KR101882830B1

KR101882830B1 - Masp-2 의존적 보체 활성화를 억제하는 조성물

Info

Publication number: KR101882830B1
Application number: KR1020167018831A
Authority: KR
Inventors: 토마스 두들러; 웨인 알. 곰보츠; 제임스 브라이언 파렌트; 클라크 이. 테드포드; 아니타 카블리; 우어스 비트 하게만; 헤랄드 라이에르센; 세르게이 키프리자노프
Original assignee: 오메로스 코포레이션
Priority date: 2011-05-04
Filing date: 2012-05-04
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2032-05-04
Also published as: JP5891298B2; US10047165B2; ES2795667T3; US9011860B2; CA3025762C; US20210054099A1; US20120282263A1; EP2704743B1; CA3131223A1; IL285522A; CL2013003140A1; MX361175B; HRP20200887T1; CN107011443B; IL266756B; RU2017137872A; CN103687620B; EP2704743A4; AU2012250627B2; IL229208A0

Abstract

본 발명은 MASP-2 의존적 보체 활성화의 부작용을 억제하는데 사용되는 항-MASP-2 억제 항체 및 이러한 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하는 조성물{COMPOSITIONS FOR INHIBITING MASP-2 DEPENDENT COMPLEMENT ACTIVATION}

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2011년 5월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 61/482,567의 이익을 주장하며, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

서열 목록에 관한 진술

이 출원에 관련된 서열 목록은 서류 사본 대신 텍스트 포맷으로 제공되고 명세서에 참고로 포함된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 파일의 이름은 MP_1_0115_PCT_SequenceListingasFiled_20120504_ST25이다. 텍스트 파일은 158 KB이고, 2012년 5월 4일에 생성되었고; 명세서의 출원과 함께 EFS-Web을 통해 제출된다.

보체 시스템은 사람 및 다른 척추동물에서 미생물 감염 및 다른 급성 상해에 대한 면역 반응을 시작하고, 증폭하고 조율하는, 초기 작동 메카니즘을 제공한다 (M.K. Liszewski and J.P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E. Paul, Raven Press, Ltd., New York). 보체 활성화는 잠재적 병원체에 대한 귀중한 1선 방어를 제공하는 한편, 보호적 면역 반응을 촉진하는 보체의 활성은 또한 숙주에 대한 잠재적 위협을 나타낼 수 있다 (K.R.　Kalli, et　al., Springer Semin . Immunopathol .　15:417-431, 1994; B.P.　Morgan, Eur .　J. Clinical Investig .　24:219-228, 1994). 예를 들어, C3 및 C5 단백질 가수분해 생성물은 호중구를 모집하고 활성화한다. 숙주의 방어에 필수적인 한편, 활성화된 호중구는 파괴적 효소의 방출에서 무차별적이고 기관 손상을 유발할 수도 있다. 게다가, 보체 활성화는 숙주 세포, 뿐만 아니라 미생물 표적의 근처에 용해성 보체 성분의 침착을 유발할 수도 있으며, 숙주 세포 용해를 일으킨다.

보체 시스템은 또한 심근 경색 (myocardial infarction), 뇌졸중 (stroke), 급성 호흡곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome; ARDS), 재관류 손상 (재관류 손상), 패혈성 쇼크 (septic shock), 열 화상에 따른 모세관 누출, 후심폐 바이패스 염증 (postcardiopulmonary bypass inflammation), 이식 거부 (transplant rejection), 류머티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 중증 근무력증 (myasthenia gravis), 및 알츠하이머 병 (Alzheimer's disease)을 포함하는, 많은 급성 및 만성 질환 상태의 발병의 원인이 되었다. 이들 질병 중 대부분에서, 보체는 발병의 원인이 아니지만 이에 수반된 인자 중 하나이다. 그럼에도 불구하고, 보체 활성화는 주요 병리학적 메카니즘일 수도 있고 이들 질병 상태 중 많은 것에서 임상적 조절을 위한 효과적인 시점을 나타낸다. 다양한 질병 상태에서 보체-매개된 조직 손상의 중요성의 증가하는 인식은 효과적인 보체 억제제에 대한 필요성을 강조한다. 지금까지, 에쿨리쥬맙 (Solaris®), C5에 대한 항체는 사람 사용에 대하여 승인된 유일한 보체-표적화 약물이다. 하지만, C5는 보체 시스템의 "다운스트림"에 위치한 여러 효과기 분자 중 하나이고, C5의 차단은 보체 시스템의 활성화를 억제하지 않는다. 그러므로, 보체 활성화의 시작 단계의 억제제는 "다운스트림" 보체 억제제보다 큰 이점을 가질 것이다.

현재, 세 개의 뚜렷한 경로를 통해 보체 시스템이 활성화될 수 있다는 것이 널리 인정된다: 고전적 경로, 렉틴 경로, 및 대체 경로. 고전적 경로는 보통 외부 입자 (즉, 항원)에 결합된 숙주 항체로 구성된 복합체에 의해 촉발되고 따라서 특이적 항체 반응의 발생을 위해 항원에 노출 전에 필요하다. 고전적 경로의 활성화가 숙주에 의한 이전의 적응성 면역 반응에 의존적이기 때문에, 고전적 경로는 후천적 면역 시스템의 일부이다. 반대로, 렉틴 및 대체 경로 둘 다는 적응성 면역력 면역에 독립적이고 선천적 면역 시스템의 일부이다.

보체 시스템의 활성화는 세린 프로테아제 치모겐의 순차적인 활성화를 일으킨다. 고전적 경로의 활성화의 첫 번째 단계는 항원-결합된 IgG 및 IgM 분자에 특이적 인식 분자, C1q의 결합이다. C1q는 C1으로 불리는 복합체로서 C1r 및 C1s 세린 프로테아제 프로 효소와 관련된다. 면역 복합체에 C1q의 결합시, C1r의 Arg-Ile 부위의 자가 단백질 가수분해 절단은 C1r-매개된 절단 및 C1s의 활성화로 이어지며, 그로 인해 C4 및 C2를 절단하는 능력을 얻는다. C4는 두 개의 단편으로 절단되고 C4a 및 C4b로 지정되고, 유사하게, C2는 C2a 및 C2b로 절단된다. C4b 단편은 인접한 히드록실 또는 아미노 기와 공유결합을 형성하고 활성화된 C2의 C2a 단편과 비공유 상호작용을 통해 C3 콘버타제 (C4b2a)를 발생시킬 수 있다. C3 콘버타제 (C4b2a)는 C3a 및 C3b 하위 성분으로 단백질 가수분해 절단에 의해 C3를 활성화하고 C5 콘버타제 (C4b2a3b)의 발생으로 이어지며, 이것은 C5를 절단함으로써 세포막을 붕괴하여 세포 용해로 이어질 수 있는 막 공격 복합체 (C6, C7, C8 및 C-9와 결합된 C5b, "MAC"로도 불림)의 형성으로 이어진다. C3 및 C4의 활성화된 형태 (C3b 및 C4b)는 외부 표적 표면에 공유결합으로 침착되며, 이것은 다수의 식세포 상의 보체 수용체에 의해 인식된다.

독립적으로, 렉틴 경로를 통한 보체 시스템의 활성화의 첫 번째 단계는 또한 특이적 인식 분자의 결합이며, 이것은 관련된 세린 프로테아제 프로효소 (proenzyme)의 활성화로 이어진다. 하지만, C1q에 의한 면역 복합체의 결합 대신에, 렉틴 경로의 인식 분자는 탄수화물-결합 단백질 (만난-결합 렉틴 (MBL), H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린 및 C-타입 렉틴 CL-11)의 그룹을 포함하며, 전체적으로 렉틴으로 불린다. J.　Lu et　al., Biochim . Biophys . Acta　1572:387-400, 2002; Holmskov et　al., Annu . Rev. Immunol.　21:547-578 (2003); Teh et　al., Immunology　101:225-232 (2000)를 참고하면 된다. 또한 J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov et al, Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000); Hansen S. et al., J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010)를 참고하면 된다.

Ikeda et al.은 처음에 C1q와 유사하게, MBL은 C4-의존적 방식으로 효모 만난-코팅된 적혈구에 결합시 보체 시스템을 활성화할 수 있다 (Ikeda et　al., J.　Biol. Chem .　262:7451-7454, 1987). MBL, 콜렉틴 단백질 패밀리의 멤버는 피라노스 고리의 적도면 (equatorial plane) 방향의 3- 및 4-히드록시 기를 가진 탄수화물과 결합하는 칼슘-의존적 렉틴이다. 따라서 MBL에 대한 중요한 리간드는 D-만노스 및 N-아세틸-D-글루코사민인 한편, 이 입체적 필요조건에 맞지 않는 탄수화물은 MBL에 대한 검출 불가능한 친화도를 갖는다 (Weis, W.I.,　et　al., Nature　360:127-134, 1992). MBL 및 일가 당 사이의 상호작용은 매우 약하며, 해리는 전형적으로 한자리 밀리 몰 단위로 일정하다. MBL은 서로 매우 근접하게 위치한 다중 단당류 잔기와의 결합력에 의해, 즉, 이들과 동시에 상호작용함으로써 글리칸 리간드에 단단하고, 특이적인 결합을 달성한다 (Lee, R.T.,　et　al., Archiv. Biochem . Biophys . 299:129-136, 1992). MBL은 보통 박테리아, 효모, 기생충 및 특정 바이러스와 같은 미생물을 장식하는 탄수화물 패턴을 인식한다. 반대로, MBL은 D-갈락토스 및 시알산, 포유동물 혈장 및 세포 표면 당단백질에 존재하는 일반적으로 "성숙한" 복합체 당접합체를 장식하는 끝에서 두 번째 및 마지막 당을 인식하지 않는다. 이 결합 특이성은 "외부" 표면의 인식을 촉진하고 "자가 활성화"로부터 보호를 돕는 것으로 생각된다. 하지만, MBL은 포유동물 세포의 소포체 및 골지체에서 격리된, N-결합된 당단백질 및 당지질 상에서 고-만노스 "전구체" 글리칸의 클러스터 (cluster)에 높은 친화도로 결합한다 (Maynard, Y.,　et　al., J. Biol . Chem .　257:3788-3794, 1982). 그러므로, 손상된 세포는 MBL 결합을 통해 렉틴 경로 활성화에 대한 잠재적 표적이다. 피콜린은 MBL 이외에 피브리노겐-유사 도메인으로 불리는, 다른 타입의 렉틴 도메인을 소유한다. 피콜린은 Ca⁺⁺-의존적 방식으로 당 잔기에 결합한다. 사람에서, 세 종류의 피콜린 (L-피콜린, M-피콜린 및 H-피콜린)이 확인되었다. 두 개의 혈청 피콜린, L-피콜린 및 H-피콜린은 N-아세틸-D-글루코사민에 대한 일반적은 특이성을 갖지만, H-피콜린은 또한 N-아세틸-D-갈락토사민에 결합한다. L-피콜린, H-피콜린, CL-11, 및 MBL의 당 특이성의 차이는 다른 렉틴이 상보적일 수도 있고, 중첩을 통해, 다른 당접합체를 표적화할 수도 있다는 것을 의미한다. 이 개념은 렉틴 경로에서 알려진 렉틴 중에, 유일하게 L-피콜린만이 리포테이코산, 모든 그람 양성 박테리아에서 발견된 세포 벽 당접합체에 특이적으로 결합한다는 최근 보고에 의해 지지가 된다 (Lynch, N.J.,　et　al., J.　 Immunol . 172:1198-1202, 2004). 콜렉틴 (즉, MBL) 및 피콜린은 아미노산 서열에서 큰 유사성을 함유하지 않는다. 하지만, 두 그룹의 단백질은 유사한 도메인 조직을 갖고, C1q와 유사하게, 올리고머 구조로 조립되며, 이것은 다점 결합의 가능성을 최대화한다.

MBL의 혈청 농도는 건강한 집단에서 매우 가변적이고 이것은 MBL 유전자의 프로모터 및 암호화 영역 둘 다의 다형현상/돌연변이에 의해 유전적으로 조절된다. 급성기 단백질로서, MBL의 발현은 염증 동안 더 상향조절된다. L-피콜린은 MBL의 그것과 유사한 농도로 혈청에 존재한다. 그러므로, 렉틴 경로의 L-피콜린 가지는 힘이 MBL 팔과 잠재적으로 비슷하다. MBL 및 피콜린은 또한 옵소닌으로서 기능 할 수 있으며, 이것은 식세포가 MBL- 및 피콜린- 장식된 표면을 표적화할 수 있게 한다 (Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004); Matsushita and Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002); Aoyagi et al., J Immunol 174(1):418-25 (2005)를 참고하면 된다). 이 옵소닌화는 식세포 수용체와 이들 단백질의 상호작용을 필요로 하며 (Kuhlman, M.,　et　al., J. Exp . Med . 169:1733, 1989; Matsushita, M.,　et　al., J. Biol . Chem .　271:2448-54, 1996), 이것의 정체는 확립되지 않았다.

사람 MBL은 그것의 콜라겐-유사 도메인을 통해, MBL-관련 세린 프로테아제 (MASP)로 불리는, 독특한 C1r/C1s-유사 세린 프로테아제와 특이적 및 고-친화도 상호작용을 형성한다. 지금까지, 세 개의 MASP가 설명되었다. 먼저, 단일 효소 "MASP"를 확인하였고 보체 캐스케이드의 시작 (즉, C2 및 C4를 절단)의 원인이 되는 효소로서 특징지어졌다 (Matsushita M and Fujita T., J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992), Ji, Y.H.,　et　al., J.　 Immunol . 150:571-578, 1993). MASP 활성은, 사실은, 두 개의 프로테아제의 혼합물인 것을 이후에 결정되었다: MASP-1 및 MASP-2 (Thiel, S.,　et　al., Nature 386:506-510, 1997). 하지만, MBL-MASP-2 복합체 단독은 보체 활성화에 충분한 것이 입증되었다 (Vorup-Jensen, T.,　et　al., J. Immunol . 165:2093-2100, 2000). 게다가, 유일한 MASP-2는 높은 속도로 C2 및 C4를 절단하였다 (Ambrus, G.,　et　al., J.　 Immunol . 170:1374-1382, 2003). 그러므로, MASP-2는 C3 콘버타제, C4b2a를 발생시키는 C4 및 C2의 활성화의 원인이 되는 프로테아제이다. 이것은 두 개의 특이적 세린 프로테아제 (C1r 및 C1s)의 협조적 작용이 보체 시스템의 활성화로 이어지는 경우, 고전적 경로의 C1 복합체와 큰 차이이다. 게다가, 세 번째 새로운 프로테아제, MASP-3이 분리되었다 (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001). MASP-1 및 MASP-3은 같은 유전자의 대안으로 스플라이싱된 (spliced) 생성물이다.

MASP는 C1r 및 C1s, C1 복합체의 효소 성분의 그것과 동일한 도메인 조직을 공유한다 (Sim, R.B.,　et　al., Biochem . Soc . Trans. 28:545, 2000). 이들 도메인은 N-말단 C1r/C1s/성게 VEGF/뼈 형태형성 단백질 (CUB) 도메인, 외피 성장 인자-유사 도메인, 제 2 CUB 도메인, 보체 조절 단백질 도메인의 탠덤 (tandem), 및 세린 프로테아제 도메인을 포함한다. C1 프로테아제에서와 같이, MASP-2의 활성화는 세린 프로테아제 도메인에 인접하게 결합된 Arg-Ile의 절단을 통해 발생하며, 이것은 효소를 이황화-결합된 A 및 B 사슬로 분열하였고, 후자는 세린 프로테아제 도메인으로 구성된다. 최근에, 유전적으로 결정된 MASP-2의 결핍이 설명되었다 (Stengaard-Pedersen, K.,　et　al., New Eng . J. Med . 349:554-560, 2003). 단일 뉴클레오티드의 돌연변이는 CUB1 도메인에서 Asp-Gly 교환으로 이어지고 MASP-2가 MBL에 결합할 수 없게 한다.

MBL은 또한 19 kDa (MAp19)의 MBL-관련 단백질 (Stover, C.M., J. Immunol. 162:3481-90, 1999) 또는 작은 MBL-관련 단백질 (sMAP) (Takahashi, M.,　et　al., Int . Immunol .　11:859-863, 1999)로 알려진, MASP-2의 대안으로 슬라이스된 (sliced) 형태와 관련될 수 있으며, 이것은 MASP 2의 촉매 활성이 결핍된다. MAp19는 MASP-2의 처음 두 개의 도메인에 이어서, 네 개의 독특한 아미노산의 추가 서열을 포함한다. MASP-1 및 MASP-2 유전자는 각각 사람 염색체 3 및 1에 위치한다 (Schwaeble, W.,　et　al., Immunobiology 205:455-466, 2002).

여러 줄의 증거는 다른 MBL-MASP 복합체가 있고 혈청에 MASP의 큰 분획이 MBL과 복합체를 형성하지 않는다는 것을 제안한다 (Thiel,　S.,　et　al., J. Immunol. 165:878-887, 2000). MBL과 마찬가지로, H- 및 L-피콜린 둘 다는 모든 MASP에 결합하고 렉틴 보체 경로를 활성화한다 (Dahl,　M.R., et　al., Immunity 15:127-35, 2001; Matsushita, M., et　al., J. Immunol .　168:3502-3506, 2002). 렉틴 및 고전적 경로 둘 다는 일반적인 C3 콘버타제 (C4b2a)를 형성하고 두 개의 경로는 이 단계에서 만나게 된다.

렉틴 경로는 나이브 (naive) 숙주의 감염에 대한 숙주 방어에서 중요한 역할을 갖는 것으로 널리 생각된다. 숙주 방어에서 MBL의 수반에 대한 강한 증거는 기능적 MBL의 감소한 혈청 수준을 갖는 환자의 분석으로부터 생긴다 (Kilpatrick, D.C., Biochim . Biophys . Acta 1572:401-413, 2002). 이러한 환자는 반복되는 박테리아 및 균류 감염에 민감성을 나타낸다. 이들 증상은 보통 젊을 때, 모체 유도된 항체 역가가 감소되는 만큼 겉보기에 취약한 동안, 하지만 항체 반응의 전체 레퍼토리가 발달하기 전에 분명하다. 이 증후군은 종종 MBL의 콜라겐성 부분의 여러 부위에서의 돌연변이로부터 발생하며, 이것은 MBL 올리고머의 적절한 형성을 방해한다. 하지만, MBL이 보체와 관계없이 옵소닌으로 기능 할 수 있기 때문에, 감염에 대한 증가한 민감성은 어느 정도가 손상된 보체 활성화로 인한 것인지 알려져 있지 않다.

고전적 및 렉틴 경로와 달리, 대체 경로의 개시자 (initiator)는 C1q 및 렉틴이 다른 두 개의 경로로 수행한다는 인식 기능을 수행하는 것으로 발견되지 않았다. 현재 대체 경로가 자발적으로 낮은 수준의 턴오버 (turnover) 활성화를 경험하며, 이것은 자발적으로 보체 활성화를 억제하는 적절한 분자 요소가 없는 외부 또는 다른 비정상적인 표면 (박테리아, 효모, 바이러스 감염된 세포 또는 손상된 조직)에서 쉽게 증폭될 수 있다는 것이 널리 인정된다. 대체 경로의 활성화에 직접적으로 수반된 네 개의 혈장 단백질이 있다: C3, 인자 B 및 D, 및 프로퍼딘. 비-감염성 사람 질환의 발병시 고전적 및 대체 보체 경로 둘 다와 연관된 광범위한 증거가 있지만, 렉틴 경로의 역할은 막 평가되기 시작한다. 최근 연구는 렉틴 경로의 활성화가 허혈성/재관류 손상시 보체 활성화 및 관련 염증의 원인이 될 수 있다는 증거를 제공한다. Collard et al. (2000)은 산화적 스트레스를 받은 배양된 내피 세포가 MBL에 결합하고 사람 혈청에 노출시 C3의 침착을 나타내는 것을 보고하였다 (Collard, C.D.,　et　al., Am. J. Pathol . 156:1549-1556, 2000). 게다가, 차단 항-MBL 단클론성 항체로 사람 혈청의 치료는 MBL 결합 및 보체 활성화를 억제하였다. 이들 발견은 래트 MBL과 관련된 차단 항체가 처리된 래트가 대조군 항체가 처리된 래트보다 관상 동맥의 폐색 시 훨씬 더 적은 심근 장애를 나타낸 심근 허혈-재관류의 래트 모델로 확장되었다 (Jordan,　J.E.,　et　al., Circulation 104:1413-1418, 2001). 산화적 스트레스 후에 혈관 내피에 결합하는 MBL의 분자적 메카니즘은 불분명하다; 최근 연구는 산화적 스트레스 후 렉틴 경로의 활성화가 혈관 내피 시토케라틴에 결합하지만, 당접합체에는 아닌 MBL에 의해 매개 될 수도 있다는 것을 제안한다 (Collard,　C.D.,　et　al., Am. J. Pathol . 159:1045-1054, 2001). 다른 연구는 허혈/재관류 손상의 발병시 고전적 및 대체 경로와 연관되고 이 질환에서 렉틴 경로의 역할은 논란이 남아있다 (Riedermann, N.C.,　et　al., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).

최근 연구는 MASP-1 (및 또한 아마도 MASP-3)은 대체 경로 활성화 효소 인자 D를 그것의 치모겐 형태로부터 그것의 효소의 의해 활성화된 형태로 전환하기 위해 필요하다 (Takahashi M. et al., J Exp Med 207(1):29-37 (2010)을 참고하면 된다). 이 과정의 생리학적 중요성은 MASP-1/3-결핍 마우스의 혈장의 대체 경로 기능적 활성화의 부재에 의해 강조된다. 원래의 C3으로부터 C3b의 단백질 가수분해 발생은 대체 경로가 기능 하기 위해 필요하다. 대체 경로 C3 콘버타제 (C3bBb)가 필수 서브유닛으로 C3b를 함유하기 때문에, 대체 경로를 통한 첫 번째 C3b의 기원과 관련된 질문은 당혹스러운 문제를 제시하고 상당한 연구를 자극했다.

C3은 티오에스테르 결합으로 알려진 드문 번역 후 변형을 함유하는 단백질의 패밀리에 속한다 (C4 및 α-2 마크로글로불린과 함께). 티오에스테르 기는 말단 카르보닐기가 세 개의 아미노산 떨어진 시스테인의 술피딜 기와 공유결합에 의해 티오에스테르 결합을 형성하는 글루타민으로 구성된다. 이 결합은 불안정하고 친전자성 글루타밀-티오에스테르는 히드록실 또는 아미노 기와 같은 친핵성 모이어티와 반응할 수 있고 따라서 다른 분자와 공유결합을 형성할 수 있다. 티오에스테르 결합은 온전한 C3의 소수성 포켓 내에 격리될 때 상당히 안정적이다. 하지만, C3a 및 C3b로 C3의 단백질 가수분해 절단은 C3b상에서 매우 반응성인 티오에스테르 결합의 노출에 이은, 히드록실 또는 아미노 기를 포함하는 인접한 모이어티에 의한 친핵성 공격을 일으키고, C3b는 공유결합에 의해 표적과 결합한다. 보체 표적에 C3b의 공유결합에 의한 부착시 그것의 잘 기록된 역할 이외에, C3 티오에스테르는 또한 대체 경로를 촉발하는데 있어서 중심 역할을 하는 것으로 생각된다. 널리 인정된 "틱-오버 (tick-over) 이론"에 따라, 대체 경로는 유체상 콘버타제, iC3Bb의 발생에 의해 시작되며, 이것은 가수분해된 티오에스테르 (iC3; C3(H₂O)) 및 인자 B를 가진 C3으로부터 형성된다 (Lachmann, P.J.,　et　al., Springer Semin . Immunopathol .　7:143-162, 1984). C3b-유사 C3(H₂O)는 단백질의 내부 티오에스테르의 느린 자발적인 가수분해에 의해 원래의 C3으로부터 발생한다 (Pangburn, M.K.,　et　al., J. Exp . Med . 154:856-867, 1981). C3(H₂O)Bb 콘버타제의 활성을 통해, C3b 분자는 표적 표면상에 침착되고 그로 인해 대체 경로를 시작한다.

대체 경로의 활성화의 개시자에 대하여 알려진 것은 매우 적다. 활성화제는 효모 세포벽 (치모산), 많은 순수한 다당류, 토끼 적혈구, 특정 면역글로불린, 바이러스, 균류, 박테리아, 동물 종양 세포, 기생충, 및 손상된 세포를 포함하는 것으로 생각된다. 이들 활성화제에 일반적인 유일한 특징은 탄수화물의 존재이지만, 탄수화물 구조의 복합성 및 다양성은 인식된 공유 분자 결정인자를 입증하는 것을 어렵게 만든다. 대체 경로 활성화는 이 경로의 억제 조절 성분, 예를 들어, 인자 H, 인자 I, DAF, 및 Cr1 및 프로퍼딘 사이의 좋은 균형을 통해 조절되며, 이것은 대체 경로의 유일한 양성 조절기이다는 것이 널리 인정되어 있다 (Schwaeble W.J. and Reid K.B., Immunol Today 20(1):17-21 (1999))를 참고하면 된다).

상기 설명된, 겉보기에 미조절된 활성화 메카니즘 이외에, 발생한 어떤 C3b도 추가적인 대체 경로 C3 콘버타제 (C3bBb)의 형성에 있어서 인자 B와 함께 참여할 수 있기 때문에, 대체 경로는 또한 렉틴/고전적 경로 C3 콘버타제 (C4b2a)에 대한 강력한 증폭 루프를 제공할 수 있다. 대체경로 C3 콘버타제는 프로퍼딘의 결합에 의해 안정화된다. 프로퍼딘은 대체 경로 C3 콘버타제 반감기를 6 내지 10배로 확장된다. 대체 경로 C3 콘버타제에 C3b의 추가는 대체 경로 C5 콘버타제의 형성으로 이어진다.

모든 세 개의 경로 (즉, 고전적, 렉틴 및 대체)는 C5에서 만나는 것으로 생각되며, 이것은 절단되어 다수의 염증 전 효과를 갖는 생성물을 형성한다. 만나게 된 경로는 말단 보체 경로로 나타난다. C5a는 가장 강한 아나필라톡신이며, 민무늬근 및 혈관 긴장도, 뿐만 아니라 혈관 삼투성을 포함한다. 그것은 또한 강력한 케모탁신이고 호중구 및 단핵구 둘 다의 활성화제이다. C5a-매개된 세포 활성화는 시토킨, 가수분해 효소, 아라키돈산 대사산물, 및 활성산소종을 포함하는, 다수의 추가적인 염증 매개자의 방출을 유발함으로써 염증 반응을 크게 증폭시킬 수 있다. C5 절단은 막 공격 복합체 (mambrane attack complex; MAC)로도 알려진, C5b-9의 형성으로 이어진다. 현재 저 용해 MAC 침착이 용해성 기공 형성 복합체로서 그것의 역할 이외에 염증에 있어서 중요한 역할을 할 수도 있다는 강한 증거가 있다.

면역 방어에 있어서 그것의 필수적인 역할 이외에, 보체 시스템은 많은 임상적 질병의 조직 손상에 기여한다. 따라서, 이들 부작용을 방지하기 위해 치료적으로 유효한 보체 억제제를 개발할 긴급한 필요가 있다.

이 개요는 하기 상세한 설명에 추가로 설명된 단순화된 형태로 개념의 선택을 도입하기 위해 제공된다. 이 개요는 주장된 대상 물질의 주요 특징을 확인하기 위한 것이 아니고, 주장된 대상 물질의 범위의 결정에 대한 지원으로서 사용되기 위한 것도 아니다.

한 양태에서, 본 발명은 사람 MASP-2에 결합하는 분리된 사람 단클론성 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편을 제공하며, (i) CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (ii) CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역 CDR-H3 서열은 SEQ ID NO: 38 또는 SEQ ID NO: 90으로 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 보존적 서열 변형을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR-L3 서열은 SEQ ID NO: 51 또는 SEQ ID NO: 94로 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 보존적 서열 변형을 설명하고, 분리된 항체는 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 사람 MASP-2에 결합하는 사람 항체를 제공하며, 항체는 I) a) i) SEQ ID NO: 21의 31-35개의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO: 21의 50-65개의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO: 21의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 b) i) SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 27의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 27의 50-56개의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 27의 89-97개의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 II) 그렇지 않으면 상기 중쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역 내에 조합된 최대 총 10개의 아미노산 치환 및 상기 경쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역 내에 조합된 최대 총 10개의 아미노산 치환을 제외하고, 상기 가변 도메인과 동일한 이들의 변이체를 포함하며, 항체 또는 이들의 변이체는 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 사람 MASP-2에 결합하는 분리된 사람 단클론성 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편을 제공하며, 항체는 I) a) i) SEQ ID NO: 20의 31-35개의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO: 20의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 20의 95-102개의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 b) i) SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 24의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 24의 50-56개의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 24의 89-97개의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 II) 그렇지 않으면 상기 중쇄의 상기 CDR 영역 내에 조합된 최대 총 10개의 아미노산 치환 및 상기 경쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역 내에 조합된 최대 총 10개의 아미노산 치환을 제외하고, 상기 가변 도메인과 동일한 이들의 변이체를 포함하며, 항체 또는 이들의 변이체는 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 사람 MASP-2에 결합하는 분리된 단클론성 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편을 제공하며, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 21에 설명된 아미노산 서열 중 어느 하나라도 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 사람 MASP-2에 결합하는 분리된 단클론성 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편을 제공하며, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 27에 설명된 아미노산 중 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-MASP-2 항체, 또는 이들의 단편의 아미노산을 암호화하는 핵산 분자, 예를 들어, 표 2에 설명된 것들을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-MASP-2 항체, 또는 이들의 단편의 아미노산을 암호화하는 핵산 분자, 예를 들어, 표 2에 설명된 것들 중 적어도 하나를 포함하는 세포를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 항-MASP-2 항체를 암호화하고 상기 항-MASP-2 항체를 분리하는 핵산 분자의 발현을 허용하는 조건 하에 본 발명의 항-MASP-2 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자 중 적어도 하나를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 분리된 MASP-2 항체를 생성하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance)에 의해 결정된 바와 같이 10 nM 이하의 KD를 갖는 사람 MASP-2와 분리하고 1% 혈청 중에 10 nM 이하의 IC50을 갖는 만난-코팅된 기질 상에서 C4 활성화를 억제하는 완전히 분리된 사람 단클론성 항체 또는 이들의 항원-결합 단편를 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 참조 항체에 의해 인식된 에피토프의 적어도 부분을 특이적으로 인식하며, 상기 언급 항체는 SEQ ID NO: 20에 설명된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 24에 설명된 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 사람 단클론성 항-MASP-2 항체 of 본 발명의 완전히 사람 단클론성 항-MASP-2 항체 및 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함하는 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 사람 대상체에서 MASp-2 의존적 보체 활성화를 억제하기 위해 충분한 양으로 본 발명의 사람 단클론성 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 사람 대상체에서 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 사람 대상체에 치료적 투여에 적합한 본 발명의 사람 단클론성 MASP-2 항체의 단위 투여량을 포함하는 제조 물품을 제공하며, 단위 투여량은 1 mg 내지 1000 mg의 범위에 있다.

본 발명의 상기 언급된 양태 및 부수적인 이점 중 다수는 첨부된 도면과 함께 취해질 때, 같은 것이 다음 상세한 설명에 대한 참고로 더 잘 이해되는 것처럼 더 쉽게 인정될 것이다.
도　1a는 사람 MASP-2의 유전적 구조를 설명하는 도면이다;
도 1b는 사람 MASP-2 단백질의 도메인 구조를 설명하는 도면이다;
도 2는 실시예 2에 설명된 바와 같이, 다양한 MASP-2 항원에 대하여 패닝된 (panned) scFcv 파지 (phage) 라이브러리로부터 선택된 다클론성 집단에서 수행된 ELISA 검정의 결과를 그래프로 설명한다;
도 3a 및 3b는 실시예 3에 의해 설명된 바와 같이, 보체 검정에서 기능적 활성에 대하여 45개의 후보 scFv 클론의 테스트 결과를 나타낸다;
도 4는 실시예 4에 설명된 바와 같이, 세 개의 혈청 (사람, 래트 및 NHP)에서 C3c 수준을 비교하기 위해 수행된 실험의 결과를 그래프로 설명한다;
도 5a는 실시예 4에 설명된 바와 같이, 각각 VH2 및 VH6 유전자 패밀리에 속하는 두 개의 별개의 그룹을 나타내는 가장 활성인 클론의 중쇄 영역 (잔기 1-120)의 아미노산 서열 정렬이다;
도 5b는 실시예 4에 설명된 바와 같이, scFv 클론 17D20, 17N16, 18L16 및 4D9의 아미노산 서열 정렬이다;
도 6은 실시예 5에 설명된 바와 같이, 90% 사람 혈장을 사용하여 C3b 침착 검정에서 IgG4 전환된 모체 클론의 조제물의 억제 활성을 그래프로 설명한다:
도 7a는 실시예 6에 설명된 바와 같이, huMASP2A상에 적정된 딸 클론에 비해 17N16 모체 클론의 ELISA 검정의 결과를 그래프로 설명한다;
도 7b는 실시예 6에 설명된 바와 같이, huMASP2A상에 적정된 딸 클론에 비해 17D20 모체 클론의 ELISA 검정의 결과를 그래프로 설명한다;
도 8은 실시예 6에 설명된 바와 같이, 경쇄 (SYE로 시작)가 두 개의 클론 사이에서 다른 17개의 아미노산 잔기를 갖는다는 것을 나타내는 모체 클론 17N16 및 17N9 딸 클론의 단백질 서열 정렬이다;
도 9는 실시예 7에 설명된 바와 같이, 17D20 모체 클론과 비교하여 돌연변이 생성으로부터 발생한 클론 #35, #59 및 #90의 서열의 CDR-H3 영역의 단백질 서열 정렬이다;
도　10a는 실시예 7에 설명된 바와 같이, 사슬 셔플링된 (shuffled)클론 17D20md21N11을 갖는 17D20 모체 클론의 CDR3 영역 및 17D20md21N11의 VL (VH35-VL21N11)과 결합된, 도 9에 나타난 돌연변이 생성 클론 #35 CDR-H3 클론의 단백질 서열 정렬이다;
도 10b는 실시예 7에 설명된 바와 같이, 17D20 모체 클론 및 딸 클론 17D20md21N11의 VL 및 VH 영역의 단백질 서열 정렬이다;
도 11a는 실시예 8에 설명된 바와 같이, 사람 항-MASP-2 단클론성 항체 모체 클론 17N16으로부터 유도된 딸 클론 이소타입 변이체 (MoAb#1-3)에 대하여 수행된 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 설명한다;
도 11b는 실시예 8에 설명된 바와 같이, 사람 항-MASP-2 단클론성 항체 모체 클론 17D20으로부터 유도된 딸 클론 이소타입 변이체 (MoAb#4-6)에 대하여 수행된 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 설명한다;
도 12a 및 12b는 실시예 8에 설명된 바와 같이, 95% 혈청에서 C3b 침착 검정에서 모체 클론 및 MoAb#1-6의 테스트를 그래프로 설명한다;
도 13은 실시예 8에 설명된 바와 같이, 95% 정상 사람 혈청에서 C4b의 억제를 그래프로 설명한다;
도 14는 실시예 8에 설명된 바와 같이, 95% 아프리카 사바나 원숭이 (African Green monkey) 혈청에서 C3b 침착의 억제를 그래프로 설명한다;
도 15는 실시예 8에 설명된 바와 같이, MoAb#2-6에 의해 미리 조립된 MBL-MASP2 복합체의 C4 절단 활성의 억제를 그래프로 설명한다;
도　16은 실시예 8에 설명된 바와 같이, C1s와 비교하여 사람 MASP2에 MpAb#6의 우선적인 결합을 그래프로 설명한다;
도 17은 실시예 10에 설명된 바와 같이, 렉틴 경로가 아프리카 사바나 원숭이에 항-사람 MoAb#OMS646의 정맥 내 투여 후 완벽히 억제되었다는 것을 그래프로 나타낸다;
도 18a는 실시예 11에 설명된 바와 같이, 대조군 마우스 및 항-쥐 MASP-2 항체 (mAbM11) 또는 항-사람 MASP-2 항체 (mAbOMS646)가 처리된 마우스에서 7.0 Gy 방사선에 노출 후 시간이 흐름에 따른 퍼센트 생존을 나타내는 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 생존 플롯이다;
도 18b는 실시예 11에 설명된 바와 같이, 대조군 마우스 및 항-쥐 MASP-2 항체 (mAbM11) 또는 항-사람 MASP-2 항체 (mAbOMS646)가 처리된 마우스에서 6.5 Gy 방사선에 노출 후 시간이 흐름에 따른 퍼센트 생존을 나타내는 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 생존 플롯이다;
도 18c는 실시예 11에 설명된 바와 같이, 대조군 마우스 및 항-사람 MASP-2 항체 (mAbOMS646)가 처리된 마우스에서 8.0 Gy 방사선에 노출 후 시간이 흐름에 따른 퍼센트 생존을 나타내는 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 생존 플롯이다;
도 19는 실시예 12에 설명된 바와 같이, 항-MASP-2 항체 OMS646에 대한 표면 플라스몬 공명 (Biacore) 분석의 결과 (초 단위의 시간에 대한 반응 단위 (결합))를 그래프로 설명하며, 고정된 OMS646이 약 1-3x10^-4S^-1의 K_off 속도 및 약 1.6-3x10⁶M^-1S^-1의 K_on 속도로 재조합 MASP-2에 결합한다는 것을 나타낸다;
도 20은 실시예 12에 설명된 바와 같이, 고정된 사람 MASP-2에 대한 항-MASP-2 항체 OMS646의 결합 친화도를 결정하기 위한 ELISA 검정의 결과를 그래프로 설명하며, OMS646은 대략 100 pM의 K_D로 고정된 재조합 사람 MASP-2에 결합한다는 것을 나타낸다;
도 21a는 실시예 12에 설명된 바와 같이, 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 만난-코팅된 표면상의 C4 활성화의 수준을 그래프로 설명하며, OMS646이 1% 사람 혈청에서 대략 0.5 nM의 IC₅₀으로 만난-코팅된 표면상의 C4 활성화를 억제한다는 것을 입증한다;
도 21b는 실시예 12에 설명된 바와 같이, 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 IgG-코팅된 표면상의 C4 활성화의 수준을 그래프로 설명하며, OMS646이 보체 성분 C4의 고전적 경로-의존적 활성화를 억제하지 않는다는 것을 나타낸다;
도 22a는 실시예 12에 설명된 바와 같이, 렉틴 경로-특이적 검정 조건 하에 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 MAC 침착의 수준을 그래프로 설명하며, OMS646이 대략 1 nM의 IC₅₀ 값으로 렉틴-매개된 MAC 침착을 억제한다는 것을 입증한다;
도 22b는 실시예 12에 설명된 바와 같이, 고전적 경로-특이적 검정 조건 하에 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 MAC 침착의 수준을 그래프로 설명하며, OMS646이 고전적 경로-매개된 MAC 침착을 억제하지 않는다는 것을 입증한다;
도 22c는 실시예 12에 설명된 바와 같이, 대체 경로-특이적 검정 조건 하에 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 MAC 침착의 수준을 그래프로 설명하며, OMS646이 대체 경로-매개된 MAC 침착을 억제하지 않는다는 것을 입증한다;
도 23a는 실시예 12에 설명된 바와 같이, 렉틴 경로-특이적 조건 하에 90% 사람 혈청의 다양한 농도에 걸쳐 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 C3 침착의 수준을 그래프로 설명하며, OMS646이 생리학적 조건 하에 C3 침착을 차단한다는 것을 입증한다;
도 23b는 실시예 12에 설명된 바와 같이, 90% 사람 혈청의 다양한 농도에 걸쳐 C4 침착 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 C4 침착의 수준을 그래프로 설명하며, OMS646이 생리학적 조건 하에 C4 침착을 차단한다는 것을 입증한다;
도 24a는 실시예 12에 설명된 바와 같이, 렉틴 경로-특이적 조건 하에 90% 게먹이 원숭이 (cynomolgus monkey) 혈청에서 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 부재 또는 존재시 C4 침착의 수준을 그래프로 설명하며, OMS646이 30 내지 50 nM의 범위의 IC₅₀ 값으로 용량-반응 방식으로 게먹이 원숭이 혈청에서 렉틴 경로 C4 침착을 억제한다는 것을 입증한다; 및
도 24b는 실시예 12에 설명된 바와 같이, 렉틴 경로-특이적 조건 하에 90% 아프리카 사바나 원숭이 혈청에서 C4 침착 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 부재 또는 존재시 C4 침착의 수준을 그래프로 설명하며, OMS646이 15 내지 30 nM의 범위의 IC₅₀ 값으로 용량-반응 방식으로 용량-반응 방식으로 아프리카 사바나 원숭이 혈청에서 렉틴 경로 C4 침착을 억제한다는 것을 입증한다.

서열 목록의 설명

SEQ ID NO: 1 사람 MASP-2 cDNA

SEQ ID NO: 2 사람 MASP-2 단백질 (선도 서열 포함)

SEQ ID NO: 3 사람 MASP-2 단백질 (성숙)

SEQ ID NO: 4 래트 MASP-2 cDNA

SEQ ID NO: 5 래트 MASP-2 단백질 (선도 서열 포함)

SEQ ID NO: 6 래트 MASP-2 단백질 (성숙)

항원 (사람 MASP-2 성숙한 단백질에 관하여)

SEQ ID NO: 7 사람 MASP-2의 CUBI 도메인 (aa 1-121)

SEQ ID NO: 8 사람 MASP-2의 CUBI/EGF 도메인 (aa 1-166)

SEQ ID NO: 9 사람 MASP-2의 CUBI/EGF/CUBII 도메인 (aa 1-277)

SEQ ID NO: 10 사람 MASP-2의 EGF 도메인 (aa 122-166)

SEQ ID NO: 11 사람 MASP-2의 CCPI/CCPII/SP 도메인 (aa 278-671)

SEQ ID NO: 12 사람 MASP-2의 CCPI/CCPII 도메인 (aa 278-429)

SEQ ID NO: 13 사람 MASP-2의 CCPI 도메인 (aa 278-347)

SEQ ID NO: 14 사람 MASP-2의 CCPII/SP 도메인 (aa348-671)

SEQ ID NO: 15 사람 MASP-2의 CCPII 도메인 (aa 348-429)

SEQ ID NO: 16 사람 MASP-2의 SP 도메인 (aa 429-671)

SEQ ID NO: 17: 세린-프로테아제 불활성화된 돌연변이 (돌연변이된 Ser 618을 갖는 aa 610-625)

항-MASP-2 단클론성 항체 VH 사슬

SEQ ID NO: 18 17D20mc 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩티드

SEQ ID NO: 19 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 중쇄 가변 영역 (VH)을 암호화하는 DNA (신호 펩티드 없음)

SEQ ID NO: 20 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩티드

SEQ ID NO: 21 17N16mc 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩티드

항-MASP-2 단클론성 항체 VL 사슬

SEQ ID NO: 22 17D20mc 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩티드

SEQ ID NO: 23 17D20_dc21N11VL (OMS644) 경쇄 가변 영역 (VL)을 암호화하는 DNA (신호 펩티드 없음)

SEQ ID NO: 24 17D20_dc21N11VL (OMS644) 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩티드

SEQ ID NO: 25 17N16mc 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩티드

SEQ ID NO: 26 17N16_dc17N9 (OMS641) 경쇄 가변 영역 (VL)을 암호화하는 DNA (신호 펩티드 없음)

SEQ ID NO: 27 17N16_dc17N9 (OMS641) 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩티드

항-MASP-2 단클론성 항체 중쇄 CDR

SEQ ID NO: 28-31 CDR-H1

SEQ ID NO: 32-35 CDR-H2

SEQ ID NO: 36-40 CDR-H3

항-MASP-2 단클론성 항체 경쇄 CDR

SEQ ID NO: 41-45 CDR-L1

SEQ ID NO: 46-50 CDR-L2

SEQ ID NO: 51-54 CDR-L3

MASP-2 항체 서열

SEQ ID NO: 55: scFv 모체 클론 17D20 전체 길이 폴리펩티드

SEQ ID NO: 56: scFv 모체 클론 18L16 전체 길이 폴리펩티드

SEQ ID NO: 57: scFv 모체 클론 4D9 전체 길이 폴리펩티드

SEQ ID NO: 58: scFv 모체 클론 17L20 전체 길이 폴리펩티드

SEQ ID NO: 59: scFv 모체 클론 17N16 전체 길이 폴리펩티드

SEQ ID NO: 60: scFv 모체 클론 3F22 전체 길이 폴리펩티드

SEQ ID NO: 61: scFv 모체 클론 9P13 전체 길이 폴리펩티드

SEQ ID NO: 62: 야생형 IgG4 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA

SEQ ID NO: 63: 야생형 IgG4 중쇄 불변 영역 폴리펩티드

SEQ ID NO: 64 돌연변이 S228P를 갖는 IgG4 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA

SEQ ID NO: 65: 돌연변이 S228P 폴리펩티드를 갖는 IgG4 중쇄 불변 영역

SEQ ID NO: 66: scFv 딸 클론 17N16m_d17N9 전체 길이 폴리펩티드

SEQ ID NO: 67: scFv 딸 클론 17D20m_d21N11 전체 길이 폴리펩티드

SEQ ID NO: 68: scFv 딸 클론 17D20m_d3521N11 전체 길이 폴리펩티드

SEQ ID NO: 69: 야생형 IgG2 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA

SEQ ID NO: 70: 야생형 IgG2 중쇄 불변 영역 폴리펩티드

SEQ ID NO: 71: 17N16m_d17N9 경쇄 유전자 서열 (nt 1-57에 의해 암호화된 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 72: 17N16m_d17N9 경쇄 단백질 서열 (aa 1-19 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 73: 17N16m_d17N9 IgG2 중쇄 유전자 서열 (nt 1-57에 의해 암호화된 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 74: 17N16m_d17N9 IgG2 중쇄 단백질 서열 (aa 1-19 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 75: 17N16m_d17N9 IgG4 중쇄 유전자 서열 (nt 1-57에 의해 암호화된 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 76: 17N16m_d17N9 IgG4 중쇄 단백질 서열 (aa 1-19 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 77: 17N16m_d17N9 IgG4 돌연변이된 중쇄 유전자 서열 (nt 1-57에 의해 암호화된 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 78: 17N17m_d17N9 IgG4 돌연변이된 중쇄 단백질 서열 (aa 1-19 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 79: 17D20_3521N11 경쇄 유전자 서열 (nt 1-57에 의해 암호화된 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 80: 17D20_3521N11 경쇄 단백질 서열 (aa 1-19 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 81: 17D20_3521N11 IgG2 중쇄 유전자 서열 (nt 1-57에 의해 암호화된 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 82: 17D20_3521N11 IgG2 중쇄 단백질 서열 (aa 1-19 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 83: 17D20_3521N11 IgG4 중쇄 유전자 서열 (nt 1-57에 의해 암호화된 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 84: 17D20_3521N11 IgG4 중쇄 단백질 서열 (aa 1-19 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 85: 17D20_3521N11 IgG4 돌연변이된 중쇄 유전자 서열 (nt 1-57에 의해 암호화된 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 86: 17D20_3521N11 IgG4 돌연변이된 중쇄 단백질 서열 (aa 1-19 신호 펩티드를 가짐)

SEQ ID NO: 87: 전체 길이 폴리펩티드를 암호화하는 scFv 딸 클론 17N16m_d17N9 DNA (신호 펩티드 없음)

SEQ ID NO: 88: 전체 길이 폴리펩티드를 암호화하는 scFv 딸 클론 17D20m_d21N11 DNA (신호 펩티드 없음)

SEQ ID NO: 89: 전체 길이 폴리펩티드를 암호화하는 scFv 딸 클론 17D20m_d3521N11 DNA (신호 펩티드 없음)

SEQ ID NO: 90: 17D20m 및 d3521N11의 공통 중쇄 CDR-H3

SEQ ID NO: 91: 17D20m 및 d3521N11의 공통 경쇄 CDR-L1

SEQ ID NO: 92: 17N16m 및 d17N9의 공통 경쇄 CDR-L1

SEQ ID NO: 93: 17D20m, d3521N11, 17N16m 및 d17N9의 공통 경쇄 CDR-L2

SEQ ID NO: 94: 17N16m 및 d17N9의 공통 경쇄 CDR-L3

상세한 설명

본 발명은 사람 MASP-2에 결합하고 면역 시스템의 고전적 (C1q-의존적) 경로 성분을 온전하게 두면서 렉틴-매개된 보체 활성화를 억제하는 완전한 사람 항체를 제공한다. 사람 항-MASP-2 항체는 실시예 2-9에 설명된 바와 같이, 파지 디스플레이 라이브러리 (phage display library)에 의해 확인되었다. 실시예 10-12에 설명된 바와 같이, 높은 친화도 항-MASP-2 항체는 시험관 내 검정 및 생체 내 둘 다에서 입증된 바와 같이, 렉틴-매개된 보체 활성화를 억제하는 능력으로 확인되었다. 항체의 가변 경쇄 및 중쇄 단편은 scFv 포맷 및 전체 길이 IgG 포맷 둘 다에서 분리되었다. 사람 항-MASP-2 항체는 면역 시스템의 고전적 (C1q-의존적) 경로 성분을 온전하게 두면서 렉틴-매개된 보체 경로 활성화와 관련된 세포 손상을 억제하는데 유용하다.

I. 정의

여기에서 달리 정의되지 않으면, 여기에 사용된 모든 용어는 본 발명의 당업자에 의해 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 다음 정의는 본 발명을 설명하기 위해 명세서 및 청구범위에 사용된 용어에 관한 명확성을 제공하기 위해 제공된다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-2 의존적 보체 활성화"는 렉틴 경로의 MASP-2 의존적 활성화를 포함하며, 이것은 렉틴 경로 C3 콘버타제 C4b2a의 형성으로 이어지는 생리학적 조건 하에 (즉, Ca⁺⁺의 존재시) 및 이후에 C5 콘버타제 C4b2a(C3b)n의 형성으로 이어지는 C3 절단 생성물 C3b의 축적시 발생한다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "대체 경로"는, 예를 들어, 균류 및 효모 세포벽의 치모산, 그람 음성 외벽, 및 토끼 적혈구, 뿐만 아니라 많은 순수한 다당류, 토끼 적혈구, 바이러스, 박테리아, 동물 종양 세포, 기생충 및 손상된 세포의 지질다당류 (LPS)에 의해 촉발되고 전통적으로 보체 인자 C3로부터 C3b의 자발적 단백질 가수 분해 생성으로부터 발생하는 것으로 생각되는 보체 활성화를 나타낸다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "렉틴 경로"는 만난- 결합 렉틴 (MBL), CL-11 및 피콜린 (H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)을 포함하는 혈청 및 비-혈청 탄수화물-결합 단백질의 특이적 결합을 통해 발생하는 보체 활성화를 나타낸다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "고전적 경로"는 외부 입자에 결합된 항체에 의해 촉발되고 인식 분자 C1q의 결합을 필요로 하는 보체 활성화를 나타낸다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-2 억제 항체"는 MASP-2에 결합하거나 이와 직접적으로 상호작용하고 MASP-2 의존적 보체 활성화를 효과적으로 억제하는 어떤 항-MASP-2 항체, 또는 이들의 MASP-2 결합 단편도 나타낸다. 본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제 항체는 MASP-2 의존적 보체 활성화를 20% 이상, 예를 들어, 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상 감소시킬 수도 있다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-2 차단 항체"는 MASP-2 의존적 보체 활성화를 90% 이상, 예를 들어, 95% 이상, 또는 98% 이상 감소시키는 MASP-2 억제 항체를 나타낸다 (즉, 단지 10%, 예를 들어, 단지 9%, 또는 단지 8%, 또는 단지 7%, 또는 단지 6%, 예를 들어, 단지 5% 이하, 또는 단지 4%, 또는 단지 4%, 또는 단지 3% 또는 단지 2% 또는 단지 1%의 MASP-2 보체 활성화를 일으킨다).

용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 여기에 교체 가능하게 사용된다. 이들 용어는 업계에서 잘 이해되고, 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된 단백질을 나타낸다. 항체의 한 형태는 항체의 염기성 구조 단위를 구성한다. 이것은 테트라머이고 항체 사슬의 두 개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 갖는다. 각 쌍에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 함께 항원에 결합의 원인이 되고, 불변 영역은 항체 효과기 기능에 원인이 된다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 항체 및 이들의 항체 단편을 포함하며, 어떤 항체-생성 포유동물 (예를 드렁, 마우스, 래트, 토끼, 및 사람을 포함하는 영장류), 또는 히브리도마 (hybridoma), 파지 선택, 재조합 발현 또는 형질전환 동물 (또는 항체 또는 항체 단편을 생성하는 다른 방법)로부터 유도되고, MASP-2 폴리펩티드 또는 이들의 일부에 특이적으로 결합한다. 용어 "항체"는 항체의 근원 또는 그것이 만들어진 방식 (예를 들어, 히브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 형질전환 동물, 펩티드 합성, 등에 의해)에 관하여 제한되는 것은 아니다. 전형적인 항체는 다클론성, 단클론성 및 재조합 항체; 다중 특이적 항체 (예를 들어, 이중 특이적 항체); 사람화된 항체; 쥐 항체; 키메라, 마우스-사람, 마우스-영장류, 영장류-사람 단클론성 항체; 및 항-유전자형 항체를 포함하고, 이들의 어떤 온전한 분자 또는 단편도 될 수 있다. 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 다클론성 또는 단클론성 항체, 뿐만 아니라 이들의 단편 (예를 들어, dAb, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 이들의 합성 변이체, 자연 발생 변이체, 필수적인 특이성의 항원-결합 단편을 갖는 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 사람화된 항체, 키메라 항체, 및 필수적인 특이성의 항원-결합 부위 또는 단편 (에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역 글로불린 분자의 어떤 다른 변형된 구조도 포함한다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "항원-결합 단편"은 사람 MASP-2에 결합하는 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄의 적어도 하나의 CDR을 함유하는 폴리펩티드 단편을 나타낸다. 이점에서, 여기에 설명된 항체의 항원-결합 단편은 MASP-2에 결합하는 항체의, 여기에 설명된 VH 및 VL 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 모두 6개의 CDR을 포함할 수도 있다. 여기에 설명된 MASP-2-특이적 항체의 항원-결합 단편은 MASP-2에 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 항원-결합 단편 또는 항원-결합 단편을 포함하는 항체는 MASP-2 의존적 보체 활성화의 억제를 매개한다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "항-MASP-2 단클론성 항체"는 동질한 항체 집단을 나타내며, 단클론성 항체는 MASP-2상에서 에피토프의 결합을 선택하는데 있어서 수반되는 아미노산으로 구성된다. 항-MASP-2 단클론성 항체는 MASP-2 표적 항원에 매우 특이적이다. 용어 "단클론성 항체"는 온전한 단클론성 항체 및 전체 길이 단클론성 항체, 뿐만 아니라 이들의 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 이들의 변이체, 항원-결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 사람화된 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체, 및 필수적인 특이성의 항원-결합 단편 (에피토프 인식 부위) 및 에피토프에 결합하는 능력을 포함하는 면역글로불린 분자의 어떤 다른 변형된 구조도 포함한다.

여기에 사용된 바와 같이, 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 동질한 집단으로부터 얻어지는 것으로서 항체의 특징을 나타내고, 항체의 근원 또는 그것이 만들어진 방식 (예를 들어, 히브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 형질전환 동물, 등에 의해)에 관하여 제한되지 않는다. 용어는 "항체"의 정의 하에 상기 설명된 전체 면역글로불린, 뿐만 아니라 단편 등을 포함한다. 단클론성 항체는 배양시 지속적 세포주에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는 어떤 기술, 예를 들어, Kohler, G., et　al., Nature　256:495, 1975에 설명된 히브리도마 방법을 사용하여 얻어질 수 있거나 그것들은 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수도 있다 (예를 들어, Cabilly에 대한 미국 특허 번호 4,816,567을 참고하면 된다). 단클론성 항체는 또한 Clackson, T., et　al., Nature　352:624-628, 1991, 및 Marks, J.D., et　al., J. Mol . Biol .　222:581-597, 1991에 설명된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수도 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이들의 어떤 하위 등급도 포함하는 어떤 면역글로불린 등급 중 하나일 수 있다.

인식된 면역글로불린 폴리펩티드는 카파 및 람다 경쇄 및 알파, 감마 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 (epsilon) 및 뮤 (mu) 중쇄 또는 다른 종의 동등물을 포함한다. 전체 길이 면역글로불린 "경쇄" (약 25 kDa 또는 약 214개의 아미노산의)는 NH₂-말단에서 약 110개의 아미노산의 가변 영역 및 COOH-말단에서 카파 또는 람다 불변 영역을 포함한다. 전체 길이 면역글로불린 "중쇄" (약 50 kDa 또는 약 446개의 아미노산의)는 유사하게 가변 영역 (약 116개의 아미노산의) 및 상기 언급된 중쇄 불변 영역 중 하나, 예를 들어, 감마 (약 330개의 아미노산의)를 포함한다.

염기성 4-사슬 항체 단위는 두 개의 동일한 경쇄 (L) 및 두 개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 헤테로테트라머 당단백질이다. IgM 항체는 J 사슬로 불리는 추가적인 폴리펩티드와 함께 염기성 헤테로테트라머 단위 중 5개로 구성되고, 그러므로 10개의 항원 결합 부위를 함유한다. 분비된 IgA 항체는 폴리머화하여 J 사슬과 함께 염기성 4-사슬 단위 중 2-5개를 포함하는 다가 집합체 (assemblage)를 형성할 수 있다. 각각의 L 사슬은 한 공유 이황화 결합에 의해 H 사슬에 결합되는 한편, 두 개의 H 사슬은 H 사슬 이소타입에 의존적으로 하나 이상의 이황화 결합으로 하나 이상에 의해 서로 결합된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적인 간격의 사슬 내 이황화 결합을 갖는다. VH 및 VL의 짝 이루기는 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다.

각각의 H 사슬은 N-말단에서, 가변 도메인 (VH)에 이어서, α 및 γ 사슬 각각에 대하여 세 개의 불변 도메인 (CH), 및 μ 및 ε 이소타입에 대하여 네 개의 CH 도메인 (CH)을 갖는다.

각각의 L 사슬은 N-말단에서, 가변 도메인 (VL)에 이어서, 그것의 다른 끝에서 불변 도메인 (CL)을 갖는다. VL은 VH와 함께 정렬되고 CL은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (CH1)과 함RP 정렬된다. 어떤 척추동물 종의 L 사슬도 그것들의 불변 도메인 (CL)의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 두 개의 명백하게 별개의 타입 중 하나에 할당될 수 있다.

그것들의 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 의존적으로, 면역글로불린은 다른 등급 또는 이소타입에 할당될 수 있다. 면역글로불린의 다섯 개의 등급이 있다: 각각 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 및 뮤 (μ)로 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. γ 및 α 등급은 CH 서열 및 가능의 사소한 차이에 기초하여 하위 등급으로 더 나누어지고, 예를 들어, 사람은 다음 하위 등급을 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.

다른 등급의 항체의 구조 및 성질에 대하여, 예를 들어, Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds); Appleton and Lange, Norwalk, Conn., 1994, 페이지 71 및 제 6장을 참고하면 된다.

용어 "가변"은 V 도메인의 특정 세그먼트가 항체 사이의 서열이 광범위하게 다르다는 사실을 나타낸다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고 그것의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 하지만, 가변성은 가변 도메인의 110개의 아미노산 범위에 걸쳐 골고루 분배되지 않는다. 오히려, V 영역은 각각 9-12개의 아미노산 길이인 "초가변 영역"으로 불리는 극도의 가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리된 15-30개의 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)로 불리는 상대적으로 불변 스트레치 (stretch)로 구성된다. 본래의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 네 개의 FR을 포함하며, 세 개의 초 가변 영역에 의해 연결된 베타-시트 구조를 주로 사용하며, 이것은 n-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에 이의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 사슬에서 초가변 영역은 FR에서 가까운 거리에 유지되고, 다른 사슬의 초가변 영역과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat, et　al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)을 참고하면 된다). 불변 도메인은 항원에 항체를 결합하는데 있어서 직접 수반되지는 않지만, 항체 의존적 세포 독성 (ADCC)에 항체의 참여와 같은, 다양한 효과기 기능을 나타낸다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역"은 항원 결합의 원인이 되는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" (즉, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)에 설명된 바와 같이 카바트 번호 붙이기 (Kabat numbering) 시스템에 따라 번호를 붙일 때, 경쇄 가변 도메인에서 대략 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인에서 대략 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3))의 아미노산 잔기; 및/또는 "초가변 루프" (즉, Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)에 설명된 바와 같이, 초티아 번호 붙이기 (chothia numbering) 시스템에 따라 번호를 붙일 때, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인에서 26-32 (H1), 52-56 (H2) 및 95-101 (H3))의 그들의 잔기; 및/또는 "초가변 루프"/CDR (예를 들어, Lefranc, J.P., et　al., Nucleic Acids Res 27:209-212; Ruiz, M., et al., Nucleic Acids Res 28:219-221 (2000)에 설명된 바와 같이 IMGT 번호 붙이기 시스템에 따라 번호를 붙일 때, VL에서 잔기 27-38 (L1), 56-65 (L2) 및 105-120 (L3), 및 VH에서 27-38 (H1), 56-65 (H2), 및 105-120 (H3))의 그들의 잔기를 포함한다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 전체 길이 항-MASP-2 항체로부터 유도되거나 이와 관련된 부분을 나타내며, 일반적으로 이들의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 구체적인 예는 Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂ 및 Fv 단편, scFv 단편, 이중체, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자, 항체 단편에 의해 형성된 이중 특이적 및 다중 특이적 항체를 포함한다.

이중 특이적 항체가 사용될 경우에, 이들은 통상적인 이중 특이적 항체일 수도 있으며, 이것은 다양한 방법으로 제조될 수 있고 (Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), 예를 들어, 화학적으로 또는 잡종 히브리도마로부터 제조되거나, 상기 언급된 이중 특이적 항체 단편 중 어떤 것도 될 수 있다.

여기에 사용된 바와 같이, "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 V_H 및 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 결합자를 추가로 포함하며, 이것은 scFv가 항원 결합을 위해 바람직한 구조를 형성할 수 있게 한다. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.　113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.　269-315 (1994)를 참고하면 된다. "Fv"는 완벽한 항원-인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 단단한, 비-공유 결합에서 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 다이머로 구성된다. 항원 결합을 위해 아미노산 잔기를 기부하고 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여하는 여섯 개의 초가변 루프 (H 및 L 사슬로부터 각각 세 개의 루프)가 이들 두 개의 도메인의 폴딩 (folding)으로부터 발산된다. 하지만, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 세 개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도에도 불구하고 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 가진다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 바람직하게 다른 분해물질의 동질의 혼합물에 존재하는 특정 분해물질에 결합하는 항체의 능력을 나타낸다. 특정 구체예에서, 특이적 결합 상호작용은 샘플의 원하는 분해물질 및 원하지 않는 분해물질 사이에서, 일부 구체예에서는, 약 10 내지 100배 이상보다 더 많은 (예를 들어, 약 1000배 또는 10,000배보다 더 많은) 차이가 있을 것이다. 특정 구체예에서, 유기 포획제 (capture agent) 및 분해물질 사이의 친화도는 그것들이 유기 포획제/분해물질 복합체에 특이적으로 결합될 때 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만, 또는 약 25 nM 미만, 또는 약 10 nM 미만, 또는 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 K_D(해리 상수)를 특징으로 한다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체" 항-MASP-2 항체는 모체 항체 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 추가, 삭제, 및/또는 치환의 장점에 의해 "모체" 또는 참조 항체 아미노산 서열의 아미노산 서열과 다른 분자를 나타낸다. 한 구체예에서, 변이체 항-MASP-2 항체는 중쇄 가변 영역의 CDR 영역 내에서 조합된 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환, 및/또는 경쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역과 조합된 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환을 제외하고, 모체 가변 도메인과 동일한 가변 영역을 함유하는 분자를 나타낸다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 보존적 서열 변형이다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "모체 항체"는 변이체의 제조에 사용된 아미노산에 의해 암호화된 항체를 나타낸다. 바람직하게, 모체 항체는 사람 프레임워크 영역을 갖고, 존재하면, 사람 항체 불변 영역(들)을 갖는다. 예를 들어, 모체 항체는 사람화된 또는 완전히 사람 항체일 수도 있다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "분리된 항체"는 그것의 자연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리된 및/또는 회수된 항체를 나타낸다. 그것의 자연 환경의 오염물질 성분은 항체에 대한 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 항체는 (1) 로리 (Lowry) 방법에 의해 결정된 항체의 95 중량%, 가장 바람직하게 99 중량% 이상으로; (2) 회전 컵 배열 결정 장치 (spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열 중 적어도 15개의 잔기를 얻기 위해 충분한 정도로; 또는 (3) 쿠마시 블루 (coomassie blue) 또는, 바람직하게 은염색법 (silver stain)을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의한 동질성으로 정제될 것이다. 분리된 항체는 항체의 자연의 환경 중 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내 제자리에서 항체를 포함한다. 하지만, 보통, 분리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 단클론성 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 일부를 나타낸다. 에피토프 결정요인은 보통 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자를 그룹화하는 화학적 활성 표면으로 구성되고 보통 특정 3차원 구조적 특성, 뿐만 아니라 특정 전하적 특성을 갖는다. 더 특이적으로, 용어 "MASP-2 에피토프"는 여기에 사용된 바와 같이, 업계에 잘 알려진 어떤 방법에 의해, 예를 들어, 면역검정에 의해, 결정된 바와 같이 항체가 면역특이적으로 결합하는 해당 폴리펩티드의 일부를 나타낸다. 항원성 에피토프는 반드시 면역성일 필요는 없다. 이러한 에피토프는 자연에서 선형일 수 있거나 불연속 에피토프일 수 있다. 따라서, 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "형태적 에피토프"는 파괴되지 않은 일련의 아미노산 이외의 항원의 아미노산 사이의 공간적 관계에 의해 형성된 불연속 에피토프를 나타낸다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "만난-결합 렉틴" ("MBL")은 만난-결합 단백질 ("MBP")와 동등하다.

여기에 사용된 바와 같이, "막 공격 복합체 (membrane attack complex)" ("MAC")는 막에 삽입되거나 이를 붕괴하는 다섯 개의 말단 보체 성분 (C5-C9)의 복합체를 나타낸다. 또한 C5b-9로도 나타난다

여기에 사용된 바와 같이, "대상체"는 사람, 비-사람 영장류, 개, 고양이, 말, 양, 염소, 소, 토끼, 돼지 및 설치류를 포함하지만 제한이 없는 모든 포유동물을 나타낸다.

여기에 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기는 다음과 같이 축약된다: 알라닌 (Ala;A), 아스파라긴 (Asn;N), 아스파르트산 (Asp;D), 아르기닌 (Arg;R), 시스테인 (Cys;C), 글루탐산 (Glu;E), 글루타민 (Gln;Q), 글리신 (Gly;G), 히스티딘 (His;H), 이소류신 (Ile;I), 류신 (Leu;L), 리신 (Lys;K), 메티오닌 (Met;M), 페닐알라닌 (Phe;F), 프롤린 (Pro;P), 세린 (Ser;S), 트레오닌 (Thr;T), 트립토판 (Trp;W), 티로신 (Tyr;Y), 및 발린 (Val;V).

가장 넓은 의미에서, 자연 발생한 아미노산은 각각의 아미노산의 측쇄의 화학적 성질에 기초하여 그룹으로 나누어질 수 있다. "소수성" 아미노산은 Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys 또는 Pro를 의미한다. "친수성" 아미노산은 Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His를 의미한다. 아미노산의 이 그룹은 다음과 같이 추가로 하위 등급으로 분류될 수 있다. "비전하 친수성" 아미노산은 Ser, Thr, Asn 또는 Gln을 의미한다. "산성" 아미노산은 Glu 또는 Asp를 의미한다. "염기성" 아미노산은ㅇ Lys, Arg 또는 His를 의미한다.

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 아미노산 치환"은 각각의 다음 그룹 내 아미노산 사이에서 치환으로 설명된다: (1)　글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신, (2)　페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판, (3)　세린 및 트레오닌, (4)　아스파르테이트 및 글루타메이트, (5)　글루타민 및 아스파라긴, 및 (6)　리신, 아르기닌 및 히스티딘.

여기에 사용된 바와 같이, "분리된 핵산 분자"는 유기체의 게놈 DNA에 포함되지 않는 핵산 분자 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)이다. 예를 들어, 세포의 게놈 DNA로부터 분리된 성장 인자를 암호화하는 DNA 분자는 분리된 DNA 분자이다. 분리된 핵산 분자의 또 다른 예는 유기체의 게놈에 포함되지 않는 화학적으로 합성된 핵산 분자이다. 특정 종으로부터 분리된 핵산 분자는 상기 종의 염색체의 완벽한 DNA 분자보다 더 작다.

여기에 사용된 바와 같이, "핵산 분자 구조"는 자연에 존재하지 않는 배열에서 결합되고 병치된 핵산의 세그먼트를 함유하는 사람 간섭을 통해 변형된, 단일- 또는 이중-가닥 핵산 분자이다.

여기에 사용된 바와 같이, "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 암호화하는 핵산 분자이다. 전형적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터, 유전자, 및 전사 종결자를 포함한다. 유전자 발현은 보통 프로모터의 조절 하에 배치되고, 이러한 유전자는 프로모터에 "작동 가능하게 결합된" 것으로 나타난다. 유사하게는, 조절 요소 및 코어 프로모터는 조절 요소가 코어 프로모터의 활성을 조절하는 경우 작동 가능하게 결합된다.

여기에 사용된 바와 같이, 숫자에 대한 참조로 용어 "대략" 또는 "약"은 일반적으로 달리 진술되지 않거나 그렇지 않으면 문맥으로부터 명시되지 않으면 숫자의 어떤 방향의 5%의 범위 (이상 또는 이하)에 들어가는 숫자를 포함하도록 취해진다 (이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외). 범위가 진술된 경우, 종료점은 달리 진술되지 않거나 그렇지 않으면 문맥으로부터 명시되지 않으면 범위 내에 포함된다.

여기에 사용된 바와 같이, 단수형 "하나의", "하나의" 및 "그"는 문맥이 달리 명백하게 지시되지 않으면 복수의 양태를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 세포"에 대한 참조는 단일 세포, 뿐만 아니라 둘 이상의 세포도 포함한다; "하나의 약제"에 대한 참조는 하나의 약제, 뿐만 아니라 둘 이상의 약제도 포함한다; "하나의 항체"에 대한 참조는 복수의 이러한 항체를 포함하고 "하나의 프레임워크 영역"에 대한 참조는 하나 이상의 프레임워크 영역 및 당업자에게 알려진 이들의 동등물, 등에 대한 참조를 포함한다.

이 명세서에서 각 구체예는 달리 명확히 진술되지 않으면 모든 다른 구체예에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용될 것이다.

표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환 (예를 들어, 전기 천공, 리포펙타민)에 사용될 수도 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조사의 지시에 따라 또는 업계에서 보통 달성되는 바와 가팅 또는 여기에 설명된 바와 같이 수행될 수도 있다. 이들 및 관련된 기술 및 과정은 일반적으로 업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 및 본 명세서를 통해 인용되거나 논의된 다양한 일반적 및 더 특이적 참조에 설명된 바와 같이 수행될 수도 있다. 예를 들어, Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Current Protocols in Immunology (Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); 또는 다른 적절한 현재 프로토콜 간행물 및 다른 유사한 참고문헌을 참고하면 된다. 특이적 정의가 제공되지 않으면, 여기에 설명된 분자 생물학, 분석화학, 합성 유기 화학, 및 의학적 및 약학적 화학 반응에 관하여 이용된 명명법, 및 이들의 실험 과정 및 기술은 업계에 잘 알려져 있고 보통 사용되는 것들이다. 표준 기술은 재조합 기술, 분자 생물학, 미생물학, 화학적 합성, 화학적 분석, 약학적 조제물, 조제, 및 전달, 및 환자의 치료에 사용될 수도 있다.

이 명세서에서 논의된 어떤 구체예도 본 발명의 어떤 방법, 키트, 시약, 또는 조성물, 및 그 반대에 관하여 시행될 수 있다고 생각된다. 게다가, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법을 달성하기 위해 사용될 수 있다.

II. 개요

렉틴 (MBL, M-피콜린, H-피콜린, L-피콜린 및 CL-11)은 선천적 보체 시스템응ㄹ 촉발하는 특이적 인식 분자이고 시스템은 렉틴 시작 경로 및 말단 보체 효과기 분자의 렉틴-시작된 활성화를 증폭하는 관련된 말단 경로 증폭 루프를 포함한다. C1q는 후천적 보체 시스템을 촉발하는 특이적 인식 분자이고 시스템은 고전적 시작 경로 및 말단 보체 효과기 분자의 C1q-시작된 활성화를 증폭하는 관련 말단 경로 증폭 루프를 포함한다. 우리는 이들 두 개의 주요 보체 활성화 시스템을 각각 렉틴-의존적 보체 시스템 및 C1q-의존적 보체 시스템으로 나타낸다.

면역 방어시 그것의 필수적인 역할 이외에, 보체 시스템은 많은 임상적 질병에서 조직 손상에 기여한다. 따라서, 이들 부작용을 방지하기 위해 치료적으로 효과적인 보체 억제제를 개발하는 것이 긴급하게 필요하다.

미국 특허 번호 7,919,094, 동시 계속 미국 특허 출원 일련 번호 12/905,972 (US 2011/0091450로서 공개됨), 및 동시계속 미국 특허 출원 일련 번호 13/083,441 (US2011/0311549로서 공개됨)에 설명된 바와 같이, 이것들 각각은 Omeros Corporation, 본 출원의 양수인에게 할당되고, 이것들 각각은 본원에 참고로 포함되며, MASP-2 -/- 마우스 모델의 사용을 통해 고전적 경로를 온전하게 두면서 렉틴 매개된 MASP-2 경로를 억제하는 것이 가능하다는 것이 결정되었다. 고전적 경로를 온전하게 두면서 렉틴 매개된 MASP-2 경로를 억제하는 것이 가능한 인식과 함께 보체의 면역 방어 능력을 완벽히 폐쇄하지 않고 특정 병리학을 유발하는 보체 활성화 시스템만을 특이적으로 억제하는 것이 매우 바람직할 것이라는 것이 실현될 것이다. 예를 들어, 보체 활성화가 렉틴-의존적 보체 시스템에 의해 대부분 매개되는 질환 상태에서, 이 시스템만을 특이적으로 억제하는 것이 이로울 것이다. 이것은 면역 복합체 가공을 조작하고 감염에 대한 숙주 방어를 지원하는 C1q-의존적 보체 활성화 시스템을 프로퍼딘 유지할 것이다.

렉틴-의존적 보체 시스템을 특이적으로 억제하는 치료제의 개발시 표적화하는 바람직한 단백질 성분은 MASP-2이다. 렉틴-의존적 보체 시스템의 모든 알려진 단백질 성분 (MBL, H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린, MASP-2, C2-C9, 인자 B, 인자 D, 및 프로퍼딘) 중에, MASP-2만이 렉틴-의존적 보체 시스템에서 고유하고 작동할 시스템이 필요하다. 렉틴 (MBL, H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린 및 CL-11)은 또한 렉틴-의존적 보체 시스템의 고유의 성분이다. 하지만, 렉틴 성분 중 어느 하나의 손실이 반드시 렉틴 반복으로 인한 시스템의 활성화를 반드시 억제하지 않는다. 렉틴-의존적 보체 활성화의 억제를 보장하기 위해 모두 다섯 개의 렉틴을 억제하는 것이 필요하다. 게다가, MBL 및 피콜린은 또한 보체 독립적인 옵소닌 활성을 갖는 것으로 알려져 이씩 때문에, 렉틴 기능의 억제는 감염에 대한 이 유익한 숙주 방어 메카니즘의 손실을 일으킬 것이다. 반대로, 이 보체-독립적 렉틴 옵소닌 활성은 MASP-2가 억제 표적인 경우 온전하게 유지될 것이다. 렉틴-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하는 치료적 표적으로서 MASP-2의 추가적 이득은 MASP-2의 혈장 농도가 보체 단백질 중 가장 낮다는 것이다 (500　ng/ml); 그러므로, 상대적으로 낮은 농도의 MASP-2 고-친화도 억제제가 여기에서 실시예에 의해 입증된 바와 같이, 완전한 억제를 얻는데 충분하다.

상기 언급된 것에 따라, 여기에 설명된 바와 같이, 본 발명은 높은 친화도로 사람 MASP-2에 결합하고 렉틴-매개된 보체 경로 활성화를 억제할 수 있는 단클론성 완전한 사람 항-MASP-2 항체를 제공한다.

III. MASP-2 억제 항체

한 양태에서, 본 발명은 사람 MASP-2에 특이적으로 결합하고 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하거나 차단하는 단클론성 완전한 사람 항-MASP-2 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편을 제공한다. MASP-2 억제 항체는 MASP-2의 생물학적 기능을 억제하거나 차단함으로써 MASP-2 의존적 보체 활성화 시스템을 효과적으로 억제하거나 효과적으로 차단할 수도 있다. 예를 들어, 억제 항체는 MASP-2 단백질-대-단백질 상호작용을 효과적으로 억제하거나 차단할 수도 있고, MASP-2 다이머화 또는 조립을 방해할 수도 있고, Ca² ⁺ 결합을 차단할 수도 있거나, MASP-2 세린 프로테아제 활성 부위를 방해할 수도 있다.

MASP-2 에피토프

본 발명은 사람 MASP-2에 특이적으로 결합하는 완전한 사람 항체를 제공한다. MASP-2 폴리펩티드는 MASP-1, MASP-3, 및 C1r 및 C1s. C1 보체 시스템의 프로테아제와 유사한 분자 구조를 나타낸다. SEQ ID NO: 1에 설명된 cDNA 분자는 MASP-2 (SEQ ID NO: 2에 설명된 아미노산 서열로 구성됨)의 대표적인 예를 암호화하고 분비 후 분열되는 선도 서열 (aa 1-15)를 갖는 사람 MASP-2 폴리펩티드를 제공하며, 사람 MASP-2 (SEQ ID NO: 3)의 성숙한 형태를 발생시킨다. 도 1a에 설명된 바와 같이, 사람 MASP　2 유전자는 열두 개의 엑손을 포함한다. 사람 MASP-2 cDNA는 엑손 B, C, D, F, G, H, I, J, K 및 L에 의해 암호화된다. SEQ ID NO: 4에 설명된 cDNA 분자는 래트 MASP-2 (SEQ ID NO: 5에 설명된 아미노산으로 구성됨)를 암호화하고 분비 후 분열되는 선도 서열을 갖는 래트 MASP-2 폴리펩티드를 제공하며, 래트 MASP-2 (SEQ ID NO: 6)의 성숙한 형태를 발생시킨다.

당업자는 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 4에 개시된 서열이 각각 사람 및 래트 MASP-2의 단일 대립 유전자를 나타내고, 대립 유전자 변이 및 대체 스플라이싱이 발생할 것으로 예상된다는 것을 인식할 것이다. SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 4에 나타난 뉴클레오티드 서열의 대립 유전자 변이체는 침묵 돌연변이를 함유하는 것들 및 이 돌연변이에서 아미노산 서열 변화를 일으키는 것들을 포함하며, 본 발명의 범위 내에 있다. MASP-2 서열의 대립 유전자 변이체는 표준 과정에 따라 다른 개개의 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 탐침함으로써 클로닝될 수 있다.

사람 MASP-2 단백질 (SEQ ID NO: 3)의 도메인은 하기 도 1B 및 표 1에 나타나고, N-말단 C1r/C1s/성게 VEGF/뼈 형태 형성 단백질 (CUBI) 도메인, 상피 성장 인자-유사 도메인, 제2 CUB 도메인 (CUBII), 뿐만 아니라 보체 대조군 단백질 도메인 CCP1 및 CCP2의 텐덤 (TANDEM), 및 세린 프로테아제 도메인을 포함한다. MASP-2 유전자의 대체 스플라이싱은 MAp19를 발생시킨다. MAp19는 네 개의 추가적 잔기 (EQSL)를 갖는 MASP-2의 N-말단 CUB1-EGF 영역을 함유하는 비효소 단백질이다.

다수의 단백질은 단백질-대-단백질 상호작용을 통해 MASP-2에 결합하거나, 이와 상호작용하는 것으로 나타났다. 예를 들어, MASP-2는 렉틴 단백질 MBL, H-피콜린 및 L-피콜린에 결합하거나, 이와 함께 Ca² ⁺ 의존적 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 각각의 MASP-2/렉틴 복합체는 단백질 C4 및 C2의 MASP-2 의존적 절단을 통해 보체를 활성화하는 것으로 나타났다 (Ikeda, K., et　al., J. Biol . Chem.　262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et　al., J. Exp . Med . 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et　al., J.　 Immunol . 168:3502-3506, 2002). 연구는 MASP-2의 CUB1-EGF 도메인이 MBL과 MASP-2의 결합에 필수적이다는 것을 나타냈다 (Thielens, N.M., et　al., J.　 Immunol . 166:5068, 2001). 또한 CUB1EGFCUBII 도메인이 MASP-2의 다이머화를 매개하며, 활성 MBL 복합체의 형성에 필요하다는 것이 나타났다 (Wallis, R., et　al., J. Biol . Chem .　275:30962-30969, 2000). 그러므로, MASP-2 억제 항체는 MASP-2 의존적 보체 활성화에 중요한 것으로 알려진 MASP-2 표적 영역에 결합하거나 이를 방해하는 것으로 확인될 수 있다.

표 1: MASP-2 폴리펩티드 도메인

한 구체예에서, 본 발명의 항-MASP-2 억제 항체는 전체 길이 사람 MASP-2 단백질 (SEQ ID NO: 3)의 일부, 예를 들어, MASP-2의 CUBI, EGF, CUBII, CCPI, CCPII, 또는 SP 도메인에 결합한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-MASP-2 억제 항체는 CCP1 도메인 (SEQ ID NO: 13 (SEQ ID NO: 3의 aa 278-347))의 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 항-MASP-2 항체 (예를 들어, OMS646)는 실시예 9에 설명된 바와 같이, CCP1 도메인을 함유하는 MASP-2 단편에만 결합하고 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하는 것으로 확인되었다.

MASP -2 억제 항체의 결합 친화도

항-MASP-2 억제 항체는 보체 시스템에서 다른 항원보다 적어도 10배 더 큰 친화도로 사람 MASP-2 (SEQ ID NO: 3으로 설명되고, SEQ ID NO: 1에 의해 암호화됨)에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 보체 시스템에서 다른 항원보다 적어도 100배 더 큰 친화도로 사람 MASP-2에 특이적으로 결합한다.

일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 약 100 nM 미만, 또는 약 50　nM 미만, 또는 약 25 nM 미만, 또는 약 10 nM 미만, 또는 약 5 nM 미만, 또는 약 1　nM 이하, 또는 0.1nM 이하의 K_D (해리 상수)로 사람 MASP-2에 특이적으로 결합한다. MASP-2 억제 항체의 결합 친화도는 여기에 실시예 3-5에 설명된 바와 같이, 업계에 알려져 있는 적합한 결합 검정, 예를 들어, ELISA 검정을 사용하여 결정될 수 있다.

MASP -2 억제 항체의 힘

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 1% 혈청에서 측정될 때 IC₅₀　=　30 nM, 바람직하게 또는 약 20　nM 미만, 또는 약 10 nM 미만, 또는 약 5 nM 미만, 또는 약 3nM 이하, 또는 약 1 nM 이하에서 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하기 위해 충분히 강하다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 90% 혈청에서 측정될 때 IC₅₀　=　30 nM, 바람직하게 또는 약 20　nM 미만, 또는 약 10 nM 미만, 또는 약 5 nM 미만, 또는 약 3nM 이하, 또는 약 1 nM 이하에서 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하기 위해 충분히 강하다.

MASP-2 의존적 보체 활성화의 억제는 MASP-2 억제 항체의 투여의 결과로서 발생하는 보체 시스템의 성분의 다음 변화 중 적어도 하나를 특징으로 한다: MASP-2 의존적 보체 활성화 시스템 생성물 C4a, C3a, C5a 및/또는 C5b-9 (MAC) (예를 들어, 미국 특허 번호 7,919,094의 실시예 2에 설명된 바와 같이 측정됨), 뿐만 아니라 그것들의 이화작용 분해 생성물 (예를 들어, C3desArg)의 발생 또는 생성의 억제, C4 절단 및 C4b 침착 (예를 들어, 실시예 5에 설명된 바와 같이 측정됨) 및 그것의 이후의 이화작용 분해 생성물 (예를 들어, C4bc 또는 C4d)의 감소 또는 C3 절단 및 C3b 침착 (예를 들어, 실시예 5에 설명된 바와 같이 측정됨), 또는 그것의 이후의 이화작용 분해 생성물 (예를 들어, C3bc, C3d, 등)의 감소.

일부 구체예에서, 본 발명의 MASP-2 억제 항체가 대조근 C3 침착의 80% 미만, 예를 들어, 70% 미만, 예를 들어, 60% 미만, 예를 들어, 50% 미만, 예를 들어, 40% 미만, 예를 들어, 30% 미만, 예를 들어, 20% 미만, 예를 들어, 15% 미만, 예를 들어, 10% 미만으로 전체 혈청의 C3 침착을 억제할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 MASP-2 억제 항체가 대조근 C4 침착의 80% 미만, 예를 들어, 70% 미만, 예를 들어, 60% 미만, 예를 들어, 50% 미만, 예를 들어, 40% 미만, 예를 들어, 30% 미만, 예를 들어, 20% 미만, 예를 들어, 15% 미만, 예를 들어, 10% 미만으로 전체 혈청의 C4 침착을 억제할 수 있다.

일부 구체예에서, 항-MASP-2 억제 항체는 MASP-2 보체 활성화를 선택적으로 억제하며 (즉, C1r 또는 C1s보다 적어도 100배 이상의 친화도로 MASP-2에 결합한다), C1q-의존적 보체 활성화 시스템을 기능적으로 온전하게 둔다 (즉, 고전적 경로 활성의 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98%, 또는 100%가 유지된다).

일부 구체예에서, 대상체 항-MASP-2 억제 항체는 다음 특성을 갖는다: (a) 사람 MASP-2에 대하여 높은 친화도 (예를 들어, 10 nM 이하의 K_D, 바람직하게 1 nM 이하의 K_D), 및 (b) 30 nM 이하의 IC₅₀, 바람직하게 10 nM 이하의 IC₅₀으로 90% 사람 혈청에서 MASP-2 의존적 보체 활성의 억제.

실시예 2-12에 설명된 바와 같이, 완전한 사람 항체는 면역 시스템의 고전적 (C1q-의존적) 경로 성분을 온전하게 두면서 높은 친화도로 MASP-2에 결합하고 렉틴-매개된 보체 활성화를 억제하는 것으로 확인되었다. 항체의 가변 경쇄 및 중쇄 단편은 scFv 포맷 및 전체 길이 IgG 포맷에서 시퀀싱되었고, 분리되었고 분석되었다. 도 5a는 MASP-2에 대한 높은 결합 친화도 및 MASP-2 의존적 활성을 억제하는 능력을 가진 것으로 확인된 일곱 개의 scFv 항-MASP-2 클론의 아미노산 서열 정렬이다. 도　5b는 scFv 모체 클론 17D20, 17N16, 18L16 및 4D9 중 네 개의 아미노산 서열 정렬이며, 프레임워크 영역 및 CDR 영역을 나타낸다. scFv 모체 클론 17D20 및 17N16은 실시예 6 및 7에 설명된 바와 같이, 친화도 성숙화를 받았으며, 모체 클론과 비교하여 높은 친화도 및 증가된 힘을 갖는 딸 클론의 발생으로 이어졌다. 도 5a 및 5b에 나타난 scFv 클론 및 결과의 딸 클론의 중쇄 가변 영역 (VH) (aa 1-120) 및 경쇄 가변 영역 (VL) (aa 148-250)의 아미노산 서열은 하기 표 2에 제공된다.

사람 항-MASP-2 억제 항체의 치환 가능한 위치, 뿐만 아니라 그들 위치에 치환될 수도 있는 아미노산의 선택은 상기 논의된 항-MASP-2 억제 항체의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 정렬하고, 이 아미노산이 그들 항체의 어느 위치에서 발생하는지 결정함으로써 나타난다. 한 전형적인 구체예에서, 도 5a 및 5b의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열이 정렬되고 전형적인 항체의 각 위치에서 아미노산의 정체성이 결정된다. 도 5a 및 5b에 설명된 바와 같이 (전형적인 MASP-2 억제 항체의 중쇄 및 경쇄의 각 위치에 존재하는 아미노산을 설명함), 다수의 치환 가능한 위치, 뿐만 아니라 그들 위치에서 치환될 수 있는 아미노산 잔기가 쉽게 확인된다. 도 다른 전형적인 구체예에서, 치환 가능한 위치, 뿐만 아니라 이들 위치에서 치환될 수 있는 아미노산 잔기를 결정하기 위해 모체 클론 및 딸 클론의 경쇄 아미노산 서열이 정렬되고 전형적인 항체의 각 위치에서 아미노산의 정체성이 결정된다.

표 2: 대표적인 항-MASP-2 항체의 서열

특정 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 표 2에 설명된 중쇄 가변 도메인 서열 중 어느 하나의 그것과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 약 70%, 적어도 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96% 동일한, 또는 적어도 약 97% 동일한, 또는 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한) 중쇄 가변 도메인을 갖는다.

일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 SEQ ID NO: 18로서 설명된, 17D20 (VH)와 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 약 70%, 적어도 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96% 동일한, 또는 적어도 약 97% 동일한, 또는 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한) 중쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 SEQ ID NO: 18을 포함하거나, 이로 구성된 중쇄 가변 도메인을 갖는다.

일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 SEQ ID NO: 20으로 제시된, 17D20_cd35VH2N11 (VH)과 실질적으로 동일한 (예를 들어 적어도 약 70%, 적어도 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한) 중쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 SEQ ID NO: 20을 포함하거나, 이로 구성된 중쇄 가변 도메인을 갖는다.

일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 SEQ ID NO: 21로 제시된, 17N16 (VH)과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 약 70%, 적어도 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96% 동일한, 또는 적어도 약 97% 동일한, 또는 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한) 중쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 SEQ ID NO: 21을 포함하거나, 이로 구성된 중쇄 가변 도메인을 갖는다.

일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 표 2에 설명된 경쇄 가변 도메인 서열 중 어느 하나의 그것과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 약 70%, 적어도 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96% 동일한, 또는 적어도 약 97% 동일한, 또는 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한) 중쇄 가변 도메인을 갖는다.

일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 SEQ ID NO: 22로 제시된, 17D20 (VL)과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 약 70%, 적어도 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96% 동일한, 또는 적어도 약 97% 동일한, 또는 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한) 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 SEQ ID NO: 22를 포함하거나, 이로 구성된 경쇄를 갖는다.

일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 SEQ ID NO: 24로 제시된, 17D20_35VH-21N11VL (VL)과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 약 70%, 적어도 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96% 동일한, 또는 적어도 약 97% 동일한, 또는 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한) 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 SEQ ID NO: 24를 포함하거나, 이로 구성된 경쇄를 갖는다.

일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 SEQ ID NO: 25로 제시된, 17N16 (VL)과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 약 70%, 적어도 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96% 동일한, 또는 적어도 약 97% 동일한, 또는 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한) 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 SEQ ID NO: 25를 포함하거나, 이로 구성된 경쇄를 갖는다.

일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 SEQ ID NO: 27로 제시된, 17N16_17N9 (VL)와 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 약 70%, 적어도 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96% 동일한, 또는 적어도 약 97% 동일한, 또는 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한) 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 구체예에서, 대상 사람 항-MASP-2 단클론성 억제 항체는 SEQ ID NO: 27을 포함하거나, 이로 구성된 경쇄를 갖는다.

일부 구체예에서, 표 2에 설명된 바와 같이, 본 발명의 항-MASP-2 항체는 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대한 높은 엄중 조건 하에 잡종화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 중쇄 또는 경쇄를 함유한다. 높은 엄중 조건은 50 ℃에서 0.1x SSC (15　mM 식염수/0.15 mM 나트륨 시트레이트)에서 배양을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-MASP-2 억제 항체는 도 5a 또는 5b에 나타나거나, 하기 표 3a-f 및 표 4에 설명된 중쇄 가변 서열 중 어느 하나의 CDR의 아미노산 서열과 비교하여 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 약 70%, 적어도 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96% 동일한, 또는 적어도 약 97% 동일한, 또는 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한), 또는 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성되는 하나 이상의 CDR (CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-MASP-2 억제 항체는 도 5a 또는 5b에 나타나거나, 하기 표 3a-f 및 표 4에 설명된 경쇄 가변 서열 중 어느 하나의 CDR의 아미노산 서열과 비교하여 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 약 70%, 적어도 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96% 동일한, 또는 적어도 약 97% 동일한, 또는 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한), 또는 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성되는 하나 이상의 CDR (CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

중쇄 가변 영역

표 3a: 중쇄 (aa 1-20)

표 3b: 중쇄 (aa 21-40)

표 3c: 중쇄 (aa 41-60)

표 3d: 중쇄 (aa 61-80)

표 3e: 중쇄 (aa 81-100)

표 3f: 중쇄 (aa 101-118)

하기 제공된 것은 상기 표 2 및 표 3a-f에 나열된 모체 클론 및 딸 클론에 대한 중쇄 가변 영역 (VH) 서열이다.

카바트 CDR (31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3))은 볼드체이고; 초티아 CDR (26-32 (H1), 52-56 (H2) 및 95-101 (H3))은 밑줄 그어져 있다.

17D20 중쇄 가변 영역 ( VH ) ( SEQ ID NO: 18):

QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS RG KMGVSWIRQPPGKALEWLA HIFSS DEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTAT YYCARIR AGGIDYWGQGTLVTVSS

17D20 _ 35VH - 21N11VL 중쇄 가변 영역 ( VH ) ( SEQ ID NO: 20)

QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS RG KMGVSWIRQPPGKALEWLA HIFSS DEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTAT YYCARIR RGGIDYWGQGTLVTVSS

17N16 중쇄 가변 영역 ( VH ) ( SEQ ID NO: 21)

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS ST SAAWNWIRQSPSRGLEWLG RTYYR SKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDT AVYYCAR DPFGVPFDIWGQGTMVTVSS

표 4: 중쇄

경쇄 가변 영역

표 5a: 경쇄 (aa 1-20)

표 5b: 경쇄 (aa 21-40)

표 5c: 경쇄 (aa 41-60)

표 5d: 경쇄 (aa 61-80)

표 5e: 경쇄 (aa 81-100)

표 5f: 경쇄 (aa 101-120)

하기 제공된 것은 상기 표 2 및 표 5a-f에 나열된 모체 클론 및 딸 클론에 대한 경쇄 가변 영역 (VL) 서열이다.

카바트 CDR (24-34 (L1); 50-56 (L2); 및 89-97 (L3))은 볼드체이고; 초티아 CDR (24-34 (L1); 50-56 (L2) 및 89-97 (L3))은 은 밑줄 그어져 있다. 이들 영역은 카바트 또는 초티아 시스템에 의해 번호가 붙여지는지에 관계없이 동일하다.

17D20m 경쇄 가변 영역 ( VL ) ( SEQ ID NO: 22)

QPVLTQPPSVSVSPGQTASITCS GDKLGDKFAYW YQQKPGHSPVLVIYQ DNKRPSG IPGRFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQ AWDSSTAVF GTGTKVTVLA

17D20m _ d3521N11 경쇄 가변 영역 ( VL ) ( SEQ ID NO: 24)

QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCS GEKLGDKYAYW YQQKPGQSPVLVMYQ DKQRPSG IPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQ AWDSSTAVF GGGTKLTVL

17N16m 경쇄 가변 영역 ( VL ) ( SEQ ID NO: 25)

SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCG GNNIGSKNVHW YQQKPGQAPVLVVYD DSDRPSG IPERFSGSNSGNTATLTVSRVEAGDEADYYCQ VWDTTTDHV VFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISE

17N16m _ d17N9 경쇄 가변 영역 ( VL ) ( SEQ ID NO: 27)

SYELIQPPSVSVAPGQTATITCA GDNLGKKRVHW YQQRPGQAPVLVIYD DSDRPSG IPDRFSASNSGNTATLTITRGEAGDEADYYCQ VWDIATDHV VFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISE

표 6: 경쇄 CDR (카바트/초티아)

한 양태에서, 본 발명은 사람 MASP-2에 결합하는, 분리된 사람 단클론성 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편을 제공하며, (i) CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (ii) CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역 CDR-H3 서열은 SEQ ID NO: 38 또는 SEQ ID NO: 90에 설명된 아미노산, 및 이들의 보존적 서열 변형을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR-L3 서열은 SEQ ID NO: 51 또는 SEQ ID NO: 94에 설명된 아미노산 서열, 및 이들의 보존적 서열 변형을 포함하고, 분리된 항체는 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제한다.

한 구체예에서, 중쇄 가변 영역 CDR-H2 서열은 SEQ ID NO: 32 또는 33으로 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 보존적 서열 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역 CDR-H1 서열은 SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29로 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 보존적 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 영역 CDR-L2 서열은 SEQ ID NO: 93으로 제시된 아미노산 및 이들의 보존적 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 영역 CDR-L1 서열은 SEQ ID NO: 91 또는 SEQ ID NO: 92로 제시된 아미노산 서열 및 이들의 보존적 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR-H1은 SEQ ID NO: 28을 포함한다.

한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR-H2는 SEQ ID NO: 32를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR-H3은 SEQ ID NO: 90을 포함한다 (표 4에 나타난 바와 같음). 한 구체예에서, SEQ ID NO: 90에 설명된 아미노산 서열은 위치 8에서 R (Arg)을 함유한다.

한 구체예에서, 경쇄 가변 영역의 CDR-L1은 SEQ ID NO: 91을 포함한다 (표 6에 나타난 바와 같음). 한 구체예에서, SEQ ID NO: 91에 설명된 아미노산은 위치 2에서 E (Glu)를 함유한다. 한 구체예에서, SEQ ID NO: 91에 설명된 아미노산 서열은 위치 8에서 Y (Tyr)를 함유한다.

한 구체예에서, 경쇄 가변 영역의 CDR-L2는 SEQ ID NO: 93을 포함하며 (표 6에 나타난 바와 같음), SEQ ID NO: 93에 설명된 아미노산 서열은 위치 2에서 K (Lys)를 함유한다. 한 구체예에서, SEQ ID NO: 93에 설명된 아미노산 서열은 위치 3에서 Q (Gln)를 함유한다.

한 구체예에서, 경쇄 가변 영역의 CDR-L3은 SEQ ID NO: 51을 포함한다.

한 구체예에서, 상기 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 10 nM 이하의 K_D로 사람 MASP-2에 결합한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 10 nM 이하의 IC₅₀에서 1% 사람 혈청의 시험관 내 검정에서 C4 활성화를 억제한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 30 nM 이하의 IC₅₀에서 90% 사람 혈청의 시험관 내 검정에서 C4 활성화를 억제한다. 한 구체예에서, 이들의 보존적 서열 변형은 중쇄 가변 영역의 CDR 영역 내에서 조합된 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환, 및/또는 경쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역과 조합된 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환을 제외하고, 나열된 가변 도메인(들)과 동일한 가변 영역을 함유하는 분자를 포함하거나 이로 구성된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 사람 MASP-2에 결합하는, 분리된 사람 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편을 제공하며, 항체는 I) a)　i) SEQ ID NO: 21의 31-35개의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO: 21의 50-65개의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO: 21을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 b) i) SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 27의 24-34개의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 27의 50-56개의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 27의 89-97개의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 II) 그렇지 않으면 상기 중쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역 내에서 조합된 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환 및 상기 경쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역 내에서 조합된 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환을 제외하고, 상기 가변 도메인과 동일한 이들의 변이체를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 변이체는 상기 중쇄 가변 영역의 위치 31, 32, 33, 34, 35, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 102로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 변이체는 상기 경쇄 가변 영역의 위치 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 51, 52, 89, 92, 93, 95, 96 또는 97로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체의 중쇄는 SEQ ID NO: 21을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 25를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 27을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 사람 MASP-2에 결합하는, 분리된 사람 단클론성 항체를 제공하며, 항체는 I) a)　i) SEQ ID NO: 20의 31-35개의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO: 20의 50-65개의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDRH-2; 및 iii) SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 20의 95-102개의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 b) i) SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 24의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 24의 50-56개의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 24의 89-97개의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 II) 그렇지 않으면 그렇지 않으면 상기 중쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역 내에서 조합된 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환 및 상기 경쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역 내에서 조합된 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환을 제외하고, 상기 가변 도메인과 동일한 이들의 변이체를 포함하며, 항체 또는 이들의 변이체는 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제한다. 한 구체예에서, 상기 변이체는 상기 중쇄 가변 영역의 위치 31, 32, 33, 34, 35, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 102로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 변이체는 상기 경쇄 가변 영역의 위치 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 51, 52, 89, 92, 93, 95, 96 또는 97로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체의 중쇄는 SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 20과 적어도 80% 동일성 (예를 들어, SEQ ID NO: 20과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일성)을 포함하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체의 중쇄는 SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 18과 적어도 80% 동일성 (예를 들어, SEQ ID NO: 18과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일성)을 포함하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 22, 또는 SEQ ID NO: 22와 적어도 80% 동일성 (예를 들어, SEQ ID NO: 22와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일성)을 포함하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 24와 적어도 80% 동일성 (예를 들어, SEQ ID NO: 24와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일성)을 포함하는 이들의 변이체를 포함한다.

한 구체예에서, 상기 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인의 에피토프에 결합한다.

한 구체예에서, 상기 항체는 10 nM 이하의 K_D로 사람 MASP-2에 결합한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 10 nM 이하의 IC₅₀에서 1% 사람 혈청의 시험관 내 검정에서 C3b 침착을 억제한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 30 nM 이하의 IC₅₀에서 90% 사람 혈청의 시험관 내 검정에서 C3b 침착을 억제한다.

한 구체예에서, 상기 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ 및 F(ab')₂로 구성된 그룹으로부터 선택된 항체 단편이다. 한 구체예에서, 상기 항체는 단일 사슬 분자이다. 한 구체예에서, 상기 항체는 IgG2 분자이다. 한 구체예에서, 상기 항체는 IgG1 분자이다. 한 구체예에서, 상기 항체는 IgG4 분자이다. 한 구체예에서, 상기 IgG4 분자는 S228P 돌연변이를 포함한다.

한 구체예에서, 상기 항체는 고전적 경로를 실질적으로 억제하지 않는다 (즉, 고전적 경로 활성은 적어도 80%, 또는 적어도 90% 또는 적어도 95%, 또는 적어도 95% 온전하다).

또 다른 양태에서, 본 발명은 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 바와 같이 10 nM 이하의 K_D로 사람 MASP-2로부터 구분되고 1% 혈청에서 10nM 이하의 IC₅₀로 만난-코팅된 기질에서 C4 활성화를 억제하는 분리된 완전한 사람 단클론성 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 20에 설명된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 24에 설명된 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체, 예를 들어 참조 항체 OMS646에 의해 인식된 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식한다 (표 22를 참고하면 된다). 상기 언급된 내용에 따라, 본 출원의 특정 바람직한 구체예에 따르는 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 사람 MASP-2에 결합에 대하여 (i) 항원에 특이적으로 결합하고 (ii) 여기에 개시된 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하거나, 여기에 개시된 CDR-H3, 또는 이들 중 어느 하나의 변이체를 포함하는, 여기에 개시된 어떤 항체와도 경쟁하는 것일 수도 있다. 결합 멤버들 사이의 경쟁은, 예를 들어, ELISA를 사용하여 및/또는 다른 태그되지 않은 결합 멤버(들)의 존재시 검출될 수 있는 하나의 결합 멤버에 특이적 리포터 분자를 태그함으로써 시험관 내에서 쉽게 검정되어 같은 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하는 특이적 결합 멤버의 확인을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 단편이 현재 제공되며, 사람 MASP-2에 결합에 대하여 사람 MASP-2에 결합하는, 여기에 개시된 항체, 예를 들어, 표 24에 설명된 OMS641 내지 OMS646 중 어느 하나와 경쟁하는 사람 항체 항원-결합 부위를 포함한다.

변이체 MASP-2 억제 항체

상기 설명된 사람 단클론성 항체는 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하는 변이체 항체를 제공하도록 변형될 수도 있다. 변이체 항체는 상기 설명된 사람 단클론성 항체 중 적어도 하나의 아미노산을 치환, 추가, 또는 삭제함으로써 만들어질 수도 있다. 일반적으로, 이들 변이체 항체는 상기 설명된 사람 항체의 일반적인 특성을 갖고 상기 설명된 사람 항체 중 적어도 CDR, 또는, 특정 구체예에서, 상기 설명된 사람 항체의 CDR에 매우 유사한 CDR을 함유한다.

바람직한 구체예에서, 변이체는 모체 항체의 하나 이상의 초가변 영역(들)에서 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. 예를 들어, 변이체는 적어도 하나, 예를 들어, 약 하나 내지 약 열 개, 예를 들어, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개의 치환, 및 바람직하게 모체 항체의 하나 이상의 CDR 영역에서 약 둘 내지 약 여섯 개의 치환을 포함할 수도 있다. 한 구체예에서, 상기 변이체는 상기 중쇄 가변 영역의 위치 31, 32, 33, 34, 35, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 102로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 변이체는 상기 경쇄 가변 영역의 위치 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 51, 52, 89, 92, 93, 95, 96 또는 97로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.

일부 구체예에서, 변이체 항체는 상기 중쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역 내에서 조합된 총 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환 및/또는 상기 경쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역 내에서 조합된 총 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환을 제외하고, 표 2에 설명된 대상 항체의 가변 도메인과 동일한 아미노산 서열을 가지며, 항체 또는 이들의 변이체는 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제한다.

정상적으로는, 변이체는 모체 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 서열과 적어도 75% 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게 적어도 80%, 더 바람직하게 적어도 85%, 더 바람직하게 적어도 90%, 및 가장 바람직하게 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 이 서열에 관한 동일성 또는 상동성은, 필요하면, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭 (gap)을 도입한 후, 모체 항체 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 퍼센트로서 여기에 정의된다. N-말단, C-말단, 또는 내부 연장, 삭제, 또는 항체 서열 (예를 들어, 신호 펩티드 서열, 결합자 서열, 또는 태그, 예를 들어, HIS 태그)로 삽입 중 아무것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않아야 한다. 변이체는 사람 MASP-2에 결합하는 능력을 유지하고 바람직하게 모체 항체의 그것보다 우수한 성질을 가진다. 예를 들어, 변이체는 더 강한 결합 친화도 및/또는 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하거나 차단하는 향상된 능력을 가질 수도 있다.

이러한 성질을 분석하기 위해, 예를 들어, 항-MASP-2 항체의 포맷이 여기에 개시된 생물학적 활성 검정에서 그것의 활성에 영향을 미치는 것이 발견되었기 때문에, 변이체의 Fab 형태를 모체 항체의 Fab 형태에 또는 변이체의 전체 길이 형태를 모체 항체의 전체 길이 형태에 비교해야 한다. 여기에서 특히 흥미로운 변이체 항체는 모체 항체와 비교할 때 생물학적 활성의 적어도 약 10배, 바람직하게 적어도 약 20배, 및 가장 바람직하게 적어도 약 50배 향상을 나타내는 것이다.

본 발명의 항체는 원하는 성질을 향상시키도록 변형될 수도 있는데, 예를 들어, 항체의 혈청 반감기를 조절하는 것이 바람직할 수도 있다. 일반적으로 완벽한 항체 분자는 매우 긴 혈청 지속력을 갖는 반면에, 단편 (<60-80 kDa)은 신장을 통해 매우 신속하게 여과된다. 이런 이유로, MASP-2 항체의 장기간 작용이 바람직하면, MASP-2 항체는 바람직하게 완벽한 전체 길이 IgG 항체 (예를 들어, IgG2 또는 IgG4)인 반면에, MASP-2 항체의 더 짧은 작용이 바람직하면, 항체 단편이 바람직할 수도 있다. 실시예 5에 설명된 바와 같이, IgG4의 힌지 영역에서 S228P 치환은 혈청 안정성을 증가시킨다는 것이 결정되었다. 따라서, 일부 구체예에서, 대상 MASP-2 항체는 S228P 치환을 갖는 전체 길이 IgG4 항체이다.

단일 사슬 항체

본 발명의 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 단일 사슬 항체이고, 경쇄의 가변 영역, 중쇄의 가변 영역을 함유하는 유전적으로 조작된 분자로서 정의되고, 유전적으로 융합된 단일 사슬 분자로서 적합한 폴리펩티드 결합자에 의해 결합된다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편으로 나타난다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성하게 할 수 있는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 결합자를 추가로 포함한다. MASP-2에 결합하는 scFv 항체는 가변 경쇄 영역은 가변 경쇄 영역과 함께 아미노 말단을 가변 중쇄 영역으로 또는 카르복시 말단을 그것으로 향하게 할 수 있다. 본 발명의 전형적인 scFv 항체는 SEQ ID NO: 55-61 및 SEQ ID NO: 66-68로서 여기에 설명된다.

항체를 생산하는 방법

많은 구체예에서, 대상 단클론성 항체를 암호화하는 핵산은 숙주 세포에 직접적으로 도입되고, 세포를 암호화된 항체의 발현을 유발하기 위해 충분한 조건 하에 배양하였다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항-MASP-2 항체, 또는 이들의 단편, 예를 들어, 표 2에 설명된 항체 또는 이들의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 88 및 SEQ ID NO: 89로 구성된 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항-MASP-2 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항-MASP-2 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트를 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항-MASP-2 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항-MASP-2 항체를 생산하는 방법을 제공한다.

특정 관련 구체예에 따라, 여기에 설명된 바와 같이 하나 이상의 구조를 포함하는 재조합 숙주 세포, 어떤 항체도 암호화하는 핵산, CDR, VH 또는 VL 도메인, 또는 이들의 항원-결합 단편; 및 암호화된 생성물의 생산 방법이 제공되며, 이 방법은 그것을 위한 암호화 핵산으로부터 발현을 포함한다. 발현은 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건 하에 배양함으로써 편리하게 달성될 수도 있다. 발현에 의한 생산 후에, 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 어떤 적합한 기술을 사용하여 분리될 수도 있고 및/또는 정제될 수도 있고, 원하는 바와 같이 사용될 수도 있다.

예를 들어, 발현 카세트의 발현에 적합한 어떤 세포는 숙주 세포, 예를 들어, 효모, 곤충, 식물, 등의 세포로서 사용될 수도 있다. 많은 구체예에서, 정상적으로 항체를 생산하지 않는 포유동물 숙주 세포주가 사용되며, 이것의 예는 다음과 같다: 원숭이 신장 세포 (COS cells), SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVI 세포 (COS-7, ATCC CRL 165 1); 사람 배아 신장 세포 (HEK-293, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포 (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216, (1980); 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CVI ATCC CCL 70); 아프리카 사바나 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 사람 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 사람 간세포 (hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982)); NIH/3T3 세포 (ATCC CRL-1658); 및 마우스 L 세포 (ATCC CCL-1). 추가적인 세포주는 당업자에게 분명해질 것이다. 다양한 세포주가 American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209로부터 이용 가능하다.

핵산을 세포 내로 도입하는 방법은 업계에 잘 알려져 있다. 적합한 방법은 전기 천공, 입자 총 기술 (particle gun technology), 칼슘 포스페이트 침전, 직접적인 미량주사, 등을 포함한다. 방법의 선택은 일반적으로 형질전환되는 세포의 타입 및 형질전환이 일어나는 상황 (즉, 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내)에 의존적이다. 이들 방법의 일반적인 논의는 Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3d ed., Wiley & Sons, 1995에서 발견될 수 있다. 일부 구체예에서, 리포펙타민 및 칼슘 매개된 유전자 수송 기술이 사용된다.

대상 핵산이 세포에 도입된 후, 세포는 전형적으로 정상적으로 37 ℃에서, 가끔 선택 하에, 항체의 발현을 허용하는 적합한 시간 동안 배양된다. 대부분의 구체예에서, 항체는 전형적으로 세포가 성장하는 배지의 상층액으로 분비된다.

포유동물 숙주 세포에서, 많은 바이러스-기반 발현 시스템이 대상 항체를 발현시키는데 이용될 수도 있다. 발현 벡터로서 아데노바이러스가 사용되는 경우에, 원하는 항체 암호화 서열이 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예를 들어, 후반 프로모터 (late promoter) 및 삼자 선도 서열 서열 (tripartite leader sequence)에 결찰될 수도 있다. 이 키메라 유전자는 시험관 내 또는 생체 내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수도 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역 (예를 들어, 영역 E1 또는 E3)에 삽입은 감염된 숙주가 살 수 있고 이것에서 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 발생시킬 것이다 (예를 들어, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)를 참고하면 된다). 발현의 효능은 적절한 전사 인핸서 (enhancer) 요소, 전사 종결자, 등의 포함에 의해 향상될 수도 있다 (Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)을 참고하면 된다).

장기간, 재조합 항체의 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주가 조작될 수도 있다. 복제의 바이러스 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것 대신에, 숙주 세포가 면역글로불린 발현 카세트 및 선택 가능한 마커로 형질전환될 수 있다. 외부 DNA의 도입 후에, 조작된 세포는 농축 배지에서 1-2일 동안 키우는 것이 허용될 수도 있고, 선택 배지로 바뀐다. 재조합 플라스미드의 선택 가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고 세포가 플라스미드를 염색체 내로 안정하게 통합하고 성장하여 차례로 클로닝되고 확장될 수 있는 초점을 형성하는 것을 허용한다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수도 있다.

본 발명의 항체 분자가 생산되면, 그것은 면역글로불린 분자의 정제를 위해 업계에 알려진 어떤 방법에 의해서도, 예를 들어, 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 이후 특이적 항원에 대한 친화도, 및 크기 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도에 의해, 또는 단백질의 정제를 위한 어떤 다른 표준 기술에 의해서도 정제될 수도 있다. 많은 구체예에서, 항체는 세포로부터 배양 배지에 분비되고 배양 배지로부터 수확된다. 예를 들어, 신호 펩티드를 암호화하는 핵산 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO: 71의 뉴클레오티드 1-57에 제공된 항체 또는 단편의 암호화 영역에 인접하게 포함될 수도 있으며, SEQ ID NO: 72의 아미노산 1-19에 제공된 바와 같이 신호 펩티드를 암호화한다. 이러한 신호 펩티드는 대상 항체의 생산을 가능하게 하기 위해 대상 항체에 대하여 여기에 설명된 아미노산 서열의 5' 끝에 인접하게 통합될 수도 있다.

약학적 담체 및 전달 비히클

또 다른 양태에서, 본 발명은 사람 항-MASP-2 억제 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체의 치료적 유효량을 포함하는 MASP-2 의존적 보체 활성화의 부작용을 억제하는 조성물을 제공한다.

일반적으로, 본 발명의 사람 MASP-2 억제 항체 조성물은 어떤 다른 선택된 치료제와도 결합되고, 약학적으로 허용 가능한 담체에 적합하게 함유된다. 담체는 비-독성, 생체 적합성이고 MASP-2 억제 항체 (및 이들과 결합된 어떤 다른 치료제)의 생물학적 활성에 해롭게 영향을 미치지 않기 위해 선택된다. 폴리펩티드에 대하여 전형적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 Yamada의 미국 특허 번호　5,211,657에 설명된다. 항-MASP-2 항체는 고체, 반고체, 겔, 액체 또는 가스 형태의 조제물, 예를 들어, 경구, 비경구 또는 수술적 투여를 허용하는 타블렛, 캡슐, 파우더, 과립, 연고, 용액, 침착물, 흡입제 및 주사제로 조제될 수도 있다. 본 발명은 또한 의료장비 등을 코팅함으로써 조성물의 국부적 투여를 고려한다.

주사 가능한, 투입 또는 관주법을 통한 비경구 전달 및 국부적 전달에 적합한 담체는 증류수, 생리학적 포스페이트-완충된 식염수, 정상 또는 락테이트화된 링거 용액, 덱스트로스 용액, 행크 용액 (Hank's solution), 또는 프로판디올을 포함한다. 게다가, 멸균되고, 고정된 오일이 용매 또는 현탁화 배지로서 이용될 수도 있다. 이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는, 어떤 생체 적합성 오일도 이용될 수 있다. 게다가, 올레산과 같은 지방산은 주사 가능한 것들의 제조에 있어서 용도를 찾는다. 담체 및 약제는 액체, 현탁화제, 폴리머화 가능한 또는 비-폴리머화 가능한 겔, 페이스트 (paste) 또는 고약 (salve)으로 합성될 수도 있다.

담체는 또한 약제(들)의 전달을 유지 (즉, 연장, 지연 또는 조절)하거나 치료제(들)의 전달, 흡수, 안정화 또는 약물동력학을 향상시키기 위해 전달 비히클을 포함할 수도 있다. 이러한 전달 비히클은 비-제한 예의 방법에 의해, 단백질, 리포솜, 탄수화물, 합성 유기 화합물, 무기 화합물, 폴리머 또는 코폴리머 히드로겔 및 폴리머 미셸로 구성된 미립자, 미소구체, 나노구체 또는 나오 입자를 포함한다. 적합한 히드로겔 및 미셸 전달 시스템은 PEO:PHB:PEO 코폴리머 및 WO　2004/009664　A2에 개시된 코폴리머/시클로덱스트린 복합체 및 미국 특허 출원 공개 번호 　2002/0019369　A1에 개시된 PEO 및 PEO/시클로덱스트린을 포함한다. 이러한 히드로겔은 지속적인 방출 디폿 (depot)을 형성하기 위해 의도된 작용의 부위에 국부적으로, 또는 피하에 또는 근육 내에 주사될 수도 있다.

관절 내 전달을 위해, MASP-2 억제 항체는 주사 가능한 상기 설명된 액체 또는 겔 담체, 주사 가능한 상기 설명된 지속적-방출 전달 비히클, 또는 히알루론산 또는 히알루론산 유도체에서 운반될 수도 있다.

척추 강 내 (IT) 또는 뇌실 내 (ICV) 전달을 위해, 적절하게 멸균된 전달 시스템 (예를 들어, 액체; 겔, 현탁액, 등)은 본 발명을 투여하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 분산제 또는 습윤제, 현탁화제, 희석제, 완충제, 흡수 촉진제, 에멀젼화제, 결합제, 농후화제, 방향제와 같은 생체 적합성 첨가제를 포함할 수도 있다 (경구 투여용).

국부적 전달을 위해 항-MASP-2 항체의 고농도를 달성하기 위해, 항체는 이후의 주사를 위해, 예를 들어, 디폿의 근육 내 주사를 위해 용액 중의 입자성 물질 또는 결정으로 조제될 수도 있다.

항-MASP-2 항체에 관하여 더 특이적으로, 전형적인 제형은 물, 오일, 식염수, 글리세롤 또는 에탄올과 같은 멸균된 액체일 수 있는 약학적 담체와 함께 생리학적으로 허용 가능한 희석제 중의 화합물의 용액 또는 현탁액의 주사 가능한 투약량으로 비경구로 투여될 수 있다. 추가적으로, 습윤제 또는 에멀젼화제, 계면활성제, Ph 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 항-MASP-2 항체를 포함하는 조성물에 존재할 수 있다. 약학적 조성물의 추가적인 성분은 석유 (예를 들어, 동물, 식물 또는 합성 기원의), 예를 들어, 대두 오일 및 미네랄 오일을 포함한다. 일반적으로, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜은 주사 가능한 용액에 대한 바람직한 액체 담체이다.

항-MASP-2 항체는 또한 활성제의 지속성 또는 박동성 방출을 허용하기 위해 이러한 방식으로 조제될 수 있는 디폿 주사 또는 임플란트 (implant) 조제물의 형태로 투여될 수 있다.

MASP-2 억제 항체를 포함하는 약학적 조성물은 투여의 국부적 또는 전신적 방식이 치료되는 질병에 가장 적절한지에 의존적인 다양한 방법에 의해 투여될 수도 있다. 추가적으로, 체외 재관류 수술에 관하여 여기에 상기 설명된 바와 같이, MASP-2 억제 항체는 재순환 혈액 또는 혈장에 본 발명의 조성물의 도입을 통해 투여될 수 있다. 게다가, 본 발명의 조성물은 이식 가능한 의료장비 상에 코팅하거나 조성물을 이에 통합함으로써 전달될 수 있다.

전신성 전달

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "전신성 전달" 및 "전신성 투여"는 근육 내 (IM), 피하, 정맥 내 (IV), 동맥 내, 흡입, 혀 밑, 볼, 국부, 경피, 비강, 직장, 질 및 의도된 치료적 작용의 단일 또는 다수 부위에 전달된 항체의 분산을 효과적으로 일으키는 투여의 다른 루트를 포함하는 경구 및 비경구 루트를 포함하지만 이에 제한되어서는 안 된다. 본 조성물에 대한 전신성 전달의 바람직한 루트는 정맥 내, 근육 내, 피하 및 흡입을 포함한다. 본 발명의 특정 조성물에 이용된 선택된 약제에 대한 정확한 전신성 투여 루트가 투여의 특정 루트와 관련된 물질대사 형질전환 경로에 대한 약제의 민감도를 부분적으로 설명하기 위해 결정된다는 것이 인정될 것이다.

MASP-2 억제 항체 및 폴리펩티드가 어떤 적합한 방법에 의해서도 이들이 필요한 대상체에 전달될 수 있다. MASP-2 항체 및 폴리펩티드의 전달 방법은 투여의 경구, 폐, 비경구 (예를 들어, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 (IV) 또는 피하 주사), 흡입 (예를 들어, 미세한 분말 제형을 통해), 경피, 비강, 질, 직장, 또는 혀 밑 루트에 의해 투여를 포함하고, 투여의 각각의 루트에 적합한 투약 형태로 조제될 수 있다.

대표적인 예시의 방법에 의해, MASP-2 억제 항체 및 펩티드는 폴리펩티드를 흡수할 수 있는 신체의 막, 예를 들어, 비강, 위장 및 직장 막에 적용에 의해 살아있는 생체 내로 도입될 수 있다. 폴리펩티드는 전형적으로 침투 강화제와 함께 흡수성 막에 적용된다 (예를 들어, Lee, V.H.L., Crit . Rev. Ther . Drug Carrier Sys.　5 :69, 1988; Lee, V.H.L., J.　Controlled Release 13:213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A.G.,　et　al., J.　Controlled Release　13 :241, 1990을 참고하면 된다). 예를 들어, STDHF는 푸시딘산의 합성 유도체, 담즙산염과 구조가 유사하고, 비강 전달을 위한 침투 강화제로서 사용된 스테로이드성 계면강화제이다 (Lee, W.A., Biopharm.　22, Nov./Dec. 1990.)

MASP-2 억제 항체 및 폴리펩티드는 효소의 분해로부터 폴리펩티드를 보호하기 위해 지질과 같은 또 다른 분자와 함께 도입될 수도 있다. 예를 들어, 폴리머, 특히 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 공유 부착은 신체에서 효소의 가수분해로부터 특정 단백질을 보호하기 위해 사용되었고 따라서 반감기를 연장한다 (Fuertges, F.,　et　al., J.　Controlled Release　11:139, 1990). 많은 폴리머 시스템이 단백질 전달에 대하여 보고되었다 (Bae, Y.H.,　et　al., J.　Controlled Release　9:271, 1989; Hori, R.,　et　al., Pharm . Res.　6:813, 1989; Yamakawa, I.,　et　al., J. Pharm . Sci.　79:505, 1990; Yoshihiro, I.,　et　al., J.　Controlled Release　10:195, 1989; Asano, M.,　et　al., J.　Controlled Release　9:111, 1989; Rosenblatt, J., et　al., J.　Controlled Release　9:195, 1989; Makino, K., J.　Controlled Release　12:235, 1990; Takakura, Y., et　al., J.　 Pharm . Sci.　78:117, 1989; Takakura, Y.,　et　al., J. Pharm . Sci.　78:219, 1989).

최근에, 리포솜은 개선된 혈청 안정성 및 순환 하프타임 (half-times)을 갖도록 개발되었다 (예를 들어, Webb의 미국 특허 번호　5,741,516을 참고하면 된다). 게다가, 잠재적 약물 담체로서 리포솜 및 리포솜-유사물의 다양한 제조 방법은 재검토되었다 (예를 들어, Szoka의 미국 특허 번호　5,567,434; Yagi의 미국 특허 번호　5,552,157; Nakamori의 미국 특허 번호　5,565,213; Shinkarenko의 미국 특허 번호　5,738,868; 및 Gao의 미국 특허 번호　5,795,587을 참고하면 된다).

경피성 적용을 위해, MASP-2 억제 항체 및 폴리펩티드는 다른 적합한 성분, 예를 들어, 담체 및/또는 보조제와 결합될 수도 있다. 그것들의 의도된 투여를 위해 그것들이 약학적으로 허용 가능해야하고 조성물의 활성 성분의 활성을 분해할 수 없는 것을 제외하고는, 이러한 다른 성분의 성질에 대한 제한은 없다. 적합한 비히클의 예는 정제된 콜라겐과 함께 또는 없이, 연고, 크림, 겔, 또는 현탁액을 포함한다. MASP-2 억제 항체 및 폴리펩티드는 바람직하게 액체 또는 반액체 형태로 경피 패치, 플라스터 (plaster) 및 붕대에 주입될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 원하는 수준의 치료적 효과를 유지하기 위해 결정된 간격으로 주기적으로 전신에 투여될 수도 있다. 예를 들어, 조성물은, 예를 들어, 피하 주사에 의해 2 내지 4주마다 또는 낮은 빈도의 간격으로 투여될 수도 있다. 투약 요법은 약제의 조합의 작용에 영향을 미칠 수도 있는 다양한 인자를 고려하여 의사에 의해 결정될 것이다. 이들 인자는 치료되는 질병의 진행의 정도, 환자의 나이, 성별 및 체중, 및 다른 임상적 인자를 포함할 것이다. 각 개개의 약제에 대한 투약은 조성물에 포함되는 MASP-2 억제 항체의 기능, 뿐만 아니라 어떤 약물 전달 비히클의 존재 및 성질 (예를 들어, 지속적인 방출 전달 비히클)에 따라 다를 것이다. 게다가, 투약의 양은 전달되는 약제(들)의 투여의 빈도 및 약물동력학적 행동의 변화를 설명하기 위해 조정될 수도 있다.

국부적 전달

여기에 사용된 바와 같이, 용어 "국부적"은 의도된 국부화된 작용의 부위에 또는 주위에 약물의 적용을 포함하고, 예를 들어, 피부 또는 다른 영향을 받은 조직에 국부적 전달, 눈 전달, 척추 강 내 (IT), 뇌실 내 (ICV), 관절 내, 공동 내, 두개 내 또는 방광 내 투여, 배치 또는 관주법 (irrigation)을 포함할 수도 있다. 국부적 투여는 전신성 부작용을 방지하기 위해, 및 국부적 전달의 부위에서 활성제의 전달의 시기 및 농도의 더 정확한 조절을 위해 저용량의 투여가 가능한 것이 가장 바람직할 수도 있다. 국부적 투여는 표적 부위에 대사, 혈류, 등에서 환자 내 가변성에 상관없이 알려진 농도를 제공한다. 개선된 투약 조절은 또한 직접적인 방식의 전달에 의해 제공된다.

MASP-2 억제 항체의 국부적 전달은 예를 들어, 동맥 우회 수술 (arterial bypass surgery), 죽종 절제술 (atherectomy), 레이져 수술, 초음파 수술, 기구 혈관 형성 (balloon angioplasty) 및 스텐트 삽입술 (stent placement)과 같은 수술 중에, 질환 또는 질병의 치료를 위한 수술적 방법의 맥락에서 달성될 수도 있다. 예를 들어, MASP-2 억제제는 기구 혈관 형성 수술과 함께 대상체에 투여될 수 있다. 기구 혈관 형성 수술은 바람이 빠진 풍선이 달린 카테터 (catheter)를 동맥에 삽입하는 단계를 수반한다. 바람이 빠진 풍선은 동맥경화 플라크 (atherosclerotic plaque)의 가까이에 위치하고 혈관벽에 압축되도록 부풀려진다. 결과로서, 풍선 표면은 혈관의 표면상의 혈관 내피 세포층과 접촉된다. MASP-2 억제 항체는 동맥경화 플라크의 부위에서 약제의 방출을 허용하는 방식으로 기구 혈관 형성 카테터에 부착될 수도 있다. 약제는 업계에 알려진 표준 과정에 따라 풍선 카테터에 부착될 수도 있다. 예를 들어, 약제는 풍선이 부풀려질 때까지 풍선 카테터의 구획에 저장될 수도 있으며, 이 지점에서 그것이 국부적 환경으로 방출된다. 대안으로, 약제는 풍선 표면상에 주입될 수도 있으며, 그것은 풍선이 부풀려져 있기 때문에 동맥의 세포에 접촉한다. 약제는 또한 Flugelman, M.Y.,　et　al., Circulation　85:1110-1117, 1992에 개시된 것들과 같은 천공된 풍선 카테터에서 전달될 수도 있다. 또한 치료적 단백질을 기구 혈관 형성 카테터에 부착하는 전형적인 수술에 대하여 공개된 PCT 출원 WO　95/23161을 참고하면 된다. 유사하게, MASP-2 억제 항체는 스텐트에 적용된 겔 또는 폴리머 코팅에 포함될 수도 있거나, 스텐트의 재료에 통합될 수도 있으며, 스텐트는 혈관 배치 후 MASP-2 억제 항체를 용출한다.

치료 요법

관절염 및 다른 근골격 장애의 치료에 사용된 MASP-2 억제 항체 조성물은 관절 내 주사에 의해 국부적으로 전달될 수도 있다. 이러한 조성물은 적합하게 지속적인 방출 전달 비히클을 포함할 수도 있다. 국부적 전달이 요구될 수도 있는 경우의 추가의 예로서, 비뇨생식기 질병의 치료에 사용된 MASP-2 억제 항체 조성물은 방광 내에 또는 또 다른 비뇨생식기 구조 내에 적합하게 주입될 수도 있다.

예방적 적용에서, 약학적 조성물은 질병의 증상에 걸릴 위험을 제거하거나 감소시키기 위해 충분한 양으로 MASP-2 의존적 보체 활성화와 관련된 질병에 걸린 것으로 의심되거나, 그렇지 않으면 걸릴 위험이 있는 대상체에 투여된다. 치료적 적용에서, 약학적 조성물은 질병의 증상을 완화하거나, 적어도 부분적으로 감소시키기 위해 충분한 치료적 유효량으로 MASP-2 의존적 보체 활성화와 관련된 질병에 걸린 것으로 의심되거나, 이미 이로 고통받는 대상체에 투여된다. 예방적 및 치료적 요법 둘 다에서, MASP-2 억제 항체를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 치료적 결과가 달성될 때까지 다 회수 투약량으로 투여될 수도 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 항체 조성물의 적용은 급성 질병, 예를 들어, 재관류 손상 또는 다른 외상성 손상의 치료를 위해 조성물의 단일 투여, 제한된 순서의 투여에 의해 수행될 수도 있다. 대안으로는, 조성물은 만성 질병, 예를 들어, 관절염 또는 건선의 치료를 위해 연장된 기간에 걸쳐 주기적으로 투여될 수도 있다.

본 발명에 사용된 MASP-2 억제 조성물은 렉틴 경로의 활성화를 일으키는 급성 이벤트 직후에 또는 이후 곧, 예를 들어, 허혈성 이벤트 및 허혈성 조직의 재관류 이후에 전달될 수도 있다. 예는 심근 허혈성 재관류 (myocardial ischemia reperfusion), 신장 허혈성 재관류 (renal ischemia reperfusion), 전뇌 허혈성 재관류 (cerebral ischemia reperfusion), 기관 이식 및 손(발)가락/손발 재부착 (digit/extremity reattachment)을 포함한다. 다른 급성 예는 패혈증 (sepsis)을 포함한다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 예를 들어렉틴 경로를 활성화하는 급성 이벤트 후 가능한 빨리, 바람직하게 이벤트의 촉발의 12시간 내에 및 더 바람직하게 두 시간 내지 세 시간 내에, 예를 들어, MASP-2 억제 조성물의 전신성 전달을 통해 투여될 수도 있다.

본 발명의 방법 및 조성물은 전형적으로 진단적 및 치료적 의료 방법 및 수술 절차로부터 발생하는 염증 및 관련 절차를 억제하기 위해 사용될 수도 있다. 이러한 절차를 억제하기 위해, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물이 수술시에 적용될 수도 있다. 여기에 사용된 바와 같이, "수술시에"는 수술 전에 및/또는 수술 중에 및/또는 수술 후에, 즉, 수술 전에, 수술 전에 및 중에, 수술 전에 및 후에, 수술 전이, 중에 및 후에, 수술 중에, 수술 중에 및 후에, 또는 수술 후에 억제 조성물의 투여를 나타낸다. 수술시 적용은 조성물의 수술 또는 수술 부위에 국부적 투여에 의해, 예를 들어, 주사 또는 부위의 연속적 또는 간헐성 관주법 또는 전신성 투여에 의해 수행될 수도 있다. MASP-2 억제 항체 용액의 국부적 수술시 전달에 적합한 방법은 ㅁ Demopulos의 미국 특허 번호 6,420,432 및 Demopulos의 6,645,168에 개시된다. MASP-2 억제 항체를 포함하는 연골 보호적 (chondroprotective) 조성물의 국부적 전달에 적합한 방법은 국제 PCT 특허 출원 WO　01/07067 A2에 개시된다. MASP-2를 포함하는 연골 보호적 조성물의 표적화된 전신성 전달에 적합한 방법 및 조성물은 국체 PCT 특허 출원 WO　03/063799　A2에 개시된다.

투약

MASP-2 억제 항체는 MASP-2 의존적 보체 활성화와 관련된 질병을 치료하거나 개선하기 위한 치료적 유효량으로 이들이 필요한 대상체에 투여될 수 있다. 치료적 유효량은 질병의 증상의 개선을 일으키는데 충분한 MASP-2 억제 항체의 양을 나타낸다.

MASP-2 억제 항체의 독성 및 치료적 효능은 여기에 설명된 바와 같이, 아프리카 사바나 원숭이와 같은, 실험적 동물 모델을 이용하는 표준 약학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 이러한 동물 모델을 사용하여, NOAEL (관찰된 부작용 수준 없음) 및 MED (최소 유효량)은 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. NOAEL 및 MED 효과 사이의 용량 비율은 치료적 비율이며, 비율 NOAEL/MED로서 표현된다. 큰 치료적 비율 또는 지수를 나타내는 MASP-2 억제 항체가 가장 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 사람에 사용되는 다양한 투약량을 조제하는데 사용될 수 있다. MASP-2 억제 항체의 투약량은 바람직하게 거의 또는 전혀 독성이 없는 MED를 포함하는 다양한 순환 농도 내에 있다. 투약량은 이용된 투약 형태 및 활용된 투여의 루트에 의존적으로 이 범위 내에서 다를 수도 있다.

어떤 화합물 제형에 대해서도, 치료적 유효량은 동물 모델을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 투여량은 MED를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 조제될 수도 있다. 혈장에서 MASP-2 억제 항체의 양적 수준이 또한, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수도 있다.

독성 연구 이외에, 유효량은 또한 살아있는 대상체에 존재하는 MASP-2 단백질의 양 및 MASP-2 억제 항체의 결합 친화도에 기초하여 추정될 수도 있다. 정상 사람 대상체에서 MASP-2 수준은 500　ng/ml의 범위의 낮은 수준으로 혈청에 존재하고, 특정 대상체에서 MASP-2 수준은 Moller-Kristensen M.,　et　al., J.　Immunol. Methods　282:159-167, 2003에 설명된 MASP-2에 대한 정량 검정을 사용하여 결정될 수 있으며, 본원에 참고로 포함된다.

일반적으로, MASP-2 억제 항체를 포함하는 투여된 조성물의 투약량은 대상체의 나이, 체중, 키, 성별, 일반적인 의학적 상태, 및 이전 병력과 같은 인자에 따라 다르다. 설명과 같이, MASP-2 억제 항체는 대상체 체중의 약　0.010 내지 10.0　mg/kg, 바람직하게　0.010 내지 1.0　mg/kg, 더 바람직하게　0.010 내지 0.1　mg/kg의 투약 범위에서 투여될 수 있다.

특정 대상체에서 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 치료적 효능 및 치료 방법, 및 적절한 투약량은 당업자에 의해 잘 알려진 보체 검정에 따라 결정될 수 있다. 보체는 많은 특이적 생성물을 생성한다. 지난 10년 동안, 예만하고 특이적인 검정들이 개발되었고 이들 활성화 생성물의 대부분에 대하여 상업적으로 이용 가능하며, 작은 활성화 단편 C3a, C4a, 및 C5a 및 큰 활성화 단편　iC3b, C4d, Bb, 및　sC5b-9를 포함한다. 이들 검정의 대부분은 단편에 노출되지만, 그것들이 형성되는 본래의 단백질에는 노출되지 않는 새로운 항원 (신항원)과 반응하는 항체를 이용하며, 이들 검정을 매우 단순하고 특이적으로 만든다. 대부분은 ELISA 기술에 의존하지만, 방사선면역검정이 C3a 및 C5a에 대해서는 여전히 가끔 사용된다. 이들 후자의 검정은 미가공된 단편 및 그것들의 'desArg' 단편 둘다를 측정하며, 이것은 순환에서 발견되는 대부분의 형태이다. 미가공된 단편 및 C5a_desArg는 세포 표면 수용체에 결합함으로써 신속하게 제거되고 이런 이유로 매우 낮은 농도로 존재하는 반면에, C3a_desArg는 세포에 결합하지 않고 혈장에 누적된다. C3a의 측정은 보체 활성화의 민감하고, 경로-독립적 지표를 제공한다. 대체 경로 활성화는 Bb 단편을 측정함으로써 평가될 수 있다. 막 공격 경로 활성화의 유체 단계 생성물,　sC5b-9의 검출은 보체가 완료될 때까지 활성화된다는 증거를 제공한다. 렉틴 및 고전적 경로 둘 다가 같은 활성화 생성물, 　C4a 및　C4d를 생성하기 때문에, 이들 두 개의 단편의 측정값은 이들 두 개의 경로 중 어느 하나가 활성화 생성물을 발생시키는지에 대한 어떤 정보도 제공하지 않는다.

MASP-2 의존적 보체 활성화의 억제는 본 발명에 따르는 항-MASP-2 항체의 투여의 결과로서 나타나는 보체 시스템의 성분의 다음 변화 중 적어도 하나를 특징으로 한다: MASP-2 의존적 보체 활성화 시스템 생성물 C4b, C3a, C5a 및/또는 C5b-9 (MAC)의 생성 또는 생산의 억제, C4 절단 및 C4b 침착의 감소, 또는 C3 절단 및 C3b 침착의 감소.

제조 물품

또 다른 양태에서, 본 발명은 여기에 설명된 바와 같이 1 mg 내지 5000 mg, 예를 들어, 1 mg 내지 2000 mg, 예를 들어, 1 mg 내지 1000 mg, 예를 들어, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 500 mg, 또는 1000 mg의 범위의 단위 투약량으로 사람 대상체에 치료적 투여에 적합한 단위 투약 형태로 사람 MASP-2 억제 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편을 함유하는 제조 물품을 제공한다. 일부 구체예에서, 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 이와 관련된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수도 있다. 용기는 질병의 치료에 유효한 조성물을 보유하고 있고 멸균 접근 포트를 가질 수도 있다 (예를 들어, 용기는 정맥 내 용액 가방 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 가진 바이알일 수도 있다). 조성물에서 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 MASP-2 억제 항체 또는 이들의 항원 결합 단편이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 특정 질병의 치료에 사용된다는 것을 나타낸다. 표지 또는 패키지 삽입물은 환자에 항체 조성물을 투여하기 위해 설명서를 추가로 포함할 것이다. 제조 물품 및 여기에 설명된 조합 치료를 포함하는 키트가 또한 고려된다.

항- MASP -2 억제 항체의 치료적 사용

또 다른 양태에서, 본 발명은 사람 대상체에서 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 상기 사람 대상체의 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하는데 충분한 양으로 본 발명의 사람 단클론성 항-MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 이 양태에 따라, 실시예 10에 설명된 바와 같이, 본 발명의 MASP-2 억제 항체는 정맥 내 투여 후에 아프리카 사바나 원숭이의 렉틴 경로를 억제할 수 있다. 표 24, 실시예 8에 나타난 바와 같이, 이 연구에 사용된 항체, OMS646은 사람 혈청에서 더 강한 것으로 발견되었다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 비-사람 영장류는 종종 항체 치료제를 평가하는 모델로서 사용된다.

미국 특허 번호　7,919,094, 동시계속 미국 특허 출원 일련 번호　13/083,441, 및 동시계속 미국 특허 출원 일련 번호 12/905,972에 설명된 바와 같이 (이것들 각각은 Omeros Corporation, 본 출원의 양수인에게 할당된다), MASP-2 의존적 보체 활성화는 MASP-2 의존적 보체 매개된 혈관 질환, 허혈성 재관류 손상, 아테롬성 동맥 경화증 (atherosclerosis), 염증성 위장 장애, 폐 질환, 체외 재관류 수술, 근골격 질환, 신장 질병, 피부 질환, 기관 또는 조직 이식, 신경계 장애 또는 손상, 혈액 장애, 비뇨생식기 질환, 당뇨병, 화학 요법 또는 방사선 요법, 악성 종양, 내분비계 장애, 응고 장애, 또는 안과 질환을 포함하는, 많은 급성 및 만성 질환 상태의 발병에 기여함으로써 연루되었고, 이것들 각각은 본원에 참고로 포함된다. 그러므로, 본 발명의 MASP-2 억제 항체는 상기 언급된 질환 및 질병을 치료하기 위해 사용될 수도 있다.

실시예 11에 더 설명된 바와 같이, 본 발명의 MASP-2 억제 항체는 급성 방사선 증후군의 부작용에 걸릴 위험이 있거나, 이로 고통받는 포유동물 대상체를 치료하는데 있어서 효과적이고, 그로 인해 생체 내 치료적 효능을 입증한다.

다음 실시예는 단지 본 발명을 실행하기 위해 현재 고려되는 최고의 방식을 설명하지만, 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

실시예 1

이 실시예는 재조합 발현 및 재조합 전체 길이 사람, 래트 및 쥐 MASP-2, MASP-2 유도된 폴리펩티드, 및 MASP-2의 촉매작용에 의해 불활성화된 돌연변이 형태의 단백질 생산을 설명한다.

전체 길이 사람 및 래트 MASP -2의 발현:

선도 서열을 갖는 사람 MASP-2 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 2)를 암호화하는, 사람 MASP-2 (SEQ ID NO: 1)의 전체 길이 cDNA 서열을 포유동물 발현 벡터 pCI-Neo (Promega)에 서브클로닝하였으며, 이것은 CMV 인핸서/프로모터 영역의 조절 하에 진핵세포 발현을 구동한다 (Kaufman R.J.　et　al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)에 설명됨). 선도 서열을 갖는 래트 MASP-2 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 5)을 암호화하는, 전체 길이 래트 MASP-2 cDNA (SEQ ID NO: 4)를 pED 발현 벡터에 서브클로닝하였다. MASP-2 발현 벡터를 Maniatis　et　al., 1989에 설명된 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정을 사용하여 부착된 중국 햄스터 난소 세포주 DXB1에 트랜스펙션하였다. 이들 구조로 트랜스펙션된 세포는 매우 느리게 자랐으며, 암호화된 프로테아제가 세포 독성이라는 것을 나타낸다. 사람 MASP-2 단백질 (SEQ ID NO: 3)의 성숙한 형태 및 래트 MASP-2 단백질 (SEQ ID NO: 6)의 성숙한 형태를 배양 배지로 분비하였고 하기 설명된 바와 같이 분리하였다.

전체 길이 촉매작용에 의한 불활성 MASP -2의 발현:

근거:

MASP-2는 전체적으로 렉틴으로 나타나는 인식 하위 성분 MBL, C-타입 렉틴 CL-11, 또는 피콜린 (L-피콜린, H-피콜린 또는 M-피콜린) 이후의 자가촉매적 절단에 의해 활성화되고, 그것들의 각각의 탄수화물 패턴에 결합한다. MASP-2의 활성화를 일으키는 자가촉매적 절단은 종종 재조합 발현 후에 혈청으로부터 MASP-2의 분리 과정 중에, 또는 정제 중에 발생한다. 항원으로 사용되는 더 안정한 단백질 조제물을 얻기 위해, MASP-2A로 지정된, MASP-2의 촉매작용에 의한 불활성 형태를 프로테아제 도메인의 촉매 트라이어드 (triad)에 존재하는 세린 잔기를 성숙한 래트 MASP-2 단백질의 알라닌으로 (SEQ ID NO: 6 Ser617 내지 Ala617); 또는 성숙한 사람 MASP-2 단백질의 알라닌으로 (SEQ ID NO: 3 Ser618 내지 Ala618) 대체함으로써 생성하였다.

촉매작용에 의한 불활성 사람 및 래트 MASP-2A 단백질을 생성하기 위해, 부위-관련 돌연변이 생성을 US2007/0172483에 설명된 바와 같이 수행하였으며, 본원에 참고로 포함된다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동 후 정제하였고 밴드 제조 및 단일 아데노신 중첩을 표준 테일링 (tailing) 방법을 사용하여 발생시켰다. 아데노신 테일링된 MASP-2A를 pGEM-T 이지 벡터 (easy vector)에 클로닝하였고, 이. 콜리 (E. coli)에 형질전환하였다. 사람 및 래트 MASP-2A를 하기 설명된 바와 같이 포유동물 발현 벡터 pED 또는 pCI-Neo에 각각 추가로 서브클로닝하였고 중국 햄스터 난소 세포주 DXB1에 트랜스펙션하였다.

사람 MASP -2로부터 유도된 폴리펩티드 영역을 함유하는 발현 플라스미드의 구조.

MASP-2의 다양한 도메인을 분비하기 위해 다음 구조를 MASP-2 신호 펩티드 (SEQ ID NO: 2의 잔기 1-15)를 사용하여 생성하였다. 사람 MASP-2 CUBI 도메인 (SEQ ID NO: 7)을 발현하는 구조는 MASP-2 (SEQ ID NO: 3)의 잔기 1-121을 암호화하는 영역 (N-말단 CUB1 도메인에 해당)을 PCR 증폭함으로써 만들어졌다. 사람 MASP-2 CUBI/EGF 도메인 (SEQ ID NO: 8)을 발현하는 구조는 MASP-2 (SEQ ID NO: 3)의 잔기 122-166을 암호화하는 영역 (N-말단 CUB1/EGF 도메인에 해당)을 PCR 증폭함으로써 만들어졌다. 사람 MASP-2 CUBI/EGF/CUBII 도메인 (SEQ ID NO: 9)을 발현하는 구조는 MASP-2 (SEQ ID NO: 3)의 잔기 1-277을 암호화하는 영역 (N-말단 CUBIEGFCUBII 도메인에 해당)을 PCR 증폭함으로써 만들어졌다. 사람 MASP-2 EGF 도메인 (SEQ ID NO: 10)을 발현하는 구조는 MASP-2 (SEQ ID NO: 3)의 잔기 122-166을 암호화하는 영역 (EGF 도메인에 해당)을 PCR 증폭함으로써 만들어졌다. 사람 MASP-2 CCPI/CCPII/SP 도메인 (SEQ ID NO: 11)을 발현하는 구조는 MASP-2 (SEQ ID NO: 3)의 잔기 278-671을 암호화하는 영역 (CCPI/CCPII/SP 도메인에 해당)을 PCR 증폭함으로써 만들어졌다. 사람 MASP-2 CCPI/CCPII 도메인 (SEQ ID NO: 12)을 발현하는 구조는 MASP-2 (SEQ ID NO: 3)의 잔기 278-429를 암호화하는 영역 (CCPI/CCPII 도메인에 해당)을 PCR 증폭함으로써 만들어졌다. MASP-2의 CCPI 도메인 (SEQ ID NO: 13)을 발현하는 구조는 MASP-2 (SEQ ID NO: 3)의 잔기 278-347을 암호화하는 영역 (CCPI 도메인에 해당)을 PCR 증폭함으로써 만들어졌다. MASP-2의 CCPII/SP 도메인 (SEQ ID NO: 14)을 발현하는 구조는 MASP-2 (SEQ ID NO: 3)의 잔기 348-671을 암호화하는 영역 (CCPII/SP 도메인에 해당)을 PCR 증폭함으로써 만들어졌다. MASP-2의 CCPII 도메인 (SEQ ID NO: 15)을 발현하는 구조는 MASP-2 (SEQ ID NO: 3)의 잔기 348-429을 암호화하는 영역 (CCPII 도메인에 해당)을 PCR 증폭함으로써 만들어졌다. MASP-2의 SP 도메인 (SEQ ID NO: 16)을 발현하는 구조는 MASP-2 (SEQ ID NO: 3)의 잔기 429-671을 암호화하는 영역 (SP 도메인에 해당)을 PCR 증폭함으로써 만들어졌다.

상기 언급된 MASP-2 도메인을 Vent_R 폴리머라제 및 주형으로서 pBS-MASP-2를 사용하는 PCR에 의해 증폭하였다. 센스 프라이머의 5' 프라이머 서열는 PCR 생성물의 5' 끝에서 BamHI 제한 부위 (밑줄 그어짐)를 도입하였다. 각각의 MASP-2 도메인에 대한 안티센스 프라이머를 각 PCR 생성물의 끝에 종결 코돈에 이어 EcoRI 부위를 도입하도록 설계하였다. 증폭되면, 움 단편을 BamHI 및 EcoRI으로 분해하였고 pFastBac1 벡터의 해당 부위에 클로닝하였다. 결과의 구조는 제한 매핑 (mapping)을 특징으로 하였고 dsDNA 시퀀싱에 의해 확인되었다.

MASP -2의 재조합 진핵세포 발현 및 효소적 불활성 래트 및 사람 MASP -2A의 단백질 생산

상기 설명된 MASP-2 및 MASP-2A 발현 구조를 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정을 사용하여 DXB1 세포에 트랜스펙션하였다 (Maniatis　et　al., 1989). MASP-2A를 조제물이 다른 혈청 단백질로 오염되지 않았다는 것을 보장하기 위해 혈청이 없는 배지에서 생산하였다. 배지를 이틀마다 융합성 세포로부터 수확하였다 (총 네 번). 재조합 MASP-2A의 수준은 각각 두 종에 대하여 배양물의 대략 1.5 mg/리터를 평균으로 하였다.

MASP -2A 단백질 정제: MASP-2A (상기 설명된 Ser-Ala 돌연변이)를 MBP-A-아가로스 컬럼 상의 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이 계획은 관련없는 태그를 사용하지 않고 신속한 정제를 가능하게 했다. MASP-2A (동량의 로딩 버퍼 (50　mM Tris-Cl, pH　7.5, 150　mM NaCl 및 25　mM CaCl₂를 함유)로 희석된 배지의 100-200　ml)를 10 ml의 로딩 버퍼로 사전 평형화된 MBP-아가로스 친화도 컬럼 (4　ml)에 로딩하였다. 10 ml의 로딩 버퍼로 세척한 후, 단백질을 용출하였다. 1.25 M NaCl 및 10　mM EDTA를 함유하는 50　mM Tris-Cl, pH　7.5로 1 ml 분획에 용출하였다. MASP-2A를 함유하는 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 필요한 경우, MASP-2A를 MonoQ 컬럼 (HR 5/5)에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 단백질을 50　mM NaCl을 함유하는 50　mM Tris-Cl pH　7.5로 투석하였고 같은 버퍼로 평형화된 컬럼에 로딩하였다. 세척 후, 결합된 MASP-2A를 10 ml에 걸쳐 0.05-1 M NaCl 구배로 용출하였다.

결과: MASP-2A 단백질의 0.25-0.5 mg의 수득율을 200 ml의 배지로부터 얻었다. MALDI-MS에 의해 결정된 77.5 kDa의 분자량은 글리코실화로 인해 변형되지 않은 폴리펩티드의 계산 값 (73.5　kDa)보다 더 크다. 각각의 N-글리코실화 부위에서 글리칸의 부착은 관찰된 질량을 설명한다. MASP-2A는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 단일 밴드로 이동하며, 그것이 생합성 중에 단백질 가수분해에 의해 가공되지 않는다는 것을 입증한다. 평형 초원심분리에 의해 결정된 중량-평균 분자량은 글리코실화된 폴리펩티드의 호모다이머에 대한 계산값과 일치한다.

실시예 2

이 실시예는 친화도 성숙화로 진행하는 MASP-2 기능적 활성을 차단하는 고 친화도 완전한 사람 항-MASP-2 scFv 항체 후보를 확인하기 위해 사용된 스크리닝 방법을 설명한다.

배경 및 근거:

MASP-2는 많은 별도의 기능적 도메인을 가진 복합성 단백질이며, 다음을 포함한다: MBL 및 피콜린에 대한 결합 부위(들), 세린 프로테아제 촉매점, 단백질 가수분해 기질 C2에 대한 결합 부위, 단백질 가수분해 기질 C4에 대한 결합 부위, MASP-2 치모겐의 자가활성화를 위한 MASP-2 절단 부위, 및 두 개의 Ca⁺⁺ 결합 부위. scFv 항체 단편이 높은 친화도로 MASP-2에 결합한다는 것을 확인하였고, 확인된 Fab2 단편을 그것들이 MASP-2 기능적 활성을 차단할 수 있는지 결정하기 위해 기능적 검정에서 테스트하였다.

MASP-2 기능적 활성을 차단하기 위해, 항체 또는 scFv 또는 Fab2 항체 단편은 MASP-2 기능적 활성이 필요한 구조적 에피토프에 결합하여 이것을 방해해야 한다. 그러므로, 고 친화도 결합 항-MASP-2 scFvs 또는 Fab2s 중 다수 또는 모두는 그것들이 MASP-2 기느적 활성에 직접적으로 수반되는 MASP-2 상의 구조적 에피토프에 결합하징 않으면 MASP-2 기능적 활성을 억제하지 않을 수도 있다.

렉틴 경로 C3 콘버타제 형성의 억제를 측정하는 기능적 검정을 항-MASP-2 scFv의 "차단 활성"을 평가하기 위해 사용하였다. 렉틴 경로에서 MASP-2의 주요 생리학적 역할이 렉틴-매개된 보체 경로, 즉, 렉틴 경로 C3 콘버타제의 다음 기능적 성분을 발생시키는 것으로 알려져 있다. 렉틴 경로 C3 콘버타제는 단백질 가수분해에 의해 C3를 C3a 및 C3b로 분열시키는 중요한 효소 복합체 (C4b2a)이다. MASP-2는 렉틴 경로 C3 콘버타제 (C4b2a)의 구조 성분이 아니다; 하지만, MASP-2 기능적 활성은 렉틴 경로 C3 콘버타제를 포함하는 두 개의 단백질 성분 (C4b, C2a)을 생성하기 위해 필요하다. 게다가, 상기 나열된 MASP-2의 별개의 기능적 활성 모두는 MASP-2가 렉틴 경로 C3 콘버타제를 생성하기 위해 필요한 것으로 나타난다. 이들 이유에 대하여, 항-MASP-2 Fab2 및 scFv 항체 단편의 "차단 활성"을 평가하는데 사용된 바람직한 검정은 렉틴 경로 C3 콘버타제 형성의 억제를 측정하는 기능적 검정인 것으로 생각된다.

사람에 1 mg/kg의 투여 후 생체 내에서 >90% 렉틴 경로 제거를 수득하는 것으로 예상된 치료적 항-MASP-2 항체에 대한 표적 프로파일은 90% 혈장에서 <5 nM인 IC₅₀이다. 이들 검정 포맷에서 시험관 내 약학적 활성 및 생체 내 약물동력학 사이의 관계를 항-설치류 MASP-2 항체를 사용하여 실험적으로 입증하였다.

치료적으로 사용되는 제 1 세대 MASP-2 차단 항체의 선택에 대한 기준은 다음과 같았다: MASP-2에 대한 높은 친화도 및 최대 ~25 nM의 기능적 IC₅₀ 값. 게다가, 후보를 비-사람 영장류 혈청, 및 래트 혈청과 교차 반응성에 대하여 스크리닝하였다.

방법:

MASP -2 항원에 대한 scFv 파지미드 ( phagemid ) 라이브러리의 스크리닝

항원:

N-말단 5X His 태그를 가진 사람 MASP-2A, 및 N-말단 6X His 태그를 가진 래트 MASP-2A를 실시예 1에 설명된 시약을 사용하여 생성하였고 이전에 설명된 바와 같이, 니켈-친화도 크로마토그래피에 의해 배양 상층액으로부터 정제하였다 (Chen et al., J. Biol . Chem . 276:25894-02 (2001)).

OMS100, Fab2 포맷의 사람 항-MASP-2 항체를 MASP-2에 결합하는 양성 대조군으로 사용하였다.

파지미드 라이브러리 설명:

사람 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열의 파지 디스프르레이 라이브러리는 항원 패닝 후 이어서 래트 MASP-2 단백질 및 사람 MASP-2 단백질에 대한 고 친화도 scFv 항체를 확인하기 위해 자동화된 항체 스크리닝 및 선택을 받았다.

패닝 방법:

개요: 두 개의 패닝 계획을 사용하여 총 세 라운드의 패닝에서 MASP-2에 결합된 파지미드 라이브러리로부터 파지를 분리하였다. 두 계획은 용액에서 패닝 단계 및 MASP-2에 결합된 파지를 찾아내는 단계를 수반하였다. MASP-2를 His-태그를 통해 (NiNTA 비드를 사용하여) 또는 표적 상의 비오틴을 통해 (스트렙타비딘 비드를 사용하여) 마그네틱 비드에 고정하였다

처음 두 번의 패닝 라운드는 알칼린 용출 (TEA)을 수반하였고, 세 번째 패닝 라운드를 통상적인 알칼린 (TEA) 용출 단계 전에 MBL로 처음으로 완벽히 용출하였다. 음성 선택을 라운드 2 및 3 전에 수행하였고, 이것은 고전적 보체 경로의 기능적 유사체 C1s 및 C1r에 대한 것이었다. 패닝 후, MASP-2A에 대하여 scFv 단편을 가진 파지의 특이적 농축을 관찰하였고, 패닝 계획이 성공적이었다는 것이 결정되었다 (데이터 미도시).

하기 추가로 설명된 바와 같이 패닝 라운드 3의 scFv 유전자를 pHOG 발현 벡터에 클로닝하였고 MASP-2A에 대한 특이적 클론을 찾기 위해 소규모 필터 스크리닝에서 수행하였다.

표 7: 파지 패닝 방법 (비오틴/스트렙타비딘)

표 8: 파지 패닝 방법 (HIS/NiNTA)

패닝 시약:

사람 MASP-2A

OMS100 항체 (양성 대조군)

염소 항-사람 IgG (H+L) (Pierce #31412)

NiNTA 비드 (Qiagen #LB13267)

Dynabeads® M-280 스트렙타비딘, 10 mg/ml (LB12321)

정상 사람 혈청 (LB13294)

다클론성 토끼 항-사람 C3c (LB13137)

염소 항-토끼 IgG, HRP (American Qualex #A102PU)

태그된 MASP-2A 항원을 테스트하기 위해, 각각 비오틴-태그된 MASP-2A 또는 HIS-태그된 MASP-2A 항원 (10 μg), 4% 탈지유 PBS 또는 200 μl 스트렙타비딘 비드 중의 50 μl NiNTA 비드와 함께 사전 배양된 양성 대조군 OMS100 항체 (200 ng/ml)를 캡쳐하는 실험을 수행하였다. 결합된 MASP-2A-OMS100 항체를 염소-항-사람 IgG (H+L) HRP (1:5000) 및 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 기질로 검출하였다.

NiNTA 비드 ELISA 검정

50 μl NiNTA 비드를 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) 중의 1 ml 4% 탈지유로 차단하였고 상온에서 1시간 동안 회전 바퀴에서 배양하였다. 유사하게, 10 μg의 MASP-2A 및 OMS100 항체 (4% 탈지유-PBS에서 200 ng/ml로 희석됨)를 한 시간 동안 사전 배양하였다. 비드를 각 단계 사이에 마그넷을 사용하여 1 ML PBS-T로 세 번 세척하였다. OMS100 항체와 함께 사전 배양된 MASP-2A를 세척된 비드에 추가하였다. 혼합물을 상온에서 1시간 동안 회전 바퀴에서 배양하였고, 상기 설명된 바와 같이 마그넷을 사용하여 1 ml PBS-T로 세 번 세척하였다. 튜브를 PBS 중의 4% 탈지유에 1:5000으로 희석된 염소 항-사람 IgG (H+L) HRP와 함께 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 음성 대조군을 위해, 별도의 튜브에서 염소-항-사람 IgG (H+L) HRP (1:5000)를 추가하여 Ni-NTA 비드를 세척하고 차단하였다.

샘플을 회전 바퀴에서 상온에서 1시간 동안 배양하였고 상기 설명된 바와 같이 마그넷을 사용하여 1 ml PBS-T로 세 번 및 1x PBS로 한번 세척하였다. 100 μl TMB 기질을 추가하였고 상온에서 3분 동안 배양하였다. 튜브를 비드를 농축하기 위해 마그네틱 랙 (rack)에 2분 동안 배치하였고 TMB 용액을 미세적정 플레이트로 옮겼고 반응을 100 μl 2M H₂SO₄로 중단하였다. 450nm에서 흡광도를 ELISA 리더로 측정하였다.

스트렙타비딘 비드 ELISA 검정

NiNTA 비드 ELISA 검정에 대하여 상기 설명된 바와 같이, 하지만 대신에 샘플당 200 μl 스트렙타비딘 비드, 및 비-비오티닐화된 항원을 사용하여 이 검정을 수행하였다.

결과: 양성 대조군 OMS100 항체와 함께 사전 배양된 His-태그된 및 비오틴-태그된 MASP-2A 항원을 각각 NiNTA 비드, 또는 스트렙타비딘 비드로 성공적으로 캡쳐하였다.

패닝

HIS-태그된 또는 비오틴-태그된 MASP-2A에 대한 scFv 파지 라이브러리의 세 라운드의 패닝을 각각 표 7 또는 표 8에 나타난 바와 같이 수행하였다. 패닝의 제 3 라운드를 처음에 MBL로 용출하였고, 이후에 TEA (알칼린)으로 용출하였다. 표적 MASP-2A에 대한 scFv 단편을 나타내는 파지의 특이적 농축을 관찰하기 위해, 고정된 MASP-2A에 대한 다클론성 파지 ELISA를 하기 설명된 바와 같이 수행하였다.

패닝 후 농축된 다클론성 파지에서 MASP -2A ELISA

상기 설명된 바와 같이 사람 MASP-2에 대한 scFv 파지 라이브러리의 세 라운드의 패닝 후, 하기 설명된 바와 같이 표적 MASP-2A에 대하여 scFv 단편을 가진 파지의 특이적 농축을 고정된 MASP-2A에 대한 패닝에 의해 발생한 농축된 다클론성 파지 집단에서 ELISA 검정을 수행함으로써 관찰하였다.

방법:

5 ng/ml MASP-2A를 4 ℃에서 하룻밤 동안 PBS에서 maxisorp ELISA 플레이트에 고정하였다. 모든 세 번의 패닝 라운드의 포장된 파지를 4% 탈지유-PBS로 1:3으로 희석하였고 3배 희석으로 적정하였다. 음성 대조군은 M13 헬퍼 (helper) 파지였다.

차단은 PBS 중의 4% 탈지유였다. 플레이트를 매 단계 사이에 200 μl PBS-Tween 0.05 부피%로 세 번 세척하였다. 1차 항체는 4 중량% 탈지유-PBS로 1:5000으로 희석된 토끼 α-fd (M13 코트 (coat) 단백질)였다. 콘쥬게이트 (conjugate)는 4 중량% 탈지유-PBS로 1:10,000으로 희석된 토끼 α-염소 HRP였다. 기질은 ABTS였다. 세척 및 차단을 제외한 모든 부피는 100 μl/웰이었다. 모두를 상온에서 흔들면서 1시간 동안 배양하였다.

결과:

파지 ELISA의 결과는 패닝 계획에 대하여 MASP-2A에 대한 scFv의 특이적 농축을 나타낸다. 도 2를 참고하면 된다. 도 2에 나타난 바와 같이, NiNTA 마그네틱 비드에 의한 캡쳐를 수반하는 계획은 두 라운드의 패닝 후 MASP-2A에 대하여 파지에서 scFv의 농축을 제공하는 반면에, 세 라운드의 패닝 후, 두 계획은 경쟁적 및 TEA 용출 둘 다에서 좋은 농축을 가졌다. 음성 대조군 파지는 M13 헬퍼 파지였으며, 그것의 가장 낮은 희석에서 MASP-2A에 대한 교차 반응을 나타내지 않았다. 이들 결과는 관찰된 신호가 MASP-2A에 특이적으로 결합하는 scFv 때문이라는 것을 입증한다.

필터 스크리닝:

세 라운드의 패닝으로부터 scFv 단편을 암호화하는 플라스미드를 함유하는 박테리아 콜로니를 골랐고, 니트로셀룰로스 막에 그리드화하였고 기준판을 생산하기 위해 비-유발 배지에서 하룻밤 동안 키웠다. 세 번째 패닝 라운드에서 총 18,000개의 콜로니를 골랐고 경쟁적 용출에서 반 및 이후의 TEA 용출에서 반을 분석하였다.

박테리아 콜로니가 있는 니트로셀룰로스 막을 IPTG로 유발하여 가용성 scFv 단백질을 발현하고 분비하였고 PBS 중의 5% 탈지유 (차단 용액)로 코팅된 평행 막과 함께 MASP-2A 항원으로 코팅된 제 2 니트로셀룰로스 막과 접촉되었다.

MASP-2A에 결합된 ScFv를 마우스 α-cMyc mAb 및 토끼 α-마우스 HRP와 함께 그것들의 c-Mys 태그를 통해 검출하였다. MASP-2A에 양성이고 탈지유-PBS에 음성인 scFv 클론에 해당하는 히트를 추가의 발현, 및 이후의 ELISA 분석에 대하여 선택하였다.

결과: MASP-2A에 대한 scFv 파지미드 라이브러리의 패닝 후 이어서 scFv 전환 및 필터 스크린은 137개의 양성 클론을 수득하였다. 대부분의 양성 클론은 MBL로 경쟁적 클론으로부터 생겼으며, NiNTA 및 스트렙타비딘 계획을 사용한다. 모든 양성 클론은 소량의 발현 (200 μl 규모) 및 이후의 추출을 계속하였다. ScFv를 박테리아 현탁액을 수크로스 용해 버퍼 및 리소자임과 함께 한 시간 동안 배양함으로써 박테리아의 주변 세포질로부터 분리하였으며, 이후에 상층액을 원심분리 단계에 의해 분리하였다. 하기 더 상세히 설명된 바와 같이, 주변 세포질의 내용물과 함께 배지로 분비된 scFv를 함유하는 상층액을 두 개의 검정에 의해 분석하였다: 물리적으로 흡착된 MASP-2A를 사용하는 ELISA, 및 Biocore 상의 CM5 칩에 아민 커플링된 MASP-2Afmf 사용하는 결합 분석.

패닝 / scFv 전환 및 필터 스크리닝에 의해 확인된 ScFv 후보 클론에서 MASP-2A ELISA

방법:

4 μg/ml MASP-2A를 4 ℃에서 하룻밤 동안 PBS 중의 maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc)에 고정하였다. 그 다음날, 플레이트를 PBS-Tween (0.05%)로 세 번 세척함으로써 차단하였다. 137개의 scFv 후보 (상기 설명된 바와 같이 발생함) 각각의 미가공 scFv 물질 (100 μl 배지-주변 세포질 추출물)을 플레이트에 웰 마다 추가하였다. 다음에, 항-cMyc를 추가하였고, 최종 단계에서 HRP-콘쥬게이션된 토끼 항-마우스를 적용하여 결합된 scFv를 검출하였다. 반응은 퍼옥시다제 기질 1-단계 ABTS (Calbiochem)에서 전개하였다. 양성 대조군은 PBS-Tween 0.05%의 10 μg/ml에 희석된 OMS100 (Fab2 포맷의 항-MASP-2 항체)였다. 음성 대조군은 플라스미드가 없는 XL1-Blue의 배지-주변 세포질이었다.

3x 200 μl PBS-Tween 0.05 중량%의 세척을 매 단계 사이에 수행하였다.

1차 항체는 PBS-Tween 0.05 부피%에 1:5000으로 희석된 쥐 α-cMyc였다.

콘쥬게이트는 PBS-Tween 0.05 부피%에서 1:5000의 토끼 α-염소-HRP 또는 염소 항-사람 IgG (H+L, Pierce 31412)였다. 기질은 ABTS였고, 상온에서 15분 동안 배양하였다. 세척 및 차단을 제외한 모든 부피는 100 μl/웰이었다. 모두 상온에서 흔들면서 1시간 동안 배양하였다.

결과: 108/137 클론은 이 ELISA 검정에서 양성이었으며 (데이터 미도시), 이것들 중 45개의 클론을 하기 설명된 바와 같이 추가로 분석하였다. 양성 대조군은 PBS-Tween의 10 μg/ml에 희석된 OMS100 Fab2였고, 이 클론은 양성이었다. 음성 대조군은 플라스미드가 없는 XL1-Bluedml 배지-주변 세포질이었으며, 이것은 음성이었다.

실시예 3

이 실시예는 고 친화도 완전한 사람 항-MASP-2 scFv 항체 후보를 정상 사람 혈청에서 MASP-2 활성을 차단하는 능력에 대하여 분석하기 위해 사용된 MASP-2 기능적 스크리닝 방법을 설명한다.

근거/배경

렉틴 경로 C3 콘버타제의 형성의 억제를 측정하는 검정:

렉틴 경로 C3 콘버타제 형성의 억제를 측정하는 기능적 검정을 항-MASP-2 scFv 후보 클론의 "차단 활성"을 평가하기 위해 사용하였다. 렉틴 경로 C3 콘버타제는 C3을 두 개의 강한 전염증성 단편, 아나필라톡신 C3a 및 옵소닌 C3b로 단백질 가수분해에 의해 분열시키는 효소 복합체 (C4b2a)이다. C3 콘버타제의 형성은 염증의 매개에 관하여 렉틴 경로의 주요 단계에 나타난다. MASP-2는 렉틴 경로 C3 콘버타제 (C4b2a)의 구조적 성분이 아니다; 그러므로 항-MASP-2 항체 (또는 Fab2)는 기존의 C3 콘버타제의 활성을 직접적으로 억제하지 않을 것이다. 하지만, MASP-2 세린 프로테아제 활성은 렉틴 경로 C3 콘버타제를 포함하는 두 개의 단백질 성분 (C4b, C2a)을 발생시키기 위해 필요하다. 그러므로, MASP-2 기능적 활성을 억제하는 (즉, 항-MASP-2 scFv를 차단하는) 항-MASP-2 scFv는 렉틴 경로 C3 콘버타제의 데 노보 (de novo) 형성을 억제할 것이다. C3는 그것의 구조의 일부로서 특이하고 매우 반응성인 티오에스테르 기를 함유한다. 이 검정에서 C3 콘버타제에 의한 C3의 절단시, C3b 상의 티오에스테르 기는 에스테르 또는 아미드 결합을 통해 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 거대 분자의 히드록실 또는 아미노기와 공유 결합을 형성할 수 있고, 따라서 ELISA 검정에서 C3bDML 검출을 가능하게 한다.

효모 만난은 렉틴 경로의 알려진 활성화제이다. C3 콘버타제의 형성을 측정하는 다음 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 렉틴 경로를 활성화하기 위해 희석된 사람 혈청과 함께 배양하였다. 웰을 세척하였고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰에 고정된 C3bDP 대하여 검정하였다. 이 검정에서 발생한 C3b의 양은 렉틴 경로 C3 콘버타제의 데 노보 형성의 직접적인 반영이다. 선택된 농도의 항-MASP-2 scFv를 그것들의 C3 콘버타제 형성 및 이후의 C3B 발생을 억제하는 능력에 대하여 이 검정에서 테스트하였다.

방법:

실시예 2에 설명된 바와 같이 확인된 45개의 후보 클론을 발현시켰고, 정제하였고 같은 스톡 (stock) 농도로 희석하였으며, 이것을 모든 클론이 같은 양의 버퍼를 가진다는 것을 확인하기 위해 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 버퍼 (4.0 mM 바비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂, 2.0 mM CaCl₂, 0.1% 겔atin, pH 7.4)에 다시 희석하였다. scFv 클론을 2 μg/ml의 농도에서 3배수로 각각 테스트하였다. 양성 대조군은 OMS100 Fab2였고 0.4 μg/ml로 테스트하였다. scFv/IgG 클론의 존재 및 부재시 C3c 형성을 관찰하였다.

만난을 50 mM 카르보네이트 버퍼 (15 mM Na₂CO₃ + 35 mM NaHCO₃ + 1.5 mM NaN₃), pH 9.5에서 20 μg/ml (1 μg/웰)의 농도로 희석하였고 4 ℃에서 하룻밤 동안 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 그 다음날, 만난 코팅된 플레이트를 200　μl PBS로 세 번 세척하였다. 1% HSA 차단 용액의 100 μl를 웰에 추가하였고 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 200 μl PBS로 세 번 세척하였고, 샘플을 추가할 때까지 200 μl PBS와 함께 얼음 위에 저장하였다.

정상 사람 혈청을 CaMgGVB 버퍼에서 0.5%로 희석하였고, scFv 클론 또는 OMS100 Fab2 양성 대조군을 이 버퍼에 0.01 μg/ml; 1 μg/ml (단지 OMS100 대조군) 및 10 μg/ml로 세 번 추가하였고 차단된 ELISA 플레이트에 추가 전에 얼음 위에서 45분 사전 배양하였다. 반응은 37 ℃에서 한 시간 동안 배양에 의해 시작되었고 얼음이 담긴 그릇에 플레이트를 옮김으로써 중단되었다. C3b 침착을 토끼 α-마우스 C3c 항체에 이어 염소 α-토끼 HRP로 검출하였다. 음성 대조군은 항체가 없는 버퍼였고 (OMS100 없음 = 최대 C3b 침착), 양성 대조군은 EDTA가 있는 버퍼였다 (C3b 침착 없음). 같은 검정을 수행하였지만, 만난 음성 웰에서 배경을 결정하였다. 만난이 없는 플레이트에 대한 배경 신호를 만난 양성 신호에서 뺐다. 컷-오프 (cut-off) 기준을 무관한 scFv 클론 (VZV) 및 버퍼 단독의 활성의 절반으로 설정하였다.

결과: 컷-오프 기준에 기초하여, 총 13개의 클론은 도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이 MASP-2의 활성을 차단하는 것으로 발견되었다. 표 9에 설명된 바와 같이, > 50% 경로 억제를 생성하는 13개의 클론 모두를 선택하였고 시퀀싱하였으며, 10개의 독특한 클론을 수득하였다. 표 9에 나타난 10개의 다른 클론은 보체 검정에서 허용 가능한 기능적 활성을 일으키는 것으로 발견되었다. 열 개의 클론 모두는 같은 경쇄 하위 단계, λ3을 갖지만, 세 개의 다른 중쇄 하위 단계, VH2, VH3 및 VH6을 갖는 것으로 발견되었다. 생식세포 서열과 클론의 서열 동일성은 또한 표 9에 나타난다.

표 9: 기능적 GD-MASP-2 활성을 가진 10개의 독특한 클론

상기 표 9에 나타난 바와 같이, 허용 가능한 기능적 활성 및 독특한 서열을 가진 10개의 다른 클론을 추가의 분석을 위해 선택하였다. 표 9에 지적된 바와 같이 클론 중 일부는 동일한 서열에 기초하여, 두 번 또는 세 번 검출되었다 (클론 이름이 적힌 표 9의 첫 번째 컬럼을 참고하면 된다)

10개의 scFv 후보 클론의 발현 및 정제

표 9에 나타난 열 개의 후보 클론을 1리터 규모로 발현시켰고 니켈 크로마토그래피에서 이온 교환을 통해 정제하였다. 그 후 각 클론의 샘플을 모노머 및 다이머 함량을 평가하기 위해 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에서 실행하였다. 하기 표 10에 나타난 바와 같이, 거의 모든 scFv 클론은 모노머 형태로 존재하였고 이 모노머 분획을 추가의 테스트 및 순위를 위해 분리하였다.

표 10: 모노머 함량의 분석

결합 및 기능적 활성에 대한 모노머 분획의 테스트

표 10에 나타난 클론을 1 L 규모로 발현시켰고, 금속 크로마토그래피 및 이온 교환에서 정제하였고, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 모노머 분획으로 분리하였고 기능적 검정을 IC₅₀ 값 및 교차 반응성을 결정하기 위해 반복하였다.

모노머 분획에 대한 기능적 검정:

표 10에 나타난 상위 열 개의 클론의 모노머 분획을 정제하였고 칼슘 및 마그네슘이 들어있는 GVB 버퍼 및 사람 혈청의 같은 농도를 받는 희석 단계에서 기능적 IC₅₀ nM에 대하여 테스트하였다. scFv 클론을 12번의 희석으로 세 번 테스트하였다. 양성 대조군은 OMS100 Fab2였다. C3b 침착을 항체의 존재 및 부재시 관찰하였다. 결과는 하기 표 11에 나타난다.

결합 검정:

열 개의 후보 scFv 클론의 정제된 모노머 분획에 대한 결합 친화도 K_D를 두 개의 다른 방법으로 결정하였다. MASP-2A를 CM5 칩에 커플링된 아민에 의해 고정하거나, 고정된 농도의 scFv (50 nM)를 높은 친화도 α-cMyc 항체와 커플링된 아민으로 먼저 캡쳐하였고, 다음에 용액에서 MASP-2ADML 농도 단계를 칩을 통해 전달하였다. 결과는 하기 표 11에 나타난다.

결과:

표 11: 모노머 상태에서 검정된 열 개의 후보 scFv 클론에 대한 기능적 억제 활성 (IC₅₀) 및 MASP-2 결합 친화도 (K_D)의 요약

결과의 논의:

표 11에 나타난 바와 같이, 기능적 검정에서, 열 개의 scFv 클론 중 다섯 개는 0.5% 사람 혈청을 사용하여 25 nM 표적 기준보다 낮은 IC₅₀ nM 값을 제공하였다. 하기 설명된 바와 같이, 이들 클론을 다른 종에서 기능적 활성을 결정하기 위해비-사람 영장류 혈청 및 래트 혈청의 존재시 추가로 테스트하였다. 결합 친화도에 관하여, 용액에서, 모든 결합 친화도는 낮은 nM의 범위에 있거나 더 좋은 반면에, 고정된 MASP-2로 통상적인 검정에서, 두 개의 클론 (4D9 및 17D20)만이 낮은 nM 범위의 친화도를 가졌다. 검정에 기초하여 용액에서 더 높은 친화도의 관찰은 항원이 용액에서 멀티머화된다는 사실의 결과일 것이다. 또한, 표적이 칩에 고정될 때 (방향 조정된 커플링을 통해) 에피토프를 가릴 수도 있고, 그로 인해 고정된 검정에서 관찰된 친화도를 감소시킨다.

실시예 4

이 실시예는 래트 MASP-2와 교차 반응성에 대하여 열 개의 후보 사람 항-MASP-2 scFv 클론의 테스트 및 사람 혈청, 비-사람 영장류 혈청, 및 래트 혈청에서 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하는 그것들의 능력을 결정하는 기능적 검정에서 사람 혈청 이들 scFv 클론의 IC₅₀ 값의 결정의 결과를 설명한다.

방법:

래트 MASP-2와 교차 반응성

실시예 3의 표 9에 나타난 열 개의 후보 scFv 클론을 흡착된 래트 MASP-2A에 대한 통상적인 ELISA 검정에서 래트 MASP-2A에 대한 교차 반응성에 대하여 테스트하였다. 래트 MASP-2A를 PBS에서 4 μg/ml로 희석하였고 4 ℃에서 하룻밤 동안 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc)에 코팅하였다. 그 다음날, 플레이트를 PBS-Tween (0.05%)에서 세 번 세척함으로써 차단하였다. PBS-Tween에서 20 μg/ml으로 희석된 ScFv 클론 (100 μl)을 플레이트에 추가하였고, 4배 희석으로 세 번 추가로 적정하였다. MASP-2A 특이적 svFc 클론 (결합된 scFv를 함유하는 웰)을 항-cMyc 및 토끼 항-마우스 HRP 2차 항체로 검출하였다. 반응을 퍼옥시다제 기질 TMB (Pierce)에서 전개하였다. 양성 대조군은 PBS-Tween에서 10 μg/ml로 희석된 OMS100 Fab2였다. 테스트된 클론 모두는 래트 MASP-2A와 교차 반응을 나타냈으며, 이것은 2차 패닝 라운드가 래트 MASP-2였기 때문인 것으로 예상되었다 (데이터 미도시).

사람 혈청, 비-사람 영장류 ( NHP ) 혈청 및 래트 혈청에서 열 개의 후보 scFv 클론의 기능적 특성

다른 혈청에서 기준 C3c 수준의 결정

먼저, 실험을 세 개의 혈청 (사람, 래트 및 NHP)의 기준 C3b 수준을 비교하기 위해 다음과 같이 수행하였다.

만난을 20 μg/ml로 희석하였고 4 ℃에서 하룻밤 동안 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 그 다음날 웰을 1% HSA로 차단하였다. 정상 사람, 래트 및 아프리카 사바나 원숭이 (비-사람 영장류 "NHP") 혈청을 CaMgGVB 버퍼에서 2배 희석으로 2%에서 시작하여 희석하였다. 반응을 37 ℃에서 한 시간 동안 배양에 의해 시작하였고, 얼음이 담긴 그릇에 플레이트를 옮김으로써 중단하였다. C3b 침착을 토끼 항-마우스 C3c 항체에 이어, 염소 항-토끼 HRP로 검출하였다. 음성 대조군은 항체가 없는 버퍼였고 (OMS100은 최대 C3b 침착을 일으키지 않는다) 억제되는 양성 대조군은 EDTA가 들어있는 버퍼였다 (C3b 침착 없음).

도 4는 세 개의 혈청 (사람, 래트 및 NHP)의 기준 C3c 수준을 그래프로 설명한다. 도 4에 나타난 바와 같이, C3c 수준은 테스트된 다른 혈청과 매우 달랐다. C3c 수준과 비교할 때, 1% 사람 혈청이 0.2% NHP 및 0.375% 래트 혈청과 동등한 수준을 제공한다는 것으로 나타났다. 이들 결과에 기초하여, 혈청의 농도는 scFv 결과가 세 개의 다른 타입의 혈청에서 직접적으로 비교될 수 있도록 표준화되었다.

다른 혈청의 ScFv 클론의 기능적 검정

열 개의 후보 scFv 클론의 정제된 모노머 분획을 사람 혈청, 래트 혈청 및 아프리카 사바나 원숭이 혈청 (비-사람 영장류 "NHP")의 기능적 IC₅₀ nM에 대하여 테스트하였다. 검정을 실시예 3에 설명된 바와 같이, 1000 nM scFv 정제된 단백질 및 CaMgGVB 버퍼에서 0.95로 희석된 정상 사람 혈청; CaMgGVB 버퍼에서 0.2%로 희석된 아프리카 사바나 원숭이 혈청; 또는 CaMgGVB 버퍼에서 0.375%로 희석된 래트 혈청을 사용하여 수행하였다. 열 개의 scFv 클론 모두를 그것들이 칼슘 및 마그네슘이 있는 GVB 버퍼 및 혈청의 같은 농도을 받는 희석 단계에서 테스트하였다. scFv 클론을 열두 번의 희석에서 세 번 테스트하였다. 양성 대조군은 100 ng/ml의 OMS100 Fab2였거나 반응물에 EDTA를 추가한 것이었다. 음성 대조군은 무관한 scFv 대조군 또는 scFv가 없는 PBS였다. C3b 침착을 scFv 또는 Fab2 항체의 존재 및 부재시 관찰하였다. 100 ng/ml에서 OMS100의 배경 신호를 모든 신호에서 뺐다. 표 12는 세 개의 혈청 모두에서 기능적 검정의 결과를 요약한다.

표: 12: 세 개의 다른 타입의 혈청에서 scFv 클론의 기능적 IC₅₀ (nM) 활성.

주: * 사람 혈청 (Exp #1)에 대한 데이터의 첫 번째 세트를 농축되지 않은 scFv 샘플에서 실행하였다. 그러므로, 저농도의 클론은 완전히 적정될 수 없다. 나머지 실험에서, 모든 클론을 농축하였고 동일한 농도에서 적정을 시작하였다.

다른 혈청에서 scFv 후보 클론의 기능적 활성에 대한 결과의 요약:

scFv 클론 중 열 개 모두는 혈청이 C3b 침착 수준에 관하여 표준화된 후 사람 및 비-사람 영장류 (NHP) 혈청 둘 다에서 기능을 나타냈다. 사람 혈청에서 여섯 개의 가장 활성인 클론은 최고에서 최악으로 정렬시킬 때, 9P13>17N16>17D20>4D9>3F22>18L16이었다. NHP 혈청에서, 클론을 정렬하였다 (최고에서 최악으로): 17L20>17N16>17D20>9P13>18L16>3F22. 17N16 및 17D20 둘 다는 사람 및 NHP 혈청 둘 다에 대하여 상위 세 개에 랭크되었다. 17D20은 래트 혈청에서도 일부 활성을 나타냈다.

이들 결과에 기초하여, 상위 세 개의 scFv 클론은 18L16, 17D20 및 17N16인 것으로 결정되었다. 이들 세 개의 클론을 하기 표 13에 나타난 바와 같이 희석 사람 혈청 (1% 혈청)에서 추가로 분석하였다.

표 13: 세 개의 후보 클론의 C3 검정: 희석 혈청 (1%)에서 (IC₅₀ nM)

도　5a는 전체 길이 scFv 클론 17D20, 18L16, 4D9, 17L20, 17N16, 3F22 및 9P13의 아미노산 서열 정렬이다. scFv 클론은 중쇄 가변 영역 (aa1-120), 결합자 영역 (aa121-145), 및 경쇄 가변 영역 (aa 146-250)을 포함한다. 도 5a에 나타난 바와 같이, 가장 활성인 클론의 중쇄 영역 (잔기 1-120)의 정렬은 각각 VH2 및 VH6 유전자 패밀리에 속하는 두 개의 별개의 그룹을 나타낸다. 도 5a에 나타난 바와 같이, VH2 등급의 클론에 대한 VH 영역 17D20, 18L16 및 4D9는 총 120개의 아미노산 영역 중에 20개의 aa 위치에서 가변성을 가진다 (즉 83% 동일성).

도 5a에 더 나타난 바와 같이, VH6 등급의 클론에 대한 VH 영역 17L20, 17N16, 3F22, 및 9P13은 120개의 아미노산 영역 중에 18개의 aa 위치에서 가변성을 가진다 (즉 85% 동일성).

도 5b는 scFv 클론 17D20, 17N16, 18L16 및 4D9의 서열 정렬이다.

표 14: 도 5a 및 5b에 나타난 ScFv 후보 클론의 서열

랭킹 우선 순위는 (1) 사람 혈청 기능적 힘 및 완전한 차단; (2) NHP 교차 반응성 및 (3) 서열 다양성이었다. 17D20 및 17N16을 각각의 유전자 패밀리의 최고의 대표로서 선택하였다. 18L16을 주목할 만한 CDR3 서열 다양성을 가진 세 번째 후보로서 선택하였다.

17N16 및 17D20은 사람에 대하여 최고의 기능적 힘으로 완벽한 기능적 차단, 주목할 만한 원숭이 교차 반응성 및 다른 VH 유전자 패밀리로 인해 상위 두 개의 선택이었다. 3F22 및 9P13을 17N16과 거의 동일한 VH 서열로 인해 제거하였다. 18P15, 4J9 및 21B17을 보통의 힘으로 인해 제거하였다. 17L20은 그것이 부분적으로만 차단하기 때문에 추구하지 않았다.

18L16 및 4D9는 17D20과 비교하여 유사한 활성 및 주목할 만한 다양성을 을 가졌다. 18L16을 4D9보다 더 큰 영장류 교차 반응성으로 인해 선택하였다.

그러므로, 이들 기준에 기초하여, 다음 세 개의 모체 클론 17D20, 17N16 및 18L16은 하기 추가로 설명된 바와 같이 친화도 성숙으로 발전하였다.

실시예 5

이 실시예는 야생형 IgG4 포맷에 세 개의 모체 클론 17D20, 17N16 및 18L16의 클로닝, 및 전체 길이 IgG로서 세 개의 모체 클론의 기능성의 평가를 설명한다 (실시예 2-4에 설명된 바와 같이 확인됨).

근거:

완전한 사람 항-MASP-2 scFv 항체를 실시예 2-4에 설명된 바와 같이 파지 디스플레이를 사용하여 확인하였다. 이러한 세 개의 모체 클론, 17D20, 17N16 및 18L16을 친화도 성숙에 대하여 선택하였다. 전체 길이 IgG로서 이들 모체 클론의 기능성을 평가하기 위해, 이들 항체의 IgG4 야생형 및 S228P 힌지 영역 IgG4 돌연변이 형태를 생산하였다. S228P 힌지 영역 돌연변이는 혈청 안정성을 증가시키기 위해 포함되었다. (Labrijn A.F. et al., Nature Biotechnology 27:767 (2009)를 참고하면 된다).

IgG4 야생형의 아미노산은 SEQ ID NO: 63로서 설명되고, SEQ ID NO: 62에 의해 암호화된다.

IgG4 S228P의 아미노산은 SEQ ID NO: 65로서 설명되고, SEQ ID NO: 64에 의해 암호화된다.

IgG4 분자는 또한 모체 클론을 OMS100 대조군 항체와 직접적으로 비교하기 위해 펩신 분해로 F(ab')2 포맷으로 분열되었고 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분획화되었으며, 이것은 F(ab)2 분자이다.

방법:

전체 길이 포맷에 클론의 생성

세 개의 모체 클론을 야생형 IgG4 포맷 및 IgG4 돌연변이 S228P 포맷으로 전환하였다. 이것은 상기 언급된 모체 클론으로부터 적절한 VH 및 VL 영역의 PCR 분리 및 그것들을 원하는 항체를 생산하는 인 프레임 (in-frame) 융합체를 생성하기 위해 적절한 중쇄 불변 영역을 보호하는 pcDNA3 발현 벡터에 클로닝에 의해 달성되었다. 돌연변이 IgG4 포맷의 세 개의 모체 클론을 F(ab')2 단편을 생성하기 위해 펩신을 가지고 분열시켰고 후자를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에서 분획화에 의해 정제하였다.

결합 검정

IgG4 포맷으로 전환된 후보 모체 클론을 HEK 293 세포에 일시적으로 트랜스펙션하였고 일시적 트랜스펙션의 상층액을 ELISA 검정에서 적정하였다. 클론은 물리적으로 흡착된 사람 MASP-2A과 훌륭한 반응성을 나타냈고, 다음 순서로 정렬된다: 17N16>17D20>18L16 (데이터 미도시).

클론을 정제하였고 다음과 같이 ELISA 및 활성 검정에서 다시 테스트하였다. 사람 MASP-2A를 maxisorp 플레이트에서 PBS의 3 μg/ml로 코팅하였고, IgG (45 μg/ml) 및 Fab'2 (30 μg/ml)를 PBS-Tween에서 300 nM의 시작 농도로 희석하였고, 추가로 3배 희석하였다. IgG를 HRP 콘쥬게이션된 염소 α-사람 IgG (Southern Biotech)로 검출하였고 F(ab')2를 HRP-콘쥬게이션된 염소 α-사람 IgG H+L (Pierce 31412)로 검출하였다. 반응을 TMB 기질로 전개하였고 2 M H₂SO₄로 중단하였다. 결과는 하기 표 15에 나타난다.

표 15: 사람 MASP-2에 대한 결합 친화도

기능적 검정

1% 정상 사람 혈청 (NHS)을 사용하는 C3 콘버타제 검정을 실시예 4에 설명된 바와 같이, 1% NHS에서 모체 scFv 클론 및 전체 길이 IgG4 대응물의 기능적 활성을 비교하는데 사용하였다. 만난을 20 μg/ml의 농도로 희석하였고 4 ℃에서 하룻밤 동안 ELISA 플레이트를 코팅하였다. 그 다음날, 웰을 1% 사람 혈청으로 차단하였다. 사람 혈청을 CaMgGVB 버퍼에서 1%로 희석하였고 정제된 항체 scFv (900 nM), F(ab')2 (300 nM), IgG (300 nM)를 같은 양의 버퍼에 다른 희석의 시리즈로 두 번 추가하였고 차단된 ELISA 플레이트에 추가하기 전에 얼음에서 45분 동안 사전 배양하였다. 반응을 37 ℃에서 한 시간 동안 배양함으로써 시작하였고 얼음 위에 플레이트를 배치함으로써 중단하였다. C3b 침착을 토끼 α-마우스 C3c 항체에 이어 염소 α-토끼 HRP로 검출하였다. 만난 양성 플레이트에서 50 nM에서 OMS100의 배경을 곡선에서 뺐다. 이 분석의 결과의 요약은 하기 표 16에 나타난다.

표 16: 1% 사람 혈청을 사용하는 C3 콘버타제 검정 (IC₅₀ nM)

주: 표 16의 컬럼 2-4에 나타난 두 개의 값은 두 개의 별도의 실험의 결과를 나타낸다.

각 클론에 대하여 IgG4 모체 클론의 기능적 힘을 또한 IgG4 힌지 돌연변이 (S228P) 포맷에 비교하였다. 1% NHS를 사용하는 C3b 침착 검정에 대한 수치 IC₅₀ 값은 하기 표 17에 나타난다.

표 17: 1% 사람 혈청 (IC₅₀ nM)의 C3b 침착 검정에서 야생형 (IgG4) 대 힌지 돌연변이 포맷 (S228P)

상기 표 17에 나타난 바와 같이, 일부 경우에, 예상되지 않은 작용제 약리학이 길항적 scFv's로부터 유도된 IgG's에 대하여 지적되었다. 이 관찰에 대한 기계론적 기반은 이해되지 않는다.

1% NHS의 억제 기능을 갖는 IgG4 전환된 모체 클론의 활성을 생리학적 조건을 더 자세히 모방하는 더 엄중한 검정 조건 하에 평가하였다. 생리학적 조건 하에 항체 활성을 평가하기 위해, 모체 클론 IgG4 조제물의 테스트를 최소한으로 희석된 (90%) 사람 혈장을 사용하는 엄중 검정 조건 하에 만난-코팅된 플레이트에 렉틴-경로 (LP) 의존적 C3b 침착을 억제하는 그것들의 능력에 대하여 수행하였다.

90% 사람 혈장에서 C3b 침착 검정의 결과는 도 6에 나타난다. MASP-2 및 그것의 기질이 1% 정상 사람 혈청을 사용하는 희석 혈청 검정보다 대략 100배 더 높은 농도의 검정 혼합물에 존재하기 때문에 길항제 용량-반응 곡선의 오른쪽 이동 (right-shift)이 일반적으로 예측된다. 도 6에 나타난 바와 같이, 예상된 바와 같이, 더 낮은 겉보기 힘 (apparent potency)으로 오른쪽 이동을 OMS100 및 테스트된 모든 MASP-2 항체에 대하여 관찰하였다. 하지만, 놀랍게도, 겉보기 힘의 감소가 17D20의 힌지 영역 돌연변이 (S228P)에 대하여 관찰되지 않았고, 이 포맷의 힘은 1% 혈장에서 측정된 것과 비슷하였다 (표 17을 참고하면 된다). 90% NHS 검정 포맷에서, 17D20 IgG4 (S228)의 기능적 힘은 OMS100 Fab2보다 약간 더 낮은 것으로 발견되었으며, 이것은 OMS100이 17D20 IgG4 S228P보다 50 내지 100배 더 강한 경우에 1% NHS의 검정 결과와 대조적이다 (데이터 미도시). 도 6에 설명된 바와 같이, 18L16의 야생형 IgG4 형태가 덜 강하고 부분적으로만 억제하는 한편, 17N16의 야생형 IgG4 형태는 또한 90% NHS에서 완전한 억제를 나타냈지만 이 검정 포맷에서 약간 덜 강했다 (~15 nM의 IC₅₀).

이들 발견에 기초하여, IgG4 전환된 모체 클론의 활성을 엄중 검정 조건 (90% NHS) 하에 C4b 침착을 검사함으로써 추가로 평가하였다. 이 검정 포맷은 MASP-2에 의해 촉진된 효소 반응에 대한 항체 활성의 직접적인 측정값을 제공한다.

MASP -2 의존적 C4 절단의 억제를 측정하는 검정

배경: MASP-2의 세린 프로테아제 활성은 매우 특이적이고 MASP-2에 대한 두 개의 단백질 기질만이 확인되었다; C2 및 C4. C4의 절단은 C4a 및 C4b를 발생시켰다. 항-MASP-2 Fab2는 C4 절단에 직접적으로 수반되는 MASP-2 상의 구조적 에피토프 (예를 들어, C4에 대한 MASP-2 결합 부위; MASP-2 세린 프로테아제 촉매점)에 결합할 수도 있고 그로 인해 MASP-2의 C4 절단 기능적 활성을 억제한다.

효모 만난은 렉틴 경로의 알려진 활성화제이다. MASP-2의 C4 절단 활성을 측정하는 다음 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 90% 사람 혈청과 함께 4 ℃에서 90분 동안 배양하여 렉틴 경로를 활성화하였다. 웰을 세척하였고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰에 고정된 사람 C4b에 대하여 검정하였다. 이 검정에서 발생한 C4b의 양은 MASP-2 의존적 C4 절단 활성의 측정값이다. 선택된 농도에서 항-MASP-2 항체를 이 검정에서 C4 절단을 억제하는 그것들의 능력에 대하여 테스트하였다.

방법: 96-웰 Costar 배지 결합 플레이트를 1.0 μg/50 μL/웰에서 50 mM 카르보네이트 버퍼, pH 9.5에서 희석된 만난과 함께 5 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 각 웰을 200 μL PBS로 세 번 세척하였다. 웰을 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민의 100 μL/웰로 차단하였고 부드럽게 혼합하면서 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 각 웰을 PBS의 200 μL로 세 번 세척하였다. 항-MASP-2 항체 샘플을 5 ℃에서 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 버퍼 (4.0　mM 바비탈, 141　mM NaCl, 1.0　mM MgCl₂, 2.0　mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH　7.4)에서 선택된 농도로 희석하였다. 90% 사람 혈청을 5 ℃에서 상기 샘플에 추가하였고 100 μL를 각 웰로 옮겼다. 플레이트를 커버하였고 보체 활성화를 허용하기 위해 차가운 항온조에서 90분 동안 배양하였다. 반응을 반응 혼합물에 EDTA를 추가함으로써 중단하였다. 각 웰을 PBS-Tween　20 (PBS 중의 0.05% Tween　20) 200 μL로 다섯 번 세척하였고, 각 웰을 200 μL PBS로 두 번 세척하였다. 비오틴-콘쥬게이션된 닭 항-사람 C4c (Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)의 1:700 희석액의 100 μL/웰을 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA)를 함유하는 PBS에 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 각 웰을 200 μL PBS로 다섯 번 세척하였다. 퍼옥시다제-콘쥬게이션된 스트렙타비딘 (Pierce Chemical #21126)의 0.1 μg/ml의 100 μL/웰을 2.0 mg/ml BSA를 함유하는 PBS에 추가하였고 부드럽게 혼합하는 셰이커에서 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 각 웰을 200 μL PBS로 다섯 번 세척하였다. 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)의 100 μL/웰을 추가하였고 상온에서 16분 동안 배양하였다. 퍼옥시다제 반응을 1.0 M H₃PO₄의 100　μL/웰을 추가함으로써 중단하였고 OD₄₅₀를 측정하였다.

결과:

이 포맷에서, IC₅₀ 값이 C3b 침착 검정과 비교하여 ~3배 더 높지만, 17D20의 IgG4 형태 둘 다는 렉틴 경로 구동된 C4b 침착을 억제한다. 흥미롭게도, 17N16 IgG4 야생형은 이 검정에서 좋은 활성을 나타냈으며 IC₅₀ 값 및 용량-반응 프로파일은 C3b 침착 검정과 비슷하다. 18L16은 훨씬 덜 강하고 이 포맷에서 완벽한 억제를 달성하지 않았다 (데이터 미도시).

논의:

실시예 2-5에 설명된 바와 같이, 기능적 차단 활성을 갖는 완전한 사람 항-MASP-2 scFv 항체를 파지 디스플레이를 사용하여 확인하였다. 이러한 세 개의 클론 17N16, 17D20 및 18L16을 친화도 성숙 및 추가의 테스트에 대하여 선택하였다. 전체 길이 IgG로서 이들 모체 클론의 기능성을 평가하기 위해, 이들 항체의 IgG4 야생형 및 IgG4 S228P 힌지 영역 돌연변이 형태를 생산하였다. 이 실시예에 설명된 바와 같이, 1% 사람 혈장으로 표준 기능적 검정 포맷에서 테스트될 때 전체 길이 IgG의 대부분은 그것들의 scFv 대응물과 비교하여 개선된 기능적 활성을 가졌다. 생리학적 조건 하에 항체 활성을 평가하기 위해, 모체 클론 IgG4 조제물의 테스트를 90% 사람 혈장을 사용하는 엄중 검정 조건 하에 수행하였다. 이들 조건 하에, 여러 항체는 표준 (1%) 혈장 기능적 검정에서 그것들의 성능에 기초하여 예측된 것보다 실질적으로 더 나은 기능적 힘을 나타냈다.

실시예 6

이 실시예는 모체 클론 17D20, 17N16 및 18L16의 사슬 셔플링 및 친화도 성숙, 및 결과의 딸 클론의 분석을 설명한다.

방법:

개선된 힘을 갖는 항체를 확인하기 위해, 실시예 2-5에 설명된 바와 같이 확인된, 세 개의 모체 scFv 클론 17D20, 17N16 및 18L16은 경쇄 셔플링을 받았다. 이 공정은 여섯 명의 건강한 기증자로부터 유도된 나이브 (naive), 사람 람다 경쇄 (VL)의 라이브러리와 짝을 이룬 모체 클론 각각의 VH로 구성된 조합 라이브러리의 발생을 수반하였다. 이 라이브러리를 개선된 결합 친화도 및/또는 기능성을 갖는 scFv 클론에 대하여 스크리닝하였다.

총 27,000개의 클론에 대하여, 9,000개의 경쇄가 셔플링된 딸 클론을 모체 클론마다 분석하였다. 각각의 딸 클론을 가용성 scFv를 발현하고 분비하기 위해 유발하였고 사람 MASP-2A에 결합하는 능력에 대하여 스크리닝하였다. 사람 MASP-2A에 결합하는 ScFv를 그것들의 c-Myc 태그를 통해 검출하였다. 이 처음의 스크리닝은 총 119개의 클론의 선택을 발생시켰으며, 이것은 17N16 라이브러리의 107개의 딸 클론, 17D20 라이브러리의 8개의 딸 클론, 및 18L16 라이브러리의 4개의 딸 클론을 포함하였다.

119개의 클론을 소규모로 발현시켰고, NiNTA 컬럼에서 정제하였고 물리적으로 흡착된 사람 MASP-2A에 대한 ELISA 검정에서 결합 친화도에 대하여 테스트하였다.

결과:

119개의 딸 클론의 대표적인 서브세트에 대한 ELISA 검정의 결과는 도 7a 및 7b에 나타난다. 도 7a는 17N16 모체 클론 대 huMASP-2A에서 적정된 딸 클론에 대한 ELISA 검정의 결과를 그래프로 설명한다. 도 7b는 17D20 모체 클론 대 huMASP-2A에서 적정된 딸 클론에 대한 ELISA 검정의 결과를 그래프로 설명한다.

도 7a에 나타난 바와 같이, 17N16 모체 클론으로부터 유도된 딸 클론 17N16m_d16E12 및 17N16m_d17N9는 모체 클론보다 더 높은 친화도를 가졌다. 또한 도 7b에 나타난 바와 같이, 17D20 모체 클론으로부터 유도된 한 클론, 17D20m_d18M24는 모체 클론보다 더 높은 친화도를 가졌다. 이들 세 개의 클론, 및 추가적인 세 개의 클론 17N16m_d13L12, 17N16m_d16K5, 17N16m_d1G5, 및 낮은 발현 수준을 갖는 17D20m_d1824은 0.5 L 규모로 발현되었고, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 모노머 분획으로 정제되었고 ELISA 및 기능적 검정으로 다시 테스트 되었다. 18L16 라이브러리는 원하는 결합 친화도로 어떤 딸 클론도 생산하지 않았다.

정제 후, 여섯 개의 딸 클론을 억제 활성에 대하여 보체 검정으로 테스트하였다. 결과는 표 18에 나타난다.

표 18: 모체 및 딸 클론의 보체 검정

상기 표 18에 나타난 바와 같이, 클론 17N16m_d17N9 중 하나만이 모체 클론과 같은 범위의 친화도 및 활성을 가졌다.

도 8은 전체 길이 scFv 모체 클론 17N16 (SEQ ID NO: 59) 및 17N16m_d17N9 딸 클론 (SEQ ID NO: 66)의 아미노산 서열 정렬이며, 경쇄 (SYE로 시작함)가 두 개의 클론마다 다른 17개의 아미노산 잔기를 갖는다.

17N16 람다 라이브러리의 재 스크리닝은 여러 추가적인 후보 딸 클론을 발생시켰으며, 이들 중에 17N16m_d27E13을 ELISA 및 보체 검정에서 확인하였고, 추가의 분석을 위해 후보 딸 클론의 세트에 포함시켰다.

다른 혈청에서 딸 클론의 검정

후보 딸 클론을 다음과 같이 다른 혈청에서 분석하였다. 만난을 20 μg/ml로 희석하였고 4 ℃에서 하룻밤 동안 ELISA 플레이트에서 코팅하였다. 그 다음날, 웰을 1% HSA로 차단하였다. 아프리카 사바나 원숭이 혈청을 CaMgGVB 버퍼에서 0.2%로 희석하였고, 래트 혈청을 0.375%로 희석하였고 사람 혈청을 1%로 희석하였다.각 후보 딸 클론의 정제된 scFv를 같은 양의 버퍼에 다른 농도의 시리즈로 두 번 추가하였고 차단된 ELISA 플레이트에 추가 전에 얼음 위에서 45분 동안 사전 배양하였다. 반응을 37 ℃에서 한 시간 동안 배양에 의해 시작하였고 얼음이 담긴 그릇에 플레이트를 옮김으로써 중단하였다. C3c 방출을 토끼 α-마우스 C3c 항체에 이어 염소 α-토끼 HRP로 검출하였다. 만난 음성 플레이트에서 0.1 μg/ml에서 OMS100의 배경을 이들 곡선에서 뺐다. 결과는 하기 표 19에서 요약된다.

표 19: 다른 혈청에서 모체 클론 17N16 및 딸 클론 17N16m_d17N9 및 17N16m_d27E13에 대한 IC₅₀ 값.

주: 컬럼 2-4에 나타난 두 개의 값은 두 개의 별개의 실험의 결과를 나타낸다.

결과의 논의:

표 19에 나타난 바와 같이, 딸 클론 17N16m_d17N9는 모체 클론보다 더 높은 기능적 활성을 갖는다. 모체 클론과 비교하여 경쇄에서 열일곱 개의 아미노산 서열 차이 이외에 래트 혈청의 개선된 기능은 이 클론을 양성 후보로 만든다. 이 데이터에 기초하여, 딸 클론 17N16m_d17N9를 추가의 분석을 위해 선택하였다.

실시예 7

이 실시예는 모체 클론 17D20으로부터 유도된 딸 클론 17D20m_d3521N11의 발생 및 분석을 설명한다.

배경/근거:

모체 클론 후보 17D20mc의 친화도를 개선하기 위해, 추가적인 "돌연변이 생성의 검토 (look-through-mutagenesis)"FMF 중쇄의 CDR3 (CDR-H3)의 처음 세 개의 아미노산에서 수행하였다. 이것은 17D20mc의 정상 경쇄 셔플링과 유사한 돌연변이 생성 캠페인이었다. 그러므로, 세 개의 다른 scFv 라이브러리를 아미노산 위치 1, 2 및 3이 동의 코돈을 사용하여 모든 가능한 20개의 아미노산의 세트에 무작위로 추출되는 경우 PCR에 의해 구성하였다. 라이브러리를 클로닝한 후, 미소 규모 발현을 수행하였고 MASP-2A 코팅된 CM5 칩에서 scFv 결합을 관찰하였다 (미도시). ㅁ미소 규모의 BIAcore 분석을 MASP-2A로 코팅된 칩 상의 세 개의 다른 라이브러리에서 수행하였고, 위치 1, 2, 또는 3에서 무작위로 추출하였고 잠재적으로 흥미로운 딸 클론을 확인하였다.

CDR-H3의 아미노산 위치 1 및 2에 대하여, 모체 후보 클론 17D20m과 비교하여 개선된 오프-레이트 (off-rate)를 갖는 클론이 발견되지 않았다는 것이 관찰되었다. 하지만, CDR-H3의 아미노산 위치 3에서 돌연변이를 갖는 소수의 후보는 모체 클론 17D20m과 비교하여 개선된 오프-레이트를 입증하였다. 이들 클론 (#35, #59 및 #90)을 돌연변이를 확인하기 위해 시퀀싱하였다. 두 개의 "돌연변이 생성의 검토" 유도된 클론의 서열을 17D20mc (원래의 서열)와 비교하였다. 흥미롭게도, 하나 (#90)를 제외한 모든 시퀀싱된 클론은 모체 후보와 비교하여 Ala-Arg 치환을 보호하였다.

도 9는 scFv 모체 클론 17D20m의 중쇄 영역의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 18의 aa 61-119) 및 CDR-H3의 돌연변이를 갖는 scFv 클론, 클론 #35 (SEQ ID NO: 20의 aa 61-119, SEQ ID NO: 18의 위치 102의 A에 대하여 R의 치환을 가짐), 클론 #59 (클론 #35와 같은 서열), 및 클론 #90 (SEQ ID NO: 18의 위치 12의 A에 대하여 P의 치환)의 CDR-H3 영역의 아미노산 서열의 서열 비교이다.

돌연변이 클론 #35 및 #59의 분석

돌연변이 클론 #35 및 #59는 소규모로 발현되었고 모체 후보 클론 17D20와 비교하여 고정된 MASP-2A (10 μg/ml)에서 적정-ELISA로 추가로 테스트하였다. scFv는 5배 단계 희석하여 20 μg/ml에서 시작하고 결합을 항-Myc (마우스)/항-마우스 HRP를 사용하여 검출하였다. 약간 개선된 결합을 모체 후보 클론 17D20과 비교하여 후보 클론 #35 및 #59에 대한 ELISA 검정에서 관찰하였다 (데이터 미도시).

개선된 클론 #35를 최고의 경쇄 셔플링된 클론 17D20m_d21N11과 결합시켰다. 후보 17D20md35의 VH에서 돌연변이 (Ala-Arg)를 후보 17D20m_d21N11의 경쇄와 결합시켰고, 따라서 VH35-VL21N11로 불리는, 아니면 3521N11로 나타나는 클론을 발생시켰다.

도 10a는 모체 클론 17D20의 CDR3 영역 (SEQ ID NO: 18의 aa 61-119), 같은 서열을 갖는 딸 클론 17D20m_d21N11의 같은 영역 및 "3521N11"로 나타나는, 17D20m_d21N11의 VL과 결합된 돌연변이 생성 클론 #35의 같은 영역 (SEQ ID NO: 20의 aa 61-119)의 서열의 아미노산 서열 정렬이다. 강조된 VH 서열 영역은 CDRH3을 포함하고, 돌연변이된 표적 잔기 영역은 밑줄 그어져 있다.

도 10b는 17D20 모체 클론 (SEQ ID NO: 55) 및 딸 클론 17D20m_d21N11 (SEQ ID NO: 67)의 VL 및 VH 영역을 포함하는 전체 길이 scFv의 단백질 서열 정렬이다. scFv 딸 클론 17D20m_d3521N11은 SEQ ID NO: 68로 제시된다. 주: 위치 220에서 도 10b의 X 잔기가 SEQ ID NO: 68에 설명된 바와 같이 "E"라는 것이 결정되었다.

도 10에 나타난 scFv의 세트의 적정 ELISA 검정을 MASP-2 (10 μg/ml)에서 실행하였다. 결과는 표 20에 나타난다.

표 20: 사람 MASP-2의 ELISA

17D20m_d3521N11 딸 클론을 하기 실시예 8에 설명된 바와 같이 기능적 활성에 대하여 추가로 분석하였다.

실시예 8

이 실시예는 후보 딸 클론 17N16m_d17N9 및 17D20m_d3521N11의 IgG4, IgG4/S228P 및 IgG2 포맷으로 전환 및 17N16m_d17N9 및 17D20m_d3521N11의 분석을 설명한다.

근거/배경

실시예2-7에 설명된 항체 스크리닝 방법은 두 개의 모체 클론, 17N16 및 17D20을 확인하였으며, 적합한 기능성을 갖는다. 이들 모체 클론의 친화도 성숙화는 scFv 수준의 대리의 기능적 검정에서 모체 클론에 비교하여 힘에서 대략 2배 개선을 나타내는 딸 클론을 수득하였다. 최고의 활성을 가진 딸 클론은 17N16m_d17N9 및 17D20m_d3521N11이었다. 실시예 6에 설명된 바와 같이, 경쇄 셔플링된 딸 클론을 갖는 17N16 모체 클론의 기능적 활성과 비교하여 (scFv 포맷, 1% NHS 검정) 17N16m_d17N9은 모체 클론보다 약간 더 강하고 이 검정에서 테스트된 모든 딸 클론의 최고의 기능적 힘을 갖는다는 것이 결정되었다.

방법:

후보 scFv 클론의 기능적 힘의 비교를 실시예 5에 설명된 바와 같이 수행된, C3 전환 검정에서 (1% 사람 혈청 및 90% 사람 혈청), 및 C4 전환 검정에서 (90% 사람 혈청) 수행하였다.

결과는 하기 표 21에 나타난다.

표 21: 선도 딸 클론 및 그것들의 각각의 모체 클론 (scFv 포맷의 모든 것)의 IC₅₀ (nM)에서 기능적 힘의 비교

상기 표 21에 나타난 바와 같이, 17N16m_d17N9는 C3 검정으로 90% 정상 사람 혈청 (NHS)에서 검정될 때 좋은 활성을 갖고 이 포맷의 다른 딸 클론보다 더 강하다.

IgG4 , IgG4 / S228P 및 IgG2 포맷으로 후보 클론의 전환

이들 후보 클론 모두를 추가의 분석을 위해 IgG4, IgG4/S228P 및 IgG2 포맷으로 전환하였다.

SEQ ID NO: 62: cDNA 암호화 야생형 IgG4

SEQ ID NO: 63: 야생형 IgG4 폴리펩티드

SEQ ID NO: 64 cDNA 암호화 IgG4 돌연변이 S228P

SEQ ID NO: 65: IgG4 돌연변이 S228P 폴리펩티드

SEQ ID NO: 69: cDNA 암호화 야생형 IgG2

SEQ ID NO: 70: 야생형 IgG2 폴리펩티드

표 22: 후보 클론의 요약:

단클론성 항체 #1-6을 이들 항체가 사람에 대하여 예측하는 동물 모델에서 독성에 대하여 테스트하는데 사용될 수 있는지 결정하기 위해 C3 검정에서 비-사람 MASP-2 단백질 (아프리카 사바나 (AG) 원숭이)와 교차 반응하는 능력에 대하여 테스트하였다. 단클론성 항체 #1-6를 또한 90% 사람 혈청에서 C3b 침착 검정 및 C4 검정으로 테스트하였다. 결과는 하기 표 23에 나타난다.

표 23: 90% 사람 혈청에서 사람 항-MASP-2 MoAbs (IC₅₀ nM)

도 11a는 사람 항-MASP-2 단클론성 항체 모체 클론 17N16으로부터 유도된, 딸 클론 이소타입 변이체 (MoAb#1-3)에 대하여 수행된 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 설명한다.

도 11b는 사람 항-MASP-2 단클론성 항체 모체 클론 17D20으로부터 유도된, 딸 클론 이소타입 변이체 (MoAb#4-6)에 대하여 수행된 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 설명한다.

표 23 및 도 11a 및 11b에 나타난 바와 같이, 사람 항-MASP-2 단클론성 항체 (MoAb#1-6)는 높은 친화도로 MASP-2에 결합하고, 90% 사람 혈청에서 C3 및 C4 활성의 기능을 억제한다. 또한 사람 항-MASP-2 MoAb가 비-사람 MASP-2 단백질과 교차 반응하며, 이것은 사람에 대하여 예측하는 독성 연구를 위한 동물 모델을 제공한다는 것이 지적된다.

MoAb#1-6을 95% 사람 혈청, 95% 아프리카 사바나 원숭이 혈청에서 추가로 분석하였다. 결과는 하기 표 24에 요약된다.

표 24

도 12a 및 도 12b는 95% 사람 혈청에서 C3b 침착 검정으로 모체 클론 및 MoAb#1-6의 테스트를 그래프로 설명한다.

도 13은 95% 정상 사람 혈청에서 C4b 침착의 억제를 그래프로 설명한다.

도 14는 95% 아프리카 사바나 원숭이 혈청에서 C3b 침착의 억제를 그래프로 설명한다.

MoAb#1-6을 래트 C3b의 억제, 미리 조립된 MBL-MASP-2 복합체의 억제; 고전적 경로 억제, 및 C1s를 통한 선택성에 대하여 검정함으로써 렉틴 경로를 선택적으로 억제하는 능력에 대하여 추가로 테스트하였다. 결과는 표 25에 요약된다.

표 25: 기능적 검정 결과의 요약

도 15는 MoAb#2, 3, 5 및 6에 의해 미리 조립된 MBL-MASP-2 복합체의 C4 절단 활성의 억제를 그래프로 설명한다.

도 16은 C1s와 비교하여 사람 MASP-2에 대한 MoAb#6의 우선적 결합을 그래프로 설명한다.

표 26: 다양한 포맷의 딸 클론의 서열의 요약:

실시예 9

이 실시예는 다수의 차단 사람 항-MASP-2 MoAb에 대하여 수행된 에피토프 매핑을 설명한다.

방법:

다음 재조합 단백질을 실시예 1에 설명된 바와 같이 생산하였다:

사람 MAp19

사람 MASP2A

사람 MASP-2 SP

사람 MASP-2 CCP2-SP

사람 MASP-2 CCP1-CCP2-SP

사람 MASP-1/3 CUB1-EGF-CUB2

사람 MASP-1 CCP1-CCP2-SP

항-MASP-2 항체 OMS100 및 MoAb#6 (35VH-21N11VL)은 높은 친화도로 사람 MASP-2에 결합하고 기능적 보체 활성을 차단하는 능력을 갖는 것으로 (실시예 6-8을 참고하면 된다) 입증되었으며, 도트 블롯 (dot blot) 분석에 의해 결합하는 에피토프에 관하여 분석되었다.

도트 블롯 분석

상기 설명된 재조합 MASP-2 폴리펩티드의 단계 희석을 니트로셀룰로스 막에 스폿팅하였다 (spotted). 스폿팅된 단백질의 양은 10배 단계에서, 50 ng 내지 5 pg의 범위에 있었다. 이후의 실험에서, 스폿팅된 단백질의 양은 다시 5배 단계에서, 50 ng 이하 내지 16 pg의 범위에 있었다. 막을 TBS 중의 5% 탈지유 분말 (차단 버퍼)로 차단하였고 차단 버퍼 중의 1.0 μg/ml 항-MASP-2 Fab2s (5.0　mM Ca²⁺ 함유)와 함께 배양하였다. 결합된 Fab2s를 HRP-콘쥬게이션된 항-사람 Fab (AbD/Serotec; 1/10,000 희석됨) 및 ECL 검출 키트 (Amersham)를 사용하여 검출하였다. 한 막을 양성 대조군으로서 다클론성 토끼-항 사람 MASP-2 Ab와 함께 배양하였다 (Stover　et　al., J Immunol 163:6848-59 (1999)에 설명됨). 이 경우에서, 결합된 Ab를 HRP-콘쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG를 사용하여 검출하였다 (Dako; 1/2,000 희석됨).

결과:

결과는 표 27에 요약된다.

표 27: 에피토프 매핑

결과는 MoAb#6 및 OMS100 항체가 MASP-2에 대하여 매우 특이적이고 MASP-2 또는 MASP-3에 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 항체는 Map19 및 MASP-2의 CCP1 도메인을 함유하지 않는 MASP-2 단편에 결합되지 않았고, 결합 부위가 CCP1 도메인을 포함한다는 결론으로 이어졌다.

실시예 10

이 실시예는 사람 항-MASP-2 MoAb#6이 정맥 내 투여 후 아프리카 사바나 원숭이의 렉틴 경로를 억제한다는 것을 입증한다.

방법:

MoAb#6을 1 mg/kg의 투약량으로 세 마리의 아프리카 사바나 원숭이의 제1 그룹에 및 3 mg/kg의 투약량으로 세 마리의 아프리카 사바나 원숭이의 제2 그룹에 정맥 내 투여하였다. 혈액 샘플을 투여 2, 4, 8, 10, 24, 48, 72 및 98시간 후에 얻었고 렉틴 경로 활성의 존재에 대하여 테스트하였다.

도 17에 나타난 바와 같이, 렉틴 경로는 항-사람 MoAb#6의 정맥 내 투여 후 완벽히 억제되었다.

실시예 11

이 실시예는 MASP-2 억제제, 예를 들어, 항-MASP-2 항체가 방사선 노출의 치료 및/또는 급성 방사선 증후군의 치료, 개선 또는 방지에 효과적이다는 것을 입증한다.

근거:

이온화 방사선의 고선량에 노출은 두 개의 주요 메카니즘에 의해 치사를 유발한다: 골수에 대한 독성 및 위장 증후군. 골수 동성은 모든 혈액 세포의 몰락을 일으키며, 유기체가 감염 및 출혈에 의해 죽기 쉽게 한다. 위장 신드롬은 더 심각하고 소화관 표층의 분해 및 장 내분비 기능의 손실로 인한 장 장애물 기능의 손실에 의해 구동된다. 이것은 패혈증 및 죽음을 일으킬 수 있는 관련된 전신성 염증 반응 증후군으로 이어진다.

보체의 렉틴 경로는 조직 손상 및 외부 표면 (즉, 박테리아)에 노출에 반응하여 염증을 시작하는 선천적 면역 메카니즘이다. 이 경로의 차단은 허혈성 장 조직 손상 또는 패혈성 쇼크의 마우스 모델에서 더 나은 결과로 이어진다. 렉틴 경로가 방사선-유발된 조직 손상에 반응하여 과도하고 해로운 염증을 촉발할 수도 있다는 것을 가정한다. 따라서 렉틴 경로의 차단은 급성 방사선 노출 후 2차적 손상을 감소시키고 생존을 증가시킬 수도 있다.

이 실시예에 설명된 바와 같이 수행된 연구의 목적은 항-쥐 MASP-2 항체를 투여함으로써 방사선 손상의 마우스 모델에서 생존에 대한 렉틴 경로 차단의 효과를 평가하는 것이었다.

연구 #1

방법 및 재료:

재료. 이 연구에 사용된 테스트 물품은 트랜스펙션된 포유동물 세포에서 생산되는 렉틴 보체 경로의 MASP-2 단백질 성분을 차단하는 (i) 고 친화도 항-쥐 MASP-2 항체 (mAbM11) 및 (ii) 고 친화도 항-사람 MASP-2 항체 (mAbOMS646)였다. 투여 농도는 항-쥐 MASP-2 항체 (mAbM11)의 1　mg/kg, 항-사람 MASP-2 항체 (mAbOMS646)의 5mg/kg, 또는 멸균 식염수였다. 각각의 투여 세션을 위해, 충분한 양의 신선한 투여 용액을 제조하였다.

동물. 젊은 성체 수컷 Swiss-Webster 마우스를 Harlan Laboratories (Houston, TX)에서 얻었다. 동물을 Alpha-Dri 베딩 (bedding)이 들어있는 딱딱한 바닥의 케이지에서 사육하였고 임의로 보증된 PMI 5002 Rodent Diet (Animal Specialties, Inc., Hubbard OR) 및 물을 제공하였다. 온도를 관찰하였고 동물 유지실을 12시간 명/12시간 암 주기로 작동하였다.

조사. 시설에서 2주 순응 후, 마우스를 320-kV 고안정성 X-선 발생기, 금속 세라믹 X-선 튜브, 가변 X-선 빔 콜리메이터 (collimator) 및 필터가 장착된 Therapax X-RAD 320 시스템 (Precision X-ray Incorporated, East Haven, CT)을 사용하여 0.78 Gy/분의 선량률로 10마리의 그룹에 전신 노출에 의해 6.5, 7.0 및 8.0 Gy로 조사하였다.

약물 조제 및 투여. 농축된 스톡 용액의 적절한 양을 차가운 식염수로 희석하여 프로토콜에 따라 0.2 mg/ml 항-쥐 MASP-2 항체 (mAbM11) 또는 0.5 mg/ml 항-사람 MASP-2 항체 (mAbOMS646)의 투여 용액을 제조하였다. 항-MASP-2 항체 mAbM11 및 mAbOMS646의 투여는 1 mg/kg mAbM11, 5mg/kg mAbOMS646, 또는 식염수 비히클을 전달하기 위해 동물 체중에 기초하여 25-게이지 바늘을 사용하는 IP 주사를 통해서 되었다.

연구 설계. 마우스를 표 28에 설명된 바와 같이 무작위로 그룹에 할당하였다. 체중 및 온도를 매일 측정하고 기록하였다. 그룹 7, 11 및 13의 마우스를 조사 후 7일에 희생시켰고 깊은 마취 하에 심장 천자에 의해 혈액을 수거하였다. 조사 후 30일에 생존한 동물을 같은 방식으로 희생시켰고 혈액을 수거하였다. 프로토콜에 따라 수거된 샘플로부터 혈장을 제조하였고 분석을 위해 스폰서에게 반환하였다.

표 28: 연구 그룹

통계 분석. 카플란-마이어 생존 곡선을 생성하였고 로그-랭크 (log-Rank) 및 윌콕슨 (Wilcoxon) 방법을 사용하여 처리 그룹 사이의 평균 생존 시간을 비교하기 위해 사용하였다. 평균과 표준 편차, 또는 평균과 상기 평균의 표준 오차를 보고하였다. 제어된 조사된 동물 및 개개의 처리 그룹 사이에서 통계적 비교는 양방향 짝을 이루지 않은 t-테스트 (two-tailed unpaired t-test)를 사용하여 이루어졌다.

연구 #1의 결과

6.5, 7.0 및 8.0 Gy 노출 그룹에 대한 카플란-마이어 생존 플롯은 각각 도 18a, 18b 및 18c에 제공되고, 하기 표 29에 요약된다. 전체적으로, 항-쥐 MASP-2 ab (mAbM11)의 조사 전 처리는 비히클 처리된 조사된 대조군 마우스와 비교하여 6.5 (20% 증가) 및 7.0 Gy (30% 증가) 노출 수준 둘 다에서 조사된 마우스의 생존을 증가시켰다. 6.5 Gy 노출 수준에서, 항-쥐 MASP-2 ab의 조사 후 처리는 비히클 대조군 조사된 동물과 비교하여 생존의 소규모 증가 (15%)를 일으켰다.

대조적으로, 7.0 Gy 및 8.0 Gy 노출 수준에서 처리된 모든 동물은 비히클 처리된 조사된 대조군 동물과 비교하여 생존의 증가를 나타냈다. 생존의 가장 큰 변화는 mAbOMS646를 받은 동물에서 나타났으며, 7.0 Gy 노출 수준에서 대조군 동물에 비해 생존이 45% 증가하였고, 8.0 Gy 노출 수준에서 생존이 12% 증가하였다. 게다가, 7.0 Gy 노출 수준에서, mAbOMS646 처리된 그룹의 치사는 비히클 처리된 조사된 대조군 동물에 대한 조사 후 8일과 비교하여 조사 후 15일에 처음 발생하였다. mAbOMS646을 받은 마우스에 대한 치사의 평균 시간 (27.3 ± 1.3일)은 7.0 Gy 노출 수준에서 대조군 동물 (20.7 ± 2.0일)과 비교하여 크게 증가하였다 (p = 0.0087).

조사 전 날 (-1일)과 비교하여 체중의 퍼센트 변화를 연구하는 동안 기록하였다. 일시적인 체중 감소는 모든 조사된 동물에서 발생하였으며, 대조군과 비교하여 mAbM11 또는 mAbOMS646으로 인한 차별적 변화의 증거는 없었다 (데이터 미도시). 연구 종료시, 모든 살아있는 동물은 시작 (-1일) 체중으로부터 체중의 증가를 나타냈다.

표 29: 조사에 노출된 테스트 동물의 생존율

*같은 조사 노출 수준에서 제어된 조사된 동물 및 처리 그룹 사이의 양방향 짝을 이루지 않은 t-테스트에 의해 p = 0.0087.

논의

급성 방사선 증후군은 세 개의 한정된 하위 증후군으로 구성된다: 조혈성, 위장성, 및 뇌혈관성. 관찰된 증후군은 방사선 선량에 의존적이며, 조혈성 효과가 1 Gy를 초과하는 상당한 부분적 또는 전신 조사 노출된 사람에서 관찰된다. 조혈성 증후군은 면역 시스템에 대한 손상의 수반을 발생시키는 혈구 수치, 적혈구 및 백혈구, 및 혈소판의 변화를 갖는 범혈구감소증 (pancytopenia)로 이어지는 골수 기능의 극심한 저하를 특징으로 한다. 말초 혈액에 존재하는 소수의 호중구 및 혈소판과 함께, 나디르 (nadir)가 발생하면, 호중구감소증 (neutropenia), 열병 (fever), 패혈성 및 제어 불가능한 출혈의 합병증은 죽음으로 이어진다.

본 연구에서, mAbH6의 투여는 7.0 Gy으로 조사된 Swiss-Webster 수컷 마우스에서 전신 x-선 조사의 생존 가능성을 증가시키는 것으로 발견되었다. 특히, 7.0 Gy 노출 수준에서, 30일에 생존한 mAbOMS646을 받은 동물 중 80%를 비히클 처리된 대조군 조사된 동물의 35%와 비교하였다. 중요하게는, 이 처리된 그룹의 죽음의 첫번 째 날은 조사 후 15일까지 발생하지 않았고, 비히클 처리된 대조군 조사된 동물에서 관찰된 것 보다 7일 증가하였다. 신기하게도, 더 낮은 X-선 노출 (6.5 Gy)에서, mAbOMS646의 투여는 비히클 처리된 대조군 조사된 동물과 비교하여 생존 가능성 또는 치사의 연장에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 어떤 가정의 증명도 미생물 배양 및 혈액학적 파라미터를 위한 중간 샘플 수거를 포함하는, 추가적인 연구가 필요할 수 있지만, 노출 수준 사이의 반응의 이 차이에 대한 다중적인 이유가 있을 수 있다. 한 설명은 간단하게 그룹에 할당된 동물의 수가 어떤 미묘한 처리-관련 차이를 보이는 것도 배제할 수도 있다는 것이다. 예를 들어, n=20인 그룹 크기로, 65% (6.5 Gy 노출에서 mAbOMS646) 및 80% (7.0 Gy 노출에서 mAbH6) 사이의 생존의 차이는 3마리 동물이다. 반면에, 35% (7.0 Gy 노출에서 비히클 대조군) 및 80% (7.0 Gy 노출에서 mAbOMS646) 사이의 차이는 9마리의 동물이고, 처리-관련 차이의 타당한 증거를 제공한다.

이들 결과는 항-MASP-2 항체가 급성 방사선 증후군의 해로운 영향에 걸릴 위험이 있거나, 이로 고통받는 포유동물 대상체를 치료하는데 있어서 효과적이다는 것을 입증한다.

연구 #2

Swiss Webster 마우스 (n=50)를 이온화 방사선 (8.0 Gy)에 노출시켰다. 치사에 대한, 방사선 노출 18시간 전 및 2시간 후, 및 이후 매주 투여된, 항-MASP-2 항체 치료 (OMS646 5mg/kg)의 효과를 평가하였다.

연구 #2의 결과

항-MASP-2 항체 OMS646의 투여가 8.0 Gy에 노출된 마우스의 생존을 증가시키며, 비히클 대조군을 받은 마우스와 비교하여 4 내지 6일의 조정된 중간 생존율, 및 비히클 대조군을 받은 마우스와 비교할 때 12% 감소된 치사율 (로그-랭크 테스트, p=0.040)을 갖는 것으로 결정되었다.

연구 #3

Swiss Webster 마우스 (n=50)를 다음 그룹으로 이온화 방사선 (8.0 Gy)에 노출시켰다: (I: 비히클) 식염수 대조군; (II: 낮음) 조사 18시간 전 및 조사 2시간 후 투여된 항-MASP-2 항체 OMS646 (5mg/kg), (III: 높음) 조사 18시간 전 및 조사 2시간 후 투여된 OMS646 (10mg/kg); 및 (IV: 높고 이후) 조사 2시간 후에만 투여된 OMS646 (10mg/kg).

연구 #3의 결과

조사 전 및 조사 후 항-MASP-2 항체의 투여는 비히클 대조군을 받은 동물과 비교하여 4 내지 5일의 평균 생존을 조정한다는 것으로 결정되었다. 항-MASP-2 항체-처리된 마우스의 치사율은 비히클 대조군 마우스와 비교하여 6-12% 감소하였다. 상당한 해로운 처리 효과는 관찰되지 않았다는 것이 추가로 지적되었다.

요약하면, 이 실시예의 결과는 본 발명의 항-MASP-2 항체가 급성 방사선 증후군의 해로운 효과에 걸릴 위험이 있거나, 이로 고통받는 포유동물 대상체를 치료하는데 있어서 효과적이다는 것을 입증한다.

실시예 12

이 실시예는 OMS646 항체 (17D20m_d3521N11), 힌지 영역에서 돌연변이된 완전한 사람 항-사람 MASP-2 IgG4 항체의 추가의 특성을 설명한다.

방법:

OMS646 (17D20m_d3521N11), 힌지 영역에서 돌연변이된 완전한 사람 항-사람 MASP-2 IgG4 항체를 상기 실시예 2-8에 설명된 바와 같이 발생시켰다. OMS646 항체를 OMS646의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 구조로 안정하게 트랜스펙션된 CHO 세포주의 배양 상층액으로부터 정제하였다. 세포는 PF-CHO 배지에서 16 내지 20일 동안 키워졌고 세포 생존 능력이 50% 이하로 떨어졌을 때 세포가 없는 상층액을 수거하였다. OMS646을 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 이어 이온 교환, 농축 및 PBS로 버퍼 교환에 의해 정제하였다.

1. OMS646은 높은 친화도로 사람 MASP -2에 결합한다

재조합 사람 MASP -2에 결합하는 고정된 OMS646의 표면 플라스몬 공명 (Biocore) 분석

방법:

OMS646을 CM5 칩에 커플링하는 아민에 의해 다양한 밀도로 고정하였고 9 nM, 3 nM, 1 nM 또는 0.3 nM에서 용해된 재조합 사람 MASP-2의 결합 및 해리를 결합 (K_on) 및 해리 속도 상수 (K_off)를 결정하기 위해 시간이 흐름에 따라 기록하였다. 평형 결합 상수 (K_D)를 실험적 K_on 및 K_off 값에 기초하여 계산하였다.

결과:

도 19는 OMS646에 대한 표면 플라스몬 공명 (Biocore) 분석의 결과를 그래프로 설명하며, 고정된 OMS646은 약 1-3x10^-4 S^-1의 K_off 속도 및 약 1.6-3x10⁶M^-1S^-1의K_on 속도로 재조합 MASP-2에 결합한다는 것을 나타내고, 이들 실험 조건 하에서 친화도 (약 92 pM의 K_D)를 나타낸다. 용액에서 고정된 OMS646의 밀도 및 MASP-2의 농도에 의존하여, 50 내지 250 pM의 범위에서 실험적 K_D 값을 결정하였다.

고정된 재조합 사람 MASP -2에 결합하는 OMS646의 ELISA 검정

방법: 고정된 재조합 MASP-2에 결합하는 OMS646의 용량-반응을 평가하기 위해 ELISA 검정을 수행하였다. 재조합 사람 MASP-2 (50 ng/웰)을 4 ℃에서 하룻밤 동안 PBS에서 maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc)에 고정하였다. 그 다음날, 플레이트를 PBS-Tween (0.05%)로 세 번 세척함으로써 차단하였다. 차단 버퍼에서 OMS646의 단계 희석 시리즈 (0.001 내지 10 nM의 범위의 농도)를 MASP-2 코팅된 웰에 추가하였다. OMS646이 고정된 항원에 결합하는 것을 허용하기 위해 1시간 배양 후, 웰을 결합되지 않은 OMS646을 제거하기 위해 세척하였다. 결합된 OMS646을 HRP-표지된 염소 항-사람 IgG 항체 (Qualex; diluted 1:5000 in blocking 버퍼)를 사용한 후 이어서 TMB 퍼옥시다제 기질 (Kirkegaard & Perry Laboratories)로 전개하여 검출하였다. 퍼옥시다제 반응을 100 μL/웰의 1.0 M H₃PO₄를 추가하으로써 중단하였고, 기질 전환을 96 웰 플레이트 리더 (Spectramax)를 사용하여 450 nM에서 광도 측정에 의해 정량하였다. 단일 결합 부위 곡선 맞춤 알고리즘 (Graphpad)을 사용하여 K_D 값을 계산하였다.

결과:

도 20은 고정된 사람 MASP-2에 대한 OMS646의 결합 친화도를 결정하기 위한 ELISA 검정의 결과를 그래프로 설명한다. 도 20에 나타난 바와 같이, OMS646은 85 ± 5 pM의 K_D로 고정된 재조합 사람 MASP-2에 결합하며, 이것은 도 19에 나타난 바와 같이 Biocore 분석에서 얻어진 결과와 일치한다는 것이 결정되었다. 이들 결과는 OMS646이 사람 MASP-2에 대한 높은 친화도를 가지며, 대략 100pM의 K_D를 갖는다는 것을 입증한다.

2. OMS646은 만난-코팅된 표면에서 C4 활성화를 억제하지만, 면역 복합체-코팅된 표면에서는 아니다.

방법:

C4 활성화를 각각 다음과 같이, 도 21a 및 21b에 나타난 농도 범위에서 OMS646의 존재 또는 부재시 만난-코팅된 표면 또는 면역 복합체-코팅된 표면에서 측정하였다.

MASP-2의 C4 절단 활성을 측정하기 위한 다음 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 렉틴 경로를 활성화하기 위해 1% 사람 혈청과 함께 37 ℃에서 60분 동안 배양하였다. 웰을 세척하였고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰에 고정된 사람 C4b에 대하여 검정하였다. 이 검정에서 발생한 C4b의 양은 MASP-2 의존적 C4 절단 활성의 측정값이다. 선택된 농도의 항-MASP-2 항체를 이 검정에서 C4 절단을 억제하는 그것들의 능력에 대하여 테스트하였다.

방법:

만난-코팅된 표면에서 C4 활성화:

렉틴-경로에서 OMS646의 효과를 결정하기 위해, 96-웰 Costar 배지 결합 플레이트를 5 ℃에서 하룻밤 동안 만난으로 코팅하였으며, 만난의 40 μg/mL 용액의 50 μL은 50　mM 카르보네이트 버퍼, pH　9.5에 희석되었다. 각 웰을 200 μL PBS로 세 번 세척하였다. 웰을 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민의 100 μL/웰로 차단하였고 부드럽게 혼합하면서 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 각 웰을 PBS의 200 μL로 세 번 세척하였다. 별도의 96 웰 플레이트에서, MASP-2 항체 (OMS646)의 단계 희석액을 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 버퍼 (4.0　mM 바비탈, 141　mM NaCl, 1.0　mM MgCl₂, 2.0　mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH　7.4)에서 5 ℃에서 1시간 동안 1% 사람 혈청과 사전 배양하였다. 이들 항체-형성 사전 배양 혼합물은 이후에 만난-코팅된 검정 플레이트의 해당하는 웰로 옮겨졌다. 보체 활성화를 검정 플레이트의 37 ℃ 항온조로의 이동에 의해 시작하였다. 60분 배양 후, 반응 혼합물에 EDTA를 추가함으로써 반응을 중단하였다. 각 웰을 200 μL PBS-Tween　20 (PBS 중의 0.05% Tween　20)로 다섯 번 세척하였고, 각 웰을 200 μL PBS로 두 번 세척하였다. 비오틴-콘쥬게이션된 닭 항-사람 C4c (Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)의 1:100 희석의 100 μL/웰을 2.0　mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA)를 함유하는 PBS에 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 각 웰을 200 μL PBS로 다섯 번 세척하였다. 퍼옥시다제-콘쥬게이션된 스트렙타비딘 (Pierce Chemical #21126)의 0.1 μg/ml의 100 μL/웰을 2.0 mg/ml BSA를 함유하는 PBS에 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 각 웰을 200 μL PBS로 다섯 번 세척하였다. 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)의 100 μL/웰을 추가하였고 상온에서 10분 동안 배양하였다. 퍼옥시다제 반응을 1.0 M H₃PO₄의 100　μL/웰을 추가함으로써 중단하였고 OD₄₅₀을 측정하였다.

면역-복합체 코팅된 표면에서 C4 활성화

고전적 경로에 대한 OMS646의 효과를 측정하기 위해, 상기 설명된 검정을 면역-복합체 코팅된 플레이트를 사용하는 것으로 변형하였다. 검정을 상기 렉틴 경로에 대하여 상세히 설명된 바와 같이 수행하였으며, 고전적 경로를 통해 C4 활성화를 자극하기 위해 사용된 정제된 양 IgG로 코팅되었다는 차이를 갖는다.

결과:

도 21a는 OMS646의 존재 또는 부재시 만난-코팅된 표면상에서 C4 활성화의 수준을 그래프로 설명한다. 도 21b는 OMS646의 존재 또는 부재시 IgG-코팅된 표면상에서 C4 활성화의 수준을 그래프로 설명한다. 도 21a에 나타난 바와 같이, OMS646은 1% 사람 혈청에서 대략 0.5 nM의 IC₅₀로 만난-코팅된 표면상에서 C4 활성화를 억제한다. 10번의 독립적인 실험에서 얻어진 IC₅₀ 값은 0.52 ± 0.28 nM (평균 ± SD). 반대로, 도 21b에 나타난 바와 같이, OMS646은 IgG-코팅된 표면상에서 C4 활성화를 억제하지 않았다. 이들 결과는 OMS646이 보체 성분 C4의 렉틴-의존적 활성화를 차단하지만 고전적 경로-의존적 활성화를 차단하지 않는다는 것을 입증한다.

3. OMS646은 말단 보체 성분의 렉틴-의존적 활성화를 차단한다

방법:

막 공격 복합체 (MAC) 침착에 대한 OMS646의 효과를 렉틴 경로, 고전적 경로 및 대체 경로에 대한 경로-특이적 조건을 사용하여 분석하였다. 이 목적을 위해, Wieslab Comp300 보체 스크리닝 키트 (Wieslab, Lund, Sweden)를 제조사의 지시에 따라 사용하였다.

결과:

도 22a는 렉틴 경로-특이적 검정 조건 하에 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 MAC 침착의 수준을 그래프로 설명한다. 도 22b는 고전적 경로-특이적 검정 조건 하에 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 MAC 침착의 수준을 그래프로 설명한다. 도 22c는 대체 경로-특이적 검정 조건 하에 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 MAC 침착의 수준을 그래프로 설명한다.

도 22a에 나타난 바와 같이, OMS646은 대략 1 nM의 IC₅₀ 값으로 MAC 침착의 렉틴 경로-매개된 활성화를 차단한다. 하지만, OMS646은 고전적 경로-매개된 활성화 (도 22b) 또는 대체 경로-매개된 활성화 (도 22c)로부터 발생한 MAC 침착에 대하여 아무런 효과가 없었다.

4. OMS646은 생리학적 조건 하에 렉틴 경로 활성화를 효과적으로 억제한다

방법:

렉틴 의존적 C3 및 C4 활성화를 다음과 같이 다양한 농도의 OMS646의 부재 및 존재시 90% 사람 혈청에서 평가하였다:

C4 활성화 검정

렉틴-의존적 C4 활성화에 대한 OMS646의 효과를 평가하기 위해, 96-웰 Costar 배지 결합 플레이트를 만난 (50 mM 카르보네이트 버퍼의 40 μg/mL 용액의 50 μL, pH 9.5)의 2 μg으로 5 ℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 플레이트를 200 μL PBS로 세 번 세척하였고 부드럽게 혼합하면서 상온에서 한 시간 동안 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민의 100 μL/웰로 차단하였다. 별도의 사전 배양 플레이트에서, OMS646의 선택 농도를 90% 사람 혈청과 혼합하였고 얼음 위에서 1시간 동안 배양하였다. 이들 항체-혈청 사전 배양 혼합물을 얼음 상의 검정 플레이트의 만난-코팅된 웰로 옮겼다. 검정 플레이트를 보체 활성화를 허용하는 얼음이 들어있는 그릇에서 90분 동안 배양하였다. 반응 혼합물에 EDTA를 추가함으로써 반응을 중단하였다. 각 웰을 200 μL의 PBS-Tween 20 (PBS 중의 0.05% Tween 20)로 다섯 번 세척하였고, 각 웰을 200 μL PBS로 두 번 세척하였다. 비오틴-콘쥬게이션된 닭 항-사람 C4c (Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)의 1:1000 희석액의 100 μL/웰을 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS에 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 각 웰을 200 μL PBS로 5번 세척하였다. 퍼옥시다제-콘쥬게이션된 스트렙타비딘 (Pierce Chemical #21126)의 0.1 μg/mL의 100 μL/웰을 2.0 mg/ml BSA를 함유하는 PBS에 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 각 웰은 200 μL PBS로 다섯 번 세척하였다. 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirdegaard & Perry Laboratories)의 100 μL/웰을 추가하였고 상온에서 16분 동안 배양하였다. 1.0M H₃PO₄의 100 μL/웰을 추가함으로써 퍼옥시다제 반응을 중단하였고 OD₄₅₀을 측정하였다.

C3 활성화 검정

렉틴-의존적 C3 활성화에 대한 OMS646의 효과를 평가하기 위해, 검정을 종료점으로서 C3 침착을 평가한 점을 제외하고, 상기 설명된 C4 활성화 검정과 동일한 방식으로 수행하였다. C3 침착을 다음과 같이 정량하였다. 보체 침착 반응의 끝에, 플레이트를 상기 설명된 바와 같이 세척하였고 이후에 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS 중의 토끼 항-사람 C3c 항체 (Dako)의 1:5000 희석액의 100 μL/웰과 함께 1시간 동안 배양하였다. 각 플레이트를 200 μL PBS로 다섯 번 세척하였고 2.0 mg/ml BSA를 함유하는 PBS 중의 HRP-표지된 염소 항-토끼 IgG (American Qualex Antibodies)의 100 μL/웰과 함께 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 200 μL PBS로 다섯 번 세척하였고 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)의 100 μL/웰을 추가하였고 상온에서 10분 동안 배양하였다. 퍼옥시다제 반응을 1.0M H₃PO₄의 l00 μL/웰을 추가함으로써 중단하였고 OD₄₅₀을 측정하였다. 에스자 용량-반응 곡선 맞춤 알고리즘 (GraphPad)을 실험 데이터 세트에 적용하여 IC₅₀ 값을 유도하였다.

결과:

도 23a는 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 렉틴 경로 특이적 조건 하에 90% 사람 혈청의 다양한 농도에서 C3 침착의 수준을 그래프로 설명한다. 도 23b는 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 렉틴 경로 특이적 조건 하에 90% 사람 혈청의 다양한 농도에서 C4 침착의 수준을 그래프로 설명한다. 도 23a에 나타난 바와 같이, OMS646은 90% 사람 혈청에서 IC₅₀ = 3 ± 1.5 nM로 C3 침착을 차단한다 (n=6). 도 23b에 나타난 바와 같이, OMS646은 IC₅₀ = 2.8 ± 1.3 nM로 C4 침착을 차단한다 (n=6).

이들 결과는 OMS646은 생리학적 조건 하에 렉틴 경로 활성화의 강한, 효과적인 차단을 제공하고, 그로 인해 OMS646의 낮은 치료적 용량의 사용에 대한 지지를 제공한다. 이들 데이터이 기초하여, OMS646이 20 nM (3μg/mL) 이하의 혈장 농도로 환자의 순환에서 렉틴 경로의 >90%를 차단하는 것으로 결정되었다. 대략 3L의 전형적인 사람의 혈장 부피, 및 투여된 항체 물질의 대부분이 혈장에 유지된다는 지식 (Lin Y.S. et al., JPET 288:371 (1999))에 기초하여, 정맥 내 투여된 10 mg만큼 낮은 OMS646의 용량이 급성 기간 동안 (즉, 일시적인 기간, 예를 들어, 1 내지 3일) 렉틴 경로를 차단하는데 있어서 효과적일 것으로 예상된다. 만성 질환의 맥락에서, 최대한의 치료 효과를 달성하기 위해 연장된 기간 동안 렉틴 경로를 차단하는 것이 유리할 수도 있다. 따라서, 이러한 만성 질병에 대하여, 100 mg의 OMS646 투여가 바람직할 수도 있으며, 이것은 적어도 1주 이상 동안 성인 사람 대상체에서 렉틴 경로를 차단하는데 있어서 효과적인 것으로 예상된다. 사람의 항체에 대하여 일반적으로 관찰되는 느린 제거 및 긴 반감기가 제공되면, OMS646의 100 mg은 일주일보다 더 긴 기간 동안, 예를 들어, 2주, 또는 4주 동안 효과적일 수도 있다는 것이 가능하다. 더 많은 용량의 항체 (즉, 100 mg 이상, 예를 들어, 200 mg, 500 mg 이상, 예를 들어, 700 mg 또는 1000 mg 이상)가 더 긴 작용 기간 (예를 들어, 2주 이상)을 갖는 것으로 예상된다.

5. OMS646은 원숭이에서 렉틴 경로 활성화를 차단한다

실시예 10에 상기 설명되고 도 17에 나타난 바와 같이, OMS646이 아프리카 사바나 원숭이에 OMS646 (3 mg/kg)의 정맥 내 투여 후 이어서 렉틴 경로 활성의 회복 후 약 72시간의 기간 동안 전신성 렉틴 경로 활성을 제거하는 것으로 결정되었다.

이 실시예는 다음과 같이, 렉틴 의존적 C4 활성화가 다양한 농도의 OMS646의 범위에서 및 OMS646의 부재시 90% 아프리카 사바나 원숭이 혈청 또는 90% 게먹이 원숭이 혈청에서 평가되는 추적 연구를 설명한다:

다른 비-사람 영장류 종에서 렉틴-의존적 C4 활성화에 대한 OMS646의 효과를 평가하기 위해, 96-웰 Costar 배지 결합 플레이트를 2 μg의 만난 (50 mM 카르보네이트 버퍼 중의 40 μg/mL 용액의 50 μL, pH 9.5)으로 5 ℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 플레이트를 200 μL PBS로 세 번 세척하였고 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민의 100 μL/웰로 부드럽게 혼합하면서 상온에서 한 시간 동안 차단하였다. 별도의 사전 배양 플레이트에서, OMS646의 선택 농도를 아프리카 사바나 원숭이 또는 게먹이 원숭이로부터 수거된 90% 혈청과 혼합하였고 얼음 위에서 1시간 동안 배양하였다. 이들 항체-혈청 사전 배양 혼합물을 얼음 위의 검정 플레이트의 만난-코팅된 웰로 옮겼다. 검정 플레이트를 보체 활성화를 허용하기 위해 얼음이 들어있는 그릇에서 90분 동안 배양하였다. 반응 혼합물에 EDTA를 추가함으로써 반응을 중단하였다. 각 웰을 200 μL PBS-Tween 20 (PBS 중의 0.05% Tween 20)로 다섯 번 세척하였고, 각 웰을 200 μL PBS로 두 번 세척하였다. 비오틴-콘쥬게이션된 닭 항-사람 C4c (Immunosystem AB, Uppsala, Sweden)의 1:1000 희석액의 100 μL/웰을 2.0 mg/ml BSA를 함유하는 PBS에 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 각 웰을 200 μL PBS로 다섯 번 세척하였다. 퍼옥시다제-콘쥬게이션된 스트렙타비딘 (Pierce Chemical #21126)의 0.1 μg/mL의 100 μL/웰을 2.0 mg/ml BSA를 함유하는 PBS에 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 각 웰을 200 μL PBS로 다섯 번 세척하였다. 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)의 100 μL/웰을 추가하였고 상온에서 10분 동안 배양하였다. 퍼옥시다제 반응을 1.0 M H₃PO₄의 100 μL/웰을 추가함으로써 중단하였고 OD₄₅₀을 측정하였다. 에스자 용량-반응 곡선 맞춤 알고리즘 (GraphPad)을 실험 데이터 세트에 적용하여 IC₅₀ 값을 유도하였다.

결과:

90% 게먹이 원숭이 혈청 (도 24a) 및 90% 아프리카 사바나 원숭이 혈청 (도 24b)에서 렉틴 경로 억제의 용량 반응은 각각 30 nM 내지 50 nM, 및 15 nM 내지 30 nM의 범위의 IC₅₀ 값을 갖는 것으로 관찰되었다.

요약하면, OMS646, 완전한 사람 항-사람 MASP-2 IgG4 항체 (힌지 영역에서 돌연변이됨)는 다음 유리한 성질을 갖는 것으로 관찰되었다: 사람 MASP-2에 고 친화도 결합 (1-3x10^-4 S^-1범위의K_off 속도 및 1.6-3x10⁶M^-1S^-1 범위의 K_on 속도를 갖는 50 내지 250 pM의 범위의 K_D; 1% 사람 혈청에서 0.52 ± 0.28 nM의 IC₅₀ (n=10); 및 90% 혈청에서 3 ± 1.5nM의 IC₅₀으로 C4 침착의 억제하는 사람 혈청의 기능적 힘); 및 15 내지 50 nM의 범위의 IC₅₀으로 C4 침착의 억제를 나타내는 원숭이에서 교차 반응성 (90% 원숭이 혈청).

상기 설명된 바와 같이, 100 mg의 용량의 OMS646 (평균 사람에 대하여 0.15 mg/kg에 해당)이 적어도 일주일 이상 동안 환자의 순환에서 렉틴 경로를 차단하는 것으로 예상되는 한편, 10 mg만큼 낮은 용량의 OMS646 (평균 사람에 대하여 0.15 mg/kg에 해당)은 사람 순환에서 렉틴 경로를 급성으로 차단하는데 있어서 효과적인 것으로 예상된다 (예를 들어, 적어도 1 내지 3일의 기간 동안). 더 큰 용량의 OMS646 (예를 들어, 100 mg 이상, 예를 들어, 적어도 200 mg, 적어도 300 mg, 적어도 400 mg, 적어도 500 mg 이상), 및 바람직하게 피하 (sc) 또는 근육 내 (im) 투여 루트를 효과적인 렉틴 경로 제거의 시간 창을 2주 및 바람직하게 4주로 더 연장하기 위해 이용할 수 있다.

예를 들어, 여기에서 실험 데이터에 나타난 바와 같이, 영장류에서 1 mg/kg OMS646의 용량은 1일 동안 렉틴 경로의 억제를 일으켰고, OMS646의 3 mg/kg 용량은 약 3일 (72시간) 동안 렉틴 경로의 억제를 일으켰다. 그러므로, 7 내지 10 mg/kg의 더 큰 용량은 약 7일의 기간 동안 렉틴 경로를 억제하는데 효과적일 것으로 추정된다. 여기에 나타난 바와 같이, OMS646은 원숭이 MASP-2에 비해 사람 MASP-2에 대하여 5-10배 더 큰 힘을 갖는다. 비슷한 약물동력학을 가정하면, 사람에서 효과적인 렉틴 경로 제거를 달성하기 위한 예상된 용량 범위는 하기 표 30에 나타난다.

표 30: 생체 내 렉틴 경로를 억제하는 OMS646 투여

본 발명의 바람직한 구체예가 예시되고 설명되는 한편, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 다양한 변화가 이루어질 수 있다는 것이 인정될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Omeros Corporation <120> COMPOSITIONS FOR INHIBITING MASP-2 DEPENDENT COMPLEMENT ACTIVATION <130> MP.1.0115.PCT <150> 61/482567 <151> 2011-05-04 <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2460 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (22)..(2082) <400> 1 ggccagctgg acgggcacac c atg agg ctg ctg acc ctc ctg ggc ctt ctg 51 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu 1 5 10 tgt ggc tcg gtg gcc acc ccc ttg ggc ccg aag tgg cct gaa cct gtg 99 Cys Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val 15 20 25 ttc ggg cgc ctg gca tcc ccc ggc ttt cca ggg gag tat gcc aat gac 147 Phe Gly Arg Leu Ala Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp 30 35 40 cag gag cgg cgc tgg acc ctg act gca ccc ccc ggc tac cgc ctg cgc 195 Gln Glu Arg Arg Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg 45 50 55 ctc tac ttc acc cac ttc gac ctg gag ctc tcc cac ctc tgc gag tac 243 Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr 60 65 70 gac ttc gtc aag ctg agc tcg ggg gcc aag gtg ctg gcc acg ctg tgc 291 Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys 75 80 85 90 ggg cag gag agc aca gac acg gag cgg gcc cct ggc aag gac act ttc 339 Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe 95 100 105 tac tcg ctg ggc tcc agc ctg gac att acc ttc cgc tcc gac tac tcc 387 Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser 110 115 120 aac gag aag ccg ttc acg ggg ttc gag gcc ttc tat gca gcc gag gac 435 Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp 125 130 135 att gac gag tgc cag gtg gcc ccg gga gag gcg ccc acc tgc gac cac 483 Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His 140 145 150 cac tgc cac aac cac ctg ggc ggt ttc tac tgc tcc tgc cgc gca ggc 531 His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly 155 160 165 170 tac gtc ctg cac cgt aac aag cgc acc tgc tca gcc ctg tgc tcc ggc 579 Tyr Val Leu His Arg Asn Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly 175 180 185 cag gtc ttc acc cag agg tct ggg gag ctc agc agc cct gaa tac cca 627 Gln Val Phe Thr Gln Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro 190 195 200 cgg ccg tat ccc aaa ctc tcc agt tgc act tac agc atc agc ctg gag 675 Arg Pro Tyr Pro Lys Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu 205 210 215 gag ggg ttc agt gtc att ctg gac ttt gtg gag tcc ttc gat gtg gag 723 Glu Gly Phe Ser Val Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu 220 225 230 aca cac cct gaa acc ctg tgt ccc tac gac ttt ctc aag att caa aca 771 Thr His Pro Glu Thr Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr 235 240 245 250 gac aga gaa gaa cat ggc cca ttc tgt ggg aag aca ttg ccc cac agg 819 Asp Arg Glu Glu His Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg 255 260 265 att gaa aca aaa agc aac acg gtg acc atc acc ttt gtc aca gat gaa 867 Ile Glu Thr Lys Ser Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu 270 275 280 tca gga gac cac aca ggc tgg aag atc cac tac acg agc aca gcg cag 915 Ser Gly Asp His Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln 285 290 295 cct tgc cct tat ccg atg gcg cca cct aat ggc cac gtt tca cct gtg 963 Pro Cys Pro Tyr Pro Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val 300 305 310 caa gcc aaa tac atc ctg aaa gac agc ttc tcc atc ttt tgc gag act 1011 Gln Ala Lys Tyr Ile Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr 315 320 325 330 ggc tat gag ctt ctg caa ggt cac ttg ccc ctg aaa tcc ttt act gca 1059 Gly Tyr Glu Leu Leu Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala 335 340 345 gtt tgt cag aaa gat gga tct tgg gac cgg cca atg ccc gcg tgc agc 1107 Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser 350 355 360 att gtt gac tgt ggc cct cct gat gat cta ccc agt ggc cga gtg gag 1155 Ile Val Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu 365 370 375 tac atc aca ggt cct gga gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac 1203 Tyr Ile Thr Gly Pro Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr 380 385 390 agc tgt gaa gag acc ttc tac aca atg aaa gtg aat gat ggt aaa tat 1251 Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr 395 400 405 410 gtg tgt gag gct gat gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa aaa tca 1299 Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser 415 420 425 ctc cca gtc tgt gag cct gtt tgt gga cta tca gcc cgc aca aca gga 1347 Leu Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly 430 435 440 ggg cgt ata tat gga ggg caa aag gca aaa cct ggt gat ttt cct tgg 1395 Gly Arg Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp 445 450 455 caa gtc ctg ata tta ggt gga acc aca gca gca ggt gca ctt tta tat 1443 Gln Val Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr 460 465 470 gac aac tgg gtc cta aca gct gct cat gcc gtc tat gag caa aaa cat 1491 Asp Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His 475 480 485 490 gat gca tcc gcc ctg gac att cga atg ggc acc ctg aaa aga cta tca 1539 Asp Ala Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser 495 500 505 cct cat tat aca caa gcc tgg tct gaa gct gtt ttt ata cat gaa ggt 1587 Pro His Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly 510 515 520 tat act cat gat gct ggc ttt gac aat gac ata gca ctg att aaa ttg 1635 Tyr Thr His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu 525 530 535 aat aac aaa gtt gta atc aat agc aac atc acg cct att tgt ctg cca 1683 Asn Asn Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro 540 545 550 aga aaa gaa gct gaa tcc ttt atg agg aca gat gac att gga act gca 1731 Arg Lys Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala 555 560 565 570 tct gga tgg gga tta acc caa agg ggt ttt ctt gct aga aat cta atg 1779 Ser Gly Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met 575 580 585 tat gtc gac ata ccg att gtt gac cat caa aaa tgt act gct gca tat 1827 Tyr Val Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr 590 595 600 gaa aag cca ccc tat cca agg gga agt gta act gct aac atg ctt tgt 1875 Glu Lys Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys 605 610 615 gct ggc tta gaa agt ggg ggc aag gac agc tgc aga ggt gac agc gga 1923 Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly 620 625 630 ggg gca ctg gtg ttt cta gat agt gaa aca gag agg tgg ttt gtg gga 1971 Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly 635 640 645 650 gga ata gtg tcc tgg ggt tcc atg aat tgt ggg gaa gca ggt cag tat 2019 Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr 655 660 665 gga gtc tac aca aaa gtt att aac tat att ccc tgg atc gag aac ata 2067 Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile 670 675 680 att agt gat ttt taa cttgcgtgtc tgcagtcaag gattcttcat ttttagaaat 2122 Ile Ser Asp Phe 685 gcctgtgaag accttggcag cgacgtggct cgagaagcat tcatcattac tgtggacatg 2182 gcagttgttg ctccacccaa aaaaacagac tccaggtgag gctgctgtca tttctccact 2242 tgccagttta attccagcct tacccattga ctcaagggga cataaaccac gagagtgaca 2302 gtcatctttg cccacccagt gtaatgtcac tgctcaaatt acatttcatt accttaaaaa 2362 gccagtctct tttcatactg gctgttggca tttctgtaaa ctgcctgtcc atgctctttg 2422 tttttaaact tgttcttatt gaaaaaaaaa aaaaaaaa 2460 <210> 2 <211> 686 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg 180 185 190 Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile 210 215 220 Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu 225 230 235 240 Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly 245 250 255 Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn 260 265 270 Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly 275 280 285 Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro Met 290 295 300 Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile Leu 305 310 315 320 Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu Gln 325 330 335 Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly 340 345 350 Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly Pro 355 360 365 Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro Gly 370 375 380 Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe 385 390 395 400 Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly 405 410 415 Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu Pro 420 425 430 Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly Gly 435 440 445 Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Ile Leu Gly 450 455 460 Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu Thr 465 470 475 480 Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala Ser Ala Leu Asp 485 490 495 Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala 500 505 510 Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala Gly 515 520 525 Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Val Val Ile 530 535 540 Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu Ser 545 550 555 560 Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu Thr 565 570 575 Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val Asp Ile Pro Ile 580 585 590 Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr Pro 595 600 605 Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly 610 615 620 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 625 630 635 640 Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly 645 650 655 Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val 660 665 670 Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe 675 680 685 <210> 3 <211> 671 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala 1 5 10 15 Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp 20 25 30 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His 35 40 45 Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 50 55 60 Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser 85 90 95 Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln 115 120 125 Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His 130 135 140 Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg 145 150 155 160 Asn Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln 165 170 175 Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys 180 185 190 Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val 195 200 205 Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr 210 215 220 Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His 225 230 235 240 Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser 245 250 255 Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr 260 265 270 Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro 275 280 285 Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile 290 295 300 Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu 305 310 315 320 Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp 325 330 335 Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly 340 345 350 Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro 355 360 365 Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr 370 375 380 Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp 385 390 395 400 Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu 405 410 415 Pro Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly 420 425 430 Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Ile Leu 435 440 445 Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu 450 455 460 Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala Ser Ala Leu 465 470 475 480 Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln 485 490 495 Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala 500 505 510 Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Val Val 515 520 525 Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu 530 535 540 Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu 545 550 555 560 Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val Asp Ile Pro 565 570 575 Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr 580 585 590 Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser 595 600 605 Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe 610 615 620 Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp 625 630 635 640 Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys 645 650 655 Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe 660 665 670 <210> 4 <211> 2091 <212> DNA <213> Rat <220> <221> CDS <222> (10)..(2067) <400> 4 tggcacaca atg agg cta ctg atc gtc ctg ggt ctg ctt tgg agt ttg gtg 51 Met Arg Leu Leu Ile Val Leu Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val 1 5 10 gcc aca ctt ttg ggc tcc aag tgg cct gag cct gta ttc ggg cgc ctg 99 Ala Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu 15 20 25 30 gtg tcc ctg gcc ttc cca gag aag tat ggc aac cat cag gat cga tcc 147 Val Ser Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp Arg Ser 35 40 45 tgg acg ctg act gca ccc cct ggc ttc cgc ctg cgc ctc tac ttc acc 195 Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr 50 55 60 cac ttc aac ctg gaa ctc tct tac cgc tgc gag tat gac ttt gtc aag 243 His Phe Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys 65 70 75 ttg acc tca ggg acc aag gtg cta gcc acg ctg tgt ggg cag gag agt 291 Leu Thr Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser 80 85 90 aca gat act gag cgg gca cct ggc aat gac acc ttc tac tca ctg ggt 339 Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly 95 100 105 110 ccc agc cta aag gtc acc ttc cac tcc gac tac tcc aat gag aag cca 387 Pro Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro 115 120 125 ttc aca gga ttt gag gcc ttc tat gca gcg gag gat gtg gat gaa tgc 435 Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys 130 135 140 aga aca tcc ctg gga gac tca gtc cct tgt gac cat tat tgc cac aac 483 Arg Thr Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn 145 150 155 tac ctg ggc ggc tac tac tgc tcc tgc cga gtg ggc tac att ctg cac 531 Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His 160 165 170 cag aac aag cat acc tgc tca gcc ctt tgt tca ggc cag gtg ttc act 579 Gln Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr 175 180 185 190 ggg agg tct ggc ttt ctc agt agc cct gag tac cca cag cca tac ccc 627 Gly Arg Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro 195 200 205 aaa ctc tcc agc tgc gcc tac aac atc cgc ctg gag gaa ggc ttc agt 675 Lys Leu Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu Glu Gly Phe Ser 210 215 220 atc acc ctg gac ttc gtg gag tcc ttt gat gtg gag atg cac cct gaa 723 Ile Thr Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu 225 230 235 gcc cag tgc ccc tac gac tcc ctc aag att caa aca gac aag agg gaa 771 Ala Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu 240 245 250 tac ggc ccg ttt tgt ggg aag acg ctg ccc ccc agg att gaa act gac 819 Tyr Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp 255 260 265 270 agc aac aag gtg acc att acc ttt acc acc gac gag tca ggg aac cac 867 Ser Asn Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His 275 280 285 aca ggc tgg aag ata cac tac aca agc aca gca cag ccc tgc cct gat 915 Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp 290 295 300 cca acg gcg cca cct aat ggt cac att tca cct gtg caa gcc acg tat 963 Pro Thr Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr 305 310 315 gtc ctg aag gac agc ttt tct gtc ttc tgc aag act ggc ttc gag ctt 1011 Val Leu Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu 320 325 330 ctg caa ggt tct gtc ccc ctg aag tca ttc act gct gtc tgt cag aaa 1059 Leu Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys 335 340 345 350 gat gga tct tgg gac cgg ccg ata cca gag tgc agc att att gac tgt 1107 Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys 355 360 365 ggc cct ccc gat gac cta ccc aat ggc cac gtg gac tat atc aca ggc 1155 Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly 370 375 380 cct gaa gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac agc tgt gaa gag 1203 Pro Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu 385 390 395 act ttc tac aca atg agc agc aat ggt aaa tat gtg tgt gag gct gat 1251 Thr Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp 400 405 410 gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa aaa tcc ctc ccg gtt tgc aag 1299 Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys 415 420 425 430 cct gtc tgt gga ctg tcc aca cac act tca gga ggc cgt ata att gga 1347 Pro Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly 435 440 445 gga cag cct gca aag cct ggt gac ttt cct tgg caa gtc ttg tta ctg 1395 Gly Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu 450 455 460 ggt gaa act aca gca gca ggt gct ctt ata cat gac gac tgg gtc cta 1443 Gly Glu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu 465 470 475 aca gcg gct cat gct gta tat ggg aaa aca gag gcg atg tcc tcc ctg 1491 Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu 480 485 490 gac atc cgc atg ggc atc ctc aaa agg ctc tcc ctc att tac act caa 1539 Asp Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln 495 500 505 510 gcc tgg cca gag gct gtc ttt atc cat gaa ggc tac act cac gga gct 1587 Ala Trp Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala 515 520 525 ggt ttt gac aat gat ata gca ctg att aaa ctc aag aac aaa gtc aca 1635 Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr 530 535 540 atc aac aga aac atc atg ccg att tgt cta cca aga aaa gaa gct gca 1683 Ile Asn Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala 545 550 555 tcc tta atg aaa aca gac ttc gtt gga act gtg gct ggc tgg ggg tta 1731 Ser Leu Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu 560 565 570 acc cag aag ggg ttt ctt gct aga aac cta atg ttt gtg gac ata cca 1779 Thr Gln Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro 575 580 585 590 att gtt gac cac caa aaa tgt gct act gcg tat aca aag cag ccc tac 1827 Ile Val Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr 595 600 605 cca gga gca aaa gtg act gtt aac atg ctc tgt gct ggc cta gac cgc 1875 Pro Gly Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg 610 615 620 ggt ggc aag gac agc tgc aga ggt gac agc gga ggg gca tta gtg ttt 1923 Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe 625 630 635 cta gac aat gaa aca cag aga tgg ttt gtg gga gga ata gtt tcc tgg 1971 Leu Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp 640 645 650 ggt tct att aac tgt ggg ggg tca gaa cag tat ggg gtc tac acg aaa 2019 Gly Ser Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys 655 660 665 670 gtc acg aac tat att ccc tgg att gag aac ata ata aat aat ttc taa 2067 Val Thr Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe 675 680 685 tttgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2091 <210> 5 <211> 685 <212> PRT <213> Rat <400> 5 Met Arg Leu Leu Ile Val Leu Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser 20 25 30 Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp Arg Ser Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Thr 65 70 75 80 Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser 100 105 110 Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Thr 130 135 140 Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu 145 150 155 160 Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His Gln Asn 165 170 175 Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg 180 185 190 Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu Glu Gly Phe Ser Ile Thr 210 215 220 Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu Ala Gln 225 230 235 240 Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu Tyr Gly 245 250 255 Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser Asn 260 265 270 Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr Gly 275 280 285 Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp Pro Thr 290 295 300 Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val Leu 305 310 315 320 Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu Gln 325 330 335 Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly 340 345 350 Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly Pro 355 360 365 Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Glu 370 375 380 Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe 385 390 395 400 Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe 405 410 415 Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys Pro Val 420 425 430 Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gln 435 440 445 Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly Glu 450 455 460 Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu Thr Ala 465 470 475 480 Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu Asp Ile 485 490 495 Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln Ala Trp 500 505 510 Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly Phe 515 520 525 Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile Asn 530 535 540 Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser Leu 545 550 555 560 Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr Gln 565 570 575 Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile Val 580 585 590 Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr Pro Gly 595 600 605 Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg Gly Gly 610 615 620 Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp 625 630 635 640 Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser 645 650 655 Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr 660 665 670 Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe 675 680 685 <210> 6 <211> 670 <212> PRT <213> Rat <400> 6 Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val 1 5 10 15 Ser Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp Arg Ser Trp 20 25 30 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His 35 40 45 Phe Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 50 55 60 Thr Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro 85 90 95 Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg 115 120 125 Thr Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr 130 135 140 Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His Gln 145 150 155 160 Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly 165 170 175 Arg Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys 180 185 190 Leu Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu Glu Gly Phe Ser Ile 195 200 205 Thr Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu Ala 210 215 220 Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu Tyr 225 230 235 240 Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser 245 250 255 Asn Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr 260 265 270 Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp Pro 275 280 285 Thr Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val 290 295 300 Leu Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu 305 310 315 320 Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp 325 330 335 Gly Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly 340 345 350 Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro 355 360 365 Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr 370 375 380 Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly 385 390 395 400 Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys Pro 405 410 415 Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly Gly 420 425 430 Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly 435 440 445 Glu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu Thr 450 455 460 Ala Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu Asp 465 470 475 480 Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln Ala 485 490 495 Trp Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly 500 505 510 Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile 515 520 525 Asn Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser 530 535 540 Leu Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr 545 550 555 560 Gln Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile 565 570 575 Val Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr Pro 580 585 590 Gly Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg Gly 595 600 605 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 610 615 620 Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly 625 630 635 640 Ser Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val 645 650 655 Thr Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe 660 665 670 <210> 7 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala 130 135 <210> 8 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser 180 <210> 9 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala 1 5 10 15 Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp 20 25 30 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His 35 40 45 Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 50 55 60 Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser 85 90 95 Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln 115 120 125 Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His 130 135 140 Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg 145 150 155 160 Asn Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln 165 170 175 Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys 180 185 190 Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val 195 200 205 Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr 210 215 220 Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His 225 230 235 240 Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser 245 250 255 Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr 260 265 270 Gly Trp Lys Ile His 275 <210> 10 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys 1 5 10 15 Asp His His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg 20 25 30 Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn Lys 35 40 <210> 11 <211> 394 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro Met Ala Pro Pro Asn 1 5 10 15 Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile Leu Lys Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu Gln Gly His Leu Pro 35 40 45 Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg 50 55 60 Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu 65 70 75 80 Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro Gly Val Thr Thr Tyr 85 90 95 Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Lys 100 105 110 Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser 115 120 125 Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu 130 135 140 Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys 145 150 155 160 Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala 165 170 175 Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala 180 185 190 Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly 195 200 205 Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala 210 215 220 Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp 225 230 235 240 Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile 245 250 255 Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr 260 265 270 Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe 275 280 285 Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln 290 295 300 Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val 305 310 315 320 Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser 325 330 335 Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr 340 345 350 Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys 355 360 365 Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile 370 375 380 Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe 385 390 <210> 12 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro Met Ala Pro Pro Asn 1 5 10 15 Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile Leu Lys Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu Gln Gly His Leu Pro 35 40 45 Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg 50 55 60 Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu 65 70 75 80 Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro Gly Val Thr Thr Tyr 85 90 95 Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Lys 100 105 110 Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser 115 120 125 Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu 130 135 140 Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg 145 150 <210> 13 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro Met Ala Pro Pro Asn 1 5 10 15 Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile Leu Lys Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu Gln Gly His Leu Pro 35 40 45 Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg 50 55 60 Pro Met Pro Ala Cys Ser 65 70 <210> 14 <211> 324 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 Ile Val Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu 1 5 10 15 Tyr Ile Thr Gly Pro Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr 20 25 30 Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr 35 40 45 Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser 50 55 60 Leu Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly 65 70 75 80 Gly Arg Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp 85 90 95 Gln Val Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr 100 105 110 Asp Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His 115 120 125 Asp Ala Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser 130 135 140 Pro His Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Thr His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu 165 170 175 Asn Asn Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro 180 185 190 Arg Lys Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala 195 200 205 Ser Gly Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met 210 215 220 Tyr Val Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr 225 230 235 240 Glu Lys Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys 245 250 255 Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly 260 265 270 Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly 275 280 285 Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr 290 295 300 Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile 305 310 315 320 Ile Ser Asp Phe <210> 15 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 Ile Val Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu 1 5 10 15 Tyr Ile Thr Gly Pro Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr 20 25 30 Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr 35 40 45 Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser 50 55 60 Leu Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly 65 70 75 80 Gly Arg <210> 16 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn 20 25 30 Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala 35 40 45 Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His 50 55 60 Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr 65 70 75 80 His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn 85 90 95 Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys 100 105 110 Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly 115 120 125 Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val 130 135 140 Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys 145 150 155 160 Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly 165 170 175 Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala 180 185 190 Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile 195 200 205 Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val 210 215 220 Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser 225 230 235 240 Asp Phe <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ala Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 <210> 18 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Gly 20 25 30 Lys Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu Lys Ser Tyr Arg Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Arg Ala Gly Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 caggtcacct tgaaggagtc tggtcctgtg ctggtgaaac ccacagagac cctcacgctg 60 acctgcaccg tctctgggtt ctcactcagc aggggtaaaa tgggtgtgag ctggatccgt 120 cagcccccag ggaaggccct ggagtggctt gcacacattt tttcgagtga cgaaaaatcc 180 tacaggacat cgctgaagag caggctcacc atctccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca cgtattactg tgcacggata 300 cgacgtggag gaattgacta ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ctca 354 <210> 20 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Gly 20 25 30 Lys Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu Lys Ser Tyr Arg Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Arg Arg Gly Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Phe Gly Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Phe Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 85 90 95 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Ala 100 105 <210> 23 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (246)..(246) <223> n is a, c, g, or t <400> 23 cagccagtgc tgactcagcc cccctcactg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60 acctgctctg gagagaaatt gggggataaa tatgcttact ggtatcagca gaagccaggc 120 cagtcccctg tgttggtcat gtatcaagat aaacagcggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240 gatgangctg actattactg tcaggcgtgg gacagcagca ctgcggtatt cggcggaggg 300 accaagctga ccgtccta 318 <210> 24 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Met Tyr 35 40 45 Gln Asp Lys Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 25 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Val Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Thr Thr Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly 100 105 110 Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 115 120 <210> 26 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 tcctatgagc tgatacagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaccatt 60 acctgtgcgg gagacaacct tgggaagaaa cgtgtgcact ggtaccagca gaggccaggc 120 caggcccctg tgttggtcat ctatgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgaccga 180 ttctctgcct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcactagggg cgaagccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gacattgcta ctgatcatgt ggtcttcggc 300 ggagggacca agctcaccgt ccta 324 <210> 27 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 Ser Tyr Glu Leu Ile Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ala Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Arg Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Gly Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ile Ala Thr Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly 100 105 110 Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 115 120 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 Arg Gly Lys Met Gly 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Ser Thr Ser Ala Ala 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 Gly Phe Ser Leu Ser Arg Gly 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 Gly Asp Ser Val Ser Ser Thr 1 5 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 Leu Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu Lys Ser Tyr Arg Thr Ser Leu 1 5 10 15 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val 1 5 10 15 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 His Ile Phe Ser Ser 1 5 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 Arg Thr Tyr Tyr Arg 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Arg Ala 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Arg Arg 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Arg 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 1 5 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Phe Ala Tyr Trp 1 5 10 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 Gly Glu Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Tyr Trp 1 5 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp 1 5 10 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Arg Val His Trp 1 5 10 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 Ala Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Arg Val His Trp Tyr Gln Gln Arg 1 5 10 15 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 Asp Lys Gln Arg Pro Ser Gly 1 5 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 Asp Lys Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg 1 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly 1 5 <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 50 Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala 1 5 10 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 51 Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val Phe 1 5 <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 52 Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 1 5 10 15 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 53 Val Trp Asp Thr Thr Thr Asp His Val 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 54 Val Trp Asp Ile Ala Thr Asp His Val 1 5 <210> 55 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 55 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Gly 20 25 30 Lys Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu Lys Ser Tyr Arg Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Arg Ala Gly Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Lys 115 120 125 Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Pro Val Leu Thr 130 135 140 Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr 145 150 155 160 Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Phe Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly His Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg 180 185 190 Pro Ser Gly Ile Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr 195 200 205 Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val Phe Gly Thr Gly Thr 225 230 235 240 Lys Val Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser 245 250 255 Glu Glu Asp Leu Asn Ser His His His His His His 260 265 <210> 56 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 56 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Ala 20 25 30 Arg Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Met Ala Ile Leu Thr Ala Gly Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Ser Gly Ser Ala Ser 115 120 125 Ala Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Ser Tyr 130 135 140 Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln Thr Ala 145 150 155 160 Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Val Ser Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Arg Asp 180 185 190 Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Tyr 195 200 205 Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Val Asp Glu 210 215 220 Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Gly Ser Gly Val Phe Gly 225 230 235 240 Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser Glu Gln Lys 245 250 255 Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser His His His His His His 260 265 270 <210> 57 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 57 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Ala 20 25 30 Arg Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Met Arg Tyr Ser Ser Ser Leu Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Ser Gly Ser Ala 115 120 125 Ser Ala Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Ser 130 135 140 Tyr Glu Leu Ile Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr 145 150 155 160 Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Val Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Arg 180 185 190 Asp Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn 195 200 205 Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp 210 215 220 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val Phe 225 230 235 240 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser Glu Gln 245 250 255 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser His His His His His His 260 265 270 <210> 58 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 58 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Lys 20 25 30 Arg Ala Ala Trp Asp Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Phe Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Ile Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Ala Asp Thr Ser Arg Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Val Lys Ser Asn Ser Gly Thr Gly Ala Phe Asp Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Ser Gly Ser Ala 115 120 125 Ser Ala Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln 130 135 140 Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr 145 150 155 160 Ala Arg Ile Thr Cys Ser Arg Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Val Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Val Val Met Tyr Lys 180 185 190 Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn 195 200 205 Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp 210 215 220 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Gly Val 225 230 235 240 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser Glu 245 250 255 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser His His His His His 260 265 270 His <210> 59 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 59 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Phe Gly Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Ser Gly Ser Ala Ser 115 120 125 Ala Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Ser Tyr 130 135 140 Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala 145 150 155 160 Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp 180 185 190 Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser 195 200 205 Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Val Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu 210 215 220 Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Thr Thr Asp His Val Val 225 230 235 240 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser Glu 245 250 255 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser His His His His His 260 265 270 His <210> 60 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 60 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Phe Gly Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Ser Gly Ser Ala Ser 115 120 125 Ala Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Ser Tyr 130 135 140 Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala 145 150 155 160 Arg Val Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Arg Ser Lys Asn Val His Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp 180 185 190 Thr Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser 195 200 205 Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Val Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu 210 215 220 Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Thr Thr Asp His Val Val 225 230 235 240 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser Glu 245 250 255 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser His His His His His 260 265 270 His <210> 61 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 61 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Phe Gly Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Ser Gly Ser Ala Ser 115 120 125 Ala Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Ser Tyr 130 135 140 Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala 145 150 155 160 Arg Val Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Arg Ser Lys Asn Val His Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp 180 185 190 Thr Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser 195 200 205 Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Val Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu 210 215 220 Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Thr Thr Asp His Val Val 225 230 235 240 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser Glu 245 250 255 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser His His His His His 260 265 270 His <210> 62 <211> 984 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 gcctccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300 aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840 gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900 aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960 ctctccctgt ctctcgggaa atga 984 <210> 63 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 64 <211> 984 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 64 gcctccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300 aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840 gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900 aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960 ctctccctgt ctctcgggaa atga 984 <210> 65 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 65 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 66 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 66 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Phe Gly Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Ser Gly Ser Ala Ser 115 120 125 Ala Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Ser Tyr 130 135 140 Glu Leu Ile Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala 145 150 155 160 Thr Ile Thr Cys Ala Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Arg Val His Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Asp Asp 180 185 190 Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Asn Ser 195 200 205 Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Gly Glu Ala Gly Asp Glu 210 215 220 Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ile Ala Thr Asp His Val Val 225 230 235 240 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser Glu 245 250 255 Gln Lys Leu Ile Ser Glu 260 <210> 67 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 67 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Gly 20 25 30 Lys Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu Lys Ser Tyr Arg Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Arg Ala Gly Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Lys 115 120 125 Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Pro Val Leu Thr 130 135 140 Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr 145 150 155 160 Cys Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Met Tyr Gln Asp Lys Gln Arg 180 185 190 Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr 195 200 205 Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 Lys Leu Thr Val Leu 245 <210> 68 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 68 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Gly 20 25 30 Lys Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu Lys Ser Tyr Arg Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Arg Arg Gly Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Lys 115 120 125 Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Pro Val Leu Thr 130 135 140 Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr 145 150 155 160 Cys Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Met Tyr Gln Asp Lys Gln Arg 180 185 190 Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr 195 200 205 Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 Lys Leu Thr Val Leu 245 <210> 69 <211> 981 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtagagtgg 780 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960 tccctgtctc ccgggaaatg a 981 <210> 70 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 71 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 71 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcctcc 60 tatgagctga tacagccacc ctcggtgtca gtggccccag gacagacggc caccattacc 120 tgtgcgggag acaaccttgg gaagaaacgt gtgcactggt accagcagag gccaggccag 180 gcccctgtgt tggtcatcta tgatgatagc gaccggccct cagggatccc tgaccgattc 240 tctgcctcca actctgggaa cacggccacc ctgaccatca ctaggggcga agccggggat 300 gaggccgact attattgtca ggtgtgggac attgctactg atcatgtggt cttcggcgga 360 gggaccaagc tcaccgtcct aggccagcct aaggcggcgc cctcggtcac cctgttcccg 420 ccctcctctg aggagcttca agccaacaag gccacactgg tgtgtctcat aagtgacttc 480 tacccgggag ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg 540 gagaccacca caccctccaa acaaagcaac aacaagtacg cggccagcag ctatctgagc 600 ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaga agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg 660 agcaccgtgg agaagacagt ggcccctaca gaatgttcat ag 702 <210> 72 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 72 Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala 1 5 10 15 Thr Gln Ala Ser Tyr Glu Leu Ile Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala 20 25 30 Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ala Gly Asp Asn Leu Gly Lys 35 40 45 Lys Arg Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu 50 55 60 Val Ile Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 65 70 75 80 Ser Ala Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Gly 85 90 95 Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ile Ala 100 105 110 Thr Asp His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 115 120 125 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 130 135 140 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 165 170 175 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 180 185 190 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 195 200 205 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 210 215 220 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 <210> 73 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 73 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcccag 60 gtacagctgc agcagtcagg tccaggactg gtgaagccct cgcagaccct ctcactcacc 120 tgtgccatct ccggggacag tgtctctagc accagtgctg cttggaactg gatcaggcag 180 tccccatcga gaggccttga gtggctggga aggacatact acaggtccaa gtggtataat 240 gattatgcag tatctgtgaa aagtcgaata accatcaacc cagacacatc caagaaccag 300 ttctccctgc agctgaactc tgtgactccc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcaaga 360 gatcctttcg gggtaccttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 420 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 480 agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540 tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 600 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 660 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 720 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtagagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc ccgggaaatg a 1401 <210> 74 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 74 Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala 1 5 10 15 Thr Gln Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val 35 40 45 Ser Ser Thr Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn 65 70 75 80 Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr 85 90 95 Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp 100 105 110 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Phe Gly Val Pro Phe Asp 115 120 125 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 145 150 155 160 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn 210 215 220 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg 225 230 235 240 Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 75 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 75 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcccag 60 gtacagctgc agcagtcagg tccaggactg gtgaagccct cgcagaccct ctcactcacc 120 tgtgccatct ccggggacag tgtctctagc accagtgctg cttggaactg gatcaggcag 180 tccccatcga gaggccttga gtggctggga aggacatact acaggtccaa gtggtataat 240 gattatgcag tatctgtgaa aagtcgaata accatcaacc cagacacatc caagaaccag 300 ttctccctgc agctgaactc tgtgactccc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcaaga 360 gatcctttcg gggtaccttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 420 gcctccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 480 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 660 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 720 aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 780 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1320 aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1380 ctctccctgt ctctcgggaa atga 1404 <210> 76 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 76 Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala 1 5 10 15 Thr Gln Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val 35 40 45 Ser Ser Thr Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn 65 70 75 80 Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr 85 90 95 Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp 100 105 110 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Phe Gly Val Pro Phe Asp 115 120 125 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 145 150 155 160 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 210 215 220 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 225 230 235 240 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Gly Lys 465 <210> 77 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 77 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcccag 60 gtacagctgc agcagtcagg tccaggactg gtgaagccct cgcagaccct ctcactcacc 120 tgtgccatct ccggggacag tgtctctagc accagtgctg cttggaactg gatcaggcag 180 tccccatcga gaggccttga gtggctggga aggacatact acaggtccaa gtggtataat 240 gattatgcag tatctgtgaa aagtcgaata accatcaacc cagacacatc caagaaccag 300 ttctccctgc agctgaactc tgtgactccc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcaaga 360 gatcctttcg gggtaccttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 420 gcctccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 480 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 660 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 720 aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 780 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1320 aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1380 ctctccctgt ctctcgggaa atga 1404 <210> 78 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 78 Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala 1 5 10 15 Thr Gln Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val 35 40 45 Ser Ser Thr Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn 65 70 75 80 Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr 85 90 95 Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp 100 105 110 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Phe Gly Val Pro Phe Asp 115 120 125 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 145 150 155 160 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 210 215 220 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 225 230 235 240 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Gly Lys 465 <210> 79 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (303)..(303) <223> n is a, c, g, or t <400> 79 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcccag 60 ccagtgctga ctcagccccc ctcactgtcc gtgtccccag gacagacagc cagcatcacc 120 tgctctggag agaaattggg ggataaatat gcttactggt atcagcagaa gccaggccag 180 tcccctgtgt tggtcatgta tcaagataaa cagcggccct cagggatccc tgagcgattc 240 tctggctcca actctgggaa cacagccact ctgaccatca gcgggaccca ggctatggat 300 gangctgact attactgtca ggcgtgggac agcagcactg cggtattcgg cggagggacc 360 aagctgaccg tcctaggcca gcctaaggcg gcgccctcgg tcaccctgtt cccgccctcc 420 tctgaggagc ttcaagccaa caaggccaca ctggtgtgtc tcataagtga cttctacccg 480 ggagccgtga cagtggcctg gaaggcagat agcagccccg tcaaggcggg agtggagacc 540 accacaccct ccaaacaaag caacaacaag tacgcggcca gcagctatct gagcctgacg 600 cctgagcagt ggaagtccca cagaagctac agctgccagg tcacgcatga agggagcacc 660 gtggagaaga cagtggcccc tacagaatgt tcatag 696 <210> 80 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 80 Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala 1 5 10 15 Thr Gln Ala Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser 20 25 30 Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp 35 40 45 Lys Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu 50 55 60 Val Met Tyr Gln Asp Lys Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr 85 90 95 Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser 100 105 110 Thr Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 115 120 125 Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 130 135 140 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 165 170 175 Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 180 185 190 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 195 200 205 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 210 215 220 Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 <210> 81 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 81 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcccag 60 gtcaccttga aggagtctgg tcctgtgctg gtgaaaccca cagagaccct cacgctgacc 120 tgcaccgtct ctgggttctc actcagcagg ggtaaaatgg gtgtgagctg gatccgtcag 180 cccccaggga aggccctgga gtggcttgca cacatttttt cgagtgacga aaaatcctac 240 aggacatcgc tgaagagcag gctcaccatc tccaaggaca cctccaaaaa ccaggtggtc 300 cttacaatga ccaacatgga ccctgtggac acagccacgt attactgtgc acggatacga 360 cgtggaggaa ttgactactg gggccaggga accctggtca ctgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtagagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 cccgggaaat ga 1392 <210> 82 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 82 Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala 1 5 10 15 Thr Gln Ala Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys 20 25 30 Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Ser Arg Gly Lys Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu Lys Ser Tyr 65 70 75 80 Arg Thr Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala 100 105 110 Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Arg Arg Gly Gly Ile Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 225 230 235 240 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 83 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 83 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcccag 60 gtcaccttga aggagtctgg tcctgtgctg gtgaaaccca cagagaccct cacgctgacc 120 tgcaccgtct ctgggttctc actcagcagg ggtaaaatgg gtgtgagctg gatccgtcag 180 cccccaggga aggccctgga gtggcttgca cacatttttt cgagtgacga aaaatcctac 240 aggacatcgc tgaagagcag gctcaccatc tccaaggaca cctccaaaaa ccaggtggtc 300 cttacaatga ccaacatgga ccctgtggac acagccacgt attactgtgc acggatacga 360 cgtggaggaa ttgactactg gggccaggga accctggtca ctgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 720 cccccatgcc catcatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 780 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1380 tctctcggga aatga 1395 <210> 84 <211> 464 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 84 Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala 1 5 10 15 Thr Gln Ala Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys 20 25 30 Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Ser Arg Gly Lys Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu Lys Ser Tyr 65 70 75 80 Arg Thr Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala 100 105 110 Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Arg Arg Gly Gly Ile Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 225 230 235 240 Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 245 250 255 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 260 265 270 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 275 280 285 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 290 295 300 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 305 310 315 320 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 325 330 335 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 340 345 350 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 355 360 365 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 370 375 380 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 385 390 395 400 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 405 410 415 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 420 425 430 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 435 440 445 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 450 455 460 <210> 85 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 85 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcccag 60 gtcaccttga aggagtctgg tcctgtgctg gtgaaaccca cagagaccct cacgctgacc 120 tgcaccgtct ctgggttctc actcagcagg ggtaaaatgg gtgtgagctg gatccgtcag 180 cccccaggga aggccctgga gtggcttgca cacatttttt cgagtgacga aaaatcctac 240 aggacatcgc tgaagagcag gctcaccatc tccaaggaca cctccaaaaa ccaggtggtc 300 cttacaatga ccaacatgga ccctgtggac acagccacgt attactgtgc acggatacga 360 cgtggaggaa ttgactactg gggccaggga accctggtca ctgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 720 cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 780 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1380 tctctcggga aatga 1395 <210> 86 <211> 464 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 86 Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala 1 5 10 15 Thr Gln Ala Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys 20 25 30 Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Ser Arg Gly Lys Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu Lys Ser Tyr 65 70 75 80 Arg Thr Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala 100 105 110 Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Arg Arg Gly Gly Ile Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 225 230 235 240 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 245 250 255 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 260 265 270 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 275 280 285 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 290 295 300 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 305 310 315 320 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 325 330 335 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 340 345 350 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 355 360 365 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 370 375 380 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 385 390 395 400 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 405 410 415 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 420 425 430 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 435 440 445 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 450 455 460 <210> 87 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 87 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaccagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180 aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agagatcctt tcggggtacc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360 tcaaagcttt cagggagtgc atccgcccca aaacttgaag aaggtgaatt ttcagaagca 420 cgcgtatcct atgagctgat acagccaccc tcggtgtcag tggccccagg acagacggcc 480 accattacct gtgcgggaga caaccttggg aagaaacgtg tgcactggta ccagcagagg 540 ccaggccagg cccctgtgtt ggtcatctat gatgatagcg accggccctc agggatccct 600 gaccgattct ctgcctccaa ctctgggaac acggccaccc tgaccatcac taggggcgaa 660 gccggggatg aggccgacta ttattgtcag gtgtgggaca ttgctactga tcatgtggtc 720 ttcggcggag ggaccaagct caccgtccta 750 <210> 88 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (663)..(663) <223> n is a, c, g, or t <400> 88 caggtcacct tgaaggagtc tggtcctgtg ctggtgaaac ccacagagac cctcacgctg 60 acctgcaccg tctctgggtt ctcactcagc aggggtaaaa tgggtgtgag ctggatccgt 120 cagcccccag ggaaggccct ggagtggctt gcacacattt tttcgagtga cgaaaaatcc 180 tacaggacat cgctgaagag caggctcacc atctccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca cgtattactg tgcacggata 300 cgagcgggag gaattgacta ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ctcaaagctt 360 tcagggagtg catccgcccc aaaacttgaa gaaggtgaat tttcagaagc acgcgtacag 420 ccagtgctga ctcagccccc ctcactgtcc gtgtccccag gacagacagc cagcatcacc 480 tgctctggag agaaattggg ggataaatat gcttactggt atcagcagaa gccaggccag 540 tcccctgtgt tggtcatgta tcaagataaa cagcggccct cagggatccc tgagcgattc 600 tctggctcca actctgggaa cacagccact ctgaccatca gcgggaccca ggctatggat 660 gangctgact attactgtca ggcgtgggac agcagcactg cggtattcgg cggagggacc 720 aagctgaccg tccta 735 <210> 89 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (663)..(663) <223> n is a, c, g, or t <400> 89 caggtcacct tgaaggagtc tggtcctgtg ctggtgaaac ccacagagac cctcacgctg 60 acctgcaccg tctctgggtt ctcactcagc aggggtaaaa tgggtgtgag ctggatccgt 120 cagcccccag ggaaggccct ggagtggctt gcacacattt tttcgagtga cgaaaaatcc 180 tacaggacat cgctgaagag caggctcacc atctccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca cgtattactg tgcacggata 300 cgacgtggag gaattgacta ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ctcaaagctt 360 tcagggagtg catccgcccc aaaacttgaa gaaggtgaat tttcagaagc acgcgtacag 420 ccagtgctga ctcagccccc ctcactgtcc gtgtccccag gacagacagc cagcatcacc 480 tgctctggag agaaattggg ggataaatat gcttactggt atcagcagaa gccaggccag 540 tcccctgtgt tggtcatgta tcaagataaa cagcggccct cagggatccc tgagcgattc 600 tctggctcca actctgggaa cacagccact ctgaccatca gcgggaccca ggctatggat 660 gangctgact attactgtca ggcgtgggac agcagcactg cggtattcgg cggagggacc 720 aagctgaccg tccta 735 <210> 90 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus CDRH3 of 17D20m and d3521N11 <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> wherein Xaa at position 8 is Ala or Arg <400> 90 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Arg Xaa 1 5 <210> 91 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> consensus of CDRL1 of 17D20m and d3521N11 <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> wherein Xaa at position 2 is Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> wherein Xaa at position 8 is Phe or Tyr <400> 91 Gly Xaa Lys Leu Gly Asp Lys Xaa Ala Tyr Trp 1 5 10 <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> consensus CDRL1 of 17N16m and d17N9 <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> wherein Xaa at position 2 is Asn or Asp <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> wherein Xaa at position 4 is Ile or Leu <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> wherein Xaa at position 6 is Ser or Lys <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> wherein Xaa at position 8 is Asn or Arg <400> 92 Gly Xaa Asn Xaa Gly Xaa Lys Xaa Val His Trp 1 5 10 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> consensus CDRL2 of 17D20m and d3521N11 <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> wherein Xaa at position 2 is Asn or Lys or Ser <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> wherein Xaa at position 3 is Lys or Gln or Asp <400> 93 Asp Xaa Xaa Arg Pro Ser Gly 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> consensus CDRL3 of 17N16m and d17N9 <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> wherein Xaa at position 4 is Thr or Ile <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> wherein Xaa at position 5 is Thr or Ala <400> 94 Val Trp Asp Xaa Xaa Thr Asp His Val 1 5

Claims

사람 MASP-2에 결합하는 분리된 사람 단클론성 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편으로서,
(i) 아미노산 서열 STSAA (SEQ ID NO:29)를 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 LGRTYYRSKWYNDYAV (SEQ ID NO:33)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 AVYYCARD (SEQ ID NO:38)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 세 개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(ii) a) 위치 2에서 X는 N이고 위치 4에서 X는 I이며 위치 6에서 X는 S이고 위치 8에서 X는 N인 아미노산 서열 GXNXGXKXVHW (SEQ ID NO:92)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 DSDRPSG (SEQ ID NO:49)를 포함하는 CDR-L2, 및 위치 4에서 X는 T이고 위치 5에서 X는 T인 아미노산 서열 VWDXXTDHV (SEQ ID NO:94)를 포함하는 CDR-L3; 또는
b) 위치 2에서 X는 D이고 위치 4에서 X는 L이며 위치 6에서 X는 K이고 위치 8에서 X는 R인 아미노산 서열 GXNXGXKXVHW (SEQ ID NO:92)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 DSDRPSG (SEQ ID NO:49)을 포함하는 CDR-L2, 및 위치 4에서 X는 I이고 위치 5에서 X는 A인 아미노산 서열 VWDXXTDHV (SEQ ID NO:94)를 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 세 개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하고, 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 사람 MASP-2에 결합하여 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하는, 분리된 사람 단클론성 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
제1 항에 있어서, 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 Fab, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편 및 전체 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
제1 항에 있어서, 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 단일 사슬 항체, ScFv, 및 힌지 영역이 없는 일가 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
제1 항에 있어서, 상기 항체는 10 nM 이하의 K_D로 사람 MASP-2에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
제1 항에 있어서, 상기 항체는 10 nM 이하의 IC₅₀으로 1% 사람 혈청의 시험관 내 검정에서 C4 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
제1 항에 있어서, 상기 항체는 10 nM 이하의 IC₅₀으로 1% 사람 혈청의 시험관 내 검정에서 C3b 침착을 억제하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
제1 항에 있어서, 항체는 고전적 경로를 억제하지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
i) SEQ ID NO:21로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:25로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
ii) SEQ ID NO:21로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:27로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
iii) SEQ ID NO: 56의 아미노산 잔기 1 내지 120으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 56의 아미노산 잔기 146 내지 250으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
iv) SEQ ID NO: 57의 아미노산 잔기 1 내지 120으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 57의 아미노산 잔기 146 내지 250으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
v) SEQ ID NO: 58의 아미노산 잔기 1 내지 120으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 58의 아미노산 잔기 146 내지 250으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
vi) SEQ ID NO: 60의 아미노산 잔기 1 내지 120으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 60의 아미노산 잔기 146 내지 250으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
vii) SEQ ID NO: 61의 아미노산 잔기 1 내지 120으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 61의 아미노산 잔기 146 내지 250으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 사람 MASP-2에 결합하는 분리된 단클론성 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편.
제8 항에 있어서, SEQ ID NO:21로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:27로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 단클론성 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
제1 항 또는 제8 항에서 제시된 MASP-2 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자.
제10 항에 따르는, 본 발명의 MASP-2 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트.
제10 항에 따르는, 본 발명의 MASP-2 항체를 암호화하는 핵산 분자 중 적어도 하나를 포함하는 세포.
항-MASP-2 항체를 암호화하는 핵산 분자의 발현을 허용하는 조건 하에 제12 항의 세포를 배양하는 단계 및 상기 항-MASP-2 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 분리된 항-MASP-2 항체를 생성하는 방법.
혈관 질환, 허혈성 재관류 손상, 아테롬성 동맥 경화증, 염증성 위장 장애, 폐 질환, 체외 재관류 수술, 근골격 질환, 신장 질병, 피부 질환, 기관 또는 조직 이식, 신경계 장애 또는 손상, 혈액 장애, 비뇨생식기 질환, 당뇨병, 화학 요법 또는 방사선 요법, 악성 종양, 내분비계 장애, 응고 장애, 안과 질환, 급성 방사선 증후군으로부터 선택된 MASP-2 의존적 보체 매개된 질환으로 고통받는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화의 억제 및 진단적 및 치료적 의료 방법 및 수술 절차로부터 발생한 염증의 억제에 사용되는, 제1 항 또는 제8 항의 완전한 사람 단클론성 항-MASP-2 항체, 또는 이것의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.
제14 항에 있어서, 조성물은 동맥 내, 정맥 내, 두개 내, 근육 내, 흡입, 비강 또는 피하 투여를 위해 제형화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
사람 대상체에 치료적 투여에 적합한 제1 항 또는 제8 항의 사람 단클론성 항-MASP-2 항체의 단위 용량을 포함하는 제조 물품으로서, 단위 용량은 1mg 내지 1000mg의 범위인 제조 물품.
삭제
삭제
삭제
삭제