胞癌、胆管癌、卡波氏肉瘤、原发性肝癌或子宫内膜癌、以及血管系统肿瘤(血管肉瘤和hemagiopericytoma)、血液瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤(Burkitt’s淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞性白血病、蕈样肉芽肿病、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性巨大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞性白血病以及淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞肿瘤、B细胞急性成淋巴细胞性非白血性白血病/淋巴瘤、T细胞急性成淋巴细胞性非白血性白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞肿瘤、外周T细胞非白血性白血病、成熟T细胞非白血性白血病/T细胞淋巴瘤、大颗粒状淋巴细胞性白血病、朗罕氏细胞组织细胞增多症、急性骨髓性粒细胞性白血病的骨髓瘤，成熟的急性骨髓性白血病(AML)、分化的急性骨髓性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、脊髓发育不良综合征、慢性骨髓增生病，慢性髓细胞性白血病、血液恶性肿瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)。在一些实施方案中，所述癌症选自CTLA4相关的癌症。所述癌症可以选自例如黑色素瘤、肺癌、肾癌、前列腺癌、肝癌。
本发明的抗体或抗原结合片段或双特异性抗体或嵌合抗原受体或其核酸分子、质粒或表达该嵌合抗原受体的细胞、以及药用组合物可以通过各种不同的给药途径给予人或动物受试者，所述给药途径通常取决于待治疗的疾病本身的特征。一般而言，可利用医学上可接受的任何给药模式来实施本发明的方法，所述给药模式包括经口、直肠、局部、眼内、脑池内、脑室内、气管内、鼻内滴入、透皮、皮下、鞘内、肌内、腹腔、腹膜内、颅内输注或者静脉输注。
为了能更彻底地理解发明，以下列出一些定义。上述定义意在包含语法等同成分。
本文中“抗体”意指由基本上为公认的免疫球蛋白基因的全部或部分所编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。所述公认的免疫球蛋白基因，例如在人中，包括kappa(κ)、lambda(λ)和重链基因座，其中包含了无数的可变区基因，以及分别编码IgM、IgD、IgG、IgE和IgA同种型的恒定区基因mu(μ)、delta(δ)、gamma (γ)、epsilon(ε)、alpha(α)。本文中的抗体意指包括全长抗体和抗体片段，以及来自任意生物体的天然抗体，工程抗体，或为试验、治疗目的或其它如下所进一步规定的目的而重组产生的抗体。术语“抗体”包括抗体片段，为本领域所公知，诸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv，scFv或抗体的抗原结合的其它亚序列，或通过修饰完整抗体或使用重组DNA技术重新合成的那些抗体而产生的抗体片段。术语“抗体”包括单克隆以及多克隆抗体。抗体可以是拮抗剂、激动剂、中和性抗体、或抑制性抗体、或刺激性抗体。本发明的抗体可以是非人抗体，嵌合抗体，人源化抗体或完全人抗体。
本文使用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即，所述包含单一抗体的群体除了可能以极少量存在的可能突变(例如天然突变)之外是相同的。因此，所述术语“单克隆”表明所述抗体的性质，即不是不相关(discrete)抗体的混合物。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体均针对抗原上的单独一个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制剂的优点在于它们通常不会被其他免疫球蛋白污染。所述术语“单克隆”不应被理解为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。所述术语单克隆抗体具体地包括全人源抗体。(ref CN201280067865-抗FGFR2的抗体及其用途-审定授权)。
用于本文时术语“互补决定区”(CDR，例如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的氨基酸残基，互补决定区的存在对于抗原结合来说是必需的。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体的一个或多个高变区中，例如CDR1、CDR2和CDR3的CDR区域。每个互补决定区可包含来自如Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基，例如，轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区中的26-33(H1)、51-57(H2)和96-105(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immulological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,1991)。在一些实施方案中，本文中CDR区的编号方式采用Kabat编号，例如，本文所述的“31H”、“32H”、“第35位氨基酸”等分别指的是按照Kabat编号在第31位的组氨酸、第32位的组氨酸、第35位的氨基酸。
抗体序列中的可变区和CDR还可以根据本领域已经开发的其它一般规则 (例如Chothia、IMGT、Contact编号系统等)或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。在Kontermann和Dubel编,Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001和Dinarello等人,Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000中描述了鉴定这些区域的方法。
本文中使用的“抗原”意指可以在动物体内刺激抗体产生或T细胞反应的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物体内的组合物，可以是蛋白质、糖类、脂质或其它病原体。
抗体/免疫球蛋白的“功能片段”或“抗原结合片段”在本文中被定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体的一个或多个高变区中，例如CDR1、-2和/或–3区；然而，可变“框架”区也可以在抗原结合中起重要作用，例如通过提供CDR的支架。优选地，所述“抗原结合区”至少包括可变轻链(VL)的氨基酸残基4-103和可变重链(VH)的氨基酸残基5-109，更优选VL的氨基酸残基3-107和VH的氨基酸残基4-111，并且特别优选完整的VL和VH链(VL的氨基酸第1-109位和VH的氨基酸第1-113位；编号根据WO97/08320进行)。本发明中使用的优选的免疫球蛋白类为IgG。
本文中使用的“氨基酸”意指20种天然存在的氨基酸之一或任一非天然类似物，它们可位于具体规定的位置。本文中“蛋白质”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。蛋白质可由天然存在的氨基酸和肽键构成，或由合成的肽模拟物结构构成，该肽模拟物即“类似物”。因此本文中使用的“氨基酸”或“肽残基”意指天然存在和合成的氨基酸。举例来说，对于本发明目的而言，高苯基丙氨酸、瓜氨酸和降亮氨酸被认为是用于本发明目的的氨基酸。“氨基酸”也包括诸如脯氨酸和羟脯氨酸的亚氨基酸残基。侧链可以是(R)或(S)构型。在优选的实施方案中，氨基酸以(S)或L-构型存在。如果使用非天然存在的侧链，可使用非氨基酸取代，例如以阻止或延迟体内降解。
本文中使用的“一致性”意指核苷酸或氨基酸序列之间的相似性，或者称为序列同一性。序列同一性通常根据百分比同一性(或相似性或同源性)来衡量；百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法比对时，同源物或变体将具有相对高程度的序列同一性。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。各种程序和对 准算法描述于：Smith and Waterman，Adv Appl.Math.，2:482,1981；Needlema and Wunsch，J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988；Higgins and Sharp，Gene 73：237-244，1988；Higgins and Sharp，CABIOS 5：151-153，1989；Corpet等，Nucleic Acids Research 16：10881-10890,1988；和Altschul等，Nature Genet.，1994,6：119-129。
可从若干来源获得NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST TM)(Altschul等，J.Mol.Biol.，215：403-410,1990。)，包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，Md.)和在因特网上有关用于序列分析程序blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx。
本文所使用的“核酸”意指由核苷酸单元(核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物)通过磷酸二酯键组成的聚合物。因此，该术语包括核苷酸聚合物，其中核苷酸和它们之间的键包括非天然存在的合成类似物，例如但不限于硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，甲基磷酸酯，手性甲基磷酸酯，2'-O-甲基核糖核苷酸，肽核酸(PNA)等。例如，可以使用自动DNA合成仪合成这些多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常是指短多核苷酸，通常不大于约50个核苷酸。应当理解，当核苷酸序列由DNA序列(即A，T，G，C)表示时，这也包括其中“U”取代“T”的RNA序列(即A，U，G，C)。
本文使用常规符号来描述核苷酸序列：单链核苷酸序列的左手末端5'末端；双链核苷酸序列的左手方向称5'方向。向新生RNA转录物添加5'至3'核苷酸的方向称为转录方向。具有与mRNA相同序列的DNA链被称为编码链。
本文中所使用的“编码”意指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，用作在具有确定的核苷酸序列的生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，或确定的氨基酸序列和由此产生的生物学特性。因此，如果由该基因产生的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作转录模板，基因或cDNA)可以被称为编码蛋白质。或该基因或cDNA的其他产物。除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
本文中使用的“质粒”意指在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人 工构建的质粒。可将核酸分子导入宿主细胞，从而产生转化的宿主细胞。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点，还可以包括一种或多种选择标记基因和本领域已知的其他遗传元件。
本文所使用的“宿主细胞”也称为受体细胞，是指在转化和转导(感染)中接受外源基因的宿主细胞。
本文中使用的“药学可接受载体”意指常规的药学上可接受的载体。Remington's Pharmaceutical Sciences，EWMartin，Mack Publishing Co.，Easton,Pa.，第15版(1975)，描述了适用于药物递送一种或多种治疗化合物或分子(例如一种或多种抗体)的组合物和制剂，以及另外的药剂。
本文中所使用的“诊断”疾病是指在给病人做检查之后判定病人的病症及其发展情况。“预防”疾病是指抑制疾病的完全发展。“治疗”是指在其开始发展后改善疾病或病理状况的体征或症状的治疗性干预。
本文中“施用”意指选择合适的途径将所述物质引入受试者。例如，如果所选择的途径是静脉内的，则通过将所述物质引入受试者的静脉来施用组合物。
本文中“有效预防/治疗剂量”意指足以在用该药剂治疗的受试者中达到所需效果的一定量的特定药剂。精确的剂量将依赖于治疗的目的，并可为本领域技术人员通过使用公知技术所确定。剂量范围可为0.01-100mg/kg体重或更大，例如0.1、1、10或50mg/kg体重，优选1-10mg/kg。如本领域所公知，对于抗体或Fc融合体降解、全身性或局部性递药和新蛋白酶合成速率，以及年龄、体重、大致健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用以及病症的严重程度而言，调整可以是必需的，并可由本领域那些技术人员通过常规的实验方法来确定。此类试剂包括本文所述的单体Fc结构域分子。在一个非限制性实例中，这可以是用于预防，治疗或改善HIV感染的HIV特异性单体Fc结构域(或HIV特异性CH3结构域分子)的量。理想地，治疗有效量的抗体是足以预防，治疗或改善感染或疾病的量，例如由受试者中的HIV感染引起而不会在受试者中引起显着的细胞毒性作用。用于预防，改善和/或治疗受试者的治疗有效量的药剂将取决于所治疗的受试者，痛苦的类型和严重程度，以及治疗组合物的施用方式。
本文中的“癌症”为实体瘤或血源性癌。本发明所述的实体瘤是肉瘤或癌，例如纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，或另一种肉瘤，滑膜 瘤，间皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，淋巴恶性肿瘤，胰腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，绒毛膜癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，睾丸肿瘤，膀胱癌或中枢神经系统肿瘤(如胶质瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，血管瘤，黑素瘤，神经母细胞瘤或视网膜母细胞瘤)。本发明所述的血源性癌症是白血病，如急性白血病(如急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，急性髓性白血病和成髓细胞，早幼粒细胞，髓单核细胞，单核细胞和红白血病)；慢性白血病(如慢性粒细胞性(粒细胞)白血病，慢性粒细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病)，真性红细胞增多症，淋巴瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，重链性疾病，骨髓增生异常综合征，多毛细胞白血病或骨髓增生异常。
除非另外说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一”，“一个”和“该”包括复数指示物。还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子量值是近似的，并且提供用于描述。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。术语“包含”表示“包括”。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。如果发生冲突，将以本说明书(包括术语解释)为准。另外，材料，方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
抗CTLA4抗体
本申请的抗体包括所有类别的抗体(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)和所有亚类(即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。所述抗体可以是嵌合的、人源化的或全人源的单克隆抗体。
抗体通常包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，VH和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(称为互补决 定区(CDR))。每个VH和VL由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每个重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合位点。已知CDR负责抗原结合，然而，已经发现并非所有的6个CDR都是必不可少的或不可改变的。换言之，可以替换或改变或修饰一个或多个CDR，但仍基本上保留甚至改善对CTLA4的特异性结合亲和力。此外，重链CDR3区位于抗原结合位点的中心，因此被认为与抗原接触最多，并为抗体与抗原的亲和力提供最多的自由能。还认为，重链CDR3是迄今在长度、氨基酸组成和构象方面通过多种多样化机制而导致的抗原结合位点中最多样化的CDR(Tonegawa S.Nature.302:575-81)。重链CDR3中的多样性足以产生大多数抗体特异性(Xu JL，Davis MM.Immunity.13:37-45)以及所需的抗原结合亲和力(Schier R等，J Mol Biol.263:551-67)。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的重链CDR3(HCDR3)。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些进一步的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含：包含选自SEQ ID NO:7-16中任一项的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些进一步的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3、包含选自SEQ ID NO:4和17-19中任一项的 氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)：
所述VH包含：(i)SEQ ID NO：22-31中任一项所示的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO：22-31中任一项所示的氨基酸序列至少85％、90％或95％相同且与VL区联合仍保留对CTLA4的特异性结合亲和力的氨基酸序列；和
所述VL包含：(i)SEQ ID NO：21和32-35中任一项所示的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO：21和32-35中任一项所示的氨基酸序列至少85％、90％或95％相同且与VH区联合仍保留对CTLA4的特异性结合亲和力的氨基酸序列。
优选地，上文所述的至少85％、90％或95％相同的氨基酸序列的变体包含的突变发生在框架区而非CDR区中，例如在框架区中具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的添加、缺失和/或取代。优选地，所述取代为保守取代。
如本文所用的术语“保守取代”是指氨基酸取代，其不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小，形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人,Protein Eng. 12(10):879-884(1999)；和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文中提供的抗体和抗原结合片段可进一步包含人IgG恒定区，该人IgG恒定结构区包含Fc区和任选的铰链区。所述人IgG恒定区可以是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。在一些实施方案中，所述抗体包含人IgG1或IgG4Fc区。所述Fc区可以是野生型Fc区，或者Fc区可以包含改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或其他效应器功能的一个或多个氨基酸修饰(例如Leu234Ala/Leu235Ala或LALA取代)。
在某些实施方案中，Fc修饰包含LALA突变，即根据Kabat等人的EU编号L234A和L235A的突变。LALA突变可能是破坏抗体效应器功能的最常用突变，例如消除Fc与特异性FcγR的结合，降低由PBMC和单核细胞介导的ADCC活性。Fc修饰的非限制性实例还包括，例如在涉及人IgG4Fc区的情况下，在氨基酸序列的第228位丝氨酸(“S”)突变为脯氨酸(“P”)。S228P突变通过稳定IgG4分子核心铰链中的二硫键来减少Fab臂交换，因此属于有助于防止半抗体形成的IgG4稳定突变。
当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，上文Kabat等人报道的EU索引)。因此，提及抗体恒定结构域中的残基编号是指通过EU编号系统进行的残基编号。
抗体序列信息：
抗体互补决定区氨基酸序列



抗体可变区氨基酸序列：




抗体全长氨基酸序列








实施例1：本发明的重组抗体的制备
1.转染与表达
实验方法：
1、取1.45E8个ExpiCHO细胞，离心去上清。
2、将0.5ml左右电转液加入细胞，混匀后添加适量的包含各不同分子序列的相应质粒(浓度500ng/ul)。
3、上述细胞质粒混悬液充分混匀后取1ml加入1ml电击管，把电击管放入电转仪进行电击。
4、电击完成后，将电击管内细胞分装进提前准备好含有20ml培养液摇瓶内，静止孵育40min。
5、孵育结束后将摇瓶放入37℃，270rpm，8％CO2培养，24h后添加补料/丁酸钠/双抗，继续培养3-7d。
2、抗体纯化
实验方法：Protein A亲和层析柱纯化
1)平衡层析柱:用1xPBS缓冲液，设置流速为1ml/min，上样体积为20ml
2)上样：流速设置为1ml/min
3)洗杂:以1xPBS缓冲液，流速设置为1ml/min，体积为20ml
4)洗脱：用柠檬酸缓冲液(pH3.4)，流速设置为1ml/min，分管收集，每管约500ul。共收集10管，使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值。
5)透析：将高浓度蛋白吸至透析袋放1XPBS的烧杯中透析。
3、抗体基础质控
1)纯度检测(SDS-PAGE)
实验方法：
1、准备工作电泳槽的安装：取出制好胶的玻璃夹，放入电极架，矮玻璃朝向电极红色胶条方向，将电极架放入电机座，合上开关。取出制好胶的玻璃夹，放入电极架，矮玻璃朝向电极红色胶条方向，将电极架放入电机座，合上开关。将底座放入电泳槽内，向电极架中间加入电泳缓冲液直至浓缩胶上1cm处。再向电泳槽内加入电泳缓冲液，液面高度至浓缩胶顶部。
2、样品加热处理
还原胶的样品99℃下，加热6min；非还原胶的样品在99℃下，加热3min。
3、上样，跑电泳凝胶，染脱，拍照
上样量：每孔10微升
电泳条件：180v，45min
蛋白染色仪：染脱时间为15min。
凝胶成相仪：设置参数为白光并进行拍照。
2)纯度检测(SEC-HPLC)
实验方法：
使用高效液相色谱仪LC-20AT及凝胶色谱柱进行SEC实验，实验条件如下：
将水更换为流动相，流速缓慢升至1.000ml/min，至基线平稳。取50ul的抗体至对应编号的进样瓶中，将样品瓶放入仪器相应的位置，进样时间是15min，分析处理数据并保存，将流动相更换成去离子水，冲洗1.5h。
3)内毒素检测
实验方法：
1)样品阳性对照液配制：2倍供试液浓度溶液+内毒素标准品(0.24EU/ml)，1:1混合
2)供试液制备：
样品稀释倍数：MVD＝C·L/λ
*注：MVD：供试品最大有效稀释倍数
L：供试品细菌内毒素限值(1EU/mg)
C:供试品浓度
λ：鲎试剂标示灵敏度
110ul供试液取样量＝C/MVD*110ul
封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37℃恒温培养箱孵育60min
实施例2：本发明的伊匹单抗变体的结合参数的pH依赖性
·包被2ug/mL的抗原(分别用pH6.0和7.4的碳酸盐碳酸氢盐缓冲液稀释)在Elisa平板，4℃孵育过夜；
·分别用pH6.0和7.4的washing buffer将对应的平板清洗3次，再加入150ul/孔pH分别为6.0和7.4的5％脱脂牛奶室温封闭1小时；
·分别用pH6.0和7.4的washing buffer将对应的平板清洗3次，再加入50ul/孔分别用pH6.0和7.4稀释液梯度稀释的抗体(从100nM开始3倍梯度稀释)，室温孵育1小时；
·分别用pH6.0和7.4的washing buffer将对应的平板清洗3次，再加入50ul/孔分别用pH6.0和7.4稀释液1:5000稀释的anti-hIgG1Fc HRP抗体，室温孵育1小时；
·分别用pH6.0和7.4的washing buffer将对应的平板清洗6次，加入TMB显色后测OD450。
图1显示了随着pH而变化的本发明的各种抗体pH依赖性的结合参数。其中，IPD52为对照抗体伊匹单抗，IPD53-IPD66为伊匹单抗变体。与在中性条件下相比，在肿瘤微环境的酸性条件下，本发明的抗体具有更高的结合(EC50更低或OD450更高)。

Claims (38)

  1. 一种抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
    (1)所述的HCDR1具有一个组氨酸(H)残基；
    (2)所述的HCDR2具有至少一个组氨酸(H)残基；
    (3)所述的HCDR3具有零或1个组氨酸(H)残基；
    (4)所述的LCDR1具有至少一个酸性氨基酸残基；
    (5)所述的LCDR2具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
    (6)所述的LCDR3具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
  2. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述的重链可变区HCDR1包含31H、32H中的任意一种残基，并且第35位氨基酸不为H。
  3. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述的重链可变区HCDR1包含31H。
  4. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述的重链可变区HCDR1包含32H。
  5. 根据权利要求1-4任意一项所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述的重链可变区HCDR1区，其中第35位氨基酸不为组氨酸(H)。
  6. 根据权利要求1-5任意一项所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述的重链可变区HCDR1区包含35A、35G、35V、35L、35I、35F、35W、35Y、35D、35N、35E、35K、35Q、35M、35S、35T、35C、35P、35R中的任意一种残基。
  7. 根据权利要求1-6任意一项所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述的重链可变区HCDR1区包含35A、35V、35L、35I、35F、35Y、35S、35N中的任意一种残基。
  8. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述的重链可变区包含30H。
  9. 根据权利要求8所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述的重链可变区HCDR1区包含35H。
  10. 根据权利要求1-9任意一项所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述的重链可变区HCDR2包含56H残基。
  11. 根据权利要求1-10任意一项所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述的重链可变区HCDR3包含零个H残基。
  12. 根据权利要求1-11任意一项所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述的轻链可变区LCDR1中的酸性氨基酸残基选自天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。
  13. 根据权利要求1-12任意一项所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述的轻链可变区LCDR1包含24D、26D、28E、31E、33E、35D中的任意一种氨基酸残基。
  14. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
    (1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；
    (2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
    (3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
    (4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
    (5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
    (6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
  15. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
    (1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；
    (2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
    (3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
    (4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
    (5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
    (6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
  16. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、 LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
    (1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；
    (2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
    (3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
    (4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
    (5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
    (6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
  17. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
    (1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；
    (2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
    (3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
    (4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
    (5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
    (6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
  18. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
    (1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
    (2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
    (3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
    (4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
    (5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
    (6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
  19. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
    (1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；
    (2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
    (3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
    (4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
    (5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
    (6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
  20. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
    (1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；
    (2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
    (3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
    (4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
    (5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
    (6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
  21. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
    (1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；
    (2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
    (3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
    (4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
    (5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
    (6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
  22. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
    (1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；
    (2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
    (3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
    (4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
    (5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
    (6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
  23. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
    (1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；
    (2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
    (3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
    (4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
    (5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
    (6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
  24. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
    (1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；
    (2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
    (3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
    (4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；
    (5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
    (6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
  25. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
    (1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；
    (2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
    (3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
    (4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；
    (5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
    (6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
  26. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区序列，其中：
    (1)所述的HCDR1包括如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；
    (2)所述的HCDR2包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
    (3)所述的HCDR3包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
    (4)所述的LCDR1包括如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；
    (5)所述的LCDR2包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
    (6)所述的LCDR3包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
  27. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含选自以下的重链可变区和轻链可变区序列对：
    (1)包含有SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
    (2)包含有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
    (3)包含有SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
    (4)包含有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
    (5)包含有SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
    (6)包含有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
    (7)包含有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
    (8)包含有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
    (9)包含有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有 SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
    (10)包含有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的轻链可变区；
    (11)包含有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的轻链可变区；
    (12)包含有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的轻链可变区；
    (13)包含有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的轻链可变区；
    (14)包含有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的重链可变区以及包含有SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的轻链可变区。
  28. 根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或片段包含选自以下的重链序列和轻链序列：
    (1)包含有SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
    (2)包含有SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
    (3)包含有SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
    (4)包含有SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
    (5)包含有SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
    (6)包含有SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
    (7)包含有SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
    (8)包含有SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
    (9)包含有SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
    (10)包含有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链；
    (11)包含有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列的轻链；
    (12)包含有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列的轻链；
    (13)包含有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的轻链；
    (14)包含有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的重链以及包含有SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的轻链。
  29. 根据权利要求1-27任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、重组抗体、嵌合抗体、双价抗体、抗独特型抗体或融合蛋白。
  30. 一种核酸分子，其编码权利要求1-29中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
  31. 根据权利要求30所述的核酸分子，可操作地连接至启动子。
  32. 一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含有权利要求30或31所述的核酸分子。
  33. 一种质粒，含有权利要求30或31所述的核酸分子。
  34. 一种宿主细胞，含有权利要求30或31所述的核酸分子、权利要求32所述的重组表达载体或权利要求33所述的质粒。
  35. 一种药物组合物，包括权利要求1-29任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
  36. 一种试剂盒，包括权利要求1-29任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
  37. 一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的对象施用权利要求1-29任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
  38. 权利要求1-29任一项所述的抗体或其抗原结合片段用于治疗或诊断CTLA4相关的癌症的用途。
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