CN112552411B - 新型抗pd-l1/抗lag-3双特异性抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开提供了针对PD‑L1和LAG‑3的双特异性抗体，编码该抗体的核酸分子，用于表达该抗体的表达载体和宿主细胞。本公开还提供了体内和体外验证抗体的功能的方法。本公开的抗体提供了用于通过调控免疫功能来治疗癌症的潜在药剂。

Description

新型抗PD-L1/抗LAG-3双特异性抗体及其用途

对相关申请的交叉引用

本申请要求2019年9月26日提交的国际专利申请PCT/CN2019/108062的权益，其全部内容通过提述并入本文。

序列表

本申请以电子形式与序列表一起提交。序列表的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本申请一般地涉及抗体。更具体地，本申请涉及针对PD-L1和LAG-3的双特异性抗体，制备其的方法以及抗体的用途。

背景技术

在过去的几年中，免疫疗法已经发展成为对抗某些类型癌症的非常有前途的新领域。PD-1，作为免疫检查点蛋白之一，是在活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞以及B细胞上表达的CD28家族的抑制性成员。其配体PD-L1是1型跨膜蛋白，被认为在抑制适应性免疫系统中起着主要作用。PD-L1与PD-1的结合通过免疫受体酪氨酸基开关基序(ITSM)与磷酸酶(SHP-1或SHP-2)相互作用传递抑制信号。结果，该信号通路抑制T细胞增殖和T细胞功能，如细胞因子产生和细胞毒性活性。因此，PD-1/PD-L1轴在下调免疫系统中起着主要作用[1、2]。

靶向PD-1或PD-L1的单克隆抗体可以阻断PD-1/PD-L1结合并增强针对癌细胞的免疫应答。这类药物在治疗某些癌症方面显示出巨大的潜力。几家制药公司已经开发出多种获得批准的靶向PD-1/PD-L1的治疗性抗体，包括派姆单抗(Pembrolizumab)(Keytruda)、纳武单抗(Nivolumab)(Opdivo)、Cemiplimab(Libtayo)、阿特珠单抗(Atezolizumab)(Tecentriq)、Avelumab(Bavencio)和Durvalumab(Imfinzi)。这些药物已显示可有效治疗多种类型的癌症，包括皮肤黑素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌和霍奇金淋巴瘤。也正在研究它们用于针对许多其他类型的癌症[3]。

淋巴细胞活化基因3，也称为LAG-3，是I型跨膜蛋白，是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员。LAG-3是在活化的T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞样树突细胞上表达的细胞表面分子，但在静息T细胞上不表达。LAG-3与CD4共有大约20％的氨基酸序列同源性，但以更高的亲和力结合II类MHC，从而提供了对T细胞受体信号传导的负调节[4]。

体外阻断LAG-3增加了T细胞增殖和细胞因子产生，并且LAG-3缺陷型小鼠在由超抗原葡萄球菌肠毒素B、肽或仙台病毒感染诱导的T细胞应答的下调中存在缺陷。LAG-3在活化的天然Treg(nTreg)和诱导的CD4+FoxP3+Treg(iTreg)细胞上均表达，其中表达水平高于在激活的效应器CD4+T细胞上观察到的表达水平。对Treg细胞上LAG-3的阻断消除了Treg细胞抑制器功能，而非Treg CD4+T细胞中LAG-3的异位表达赋予了抑制活性。基于LAG-3对慢性感染和癌症中T细胞功能的免疫调节作用，预测的LAG-3特异性单克隆抗体的作用机制是抑制对肿瘤特异性效应器T细胞的负调控[5]。还揭示了LAG-3干扰T细胞的活性，导致对PD1/PDL1抑制剂的获得性抗性[6]。此外，在小鼠和人类中，对PD-1途径和LAG-3的双重阻断已显示出比单独阻断任一分子对抗肿瘤免疫力更有效[7]。而且，临床发现只有少数癌症患者对抗PD1/PDL1免疫疗法有应答。

因此，需要靶向PD1/PDL1和LAG-3的抗体，其可以克服PD-1抗性并产生更有效的抗肿瘤免疫。

发明概述

本公开提供了这些和其他目的，其在广义上涉及提供具有改善功效的抗体的化合物、方法、组合物和制品。本公开提供的益处可以广泛应用于抗体治疗和诊断领域，并可以与多种靶标反应的抗体结合使用。

本公开提供了针对PD-L1和LAG-3的双特异性抗体。还提供了编码抗PD-L1/抗LAG-3抗体的核酸分子，用于表达双特异性抗体的表达载体和宿主细胞。本公开还提供了制备抗PD-L1/抗LAG-3抗体的方法，以及在体内和体外验证其功能的方法。本公开的双特异性抗体提供了用于预防或治疗包括增生性疾病、免疫性疾病或感染在内的疾病或病况的非常有效的药剂。

在一些方面，本公开提供了双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含特异性结合PD-L1的第一抗原结合位点和特异性结合与PD-L1不同的抗原的第二抗原结合位点。在一些实施方案中，与PD-L1不同的抗原是LAG-3。

在一些方面，本公开提供了双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中：

第一抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO：1的CDRH1；包含SEQ ID NO：2的CDRH2；和包含SEQ ID NO：3的CDRH3；和

第二抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO：4的CDRH1；包含SEQ ID NO：5的CDRH2；和包含SEQ ID NO：6的CDRH3。

在某些实施方案中，所述第一和/或第二抗原结合结构域是单可变结构域、VHH、sdAb或纳米抗体。VHH可以衍生自骆驼科动物，包括羊驼或美洲驼。在某些实施方案中，VHH是人源化VHH。

在某些实施方案中，第一抗原结合结构域包含第一重链可变区，其包含SEQ IDNO：7的氨基酸序列或具有至少80％序列同一性且保留对PD-L1的特异性结合亲和力的其同源序列；和第二抗原结合结构域包含第二重链可变区，其包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或具有至少80％序列同一性且保留对LAG-3的特异性结合亲和力的其同源序列。

在一些具体的实施方案中，第一抗原结合结构域包含由SEQ ID NO：7组成的第一重链可变区，第二抗原结合结构域包含由SEQ ID NO：8组成的第二重链可变区。

在某些实施方案中，从N末端至C末端，第一抗原结合结构域可操作地连接于恒定区，该恒定区可操作地连接于第二抗原结合结构域。或者，从N末端至C末端，第二抗原结合结构域可操作地连接于恒定区，该恒定区可操作地连接于第一抗原结合结构域。

在某些实施方案中，恒定区是人IgG恒定区，例如人IgG Fc区。在某些实施方案中，人IgG Fc区是人IgG1 Fc区。进一步地，人IgG1 Fc区与野生型人IgG1 Fc区相比可以包含LALA突变，特别是L234A和L235A的突变(根据EU编号)。在一些实施方案中，Fc区可以包含SEQ ID NO：11或由其组成。

在某些实施方案中，恒定区通过接头可操作地连接于第一和/或第二抗原结合结构域的至少一个。接头可以是肽序列，例如包含(G4S)n，其中n＝1-10。在某些特定的实施方案中，接头包含SEQ ID NO：12或由其组成。

在一些实施方案中，从N末端至C末端，如本文公开的双特异性抗体为如下形式：第一抗原结合结构域-恒定区-接头-第二抗原结合结构域，或者第二抗原结合结构域-恒定区-接头-第一抗原结合结构域。具体地，抗体或其抗原结合部分的全长包含SEQ ID NO：13或由其组成。

在一些实施方案中，如上所述的双特异性抗体或其抗原结合部分是单克隆抗体，优选地人源化抗体。

在一些实施方案中，第一抗原结合结构域可以特异性结合PD-L1抗原，且第二抗原结合结构域可以特异性结合LAG-3抗原。PD-L1和LAG-3抗原可以衍生自食蟹猴、小鼠或人等。PD-L1和LAG-3抗原可以表达为可溶性蛋白或在细胞表面表达。优选地，PD-L1和LAG-3蛋白是人PD-L1和LAG-3蛋白。在一些特定的实施方案中，上述抗体可以同时特异性结合人PD-L1和LAG-3蛋白。

在一些实施方案中，双特异性抗体或其抗原结合部分具有以下一种或多种特性：

(a)同时以高亲和力特异性结合人PD-L1和LAG-3蛋白，而不交叉反应性结合人PD-L2或人CD4；

(b)特异性结合食蟹猴PD-L1和/或小鼠PD-L1蛋白；

(c)特异性结合食蟹猴LAG-3和/或小鼠LAG-3蛋白；

(d)能够阻断PD-1结合PD-L1；

(e)能够阻断LAG-3结合MHC-II以及LAG-3结合FGL-1；

(f)能够诱导PD-1信号传导通路和LAG-3信号传导通路；

(g)与抗PD-L1单特异性抗体或抗LAG-3单特异性抗体、其组合以及其他靶向PD-L1和LAG-3的双特异性抗体相比，能够诱导显著更高水平的细胞因子(例如IL-2)产生；

(h)提供良好的热稳定性并在人血清中稳定；和

(i)与抗PD-L1单特异性抗体或抗LAG-3单特异性抗体、其组合以及其他靶向PD-L1和LAG-3的双特异性抗体相比，提供显著更好的抗肿瘤效果。

在一些方面，本公开提供了分离的核酸分子，其包含编码上文所描述的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸序列。

在一些实施方案中，分离的核酸分子中包含选自以下的核酸序列：

(A)编码如SEQ ID NO：7所示的重链可变区的核酸序列；

(B)如SEQ ID NO：9所示的核酸序列；或

(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。

在一些实施方案中，分离的核酸分子中包含选自以下的核酸序列：

(A)编码如SEQ ID NO：8所示的轻链可变区的核酸序列；

(B)如SEQ ID NO：10所示的核酸序列；或

(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。

在一些方面，本公开提供了包含上文所描述的核酸分子的载体。

在一些方面，本公开提供了包含上文所描述的核酸分子或载体的宿主细胞。

在一些方面，本公开提供了包含上文所描述的双特异性抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的药物组合物。

在一些方面，本公开提供了用于产生上文所描述的双特异性抗体或其抗原结合部分的方法，包括以下步骤：

-在本公开的宿主细胞中表达所述双特异性抗体或其抗原结合部分；和

-从宿主细胞分离双特异性抗体或其抗原结合部分。

在一些方面，本公开提供了一种调控受试者中免疫应答的方法，包括对受试者施用治疗有效量的如本文所描述的双特异性抗体或其抗原结合部分或者药物组合物，任选地所述免疫应答是PD-L1和/或LAG-3相关的。

在一些方面，本公开提供了一种抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括对受试者施用治疗有效量的的如本文所描述的双特异性抗体或其抗原结合部分或者药物组合物。

在一些方面，本公开提供了预防或治疗受试者中的包括增殖性疾病、免疫性疾病或感染在内的疾病或病况的方法，包括对受试者施用治疗有效量的如本文所描述的双特异性抗体或其抗原结合部分或者药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病况是PD-L1和/或LAG-3相关的。在一些实施方案中，增殖性疾病是癌症，例如结肠癌、淋巴瘤、肺癌、肝癌、子宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤、前列腺癌、食道癌或胃癌。在一些实施方案中，癌症是结肠癌。在一些实施方案中，感染是慢性感染。

在一些实施方案中，本文所描述的双特异性抗体或其抗原结合部分可以与用于癌症免疫疗法的化学治疗剂、放射疗法和/或其他药剂组合施用。

在一些方面，本公开提供了双特异性抗体或其抗原结合部分，其用于：

i)调控免疫应答，例如恢复T细胞活性；

ii)增强T细胞增殖和细胞因子产生，例如IL-2产生；和/或

iii)刺激免疫应答或功能，例如增强针对癌细胞的免疫应答。

在一些方面，本公开提供了本文所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分，用于治疗或预防增生性疾病(例如癌症)、免疫性疾病或感染。

在一些方面，本公开提供了本文所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分，用于诊断增生性疾病(例如癌症)、免疫性疾病或感染。

在一些方面，本公开提供了本文所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于调控受试者的免疫应答或抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。

在一些方面，本发明提供了本文所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防增生性疾病(例如癌症)、免疫性疾病或感染的药物中的用途。

在一些方面，本公开提供了用于治疗或诊断增生性疾病(例如癌症)、免疫性疾病或感染的试剂盒，其包括包含本文所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分的容器。

以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。提供概述以简化地介绍一些选择的概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。本概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用作确定所要求保护的主题的范围的辅助手段。

附图简述

图1A例示了如本文所公开的W3669双特异性抗体的示意图，图1B显示了该抗体的具体序列。

图2例示了蛋白A层析后SDS-PAGE(A)和SEC-HPLC(B)的结果。

图3例示了通过FACS测量的抗体与表达人PD-L1的CHO-K1细胞的结合。

图4例示了通过ELISA测量的抗体与人PD-L1蛋白的结合。

图5例示了通过FACS测量的抗体与表达人LAG-3的293细胞的结合。

图6例示了通过ELISA测量的抗体与重组人LAG-3蛋白的结合。

图7例示了通过ELISA测量的抗体与人PD-L1和LAG-3蛋白的双重结合。

图8例示了通过FACS测量的抗体与表达人PD-L1的细胞和表达LAG-3的细胞的结合。

图9显示分别通过FACS和ELISA测量的W3669双特异性抗体对人PD-L2(A)和人CD4(B)的交叉反应性结果。阳性对照是以1:100稀释的市售抗CD4抗体。

图10例示了通过ELISA测量的抗体与重组食蟹猴PD-L1蛋白的结合。

图11例示了通过ELISA测量的抗体与重组小鼠PD-L1蛋白的结合。

图12例示了通过ELISA测量的抗体与重组食蟹猴LAG-3蛋白的结合。

图13例示了通过ELISA测量的抗体与重组小鼠LAG-3蛋白的结合。

图14例示了通过FACS测量的对PD-1结合表达PD-L1的细胞的阻断。

图15例示了通过FACS测量的对LAG-3结合表达MHC-II的Raji细胞的阻断。

图16例示了通过ELISA测量的对FGL-1/LAG-3相互作用的阻断。

图17显示PD-1报告基因测定法的结果。

图18显示LAG-3报告基因测定法的结果。

图19显示双重通路报告基因测定法的结果。

图20显示人同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)中的IL-2产生。

图21显示由SEB活化的人PBMC中分泌的IL-2水平(A)和倍数变化(B)的结果。PD-L1mab、LAG-3mab和“combo”分别是亲本抗PD-L1 VHH、亲本抗LAG-3VHH和抗PD-L1 VHH+抗LAG-3VHH。

图22A-C显示了通过差示扫描荧光法(DSF)测量的热稳定性。图22A的表将结果汇总，图22B和22C分别是对应于W3669抗体和W366BMK1的熔解曲线图。与双特异性W366-BMK1相比，W3669双特异性抗体的更高Tm1指示更好的热稳定性。

图23显示血清稳定性测试的结果。

图24显示结肠26同基因模型中不同抗体的抗肿瘤作用。箭头指示施用的时间点。BsAb是指W3669抗体。PD-L1 mab和LAG-3mab分别是W315-BMK8和亲本抗LAG-3VHH，两者均具有小鼠交叉反应性。

图25是显示结肠26同基因模型中抗肿瘤作用的剂量应答的图。箭头指示施用的时间点。

图26A是显示小鼠中的药代动力学曲线的图。结果表明W3669抗体在高剂量在小鼠体内具有正常的PK谱。

图26B显示在小鼠中抗药物抗体生成的结果。

发明详述

虽然本发明可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是验证本发明原理的其具体的举例说明性实施方案。应该强调的是，本发明不限于所举例说明的具体实施方案。

除非在此另外定义，否则与本公开结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个/种”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个/种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个/种细胞”包括细胞的混合物等。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和端点之间的所有点。

通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及其技术是本领域众所周知和常用的术语。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述进行。参见例如Abbas等人,Cellular and Molecular Immunology,6^th ed.,W.B.Saunders Company(2010)；SambrookJ.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人,Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow and Lane Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；和Coligan等人,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。与本文描述的分析化学、合成有机化学和药物和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。

定义

为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。

术语“抗体”或“Ab”在本文中以最广泛含义使用，其涵盖多种抗体结构，包括多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。术语抗体通常是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重链(H)和两条轻链(L)多肽链的Y形四聚体蛋白。抗体的轻链可以分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定区连接，并且重链还包含约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链由重链可变区(V_H)和重链恒定区(C_H)组成。重链恒定区由3个结构域(C_H1，C_H2和C_H3)组成。每条轻链由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)组成。V_H和V_L区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个V_H和V_L由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N末端到C末端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每个重链/轻链对的可变区(V_H和V_L)分别形成抗原结合位点。氨基酸在各种区域或结构域中的分布遵循KabatSequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987和1991))或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature 342:878-883中的定义。抗体可以具有不同的抗体同种型，例如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。

术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”可以在本申请的上下文中互换使用，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保留了与全长抗体特异性结合的抗原特异性结合，和/或与全长抗体竞争结合相同的抗原的能力。一般而言，参见Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.编,第二版,Raven Press,N.Y.(1989)，其出于所有目的通过引用并入本文。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术，例如蛋白质水解消化作用或涉及编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的DNA的操作和表达的重组基因工程技术，衍生自例如全抗体分子。这样的DNA为已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)取得，或是可合成的。DNA可用化学或通过使用分子生物技术来测序和操作，例如，以将一或多个可变和/或恒定结构域排列成适合的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、增加或删除氨基酸等。

如本文所用，术语“抗原结合结构域”(例如LAG-3结合结构域或PD-L1结合结构域)是指由包含一个或多个CDR的抗体的部分形成的抗体片段，或结合抗原但不包含完整天然抗体结构的其他抗体片段。抗原结合结构域的实例包括但不限于双抗体、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化的单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合结构域能够结合与亲本抗体结合的相同的抗原。在某些实施方案中，抗原结合结构域可以包含来自特定人抗体的一个或多个CDR，其嫁接到来自一种或多种不同人抗体的框架区。有关抗原结合结构域的更多详细形式描述在Spiess等人，，Molecular Immunology，67(2)，pp.95-106(2015)和Brinkman等人，mAbs，9(2)，pp.182-212(2017)中，其通过提述完整并入本文。

术语“单可变结构域”或“VHH结构域”可以在本文中交换使用且指能够独立于不同的可变结构域结合抗原或表位的抗原结合结构域。VHH结构域(即重链抗体的可变结构域)代表通过适应性免疫应答产生的已知最小的抗原结合单位(Koch-Nolte F.等人,FASEBJ.Nov；21(13):3490-8.Epub 2007 Jun 15(2007))。VHH结构域可以是人结构域，但也包括来自其他物种的单个结构域，例如啮齿动物、铰口鲨和骆驼科动物VHH结构域。骆驼科动物VHH是免疫球蛋白单可变结构域多肽，衍生自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰驼和原驼(guanaco)在内的物种，它们产生天然缺乏轻链的重链抗体。可以根据本领域可用的标准技术将此类VHH结构域人源化，并且将此类结构域视为“单结构域抗体”。如本文所使用的，VHH包括骆驼科动物VHH结构域以及人源化VHH结构域。

术语“PD-L1”，也称为程序性死亡配体1，是一种40kDa的1型跨膜蛋白，据推测在抑制适应性免疫系统中起主要作用。PD-L1是程序性死亡1蛋白(PD-1)的主要配体，PD-1是一种共抑制性受体，可以在髓样、淋巴样、正常上皮细胞和癌症中组成性表达或诱导。PD-L1在胎盘、脾脏、淋巴结、胸腺、心脏、胎儿肝脏中表达，并且也在许多肿瘤或癌细胞中发现。PD-L1结合其受体PD-1或B7-1，后者在活化的T细胞、B细胞和髓样细胞上表达。PD-L1与其受体的结合诱导信号转导，从而抑制TCR介导的对细胞因子产生和T细胞增殖的活化。因此，PD-L1在特定事件例如怀孕、自身免疫性疾病、组织同种异体移植期间在抑制免疫系统中起主要作用，并且认为可以使肿瘤或癌细胞绕过免疫学检查点并逃避免疫应答。

如本文所用，术语“PD-L1”在指PD-L1蛋白的氨基酸序列时，包括全长PD-L1蛋白，或PD-L1的胞外域(PD-L1 ECD)或含有PD-L1 ECD的片段；还包括PD-L1 ECD的融合蛋白，例如与小鼠或人的IgG Fc(mFc或hFc)融合的片段。此外，如本领域技术人员所理解的，PD-L1蛋白也将包括那些天然或人工引入氨基酸序列的突变(包括但不限于置换、缺失和/或添加)而不影响生物学功能的蛋白。因此，在本公开中，术语“PD-L1蛋白”应包括所有这样的序列，包括上述序列表及其天然或人工变体。另外，当提及PD-L1蛋白的序列片段时，其不仅指上述序列片段，而且还指天然或人工变体的相应序列片段。

如本文所用，术语“细胞表面表达的PD-L1”是指一种或多种在体外或体内在细胞表面上表达的PD-L1蛋白，从而至少PD-L1蛋白的一部分暴露于细胞膜的细胞外侧，并且可与抗体的抗原结合部分接触。“细胞表面表达的PD-L1”可以包含在正常表达PD-L1蛋白的细胞表面上表达的PD-L1蛋白或由其组成。或者，“细胞表面表达的PD-L1”可以包含在通常其表面上不表达人PD-L1的细胞的表面上表达的PD-L1蛋白或由其组成，该细胞已经被人为工程化改造为在其表面上表达PD-L1。

如本文所用，术语“结合PD-L1的抗体”或“抗PD-L1抗体”包括特异性识别PD-L1的抗体及其抗原结合片段。本公开的抗体和抗原结合片段可以结合可溶性PD-L1蛋白和/或细胞表面表达的PD-L1。可溶性PD-L1包括天然PD-L1蛋白以及缺少跨膜结构域或与细胞膜不相关联的重组PD-L1蛋白变体。表述“抗PD-L1抗体”在本文中包括具有单一特异性的单价抗体，以及包含结合PD-L1的第一抗原结合结构域和结合第二(靶)抗原的第二抗原结合结构域的双特异性抗体，其中抗PD-L1抗原结合结构域包含如本文表A所述的HCVR/LCVR或CDR的任何序列。抗PD-L1双特异性抗体的实例在本文其他地方描述。

如本文所用，术语“PD-L2”是指程序性细胞死亡配体2，其与PD-L1竞争以与PD-1结合。人PD-L2的一个代表性氨基酸序列以NCBI登录号NP_079515.2公开。

术语“LAG-3”或“LAG-3”，也称为淋巴细胞活化基因3，是I型跨膜蛋白，是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员。LAG-3被命名为CD223(分化群223)。LAG-3是在活化的T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞样树突细胞等上表达的细胞表面分子，但在静息T细胞上却不表达。LAG-3是一种免疫检查点受体，对T细胞功能具有多种生物学作用。如本文所用，术语“LAG-3”包括变体、同工型、同系物、直系同源物和旁系同源物。

如本文所用，术语“人LAG-3”是指衍生于人的LAG-3蛋白，例如具有人LAG-3的完整氨基酸序列(Genbank登录号NP_002277)。人LAG-3序列与Genbank登录号NP_002277的人LAG-3的不同之处可以在于例如保守突变或非保守区中的突变，并且LAG-3具有与Genbank登录号NP_002277的人LAG-3基本相同的生物学功能。例如，人LAG-3的生物学功能是在LAG-3的细胞外结构域中具有被本公开的抗体特异性结合的表位或者人LAG-3的生物学功能是结合MHC II类分子或FGL1样分子。

如本文所用，术语“小鼠LAG-3”是指衍生于小鼠的LAG-3蛋白，例如具有小鼠LAG-3的完整氨基酸序列(Genbank登录号NP_032505)。

如本文所用，术语“食蟹猴LAG-3”是指衍生于食蟹猴的LAG-3蛋白，例如具有食蟹猴LAG-3的完整氨基酸序列(Genbank登录号XP_005570011.1)。

如本文所用，术语“抗LAG-3抗体”是指特异性结合LAG-3的抗体。“抗LAG-3抗体”可以包括具有单一特异性的单价抗体。示例性的抗LAG-3抗体在本文其他地方描述。

如本文所用，术语“二价”是指抗体或抗原结合片段具有两个抗原结合位点；术语“单价”是指抗体或抗原结合片段仅具有一个单抗原结合位点；并且术语“多价”是指抗体或抗原结合片段具有多个抗原结合位点。在一些实施方案中，如本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段是二价或四价的。

如本文所用，“双特异性”分子是指具有衍生自两种不同单克隆抗体的片段并且能够结合两种不同表位的人工分子。这两个表位可以存在于同一抗原上，或它们可以存在于两种不同的抗原上。

术语“双特异性抗体”或“双特异性抗原结合分子”在本文中是指包含至少第一抗原结合结构域(即PD-L1结合结构域)和第二抗原结合结构域(即LAG-3结合结构域)的蛋白质、多肽或分子复合物。双特异性抗体内的每个抗原结合结构域包含至少一个CDR，其单独地或与一个或多个另外的CDR和/或FR组合地特异性结合特定抗原。在本公开的上下文中，第一抗原结合结构域特异性结合第一抗原(例如PD-L1)，并且第二抗原结合结构域特异性结合第二不同抗原(例如LAG-3)。

关于抗体的“Fc”是指由第一重链的第二和第三恒定区经由二硫键合结合至第二重链的第二和第三恒定区组成的抗体的部分，任选地Fc区还包含全部或部分的铰链区。抗体的Fc部分负责多种效应器功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，但在抗原结合中不起作用。本文中的Fc区既包括野生型Fc区还包括其变体，具有用于多种目的的不同突变。如本文使用的，Fc可以是野生型Fc区例如野生型人IgG1Fc区或其变体。

术语“可操作地连接”是指两个或更多个感兴趣的生物序列的并置(带有或不带有间隔区或接头或插入序列)以使得它们处于允许以意图方式起作用的关系。当就多肽使用时，是指以允许连接的产物具有意图的生物学功能的方式连接多肽序列。例如，抗体可变区可以可操作地连接于恒定区，以便提供具有抗原结合活性的稳定产物。又例如，抗原结合结构域可以与另一个抗原结合结构域通过其间的插入序列可操作地连接，并且该类插入序列可以是间隔区或可以包含更长的序列，例如抗体的恒定区。该术语也可以关于多核苷酸使用。举例来说，当编码多肽的多核苷酸可操作地连接于调节序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)时，其意指该多核苷酸序列以允许从多核苷酸调节表达多肽的方式连接。

术语“抗PD-L1/抗LAG-3抗体”、“抗PD-L1/抗LAG-3双特异性抗体”、“针对PD-L1和LAG-3的抗体”、“抗PD-L1×LAG-3双特异性抗体”、“PD-L1×LAG-3抗体”在本文中可交换使用，其是指特异性结合PD-L1和LAG-3的双特异性抗体。

如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指单分子成分的抗体分子制剂。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。

术语“人源化抗体”旨在指其中来源于另一种哺乳动物物种如美洲驼、羊驼、小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。

如本文所用，术语“重组抗体”是指通过重组方式制备、表达、建立或分离的抗体，例如来自对另一物种的免疫球蛋白基因转基因的动物的分离的抗体，使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体库中分离的抗体，或者通过任何其他将免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的方法制备、表达、建立或分离的抗体。

如本文所用，术语“Ka”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“Kd”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。抗体的Ka和Kd值可以使用本领域确立的方法来确定。如本文所用，术语“K_D”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离常数，其从Kd与Ka的比率(即，Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)。确定抗体Kd的优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统如

系统。

如本文所用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指如通过SPR测定的，针对靶抗原具有1×10^-7M或更低，更优选5×10^-8M或更低，甚至更优选1×10^-8M或更低，甚至更优选5×10^-9M或更低，甚至更优选1×10^-9M或更低，甚至更优选8×10^-10M或更低，甚至更优选7×10^-10M或更低，甚至更优选6×10^-10M或更低，甚至更优选5×10^-10M或更低，和甚至更优选4×10^-10M或更低的K_D的抗体。

如本文所用的术语“EC₅₀”，也被称为“半数最大有效浓度”，是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。在本申请的上下文中，EC₅₀的单位为“nM”。在一些实施方案中，本文公开的抗体以不大于1nM，不大于0.8nM，不大于0.5nM，不大于0.4nM，优选不大于0.3nM，更优选约0.2nM的EC₅₀结合表达人PD-L1的细胞，如通过FACS测定的。在一些实施方案中，本文公开的抗体以不大于1nM，不大于0.1nM，不大于0.05nM，不大于0.04nM或优选不大于0.03nM的EC₅₀结合人PD-L1蛋白，如通过ELISA测定的。

如本文所用，“阻断结合”或“抑制结合”的能力是指抗体或其抗原结合片段阻断或抑制两个分子的结合(例如PD1与PD-L1结合、LAG-3与MHC-II结合或LAG-3与FGL-1结合)至任何可检测水平。在某些实施方案中，两个分子的结合可以被抗体或其抗原结合片段抑制至少50％。在某些实施方案中，这种抑制作用可以大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。在一些实施方案中，PD1与其配体PD-L1(例如在表达PD-L1的细胞上)的结合可被抗体或其抗原结合片段以不大于1nM，不大于0.5nM，不大于0.4nM，不大于0.3nM或优选不大于0.2nM的IC₅₀(即50％最大抑制浓度)抑制，如通过FACS测定的。

如本文所用，术语“表位”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原部分。“表位”也被称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子例如氨基酸、碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构和特定的电荷特征。例如，表位通常包含独特立体构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或不连续的氨基酸，其可以是“线性”或“构象”表位。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用位点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用位点跨越蛋白质中彼此分离的氨基酸残基。取决于通过本领域技术人员已知的常规技术检测的结合相同表位的竞争性，可以筛选抗体。例如，可以进行竞争或交叉竞争研究以获得彼此竞争或交叉竞争结合抗原(例如RSV融合蛋白)的抗体。在国际专利申请WO 03/48731中描述了用于获得结合相同表位的抗体的高通量方法，其基于它们的交叉竞争。

如本文所用，术语“分离的”是指通过人工方式从天然状态获得的状态。如果某种“分离的”物质或组分天然存在，则可能是因为其天然环境发生变化，或者物质与天然环境分离，或者两者兼而有之。例如，某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某个活动物体内，从该天然状态分离的相同的高纯度多核苷酸或多肽被称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”既不排除混合的人造或合成物质，也不排除不影响分离的物质的活性的其他不纯物质。

如本文所用，术语“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合PD-L1/LAG-3蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合除PD-L1/LAG-3蛋白以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人PD-L1/LAG-3蛋白的分离的抗体对其他抗原如来自其他物种的PD-L1/LAG-3蛋白可能具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。

如本文所用，术语“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。该载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报告基因。另外，载体可以包含复制起点。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可被工程化以产生感兴趣的蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞系统。宿主细胞包括但不限于培养细胞，例如来源于啮齿动物(大鼠，小鼠，豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞，如CHO，BHK，NSO，SP2/0，YB2/0；或人体组织或杂交瘤细胞，酵母细胞和昆虫细胞，以及包含在转基因动物或培养组织内的细胞。该术语不仅涵盖特定的受试细胞，还涵盖这种细胞的后代。由于突变或环境影响可能在后代中发生某些修饰，这样的后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。

如本文所用，术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，比对中的缺口(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来寻址。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.编),1988,New York:Oxford University Press；Biocomputing Informaticsand Genome Projects,(Smith,D.W.编),1993,New York:Academic Press；ComputerAnalysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编),1994,NewJersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in MolecularBiology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.和Devereux,J.编),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo等人,1988,SIAMJ.Applied Math.48:1073中描述的那些。

如本文所用，术语“免疫原性”是指刺激生物体中特异性抗体或致敏淋巴细胞形成的能力。它不仅指抗原刺激特定免疫细胞活化、增殖和分化以最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的性质，还指抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答可以在用抗原刺激生物体后在生物体的免疫系统中形成。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能够成功诱导宿主中免疫应答的产生取决于三个因素：抗原的性质，宿主的反应性和免疫手段。

如本文所用，术语“转染”是指将核酸引入真核细胞特别是哺乳动物细胞的过程。用于转染的方案和技术包括但不限于脂质转染和化学和物理方法如电穿孔。许多转染技术在本领域是公知的并且在本文中公开。参见例如Graham等人,1973,Virology 52:456；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,同上；Davis等人,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu et al,1981,Gene 13:197。在本发明的一些实施方案中，将人PD-L1或LAG-3基因转染入293F细胞。

如本文所用，术语“SPR”或“表面等离子体共振”是指并且包括允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)。关于详细描述，参见实施例3.5部分和

U.,等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；

U.,等人(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson,B.,等人(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；和Johnnson,B.,等人(1991)Anal.Biochem.198:268-277。

如本文所用，术语“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence ActivatedCell Sorting”.2017-11-09)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且可以对于公众是可商购获得的。这种仪器的实例包括来自Becton Dickinson(Foster City，CA)的FACS Star Plus、FACScan和FACSort仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah，FL)的Epics C和来自Cytomation(Colorado Springs，Colorado)的MoFlo。

术语“受试者”包括任何人或非人动物，优选人。

如本文所用，术语“癌症”是指或描述了哺乳动物中的生理学病况，通常特征为不受调控的细胞生长。它可以指任何肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移介导的，可以是实体瘤和非实体瘤如白血病。

本文在治疗病况的情况中使用的术语“治疗”和“医治”一般涉及人或动物的治疗和疗法，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制病情进展，包括进展速度下降，进展速度停滞，病情消退，病情改善和病情治愈。还包括了作为预防措施(即预防)的治疗。对于癌症，“治疗”可能是指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移或其一些组合。对于肿瘤，“治疗”包括去除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤的发展或其某种组合。

如本文所用，术语“有效量”涉及活性化合物的量或包含活性化合物的材料、组合物或剂量的量，其在按照所需的治疗方案施用时有效用于产生与合理的益处/风险比相称的某些所需的治疗效果。例如，当与治疗PD-L1/LAG-3相关疾病或病症联合使用时，“有效量”是指抗体或其抗原结合部分有效治疗所述疾病或病症的量或浓度。

如本文所用，关于哺乳动物中的某种疾病状况的术语“预防”、“防止”或“阻止”是指预防或延迟疾病的发作或预防其临床或亚临床症状的表现。

如本文所用，术语“药学上可接受”是指媒介物、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于pH调节剂、表面活性剂、佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文所用，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，其在与抗原一起递送至生物体或被提前递送至生物体时可以增强生物体中的对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。存在多种佐剂，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)，短小棒状杆菌，脂多糖，细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂更常用于临床试验。

双特异性抗体及其抗原结合部分

在某些实施方案中，本文中提供的抗体及其抗原结合片段是双特异性的。在一些实施方案中，本文中提供的抗体及其抗原结合片段具有对PD-L1的第一特异性，和不同于PD-L1的第二特异性。在一些实施方案中，第二特异性是针对不同于PD-L1的第二抗原并且任选地，其阻断可以产生相比于阻断单独一个抗原的协同作用。具体地，第二抗原是LAG-3。

根据某些例示性实施方案，本公开包括双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含特异性结合PD-L1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域。这类抗体在本文中可称为，例如“抗PD-L1/抗LAG-3”或“抗PD-L1/LAG-3”或“抗PD-L1xLAG-3”或“PD-L1xLAG-3”双特异性抗体，或其他类似的命名。

本公开的双特异性抗体能够以高亲和力结合人PD-L1或LAG-3。如本文公开的PD-L1和LAG-3抗原可以衍生自食蟹猴、小鼠或人等。PD-L1和LAG-3抗原可以表达为可溶性蛋白或在细胞表面表达。优选地，PD-L1和LAG-3蛋白是人PD-L1和LAG-3蛋白。

本公开的抗体对PD-L1或LAG-3的结合可使用本领域中确立的一种或多种技术(例如ELISA)来评估。本公开的抗体的结合特异性也可以通过监测抗体对表达PD-L1蛋白或LAG-3蛋白的细胞的结合(例如流式细胞术)来测定。例如，可以通过流式细胞术测试抗体，其中使抗体与表达人PD-L1的细胞系反应，例如经过转染以在其细胞表面上表达PD-L1的CHO细胞。另外或者备选地，可以在BIAcore结合测定法中测试抗体的结合，包括结合动力学(例如K_D值)。其他合适的结合测定法包括ELISA或FACS测定法，例如可使用重组PD-L1蛋白。例如，本公开的抗体以1×10^-7M或更低的K_D结合人PD-L1蛋白、以5×10^-8M或更低的K_D结合人PD-L1蛋白、以2×10^-8M或更低的K_D结合人PD-L1蛋白、以1×10^-8M或更低的K_D结合人PD-L1蛋白、以5×10^-9M或更低的K_D结合人PD-L1蛋白、以4×10^-9M或更低的K_D结合人PD-L1蛋白、以3×10^-9M或更低的K_D结合人PD-L1蛋白、以2×10^-9M或更低的K_D结合人PD-L1蛋白、以1×10^-9M或更低的K_D结合人PD-L1蛋白、以5×10^-10M或更低的K_D结合人PD-L1蛋白、以4×10^-10M或更低的K_D结合人PD-L1蛋白，如通过表面等离子共振测量的。

再例如，可以通过流式细胞术测试抗体，其中使抗体与表达人LAG-3的细胞系反应，例如经过转染以在其细胞表面上表达LAG-3的CHO或293F细胞。另外或者备选地，可以在BIAcore结合测定法中测试抗体的结合，包括结合动力学(例如K_D值)。其他合适的结合测定法包括ELISA或FACS测定法，例如可使用重组LAG-3蛋白。例如，本公开的抗体以1×10^-7M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白、以5×10^-8M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白、以2×10^-8M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白、以1×10^-8M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白、以5×10^-9M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白、以4×10^-9M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白、以3×10^-9M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白、以2×10^-9M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白、以1×10^-9M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白、或以5×10^-10M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白，如通过表面等离子共振测量的。

特异性结合PD-L1的第一抗原结合结构域

如本文公开的PD-L1结合结构域可以选自特异性结合PD-L1的多种抗体形式或片段。在一些实施方案中，PD-L1结合结构域可以是例如但不限于Fab、F(ab’)2、scFv、VHH和dAb。特别地，PD-L1结合结构域是VHH结构域。在一些实施方案中，PD-L1结合结构域包含重链可变区或域或者由其组成。具体地，该重链可变区或域包含一个或多个选自下组的重链CDR(CDRH)：

(i)包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的氨基酸序列的CDRH1；

(ii)包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的氨基酸序列的CDRH2；和

(iii)包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的氨基酸序列的CDRH3。

在一些特定的实施方案中，重链可变区或域包含：(i)包含SEQ ID NO:1或由其组成的CDRH1；(ii)包含SEQ ID NO:2或由其组成的CDRH2；和(iii)包含SEQ ID NO:3或由其组成的CDRH3。

在一些实施方案中，PD-L1结合结构域的重链可变区包含：(i)SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO:7至少85％、90％或95％相同的氨基酸序列；或(iii)与SEQ IDNO:7相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

PD-L1结合结构域可以是重链可变域，其在本文中与术语“VHH”、“VHH结构域”、“VHH抗体片段”、“V_HH”或“纳米抗体”等互换使用。源自骆驼科动物抗体的V_HH分子是已知的最小的完整抗原结合结构域(约15kDa，或是常规IgG的10分之一)，因此非常适合递送至致密组织和进入大分子之间的有限空间。

本领域技术人员可以根据本领域已知的方法或任何未来方法来制造本公开的VHH或单可变结构域。例如，可以使用本领域已知的方法获得VHH，例如通过免疫骆驼并从中获得杂交瘤，或通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆本发明的VHH的文库并然后通过使用噬菌体展示进行选择。

例如，可以通过用所需抗原免疫美洲驼或羊驼并随后分离编码重链抗体的mRNA来获得VHH。通过逆转录和聚合酶链反应，产生了包含数百万个克隆的单域抗体的基因库。噬菌体展示和核糖体展示等筛选技术有助于鉴定结合抗原的克隆。一种技术是噬菌体展示，其中在噬菌体上合成(例如人)抗体的文库，用目的抗原或其抗体结合部分筛选文库，并分离结合抗原的噬菌体，可以从其获得免疫反应片段。用于制备和筛选此类文库的方法是本领域众所周知的并且用于生成噬菌体展示文库的试剂盒是可商购的(例如，PharmaciaRecombinant Phage Antibody System，目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZAP^TM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。还存在可用于生成和筛选抗体展示文库的其他方法和试剂(参见例如，Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982(1991))。

当鉴定出最有效的克隆时，通过例如亲和力成熟或人源化来优化其DNA序列。人源化可以防止人机体针对抗体的免疫反应。

因此，可以通过以下来获得VHH：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列的表达；(3)通过天然存在的VHH结构域的“人源化”或通过编码这种人源化VHH结构域的核酸的表达；(4)通过来自任何动物物种，特别是哺乳动物物种(例如来自人类)的天然存在的VH结构域的“骆驼化”，或通过编码这种骆驼化VH结构域的核酸的表达；(5)通过“结构域抗体”或“dAb”的“骆驼化”，或通过编码这种骆驼化VH结构域的核酸的表达；(6)采用合成或半合成技术制备蛋白质、多肽或其他氨基酸序列；(7)通过使用核酸合成的技术制备编码VHH的核酸，然后表达由此获得的核酸；和/或(8)通过上述的任意组合。基于本文的公开内容，用于执行前述内容的合适的方法和技术对于本领域技术人员将是清楚的，并且例如包括下文中更详细描述的方法和技术。

通常通过将从免疫动物获得的血液、淋巴结或脾cDNA的可变域储库(repertoire)PCR克隆到噬菌体展示载体中来生成单可变结构域或单域抗体(sdAb)。一般通过淘选固定化抗原上的噬菌体文库来选择抗原特异性单域抗体，所述固定化抗原为例如包被在试管塑料表面上的抗原，固定在链霉亲和素珠上的生物素化抗原或在细胞表面表达的膜蛋白。sdAb的亲和力通常可以通过在体外模拟这种策略来提高，例如通过CDR区进行定点诱变并在严格性增加(更高的温度，高或低的盐浓度，高或低pH和低抗原浓度)的条件下在固定化的抗原上进一步淘选(Wesolowski等人，Single domain antibodies:promisingexperimental and therapeutic tools in infection and immunity.Med MicrobiolImmunol(2009)198:157-174)。

在参考文献中描述了制备特异性结合抗原或表位的VHH的方法，例如：R.van derLinden等人,Journal of Immunological Methods,240(2000)185-195；Li等人,J BiolChem.,287(2012)13713-13721；Deffar等人,African Journal of Biotechnology Vol.8(12),pp.2645,17June,2009和WO94/04678。

在一些实施方案中，双特异性抗体中的第一VHH融合于抗体的Fc结构域，例如IgG(例如，IgG4或IgG1)的Fc结构域。在一些具体的实施方案中，Fc结构域是人IgG1的Fc结构域。通过将VHH融合于Fc结构域，募集效应子功能可能更有效。而且，VHH与Fc结构域的融合可以帮助多肽链形成二聚体，并且还可以帮助延长双特异性抗体在体内的半衰期。

特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域

类似地，如本文公开的LAG-3结合结构域可以选自能特异性结合LAG-3的多种抗体形式或片段。在一些实施方案中，LAG-3结合结构域可以是例如但不限于Fab、F(ab’)2、scFv、VHH和dAb。特别地，LAG-3结合结构域是VHH结构域。在一些实施方案中，LAG-3结合结构域包含重链可变区或域或者由其组成，该重链可变区或域包含一个或多个选自下组的重链CDR(CDRH)：

(i)包含SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的氨基酸序列的CDRH1；

(ii)包含SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的氨基酸序列的CDRH2；和

(iii)包含SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失、或取代的氨基酸序列的CDRH3。

在一些实施方案中，重链可变区或域包含：(i)包含SEQ ID NO:4或由其组成的CDRH1；(ii)包含SEQ ID NO:5或由其组成的CDRH2；和(iii)包含SEQ ID NO:6或由其组成的CDRH3。

在一些实施方案中，第二单可变结构域的重链可变区或域包含：(i)SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO:8至少85％、90％或95％相同的氨基酸序列；或(iii)与SEQ ID NO:8相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

除非另有说明，否则将氨基酸分配给每个CDR可以根据以下提供的编号方案之一：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版),USDept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242；Chothia等人,1987,PMID:3681981；Chothia等人,1989,PMID:2687698；MacCallum等人,1996,PMID:8876650；或Dubel编(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies,第3版,Wily-VCHVer4-1BB GmbH and Co.。

抗体序列中的可变区和CDR可以根据本领域已经开发的一般规则(如上所述，例如Kabat编号系统)或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。在Kontermann和Dubel编,Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001和Dinarello等人,CurrentProtocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000中描述了鉴定这些区域的方法。抗体序列的示例性数据库描述于并可获自www.bioinf.org.uk/abs上的“Abysis”网站(由Department of Biochemistry&Molecular Biology UniversityCollege London,London,England的A.C.Martin维护)和VBASE2网站www.vbase2.org，如Retter等人,Nucl.Acids Res.,33(Database issue):D671-D674(2005)中所述。优选使用Abysis数据库分析序列，其整合了来自Kabat、IMGT和蛋白质数据库(PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据，参见Dr.Andrew C.R.Martin所著的书中的章节Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains.In:Antibody Engineering LabManual(Ed.:Duebel,S.和Kontermann,R.,Springer-Ver4-1BB,Heidelberg,ISBN-13:978-3540413547，也可在网站bioinforg.uk/abs上获得)。Abysis数据库网站还包括已经开发用于识别可以根据本文的教导使用的CDR的一般规则。除非另有说明，否则本文所述的所有CDR均根据Kabat的Abysis数据库网站获得。

两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))确定，该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以通过Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))确定，其已并入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。

另外地或可选地，本公开的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来执行针对公共数据库的搜索以例如识别相关序列。这种搜索可以使用Altschul,等人(1990)J.MoI.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)来执行。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本公开的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可使用Gapped BLAST，如Altschul等人,(1997)Nucleic AcidsRes.25(17):3389-3402中所述的。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

在一些实施方案中，可变区的氨基酸序列可以与上述相应序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同。

优选地，分离的抗体或其抗原结合部分的CDR包含不多于2个氨基酸或不多于1个氨基酸的保守取代。本文使用的术语“保守取代”是指氨基酸取代，其不会不利地影响或改变包含该氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小，形状，电荷，化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

双特异性抗体的生成

本文提供的双特异性抗体和抗原结合部分可以通过本领域已知的任何合适方法来制备。在常规方法中，两个具有不同抗原结合特异性的重链单可变结构域可以在宿主细胞中共表达，以重组方式产生双特异性抗体，然后例如通过亲和层析纯化。

也可以使用重组方法，其中将编码针对两种特异性的抗体重链可变域的序列分别融合至免疫球蛋白恒定结构域序列，然后插入表达载体并转染到合适的宿主细胞以重组表达双特异性抗体。

在某些实施方案中，双特异性抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以直接或间接地彼此连接。在某些实施方案中，双特异性抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以通过接头彼此连接。在一些具体的实施方案中，接头是肽接头。在某些实施方案中，双特异性抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以通过包含接头和Fc区的序列彼此连接。

在某些实施方案中，双特异性抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以直接或间接彼此连接，并进一步结合至Fc区以形成本公开的双特异性抗原结合分子。备选地，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以连接至Fc区。本公开的双特异性抗原结合分子通常将在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域之间包含Fc区。

本公开的双特异性抗体的Fc区可以是人IgG Fc区。本公开的双特异性抗体的Fc区可以具有任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些实施方案中，Fc区为IgG1同种型。

在本公开的双特异性抗体的背景下，与指定的Fc区嵌合形式相比，Fc区可以包含一个或多个氨基酸改变(例如，插入，缺失或取代)，而不改变所需的功能性。例如，本公开包括在Fc区中包含一个或多个修饰的双特异性抗原结合分子，其导致在Fc与FcRn之间具有修饰的结合相互作用(例如增强或减弱)的修饰的Fc区。此类Fc修饰的非限制性实例包括例如在人IgG4 Fc区的氨基酸序列的位置228上丝氨酸(“S”)突变为脯氨酸(“P”)。

在某些实施方案中，Fc修饰包含LALA突变，即根据Kabat等人的EU编号，L234A和L235A的突变。当指可变域中的残基(约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人，Sequences of Immunological Interest.5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。当指免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等人报道的EU索引，见上文)。“Kabat中的EU编号”或“Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，否则在抗体恒定结构域中提及残基编号是指通过EU编号系统的残基编号。

双特异性抗体的效果

本公开的抗体能够以高亲和力结合人PD-L1和LAG-3蛋白；与人PD-2或CD4没有交叉反应性结合；阻断PD-1与PD-L1之间的结合，以及阻断LAG-3与MHC-II或FGL-1之间的结合；诱导更高水平的细胞因子(例如IL-2)产生；并提供比单独或组合使用的单特异性抗PD-L1或LAG-3抗体显著更好的抗肿瘤功效。

编码本公开的抗体的核酸分子

在一些方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的双特异性抗体的第一重链可变区和/或第二重链可变区的核酸序列。

特定地，编码抗体的第一重链可变区的分离的核酸分子可以包含选自下组的核酸序列：

(A)编码如SEQ ID NO:7所示重链可变区的核酸序列；

(B)SEQ ID NO:9所示的核酸序列；或

(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。

编码抗体的第二重链可变区的分离的核酸分子可以包含选自下组的核酸序列：

(A)编码如SEQ ID NO:8所示重链可变区的核酸序列；

(B)SEQ ID NO:10所示的核酸序列；或

(C)在高严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。

在一些方面，本发明涉及包含编码如本文所公开的核酸序列的载体。在另一个实施方案中，表达载体进一步包含编码双特异性抗体例如人源化双特异性抗体的恒定区的核苷酸序列。

在本公开的上下文中载体可以是任何合适的载体，包括染色体的、非染色体的和合成的核酸载体(包含一组合适的表达控制元件的核酸序列)。这样的载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，和病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一些实施方案中，编码PD-L1或LAG-3结合结构域的核酸包含在裸DNA或RNA载体中，包括例如线性表达元件(描述于例如Sykes和Johnston,NatBiotech 17,355-59(1997))、紧密核酸载体(描述于例如US 6,077,835和/或WO 00/70087)、质粒载体例如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119、"midge"最小尺寸的核酸载体(描述于例如Schakowski等人,Mol Ther 3,793-800(2001))或作为沉淀的核酸载体构建体，例如CaP04-沉淀的构建体(描述于例如WO200046147,Benvenisty和Reshef,PNAS USA 83,9551-55(1986),Wigler等人,Cell 14,725(1978)和Coraro和Pearson,SomaticCellGenetics 7,603(1981))。这样的核酸载体和其用途是本领域众所周知的(参见例如US 5,589,466和US 5,973,972)。

在一些实施方案中，载体适合在细菌细胞中表达抗PD-L1/LAG-3双特异性抗体。这样的载体的实例包括表达载体，例如BlueScript(Stratagene)、pIN载体(Van Heeke&Schuster,J Biol Chem 264,5503-5509(1989)、pET载体(Novagen,Madison WI)等)。载体还可或备选地是适合在酵母系统中表达的载体。可使用合适在酵母系统中表达的任何载体。合适的载体包括，例如包含组成型或诱导型启动子，例如α因子、醇氧化酶和PGH启动子的载体(综述于：F.Ausubel等人编,Current Protocols in MolecularBiology,GreenePublishing and Wiley InterScience New York(1987)和Grant等人,Methods inEnzymol 153,516-544(1987))。

载体还可或备选地是适合在哺乳动物细胞中表达的载体，例如，包含谷氨酰胺合成酶作为可选择标记的载体，例如描述于Bebbington(1992)Biotechnology(NY)10:169-175中的载体。

核酸和/或载体还可包含编码分泌/定位序列的核酸序列，所述序列可将多肽，例如新生的多肽链靶向周质空间或进入细胞培养基。这样的序列是本领域已知的，包括分泌前导或信号肽。

载体可包含任何合适的启动子、增强子和其它表达促进元件或与其缔合。这样的元件的实例包括强表达启动子(例如人CMV IE启动子/增强子以及RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR启动子)、有效的多聚(A)终止序列、在大肠杆菌中质粒产物的复制起点、作为可选择标记的抗生素抗性基因和/或方便的克隆位点(例如，聚合接头)。核酸还可包含与组成型启动子相对的诱导型启动子，例如CMV IE。

在再一个方面，本公开涉及包含本文所述的载体的宿主细胞。

因此，本发明还涉及用于产生本公开的双特异性抗体的重组的真核或原核宿主细胞，例如转染瘤。双特异性抗体可在重组的真核或原核宿主细胞例如转染瘤中表达，其产生本文定义的本公开的抗体。

宿主细胞的实例包括酵母、细菌、植物和哺乳动物细胞，例如CHO、CHO-S、HEK，HEK293、HEK-293F、Expi293F、PER.C6或NS0细胞或淋巴细胞。例如，在一些实施方案中，宿主细胞可包含稳定整合至细胞基因组的第一和第二核酸构建体，其中所述核酸构建体包含如上文描述的编码第一和第二抗原结合结构域的核酸序列。在另一个实施方案中，本公开提供包含非整合核酸，例如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件的细胞，其包含上文指定的第一和第二核酸构建体。

在再一个方面，本公开涉及转基因非人动物或植物，其包含编码如本文所述的双特异性抗体的一条链的核酸，其中所述动物或植物产生本公开的双特异性抗体。在又一个方面，本发明涉及杂交瘤，其产生用于本公开的双特异性抗体的抗体片段。

在一个方面，本公开涉及表达载体，其包含

(i)核酸序列，其编码根据本文公开的任一个实施方案的第一抗原结合结构域；

(ii)核酸序列，其编码根据本文公开的任一个实施方案的第二抗原结合结构域；

(iii)核酸序列，其编码Fc区；

(iv)核酸序列，其编码接头；或

(v)上述至少两种的任意组合。

在一个方面，本公开涉及编码序列表中所列一种或多种氨基酸序列的核酸构建体。

在一个方面，本公开涉及产生根据本文公开的任一个实施方案的双特异性抗体的方法，包括培包含表达本文公开的双特异性抗体的一种或多种表达载体的宿主细胞，和从培养基纯化所述抗体。在一个方面，本公开涉及包含如上文定义的表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是重组真核、重组原核或重组微生物宿主细胞。

药物组合物

在一些方面，本公开涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所公开的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

组合物的组分

药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本公开的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗组合施用，使得抗PD-L1/抗LAG-3双特异性抗体增强免疫应答。药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体，凝胶或固体载体，水性介质，非水性介质，抗微生物剂，等渗剂，缓冲剂，抗氧化剂，麻醉剂，悬浮/分散剂，螯合剂，稀释剂，佐剂，赋形剂或无毒的辅助物质，或其他本领域已知的各种组分的组合。

合适的组分可以包括例如抗氧化剂，填充剂，粘合剂，崩解剂，缓冲剂，防腐剂，润滑剂，调味剂，增稠剂，着色剂，乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸，抗坏血酸，EDTA，硫代硫酸钠，铂，过氧化氢酶，柠檬酸，半胱氨酸，巯基甘油，巯基乙酸，巯基山梨糖醇，丁基甲基苯甲醚，丁基化羟基甲苯和/或丙基砷酸盐。如本文所公开的，在包含双特异性抗体或其抗原结合片段的溶剂中，还包括了一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸，从而将可能被氧化的抗体或其抗原结合片段还原。氧化还原可防止或减少结合亲和力的降低，从而增强抗体稳定性并延长保质期。因此，在一些实施方案中，本公开提供了包含一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。本公开进一步提供了多种方法，其中将抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合，从而可以防止抗体或其抗原结合片段氧化，以延长其保质期和/或增加活性。

为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如含水媒介物，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液，非水性媒介物如植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油，抑细菌或抑真菌浓度的抗微生物剂，等渗剂如氯化钠或葡萄糖，缓冲剂如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，抗氧化剂如硫酸氢钠，局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨酯80(TWEEN-80)，隔绝剂或螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)，乙醇，聚乙二醇，丙二醇，氢氧化钠，盐酸，柠檬酸或乳酸。用作载体的抗微生物剂可以添加到多剂量容器中的药物组合物中，且包括酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。合适的赋形剂可以包括例如水，盐水，右旋糖，甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂，溶解度增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。

施用、制剂和剂量

本公开的药物组合物可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者，所述途径包括但不限于口服、静脉内、动脉内、皮下、肠胃外、鼻内、肌内、颅内、心内、心室内、气管内、口腔、直肠、腹膜内、皮内、局部、经皮和鞘内，或者通过植入或吸入。本发明组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。根据预期的应用和治疗方案可以选择合适的制剂和施用途径。

用于肠内施用的合适制剂包括硬或软的明胶胶囊、丸剂、片剂(包括包衣片剂)、酏剂、混悬剂、糖浆剂或吸入剂及其控释剂型。

适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括活性成分溶解、悬浮于其中或以其他方式提供的(例如，在脂质体或其他微粒中)的水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如溶液，混悬液)。这些液体可以另外含有其它药学上可接受的成分，例如抗氧化剂，缓冲剂，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水，醇，多元醇，甘油，植物油等。适用于此类制剂的等渗载体的实例包括氯化钠注射液，林格溶液或乳酸林格氏注射液。类似地，特定剂量方案(包括剂量，时间和重复)将取决于具体个体和个体的病史以及诸如药代动力学(例如半衰期，清除率等)的经验考虑。

施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且基于减少增殖或致瘤细胞的数量，维持这种肿瘤细胞的减少，减少肿瘤细胞的增殖或延迟转移的发展。在一些实施方案中，施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。或者，本发明治疗组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。

本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性，施用途径，施用时间，化合物排泄速率，治疗持续时间，其他联合使用的药物、化合物和/或材料，病症的严重程度，以及患者的种类、性别、年龄、体重、病情、一般健康状况和以前的病史。化合物的量和施用途径最终由医生、兽医或临床医师决定，但通常选择剂量以达到实现所需效果的作用部位处的局部浓度，而不会导致实质性的有害或不利副作用。

通常，本发明的抗体或其抗原结合部分可以以各种范围施用。这些包括每剂量约5μg/kg体重至约100mg/kg体重；每剂量约50μg/kg体重至约5mg/kg体重；每剂量约100μg/kg体重至约10mg/kg体重。其他范围包括每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重和每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重。在一些实施方案中，每剂量为至少约100μg/kg体重，至少约250μg/kg体重，至少约750μg/kg体重，至少约3mg/kg体重，至少约5mg/kg体重，至少约10mg/kg体重。

无论如何，本公开的抗体或其抗原结合部分优选根据需要施用于有需要的受试者。本领域技术人员可以确定施用频率，例如主治医生基于所治疗病况、所治疗受试者的年龄、所治疗病症的严重程度、所治疗受试者的一般健康状况等的考虑。

在某些优选的实施方案中，涉及本公开的抗体或其抗原结合部分的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用多剂量的所选药物产品。更具体地说，本公开的抗体或其抗原结合部分可以每天，每两天，每四天，每周，每十天，每两周，每三周，每月，每六周，每两个月，每十周或每三个月施用一次。就此而言，可以理解的是，可以基于患者响应和临床实践来改变剂量或者调整间隔。

在已给予一次或多次施用的个体中也可凭经验确定所公开的治疗组合物的剂量和方案。例如，可给予个体增量剂量的如本文所述产生的治疗组合物。在选定的实施方案中，剂量可分别根据经验确定或观察到的副作用或毒性逐渐增加或减少或减轻。为了评估所选择的组合物的功效，可以如前所述跟踪特定疾病、病症或病情的标志。对于癌症，这些包括通过触诊或视觉观察直接测量肿瘤大小，通过X射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活组织检查和肿瘤样品的显微镜检查评估的改善；测量根据本文所述方法鉴定的间接肿瘤标志物(例如用于前列腺癌的PSA)或致瘤性抗原，疼痛或麻痹的减轻；与肿瘤相关的言语、视力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或通过接受的测试测量的生活质量的提高或生存期的延长。本领域技术人员将明白，剂量将根据个体、肿瘤病情的类型、肿瘤病情的阶段、肿瘤病情是否已开始转移至个体中的其他位置以及过去使用的治疗和并行使用的治疗而变化。

用于肠胃外施用(例如静脉内注射)的相容制剂将包含浓度为约10μg/ml至约100mg/ml的本文公开的抗体或其抗原结合部分。在某些选定的实施方案中，抗体或其抗原结合部分的浓度将包括20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml或1mg/ml。在其他优选的实施方案中，ADC浓度将包括2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，8mg/ml，10mg/ml，12mg/ml，14mg ml，16mg/ml，18mg/ml，20mg/ml，25mg/ml，30mg/ml，35mg/ml，40mg/ml，45mg/ml，50mg/ml，60mg/ml，70mg/ml，80mg/ml，90mg/ml或100mg/ml。

本公开的应用

在一些方面，本公开提供了治疗受试者中疾病或病况的方法，其包括向需要治疗的受试者(例如人)施用治疗有效量的如本文公开的抗体或其抗原结合部分。例如，所述疾病或病况可以是癌症、自身免疫性疾病或感染性疾病。

可以使用本公开提供的方法治疗或预防涉及PD-L1和/或LAG-3的多种癌症，无论是恶性的还是良性的，以及是否是原发性的或继发性的。这些癌症可以是实体癌或血液恶性肿瘤。这些癌症的实例包括肺癌如支气管癌(例如鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞癌和腺癌)、肺泡细胞癌、支气管腺瘤、软骨性错构瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；心脏癌如粘液瘤、纤维瘤和横纹肌瘤；骨癌例如骨软骨瘤、软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤、巨细胞瘤、软骨肉瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、尤因氏肿瘤(尤因氏肉瘤)和网织细胞肉瘤；脑癌例如神经胶质瘤(例如多形性成胶质细胞瘤)、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脊索瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、松果体瘤、骨瘤、血管母细胞瘤、颅咽管瘤、生殖细胞瘤、畸胎瘤、皮样囊肿和血管瘤；消化系统中的癌症如结肠癌、平滑肌瘤、表皮样癌、腺癌、平滑肌肉瘤、胃腺癌、肠脂肪瘤、肠神经纤维瘤、肠纤维瘤、大肠息肉和结肠直肠癌；肝癌如肝细胞腺瘤、血管瘤、肝细胞癌、纤维板层癌、胆管癌、肝母细胞瘤和血管肉瘤；肾癌如肾腺癌、肾细胞癌、高肾上腺瘤和肾盂的移行细胞癌；膀胱癌；血液系统癌症如急性淋巴细胞白血病(急性淋巴细胞性白血病)、急性骨髓性(髓细胞性、骨髓、成髓细胞性、骨髓单核细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病(例如Sezary综合征和毛细胞性白血病)、慢性髓细胞性(髓性、骨髓性、粒细胞性)淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、蕈样真菌病和骨髓增殖性疾病(包括骨髓增生性疾病，如真性红细胞增多症、骨髓纤维化、血小板增多症和慢性粒细胞白血病)；皮肤癌如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、卡波西肉瘤和佩吉特氏病；头颈部癌症；与眼相关的癌症，如成视网膜细胞瘤和眼内黑素癌；男性生殖系统癌症如良性前列腺增生、前列腺癌和睾丸癌(例如精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌和绒毛膜癌)；乳腺癌；女性生殖系统癌症如子宫癌(子宫内膜癌)、宫颈癌(宫颈肿瘤)、卵巢癌(卵巢肿瘤)、外阴癌、阴道癌、输卵管癌和葡萄胎；甲状腺癌(包括乳头状、滤泡状、间变性或髓样癌)；嗜铬细胞瘤(肾上腺)；甲状旁腺的非癌性生长；胰腺癌；和血液学癌症例如白血病、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。在一些特定的实施方案中，癌症是结肠癌。

在一些实施方案中，癌症的实例包括但不限于B细胞癌，包括B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中间级别扩散性NHL；高级别免疫母细胞NHL；高级别淋巴母细胞NHL；高级别小型非切割细胞NHL；大块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’sMacroglobulinemia)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，以及与瘢痣病相关的异常血管增生，水肿(例如与脑肿瘤相关的)，B细胞增殖性病症和Meigs'综合征。更具体的例子包括但不限于复发或难治性NHL，前线低级别NHL，III/IV期NHL，化疗耐受性NHL，前体B淋巴母细胞性白血病和/或淋巴瘤，小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞白血病和/或幼淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞幼淋巴细胞淋巴瘤，免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，结外边缘区-MALT淋巴瘤，淋巴结边缘区淋巴瘤，毛细胞白血病，浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤，低级/滤泡性淋巴瘤，中级/滤泡性NHL，套细胞淋巴瘤，滤泡中心淋巴瘤(滤泡状)、中间级别扩散性NHL、扩散性大B细胞淋巴瘤、侵袭性NHL(包括侵袭性前线NHL和侵袭性复发NHL)，自体干细胞移植后复发或对自体干细胞移植难治性的NHL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，高级免疫母细胞NHL，高级成淋巴细胞性NHL，高级小非裂解性细胞NHL，庞大疾病NHL，伯基特淋巴瘤，前体(外周)大颗粒淋巴细胞白血病，蕈样真菌病和/或塞扎里综合征，皮肤(皮肤性)淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤。

在一些实施方案中，癌症的实例包括但不限于B细胞增殖性病症，其进一步包括但不限于淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL))和淋巴细胞白血病。这种淋巴瘤和淋巴细胞白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤，b)小的非裂解性细胞淋巴瘤/伯基特淋巴瘤(包括地方性伯基特淋巴瘤，散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特淋巴瘤)，c)边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)，结节边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，d)套细胞淋巴瘤(MCL)，e)大细胞淋巴瘤(包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、弥漫性混合细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)，f)毛细胞白血病，g)淋巴细胞淋巴瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，h)急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，B细胞幼淋巴细胞性白血病，i)浆细胞赘生，浆细胞性骨髓瘤，多发性骨髓瘤，浆细胞瘤和/或j)霍奇金氏病。

在一些其他实施方案中，疾病或病况是自身免疫性疾病。可以用本文公开的抗体或其抗原结合部分治疗的自身免疫性疾病的实例包括自身免疫性脑脊髓炎、红斑狼疮和类风湿性关节炎等。所述抗体或其抗原结合部分也可用于治疗或预防感染性疾病，炎症性疾病(例如变应性哮喘)和慢性移植物抗宿主病。

与化疗组合使用

抗体或其抗原结合部分可以与抗癌剂、细胞毒性剂或化学治疗剂组合使用。

术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症例如癌症的任何药剂，并且包括但不限于细胞毒性剂、细胞抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化疗剂、放射疗法和放射治疗剂、靶向抗癌剂、BRM、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、放射疗法和抗转移剂和免疫治疗剂。应该理解的是，在如上所述的选定实施方案中，此类抗癌剂可以包含缀合物并且可以在施用之前与公开的双特异性抗体缔合。更具体而言，在一些实施方案中，将选择的抗癌剂连接至工程化抗体的未配对半胱氨酸以提供工程化的缀合物。因此，这样的工程化缀合物被明确地涵盖在本发明的范围内。在其他实施方案中，所公开的抗癌剂将与如上所述的包含不同治疗剂的位点特异性缀合物组合施用。

如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指对细胞有毒并降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。在一些实施方案中，该物质是源自活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实例包括但不限于以下的小分子毒素或酶促活性毒素：细菌(例如，白喉毒素，假单胞菌内毒素和外毒素，葡萄球菌肠毒素A)，真菌(例如α-八叠球菌素，局限曲霉素)，植物(相思豆毒蛋白，蓖麻毒素，蒴莲根毒素，槲寄生素，美洲商陆抗病毒蛋白，皂草素，白树毒素，momoridin，天花粉蛋白，大麦毒素，油桐(Aleurites fordii)蛋白，石竹素蛋白，Phytolacca mericana蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻风树毒蛋白，巴豆毒素，石碱草抑制剂，白树毒素，mitegellin，局限曲霉素，酚霉素，新霉素和单端孢霉烯族化合物)或动物(例如细胞毒性RNA酶，如胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或变体)。

为了本公开的目的，“化学治疗剂”包括非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖和/或存活的化学化合物(例如细胞毒性剂或细胞抑制剂)。这些化学试剂通常针对细胞生长或分裂所需的细胞内过程，因此对于通常快速生长和分裂的癌细胞特别有效。例如，长春新碱使微管解聚，从而抑制细胞进入有丝分裂。通常，化学治疗剂可以包括抑制或被设计用于抑制癌细胞或可能变成癌性或产生致瘤后代(例如TIC)的细胞的任何化学药剂。这些药剂通常是组合使用的，并且组合通常是最有效的，例如在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。

可以与本公开的抗体或其抗原结合部分组合使用的抗癌剂(作为位点特异性缀合物的组分或以未缀合状态)的实例包括但不限于烷化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺、多聚乙酰(acetogenins)、喜树碱、苔藓抑素、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、多拉司他汀、多卡米星、艾榴素(eleutherobin)、水鬼蕉碱、沙克迪因(sarcodictyin)、海绵素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔类抗生素、dynemicin、双膦酸盐、埃斯波霉素、色素蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡拉宾辛(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素类(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、

多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、博地霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗-代谢物、埃罗替尼、威罗菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依鲁替尼、恩杂鲁胺、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗-肾上腺素、叶酸补充剂如弗林酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯布希(bestrabucil)、比生群、依达曲沙、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋铵、爱波喜龙、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美坦生类化合物(maytansinoids)、米托胍腙、米托蒽醌、莫丹摩尔(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、

多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)、雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；卡西托欣(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；

吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱，

长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸；类视色素；卡培他滨；考布他汀；甲酰四氢叶酸；奥沙利铂；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制剂(其减少细胞增殖)，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包括的是用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂，抑制调节肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，和抗雄激素；以及曲沙他滨(1，3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、核酶诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，

rIL-2；

拓扑异构酶1抑制剂；

rmRH；长春瑞滨和埃斯波霉素，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

与放射疗法组合使用

本发明还提供了抗体或其抗原结合部分与放射疗法(即，用于在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，例如γ-照射、X-射线、UV-照射、微波、电子发射等)的组合。还涵盖使用放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的联合疗法，并且可以与靶向性的抗癌剂、抗体或缀合物或其他靶向手段结合使用。通常，放射疗法在约1周至约2周的时间段内以脉冲方式施用。放射疗法可以对患有头颈癌的受试者施用约6至7周。任选地，放射疗法可以作为单剂量或作为多个顺序剂量施用。

药物包装和试剂盒

还提供了包括一个或多个容器的药物包装和试剂盒，其中包含一个或多个剂量的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含例如抗体或其抗原结合部分，具有或不具有一种或多种其他试剂。对于其他实施方案，这种单位剂量以一次性使用的预充式注射用注射器供应。在一些实施方案中，单位剂量中包含的组合物可以包含盐水、蔗糖或类似物；缓冲液，如磷酸盐等；和/或配制在稳定和有效的pH范围内。或者，在一些实施方案中，抗体或组合物可以作为冻干粉末提供，其可以在加入合适的液体(例如无菌水或盐溶液)后重建。在某些优选的实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。容器上或与容器相关联的任何标签指示封装的抗体或组合物用于治疗选择的疾病或病况。

本公开还提供了用于产生抗体以及任选地一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。该试剂盒包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料，并且包含药学有效量的所公开的双特异性抗体或其缀合物、组合物等。在其他优选实施方案中，容器包括无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。这样的试剂盒通常在合适的容器中包含抗体的药学上可接受的制剂，并且任选地在相同或不同的容器中包含一种或多种抗癌剂。试剂盒还可以含有其他药学上可接受的制剂，用于诊断或组合治疗。例如，除了本公开的抗体或其抗原结合部分之外，这样的试剂盒可以含有任何一种或多种抗癌剂，例如化学治疗剂或放射治疗剂；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向抗癌剂；细胞毒性剂；和/或其他抗癌剂。

更具体地说，试剂盒可以具有含有所公开的抗体或其抗原结合部分的单个容器，其含有或不含另外的组分，或者它们可以具有用于每种所需试剂的不同容器。试剂盒还可以包含用于容纳无菌的药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器装置。

当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液优选为水溶液，特别优选无菌水溶液或盐水溶液。然而，试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。涵盖溶剂也可以提供于另一个容器中。

如上简要所述，所述试剂盒还可含有向患者施用抗体或其抗原结合部分和任何任选组分的工具，例如一种或多种针、I.V.袋或注射器，或者甚至滴眼器、移液管或其他类似装置，通过其可以将制剂注射或引入动物体内或将其施用于身体的患病区域。本公开的试剂盒通常还包括用于容纳小瓶或类似物的装置以及用于商业销售的其他紧密封闭的部件，例如注射或吹塑塑料容器，其中放置并且保持所需的小瓶和其他装置。

序列表概述

本申请附带有包含许多核酸和氨基酸序列的序列表。下表A、B和C提供了所包含的序列的概述。

如本文中公开的示例性抗体，即抗PD-L1/抗LAG-3双特异性抗体，称为“W3669-U15T4.G1-1.uIgG1LALA”或“W3669抗体”。

表A

W3669-U15T4.G1-1.uIgG1LALA的CDR

表B

W3669-U15T4.G1-1.uIgG1LALA的VHH的序列

表C

W3669-U15T4.G1-1.uIgG1LALA的其他序列

恒定区	接头	全长序列
			SEQ ID NO:11	SEQ ID NO:12	SEQ ID NO:13

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例并旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

实施例1

材料、基准抗体和细胞系的制备

1.1材料的制备

表1中提供了实施例中使用的市售材料的信息。

表1

1.2可溶性抗原的生成

由GENEWIZ(中国苏州)合成编码人PD-L1 ECD(NP_054862.1)的核酸，然后亚克隆到在C末端带有小鼠Fc标签的修饰的pcDNA3.3表达载体中。将该质粒转染到Expi293F细胞(ThermoFisher)中。在37℃、5％CO₂在Expi293^TM表达培养基(ThermoFisher)中培养细胞。培养5天后，将从瞬时转染的细胞的培养物中收获的上清液用于蛋白质纯化。通过镍、蛋白A和/或SEC柱纯化融合蛋白。

W315-hPro1.ECD.His、W315-mPro1.ECD.His和W315-cynoPro1.ECD.His分别对应于带有his标签的人、小鼠和食蟹猴PD-L1 ECD蛋白，购自Sino Biologics。

由Sangon Biotech合成编码人LAG-3ECD(UniProt-P18627)的核酸。从合成的核酸中扩增LAG-3基因片段，并将其插入修饰的pcDNA3.3表达载体中。通过将人LAG-3基因转染到Expi293F细胞(ThermoFisher)中，获得含有带人Fc标签的人LAG-3ECD的融合蛋白。在37℃、5％CO₂在Expi293^TM表达培养基(ThermoFisher)中培养细胞。培养5天后，将从瞬时转染的细胞的培养物中收获的上清液用于蛋白质纯化。融合蛋白通过蛋白A和/或SEC柱纯化。W339-hPro1.ECD(不带标签的LAG-3ECD蛋白)是通过使用Xa因子蛋白酶(New EnglandBiolabs)切割带有剪切位点的ECD-hFc融合蛋白而产生的。

由Sangon Biotech合成编码小鼠LAG-3ECD(UniProt-Q61790)的核酸。从合成的核酸中扩增LAG-3基因片段，并将其插入带有His标签的修饰的pcDNA3.3表达载体中。通过将质粒转染到Expi293F细胞(ThermoFisher)中获得W339-mPro1.ECD.His。在37℃、5％CO₂在Expi293^TM表达培养基(ThermoFisher)中培养细胞。培养5天后，将从瞬时转染的细胞的培养物中收获的上清液用于蛋白质纯化。蛋白质通过镍和/或SEC柱纯化。

1.3生成BMK抗体

W366-BMK1和W366-BMK2：如专利WO2017220569A1^[8]中所述，由GENEWIZ(中国苏州)合成编码FS18-7-9/84G09LALA和FS18-7-108-29/S1的DNA序列，然后亚克隆到哺乳动物细胞表达载体中。FS18-7-9/84G09LALA和FS18-7-108-29/S1是针对PD-L1和LAG-3的双特异性抗体，并且在下文中分别称为W366-BMK1和W366-BMK2。

WBP315-BMK8：基于专利US20130045202A1中公开的信息合成抗人PD-L1基准抗体(阿特珠单抗)的DNA序列，然后亚克隆到pcDNA3.3质粒中。该基准抗体在下文中称为WBP315-BMK8。

WBP339-BMK1：基于专利US20110150892A1中公开的信息(称为“25F7”)合成抗人LAG-3基准抗体的DNA序列，然后亚克隆到pcDNA3.3质粒中。该基准抗体在下文中称为WBP339-BMK1。

将质粒转染到Expi293细胞中。将细胞培养5天，并收集上清液使用蛋白A柱(GEHealthcare，175438)用于蛋白纯化。通过SDS-PAGE和SEC分析获得的抗体，然后储存在-80℃。

1.4细胞池/细胞系生成

生成人PD-L1表达细胞系(W315-CHO-K1.hPro1.C11)、小鼠PD-L1表达细胞系(W315-293F.mPro1.C1)和食蟹猴PD-L1表达细胞系(W315-293F.cynoPro1.2A2)。简而言之，使用Lipofectamine 2000转染试剂盒按照制造商的规程，分别用含有全长人、小鼠和食蟹猴PD-L1的pcDNA3.3表达载体转染CHO-K1或293F细胞。转染后48-72小时，将转染的细胞培养在含有杀稻瘟素的培养基中进行选择并测试PD-L1表达。通过有限稀释获得人PD-L1表达细胞系、食蟹猴PD-L1表达细胞系和小鼠PD-L1表达细胞系。

生成人LAG-3表达细胞系(W339-FlpIn293.hPro1.A3)、小鼠LAG-3表达细胞系(W339-FlpCHO.mPro1.A4)和食蟹猴LAG-3表达细胞系(W339-293F.cPro1.A4)。简而言之，使用Lipofectamine 2000转染试剂盒按照制造商的规程，分别用含有全长人、小鼠和食蟹猴LAG-3的pcDNA3.3表达载体转染Flp-In-293、Flp-In-CHO或293F细胞。转染后48-72小时，将转染的细胞培养在含有杀稻瘟素的培养基中进行选择并测试LAG-3表达。通过有限稀释获得人LAG-3表达细胞系、食蟹猴LAG-3表达细胞系和小鼠LAG-3表达细胞系。

实施例2

双特异性抗体的生成

抗PD-L1结构域抗体(VHH)和抗LAG-3VHH是分别通过免疫美洲驼，然后淘选并筛选噬菌体展示的VHH文库而获得的。将选定的用于构建双特异性抗体的VHH人源化并进行表征。所得序列列于表A和B中。

由GENEWIZ(中国苏州)对编码人源化抗PD-L1 VHH和抗LAG-3VHH的DNA序列进行密码子优化。然后在哺乳动物表达载体中，将抗PD-L1 VHH亚克隆在铰链区的N末端，并将抗LAG-3VHH亚克隆在具有LALA突变(L234A L235A)的人IgG1 Fc区的C末端。

将双特异性抗体的质粒转染到Expi293细胞中。将细胞培养五天，并收集培养上清液以使用蛋白A柱(GE Healthcare，175438)进行蛋白纯化。通过SDS-PAGE和HPLC-SEC分析获得的抗体(命名为W3669-U15T4.G1-1.uIgG1LALA)，然后储存在-80℃。

在整个公开中，W3669-U15T4.G1-1.uIgG1LALA也被简称为“W3669抗体”。其结构示意图和序列信息分别如图1A和1B所示。

实施例3

W3669双特异性抗体的体外表征

3.1通过SEC-HPLC的纯度

使用蛋白A色谱法纯化W3669抗体，然后使用SDS-PAGE和SEC-HPLC进行分析。使用Agilent 1260Infinity HPLC通过SEC-HPLC测试抗体的纯度。使用含50mM磷酸钠、0.15MNaCl，pH 7.0的缓冲液将50μL抗体溶液注入TSKgel SuperSW3000柱。运行时间为20分钟。在280nm处监测柱的峰保留时间。使用ChemStation软件(V2.99.2.0)分析数据。

结果：

如SDS-PAGE凝胶所示(图2A)，W3669抗体分别在非还原条件下显示的条带为～100kDa并在还原条件下显示的条带为～50kDa，与抗体的推定分子量相匹配。在SEC-HPLC谱中(图2B)，抗体显示对称单峰，计算的纯度为98.63％。两个数据集均表明该抗体制备物具有高纯度。

3.2通过ELISA/FACS确定的靶标结合

(I)人PD-L1结合

通过FACS确定双特异性抗体与细胞表面人PD-L1的结合。简而言之，将人PD-L1表达细胞W315-CHO-K1.hpro1.C11与多种浓度的PD-L1×LAG-3双特异性抗体孵育。使用PE标记的山羊抗人IgG抗体来检测PD-L1×LAG-3双特异性抗体与细胞的结合。通过流式细胞仪测量细胞的MFI，并通过FlowJo(7.6.1版)进行分析。使用GraphPad Prism 5软件(GraphPadSoftware，La Jolla，CA)确定细胞结合的EC50值。

通过ELISA确定双特异性抗体与人PD-L1蛋白的结合。简而言之，平板用1μg/mL的人PD-L1(W315-hPro1.ECD.mFc)在4℃包被过夜。封闭和洗涤后，将多种浓度的PD-L1×LAG-3双特异性抗体添加至平板中，并在室温孵育1小时。然后洗涤板，随后与HRP标记的山羊抗人IgG抗体一起孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物，并用2M HCl终止显色反应。使用酶标仪读取450nm处的吸光度。

结合结果示于图3和4中。如图3所示，W3669双特异性抗体与表达人PD-L1的CHO-K1细胞结合，结合的EC50和上限MFI值与对照双特异性抗体(W366-BMK1)和抗PD-L1抗体(W315-BMK8，即图3中的WBP315-BMK8.hIgG4)相当。

相似地，图4证明了W3669双特异性抗体结合重组人PD-L1蛋白，结合的EC50和上限值与对照双特异性抗体(W366-BMK1)和抗PD-L1抗体(W315-BMK8)相当。

(II)人LAG-3结合

通过FACS确定双特异性抗体与细胞表面人LAG-3的结合。简而言之，将人LAG-3表达细胞W339-FlpIn293.hPro1.A3与多种浓度的PD-L1×LAG-3抗体一起孵育。PE标记的山羊抗人IgG抗体用于检测W3669双特异性抗体与细胞的结合。通过流式细胞术测量细胞的MFI，并通过FlowJo进行分析。使用GraphPad Prism 5软件(GraphPad Software，La Jolla，CA)确定细胞结合的EC50值。

通过ELISA确定双特异性抗体与人LAG-3蛋白的结合。简而言之，平板用1μg/mL的山羊抗小鼠F(ab)₂在4℃包被过夜。封闭和洗涤后，将人LAG-3蛋白(W339-hPro1.ECD.mFc)以1μg/mL的浓度添加到平板中。将多种浓度的PD-L1×LAG-3双特异性抗体添加至平板，并在洗涤后在室温孵育1小时。然后洗涤板，随后与HRP标记的山羊抗人IgG抗体一起孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物，并用2M HCl终止显色反应。使用酶标仪读取450nm处的吸光度。

结果显示在图5和6中。如图5所示，W3669双特异性抗体结合人LAG-3转染的293细胞，其上限MFI值高于对照双特异性抗体(W366-BMK1)和抗LAG-3抗体(W339-BMK1，即图5中的WBP339-BMK1)。

另外，图6显示了W3669双特异性抗体结合重组人LAG-3蛋白。但是，W3669抗体的结合弱于双特异性BMK(W366-BMK1)和抗LAG-3BMK(W339-BMK1)，可能是因为在ELISA板上W3669抗体识别的表位改变了。

(III)与人PD-L1和LAG-3的双重结合

通过ELISA确定与人PD-L1和LAG-3蛋白的双重结合。平板用1μg/ml的小鼠抗His抗体在4℃包被过夜。封闭并洗涤后，将人LAG-3蛋白(W339-hPro1.ECD.His)以1μg/mL的浓度添加到平板中。将多种浓度的PD-L1×LAG-3抗体添加到平板中，并在洗涤后在室温孵育1小时。然后洗涤板，随后与生物素标记的带小鼠Fc标签的PD-L1蛋白(W315-hPro1.ECD.mFc)孵育1小时。洗涤后，将缀合有HPR的链霉亲和素添加至平板中，并在室温孵育0.5小时。洗涤后，加入TMB底物，并用2M HCl终止显色反应。使用酶标仪读取450nm处的吸光度。

通过FACS确定与细胞表面人PD-L1和LAG-3的双重结合。将人PD-L1表达细胞W315-CHO-K1.hpro1.C11和瞬时转染人LAG-3的细胞W339-293F.hPro1分别用Far red(Invitrogen-C34572)和CFSE(Invitrogen-C34554)染色。将两种类型的细胞与多种浓度的PD-L1×LAG-3抗体或对照抗体在4℃共孵育2小时。通过流式细胞仪测量与抗体连接的细胞的百分比(双阳性)，并通过FlowJo(7.6.1版)进行分析。

结果显示在图7和8中。图7表明W3669双特异性抗体和双特异性W366-BMK1同时结合人PD-L1和LAG-3蛋白，并且W3669双特异性抗体比W366-BMK1在EC50和上限(即y轴OD450值的最大值)明显表现出更好的性能。图8表明它们也同时结合人PD-L1表达细胞和LAG-3表达细胞。

3.3通过ELISA/FACS确定的旁系同源物结合

在与上述相同的规程中，通过FACS测量双特异性抗体对人PD-L2的交叉反应性。简而言之，将人PD-L2表达CHO-K1细胞与多种浓度的W3669双特异性抗体在室温孵育1小时。PE标记的山羊抗人IgG抗体用于检测W3669双特异性抗体与细胞的结合。通过流式细胞术测量细胞的MFI，并通过FlowJo进行分析。

还通过ELISA测量了与人CD4的交叉反应性。平板用1μg/ml的人CD4在4℃包被过夜。封闭和洗涤后，将多种浓度的W3669双特异性抗体添加到平板中，并在室温孵育1小时。然后洗涤板，随后与相应的二抗孵育60分钟。洗涤后，加入TMB底物，并用2M HCl终止显色反应。使用酶标仪读取450nm处的吸光度。

通过FACS和ELISA测量的W3669双特异性抗体对人PD-L2和人CD4的交叉反应性分别显示在图9A和9B中。结果表明，无论低浓度还是高浓度，W3669双特异性抗体均不能结合人PD-L2或人CD4。

3.4通过ELISA/FACS确定的跨物种靶标结合

(I)结合食蟹猴或小鼠PD-L1

平板用1μg/mL的食蟹猴PD-L1(W315-cynoPro1.ECD.His)或小鼠PD-L1(W315-mPro1.ECD.mFc)在4℃包被过夜。封闭和洗涤后，将多种浓度的W3669双特异性抗体添加到平板中，并在室温孵育1小时。然后洗涤板，随后与HRP标记的山羊抗人IgG抗体一起孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物，并用2M HCl终止显色反应。使用酶标仪读取450nm处的吸光度。

结果分别显示在图10和11中。图10表明W3669双特异性抗体结合重组食蟹猴PD-L1蛋白，该结合与对照双特异性抗体(W366-BMK1)和抗PD-L1抗体(W315-BMK8)相当。图11指示W3669双特异性抗体和抗PD-L1抗体(W315-BMK8)结合重组小鼠PD-L1蛋白，而双特异性BMK(W366-BMK1)仅在高浓度下显示弱结合。

(II)结合食蟹猴或小鼠LAG-3

平板用1μg/mL的小鼠抗His在4℃包被过夜。封闭并洗涤后，将食蟹猴LAG-3蛋白(Sino-90841-C08H)或小鼠LAG-3蛋白(W339-mPro1.ECD.His)以1μg/mL的浓度添加到平板中。将多种浓度的PD-L1×LAG-3抗体添加到平板中，并在洗涤后在室温孵育1小时。然后洗涤板，随后与HRP标记的山羊抗人IgG抗体一起孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物，并用2MHCl终止显色反应。使用酶标仪读取450nm处的吸光度。

结果如图12和13所示。如图12所示，W3669双特异性抗体结合重组食蟹猴LAG-3蛋白，该结合比对照双特异性抗体(W366-BMK1)稍好并且显著优于抗LAG-3抗体(W339-BMK1)。如图13所示，W3669双特异性抗体结合重组小鼠LAG-3蛋白，而对照双特异性抗体(W366-BMK1)显示弱结合。对照抗LAG-3抗体(W339-BMK1)不能结合小鼠LAG-3蛋白。

3.5通过表面等离子共振(SPR)测量的亲和力

通过使用Biacore 8K的SPR测定法检测对人、小鼠和食蟹猴PD-L1以及人和小鼠LAG-3蛋白的抗体结合亲和力。在固定有抗人IgG Fc抗体的CM5传感器芯片(GE)上捕捉每种抗体。将不同浓度的抗原以30uL/min的流速注射通过传感器芯片。在每个结合循环后将芯片用10mM pH 1.5甘氨酸再生。从测试传感图中减去空白表面和缓冲液通道的传感图值。将实验数据用Langmiur分析的1:1模型拟合。将50、50、40、40和40kDa的分子量分别用于计算分析物人、小鼠和食蟹猴PD-L1以及人和小鼠LAG-3蛋白的摩尔浓度。结果显示在下表2中。

表2：通过SPR测量的亲和力

如上表所示，W3669双特异性抗体可以以高亲和力结合人、小鼠和食蟹猴PD-L1以及人和小鼠LAG-3。

3.6配体竞争测定法

对PD-1蛋白结合PD-L1表达细胞的阻断：

将抗体在1％BSA-PBS中连续稀释，并在4℃与带有mFc标签的PD-1蛋白混合。将该混合物转移至接种有PD-L1阳性W315-CHO-K1.hpro1.C11细胞的96孔板中。山羊抗小鼠IgGFc-PE抗体用于检测PD-1蛋白与PD-L1表达细胞的结合。通过流式细胞术评估MFI，并通过FlowJo软件进行分析。

如图14所示，W3669双特异性抗体、对照双特异性BMK(W366-BMK1)和抗PD-L1抗体(W315-BMK8)阻断了PD1结合PD-L1表达细胞。W3669双特异性抗体在IC50和MFI最大值(即上限)方面获得了稍好的性能。

对LAG-3蛋白结合Raji细胞上表达的MHC-II的阻断：

将抗体在1％BSA-PBS中连续稀释，并在4℃与带有mFc标签的LAG-3蛋白一起孵育30分钟。将混合物转移到接种有Raji细胞的96孔板中。使用山羊抗小鼠IgG Fc-PE抗体来检测LAG-3蛋白与Raji细胞的结合。通过流式细胞术评估MFI，并通过FlowJo软件进行分析。

如图15所示，W3669双特异性抗体、双特异性BMK(W366-BMK1)和LAG-3BMK(W339-BMK1)阻断了LAG-3蛋白结合MHC-II表达Raji细胞。

对LAG-3蛋白结合FGL-1的阻断：

将96孔板用0.5μg/mL的人FGL-1(SB-13484-H08B)在4℃包被。将抗体在PBS中连续稀释并与带小鼠Fc标签的LAG-3蛋白混合。封闭并洗涤后，将混合物转移到平板上并在室温孵育1小时。然后洗涤板，随后与HRP标记的抗小鼠IgG抗体一起孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物，并用2M HCl终止显色反应。使用酶标仪读取450nm处的吸光度。

如图16所示，W3669双特异性抗体、双特异性BMK(W366-BMK1)和LAG-3BMK(W339-BMK1)阻断了LAG-3蛋白结合FGL-1蛋白。下表总结了PD-L1和LAG-3阻断的IC50值。

表3

3.7基于细胞的功能测定法

抗PD-L1×LAG-3双特异性抗体在PD-1-NFAT报告基因测定法中的作用：

将表达人PD-1以及稳定整合的NFAT荧光素酶报告基因的Jurkat细胞与表达PD-L1的人工抗原呈递细胞(APC)一起接种在96孔板中。将不同的抗体与PD-L1⁺人工抗原呈递细胞和稳定整合了NFAT荧光素酶报告基因的PD-1⁺Jurkat细胞孵育。将平板在37℃，5％CO₂孵育6小时。孵育后，加入重构的荧光素酶底物，并通过微板分光光度计测量荧光素酶强度。

如图17所示，W3669双特异性抗体、对照双特异性抗体(W366-BMK1)和抗PD-L1抗体(W315-BMK8)诱导NFAT表达，表明这些抗体诱导了PD-1信号传导通路。

抗PD-L1×LAG-3双特异性抗体在LAG-3-IL-2报告基因测定法中的作用：

在SEE(葡萄球菌肠毒素E)存在下，将表达人LAG-3和稳定整合的IL-2荧光素酶报告基因的Jurkat细胞与Raji细胞一起接种在96孔板中。将不同的抗体添加到系统中，并将平板在37℃，5％CO₂孵育过夜。孵育后，添加重构的荧光素酶底物，并通过微板分光光度计测量与IL-2基因表达相关的荧光素酶强度。

如图18所示，W3669双特异性抗体、双特异性BMK(W366-BMK1)和LAG-3BMK(W339-BMK1)诱导IL-2表达，表明它们诱导了LAG-3信号传导通路。

抗PD-L1×LAG-3双特异性抗体对表达PD-1和LAG-3的IL-2报告基因测定法的作用：

将全长人LAG-3质粒瞬时转染到表达人PD-1和稳定整合的NFAT荧光素酶报告基因的Jurkat细胞中。48小时后，在SEE(葡萄球菌肠毒素E)存在下，将细胞与Raji细胞一起接种在96孔板中。将不同的抗体添加到系统中以测量其对IL2表达的影响。将平板在37℃，5％CO₂孵育过夜。孵育后，加入重构的荧光素酶底物，并通过微板分光光度计测量荧光素酶强度。

如图19所示，与抗LAG-3抗体(W339-BMK1)和抗PD-L1抗体(W315-BMK8)及其组合相比，W3669双特异性抗体和双特异性BMK(W366-BMK1)诱导了显著更高水平的IL-2表达倍数变化。

抗PD-L1×LAG-3双特异性抗体对人同种异体混合淋巴细胞反应的作用：

使用Ficoll-Paque PLUS梯度离心从健康供体中新鲜分离出人外周血单核细胞(PBMC)。根据制造商的说明，使用人单核细胞富集试剂盒分离单核细胞。将细胞在含有GM-CSF和IL-4的培养基中培养5至7天以产生树突细胞(DC)。根据制造商的方案，使用人CD4+T细胞富集试剂盒分离人CD4+T细胞。在多种浓度的W3669双特异性抗体存在下，将纯化的CD4+T细胞与同种异体未成熟DC(iDC)在96孔板中共培养。将平板在37℃，5％CO₂孵育。分别在第3天和第5天收获上清液用于IL-2和IFN-γ测试。使用匹配的抗体对通过ELISA测量人IL-2和IFN-γ的释放。重组人IL-2和IFN-γ分别用作标准品。平板分别用对人IL-2或IFN-γ具有特异性的捕获抗体进行预包被。封闭后，将50μL标准品或样品吸移到每个孔中，并在环境温度孵育2小时。除去未结合的物质后，将对相应细胞因子具有特异性的缀合有生物素的检测抗体添加到孔中，并孵育一小时。然后将HRP-链霉亲和素添加至孔中，在环境温度孵育30分钟。通过分配50μL TMB底物进行显色，然后用50μL的N HCl终止。使用微孔板分光光度计在450nM处读取吸光度。

如图20所示，W3669双特异性抗体、双特异性BMK(W366-BMK1)和PD-L1 BMK(W315-BMK8)增强了人同种异体混合淋巴细胞反应中的IL-2产生。

抗PD-L1×LAG-3双特异性抗体对人PBMC活化的作用：

在SEB存在下，将人PBMC和多种浓度的不同抗体在96孔板中共培养。将平板在37℃，5％CO₂孵育。在第3天收获上清液用于IL-2测试。使用匹配的抗体对通过ELISA测量人IL-2的释放。重组人IL-2分别用作标准品。平板分别用对人IL-2具有特异性的捕获抗体进行预包被。封闭后，将50μL标准品或样品吸移到每个孔中，并在环境温度孵育2小时。除去未结合的物质后，将对相应细胞因子具有特异性的缀合有生物素的检测抗体添加到孔中，并孵育一小时。然后将HRP-链霉亲和素添加至孔中，在环境温度孵育30分钟。通过分配50μLTMB底物进行显色，然后用50μL 2N HCl终止。使用微孔板分光光度计读取450nM处的吸光度。

将不同的抗体添加到用葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激的人PBMC中，然后测量IL2表达以指示T细胞活化。

与同种型对照相比，分泌的IL-2水平和倍数变化显示在图21A和21B中。如图所示，W3669双特异性抗体和PD-L1+LAG-3mab组合(在图21中称为“combo”)增强了SEB刺激的人PBMC的IL-2分泌，表明T细胞的活化。结果表明，W3669双特异性抗体在调节IL-2产生方面提供了更好的功效。

3.8通过DSF测量的热稳定性

使用QuantStudioTM 7Flex Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)研究了抗体的Tm。将19μL抗体溶液与1μL的62.5X SYPRO Orange溶液(Invitrogen)混合，然后转移到96孔板(Biosystems)中。将平板以0.9℃/min的速率从26℃加热至95℃，并收集得到的荧光数据。计算相对于不同温度的荧光变化的负导数，并且将最大值定义为解链温度Tm。如果蛋白质具有多个解折叠转换，则报告前两个Tm，分别命名为Tm1和Tm2。数据收集和Tm计算由操作软件自动进行。

W3669双特异性抗体和W366-BMK1的热稳定性通过差示扫描荧光法测量(图22A)。W3669双特异性抗体的Tm1为62.8℃(图22B)，而W366-BMK1的Tm1为57.7℃(图22C)。与双特异性W366-BMK1相比，W3669双特异性抗体的较高Tm1指示更好的热稳定性。

3.9血清稳定性

W3669双特异性抗体在37℃在新鲜分离的人血清(血清含量>95％)中孵育。在指定的时间点，从培养箱中取出血清处理过的样品的等分试样，并在液体N2中速冻，然后储存在-80℃直至准备测试。在稳定性测试之前，立即将样品快速融化。

对于在不同时间点取的等分试样，通过ELISA测试了与人PD-L1和LAG-3蛋白的双重结合。将平板用1μg/ml的小鼠抗His抗体在4℃包被过夜。封闭并洗涤后，将人LAG-3蛋白(W339-hPro1.ECD.His)以1μg/mL的浓度添加到平板中。将多种浓度的W3669双特异性抗体添加到平板中，并在洗涤后在室温孵育1小时。然后洗涤板，随后与生物素标记的带小鼠Fc标签的PD-L1蛋白(W315-hPro1.ECD.mFc)孵育1小时。洗涤后，将缀合有HPR的链霉亲和素添加到平板中，并在室温孵育0.5小时。洗涤后，加入TMB底物，并用2M HCl终止显色反应。使用酶标仪读取450nm处的吸光度。

如图23所示，即使在人血清中孵育14天后，W3669双特异性抗体仍显示正常的双重结合，这表明W3669双特异性抗体在人血清中稳定至少两周。

实施例4

双特异性抗体的体内表征

4.1在结肠26同基因模型中的抗肿瘤功效研究

在补充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中，在37℃在空气中5％CO2的气氛下，将结肠26肿瘤细胞作为单层培养物进行体外维持。收获在指数生长期生长的细胞并计数以接种肿瘤。每只小鼠在右腋窝(外侧)皮下接种0.1ml PBS中的结肠26肿瘤细胞(5x 10⁵)，用于肿瘤形成。当平均肿瘤体积达到60-70mm³时，将动物随机分组，然后通过腹膜内施用抗体处理，每周两次达三周(BIW x 3)。使用测径器以二维方式每周三次测量肿瘤大小，并使用公式：V＝0.5ax b²以mm3表示体积，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。

结果显示在图24中。在结肠26同基因模型中，在6个等摩尔剂量的W3669双特异性抗体(在图24中称为“BsAb”)之后，与抗PD-L1 mab、抗LAG-3mab、抗PD-L1 mab+抗LAG-3mab(在图24中称为“combo”)或双特异性对照(W366-BMK2)组相比肿瘤体积显著减少，指示与抗PD-L1、抗LAG-3单药治疗或它们的联合治疗相比，W3669双特异性抗体具有优异的抗肿瘤作用。箭头指示施用的时间点。

此外，在结肠26同基因模型中，W3669双特异性抗体以剂量应答方式抑制肿瘤生长，如图25所示。

4.2小鼠药代动力学(PK)

研究使用了30-32周龄的雌性C57BL/6小鼠(上海SIPPR-BK有限公司)。六只动物(三只动物/组)分为两组：低剂量和高剂量组。低剂量和高剂量组的动物分别以1mg/kg和10mg/kg施用一次W3669抗体。通过静脉推注施用进行注射。将制剂配制在PBS中。在0.5h，2h，6h，24h，第2天，第4天和第7天收集PK血液样品。

在第7天收集抗药物抗体(ADA)样品。然后通过将血液样品在大约4℃，5000g离心5分钟来制备血浆样品。然后将所有血清样品在干冰上快速冷冻，并保持在-80℃直至进行ELISA分析。通过ELISA确定血浆样品中W3669抗体和ADA的血浆浓度。通过使用PhoenixWinNonlin软件(8.1版，Pharsight，Mountain View，CA)对小鼠中W3669抗体的血浆浓度进行非隔室药代动力学分析。线性/对数梯形法则用于获得PK参数。

小鼠中PK谱的结果显示在图26A中。1mg/kg组的抗体的t¹/₂为19.4小时，10mg/kg组的抗体的t¹/₂为133小时，表明W3669抗体在高剂量小鼠中具有正常的PK谱(图26A)。

使用在第7天采集的样品测量ADA。在低剂量组观察到ADA。如图26B所示，所有小鼠均产生ADA，并且低剂量组的3/3小鼠具有高滴度，而高剂量组仅1/3的小鼠具有高滴度ADA。

本领域技术人员将认识到在不脱离其精神或中心特征的情况下，本公开可以以其他具体形式来实施。由于本公开的前述描述仅公开了其示例性实施方案，其他变化应该被理解为在本发明的范围内。因此，本公开不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本公开的范围和内容。

参考文献

[1]Alsaab HO,Sau S,Alzhrani R,等人PD-1 and PD-L1 Checkpoint SignalingInhibition for Cancer Immunotherapy:Mechanism,Combinations,and ClinicalOutcome.Frontiers in Pharmacology 2017；8:561.

[2]Francisco LM,Sage PT,Sharpe AH.The PD-1 pathway in tolerance andautoimmunity.Immunological Reviews 2010；236:219–42.

[3]Gong,Jun,Chehrazi-Raffle,Alexander等人Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy:a comprehensive review ofregistration trials and future considerations.Journal for Immunotherapy ofCancer 2018；6:8.

[4]Monica V.Goldberg,Charles G.Drake.LAG-3 in CancerImmunotherapy.Curr Top Microbiol Immunol.2011；344:269–278.

[5]Lawrence P.Andrews,Ariel E.Marciscano,Charles G.Drake,等人LAG-3(CD223)as a cancer immunotherapy target.Immunol Rev.2017；276(1):80-96.

[6]Nguyen LT,Ohashi PS.Clinical blockade of PD1 and LAG-3--potentialmechanisms of action.Nature Reviews Immunology.2015Jan；15(1):45-56.

[7]Hannah Christina Puhr,Aysegül Ilhan-Mutlu.New emerging targets incancer immunotherapy:the role of LAG-3.ESMO Open 2019；4:e000482.

[8]WO2017220569A1.Jamie Campbell.Binding molecules binding pd-l1 andlag-3.2017-12-28公开，属于F-Star Delta Limited.

序列表

<110> 上海药明生物技术有限公司

<120> 新型抗PD-L1/抗LAG-3双特异性抗体及其用途

<130> IDC206043 WBP3669

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1

<400> 1

Gly His Phe Ser Asn Leu Ala Val Asn

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2

<400> 2

Gly Ile Leu Trp Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3

<400> 3

Gly Thr Asn

1

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1

<400> 4

Gly Leu Thr Leu Ser Gln Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2

<400> 5

Ala Ile His Trp Thr Ser Ser Val Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Tyr

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3

<400> 6

Thr His Tyr Tyr Thr His Arg Gly Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH1

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly His Phe Ser Asn Leu Ala

20 25 30

Val Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

35 40 45

Gly Ile Leu Trp Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ala Glu Asn Met Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Thr Gly Thr Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 8

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH2

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Leu Ser Gln Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile His Trp Thr Ser Ser Val Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Tyr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Thr His Tyr Tyr Thr His Arg Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH1

<400> 9

gaggtgcagc tggtggagtc cggaggcgga ctggtgcagc ctggaggaag cctgagactg 60

agctgcgccg ctagcggcca cttcagcaac ctggccgtga actggttcag gcaggcccct 120

ggcaaggaga gggagctggt ggctggcatc ctgtggagcg gcggaagcac cttctacgcc 180

gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc aggggcaacg ccgagaacat gctgtacctg 240

cagatgaact ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcaacac cggcaccaac 300

tggggccagg gcacactcgt gaccgtgagc agc 333

<210> 10

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH2

<400> 10

caagttcagc tggtggaaag cggcggtggt gttgttcagc cgggtggcag tctgcgtctg 60

agctgcgcag ccagtggtct gactttaagc cagtatacca tgggttggtt tcgccaagct 120

ccgggtaaag aacgcgaact ggtggccgcc attcattgga ccagcagcgt gaccgattat 180

gccgatagcg tgtacggccg ctttaccatt agccgcgatg atagcaaaaa tactggttat 240

ctgcagatga attctttacg cgccgaagat accgccgtgt attactgcgc cgccacccac 300

tactataccc atcgcggccc ctttgattac tggggtcaag gtactttagt gaccgtgagc 360

agc 363

<210> 11

<211> 230

<212> PRT

<213> 人

<400> 11

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro

225 230

<210> 12

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 12

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser

35

<210> 13

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly His Phe Ser Asn Leu Ala

20 25 30

Val Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

35 40 45

Gly Ile Leu Trp Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ala Glu Asn Met Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Thr Gly Thr Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu

100 105 110

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

115 120 125

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

130 135 140

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

145 150 155 160

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

165 170 175

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

180 185 190

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

195 200 205

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

210 215 220

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

225 230 235 240

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

245 250 255

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

260 265 270

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

275 280 285

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

290 295 300

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

305 310 315 320

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

325 330 335

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

340 345 350

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

355 360 365

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser

370 375 380

Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

385 390 395 400

Ala Ser Gly Leu Thr Leu Ser Gln Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln

405 410 415

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Ala Ile His Trp Thr Ser

420 425 430

Ser Val Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Tyr Gly Arg Phe Thr Ile Ser

435 440 445

Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

450 455 460

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr His Tyr Tyr Thr

465 470 475 480

His Arg Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

485 490 495

Ser Ser

Claims (28)

1.一种双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域为VHH结构域，其中：

第一抗原结合结构域包含：由SEQ ID NO：1组成的CDRH1，由SEQ ID NO：2组成的CDRH2，和由SEQ ID NO：3组成的CDRH3；和

第二抗原结合结构域包含：由SEQ ID NO：4组成的CDRH1，由SEQ ID NO：5组成的CDRH2，和由SEQ ID NO：6组成的CDRH3。

2.权利要求1的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中：

第一抗原结合结构域由SEQ ID NO：7的氨基酸序列或具有至少80％序列同一性且保留对PD-L1的特异性结合亲和力的其同源序列组成；和

第二抗原结合结构域由SEQ ID NO：8的氨基酸序列或具有至少80％序列同一性且保留对LAG-3的特异性结合亲和力的其同源序列组成。

3.权利要求1的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中从N末端到C末端，第一抗原结合结构域可操作地连接于恒定区并且恒定区可操作地连接于第二抗原结合结构域，或反之亦然。

4.权利要求3的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中恒定区是人IgG恒定区。

5.权利要求4的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中恒定区是人IgG Fc区。

6.权利要求5的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中人IgG Fc区是人IgG1 Fc区。

7.权利要求6的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中人IgG1 Fc区包含根据EU编号的L234A和L235A的突变。

8.权利要求7的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中Fc区包含SEQ ID NO：11。

9.权利要求3-8中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中恒定区通过接头可操作地连接于第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的至少一个。

10.权利要求9的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中接头是肽序列。

11.权利要求10的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中接头包含或组成为(G4S)n，其中n＝1-10。

12.权利要求11的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中接头由SEQ ID NO：12组成。

13.权利要求1-8或10-12中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中VHH是骆驼科动物产生的VHH或基于骆驼科动物产生的VHH人源化的VHH。

14.权利要求13的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述骆驼科动物为羊驼或美洲驼。

15.权利要求1-8中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中双特异性抗体或其抗原结合部分是人源化抗体。

16.权利要求1-8中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中双特异性抗体或其抗原结合部分的单链氨基酸序列由SEQ ID NO：13组成。

17.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-16中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸序列。

18.一种载体，其包含权利要求17的核酸分子。

19.一种宿主细胞，其包含权利要求17的核酸分子或权利要求18的载体。

20.一种药物组合物，其包含权利要求1-16中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

21.一种生产权利要求1-16中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分的方法，包括以下步骤：

-在权利要求19的宿主细胞中表达权利要求1-16中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分；和

-从宿主细胞分离抗体或其抗原结合部分。

22.权利要求1-16的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于调控受试者中的免疫应答的药物中的用途，所述免疫应答是PD-L1和/或LAG-3相关的。

23.权利要求1-16的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备用于诊断、预防或治疗与PD-L1和/或LAG-3相关的增殖性疾病、免疫性疾病或感染的药物中的用途。

24.权利要求23的用途，其中增殖性疾病是癌症。

25.权利要求24的用途，其中癌症选自结肠癌、淋巴瘤、肺癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤、前列腺癌、食道癌或胃癌。

26.权利要求24的用途，其中癌症是结肠癌。

27.权利要求23的用途，其中感染是慢性感染。

28.一种用于治疗或诊断与PD-L1和/或LAG-3相关的增殖性疾病、免疫性疾病或感染的试剂盒，其包含权利要求1-16中任一项所定义的双特异性抗体或其抗原结合部分。

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