KR102436615B1

KR102436615B1 - Fviii의 반응성을 측정하는 방법

Info

Publication number: KR102436615B1
Application number: KR1020177011028A
Authority: KR
Inventors: 게이지 노가미; 미도리 시마; 데쓰히로 소에다; 다케히사 기타자와
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2015-09-24
Publication date: 2022-08-25
Anticipated expiration: 2035-09-24
Also published as: TW201625947A; US20180011114A1; MX2017003635A; MX390723B; SG11201701280SA; US11150254B2; AU2015322658A1; IL250636B; RU2017114396A3; EP3199952A4; KR20170084030A; WO2016047652A1; MY183551A; CA2958995C; RU2752595C2; EP3199952B1; BR112017004412A2; RU2017114396A; JPWO2016047652A1; NZ729317A

Abstract

FVIII 기능 대체 활성을 갖는 이중특이성 항체의 활성을 중화하는 물질을 제작하여, 본 이중특이성 항체 존재하에서도 정확성이 유지되는 FVIII의 반응성을 측정하는 방법의 구축을 시도했다. 그 결과, APTT를 베이스로 한 one-stage clotting assay로 혈우병 A 환자 혈장 중의 FVIII 활성을 정확히 평가할 수 있다는 것을 발견하고, 더욱이 APTT를 베이스로 한 Bethesda assay로 FVIII 인히비터 보유 혈우병 A 환자 혈장 중의 FVIII 인히비터 역가를 정확히 평가할 수 있다는 것도 발견했다.

Description

FVIII의 반응성을 측정하는 방법{METHOD FOR MEASURING REACTIVITY OF FVIII}

본 발명은 응고 제 VIII 인자(FVIII) 기능 대체 활성을 갖는 물질 존재하에 있어서 FVIII의 반응성을 측정하는 방법(예를 들면 FVIII 활성, FVIII 인히비터 역가를 측정하는 방법)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 FVIII 기능 대체 활성을 갖는 물질 존재하에 있어서 FVIII의 반응성을 측정하기 위한 키트 등에 관한 것이다.

혈우병은 FVIII 또는 응고 제 IX 인자(FIX)의 선천적 결손 또는 기능 부전에 기인하는 출혈성 질환이다. 전자는 혈우병 A, 후자는 혈우병 B라고 칭해진다. 어느 유전자도 X 염색체 상에 존재하고, 유전자 이상은 X 염색체 연쇄 열성 유전 형식을 취하기 때문에, 발증 환자의 99% 이상은 남성이다. 유병률은 대략 출생 남자 1만명당 1명이고, 혈우병 A와 혈우병 B의 비율은 대략 5:1인 것이 알려져 있다.

혈우병 환자에 있어서의 주된 출혈 부위로서는, 관절내, 근육내, 피하, 구강내, 두개내, 소화관, 비강내 등을 들 수 있다. 그 중에서도 관절내로의 반복 출혈은 관절 장애, 보행 곤란을 수반하는 혈우병성 관절증으로 진전되어, 최종적으로는 관절 치환술이 필요해지는 경우도 있다. 그 때문에, 혈우병 환자의 QOL을 저하시키는 커다란 요인이 되고 있다.

혈우병의 중증도는 혈액 중의 FVIII 활성 또는 FIX 활성과 잘 상관하고 있다. 응고 인자 활성 1% 미만의 환자가 중증, 활성 1% 이상 5% 미만의 환자가 중등증, 활성 5% 이상 40% 미만의 환자가 경증으로 분류된다. 혈우병 환자의 약 반수를 차지하는 중증 환자에 있어서는, 후술하는 예방적 보충 요법 없이는 월에 수회의 출혈 증상을 나타내는데, 이는 중등증 환자 및 경증 환자에 비해 현저히 높은 빈도이다.

관련되는 출혈 이상증으로서, 혈우병, 후천성 혈우병 외에, 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 기능 이상 또는 결손에 기인하는 폰 빌레브란트병이 알려져 있다. vWF는 혈소판이 혈관벽의 손상 부위의 피하 조직에 정상적으로 점착하는 데 필요할 뿐만 아니라, FVIII와 복합체를 형성하고, 혈액 중의 FVIII 레벨을 정상적으로 유지하는 데에도 필요하다. 폰 빌레브란트병 환자에서는, 이들 기능이 저하되어, 지혈 기능 이상을 초래하고 있다.

혈우병 환자에 있어서의 출혈의 예방 및/또는 치료에는, 주로 혈장으로부터 정제된 또는 유전자 재조합 기술에 의해 제작된 혈액 응고 인자가 사용된다. 중증 혈우병 환자에 있어서는, FVIII 또는 FIX의 보충 요법에 의해 혈액 중의 FVIII 활성 또는 FIX 활성을 1% 이상으로 유지하는 것이 출혈 증상의 발현 저지에 유효하다고 생각되고 있다(비특허문헌 1, 2). 한편, 혈우병 환자, 특히 중증 혈우병 환자에는, 인히비터라고 불리는 FVIII 또는 FIX에 대한 항체가 발생하는 경우가 있다. 인히비터가 발생하면, 응고 인자 제제의 효과가 인히비터에 의해 저해된다. 그 결과, 대량의 응고 인자 제제를 이용하는 중화 요법이나, 복합체 제제(complex concentrate) 또는 활성화 응고 제 VII 인자 제제(FVIIa 제제)를 이용하는 바이패스 요법이 실시된다.

혈우병 A에 있어서의 FVIII 활성 측정은 주로 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)을 베이스로 한 one-stage clotting assay(비특허문헌 3) 및 정제 응고 인자를 이용한 재구축계인 chromogenic assay(비특허문헌 4)에 의해 실시된다.

혈우병 A에 있어서의 FVIII 인히비터의 역가 측정은 주로 Bethesda assay 또는 Nijmegen Bethesda assay에 의해 실시된다(비특허문헌 5, 6).

근년, FIX 및/또는 활성화 응고 제 IX 인자(FIXa) 및 응고 제 X 인자(FX) 및/또는 활성화 혈액 응고 제 X 인자(FXa)의 쌍방에 결합하고, FVIII의 보인자 기능, 즉 FIXa에 의한 FX 활성화를 촉진하는 기능을 대체하는 이중특이성 항체가 발견되었다(비특허문헌 7, 8, 특허문헌 1, 2, 3). 본 이중특이성 항체는 FVIII의 기능을 대체함으로써, FVIII 결손 및 기능 이상에 의한 응고 반응의 저하를 개선한다. 예를 들면, 응고 반응의 지표인 APTT, 트롬빈 생성에 관해서, 본 이중특이성 항체는 FVIII 인히비터의 존재에 관계없이 혈우병 A 환자 유래 혈장의 APTT를 단축시키고, 트롬빈 생성을 증대시킨다. 본 이중특이성 항체의 APTT 단축 작용은 FVIII에 비해 현저하다. 그것은 혈장 중의 FVIII은 트롬빈이나 활성화 제 X 인자(FXa)에 의해 활성화되고 나서 비로소 보인자 활성을 나타내는 데 비해, 본 이중특이성 항체는 그와 같은 활성화 과정은 필요하지 않아, 그만큼 빨리 보인자 기능을 발휘하기 때문이다.

또한, 본 이중특이성 항체의 FIXa Fab에 대한 항체, FX Fab에 대한 항체가 취득되어, 동물 실험의 혈장 샘플 중의 본 이중특이성 항체의 농도 측정이 행해졌다(비특허문헌 9).

이중특이성 항체는 FVIII의 보인자 기능을 대체하기 때문에, FVIII 자체의 반응성을 측정하는 어세이계에 영향을 준다. 예를 들면, 혈우병 A의 중증도를 진단하기 위해서, 또는 FVIII 제제를 투여한 환자에 있어서의 FVIII 제제의 약리 활성을 모니터링하기 위해서, APTT를 베이스로 한 one-stage clotting assay로 혈장 FVIII 활성을 측정하는 경우, 본 이중특이성 항체 존재하에서는, 그 응고 시간 단축 촉진 작용이 강하게 간섭하기 때문에, 정확성이 크게 손상된다. 또한, APTT를 베이스로 한 Bethesda assay로 혈장 FVIII 인히비터 역가를 측정하는 경우, 본 이중특이성 항체 존재하에서는, 그 응고 시간 단축 촉진 작용이 강하게 간섭하기 때문에, 정확성이 크게 손상된다. 즉, 본 이중특이성 항체를 투여한 환자에서는, FVIII 활성, FVIII 인히비터 역가를 정확히 측정할 수 없다. 그 때문에 본 이중특이성 항체 존재하에 있어서도 FVIII 활성 및 FVIII 인히비터 역가를 측정할 수 있는 방법이 요망되고 있었다.

WO 2005/035756 WO 2006/109592 WO 2012/067176

N Engl J Med. 2007; 357(6):535-44 Thromb Res. 2011; 127(suppl1):S14-7 Thromb Diath Haemorrh. 1962 May 15; 7:215-28 Haemostasis. 1989 19:196-204 Thromb Diath Haemorrh. 1975; 34(3):869-72 Thromb Haemost. 1995 Feb; 73(2):247-51 Nat Med. 2012; 18(10):1570-74 PLoS One. 2013; 8(2):e57479 J Thromb Haemost. 2014; 12(2):206-13 Supporting Information

본원 발명은 FVIII 기능 대체 활성을 갖는 물질 존재하에 있어서 FVIII의 반응성을 측정하는 방법, 예를 들면 FVIII 활성, FVIII 인히비터 역가를 측정하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 FVIII 기능 대체 활성을 갖는 물질 존재하에 있어서 FVIII의 반응성, 예를 들면 FVIII 활성 및 FVIII 인히비터 역가를 측정하기 위한 키트 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여, FVIII의 반응성을 측정하는 검사 항목을 대상으로, 본 이중특이성 항체의 활성을 중화하는 물질을 제작하여, 본 이중특이성 항체 존재하에서도 정확성이 유지되는 측정 조건을 탐색했다. 그 결과 본 발명자들은, 이중특이성 항체에 대한 중화 항체를 적절한 농도(예를 들면 이중특이성 항체를 충분히 중화할 수 있는 농도)에서 사용함으로써, APTT를 베이스로 한 one-stage clotting assay로 혈우병 A 환자 혈장 중의 FVIII 활성을 정확히 평가할 수 있다는 것을 발견하고, 더욱이 APTT를 베이스로 한 Bethesda assay로 FVIII 인히비터 보유 혈우병 A 환자 혈장 중의 FVIII 인히비터 역가를 정확히 평가할 수 있다는 것도 발견했다. 또한 본 발명자들은, 본 측정에 이용되는, FVIII 대체 활성을 갖는 이중특이성 항체에 대한 중화 항체를 포함하는 키트를 발견하는 것에 성공했다. 본 발명은 이와 같은 지견에 기초하는 것으로, 이하를 제공하는 것이다.

〔1〕 응고 제 VIII 인자의 반응성을 측정하는 방법으로서, 이하의 (1)과 (2)를 접촉시키는 공정을 포함하는 방법.

(1) 응고 제 VIII 인자의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 포함하는 혈액 유래 샘플

(2) 응고 제 VIII 인자의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 중화하는 1 이상의 물질

〔2〕 응고 제 VIII 인자의 기능 대체 활성을 갖는 물질이, 응고 제 IX 인자 및/또는 활성화 응고 제 IX 인자 및 응고 제 X 인자 및/또는 활성화 혈액 응고 제 X 인자에 결합하는 이중특이성 항체인 〔1〕에 기재된 방법.

〔3〕 상기 이중특이성 항체가 이하에 기재된 어느 하나의 항체로서, 제 1 폴리펩타이드와 제 3 폴리펩타이드가 회합하고, 제 2 폴리펩타이드와 제 4 폴리펩타이드가 회합하는 이중특이성 항체인 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 방법.

제 1 폴리펩타이드가 서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제 2 폴리펩타이드가 서열번호: 11에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제 3 폴리펩타이드와 제 4 폴리펩타이드가 서열번호: 10에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q499-z121/J327-z119/L404-k).

제 1 폴리펩타이드가 서열번호: 36에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제 2 폴리펩타이드가 서열번호: 37에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제 3 폴리펩타이드와 제 4 폴리펩타이드가 서열번호: 38에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q153-G4k/J142-G4h/L180-k).

〔4〕 상기 중화하는 물질이, 상기 응고 제 VIII 인자의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 중화하는 펩타이드, 폴리펩타이드, 유기 화합물, 앱타머 및 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질인, 〔1〕∼〔3〕 중 어느 하나에 기재된 방법.

〔5〕 상기 중화하는 물질이, 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, 활성화 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, 및 응고 제 IX 인자 및/또는 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 및 응고 제 X 인자 및/또는 활성화 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 이중특이성 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 항체인, 〔2〕∼〔4〕 중 어느 하나에 기재된 방법.

〔6〕 상기 중화하는 물질이, 이하의 항체의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 조합인, 〔1〕∼〔5〕 중 어느 하나에 기재된 방법.

(a) 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체와 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체

(b) 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체와 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체

(c) 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체와 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체

(d) 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체 및 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체

〔7〕 응고 제 VIII 인자의 반응성을 측정하는 방법이, 응고 제 VIII 인자 활성을 측정하는 방법 또는 응고 제 VIII 인자 인히비터 역가를 측정하는 방법인, 〔1〕∼〔6〕 중 어느 하나에 기재된 방법.

〔8〕 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, 활성화 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, 및 응고 제 IX 인자 및/또는 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 및 응고 제 X 인자 및/또는 활성화 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 이중특이성 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 항체를 포함하는, 〔1〕∼〔7〕 중 어느 하나에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트.

〔9〕 이하의 항체의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 조합을 포함하는, 〔8〕에 기재된 키트.

〔10〕〔1〕∼〔7〕 중 어느 하나에 기재된 방법을 이용하여, 응고 제 VIII 인자의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 투여한 환자의 중증도를 진단하는 방법.

〔11〕〔1〕∼〔7〕 중 어느 하나에 기재된 방법을 이용하여, 응고 제 VIII 인자의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 투여한 환자의 인히비터 역가를 진단하는 방법.

〔12〕〔1〕∼〔7〕 중 어느 하나에 기재된 방법을 이용하여, 응고 제 VIII 인자의 기능 대체 활성을 갖는 물질 및 FVIII 제제를 투여한 환자에 있어서의 FVIII 제제의 약리 활성을 모니터링하는 방법.

〔13〕 상기 환자가 혈우병 A 환자, 후천성 혈우병 A 환자, 폰 빌레브란트병 환자, 및 혈액 응고 제 VIII 인자 및/또는 활성화 혈액 응고 제 VIII 인자에 대한 인히비터가 출현하고 있는 혈우병 A 환자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 환자인, 〔10〕∼〔12〕 중 어느 하나에 기재된 방법.

〔14〕〔8〕 또는 〔9〕에 기재된 키트가, 응고 제 VIII 인자의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 투여한 환자의 중증도를 진단하기 위한 키트.

〔15〕〔8〕 또는 〔9〕에 기재된 키트가, 응고 제 VIII 인자의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 투여한 환자의 인히비터 역가를 진단하기 위한 키트.

〔16〕〔8〕 또는 〔9〕에 기재된 키트가, 응고 제 VIII 인자의 기능 대체 활성을 갖는 물질 및 FVIII 제제를 투여한 환자에 있어서의 FVIII 제제의 약리 활성을 모니터링하기 위한 키트.

〔17〕 상기 환자가 혈우병 A 환자, 후천성 혈우병 A 환자, 폰 빌레브란트병 환자, 및 혈액 응고 제 VIII 인자 및/또는 활성화 혈액 응고 제 VIII 인자에 대한 인히비터가 출현하고 있는 혈우병 A 환자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 환자인, 〔14〕∼〔16〕 중 어느 하나에 기재된 키트.

본 발명에 의해, FVIII 대체 활성을 갖는 물질의 활성의 영향을 받지 않고서, FVIII 활성 및 FVIII 인히비터 역가를 측정하는 것이 가능한 방법이 제공되었다. FVIII 대체 활성을 갖는 물질로서는, FIX 및/또는 FIXa 및 FX 및/또는 FXa에 결합하는 이중특이성 항체를 들 수 있다.

도 1은 rAQ8-mIgG2b 및 rAJ540-rbtIgG를 이용한 항FIXa/FX 이중특이성 항체 중화하에서의 one-stage clotting assay의 결과를 나타내는 도면이다. 항FIXa/FX 이중특이성 항체 ACE910을 첨가한 10 또는 100U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장을 버퍼로 희석한 경우(#3, #7), 검량선의 범위 이상의 FVIII 활성을 나타냈다. 한편, 항FIXa/FX 이중특이성 항체 ACE910을 첨가한 10 또는 100U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장에 대해서 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체를 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#4, #8), 항FIXa/FX 이중특이성 항체 무첨가군(#1, #5)과 마찬가지의 FVIII 활성을 나타냈다. 10 또는 100U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장에 대해서 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체만을 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#2, #6), 항FIXa/FX 이중특이성 항체 무첨가군(#1, #5)과 마찬가지의 FVIII 활성을 나타냈다.
도 2는 AQ1과 AJ541, 또는 AQ1과 AJ522에 의한 항FIXa/FX 이중특이성 항체 중화하에서의 one-stage clotting assay의 결과를 나타내는 도면이다. 항FIXa/FX 이중특이성 항체 ACE910을 첨가한 10U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장을 버퍼로 희석한 경우(#4), 검량선의 범위 이상의 FVIII 활성을 나타냈다. 한편, 항FIXa/FX 이중특이성 항체 ACE910을 첨가한 10U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장에 대해서, 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체 AQ1과 AJ541을 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#5) 또는 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체 AQ1과 AJ522를 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#6), 항FIXa/FX 이중특이성 항체 무첨가군(#1)과 마찬가지의 FVIII 활성을 나타냈다. 10U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장에 대해서 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체 AQ1과 AJ541만을 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#2) 또는 2종류의 항체 AQ1과 AJ522만을 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#3), 항FIXa/FX 이중특이성 항체 무첨가군(#1)과 마찬가지의 FVIII 활성을 나타냈다.
도 3은 AQ512와 AJ114, 또는 AQ512와 AJ521에 의한 항FIXa/FX 이중특이성 항체 중화하에서의 one-stage clotting assay의 결과를 나타내는 도면이다. 항FIXa/FX 이중특이성 항체 hBS23을 첨가한 10U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장을 버퍼로 희석한 경우(#4), 검량선의 범위 이상의 FVIII 활성을 나타냈다. 한편, 항FIXa/FX 이중특이성 항체 hBS23을 첨가한 10U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장에 대해서, 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체 AQ512와 AJ114를 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#5) 또는 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체 AQ512와 AJ521을 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#6), 항FIXa/FX 이중특이성 항체 무첨가군(#1)과 마찬가지의 FVIII 활성을 나타냈다. 10U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장에 대해서 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체 AQ512와 AJ114만을 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#2) 또는 2종류의 항체 AQ512와 AJ521만을 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#3), 항FIXa/FX 이중특이성 항체 무첨가군(#1)과 마찬가지의 FVIII 활성을 나타냈다.
도 4는 rAQ8-mIgG2b 및 rAJ540-rbtIgG를 이용한 항FIXa/FX 이중특이성 항체 중화하에서의 베데스다법의 결과를 나타내는 도면이다. 항FIXa/FX 이중특이성 항체 ACE910만을 포함하는 FVIII 인히비터 혈장(#3)에서는, 검량선의 FVIII 100% 이상의 활성을 나타냈다. 한편, 항FIXa/FX 이중특이성 항체 및 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체를 포함하는 FVIII 인히비터 혈장(#4)에서는, 무첨가의 인히비터 혈장(#1)과 마찬가지의 FVIII 인히비터 역가를 나타냈다. 2종류의 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 항체만을 포함하는 FVIII 인히비터 혈장(#2)은, #1과 마찬가지의 결과를 나타냈다.

본 발명의 FVIII의 활성을 측정하는 방법은 이하의 (1)과 (2)를 접촉시키는 공정을 포함한다. 그 이외에는, 일반적으로 이용되고 있는 FVIII 활성 측정 방법에 따라 행할 수 있다. 구체적으로는 실시예에서도 설명한다.

(1) FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 포함하는 혈액 유래 샘플

(2) FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 중화하는 물질

FVIII 활성 측정법

일반적으로 이용되고 있는 FVIII 활성 측정 방법으로서는, 당업자에게 공지인 방법을 이용할 수 있는데, 예를 들면 응고 시간(aPTT 측정)을 기본으로 한, 제 VIII 인자 결핍 혈장(Sysmex, Kobe, Japan)을 사용한 one-stage clotting assay(Casillas et al., (1971) Coagulation 4: 107-11)를 이용할 수 있다. one-stage clotting assay는, 예를 들면 이하의 방법으로 실시된다. 10배 희석한 피험 혈장 50μL, FVIII 결핍 혈장 50μL 및 APTT 시약 50μL의 3용액을 혼합하고, 37℃, 5분간 인큐베이션 후, 칼슘 용액 50μL를 첨가하는 것에 의해 응고 반응을 개시시키고, 응고될 때까지의 시간을 측정한다. 또한, 피험 혈장 대신에, 정상 혈장 희석 계열 샘플(10배 희석한 정상 혈장 중에 포함되는 FVIII 활성을 100%로 함)을 측정하여, 가로축에 FVIII 활성, 세로축에 응고 시간을 플로팅한 검량선을 작성한다. 검량선으로부터, 피험 혈장의 응고 시간을 FVIII 활성으로 환산하여, 피험 혈장 중의 FVIII 활성을 산출한다. 한편, 본 명세서에 있어서는, 「FVIII 활성의 측정」은 특별히 예고하지 않는 한, 「활성화 응고 제 VIII 인자(FVIIIa)의 활성의 측정」을 포함할 수 있는 것으로서 사용된다.

FVIII 활성을 측정하는 방법으로서는, one-stage clotting assay 이외에도, 트롬빈 생성 시험(TGA), 회전 트롬보엘라스토메트리를 이용한 측정법, FVIII chromogenic assay, 응고 파형 해석, 트롬빈 및 활성형 제 X 인자 생성 시험 등을 이용할 수 있다. 본 발명의 FVIII 인히비터의 역가를 측정하는 방법은 이하의 (1)과 (2)를 접촉시키는 공정을 포함한다. 그 이외에는, 일반적으로 이용되고 있는 FVIII 인히비터 역가 측정 방법에 따라 행할 수 있다. 구체적으로는 실시예에서도 설명한다.

(2) FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 중화하는 물질

FVIII 인히비터 역가 측정법

일반적으로 이용되고 있는 FVIII 인히비터 역가 측정 방법으로서는, 당업자에게 공지인 방법을 이용할 수 있는데, 예를 들면 Bethesda assay(Kasper et al., (1975) Thrombos Diath Haemorrh 34:869-872), ELISA법, Nijmegen Bethesda assay(Nijmegen modification assay)(Verbruggen et al., (1995) Thromb Haemost 73:247-251)를 이용할 수 있다. Bethesda assay는, 예를 들면 이하의 방법으로 실시된다. 정상 혈장과 피험 혈장을 등량 혼합한 용액을 37℃, 2시간 인큐베이션 후, 정상 혈장 중의 잔존 제 VIII 인자 활성을, 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)을 베이스로 한 one-stage clotting assay로 측정한다. 정상 혈장 중의 제 VIII 인자 활성의 50%를 저해하는 작용을 1베데스다(1BU)로 규정하고 있고, 그 때문에 FVIII 인히비터의 역가는 베데스다의 단위로 산출한다. 한편, 피험 혈장 중에 포함되는 FVIII 인히비터 역가가 높아, 잔존 제 FVIII 활성이 25∼75%의 범위에 들어가지 않는 경우에는, 완충액으로 적당히 희석한 피험 혈장을 이용하여, 재차 베데스다 단위를 산출한 후, 희석 배율을 곱하여 피험 혈장 중의 FVIII 인히비터 역가를 산출한다.

FVIII

FVIII은 혈액 응고에 관여하는 일련의 분자 중 하나이며, 트롬빈이나 FXa에 의해 활성화를 받으면 보인자 활성을 나타내, FIXa에 의한 FX 활성화 반응을 촉진한다.

FVIII 인히비터

FVIII 인히비터는 20∼30%의 혈우병 A 환자에서 생기는 외래성의 FVIII에 대한 동종 항체이다. 또한, 원래는 정상이었던 개체에서도 후천적으로 FVIII에 대해서 자기 항체가 생길 수 있다. 일반적으로 FVIII 인히비터 동종 항체 및 자기 항체의 대부분은 항FVIII 중화 항체로서 기능하여, FVIII 활성을 감소시키거나 또는 소멸시킨다.

FVIII 대체 활성

본 발명의 FVIII 기능 대체 활성을 갖는 물질은 FVIII양(樣) 활성을 갖는 물질이라고 바꾸어 말할 수도 있다. 본 발명에 있어서 「FVIII의 기능을 대체한다」란, FIXa에 의한 FX의 활성화를 촉진하는(FIXa에 의한 FXa 산생을 촉진하는) 것을 의미한다. 또한, 보다 구체적으로는, 본 발명에 있어서 「FVIII의 기능을 대체한다」란, FIX 및/또는 FIXa 및 FX 및/또는 FXa를 인식하여, FIXa에 의한 FX의 활성화를 촉진하는(FIXa에 의한 FXa 산생을 촉진하는) 것을 의미한다. FXa 산생 촉진 활성은, 예를 들면 FIXa, FX, 합성 기질 S-2222(FXa의 합성 기질), 인 지질로 이루어지는 측정계로 평가할 수 있다. 이와 같은 측정계는 혈우병 A 증례에 있어서의 질환의 중증도 및 임상 증상과 상관성을 나타낸다(Rosen S, Andersson M, Blomba¨ck M et al. Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity. Thromb Haemost 1985; 54: 811-23).

본 발명에 기재된 FVIII의 기능을 대체하는 활성을 갖는 물질의 바람직한 태양으로서, FIX 및/또는 FIXa 및 FX 및/또는 FXa에 결합하는 이중특이성 항체를 예시할 수 있다. 이와 같은 항체는, 예를 들면 WO 2005/035756, WO 2006/109592, WO 2012/067176 등에 기재된 방법에 따라 취득할 수 있다. 본 발명의 이중특이성 항체에는 이들 문헌에 기재된 항체가 포함된다.

바람직한 이중특이성 항체로서, 특허문헌(WO 2012/067176)에 기재된 이중특이성 항체인 ACE910(Q499-z121/J327-z119/L404-k)(서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄와 서열번호: 10에 기재된 L쇄가 회합하고, 서열번호: 11에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄와 서열번호: 10에 기재된 L쇄가 회합하고 있는 이중특이성 항체), hBS23(Q153-G4k/J142-G4h/L180-k)(서열번호: 36에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄와 서열번호: 38에 기재된 L쇄가 회합하고, 서열번호: 37에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄와 서열번호: 38에 기재된 L쇄가 회합하고 있는 이중특이성 항체)을 들 수 있다.

중화

본 발명에 있어서의 FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 중화하는 물질에 있어서의 「중화」란, 예를 들면 FVIII 기능 대체 활성을 갖는 물질의 FVIII 기능 대체 활성을 전부 또는 일부 저해하는 것을 말한다. FVIII 기능 대체 활성의 전부 또는 일부의 저해는, 예를 들면 FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질이 항체인 경우, 항체의 항원에 대한 결합을 전부 또는 일부 저해하는 것에 의해 실현할 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

중화하는 물질

본 발명에 있어서의 FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 중화하는 물질에 있어서의 중화하는 물질의 「물질」이란, 예를 들면 FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질에 결합하는 펩타이드, 폴리펩타이드, 유기 화합물, 앱타머, 항체 등을 말한다.

중화하는 물질은 복수 조합하여 사용할 수 있고, 예를 들면 항체와 앱타머를 조합하여 사용할 수 있다.

폴리펩타이드

본 발명에 있어서의 폴리펩타이드란, 통상 10 아미노산 정도 이상의 길이를 갖는 펩타이드, 및 단백질을 가리킨다. 또한, 통상 생물 유래의 폴리펩타이드이지만, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 인공적으로 설계된 서열로 이루어지는 폴리펩타이드여도 된다. 또한, 천연 폴리펩타이드 또는 합성 폴리펩타이드, 재조합 폴리펩타이드 등 중 어느 것이어도 된다. 또, 상기의 폴리펩타이드의 단편도 또한 본 발명의 폴리펩타이드에 포함된다.

유기 화합물

본 발명에 있어서의 유기 화합물은, 예를 들면 저분자 화합물이고, 바람직하게는 분자량이 1000 이하이다.

앱타머

「앱타머」는 폴리펩타이드 등의 표적 분자에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 가리킨다. 예를 들면, 본 발명의 앱타머는 FVIII 대체 활성을 갖는 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 RNA 앱타머일 수 있다. 앱타머의 생성 및 치료적 사용은 당 분야에 있어서 충분히 확립되어 있다. 예를 들면, 앱타머는 SELEX법(미국 특허 제5475096호, 동 5580737호, 동 5567588호, 동 5707796호, 동 5763177호, 동 6699843호 등을 참조)을 이용함으로써 취득 가능하다.

항체

FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질에 결합하는 항체로서는, 예를 들면 FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질이 FIX 및/또는 FIXa 및 FX 및/또는 FXa에 결합하는 이중특이성 항체인 경우, FIX에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, FIXa에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, FX에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, FXa에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, FIX 및/또는 FIXa에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 및 FX 및/또는 FXa에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 이중특이성 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체를 들 수 있다. 상기 항체를 단독으로 사용할 수 있고, 또한 복수 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 1종류의 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체를 복수, 예를 들면 FIX에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체를 복수 종류, 사용할 수도 있다. FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질이 FIX 및/또는 FIXa 및 FX 및/또는 FXa에 결합하는 이중특이성 항체인 경우, 예를 들면 이하의 조합으로 사용할 수 있다.

(a) FIX에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체와 FX에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체

(b) FIXa에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체와 FX에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체

(c) FIX에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체와 FIXa에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체

(d) FIX에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, FX에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체 및 FIXa에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체

FIX 및/또는 FIXa에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체로서는, 예를 들면 AQ8, AQ1, AQ512 항체를 들 수 있다. 가변 영역의 염기 서열과 그것으로부터 예측되는 아미노산 서열은 GENETYX Ver. 9(GENETYX CORPORATION)로 해석했다.

AQ8의 H쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 이하의 서열번호로 표시된다.

아미노산 서열: 서열번호: 1

핵산 서열: 서열번호: 5

AQ8의 L쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 이하의 서열번호로 표시된다.

아미노산 서열: 서열번호: 2

핵산 서열: 서열번호: 6

AQ8의 H쇄 CDR1∼3의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 이하의 서열번호로 표시된다.

CDR1 아미노산 서열: 서열번호: 12

CDR2 아미노산 서열: 서열번호: 13

CDR3 아미노산 서열: 서열번호: 14

CDR1 핵산 서열: 서열번호: 15

CDR2 핵산 서열: 서열번호: 16

CDR3 핵산 서열: 서열번호: 17

AQ8의 L쇄 CDR1∼3의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 이하의 서열번호로 표시된다.

CDR1 아미노산 서열: 서열번호: 18

CDR2 아미노산 서열: 서열번호: 19

CDR3 아미노산 서열: 서열번호: 20

CDR1 핵산 서열: 서열번호: 21

CDR2 핵산 서열: 서열번호: 22

CDR3 핵산 서열: 서열번호: 23

FX 및/또는 FXa에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체로서는, 예를 들면 AJ540, AJ541, AJ522, AJ114, AJ521 항체를 들 수 있다. 가변 영역의 염기 서열과 그것으로부터 예측되는 아미노산 서열은 GENETYX Ver. 9(GENETYX CORPORATION)로 해석했다.

AJ540의 H쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 이하의 서열번호로 표시된다.

아미노산 서열: 서열번호: 3

핵산 서열: 서열번호: 7

AJ540의 L쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 이하의 서열번호로 표시된다.

아미노산 서열: 서열번호: 4

핵산 서열: 서열번호: 8

AJ540의 H쇄 CDR1∼3의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 이하의 서열번호로 표시된다.

CDR1 아미노산 서열: 서열번호: 24

CDR2 아미노산 서열: 서열번호: 25

CDR3 아미노산 서열: 서열번호: 26

CDR1 핵산 서열: 서열번호: 27

CDR2 핵산 서열: 서열번호: 28

CDR3 핵산 서열: 서열번호: 29

AJ540의 L쇄 CDR1∼3의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 이하의 서열번호로 표시된다.

CDR1 아미노산 서열: 서열번호: 30

CDR2 아미노산 서열: 서열번호: 31

CDR3 아미노산 서열: 서열번호: 32

CDR1 핵산 서열: 서열번호: 33

CDR2 핵산 서열: 서열번호: 34

CDR3 핵산 서열: 서열번호: 35

「항체」라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 모노클로널 항체, 폴리클로널 항체, 이량체, 다량체, 다중특이성 항체(예를 들면 이중특이성 항체), 항체 유도체 및 항체 수식물이어도 된다(Miller K et al. J Immunol. 2003, 170(9), 4854-61). 항체는 마우스 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체여도 되고, 또는 다른 종 유래여도, 인공적으로 합성한 것이어도 된다. 본 명세서 중에 개시되는 항체는 면역글로불린 분자의 임의의 타입(예를 들면 IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA), 클래스(예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다. 면역글로불린은 임의의 종(예를 들면 인간, 마우스 또는 토끼) 유래일 수 있다. 한편, 「항체」, 「면역글로불린」 및 「이뮤노글로불린」이라는 용어는 호환성을 가지고 광의의 의미로 사용된다.

「항체 유도체」란 항체의 일부, 바람직하게는 항체의 가변 영역, 또는 적어도 항체의 항원 결합 영역을 포함한다. 항체 유도체에는, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 선상 항체, 1본쇄 항체(scFv), sc(Fv)₂, Fab₃, 도메인 항체(dAb)(국제 공개 제2004/058821호, 국제 공개 제2003/002609호), 다이아보디, 트라이아보디, 테트라보디, 미니보디 및 항체 유도체로부터 형성되는 다중특이성 항체가 포함되지만, 그들로 한정되는 것은 아니다. 여기에서, 「Fab」는 1본의 경쇄, 및 1본의 중쇄의 CH1 영역 및 가변 영역으로 구성된다. 또한, 「Fv」는 최소의 항체 유도체이고, 완전한 항원 인식 영역과 항원 결합 영역을 포함한다. 또한 항체 유도체는 예를 들면 IgG 항체의 Fc와의 융합체여도 된다. 예를 들면, 미국 특허 제5641870호 명세서, 실시예 2; Zapata G et al. Protein Eng. 1995, 8(10), 1057-1062; Olafsen T et al. Protein Eng. Design & Sel. 2004, 17(4):315-323; Holliger P et al. Nat. Biotechnol. 2005, 23(9); 1126-36; Fischer N et al. Pathobiology. 2007, 74(1):3-14; Shen J et al. J Immunol Methods. 2007, 318, 65-74; Wu et al. Nat Biotechnol. 2007, 25(11), 1290-7을 참조할 수 있다.

항체 수식물로서는, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항체에는, 이들 항체 수식물도 포함된다. 본 발명의 항체 수식물에 있어서는, 결합되는 물질은 한정되지 않는다. 이와 같은 항체 수식물을 얻기 위해서는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 실시하는 것에 의해 얻을 수 있다. 이들 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.

「이중특이성」항체는 상이한 에피토프를 인식하는 가변 영역을 동일한 항체 분자 내에 갖는 항체를 말한다. 이중특이성 항체는 2개 이상의 상이한 항원을 인식하는 항체여도 되고, 동일 항원 상의 상이한 2개 이상의 에피토프를 인식하는 항체여도 된다. 이중특이성 항체에는, 전체 항체뿐만 아니라 항체 유도체가 포함되어 있어도 된다. 본 발명의 항체에는, 이중특이성 항체도 포함된다. 한편, 본 명세서에 있어서, 항FIXa/FX 이중특이성 항체는 FIXa 및 FX에 결합하는 이중특이성 항체와 동일한 의미로 이용된다.

유전자 재조합 항체의 작성 방법

항체로서는, 유전자 재조합 기술을 이용하여 산생한 재조합형 항체를 이용할 수 있다. 재조합형 항체는, 그것을 코드하는 DNA를 하이브리도마, 또는 항체를 산생하는 감작 림프구 등의 항체 산생 세포로부터 클로닝하고, 벡터에 짜 넣어, 이것을 숙주(숙주 세포)에 도입하여 산생시키는 것에 의해 얻을 수 있다.

항체는 인간 항체, 마우스 항체, 래트 항체 등, 그의 유래는 한정되지 않는다. 또한 키메라 항체나 인간화 항체 등의 유전자 개변 항체여도 된다.

인간 항체의 취득 방법은 이미 알려져 있고, 예를 들면, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 트랜스제닉 동물을 목적의 항원으로 면역함으로써 목적의 인간 항체를 취득할 수 있다(국제특허출원 공개번호 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735 참조).

유전자 개변 항체는 기지의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 키메라 항체는, 면역 동물의 항체의 H쇄 및 L쇄의 가변 영역과, 인간 항체의 H쇄 및 L쇄의 정상 영역으로 이루어지는 항체이다. 면역 동물 유래의 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA를, 인간 항체의 정상 영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 짜 넣어 숙주에 도입하여 산생시키는 것에 의해, 키메라 항체를 얻을 수 있다.

인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해지는 개변 항체이다. 인간화 항체는 면역 동물 유래의 항체의 CDR을 인간 항체의 상보성 결정 영역으로 이식하는 것에 의해 구축된다. 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다(유럽특허출원 공개번호 EP 239400, 국제특허출원 공개번호 WO 96/02576, Sato K et al, Cancer Research 1993, 53: 851-856, 국제특허출원 공개번호 WO 99/51743 참조).

이중특이성 항체(bispecific 항체)는 2종의 상이한 항원에 대해서 특이성을 갖는 항체이다.

이중특이성 항체는 IgG 타입의 것으로 한정되지 않지만, 예를 들면 IgG 타입 이중특이성 항체는 IgG 항체를 산생하는 하이브리도마 2종을 융합하는 것에 의해 생기는 hybrid hybridoma(quadroma)에 의해 분비시킬 수 있다(Milstein C et al. Nature 1983, 305: 537-540). 또한 목적의 2종의 IgG를 구성하는 L쇄 및 H쇄의 유전자, 합계 4종의 유전자를 세포에 도입함으로써 공발현시키는 것에 의해 분비시킬 수 있다.

이때 H쇄의 CH3 영역에 적당한 아미노산 치환을 실시하는 것에 의해 H쇄에 대하여 헤테로인 조합의 IgG를 우선적으로 분비시킬 수도 있다(Ridgway JB et al. Protein Engineering 1996, 9: 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology 1998, 16: 677-681, WO 2006/106905, Davis JH et al. Protein Eng Des Sel. 2010, 4: 195-202).

또한, L쇄에 관해서는, H쇄 가변 영역에 비해 L쇄 가변 영역의 다양성이 낮기 때문에, 양 H쇄에 결합능을 줄 수 있는 공통의 L쇄가 얻어질 것이 기대되어, 본 발명의 항체는 공통의 L쇄를 갖는 항체여도 된다. 이 공통 L쇄와 양 H쇄 유전자를 세포에 도입하는 것에 의해 IgG를 발현시킴으로써 효율이 좋은 이중특이성 IgG의 발현이 가능해진다.

에피토프

본 발명에 있어서의 FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 중화하는 물질의 일 실시형태인 항체는, 당해 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항체, 보다 바람직하게는 동일한 에피토프에 결합하는 항체도 포함한다.

어떤 항체가 다른 항체와 중복되는 에피토프 또는 동일한 에피토프를 인식하는지 여부는 양자의 에피토프에 대한 경합에 의해 확인할 수 있다. 항체간의 경합은 경합 결합 어세이에 의해 평가할 수 있고, 그 수단으로서 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA), 형광 에너지 전이 측정법(FRET)이나 형광 미량 측정 기술(FMAT(등록상표)) 등을 들 수 있다. 항원에 결합한 해당 항체의 양은 중복되는 에피토프 또는 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해서 경합하는 후보 경합 항체(피검 항체)의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉, 중복되는 에피토프 또는 동일한 에피토프에 대한 피검 항체의 양이나 친화성이 커질수록, 해당 항체의 항원에 대한 결합량은 저하되고, 항원에 대한 피검 항체의 결합량은 증가한다. 구체적으로는, 항원에 대해, 적당한 표지를 한 해당 항체와 피검 항체를 동시에 첨가하고, 표지를 이용하여 결합하고 있는 해당 항체를 검출한다. 항원에 결합한 해당 항체량은 해당 항체를 미리 표지해 둠으로써, 용이하게 측정할 수 있다. 이 표지는 특별히 제한되지는 않지만, 수법에 따른 표지 방법을 선택한다. 표지 방법은, 구체적으로는 형광 표지, 방사 표지, 효소 표지 등을 들 수 있다.

여기에서 말하는 「중복되는 에피토프에 결합하는 항체」 또는 「동일한 에피토프에 결합하는 항체」란, 표지 해당 항체에 대해서, 비표지된 해당 항체의 결합에 의해 결합량을 50% 저하시키는 농도(IC₅₀)에 대하여, 피검 항체가 비표지 해당 항체 IC₅₀의 통상 100배, 바람직하게는 80배, 더 바람직하게는 50배, 더욱 바람직하게는 30배, 보다 바람직하게는 10배 높은 농도에서 적어도 50%, 표지 해당 항체의 결합량을 저하시킬 수 있는 항체이다. 한편, 항체가 인식하는 에피토프의 해석은 당업자에게 공지인 방법에 의해 행하는 것이 가능하고, 예를 들면 웨스턴 블로팅법 등에 의해 행하는 것이 가능하다.

항체의 제조 방법

본 발명의 항체는 당업자에게 공지인 방법에 의해 제조할 수 있다. 구체적으로는, 목적으로 하는 항체를 코드하는 DNA를 발현 벡터에 짜 넣는다. 그때, 발현 제어 영역, 예를 들면 인핸서, 프로모터의 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 짜 넣는다. 다음으로, 이 발현 벡터에 의해 숙주 세포를 형질전환하여, 항체를 발현시킨다. 그때에는, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다.

벡터의 예로서는, M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한, cDNA의 서브클로닝, 절출을 목적으로 한 경우, 상기 벡터 외에, 예를 들면 pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 이용할 수 있다.

항체를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는, 예를 들면, 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는, 대장균에서 효율 좋게 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터(Ward 등, Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터(Better 등, Science (1988) 240, 1041-1043) 또는 T7 프로모터 등을 가지고 있을 것이 불가결하다. 이와 같은 벡터로서는, 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(Pharmacia사제), 「QIAexpress system」(QIAGEN사제), pEGFP 또는 pET(이 경우, 숙주는 T7 RNA 폴리메라아제를 발현하고 있는 BL21이 바람직함) 등을 들 수 있다.

또한, 벡터에는, 폴리펩타이드 분비를 위한 시그널 서열이 포함되어 있어도 된다. 폴리펩타이드 분비를 위한 시그널 서열로서는, 대장균의 페리플라즘에 산생시키는 경우, 예를 들면 pelB 시그널 서열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397)을 사용하면 된다. 숙주 세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면 염화 칼슘법, 전기천공법을 이용하여 행할 수 있다.

대장균 발현 벡터 외, 본 발명의 항체를 제조하기 위한 벡터로서는, 예를 들면, 포유동물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pcDNA3(Invitrogen사제)나, pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p5322), pEF, pCDM8), 곤충 세포 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(GIBCO BRL사제), pBacPAK8), 식물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면 pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면 pZIPneo), 효모 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Pichia Expression Kit」(Invitrogen사제), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현 벡터(예를 들면 pPL608, pKTH50)를 들 수 있다.

CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 동물 세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포 내에서 발현시키기 위해서 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan 등, Nature (1979) 277, 108), MMTV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(Mizushima 등, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CAG 프로모터(Gene. (1991) 108, 193), CMV 프로모터 등을 가지고 있을 것이 불가결하고, 형질전환 세포를 선발하기 위한 유전자를 가지면 더 바람직하다. 형질전환 세포를 선발하기 위한 유전자로서는, 예를 들면 약제(네오마이신, G418 등)에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자가 있다. 이와 같은 특성을 갖는 벡터로서는, 예를 들면 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.

또, 유전자를 안정적으로 발현시키고, 또한 세포 내에서의 유전자의 카피수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산 합성 경로를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들면 pCHOI 등)를 도입하고, 메토트렉세이트(MTX)에 의해 증폭시키는 방법을 들 수 있고, 또한 유전자의 일과성의 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T 항원을 발현하는 유전자를 염색체 상에 가지는 COS 세포를 이용하여 SV40의 복제 기점을 가지는 벡터(pcD 등)로 형질전환하는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로서는, 또한 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 소유두종바이러스(BPV) 등의 유래의 것을 이용할 수도 있다. 또, 숙주 세포계에서 유전자 카피수 증폭을 위해, 발현 벡터는 선택 마커로서, 아미노글리코사이드 트랜스페라아제(APH) 유전자, 티미딘 키나아제(TK) 유전자, 대장균 잔틴 구아닌 포스포리보실트랜스페라아제(Ecogpt) 유전자, 다이하이드로엽산 환원 효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.

이에 의해 얻어진 본 발명의 항체는 숙주 세포 내 또는 세포 외(배지 등)로부터 단리하여, 실질적으로 순수하고 균일한 항체로서 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상의 항체의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 되고, 전혀 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외 여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역 침강, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택, 조합하면 항체를 분리, 정제할 수 있다.

크로마토그래피로서는, 예를 들면 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이들 크로마토그래피는 액상 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 이용하여 행할 수 있다. 어피니티 크로마토그래피에 이용하는 컬럼으로서는, Protein A 컬럼, Protein G 컬럼을 들 수 있다. 예를 들면, Protein A를 이용한 컬럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose FF(GE Amersham Biosciences) 등을 들 수 있다. 본 발명은 이들 정제 방법을 이용하여 고도로 정제된 항체도 포함한다.

얻어진 항체는 균일하게까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들면 어피니티 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외 여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), 이들로 한정되는 것은 아니다. 어피니티 크로마토그래피에 이용하는 컬럼으로서는, Protein A 컬럼, Protein G 컬럼 등을 들 수 있다.

샘플 취득 방법

본 발명에 있어서, 혈액 유래 샘플은 바람직하게는 피험자로부터 채취된 혈액 유래 샘플이다. 이와 같은 혈액 유래 샘플은 FVIII 대체 활성을 갖는 물질이 투여된 피험자로부터 취득할 수 있다. 피험자로서는, 체내의 어느 부위에 출혈성의 증상을 수반하는 환자(출혈성 질환 환자)를 들 수 있다. 주된 출혈 부위로서는, 관절내, 근육내, 피하, 구강내, 두개내, 소화관, 비강내 등을 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다. 출혈성 질환 환자로서는, 바람직하게는 FVIII 및/또는 FVIIIa의 활성의 저하 또는 결손이 원인인 출혈성 질환 환자를 들 수 있다. FVIII 및/또는 FVIIIa의 활성의 저하 또는 결손이 원인인 출혈성 질환 환자로서는, 출혈성의 증상을 갖는 환자이고, 선천적 또는 후천적으로 FVIII 및 FVIIIa 중 어느 한쪽 또는 양쪽 모두의 활성이 저하되거나 또는 결손된 환자를 예시할 수 있다. FVIII, FVIIIa의 활성의 저하로서는, 정상인과 비교하여, 이들 활성이 바람직하게는 40% 미만(예를 들면 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만), 보다 바람직하게는 10% 미만(예를 들면 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만), 더 바람직하게는 5% 미만(예를 들면 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만), 특히 바람직하게는 1% 미만인 환자를 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다.

보다 구체적으로는, 이와 같은 질환의 예로서, 혈우병(혈우병 A, 혈우병 B), 후천성 혈우병, 및 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 기능 이상 또는 결손에 기인하는 폰 빌레브란트병으로부터 선택되는 질환을 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다. 혈액 유래 샘플에는, 혈청, 혈장 또는 전혈이 포함된다. 본 발명에 있어서는, 혈장 샘플을 사용하는 것이 바람직하다. 피험자로부터의 혈액 유래 샘플의 취득 방법은 당업자에게 주지이다.

키트

본 발명에 의한 FVIII의 반응성을 측정하는 방법에 필요한 버퍼 등 각종 시약류는 미리 패키징하여 키트로서 공급할 수 있다. 본 발명의 키트에는, 버퍼 외, 혈액 중의 FVIII 활성이나 FIX 활성이 정상인 인간으로부터 단리된 혈장 샘플, FVIII 대체 활성을 갖는 물질, FVIII 활성 측정에 사용 가능한 것, FVIII 인히비터 역가 측정에 사용 가능한 것 등을 포함할 수 있다. 또한 키트에 포함되는 각종 시약은 그의 사용 태양에 따라 분말상 또는 액상으로 할 수 있다. 또한 이들을 적당한 용기에 수납하여, 적시에 사용할 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하여, 예를 들면, FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 투여한 환자의 중증도를 진단할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 FVIII의 반응성을 측정하고, 그 측정 결과에 기초해서, 환자의 중증도 및/또는 인히비터 역가를 진단·판정할 수 있다. 진단·판정 방법은 당업자에게 공지인 방법에 의해 행할 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하여, 예를 들면, FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질 및 FVIII 제제를 투여한 환자에 있어서의 FVIII 제제의 약리 활성을 모니터링할 수 있다. 모니터링은 당업자에게 공지인 방법에 의해 행할 수 있다.

본 발명의 키트는, 예를 들면, FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 투여한 환자의 중증도를 진단하는 키트로서 이용할 수 있다. 본 발명의 키트를 이용하여 FVIII의 반응성을 측정하고, 그 측정 결과에 기초해서, 환자의 중증도를 진단·판정할 수 있다. 진단·판정 방법은 당업자에게 공지인 방법에 의해 행할 수 있다.

본 발명의 키트는, 예를 들면, FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질 및 FVIII 제제를 투여한 환자에 있어서의 FVIII 제제의 약리 활성을 모니터링하는 키트로서 이용할 수 있다. 모니터링은 당업자에게 공지인 방법에 의해 행할 수 있다.

예를 들면, 환자를 치료하는 방법으로서,

(a) 제 1 투여량의 FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 투여하는 공정;

(b) 환자의 FVIII의 반응성을 모니터링하는 공정;

(c) 관측된 FVIII의 반응성에 기초해서, FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질의 제 2 투여량을 결정하는 공정; 및

(d) 제 2 투여량의 FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 해당 환자에게 투여하는 공정

을 포함하는 방법을 이용할 수 있다.

또한, 예를 들면, 환자를 치료하는 방법으로서,

(a) 제 1 투여 간격으로 FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 투여하는 공정;

(b) 환자의 FVIII의 반응성을 모니터링하는 공정;

(c) 관측된 FVIII의 반응성에 기초해서, FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질의 제 2 투여 간격을 결정하는 공정; 및

(d) 제 2 투여 간격으로 FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 해당 환자에게 투여하는 공정

을 포함하는 방법을 이용할 수 있다.

또한, 예를 들면, 환자를 치료하는 방법으로서, FVIII의 반응성을 모니터링하고, FVIII의 반응성에 따라 응고 제 VIII 인자의 기능 대체 활성을 갖는 물질을 투여하는 양 또는/및 투여 간격을 변경하여, 환자를 치료하는 방법을 이용할 수 있다.

FVIII의 기능 대체 활성을 갖는 물질은, 바람직하게는 FIX 및/또는 FIXa 및 FX 및/또는 FXa에 결합하는 이중특이성 항체이다. 더 바람직하게는 이하에 기재된 항체로서, 제 1 폴리펩타이드와 제 3 폴리펩타이드가 회합하고, 제 2 폴리펩타이드와 제 4 폴리펩타이드가 회합하는 이중특이성 항체이다. 제 1 폴리펩타이드가 서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제 2 폴리펩타이드가 서열번호: 11에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제 3 폴리펩타이드와 제 4 폴리펩타이드가 서열번호: 10에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q499-z121/J327-z119/L404-k), 또는 제 1 폴리펩타이드가 서열번호: 36에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제 2 폴리펩타이드가 서열번호: 37에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제 3 폴리펩타이드와 제 4 폴리펩타이드가 서열번호: 38에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q153-G4k/J142-G4h/L180-k)

투여량은, 예를 들면 상기 이중특이성 항체의 경우, 0.001∼100mg/kg이다. 바람직하게는 약 0.001mg/kg, 약 0.003mg/kg, 약 0.005mg/kg, 약 0.01mg/kg, 약 0.03mg/kg, 약 0.05mg/kg, 약 0.1mg/kg, 약 0.3mg/kg, 약 0.5mg/kg, 약 1mg/kg, 약 3mg/kg, 약 5mg/kg, 약 10mg/kg, 약 20mg/kg, 약 30mg/kg, 약 40mg/kg, 약 50mg/kg, 약 60mg/kg, 약 70mg/kg, 약 80mg/kg, 약 90mg/kg, 약 100mg/kg이다. 투여량은 모니터링의 전후에서 동일해도 되고, 상이해도 된다. 투여 간격은, 예를 들면 상기 이중특이성 항체의 경우, 적어도 1일 이상이다. 바람직하게는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주간, 2주간, 3주간, 4주간, 5주간, 6주간, 7주간, 8주간, 9주간, 10주간, 11주간, 12주간, 13주간, 14주간, 15주간, 16주간, 17주간, 18주간, 19주간, 20주간, 21주간, 22주간, 23주간, 24주간, 25주간, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년이다. 투여 간격은 모니터링의 전후에서 동일해도 되고, 상이해도 된다.

본 발명의 방법 또는 키트의 대상이 되는 환자는, 예를 들면, 혈우병 A, 후천성 혈우병 A, 폰 빌레브란트병, 및 FVIII 및/또는 FVIIIa에 대한 인히비터가 출현하고 있는 혈우병 A 환자이다.

본 명세서에서 이용하는 경우, 「…을 포함하는(comprising)」이라는 표현에 의해 나타내지는 태양은 「본질적으로 …로 이루어지는(essentially consisting of)」이라는 표현에 의해 나타내지는 태양 및 「…로 이루어지는(consisting of)」이라는 표현에 의해 나타내지는 태양을 포함한다.

본 명세서에 있어서 명시적으로 인용되는 모든 특허 및 참고문헌의 내용은 모두 본 명세서에 참조로서 포함된다.

본 발명은 이하의 실시예에 의해 더 예시되지만, 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 항체의 제작 및 가변 영역의 서열 결정

특허문헌 3(WO 2012/067176)에 기재된 이중특이성 항체인 ACE910(Q499-z121/J327-z119/L404-k)(서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄와 서열번호: 10에 기재된 L쇄가 회합하고, 서열번호: 11에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄와 서열번호: 10에 기재된 L쇄가 회합하고 있는 이중특이성 항체)에 대한 항체 제작을 시도했다. 유전자 재조합 수법 및 Pepsin 소화를 이용하여, 항FIXa측, 항FX측 각각의 Fab로 구성된 F(ab')2를 제작했다.

마우스 및 래트에 항FIXa-F(ab')2 또는 항FX-F(ab')2를 면역했다. 마우스 또는 래트로부터 적출한 비장 또는 래트 림프절로부터 얻어진 세포와 마우스 골수종 세포를 통상적 방법에 따라 세포 융합하여, 하이브리도마를 제작했다. 하이브리도마의 배양 상청은 ACE910의 항FIXa-arm 또는 항FX-arm에 대한 결합을 검출하는 ELISA로 평가하여, 최종적으로 ACE910의 항FIXa-arm에만 결합하고 항FX-arm에는 결합하지 않는 마우스 항체 AQ8, AQ1, 래트 항체 AQ512, 및 ACE910의 항FX-arm에만 결합하고 항FIXa-arm에는 결합하지 않는 래트 항체 AJ540, AJ114, AJ521, AJ522, AJ541을 선택했다. 또, AQ8 항체 또는 AJ540 항체의 가변 영역의 염기 서열을 해석했다. AQ8 및 AJ540의 가변 영역의 염기 서열과 그것으로부터 예측되는 아미노산 서열은 GENETYX Ver. 9(GENETYX CORPORATION)로 해석했다.

〔실시예 2〕 재조합 마우스 항체 AQ8 및 재조합 래트-토끼 키메라 항체 AJ540의 발현 벡터의 제작

재조합 마우스 항체 AQ8은, 실시예 1에서 얻어진 AQ8 항체의 가변 영역의 서열에 기지의 마우스 IgG2b의 정상 영역 서열(중쇄: EMBL accession No. J00461, 경쇄: EMBL accession No. V00807)을 조합하여 항체 유전자의 전체 길이를 제작하고, 발현 벡터에 삽입했다. 마찬가지로, 재조합 래트-토끼 키메라 항체 AJ540은, AJ540 항체의 가변 영역에 기지의 래빗 IgG(중쇄: EMBL accession No. L29172, 경쇄: EMBL accession No. X00231)를 조합하여 제작했다. 제작한 발현 클론 플라스미드를 HEK293 세포에 도입하고, 대량 배양 및 Protein A 및 겔 여과에 의한 정제를 행하여, 재조합 마우스 항체 AQ8(rAQ8-mIgG2b) 및 재조합 래트-토끼 키메라 항체 AJ540(rAJ540-rbtIgG)을 제작했다.

〔실시예 3〕 rAQ8-mIgG2b 및 rAJ540-rbtIgG를 이용한 항FIXa/FX 이중특이성 항체 중화하에서의 one-stage clotting assay의 실시

10 또는 100U/dL의 재조합 FVIII(코지네이트 FS, 바이엘약품주식회사)을 포함하는 FVIII 결핍 혈장(George King)에 항FIXa/FX 이중특이성 항체 ACE910을 0 또는 300μg/mL가 되도록 첨가했다. 더욱이 각 조제한 혈장을, 이미다졸 버퍼(교와메덱스)로 10배 희석하는 군과, rAQ8-mIgG2b 및 rAJ540-rbtIgG를 각각 300μg/mL가 되도록 첨가한 이미다졸 버퍼로 10배 희석하는 군의 2군으로 나누어, 측정용 샘플 용액을 조제했다. 한편, ACE910을 충분히 중화하는 데 필요한 양의 rAQ8-mIgG2b 및 rAJ540-rbtIgG를 가했다. 조합의 상세는 이하에 나타낸다.

또한, 응고 시간을 FVIII 활성으로 환산하는 검량선용으로, 표준 혈장인 코아그트롤 N(시스멕스)을 이미다졸 버퍼로 10, 20, 40, 80, 160배 희석한 용액을 조제했다(검량선용 용액의 각각의 FVIII 활성은 93, 46.5, 23.3, 11.6, 5.81%로 했다). 측정용 샘플 용액 또는 검량선용 용액 50μL, 제 VIII 인자 결핍 인간 혈장(시스멕스) 50μL 및 트롬보체크 APTT-SLA(시스멕스) 50μL를 혼합하고, 37℃에서 5분간 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 0.02mol/L 염화 칼슘 용액(시스멕스) 50μL를 첨가하여 응고를 개시하고, 혈액 응고 자동 측정 장치 KC4 델타(Stago)로 응고 시간을 측정했다.

검량선용 용액의 각 FVIII 활성에 있어서의 응고 시간으로부터, 측정용 샘플의 응고 시간을 FVIII 활성으로 환산했다.

결과

결과를 도 1에 나타냈다. 항FIXa/FX 이중특이성 항체를 첨가한 10 또는 100U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장을 버퍼로 희석한 경우(#3, #7), 검량선의 범위 이상의 FVIII 활성을 나타내, 정확하게 측정할 수 없었다. 한편, 항FIXa/FX 이중특이성 항체를 첨가한 10 또는 100U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장에 대해서 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체를 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#4, #8), 항FIXa/FX 이중특이성 항체 무첨가군(#1, #5)과 마찬가지의 FVIII 활성을 나타냈다. 따라서, 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 항체는 이중특이성 항체의 활성을 완전히 중화하는 것에 의해, 이중특이성 항체가 존재하고 있음에도 불구하고 혈장 중의 FVIII 활성을 정확히 측정할 수 있다는 것을 나타냈다. 한편, 10 또는 100U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장에 대해서 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체만을 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#2, #6), 항FIXa/FX 이중특이성 항체 무첨가군(#1, #5)과 마찬가지의 FVIII 활성을 나타냈기 때문에, 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 항체는 이중특이성 항체에 대해서 특이적인 중화 작용을 갖는다는 것을 알 수 있었다.

〔실시예 4〕 AQ1과 AJ541, 또는 AQ1과 AJ522에 의한 항FIXa/FX 이중특이성 항체 중화하에서의 one-stage clotting assay의 실시

10U/dL의 재조합 FVIII(코지네이트 FS, 바이엘약품주식회사)을 포함하는 FVIII 결핍 혈장(George King)에 항FIXa/FX 이중특이성 항체 ACE910을 0 또는 10μg/mL가 되도록 첨가했다. 더욱이 각 조제한 혈장을, 이미다졸 버퍼(교와메덱스)로 10배 희석하는 군과, AQ1 및 AJ541을 각각 100μg/mL가 되도록 첨가한 이미다졸 버퍼로 10배 희석하는 군, AQ1과 AJ522를 각각 100μg/mL가 되도록 첨가한 이미다졸 버퍼로 10배 희석하는 군의 3군으로 나누어, 측정용 샘플 용액을 조제했다. 한편, ACE910을 충분히 중화하는 데 필요한 양의 AQ1, AJ541, AJ522를 가했다. 조합의 상세는 이하에 나타낸다.

또한, 응고 시간을 FVIII 활성으로 환산하는 검량선용으로, 표준 혈장인 코아그트롤 N(시스멕스)을 이미다졸 버퍼로 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640배 희석한 용액을 조제했다(검량선용 용액의 각각의 FVIII 활성은 102, 51.0, 25.5, 12.8, 6.38, 3.19, 1.59%로 했다). 측정용 샘플 용액 또는 검량선용 용액 50μL, 제 VIII 인자 결핍 인간 혈장(시스멕스) 50μL 및 트롬보체크 APTT-SLA(시스멕스) 50μL를 혼합하고, 37℃에서 5분간 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 0.02mol/L 염화 칼슘 용액(시스멕스) 50μL를 첨가하여 응고를 개시하고, 혈액 응고 자동 측정 장치 KC4 델타(Stago)로 응고 시간을 측정했다.

결과

결과를 도 2에 나타냈다. 항FIXa/FX 이중특이성 항체 ACE910을 첨가한 10U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장을 버퍼로 희석한 경우(#4), 검량선의 범위 이상의 FVIII 활성을 나타내, 정확하게 측정할 수 없었다. 한편, 항FIXa/FX 이중특이성 항체 ACE910을 첨가한 10U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장에 대해서 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체 AQ1과 AJ541을 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#5) 또는 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체 AQ1과 AJ522를 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#6), 항FIXa/FX 이중특이성 항체 무첨가군(#1)과 마찬가지의 FVIII 활성을 나타냈다. 따라서, 이중특이성 항체 ACE910의 활성을 완전히 중화하는 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 항체로서, rAQ8-mIgG2b 및 rAJ540-rbtIgG뿐만 아니라, 다른 항체의 조합이어도 유효했다.

〔실시예 5〕 AQ512와 AJ114, 또는 AQ512와 AJ521에 의한 항FIXa/FX 이중특이성 항체 중화하에서의 one-stage clotting assay의 실시

10U/dL의 재조합 FVIII(코지네이트 FS, 바이엘약품주식회사)을 포함하는 FVIII 결핍 혈장(George King)에 항FIXa/FX 이중특이성 항체 hBS23을 0 또는 10μg/mL가 되도록 첨가했다. 더욱이 각 조제한 혈장을, 이미다졸 버퍼(교와메덱스)로 10배 희석하는 군과, AQ512 및 AJ114를 각각 100μg/mL가 되도록 첨가한 이미다졸 버퍼로 10배 희석하는 군, AQ512와 AJ521을 각각 100μg/mL가 되도록 첨가한 이미다졸 버퍼로 10배 희석하는 군의 3군으로 나누어, 측정용 샘플 용액을 조제했다. 한편, hBS23을 충분히 중화하는 데 필요한 양의 AQ512, AJ114, AJ521을 가했다. 조합의 상세는 이하에 나타낸다.

결과

결과를 도 3에 나타냈다. 항FIXa/FX 이중특이성 항체 hBS23을 첨가한 10U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장을 버퍼로 희석한 경우(#4), 검량선의 범위 이상의 FVIII 활성을 나타내, 정확하게 측정할 수 없었다. 한편, 항FIXa/FX 이중특이성 항체 hBS23을 첨가한 10U/dL의 재조합 FVIII을 포함하는 FVIII 결핍 혈장에 대해서 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체 AQ512와 AJ114를 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#5) 또는 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체 AQ512와 AJ521을 포함하는 버퍼로 희석한 경우(#6), 항FIXa/FX 이중특이성 항체 무첨가군(#1)과 마찬가지의 FVIII 활성을 나타냈다. ACE910과는 상이한 이중특이성 항체 hBS23에서도, 그의 활성을 완전히 중화하는 것에 의해, 이중특이성 항체가 존재하고 있음에도 불구하고 혈장 중의 FVIII 활성을 정확히 측정할 수 있었기 때문에, 본 접근법은 다양한 FVIII 대체 활성을 갖는 이중특이성 항체에 대해서 유효하다는 것을 나타냈다.

〔실시예 6〕 rAQ8-mIgG2b 및 rAJ540-rbtIgG를 이용한 항FIXa/FX 이중특이성 항체 중화하에서의 베데스다법의 실시

제 VIII 인자 결핍 인간 혈장(FVIII 인히비터 함유)(George King Bio-Medical)에 항FIXa/FX 이중특이성 항체 ACE910을 0 또는 300μg/mL가 되도록 첨가했다. 더욱이 각 조제한 혈장을 0.25%(w/v) 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich) 함유 이미다졸 버퍼(교와메덱스)(이하 BSA-imidazole)로 25배 희석 또는 30배 희석했다. 표준 혈장인 코아그트롤 N(시스멕스)에 rAQ8-mIgG2b 및 rAJ540-rbtIgG를 무첨가, 또는 각각 300μg/mL가 되도록 첨가했다.

조제한 각 혈장 중 2종류를 이하의 조합(합계 8종류)으로 등량 혼합하고, 37℃, 2시간 인큐베이션했다.

인큐베이션 후, 혼합 용액을 BSA-imidazole로 10배 더 희석하여, 측정용 샘플 용액을 조제했다. 또한, 응고 시간을 FVIII 활성값으로 환산하는 검량선 작성용으로, 코아그트롤 N을 BSA-imidazole로 20, 40, 80, 160, 320배 희석한 용액을 조제했다(검량선용 용액의 각각의 FVIII 활성은 100, 50, 25, 12.5, 6.25%로 했다).

측정용 샘플 용액 또는 검량선용 용액 50μL, 제 VIII 인자 결핍 인간 혈장(시스멕스) 50μL 및 트롬보체크 APTT-SLA(시스멕스) 50μL를 혼합하고, 37℃에서 3분간 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 0.02mol/L 염화 칼슘 용액(시스멕스) 50μL를 첨가하여 응고를 개시하고, 혈액 응고 자동 측정 장치 KC4 델타(Stago)로 응고 시간을 측정했다.

검량선용 용액의 각 FVIII 활성에 있어서의 응고 시간으로부터, 측정용 샘플의 응고 시간을 FVIII 활성으로 환산했다. 또 잔존 FVIII 활성이 50%일 때에 1베데스다로 해서, 측정용 샘플 중의 베데스다값을 산출 후, 25배 및 30배를 곱한 값의 평균값을 각 샘플 원액 중의 인히비터 역가로서 산출했다.

결과

결과를 도 4에 나타냈다. 항FIXa/FX 이중특이성 항체만을 포함하는 FVIII 인히비터 혈장(#3)에서는, 검량선의 FVIII 100% 이상의 활성을 나타냈기 때문에, FVIII 인히비터 역가를 측정할 수 없었다.

한편, 항FIXa/FX 이중특이성 항체 및 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 2종류의 항체를 포함하는 FVIII 인히비터 혈장(#4)에서는, 무첨가의 인히비터 혈장(#1)과 마찬가지의 FVIII 인히비터 역가를 나타냈다. 따라서, 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 항체는 이중특이성 항체의 활성을 완전히 중화하는 것에 의해, 이중특이성 항체가 존재하고 있음에도 불구하고 혈장 중의 FVIII 인히비터 역가를 정확히 측정할 수 있다는 것을 나타냈다. 한편, 2종류의 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 항체만을 포함하는 FVIII 인히비터 혈장(#2)은, #1과 마찬가지의 결과를 나타냈기 때문에, 항FIXa/FX 이중특이성 항체에 대한 항체는 이중특이성 항체에 대해서 특이적인 중화 작용을 갖는다는 것을 알 수 있었다.

본 발명에 의해, FVIII 기능 대체 활성을 갖는 이중특이성 항체의 존재하에 있어서 FVIII의 반응성을 측정하는 방법, 예를 들면 FVIII 활성, FVIII 인히비터 역가를 측정하는 방법이 제공되었다. 본 발명의 방법을 사용하는 것에 의해, 당해 이중특이성 항체에 의한 혈우병 등의 출혈성 질환의 치료에 있어서 환자의 FVIII의 반응성을 정확히 측정할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> PUBLIC UNIVERSITY CORPORATION NARA MEDICAL UNIVERSITY CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Method for measuring reactivity of FVIII <130> C1-A1406P <150> JP 2014-196974 <151> 2014-09-26 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AQ8 VH <400> 1 Glu Val Asn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Ser Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AQ8 VL <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala 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attcgtgttc agcctggaag ccagcgccag caccgccaac 240 ctgcagatca gcaacctgaa gaacgaggac accgccaacg tgttctgcgc cagagagggc 300 ggaggctact actggtactt cgacttctgg ggccctggca caatggtgac agtgtccagc 360 <210> 8 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid sequence of AJ540 VL <400> 8 gacatcgtga tgacccagag ccccaccagc atgagcatca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atgaactgca aggccaacca gaacgtggac ttcaacgtgg actggtatca gcagaaaacc 120 ggccagtccc ccaagctgct gatctacaag gccagcaacc ggtacacagg cgtgcccgac 180 agattcacag gcagcggcag cggcaccgac ttcaccttca ccatcagcaa catgcaggcc 240 gaggacctgg ccgtgtacta ctgcatgcag agcaacagct tccccctgac cttcggctcc 300 ggcaccaacc tggaaatcaa g 321 <210> 9 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln 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Lys Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AJ540 light chain CDR3 <400> 32 Met Gln Ser Asn Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid sequence of AJ540 light chain CDR1 <400> 33 aaggccaacc agaacgtgga cttcaacgtg gac 33 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid sequence of AJ540 light chain CDR2 <400> 34 aaggccagca accggtacac a 21 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid sequence of AJ540 light chain CDR3 <400> 35 atgcagagca acagcttccc cctgacc 27 <210> 36 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificial sequence <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Arg Ala Gly His Asn Tyr Gly Ala Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val 195 200 205 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 210 215 220 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 435 440 445 <210> 37 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificial sequence <400> 37 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Lys Ser Thr Gly Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr His Asp Glu Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 435 440 <210> 38 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificial sequence <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Arg Lys Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Pro Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims

응고 제 VIII 인자의 반응성을 측정하는 방법으로서, 이하의 (1)과 (2)를 접촉시키는 공정을 포함하는 방법:
(1) 응고 제 IX 인자, 활성화 응고 제 IX 인자 또는 이들 둘다, 및 응고 제 X 인자, 활성화 혈액 응고 제 X 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 이중특이성 항체를 포함하는 혈액 유래 샘플;
(2) 해당 이중특이성 항체를 중화하는 1 이상의 항체.
제 1 항에 있어서,
상기 이중특이성 항체가 이하에 기재된 어느 하나의 항체로서, 제 1 폴리펩타이드와 제 3 폴리펩타이드가 회합하고, 제 2 폴리펩타이드와 제 4 폴리펩타이드가 회합하는 이중특이성 항체인 방법:
제 1 폴리펩타이드가 서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제 2 폴리펩타이드가 서열번호: 11에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제 3 폴리펩타이드와 제 4 폴리펩타이드가 서열번호: 10에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q499-z121/J327-z119/L404-k); 및
제 1 폴리펩타이드가 서열번호: 36에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제 2 폴리펩타이드가 서열번호: 37에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제 3 폴리펩타이드와 제 4 폴리펩타이드가 서열번호: 38에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q153-G4k/J142-G4h/L180-k).
제 1 항에 있어서,
상기 중화하는 1 이상의 항체가, 상기 이중특이성 항체에 대한 이하의 중화 항체 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 중화 항체인, 방법:
(a) 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체;
(b) 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체;
(c) 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체;
(d) 활성화 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체; 및
(e) 응고 제 IX 인자, 활성화 응고 제 IX 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab, 및 응고 제 X 인자, 활성화 응고 제 X 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 이중특이성 항체.
제 1 항에 있어서,
상기 중화하는 1 이상의 항체가, 상기 이중특이성 항체에 대한 중화 항체의 이하의 조합 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 조합인, 방법:
(a) 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체와 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체;
(b) 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체와 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체;
(c) 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체와 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체; 및
(d) 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, 및 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체.
제 1 항에 있어서,
상기 중화하는 1 이상의 항체가, 상기 이중특이성 항체에 대한 중화 항체의 이하의 조합인, 방법:
응고 제 IX 인자, 활성화 응고 제 IX 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체와 응고 제 X 인자, 활성화 혈액 응고 제 X 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
응고 제 VIII 인자의 반응성을 측정하는 방법이, 응고 제 VIII 인자 활성을 측정하는 방법 또는 응고 제 VIII 인자 인히비터 역가를 측정하는 방법인, 방법.
응고 제 IX 인자, 활성화 응고 제 IX 인자 또는 이들 둘다, 및 응고 제 X 인자, 활성화 혈액 응고 제 X 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 이중특이성 항체에 대한 이하의 중화 항체 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 중화 항체를 포함하는, 제 3 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트:
(a) 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체;
(b) 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체;
(c) 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체;
(d) 활성화 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체; 및
(e) 응고 제 IX 인자, 활성화 응고 제 IX 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab, 및 응고 제 X 인자, 활성화 응고 제 X 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 이중특이성 항체.
응고 제 IX 인자, 활성화 응고 제 IX 인자 또는 이들 둘다, 및 응고 제 X 인자, 활성화 혈액 응고 제 X 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 이중특이성 항체에 대한 중화 항체의 이하의 조합 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 조합을 포함하는, 제 4 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트:
(a) 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체와 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체;
(b) 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체와 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체;
(c) 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체와 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체; 및
(d) 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, 응고 제 X 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체, 및 활성화 응고 제 IX 인자에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체.
응고 제 IX 인자, 활성화 응고 제 IX 인자 또는 이들 둘다, 및 응고 제 X 인자, 활성화 혈액 응고 제 X 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 이중특이성 항체에 대한 중화 항체의 이하의 조합을 포함하는, 제 5 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트:
응고 제 IX 인자, 활성화 응고 제 IX 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체와 응고 제 X 인자, 활성화 혈액 응고 제 X 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Fab에 결합하는 항체.
제 1 항에 있어서,
응고 제 IX 인자, 활성화 응고 제 IX 인자 또는 이들 둘다, 및 응고 제 X 인자, 활성화 혈액 응고 제 X 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 이중특이성 항체를 투여한 환자의 중증도를 진단하기 위한 정보를 제공하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
응고 제 IX 인자, 활성화 응고 제 IX 인자 또는 이들 둘다, 및 응고 제 X 인자, 활성화 혈액 응고 제 X 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 이중특이성 항체를 투여한 환자의 인히비터 역가를 진단하기 위한 정보를 제공하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
응고 제 IX 인자, 활성화 응고 제 IX 인자 또는 이들 둘다, 및 응고 제 X 인자, 활성화 혈액 응고 제 X 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 이중특이성 항체 및 FVIII 제제를 투여한 환자에 있어서의 FVIII 제제의 약리 활성을 모니터링하기 위한, 방법.
제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 환자가 혈우병 A 환자, 후천성 혈우병 A 환자, 폰 빌레브란트병 환자, 및 혈액 응고 제 VIII 인자, 활성화 혈액 응고 제 VIII 인자 또는 이들 둘다에 대한 인히비터가 출현하고 있는 혈우병 A 환자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 환자인, 방법.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
응고 제 IX 인자, 활성화 응고 제 IX 인자 또는 이들 둘다, 및 응고 제 X 인자, 활성화 혈액 응고 제 X 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 이중특이성 항체를 투여한 환자의 중증도를 진단하기 위한, 키트.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
응고 제 IX 인자, 활성화 응고 제 IX 인자 또는 이들 둘다, 및 응고 제 X 인자, 활성화 혈액 응고 제 X 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 이중특이성 항체를 투여한 환자의 인히비터 역가를 진단하기 위한, 키트.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
응고 제 IX 인자, 활성화 응고 제 IX 인자 또는 이들 둘다, 및 응고 제 X 인자, 활성화 혈액 응고 제 X 인자 또는 이들 둘다에 결합하는 이중특이성 항체 및 FVIII 제제를 투여한 환자에 있어서의 FVIII 제제의 약리 활성을 모니터링하기 위한, 키트.
제 14 항에 있어서,
상기 환자가 혈우병 A 환자, 후천성 혈우병 A 환자, 폰 빌레브란트병 환자, 및 혈액 응고 제 VIII 인자, 활성화 혈액 응고 제 VIII 인자 또는 이들 둘다에 대한 인히비터가 출현하고 있는 혈우병 A 환자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 환자인, 키트.
제 15 항에 있어서,
상기 환자가 혈우병 A 환자, 후천성 혈우병 A 환자, 폰 빌레브란트병 환자, 및 혈액 응고 제 VIII 인자, 활성화 혈액 응고 제 VIII 인자 또는 이들 둘다에 대한 인히비터가 출현하고 있는 혈우병 A 환자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 환자인, 키트.
제 16 항에 있어서,
상기 환자가 혈우병 A 환자, 후천성 혈우병 A 환자, 폰 빌레브란트병 환자, 및 혈액 응고 제 VIII 인자, 활성화 혈액 응고 제 VIII 인자 또는 이들 둘다에 대한 인히비터가 출현하고 있는 혈우병 A 환자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 환자인, 키트.
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