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KR101854931B1 - 혈청 알부민 결합성 분자 - Google Patents

혈청 알부민 결합성 분자 Download PDF

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KR101854931B1
KR101854931B1 KR1020127031428A KR20127031428A KR101854931B1 KR 101854931 B1 KR101854931 B1 KR 101854931B1 KR 1020127031428 A KR1020127031428 A KR 1020127031428A KR 20127031428 A KR20127031428 A KR 20127031428A KR 101854931 B1 KR101854931 B1 KR 101854931B1
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마이클 엘. 고쎌린
데이빗 패브리지오
조안나 에프. 스와인
트래시 에스. 미첼
레이 캠프호센
섀론 티. 클로드
에릭 푸르핀
폴 이. 모린
란잔 무커지
시메온 아이. 테일러
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브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
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Abstract

본 발명은 혈청 알부민에 결합하는 제10 피브로넥틴 유형 III 도메인 (10Fn3)을 기반으로 하는 항체-유사 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 진단 및 치료 적용분야에 사용하기 위한, 이종성 단백질에 연결된 혈청 알부민-결합성 10Fn3을 포함하는 융합 분자에 관한 것이다.

Description

혈청 알부민 결합성 분자{SERUM ALBUMIN BINDING MOLECULES}
[관련 출원]
본 출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 2011년 5월 2일자 U.S. 실용신안 출원 번호 13/098,851 및 2010년 5월 3일자 U.S. 가출원 번호 61/330,672의 우선권을 주장하는 바이다.
많은 치료제, 특히 펩티드, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드와 같은 생물학적 제제들의 이용은 불충분한 혈청 반감기라는 약점을 가지고 있다. 이는 치료 효과에 필요한 혈청 농도를 유지하기 위하여 해당 치료제를 고빈도 및/또는 고투여량으로 투여하게 하거나, 또는 지속 방출 제제를 사용하게 한다. 약물의 빈번한 전신성 투여는 상당히 좋지 않은 부작용과 연관된다. 예를 들어, 빈번한 전신성 주사는 대상체에게 상당한 불편함을 초래하며, 높은 투여 관련 감염 위험성을 야기하고, 특히 치료제가 정맥내로 투여되어야 하는 경우에는 입원 또는 빈번한 병원 방문을 요할 수 있다. 또한, 장기 치료시, 일상적인 정맥내 주사는 반복되는 혈관 천자에 의해 야기되는 조직 손상 및 혈관 병리라는 상당한 부작용으로 이어질 수도 있다. 예를 들면 당뇨병에 대한 인슐린 또는 다발성 경화증에 걸린 환자에서의 인터페론 약물의 투여와 같은 모든 빈번한 전신성 치료제 투여에 대하여 유사한 문제점이 알려져 있다. 이러한 모든 요인들은 환자 순응도의 감소 및 보건 시스템 비용의 증가로 이어진다.
본 출원은 다양한 치료제들의 혈청 반감기를 증가시키는 화합물, 증가된 혈청 반감기를 갖는 화합물, 및 치료제 혈청 반감기의 증가 방법을 제공한다. 치료제들의 혈청 반감기를 증가시키는 그와 같은 화합물 및 방법은 비용 효율적인 방식으로 제조될 수 있고, 바람직한 생물물리학적 특성들 (예컨대 Tm, 실질적인 단량체성(monomeric), 또는 우수한 폴딩성(well-folded))을 보유하며, 조직 침투를 가능하게 하기에 충분한 작은 크기를 가진다.
[발명의 개요]
본 발명은 혈청 알부민 결합성의 피브로넥틴 유형 III 제10 (10Fn3) 도메인, 및 그의 용도에 관한 것이다. 또한 본원에서 개시되는 것은 혈청 알부민 결합성 10Fn3을 포함하는 융합 분자, 및 그의 용도이다.
일 측면에서, 본 발명은, 피브로넥틴 유형 III 제10 (10Fn3) 도메인을 포함하며, 여기서 10Fn3 도메인이 1 μM 이하의 KD로 인간 혈청 알부민 (HSA)의 도메인 I 또는 II에 결합되고, 알부민 존재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기가 혈청 알부민 부재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기에 비해 5배 이상 더 큰 것인, 폴리펩티드를 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 10Fn3 도메인은 BC, DE 및 FG 루프 중 하나 이상에서, 야생형 10Fn3 도메인과 비교하여 변형된 아미노산 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 5.5 내지 7.4의 pH 범위에서 HSA에 결합된다. 일 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 5.5 내지 7.4의 pH 범위에서 200 nM 이하의 KD로 HSA에 결합된다. 또 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 pH 5.5에서 200 nM 이하의 KD로 HSA에 결합된다.
일부 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 10Fn3 도메인을 포함하며, 상기 10Fn3 도메인은 HSA에 결합하고 서열 2에 대해 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드이다. 일 실시양태에서, 상기 10Fn3 도메인은 서열 5에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 BC 루프, 서열 6에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 DE 루프, 및 서열 7에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 FG 루프 중 하나 이상을 포함한다.
전기한 측면 및 실시양태들 중 어느 하나에서, 10Fn3 도메인은 레서스(rhesus) 혈청 알부민 (RhSA), 시노몰구스 원숭이(cynomolgous monkey) 혈청 알부민 (CySA), 또는 뮤린(murine) 혈청 알부민 (MuSA) 중 하나 이상에도 결합된다. 소정 실시양태에서는, 10Fn3 도메인이 RhSA, CySA 또는 MuSA 중 하나 이상과 교차-반응하지 않는다.
전기한 측면 및 실시양태들 중 어느 하나에서, 10Fn3 도메인은 1 μM 이하의 KD로 HSA에 결합된다. 일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 500 nM 이하의 KD로 HSA에 결합된다. 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 또는 5 nM 이상의 KD로 HSA에 결합된다.
전기한 측면 및 실시양태들 중 어느 하나에서, 10Fn3 도메인은 HSA의 도메인 I 또는 II에 결합된다. 일 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 HSA의 도메인 I 및 II 모두에 결합된다. 일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 5.5 내지 7.4의 pH 범위에서 HSA에 결합된다. 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 pH 5.5에서 200 nM 이하의 KD로 HSA에 결합된다. 또 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 5.5 내지 7.4의 pH 범위에서 500 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 또는 5 nM 이상의 KD로 HSA에 결합된다. 일 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 pH 5.5에서 500 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 또는 5 nM 이상의 KD로 HSA에 결합된다.
전기한 측면 및 실시양태들 중 어느 하나에서, 혈청 알부민 존재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기는 혈청 알부민 부재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기에 비해 2배 이상 더 크다. 소정 실시양태에서, 혈청 알부민 존재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기는 혈청 알부민 부재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기에 비해 5배, 7배, 10배, 12배, 15배, 20배, 22배, 25배, 27배, 또는 30배 이상 더 크다. 일부 실시양태에서, 상기 혈청 알부민은 HSA, RhSA, CySA 또는 MuSA 중 어느 하나이다.
전기한 측면 및 실시양태들 중 어느 하나에서, 혈청 알부민 존재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기는 20시간 이상이다. 소정 실시양태에서, 혈청 알부민 존재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기는 2시간, 2.5시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 40시간, 50시간, 75시간, 90시간, 100시간, 110시간, 120시간, 130시간, 150시간, 170시간, 또는 200시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 반감기는 영장류 (예컨대 인간 또는 원숭이) 또는 뮤린에서 관측된다.
일 측면에서, 본 발명은, 10Fn3 도메인을 포함하며, 여기서 10Fn3 도메인이 HSA에 결합하고 서열 5에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 BC 루프, 서열 6에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 DE 루프, 및 서열 7에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 FG 루프를 포함하는 것인, 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 측면에서, 10Fn3 도메인은 서열 5에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 BC 루프, 서열 6에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 DE 루프, 및 서열 7에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 FG 루프 중 하나 이상을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은, 10Fn3 도메인을 포함하며, 여기서 10Fn3 도메인이 HSA에 결합하고 서열 9에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 BC 루프, 서열 10에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 DE 루프, 및 서열 11에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 FG 루프를 포함하는 것인, 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 측면에서, 10Fn3 도메인은 서열 9에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 BC 루프, 서열 10에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 DE 루프, 및 서열 11에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 FG 루프 중 하나 이상을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은, 10Fn3 도메인을 포함하며, 여기서 10Fn3 도메인이 HSA에 결합하고 서열 13에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 BC 루프, 서열 14에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 DE 루프, 및 서열 15에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 FG 루프를 포함하는 것인, 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 측면에서, 10Fn3 도메인은 서열 13에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 BC 루프, 서열 14에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 DE 루프, 및 서열 15에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 FG 루프 중 하나 이상을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은, 10Fn3 도메인을 포함하며, 여기서 10Fn3 도메인이 HSA에 결합하고 서열 17에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 BC 루프, 서열 18에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 DE 루프, 및 서열 19에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 FG 루프를 포함하는 것인, 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 측면에서, 10Fn3 도메인은 서열 17에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 BC 루프, 서열 18에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 DE 루프, 및 서열 19에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 FG 루프 중 하나 이상을 포함한다.
전기한 측면 및 실시양태들 중 어느 하나에서, 10Fn3 도메인은 레서스 혈청 알부민 (RhSA), 시노몰구스 원숭이 혈청 알부민 (CySA), 또는 뮤린 혈청 알부민 (MuSA) 중 하나 이상에도 결합된다. 일부 실시양태에서는, 10Fn3 도메인이 RhSA, CySA 또는 MuSA 중 하나 이상과 교차-반응하지 않는다. 소정 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 1 μM 이하의 KD로 HSA에 결합된다. 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 1.5 μM, 1.2 μM, 1 μM, 700 nM, 500 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 75 nM, 50 nM, 25 nM, 10 nM, 또는 5 nM 이상의 KD로 HSA에 결합된다.
전기한 측면 및 실시양태들 중 어느 하나에서, 10Fn3 도메인은 HSA의 도메인 I 또는 II에 결합된다. 소정 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 HSA의 도메인 I 및 II 모두에 결합된다. 소정 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 5.5 내지 7.4의 pH 범위에서 HSA에 결합된다. 일 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 pH 5.5에서 200 nM 이하의 KD로 HSA에 결합된다. 또 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 5.5 내지 7.4의 pH 범위에서 500 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 또는 5 nM 이상의 KD로 HSA에 결합된다. 일 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 pH 5.5에서 500 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 또는 5 nM 이상의 KD로 HSA에 결합된다.
전기한 측면 및 실시양태들 중 어느 하나에서, 혈청 알부민 존재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기는 혈청 알부민 부재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기에 비해 2배 이상 더 크다. 소정 실시양태에서, 혈청 알부민 존재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기는 혈청 알부민 부재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기에 비해 5배, 7배, 10배, 12배, 15배, 20배, 22배, 25배, 27배, 또는 30배 이상 더 크다. 일부 실시양태에서, 상기 혈청 알부민은 HSA, RhSA, CySA 또는 MuSA 중 어느 하나이다.
전기한 측면 및 실시양태들 중 어느 하나에서, 혈청 알부민 존재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기는 20시간 이상이다. 소정 실시양태에서, 혈청 알부민 존재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기는 2시간, 2.5시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 40시간, 50시간, 75시간, 90시간, 100시간, 110시간, 120시간, 130시간, 150시간, 170시간, 또는 200시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 반감기는 영장류 (예컨대 인간 또는 원숭이) 또는 뮤린에서 관측된다.
일 측면에서, 본 발명은, 피브로넥틴 유형 III 제10 (10Fn3) 도메인 및 이종성 단백질을 포함하며, 여기서 10Fn3 도메인이 1 μM 이하의 KD로 HSA에 결합하는 것인, 융합 폴리펩티드를 제공한다. 소정 실시양태에서, 상기 10Fn3 도메인은 서열 4에 대해 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 서열 5에 제시되어 있는 아미노산 서열을 갖는 BC 루프, 서열 6에 제시되어 있는 아미노산 서열을 갖는 DE 루프, 및 서열 7에 제시되어 있는 아미노산 서열을 갖는 FG 루프를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 서열 5에 제시되어 있는 아미노산 서열을 갖는 BC 루프, 서열 6에 제시되어 있는 아미노산 서열을 갖는 DE 루프, 및 서열 7에 제시되어 있는 아미노산 서열을 갖는 FG 루프 중 하나 이상을 포함한다.
일 실시양태에서, 상기 이종성 단백질은 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21), 인슐린, 인슐린 수용체 펩티드, GIP (글루코스-의존성 인슐린자극 폴리펩티드), 골 형태형성 단백질 9 (BMP-9), 아밀린, 펩티드 YY (PYY3 -36), 췌장 폴리펩티드 (PP), 인터류킨 21 (IL-21), 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1), 플렉타신, 프로그래뉼린, 오스테오칼신 (OCN), 아펠린, 또는 10Fn3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에서 선택된다. 다른 실시양태에서, 이종성 단백질은 GLP-1, 엑센딘 4, 아디포넥틴, IL-1Ra (인터류킨 1 수용체 길항제), VIP (혈관활성 장 펩티드), PACAP (뇌하수체 아데닐레이트 시클라제-활성화 폴리펩티드), 렙틴, INGAP (섬 신생 관련 단백질), BMP (골 형태형성 단백질), 및 오스테오칼신 (OCN)에서 선택된다. 일 실시양태에서, 이종성 단백질은 서열 118에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 이종성 단백질은 혈청 알부민이 아닌 다른 표적 단백질에 결합되는 제2의 10Fn3 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 표적 단백질에 결합되는 제3의 10Fn3 도메인을 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 제3 10Fn3 도메인은 제2 10Fn3 도메인과 동일한 표적에 결합된다. 다른 실시양태에서, 제3 10Fn3 도메인은 제2 10Fn3 도메인과 상이한 표적에 결합된다.
일 실시양태에서, 융합 폴리펩티드의 10Fn3 도메인은 레서스 혈청 알부민 (RhSA), 시노몰구스 원숭이 혈청 알부민 (CySA), 또는 뮤린 혈청 알부민 (MuSA) 중 하나 이상에도 결합된다. 다른 실시양태에서는, 10Fn3 도메인이 RhSA, CySA 또는 MuSA 중 하나 이상과 교차-반응하지 않는다.
소정 실시양태에서, 융합 폴리펩티드의 10Fn3 도메인은 1 μM 이하의 KD로 HSA에 결합된다. 일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 500 nM 이하의 KD로 HSA에 결합된다. 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 또는 5 nM 이상의 KD로 HSA에 결합된다.
다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드의 10Fn3 도메인은 HSA의 도메인 I 또는 II에 결합된다. 일 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 HSA의 도메인 I 및 II 모두에 결합된다. 일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 5.5 내지 7.4의 pH 범위에서 HSA에 결합된다. 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 pH 5.5에서 200 nM 이하의 KD로 HSA에 결합된다. 또 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 5.5 내지 7.4의 pH 범위에서 500 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 또는 5 nM 이상의 KD로 HSA에 결합된다. 일 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 pH 5.5에서 500 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 또는 5 nM 이상의 KD로 HSA에 결합된다.
일부 실시양태에서, 혈청 알부민 존재하에서의 융합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 혈청 알부민 부재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기에 비해 5배 이상 더 크다. 소정 실시양태에서, 혈청 알부민 존재하에서의 융합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 혈청 알부민 부재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기에 비해 2배, 5배, 7배, 10배, 12배, 15배, 20배, 22배, 25배, 27배, 또는 30배 이상 더 크다. 일부 실시양태에서, 상기 혈청 알부민은 HSA, RhSA, CySA 또는 MuSA 중 어느 하나이다.
소정 실시양태에서, 혈청 알부민 존재하에서의 융합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 20시간 이상이다. 소정 실시양태에서, 혈청 알부민 존재하에서의 융합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 2시간, 2.5시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 40시간, 50시간, 75시간, 90시간, 100시간, 110시간, 120시간, 130시간, 150시간, 170시간, 또는 200시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드의 반감기는 영장류 (예컨대 인간 또는 원숭이) 또는 뮤린에서 관측된다.
전기한 측면 및 실시양태들 중 어느 하나에서, 10Fn3 도메인은 서열 8, 12, 16, 20, 및 24-44에서 선택된 서열을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은, 피브로넥틴 유형 III 제10 (10Fn3) 도메인을 포함하며, 여기서 10Fn3 도메인이 (i) AB, BC, CD, DE, EF 및 FG 루프 중 하나 이상에서, 야생형 10Fn3 도메인과 비교하여 변형된 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 야생형 10Fn3 도메인에 의해 결합되지 않는 표적 분자에 결합하며, (iii) 서열 (ED)n을 갖는 C-말단 테일(tail)을 포함하고, 여기서 n은 3 내지 7의 정수인, 폴리펩티드를 제공한다. 소정 실시양태에서, 상기 10Fn3 도메인은 서열 1의 잔기 9-94에 제시되어 있는 아미노산 서열에 대해 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 C-말단 테일은 N-말단에 E, I 또는 EI를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, C-말단 테일은 폴리펩티드의 용해도를 향상시키고/거나, 응집을 감소시킨다.
소정 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 BC, DE 및 FG 루프 각각에서 야생형 10Fn3 도메인과 비교하여 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 1 μM 이하의 KD로 표적에 결합된다.
일부 측면에서, 본 발명은 전기한 측면 및 실시양태들 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 소정 실시양태에서, 상기 제약 조성물은 숙신산, 글리신 및 소르비톨을 포함한다. 대표적인 실시양태에서, 상기 조성물은 pH 6.0에서 5 nM 내지 30 mM의 숙신산, 5% 내지 15%의 소르비톨, 및 2.5% 내지 10%의 글리신을 포함한다. 소정 실시양태에서, 조성물은 pH 6.0에서 10 mM의 숙신산, 8%의 소르비톨, 및 5%의 글리신을 포함한다. 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 생리학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다.
[도면 및 표의 간단한 설명]
도 1. 마우스에서의 생체내 HSA 반감기. HSA를 20 mg/kg (도 1a) 또는 50 mg/kg (도 1b)으로 마우스에 주사하였다.
도 2. 마우스에서의 SABA1-4의 반감기 측정. 도 2a: SABA1.1; 도 2b: SABA2.1; 도 2c: SABA3.1; 및 도 2d: SABA4.1.
도 3. 마우스에서의 HSA와 공동-주사되었을 때의 SABA1-4의 반감기 향상을 요약하여 나타낸 그래프.
도 4. 시노몰구스 원숭이에서의 SABA1.1 (도 4a) 및 SABA5.1 (도 4b)에 대한 반감기 측정.
도 5. 직접 결합 ELISA 검정에 의한, 인간, 마우스 및 래트로부터의 알부민에 대한 SABA1.2 결합.
도 6. SABA1.1 및 HSA 화학량론의 측정. SABA1.1과 HSA는 1:1의 화학량론으로 결합한다.
도 7. HSA의 재조합 도메인 단편에 결합되는 SABA1.2의 비아코어 분석.
도 8. 원숭이에서의 1 mpk 및 10 mpk로 투여된 SABA1.2에 대한 약동학 프로파일.
도 9. 원숭이에서의 1 mpk로 정맥내 또는 피하 투여된 SABA1.2에 대한 약동학 프로파일.
도 10. FGF21 및 SABA 융합체의 생산성 발현에 사용되는 pET29b 벡터의 플라스미드 맵.
도 11. PBS 완충제 중 37℃에서의 HSA를 사용한 SABA-FGF21v1 융합체의 대표적인 등온 적정 열량법. 이와 같은 검정에서 측정된 값: N=0.87; KD=3.8×10-9 M; ΔH=-15360 cal/몰.
도 12. 37℃에서의, HSA (a), CySA (b), 및 MuSA (c)에 대한 SABA1-FGF21v1의, 또는 HSA (d), CySA (e), 및 MuSA (f)에 대한 SABA1-FGF21v3의 결합에 대한 SPR 센소그램 데이터.
도 13. 인간 혈청 알부민 존재하에서의, HEK β-클로토 세포에서의 pERK 1/2 수준을 자극함에 있어서의 His-태깅된 FGF21 대 SABA1-FGF21v1 활성의 비교.
도 14. HEK 모 세포 대 HEK β-클로토 세포에서의 pERK 1/2 수준을 자극함에 있어서의 FGF1, His6-태깅된 FGF21 및 SABA1-FGF21v1 활성의 비교. HEK 모 세포 (도 14a) 및 HEK β-클로토 발현 세포 (도 14b)에서의 pERK 1/2 수준의 용량 반응 자극의 대표적인 그래프. 3반복 샘플의 평균±sem으로 데이터를 플로팅하였다.
도 15a 및 b. 당뇨병 ob / ob 마우스에서의 SABA1-FGF21v1의 생체내 효능 조사. 식후 혈장 글루코스 수준.
도 16. 원숭이에서, SABA 및 FGF21 융합체는 His-태깅된 FGF21에 비해 t1/2을 ~27배 증가시켰다.
도 17A 및 B. HuSA/SABA1.2 복합체의 2개 도면을 나타내는데, 제2 도면 (도 17B)은 제1 도면 (도 17A)로부터 수직 축 주변으로 70° 회전된 것이다. HuSA는 표면 상으로 나타내었으며, SABA1.2는 그림으로, 즉 β-가닥은 화살표로, 루프는 줄로 나타내었다. SABA1.2 상의 변형된 루프는 흑색으로 나타낸 반면, HuSA 상의 접촉 잔기는 더 밝은 회색 음영으로 나타내었다. HuSA의 3개의 구조 도메인을 표시하였다 (즉, I, II 및 III).
도 18. 용량 상승 및 치료 코호트의 개략도 (실시예 A9 참조). 연구 주는 전체 연구 기간을 나타낸다. 각 군 내의 주 (Wk)는 해당 코호트에서의 치료 개시로부터의 기간을 나타낸다. (a) 주어진 코호트에서의 치료는 이전 코호트의 최종 대상체가 PK 분석을 허용하기 위한 29일차 방문을 완료한지 대략 4주 후까지는 개시되지 않을 것이다. (b) 각 코호트에서의 열 1, 2 또는 3은 1-주 시차 간격으로 개시되는 하위군을 나타낸다 (코호트 1의 하위군 1 및 2 사이는 15-일 간격). 군 1은 1명의 SABA1.2 치료 대상체 및 1명의 위약 대상체를 포함하게 되며; 군 2는 4명의 SABA1.2 치료 대상체 및 1명의 위약 대상체를 포함하게 되고; 군 3은 5명 (코호트 1의 경우) 또는 4명 (코호트 2 및 3의 경우)의 SABA1.2 치료 대상체 및 1명 (모든 코호트)의 위약 대상체를 포함하게 된다. 화살표 (↑)는 치료 (각 군에 있어서 1일 및 15일차)를 나타내며; 진한 선 (-)은 활성 관찰 기간을 나타내고; 점선 (…)은 안전성 추적기간을 나타낸다.
도 19. SABA1-FGF21v1을 사용한 치료 14일 후 ob/ob 마우스에서의 HbA1c의 수준.
도 20. 원숭이에서의 SABA1-FGF21v1의 평균 혈장 농도 대 시간 프로파일 (평균±SD).
도 21. 고체상 펩티드 합성 (상부)에 사용하기 위한 직교 보호(orthogonally protected) 아미노산의 예. 고체상 합성에 유용한 다른 빌딩 블록들도 예시하였다 (하부).
정의
본원에서 사용될 때, 하기의 용어 및 구들은 하기에 제시되어 있는 의미를 가지게 된다. 다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 업계 일반의 숙련자들이 보편적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 가진다.
문맥상 분명하게 다르게 구술되지 않는 한, 단수 형태인 "a", "an" 및 "the"는 복수의 내용을 포함한다.
"포함하다" 및 "포함하는"이라는 용어는 추가적인 요소가 포함될 수도 있음을 의미하는 포괄적이고도 개방적인 의미로 사용된다.
"포함한"이라는 용어는 "포함하나 그에 제한되는 것은 아닌"을 의미하는 데에 사용된다. "포함한(including)" 및 "포함하나 그에 제한되는 것은 아닌"은 호환가능하게 사용된다.
"항체-유사 단백질"이라는 용어는 "이뮤노글로불린-유사 폴드"를 갖는, 즉 약 80-150개의 아미노산 잔기를 포함하며, 베타 또는 베타-유사 가닥들의 세트로 구조적으로 조직화됨으로써 베타 시트를 형성하며, 상기 베타 또는 베타-유사 가닥들은 개재 루프 부분에 의해 연결되어 있는, 비-이뮤노글로불린 단백질을 지칭한다. 베타 시트는 항체-유사 단백질의 안정한 코어를 형성하는 동시에, 베타 또는 베타-유사 가닥들을 연결하는 루프들로 이루어지는 2개의 "전면부(face)"를 생성시킨다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 이러한 루프들은 맞춤식의 리간드 결합 부위를 생성하도록 변화될 수 있으며, 그와 같은 변이는 단백질의 전체적인 안정성을 붕괴시키지 않고도 생성될 수 있다. 이와 같은 항체-유사 단백질의 예는 "피브로넥틴-기재 스캐폴드 단백질"로서, 이는 피브로넥틴 유형 III 도메인 (Fn3) 기재의 폴리펩티드를 의미한다. 일 측면에서, 항체-유사 단백질은 제10 피브로넥틴 유형 III 도메인 (10Fn3)을 기재로 한다.
"폴리펩티드"는 길이, 번역-후 변형, 또는 기능에 관계없이, 2개 이상 아미노산을 갖는 임의의 서열을 의미한다. "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 호환가능하게 사용된다.
본원에서, "% 아미노산 서열 동일성"은 최대 % 서열 동일성을 달성하며 어떠한 보존성 치환도 서열 동일성의 일부로 고려하지 않은, 필요에 따라서는 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후의 2차 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한, 1차 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. % 아미노산 서열 동일성을 측정할 목적의 정렬은 예를 들면 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR 사) 소프트웨어와 같이 상업적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자라면, 비교되는 서열들의 전체-길이에 걸친 최대의 정렬을 달성하는 데에 필요한 소정 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터들을 확인할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적의 경우, % 아미노산 서열 동일성 값은 하기에 기술되어 있는 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 수득된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 사 저작의 것으로써, U.S. 저작권청 (워싱턴 D.C., 20559)에 유저 도큐멘테이션(user documentation)과 함께 제출되어, U.S. 저작권 등록 TXU510087로 등록되어 있으며, 캘리포니아 사우스 샌프랜시스코의 제넨테크 인크. 사를 통하여 상업적으로 입수가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운용 시스템, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터들은 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며, 가변적이지 않다.
본원 목적의 경우, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 그와의, 또는 그에 대비한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성은 (다르게는, 주어진 아미노산 서열 B에 대하여, 그와, 또는 그에 대비하여 특정 % 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음) 하기와 같이 계산된다: 100 × 분율 X/Y (식 중, X는 해당 프로그램의 A와 B의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 짝으로 선정된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B의 총 아미노산 잔기 수임). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성이 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않게 된다는 것은 이해될 것이다.
"치료 유효량"이라는 용어는 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하고/거나, 장애와 연관된 증상 중 1종 이상을 어느 정도까지 경감하는 데에 효과적인 약물의 양을 지칭한다.
"SABA"라는 용어는 혈청 알부민 결합성 애드넥틴(Serum Albumin Binding Adnectin)™을 지칭한다. 애드넥틴™ (애드넥서스(Adnexus), 브리스톨-마이어스 스퀴브 R&D 컴패니(Bristol-Myers Squibb R&D Company) 사)은 제10 피브로넥틴 유형 III 도메인, 즉 Fn3의 제10 모듈 (10Fn3)을 기재로 하는 리간드 결합성 스캐폴드 단백질이다.
아미노산 서열 또는 화합물의 반감기 (t1 /2)는 일반적으로 예를 들면 자연적 기작에 의한 서열 또는 화합물의 분해 및/또는 서열 또는 화합물의 제거 또는 격리로 인하여, 폴리펩티드의 혈청 농도가 생체 내에서 50% 감소하는 데에 걸리는 시간으로 정의될 수 있다. 반감기는 약동학적 분석에 의한 것과 같이, 당업계에 알려져 있는 어떠한 방식으로도 측정될 수 있다. 예를 들면 문헌 [M Gibaldi & D Perron "Pharmacokinetics", published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)]을 참조하라. 반감기는 t1 /2-알파, t1 /2-베타 및 곡선하 면적 (AUC)과 같은 파라미터들을 사용하여 표현될 수 있다. "반감기의 증가"는 이들 파라미터 중 어느 하나, 이들 파라미터 중 임의의 2종, 또는 이들 파라미터 3개 모두의 증가를 지칭한다. 소정 실시양태에서, 반감기의 증가는 t1 /2-알파 또는 AUC 또는 이들 모두의 증가가 있거나 없는, t1 /2-베타의 증가를 지칭한다.
"PK"라는 용어는 "약동학"의 두문자어로서, 예를 들자면 대상체에 의한 흡수, 분배, 대사 및 제거를 포함한 화합물의 특성들을 포괄한다. "PK 조절 단백질" 또는 "PK 모이어티"는 생물학적으로 활성인 분자에 융합되거나 그와 함께 투여되었을 때, 생물학적으로 활성인 분자의 약동학적 특성에 영향을 주는 소정의 단백질, 펩티드 또는 모이어티를 지칭한다.
개관
Fn3은 피브로넥틴의 유형 III 도메인을 지칭한다. Fn3 도메인은 소형이며, 단량체성이고, 가용성이며, 안정하다. 그것은 디술피드 결합이 결핍되어 있으며, 그에 따라 환원성 조건하에서 안정하다. Fn3의 전체적인 구조는 이뮤노글로불린의 폴딩성과 유사하다. Fn3 도메인은 N-말단으로부터 C-말단의 순서로 베타 또는 베타-유사 가닥 A; 루프 AB; 베타 또는 베타-유사 가닥 B; 루프 BC; 베타 또는 베타-유사 가닥 C; 루프 CD; 베타 또는 베타-유사 가닥 D; 루프 DE; 베타 또는 베타-유사 가닥 E; 루프 EF; 베타 또는 베타-유사 가닥 F; 루프 FG; 및 베타 또는 베타-유사 가닥 G를 포함한다. 7개의 역평행인 β-가닥들이 안정한 코어를 형성하는 2개의 베타 시트로 배열되면서, 베타 또는 베타-유사 가닥들을 연결하는 루프로 구성되는 2개의 "전면부"를 생성시킨다. 루프 AB, CD, 및 EF가 하나의 전면부에 위치되며, 루프 BC, DE, 및 FG가 반대편 전면부에 위치된다. 루프 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG 중 어느 것 또는 모두는 리간드 결합에 참여할 수 있다. 15종 이상의 상이한 Fn3 모듈들이 존재하는데, 모듈들 사이의 서열 상동성은 낮지만, 그들 모두는 3차 구조에 있어서 고도의 유사성을 공유한다.
애드넥틴™ (애드넥서스, 브리스톨-마이어스 스퀴브 R&D 컴패니 사)은 제10 피브로넥틴 유형 III 도메인, 즉 Fn3의 제10 모듈 (10Fn3)을 기재로 하는 리간드 결합성 스캐폴드 단백질이다. 자연적으로 발생하는 인간 10Fn3의 아미노산 서열을 서열 1에 제시하였다:
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (서열 1) (AB, CD 및 EF 루프에는 밑줄을 쳤으며, BC, FG 및 DE 루프는 진하게 강조하였음).
서열 1에서, AB 루프는 잔기 15-16에 해당하며, BC 루프는 잔기 21-30에 해당하고, CD 루프는 잔기 39-45에 해당하며, DE 루프는 잔기 51-56에 해당하고, EF 루프는 잔기 60-66에 해당하며, FG 루프는 잔기 76-87에 해당한다 (문헌 [Xu et al, Chemistry & Biology 2002 9:933-942]). BC, DE 및 FG 루프가 분자의 일 전면부를 따라 정렬되며, AB, CD 및 EF 루프가 분자의 반대편 전면부를 따라 정렬된다. 서열 1에서, 베타 가닥 A는 잔기 9-14에 해당하며, 베타 가닥 B는 잔기 17-20에 해당하고, 베타 가닥 C는 잔기 31-38에 해당하며, 베타 가닥 D는 잔기 46-50에 해당하고, 베타 가닥 E는 잔기 57-59에 해당하며, 베타 가닥 F는 잔기 67-75에 해당하고, 베타 가닥 G는 잔기 88-94에 해당한다. 상기 가닥들은 해당 루프를 통하여 서로 연결되는데, 예를 들면 가닥 A와 B가 루프 AB를 통하여 가닥 A, 루프 AB, 가닥 B의 대형으로 연결되는 등이다. 서열 1의 처음 8개 아미노산 (상기 이탤릭체)은 분자의 결합 활성을 계속 유지하면서도 결손될 수 있다. 소수성 코어를 형성하는 것과 관련된 잔기 ("코어 아미노산 잔기")에는 서열 1 중 하기의 아미노산에 해당하는 아미노산들이 포함된다: L8, V10, A13, L18, I20, W22, Y32, I34, Y36, F48, V50, A57, I59, L62, Y68, I70, V72, A74, I88, I90 및 Y92 (단일 문자 아미노산 코드에 이어지는 서열 1 내에서 그것이 배치되는 위치로 코어 아미노산 잔기를 표시하였음). 예를 들면 문헌 [Dickinson et al., J. Mol. Biol. 236: 1079-1092 (1994)]을 참조하라.
10Fn3은 구조 및 기능적으로 항체, 특히 항체의 가변 영역과 유사하다. 10Fn3 도메인이 "항체 모방물" 또는 "항체-유사 단백질"로 기술될 수 있기는 하지만, 그것은 통상적인 항체에 비해 수많은 장점들을 제공한다. 특히, 그것은 항체에 비해 더 우수한 접힘 및 열안정성 특성을 나타내며, 소정 조건하에서 적당한 접힘을 방해하거나 막는 것으로 알려져 있는 디술피드 결합이 결핍되어 있다. 대표적인 혈청 알부민 10Fn3 기재의 바인더는 주로 평균 ~65℃의 Tm을 갖는 단량체성이다.
10Fn3의 BC, DE, 및 FG 루프는 이뮤노글로불린의 상보성 결정 영역 (CDR)과 유사하다. 이들 루프 영역에서의 아미노산 서열의 변경은 10Fn3의 결합 특이성을 변화시킨다. 원하는 표적에 결합되는 분자를 생성시키기 위하여, AB, CD 및 EF 루프에 변형이 있는 10Fn3 도메인이 제조될 수도 있다. 루프 외부의 단백질 서열은 이뮤노글로불린의 골격(framework) 영역과 유사하며, 10Fn3의 구조적 형태에서 역할을 한다. 10Fn3 골격-유사 영역에서의 변경은 리간드 결합을 붕괴시킬 정도로 구조적 형태가 변경되지 않는 한까지 허용가능하다. 10Fn3 리간드 특이적 바인더를 생성시키는 방법에 대해서는 고도 친화성 TNFα 바인더에 대해 개시하고 있는 PCT 공개 번호 WO 00/034787, WO 01/64942, 및 WO 02/032925, 고도 친화성 VEGFR2 바인더에 대해 개시하고 있는 PCT 공개 번호 WO 2008/097497, 및 고도 친화성 IGFIR 바인더에 대해 개시하고 있는 PCT 공개 번호 WO 2008/066752에 기술되어 있다. 10Fn3 바인더 및 바인더의 선택 방법에 대해 논의하고 있는 추가적인 참고문헌에는 PCT 공개 번호 WO 98/056915, WO 02/081497, 및 WO 2008/031098 및 U.S. 공개 번호 2003186385가 포함된다.
상기한 바와 같이, 서열 1의 잔기 21-30, 51-56, 및 76-87에 해당하는 아미노산 잔기는 각각 BC, DE 및 FG 루프를 한정한다. 그러나, 인간 혈청 알부민과 같은 원하는 표적에 대하여 강한 친화성을 갖는 10Fn3 바인더를 수득하기 위하여 루프 영역 내의 모든 잔기가 변형될 필요는 없다는 것을 알아야 한다. 예를 들어, 본원에서 기술되는 여러 실시예에서는, BC 루프의 아미노산 23-30 및 DE 루프의 52-55에 해당하는 잔기들만이 변형되어 고도 친화성인 10Fn3 바인더를 생성시키고 있다. 따라서, 소정 실시양태에서, BC 루프는 서열 1의 잔기 23-30에 해당하는 아미노산에 의해 한정될 수 있으며, DE 루프는 서열 1의 잔기 52-55에 해당하는 아미노산에 의해 한정될 수 있다. 또한, 여전히 고도 친화성의 10Fn3 바인더를 산출하면서도, 루프 영역에서의 삽입 및 결실이 이루어질 수도 있다. 예를 들면, 서열 4 (SABA 1)는 FG 루프가 4개의 아미노산 결실을 포함하는, 즉 서열 1의 아미노산 21-29에 해당하는 11개 잔기가 7개의 아미노산으로 대체된 HSA 바인더의 예이다. 서열 113은 FG 루프가 아미노산 삽입을 포함하는, 즉 서열 1의 아미노산 21-29에 해당하는 11개 잔기가 12개의 아미노산으로 대체된 HSA 바인더의 예이다.
따라서, 일부 실시양태에서는, BC, DE 및 FG에서 선택된 하나 이상의 루프가 야생형 인간 10Fn3에서의 해당 루프에 비해 길이가 연장되거나 짧아질 수 있다. 일부 실시양태에서, 루프의 길이는 2-25개 아미노산까지 연장될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 루프의 길이가 1-11개 아미노산까지 감소될 수 있다. 특히, 10Fn3의 FG 루프는 12개 잔기 길이인 반면, 항체 중쇄에서의 해당 루프는 4-28개 잔기 범위이다. 따라서, 항원 결합을 최적화하기 위하여, 10Fn3 FG 루프의 길이는 항원 결합에 있어서 최대로 가능한 유연성 및 친화도를 수득하도록, 길이에서는 물론, 4-28개 잔기의 CDR3 범위를 포괄하는 서열에서 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 인테그린-결합성 모티프(motif)인 "아르기닌-글리신-아스파르트산" (RGD)가 극성 아미노산-중성 아미노산-산성 아미노산 (N-말단으로부터 C-말단 방향으로) 서열로 대체될 수 있다.
10Fn3은 일반적으로 서열 1의 1번에 해당하는 아미노산 잔기로 시작된다. 그러나, 아미노산 결실을 갖는 도메인 역시 본 발명에 포괄된다. 일부 실시양태에서는, 서열 1의 처음 8개 아미노산에 해당하는 아미노산 잔기들이 결실된다. 추가적인 서열이 N-또는 C-말단에 첨가될 수도 있다. 예를 들면, 추가적인 MG 서열이 10Fn3의 N-말단에 위치될 수 있다. 상기 M은 보통 절단 분리되어 N-말단에 G를 남기게 된다. 일부 실시양태에서는, 연장 서열이 10Fn3 도메인의 C-말단에 위치될 수 있는데, 예를 들면 EIDKPSQ (서열 54), EIEKPSQ (서열 60), 또는 EIDKPSQLE (서열 61)이다. 본원에서, 이와 같은 C-말단 서열들은 테일 또는 연장체로 지칭되며, 본원에서 추가로 기술된다. 일부 실시양태에서는, His6-태그(tag)가 N-말단 또는 C-말단에 위치될 수 있다.
10Fn3의 비-리간드 결합성 서열, 즉 "10Fn3 스캐폴드"는 10Fn3가 리간드 결합 기능 및/또는 구조적 안정성을 유지한다는 전제하에 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서는, Asp 7, Glu 9, 및 Asp 23 중 하나 이상이 예를 들면 비-음성 하전 아미노산 잔기 (예컨대 Asn, Lys 등)와 같은 또 다른 아미노산에 의해 대체된다. 이러한 돌연변이는 야생형 형태에 비해 중성 pH에서 돌연변이 10Fn3의 더 큰 안정성을 촉진하는 효과를 갖는 것으로 보고되어 있다 (PCT 공개 번호 WO 02/04523 참조). 유익하거나 중성인 10Fn3 골격에서의 다양한 추가적인 변경들이 개시된 바 있다. 예를 들면, 문헌 [Batori et al., Protein Eng. 2002 15(12):1015-20]; [Koide et al., Biochemistry 2001 40(34): 10326-33]을 참조하라.
하나 이상의 보존성 치환에 의해 10Fn3 스캐폴드가 변형될 수 있다. 10Fn3 골격 중 5%, 10%, 20%, 심지어는 30% 또는 그 이상으로 많은 아미노산이 리간드에 대한 10Fn3의 친화도를 실질적으로 변경하지 않으면서도 보존성 치환에 의해 변경될 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드 변형은 바람직하게는 리간드에 대한 10Fn3 바인더의 결합 친화도를 100배, 50배, 25배, 10배, 5배, 또는 2배 미만으로 감소시킨다. 해당 변화는 생체 내에서의 10Fn3의 면역원성을 변경시키게 되는 것일 수도 있는데, 면역원성이 감소되는 경우, 그와 같은 변화는 바람직하게 된다. 본원에서 사용될 때, "보존성 치환체"는 해당하는 참조 잔기와 물리 또는 기능적으로 유사한 잔기들이다. 다시 말하자면, 보존성 치환체와 그의 참조 잔기는 유사한 크기, 형상, 전기 전하, 공유 또는 수소 결합을 형성하는 능력 등을 포함한 화학적 특성들을 가진다. 바람직한 보존성 치환은 문헌 [Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 5: 345-352 (1978 & Supp.)]에서 허용되는 점 돌연변이로 한정되는 기준을 충족하는 것들이다. 보존성 치환의 예는 하기 군 내에서의 치환이다: (a) 발린, 글리신; (b) 글리신, 알라닌; (c) 발린, 이소류신, 류신; (d) 아스파르트산, 글루탐산; (e) 아스파라긴, 글루타민; (f) 세린, 트레오닌; (g) 리신, 아르기닌, 메티오닌; 및 (h) 페닐알라닌, 티로신.
소정 실시양태에서, 10Fn3 스캐폴드 기재의 항체-유사 단백질은 일반적으로 하기 서열로 한정될 수 있다:
EVVAAT(X) a SLLI(X) x YYRITYGE(X) b QEFTV(X) y ATI(X) c DYTITVYAV(X) z ISINYRT (서열 2).
서열 2에서, AB 루프는 X a 로 표시되며, CD 루프는 X b 로 표시되고, EF 루프는 X c 로 표시되며, BC 루프는 X x 로 표시되고, DE 루프는 X y 로 표시되며, FG 루프는 X z 로 표시된다. X는 임의의 아미노산을 나타내며, X에 이어지는 첨자는 정수인 아미노산 수를 나타낸다. 구체적으로, a는 1-15, 2-15, 1-10, 2-10, 1-8, 2-8, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1-3, 2-3, 또는 1-2개의 아미노산 중 어느 것일 수 있으며; b, c, x, y 및 z는 각각 독립적으로 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, 또는 6-7개의 아미노산 중 어느 것일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, a는 2개 아미노산이며, b는 7개 아미노산이고, c는 7개 아미노산이며, x는 9개 아미노산이고, y는 6개 아미노산이며, z는 12개 아미노산이다. 베타 가닥의 서열은 서열 1에 나타낸 해당 아미노산 대비 7개 골격 영역 전체에 걸쳐 0 내지 10, 0 내지 8, 0 내지 6, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2, 또는 0 내지 1개의 치환, 결실 또는 부가 중 어느 것을 가질 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 베타 가닥의 서열은 서열 1에 나타낸 해당 아미노산 대비 7개 골격 영역 전체에 걸쳐 0 내지 10, 0 내지 8, 0 내지 6, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2, 또는 0 내지 1개의 보존성 치환 중 어느 것을 가질 수 있다. 소정 실시양태에서, 코어 아미노산 잔기는 고정되며, 임의의 치환, 보존성 치환, 결실 또는 부가는 코어 아미노산 잔기가 아닌 다른 잔기에서 발생한다. 대표적인 실시양태에서, 각각 (X) x , (X) y , 및 (X) z 로 표시되는 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프는 하기 표 2에 나타낸 HSA 바인더 중 어느 것 (즉, 표 2의 서열 4, 8, 12, 16, 20, 및 24-44)으로부터의 BC, DE, 및 FG 루프 서열을 포함하는 폴리펩티드로 대체된다.
소정 실시양태에서, 10Fn3 스캐폴드 기재의 항체-유사 단백질은 일반적으로 하기 서열로 한정될 수 있다:
EVVAATPTSLLI(X)x YYRITYGETGGNSPVQEFTV(X)y ATISGLKPGVDYTITVYAV(X)z ISINYRT (서열 3).
서열 3에서, BC 루프는 Xx로 표시되고, DE 루프는 Xy로 표시되며, FG 루프는 Xz로 표시된다. X는 임의의 아미노산을 나타내며, X에 이어지는 첨자는 정수인 아미노산 수를 나타낸다. 구체적으로, x, y 및 z는 각각 독립적으로 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, 또는 6-7개의 아미노산 중 어느 것일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, x는 9개 아미노산이고, y는 6개 아미노산이며, z는 12개 아미노산이다. 베타 가닥의 서열은 서열 1에 나타낸 해당 아미노산 대비 7개 골격 영역 전체에 걸쳐 0 내지 10, 0 내지 8, 0 내지 6, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2, 또는 0 내지 1개의 치환, 결실 또는 부가 중 어느 것을 가질 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 베타 가닥의 서열은 서열 1에 나타낸 해당 아미노산 대비 7개 골격 영역 전체에 걸쳐 0 내지 10, 0 내지 8, 0 내지 6, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2, 또는 0 내지 1개의 보존성 치환 중 어느 것을 가질 수 있다. 소정 실시양태에서, 코어 아미노산 잔기는 고정되며, 임의의 치환, 보존성 치환, 결실 또는 부가는 코어 아미노산 잔기가 아닌 다른 잔기에서 발생한다. 대표적인 실시양태에서, 각각 (X)x, (X)y, 및 (X)z로 표시되는 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프는 하기 표 2에 나타낸 HSA 바인더 중 어느 것 (즉, 표 2의 서열 4, 8, 12, 16, 20, 및 24-44)으로부터의 BC, DE, 및 FG 루프 서열을 포함하는 폴리펩티드로 대체된다.
ED 테일을 갖는 10 Fn3 도메인
일 측면에서, 본 발명은 피브로넥틴 유형 III 제10 (10Fn3) 도메인을 포함하며, 상기 10Fn3 도메인은 (i) AB, BC, CD, DE, EF 및 FG 루프 중 하나 이상에서, 야생형 10Fn3 도메인과 비교하여 변형된 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 야생형 10Fn3 도메인에 의해 결합되지 않는 표적 분자에 결합하며, (iii) 서열 (ED)n을 갖는 C-말단 테일을 포함하고, 여기서 n은 2-10, 2-8, 2-5, 3-10, 3-8, 3-7, 3-5, 또는 4-7의 정수이거나, 또는 n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10인, 폴리펩티드를 제공한다.
소정 실시양태에서, 상기 10Fn3 도메인은 서열 1의 잔기 9-94에 제시되어 있는 아미노산 서열에 대해 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 소정 실시양태에서, 상기 10Fn3 도메인은 서열 1, 2 또는 3을 포함한다. 소정 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 서열 1의 아미노산 9-94를 포함한다.
소정 실시양태에서, ED 테일을 갖는 10Fn3 도메인은 C-말단의 ED 반복체 직전에 E, I 또는 EI를 포함한다. 일부 실시양태에서, ED 반복체는 용해도를 향상시키고/거나, 10Fn3 도메인의 응집을 감소시킨다.
소정 실시양태에서, ED 테일을 갖는 10Fn3 도메인은 BC, DE 및 FG 루프 각각에 야생형 10Fn3 도메인과 비교하여 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, ED 테일을 갖는 10Fn3 도메인은 1 μM 이하의 KD로 원하는 표적에 결합된다.
혈청 알부민 바인더
10Fn3 도메인은 ~10 kDa인 그의 작은 크기로 인하여, 신장 여과 및 분해를 통해 순환계로부터 빠르게 제거된다 (마우스에서 t1 /2 = 15-45분; 원숭이에서는 3시간). 소정 측면에서, 본 출원은 10Fn3 도메인의 t1 /2을 연장하는 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA)에 특이적으로 결합되는 10Fn3 도메인을 제공한다.
HSA는 인간에서 600 μM의 혈청 농도 및 19일의 t1 /2을 가진다. HSA의 연장된 t1 /2은 부분적으로 신생아 Fc 수용체 (FcRn)를 통한 그의 재순환에 기인한 것이다. HSA는 내피 세포로의 엔도솜 흡수 후 pH-의존성 방식으로 FcRn에 결합되는데; 이와 같은 상호작용은 HSA를 다시 혈류로 재순환시킴으로써, 그것을 리소솜 분해로부터 벗어나 우회시킨다. FcRn은 광범위하게 발현되므로, 재순환 경로는 상시성인 것으로 여겨진다. 대부분의 세포 유형에서, 대부분의 FcRn은 세포내 분류 엔도솜(sorting endosome)에 존재한다. HSA는 유체-상 음세포작용(fluid-phase pinocytosis)의 비특이적 기작에 의해 용이하게 내재화되며, FcRn에 의해 리소솜에서의 분해로부터 구출된다. 엔도솜에서 발견되는 산성 pH에서, FcRn에 대한 HSA의 친화성은 증가한다 (pH 6.0에서 5 μM). 일단 FcRn에 결합되고 나면, HSA는 리소솜 분해 경로로부터 벗어나 우회되어, 세포 표면으로 세포질통과된(transcytosed) 후 방출된다.
일 측면에서, 본 개시내용은 혈청 알부민 결합성 10Fn3 도메인을 포함하는 항체-유사 단백질을 제공한다. 대표적인 실시양태에서, 본원에서 기술되는 혈청 알부민 결합성 10Fn3 단백질은 3 μM, 2.5 μM, 2 μM, 1.5 μM, 1 μM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM, 100 pM, 50 pM 또는 10 pM 미만의 KD로 HSA에 결합된다. 소정 실시양태에서, 본원에서 기술되는 혈청 알부민 결합성 10Fn3 단백질은 25℃ 또는 37℃에서 5.5 내지 7.4 pH 범위에서 3 μM, 2.5 μM, 2 μM, 1.5 μM, 1 μM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM, 100 pM, 50 pM 또는 10 pM 미만의 KD로 HSA에 결합된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 혈청 알부민 결합성 10Fn3 단백질은 7.4 이상 pH에서의 HSA에 대한 결합 친화도와 비교하였을 때, 7.4 미만의 pH에서 HSA에 더 견고하게 결합된다.
소정 실시양태에서, 본원에서 기술되는 HSA 결합성 10Fn3 단백질은 원숭이, 래트 또는 마우스 중 하나 이상으로부터의 혈청 알부민에도 결합될 수 있다. 소정 실시양태에서, 본원에서 기술되는 혈청 알부민 결합성 10Fn3 단백질은 3 μM, 2.5 μM, 2 μM, 1.5 μM, 1 μM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM 또는 100 pM 미만의 KD로 레서스 혈청 알부민 (RhSA) 또는 시노몰구스 원숭이 혈청 알부민 (CySA)에 결합된다.
소정 실시양태에서, 본원에서 기술되는 혈청 알부민 결합성 10Fn3 단백질은 HSA의 도메인 I 및/또는 도메인 II에 결합된다. 일 실시양태에서, 본원에서 기술되는 혈청 알부민 결합성 10Fn3 단백질은 HSA의 도메인 III에는 결합되지 않는다.
소정 실시양태에서, 혈청 알부민 결합성 10Fn3 (SABA)는 야생형 10Fn3 도메인 (서열 1)에 대해 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 또는 85% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, BC, DE, 또는 FG 루프 중 하나 이상은 야생형 10Fn3 도메인 대비 변형된다. 또 다른 실시양태에서는, BC, DE, 또는 FG 루프 중 2종 이상이 야생형 10Fn3 도메인 대비 변형된다. 또 다른 실시양태에서는, BC, DE, 및 FG 루프 3종 모두가 야생형 10Fn3 도메인 대비 변형된다. 다른 실시양태에서, SABA는 표 2에 나타낸 26개 코어 SABA 서열들 (즉, 서열 4, 8, 12, 16, 20, 및 24-44) 중 어느 하나, 또는 표 2에 나타낸 연장된 SABA 서열들 (즉, 서열 89-116, 6xHIS 태그 제외) 중 어느 하나에 대해 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA는 서열 2 또는 3에 제시되어 있는 바와 같은 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 각각 (X)x, (X)y, 및 (X)z로 표시되는 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프는 26개 코어 SABA 서열 (즉, 표 2의 서열 4, 8, 12, 16, 20, 및 24-44) 중 어느 것에 구체화되어 있는 각 BC, DE 및 FG 루프 세트, 또는 26개 코어 SABA 서열의 BC, DE 및 FG 루프 서열에 대해 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열로 대체된다. 대표적인 실시양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA는 서열 3으로 한정되며, 26개 코어 SABA 서열 (즉, 표 2의 서열 4, 8, 12, 16, 20, 및 24-44) 중 어느 것으로부터의 BC, DE 및 FG 루프 서열 세트를 가진다. 그와 같은 SABA의 스캐폴드 영역은 서열 1의 골격 아미노산 잔기 대비 0 내지 20, 0 내지 15, 0 내지 10, 0 내지 8, 0 내지 6, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2, 또는 0 내지 1개의 치환, 보존성 치환, 결실 또는 부가 중 어느 것을 가질 수 있다. 예를 들면, SABA1은 서열 4에 제시되어 있는 코어 서열을 가지며, 각각 서열 5-7에 제시되어 있는 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프를 포함한다. 이에 따라, SABA1 코어 기재의 SABA는 서열 2 또는 3을 포함할 수 있으며, 여기서 (X)x는 서열 5를 포함하고, (X)y는 서열 6를 포함하며, (X)z는 서열 7을 포함한다. 유사한 구축물이 다른 SABA 코어 서열들로부터의 BC, DE 및 FG 루프 세트를 이용하여 시도된다. 그와 같은 SABA의 스캐폴드 영역은 서열 1의 골격 아미노산 잔기 대비 0 내지 20, 0 내지 15, 0 내지 10, 0 내지 8, 0 내지 6, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2, 또는 0 내지 1개의 치환, 보존성 치환, 결실 또는 부가 중 어느 것을 포함할 수 있다. 그와 같은 스캐폴드 변형은 SABA가 원하는 KD로 혈청 알부민, 예컨대 HSA에 결합할 수 있는 한도 내에서 이루어질 수 있다.
소정 실시양태에서, SABA (예컨대 SABA 코어 서열 또는 거기에 기반한 상기한 바와 같은 서열)는 N-말단 연장 서열 및/또는 C-말단 연장 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 대표적인 연장 서열을 표 2에 나타내었다. 예를 들면, SABA1.1로 지칭되는 서열 89는 N-말단 서열 MGVSDVPRDLE (서열 45, AdNT1으로 지칭됨), 및 C-말단 서열 EIDKPSQ (서열 54, AdCT1으로 지칭됨)을 갖는 코어 SABA1 서열 (서열 4)을 포함한다. SABA1.1은 또한 C-말단에 His6 태그를 포함하나, His6 태그는 완전히 임의적인 것으로, N-또는 C-말단 연장 서열 내 어느 곳에도 위치될 수 있다는 것을 알아야 한다. 또한, 표 2에 제공되어 있는 대표적인 N-또는 C-말단 연장 서열들 (서열 45-64 및 215) 중 어느 것도, 그리고 그의 어떠한 변이체들도 표 2에 제공되어 있는 임의의 주어진 SABA 코어 서열을 변형시키는 데에 사용될 수 있다. 소정 실시양태에서는, 표 2에 제공되어 있는 링커(linker) 서열 (서열 65-88, 216-221 및 397)이 단독, 또는 서열 54-64 또는 215 중 하나와의 조합 중 어느 것으로서 C-말단 테일 서열로 사용될 수 있다.
소정 실시양태에서, C-말단 연장 서열 ("테일"로도 지칭됨)은 E 및 D 잔기를 포함하는데, 길이가 8 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 5 내지 10, 및 2 내지 4개 사이의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 테일 서열은 ED-기재의 링커를 포함하며, 상기 서열은 ED의 직렬 반복체를 포함한다. 대표적인 실시양태에서, 테일 서열은 2-10, 2-7, 2-5, 3-10, 3-7, 3-5, 3, 4 또는 5개의 ED 반복체를 포함한다. 소정 실시양태에서는, ED-기재 테일 서열이 예를 들면 하기와 같은 추가적인 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다: EI, EID, ES, EC, EGS, 및 EGC. 그와 같은 서열은 부분적으로 EIDKPSQ (서열 54)와 같은 공지의 애드넥틴™ 테일 서열을 기재로 하는데, 거기에서 잔기 D 및 K는 제거되어 있다. 대표적인 실시양태에서, ED-기재 테일은 ED 반복체 전에 E, I 또는 EI 잔기를 포함한다.
다른 실시양태에서, SABA 융합 분자, 예컨대 서열 147 (SABA1-FGF21v16)을 설계할 경우, 테일 서열은 필요에 따라 다른 공지의 링커 서열 (예컨대 표 2의 서열 65-88, 216-221 및 397)과 조합될 수 있는데, 거기에서는 EIEDEDEDEDED가 GSGSGSGS와 연결된다.
혈청 알부민 결합성 애드넥틴 ™ ( SABA )의 융합
본 발명의 일 측면은 혈청 알부민 결합성 10Fn3 (SABA) 및 하나 이상의 추가적인 모이어티를 포함하는 접합체를 제공한다. 상기 추가 요소는 임의의 진단, 영상화, 또는 치료 목적에 유용할 수 있다.
소정 실시양태에서, SABA에 융합된 모이어티의 혈청 반감기는 SABA에 접합되지 않은 경우의 모이어티의 혈청 반감기에 대비하여 증가된다. 소정 실시양태에서, SABA 융합체의 혈청 반감기는 SABA에 융합되지 않은 경우의 모이어티의 혈청 반감기 대비 20, 40, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1500, 1800, 1900, 2000, 2500, 또는 3000% 이상 더 길다. 다른 실시양태에서, SABA 융합체의 혈청 반감기는 SABA에 융합되지 않은 경우의 모이어티의 혈청 반감기에 비해 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 10배, 12배, 13배, 15배, 17배, 20배, 22배, 25배, 27배, 30배, 35배, 40배, 또는 50배 이상 더 크다. 일부 실시양태에서, SABA 융합체의 혈청 반감기는 2시간, 2.5시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 35시간, 40시간, 50시간, 60시간, 70시간, 80시간, 90시간, 100시간, 110시간, 120시간, 130시간, 135시간, 140시간, 150시간, 160시간, 또는 200시간 이상이다.
소정 실시양태에서, SABA 융합 단백질은 3 μM, 2.5 μM, 2 μM, 1.5 μM, 1 μM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM, 100 pM, 50 pM 또는 10 pM 미만의 KD로 HSA에 결합된다. 소정 실시양태에서, SABA 융합 단백질은 25℃ 또는 37℃에서 5.5 내지 7.4 pH 범위에서 3 μM, 2.5 μM, 2 μM, 1.5 μM, 1 μM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM, 100 pM, 50 pM 또는 10 pM 미만의 KD로 HSA에 결합된다. 일부 실시양태에서, SABA 융합 단백질은 pH 7.4에서의 결합과 비교하였을 때, 7.4 미만의 pH에서 HSA에 더 견고하게 결합된다.
따라서, 본원에서 기술되는 SABA 융합 분자는 치료 모이어티와 SABA 사이에 융합을 생성시킴으로써 치료 모이어티 (예컨대 FGF21)의 반감기를 증가시키는 데에 유용하다. 이와 같은 융합 분자는 융합체에 포함되어 있는 치료 모이어티의 생물학적 활성에 반응하는 이상을 치료하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명은 하기 단백질 또는 분자들 중 어느 것의 조절장애에 의해 야기되는 질환에서의 SABA 융합 분자의 용도를 포함한다.
이종성 모이어티
일부 실시양태에서, SABA는 소형 유기 분자, 핵산, 또는 단백질인 제2의 모이어티에 융합된다. 일부 실시양태에서, SABA는 수용체, 수용체 리간드, 비이러스 외피 단백질, 면역 시스템 단백질, 호르몬, 효소, 항원, 또는 세포 신호전달 단백질을 표적으로 하는 치료 모이어티에 융합된다. 융합은 SABA 분자의 어느 한쪽 말단에 제2 모이어티를 결합시킴으로써, 즉 SABA-치료 분자 또는 치료 분자-SABA 배열로 형성될 수 있다.
대표적인 실시양태에서, 상기 치료 모이어티는 VEGF, VEGF-R1, VEGF-R2, VEGF-R3, Her-1, Her-2, Her-3, EGF-I, EGF-2, EGF-3, 알파3, cMet, ICOS, CD40L, LFA-I, c-Met, ICOS, LFA-I, IL-6, B7.1, W1.2, OX40, IL-Ib, TACI, IgE, BAFF 또는 BLys, TPO-R, CD19, CD20, CD22, CD33, CD28, IL-I-R1, TNF-알파, 트레일(TRAIL)-R1, 보체 수용체 1, FGFa, 오스테오포틴, 비트로넥틴, 에프린 A1-A5, 에프린 B1-B3, 알파-2-거대글로불린, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL1O, CXCL11, CXCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CXCL16, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, PDGF, TGFb, GMCSF, SCF, p40 (IL12/IL23), ILIb, ILIa, ILlra, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, IL10, IL12, IL15, IL23, Fas, FasL, Flt3 리간드, 41BB, ACE, ACE-2, KGF, FGF-7, SCF, 네트린1,2, IFNa,b,g, 카스파제2,3,7,8,10, ADAM S1,S5,8,9,15,TS1,TS5; 아디포넥틴, ALCAM, ALK-I, APRIL, 아넥신 V, 안지오제닌, 암피레귤린, 안지오포이에틴1,2,4, B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1, B7-H2, B7-H3, Bcl-2, BACE-I, BAK, BCAM, BDNF, bNGF, bECGF, BMP2,3,4,5,6,7,8; CRP, 카드헤린 6,8,11; 카텝신 A,B,C,D,E,L,S,V,X; CDl la/LFA-1, LFA-3, GP2b3a, GH 수용체, RSV F 단백질, IL-23 (p40, p19), IL-12, CD80, CD86, CD28, CTLA-4, 알파4-베타1, 알파4-베타7, TNF/림프독소, IgE, CD3, CD20, IL-6, IL-6R, BLYS/BAFF, IL-2R, HER2, EGFR, CD33, CD52, 디곡신, Rho (D), 수두, 간염, CMV, 파상풍, 우두, 항뱀독소, 보툴리눔, 트레일-R1, 트레일-R2, cMet, TNF-R 패밀리, 예컨대 LA NGF-R, CD27, CD30, CD40, CD95, 림프독소 a/b 수용체, WsI-I, TL1A/TNFSF15, BAFF, BAFF-R/TNFRSF13C, 트레일 R2/TNFRSF10B, 트레일 R2/TNFRSF10B, Fas/TNFRSF6 CD27/TNFRSF7, DR3/TNFRSF25, HVEM/TNFRSF14, TROY/TNFRSF19, CD40 리간드/TNFSF5, BCMA/TNFRSF17, CD30/TNFRSF8, LIGHT/TNFSF14, 4-1BB/TNFRSF9, CD40/TNFRSF5, GITR/[감마]NFRSF18, 오스테오프로테게린/TNFRSF11B, RANK/TNFRSF11A, 트레일 R3/TNFRSF10C, 트레일/TNFSFIO, TRANCE/RANK L/TNFSF11, 4-1BB 리간드/TNFSF9, TWEAK/TNFSF12, CD40 리간드/TNFSFS, Fas 리간드/TNFSF6, RELT/TNFRSF19L, APRIL/TNFSF13, DcR3/TNFRSF6B, TNF RI/TNFRSFIA, 트레일 R1/TNFRSFIOA, 트레일 R4/TNFRSF10D, CD30 리간드/TNFSF8, GITR 리간드/TNFSF18, TNFSF18, TACI/TNFRSF13B, NGF R/TNFRSF16, OX40 리간드/TNFSF4, 트레일 R2/TNFRSF10B, 트레일 R3/TNFRSF10C, TWEAK R/TNFRSF12, B AFF/BLyS/TNFSF13, DR6/TNFRSF21, TNF-알파/TNFSFl A, 프로(Pro)-TNF-알파/TNFSF1A, 림프독소 베타 R/TNFRSF3, 림프 독소 베타 R (LTbR)/Fc 키메라, TNF RI/TNFRSFIA, TNF-베타/TNFSFlB, PGRP-S, TNF RI/TNFRSFIA, TNF RII/TNFRSFIB, EDA-A2, TNF-알파/TNFSFIA, EDAR, XEDAR, TNF RI/TNFRSFIA이다.
특히 중요한 것은 정제된 형태로 상업적으로 입수가능한 인간 표적 단백질은 물론, 이러한 표적 단백질에 결합되는 단백질이다. 그 예는 하기이다: 4EBP1, 14-3-3 제타, 53BP1, 2B4/SLAMF4, CCL21/6C카인, 4-1BB/TNFRSF9, 8D6A, 4-1BB 리간드/TNFSF9, 8-옥소-dG, 4-아미노-l,8-나프탈이미드, A2B5, 아미노펩티다제 LRAP/ERAP2, A33, 아미노펩티다제 N/ANPEP, Aag, 아미노펩티다제 P2/XPNPEP2, ABCG2, 아미노펩티다제 P1/XPNPEP1, ACE, 아미노펩티다제 PILS/ARTS1, ACE-2, 암니온레스(Amnionless), 액틴, 암피레귤린, 베타-액틴, AMPK 알파 1/2, 액티빈 A, AMPK 알파 1, 액티빈 AB, AMPK 알파 2, 액티빈 B, AMPK 베타 1, 액티빈 C, AMPK 베타 2, 액티빈 RIA/ALK-2, 안드로겐 R/NR3C4, 액티빈 RIB/ALK-4, 안지오제닌, 액티빈 RIIA, 안지오포이에틴-1, 액티빈 RIIB, 안지오포이에틴-2, ADAM8, 안지오포이에틴-3, ADAM9, 안지오포이에틴-4, ADAM10, 안지오포이에틴-유사체 1, ADAM12, 안지오포이에틴-유사체 2, ADAM15, 안지오포이에틴-유사체 3, TACE/ADAM17, 안지오포이에틴-유사체 4, ADAM19, 안지오포이에틴-유사체 7/CDT6, ADAM33, 안지오스타틴, ADAMTS4, 아넥신 Al/아넥신 I, ADAMTS5, 아넥신 A7, ADAMTSl, 아넥신 AlO, ADAMTSL-1/펑틴(Punctin), 아넥신 V, 아디포넥틴/Acrp30, ANP, AEBSF, AP 부위, 아그레칸, APAF-I, 아그린, APC, AgRP, APE, AGTR-2, APJ, AIF, APLP-I, Akt, APLP-2, Aktl, 아포지단백질 AI, Akt2, 아포지단백질 B, Akt3, APP, 혈청 알부민, APRIL/TNFSF13, ALCAM, ARC, ALK-I, 아르테민, ALK-7, 아릴술파타제 AJARSA, 알칼리성 포스파타제, ASAH2/N-아실스핑고신 아미도히드롤라제-2, 알파 2u-글로불린, ASC, 알파-1-산 당단백질, ASGR1, 알파-페토단백질, ASK1, ALS, ATM, 사기질모세포 ATRIP, AMICA/JAML, 오로라 A, AMIGO, 오로라 B, AMIG02, 악신-1, AMIG03, AxI, 아미노아실라제/ACYl, 아주로시딘/CAP37/HBP, 아미노펩티다제 A/ENPEP, B4GALT1, BIM, B7-1/CD80, 6-비오틴-17-NAD, B7-2/CD86, BLAME/SLAMF8, B7-H1/PD-L1, CXCL13/BLC/BCA-1, B7-H2, BLIMP1, B7-H3, BIk, B7-H4, BMI-I, BACE-I, BMP-1/PCP, BACE-2, BMP-2, Bad, BMP-3, BAFF/TNFSF13B, BMP-3b/GDF-10, BAFF R/TNFRSF 13C, BMP-4, Bag-1, BMP-5, BAK, BMP-6, BAMBI/NMA, BMP-7, BARD 1, BMP-8, Bax, BMP-9, BCAM, BMP-10, Bcl-10, BMP-15/GDF-9B, Bcl-2, BMPR-IA/ALK-3, Bcl-2 관련 단백질 Al, BMPR-IB/ALK-6, Bcl-w, BMPR-II, Bcl-x, BNIP3L, Bcl-xL, BOC, BCMA/TNFRSF17, BOK, BDNF, BPDE, 벤즈아미드, 브라키유리(Brachyury), 공통 베타 사슬, B-Raf, 베타 IG-H3, CXCL14/BRAK, 베타셀룰린, BRCA1, 베타-데펜신 2, BRCA2, BID, BTLA, 비글리칸, Bub-1, Bik-유사 킬러 단백질, c-jun, CD90/Thyl, c-Rel, CD94, CCL6/C10, CD97, CIq R1/CD93, CD151, C1qTNF1, CD160, C1qTNF4, CD163, CIqTNF5, CD 164, 보체 성분 CIr, CD200, 보체 성분 CIs, CD200 Rl, 보체 성분 C2, CD229/SLAMF3, 보체 성분 C3a, CD23/Fc 엡실론 RII, 보체 성분 C3d, CD2F-10/SLAMF9, 보체 성분 C5a, CD5L, 카드헤린-4/R-카드헤린, CD69, 카드헤린-6, CDC2, 카드헤린-8, CDC25A, 카드헤린-11, CDC25B, 카드헤린-12, CDCP1, 카드헤린-13, CDO, 카드헤린-17, CDX4, E-카드헤린, CEACAM-l/CD66a, N-카드헤린, CEACAM-6, P-카드헤린, 세르베루스 1, VE-카드헤린, CFTR, 칼빈딘 D, cGMP, 칼시네우린 A, Chem R23, 칼시네우린 B, 케메린, 칼레티큘린-2, 케모카인 샘플러 팩, CaM 키나제 II, 키티나제 3-유사체 1, cAMP, 키토트리오시다제/CHITl, 칸나비노이드 Rl, Chkl, 칸나비노이드 R2/CB2/CNR2, Chk2, CAR/NR1I3, CHL-l/LlCAM-2, 탄산 안히드라제 I, 콜린 아세틸트랜스퍼라제/CbAT, 탄산 안히드라제 II, 콘드로렉틴, 탄산 안히드라제 III, 코르딘, 탄산 안히드라제 IV, 코르딘-유사체 1, 탄산 안히드라제 VA, 코르딘-유사체 2, 탄산 안히드라제 VB, CINC-I, 탄산 안히드라제 VI, CINC-2, 탄산 안히드라제 VII, CINC-3, 탄산 안히드라제 VIII, 클랍신, 탄산 안히드라제 IX, 클라우딘-6, 탄산 안히드라제 X, CLC, 탄산 안히드라제 XII, CLEC-I, 탄산 안히드라제 XIII, CLEC-2, 탄산 안히드라제 XIV, CLECSF 13/CLEC4F, 카르복시메틸 리신, CLECSF8, 카르복시펩티다제 A1/CPA1, CLF-I, 카르복시펩티다제 A2, CL-P1/COLEC12, 카르복시펩티다제 A4, 클러스테린, 카르복시펩티다제 Bl, 클러스테린-유사체 1, 카르복시펩티다제 E/CPE, CMG-2, 카르복시펩티다제 Xl, CMV UL146, 카르디오트로핀-1, CMV UL147, 카르노신 디펩티다제 1, CNP, 카론테, CNTF, CART, CNTF R 알파, 카스파제, 응고 인자 II/트롬빈, 카스파제-1, 응고 인자 III/조직 인자, 카스파제-2, 응고 인자 VII, 카스파제-3, 응고 인자 X, 카스파제-4, 응고 인자 XI, 카스파제-6, 응고 인자 XIV/단백질 C, 카스파제-7, COCO, 카스파제-8, 코헤신, 카스파제-9, 콜라겐 I, 카스파제-10, 콜라겐 II, 카스파제-12, 콜라겐 IV, 카스파제-13, 공통 감마 사슬/IL-2 R 감마, 카스파제 펩티드 억제제, COMP/트롬보스폰딘-5, 카탈라제, 보체 성분 CIrLP, 베타-카테닌, 보체 성분 CIqA, 카텝신 1, 보체 성분 CIqC, 카텝신 3, 보체 인자 D, 카텝신 6, 보체 인자 I, 카텝신 A, 보체 MASP3, 카텝신 B, 커넥신 43, 카텝신 C/DPPI, 콘택틴-1, 카텝신 D, 콘택틴-2/TAGl, 카텝신 E, 콘택틴-4, 카텝신 F, 콘택틴-5, 카텝신 H, 코린, 카텝신 L, 코르눌린, 카텝신 O, CORS26/ClqTNF3, 카텝신 S, 래트 피질 줄기 세포, 카텝신 V, 코르티솔, 카텝신 XITJ?, COUP-TF I/NR2F1, CBP, COUP-TF II/NR2F2, CCI, COX-I, CCK-A R, COX-2, CCL28, CRACC/SLAMF7, CCR1, C-반응성 단백질, CCR2, 크레아틴 키나제, 근육/CKMM, CCR3, 크레아티닌, CCR4, CREB, CCR5, CREG, CCR6, CRELD1, CCR7, CRELD2, CCR8, CRHBP, CCR9, CRHR-I, CCR10, CRIM1, CD155/PVR, 크립토, CD2, CRISP-2, CD3, CRISP-3, CD4, 크로스베인레스(Crossveinless)-2, CD4+/45RA-, CRTAM, CD4+/45RO-, CRTH-2, CD4+/CD62L-/CD44, CRY1, CD4+/CD62L+/CD44, 크립틱, CD5, CSB/ERCC6, CD6, CCL27/CTACK, CD8, CTGF/CCN2, CD8+/45RA-, CTLA-4, CD8+/45RO-, 큐빌린, CD9, CX3CR1, CD14, CXADR, CD27/TNFRSF7, CXCL16, CD27 리간드/TNFSF7, CXCR3, CD28, CXCR4, CD30/TNFRSF8, CXCR5, CD30 리간드/TNFSF8, CXCR6, CD31/PECAM-1, 시클로필린 A, CD34, Cyr61/CCN1, CD36/SR-B3, 시스타틴 A, CD38, 시스타틴 B, CD40/TNFRSF5, 시스타틴 C, CD40 리간드/TNFSF5, 시스타틴 D, CD43, 시스타틴 E/M, CD44, 시스타틴 F, CD45, 시스타틴 H, CD46, 시스타틴 H2, CD47, 시스타틴 S, CD48/SLAMF2, 시스타틴 SA, CD55/DAF, 시스타틴 SN, CD58/LFA-3, 시토크롬 c, CD59, 아포시토크롬 c, CD68, 홀로시토크롬 c, CD72, 시토케라틴 8, CD74, 시토케라틴 14, CD83, 시토케라틴 19, CD84/SLAMF5, 시토닌, D6, DISP1, DAN, Dkk-1, DANCE, Dkk-2, DARPP-32, Dkk-3, DAX1/NR0B1, Dkk-4, DCC, DLEC, DCIR/CLEC4A, DLLl, DCAR, DLL4, DcR3/TNFRSF6B, d-루시페린, DC-SIGN, DNA 리가제 IV, DC-SIGNR/CD299, DNA 폴리머라제 베타, Dc트레일 R1/TNFRSF23, DNAM-I, Dc트레일 R2/TNFRSF22, DNA-PKcs, DDR1, DNER, DDR2, 도파 데카르복실라제/DDC, DEC-205, DPCR-I, 데카펜타플레직(Decapentaplegic), DPP6, 데코린, DPP A4, 덱틴-1/CLEC7A, DPPA5/ESG1, 덱틴-2/CLEC6A, DPPII/QPP/DPP7, DEP-1/CD148, DPPIV/CD26, 데저트 헤지호그(Desert Hedgehog), DR3/TNFRSF25, 데스민, DR6/TNFRSF21, 데스모글레인-1, DSCAM, 데스모글레인-2, DSCAM-Ll, 데스모글레인-3, DSPG3, 디셰벨드(Dishevelled)-1, Dtk, 디셰벨드-3, 디나민, EAR2/NR2F6, EphA5, ECE-I, EphA6, ECE-2, EphA7, ECF-L/CHI3L3, EphA8, ECM-I, EphBl, 에코틴, EphB2, EDA, EphB3, EDA-A2, EphB4, EDAR, EphB6, EDG-I, 에프린, EDG-5, 에프린-Al, EDG-8, 에프린-A2, eEF-2, 에프린-A3, EGF, 에프린-A4, EGF R, 에프린-A5, EGR1, 에프린-B, EG-VEGF/PK1, 에프린-Bl, eIF2 알파, 에프린-B2, eIF4E, 에프린-B3, Elk-I, 에피겐, EMAP-II, 에피모르핀/신택신 2, EMMPRIN/CD147, 에피레귤린, CXCL5/ENA, EPR-l/Xa 수용체, 엔도칸, ErbB2, 엔도글린/CD105, ErbB3, 엔도글리칸, ErbB4, 엔도뉴클레아제 III, ERCC1, 엔도뉴클레아제 IV, ERCC3, 엔도뉴클레아제 V, ERK1/ERK2, 엔도뉴클레아제 VIII, ERKl, 엔도레펠린/페를레칸, ERK2, 엔도스타틴, ERK3, 엔도텔린-1, ERK5/BMK1, 엔그레일드(Engrailed)-2, ERR 알파/NR3Bl, EN-RAGE, ERR 베타/NR3B2, 엔테로펩티다제/엔테로키나제, ERR 감마/NR3B3, CCL11/에오탁신, 에리트로포이에틴, CCL24/에오탁신-2, 에리트로포이에틴 R, CCL26/에오탁신-3, ESAM, EpCAM/TROP-1, ER 알파/NR3Al, EPCR, ER 베타/NR3A2, Eph, 엔도뉴클레아제 III, EphAl, 엑소스토신-유사체 2/EXTL2, EphA2, 엑소스토신-유사체 3/EXTL3, EphA3, FABP1, FGF-BP, FABP2, FGF Rl-4, FABP3, FGF Rl, FABP4, FGF R2, FABP5, FGF R3, FABP7, FGF R4, FABP9, FGF R5, 보체 인자 B, Fgr, FADD, FHR5, FAM3A, 피브로넥틴, FAM3B, 피콜린-2, FAM3C, 피콜린-3, FAM3D, FITC, 섬유모세포 활성화 단백질 알파/FAP, FKBP38, Fas/TNFRSF6, Flap, Fas 리간드/TNFSF6, FLIP, FATP1, FLRG, FATP4, FLRT1, FATP5, FLRT2, Fc 감마 RI/CD64, FLRT3, Fc 감마 RIIB/CD32b, Flt-3, Fc 감마 RIIC/CD32c, Flt-3 리간드, Fc 감마 RIIA/CD32a, 폴리스타틴, Fc 감마 RIII/CD16, 폴리스타틴-유사체 1, FcRHl/IRTA5, FosB/G0S3, FcRH2/IRTA4, FoxD3, FcRH4/IRTAl, FoxJl, FcRH5/IRTA2, FoxP3, Fc 수용체-유사체 3/CD16-2, Fpg, FEN-I, FPR1, 페투인 A, FPRL1, 페투인 B, FPRL2, FGF 산성, CX3CL1/프랙탈카인, FGF 염기성, 프리즐드(Frizzled)-1, FGF-3, 프리즐드-2, FGF-4, 프리즐드-3, FGF-5, 프리즐드-4, FGF-6, 프리즐드-5, FGF-8, 프리즐드-6, FGF-9, 프리즐드-7, FGF-1O, 프리즐드-8, FGF-11, 프리즐드-9, FGF-12, Frk, FGF-13, sFRP-1, FGF-16, sFRP-2, FGF-17, sFRP-3, FGF-19, sFRP-4, FGF-20, 푸린, FGF-21, FXR/NR1H4, FGF-22, Fyn, FGF-23, G9a/EHMT2, GFR 알파-3/GDNF R 알파-3, GABA-A-R 알파 1, GFR 알파-4/GDNF R 알파-4, GABA-A-R 알파 2, GITR/TNFRSF18, GABA-A-R 알파 4, GITR 리간드/TNFSF18, GABA-A-R 알파 5, GLI-I, GABA-A-R 알파 6, GLI-2, GABA-A-R 베타 1, GLP/EHMT1, GABA-A-R 베타 2, GLP-I R, GABA-A-R 베타 3, 글루카곤, GABA-A-R 감마 2, 글루코사민 (N-아세틸)-6-술파타제/GNS, GABA-B-R2, GIuRl, GAD1/GAD67, GluR2/3, GAD2/GAD65, GluR2, GADD45 알파, GluR3, GADD45 베타, Glutl, GADD45 감마, Glut2, 갈렉틴-1, Glut3, 갈렉틴-2, Glut4, 갈렉틴-3, Glut5, 갈렉틴-3 BP, 글루타레독신 1, 갈렉틴-4, 글리신 R, 갈렉틴-7, 글리코포린 A, 갈렉틴-8, 글리피칸 2, 갈렉틴-9, 글리피칸 3, GalNAc4S-6ST, 글리피칸 5, GAP-43, 글리피칸 6, GAPDH, GM-CSF, Gasl, GM-CSF R 알파, Gas6, GMF-베타, GASP-l/WFIKKNRP, gpl30, GASP-2/WFIKKN, 글리코겐 포스포릴라제 BB/GPBB, GATA-I, GPR15, GATA-2, GPR39, GATA-3, GPVI, GATA-4, GR/NR3C1, GATA-5, Gr-1/Ly-6G, GATA-6, 그래뉼리신, GBL, 그랜자임 A, GCNF/NR6A1, 그랜자임 B, CXCL6/GCP-2, 그랜자임 D, G-CSF, 그랜자임 G, G-CSF R, 그랜자임 H, GDF-I, GRASP, GDF-3 GRB2, GDF-5, 그렘린, GDF-6, GRO, GDF-7, CXCL1/GRO 알파, GDF-8, CXCL2/GRO 베타, GDF-9, CXCL3/GRO 감마, GDF-11, 성장 호르몬, GDF-15, 성장 호르몬 R, GDNF, GRP75/HSPA9B, GFAP, GSK-3 알파/베타, GFI-I, GSK-3 알파, GFR 알파-1/GDNF R 알파-1, GSK-3 베타, GFR 알파-2/GDNF R 알파-2, EZFIT, H2AX, 히스티딘, H60, HM74A, HAI-I, HMGA2, HAI-2, HMGB1, HAI-2A, TCF-2/HNF-1 베타, HAI-2B, HNF-3 베타/FoxA2, HAND1, HNF-4 알파/NR2 Al, HAPLN1, HNF-4 감마/NR2A2, 기도 트립신-유사 프로테아제/HAT, HO-1/HMOX1/HSP32, HB-EGF, HO-2/HMOX2, CCL14a/HCC-l, HPRG, CCL14b/HCC-3, Hrk, CCL16/HCC-4, HRP-I, 알파 HCG, HS6ST2, Hck, HSD-I, HCR/CRAM-A/B, HSD-2, HDGF, HSP 10/EPF, 헤모글로빈, HSP27, 헤파쏘신, HSP60, HES-1, HSP70, HES-4, HSP90, HGF, HTRA/프로테아제 Do, HGF 활성화제, HTRA1/PRSS11, HGF R, HTRA2/0mi, HIF-I 알파, HVEM/TNFRSF 14, HIF-2 알파, 히알루로난, HIN-l/세크레토글로불린 3A1, 4-히드록시노넨알, Hip, CCLl/I-309/TCA-3, IL-10, cIAP (pan), IL-10 R 알파, cIAP-l/HIAP-2, IL-1O R 베타, cIAP-2/HIAP-l, IL-11, IBSP/시알로단백질 II, EL-11 R 알파, ICAM-1/CD54, IL-12, ICAM-2/CD102, IL-12/IL-23 p40, ICAM-3/CD50, IL-12 R 베타 1, ICAM-5, IL-12 R 베타 2, ICAT, IL-13, ICOS, IL-13 R 알파 1, 이두로네이트 2-술파타제/EOS, IL-13 R 알파 2, EFN, IL-15, IFN-알파, IL-15 R 알파, IFN-알파 1, IL-16, IFN-알파 2, IL-17, IFN-알파 4b, IL-17 R, IFN-알파 A, IL-17 RC, IFN-알파 B2, IL-17 RD, IFN-알파 C, IL-17B, IFN-알파 D, IL-17B R, IFN-알파 F, IL-17C, IFN-알파 G, IL-17D, IFN-알파 H2, IL-17E, IFN-알파 I, IL-17F, IFN-알파 Jl, IL-18/IL-1F4, IFN-알파 K, IL-18 BPa, IFN-알파 WA, IL-18 BPc, IFN-알파/베타 Rl, IL-18 BPd, IFN-알파/베타 R2, IL-18 R 알파/IL-1 R5, IFN-베타, IL-18 R 베타/IL-1 R7, IFN-감마, IL-19, IFN-감마 Rl, IL-20, IFN-감마 R2, IL-20 R 알파, IFN-오메가, IL-20 R 베타, IgE, IL-21, IGFBP-I, IL-21 R, IGFBP-2, IL-22, IGFBP-3, IL-22 R, IGFBP-4, IL-22BP, IGFBP-5, IL-23, IGFBP-6, IL-23 R, IGFBP-L1, IL-24, IGFBP-rpl/IGFBP-7, IL-26/AK155, IGFBP-rPIO, IL-27, IGF-I, EL-28A, IGF-I R, IL-28B, IGF-II, IL-29/EFN-람다 1, IGF-II R, IL-31, IgG, EL-31 RA, IgM, IL-32 알파, IGSF2, IL-33, IGSF4A/SynCAM, ILT2/CD85J, IGSF4B, ILT3/CD85k, IGSF8, ILT4/CD85d, IgY, ILT5/CD85a, IkB-베타, ILT6/CD85e, IKK 알파, 인디안 헤지호그(Indian Hedgehog), IKK 엡실론, INSRR, EKK 감마, 인슐린, IL-I 알파/IL-IFl, 인슐린 R/CD220, IL-I 베타/IL-lF2, 프로인슐린, IL-lra/IL-lF3, 인슐리신/EDE, IL-1F5/FIL1 델타, 인테그린 알파 2/CD49b, IL-1F6/FIL1 엡실론, 인테그린 알파 3/CD49c, IL-1F7/FIL1 제타, 인테그린 알파 3 베타 l/VLA-3, IL-1F8/FIL1 에타, 인테그린 알파 4/CD49d, IL-1F9/IL-1 H1, 인테그린 알파 5/CD49e, IL-1F10/IL-1HY2, 인테그린 알파 5 베타 1, IL-I RI, 인테그린 알파 6/CD49f, IL-I RII, 인테그린 알파 7, IL-I R3/IL-1 R AcP, 인테그린 알파 9, IL-I R4/ST2, 인테그린 알파 E/CD103, IL-I R6/IL-1 R rp2, 인테그린 알파 L/CD11a, IL-I R8, 인테그린 알파 L 베타 2, IL-I R9, 인테그린 알파 M/CD11b, IL-2, 인테그린 알파 M 베타 2, IL-2 R 알파, 인테그린 알파 V/CD51, IL-2 R 베타, 인테그린 알파 V 베타 5, IL-3, 인테그린 알파 V 베타3, IL-3 R 알파, 인테그린 알파 V 베타 6, IL-3 R 베타, 인테그린 알파 X/CD11c, IL-4, 인테그린 베타 1/CD29, IL-4 R, 인테그린 베타 2/CD18, IL-5, 인테그린 베타 3/CD61, IL-5 R 알파, 인테그린 베타 5, IL-6, 인테그린 베타 6, IL-6 R, 인테그린 베타 7, IL-7, CXCL10/EP-10/CRG-2, IL-7 R 알파/CD127, IRAKI, CXCR1/IL-8 RA, IRAK4, CXCR2/IL-8 RB, ERS-I, CXCL8/IL-8, 섬-1, IL-9, CXCL11/I-TAC, IL-9 R, 재그드(Jagged) 1, JAM-4/IGSF5, 재그드 2, JNK, JAM-A, JNK1/JNK2, JAM-B/VE-JAM, JNK1, JAM-C, JNK2, 키니노겐, 칼리크레인 3/PSA, 키니노스타틴, 칼리크레인 4, KER/CD158, 칼리크레인 5, KER2DL1, 칼리크레인 6/뉴로신, KIR2DL3, 칼리크레인 7, KIR2DL4/CD158d, 칼리크레인 8/뉴로신, KIR2DS4, 칼리크레인 9, KIR3DL1, 혈장 칼리크레인/KLKBl, KER3DL2, 칼리크레인 10, 키렐2, 칼리크레인 11, KLF4, 칼리크레인 12, KLF5, 칼리크레인 13, KLF6, 칼리크레인 14, 클로토, 칼리크레인 15, 클로토 베타, KC, KOR, 키프1, 크레멘-1, Kel1, 크레멘-2, KGF/FGF-7, LAG-3, LINGO-2, LAIR1, 리핀 2, LAIR2, 리포칼린-1, 라미닌 알파 4, 리포칼린-2/NGAL, 라미닌 감마 1, 5-리폭시게나제, 라미닌 I, LXR 알파/NRlH3, 라미닌 S, LXR 베타/NRlH2, 라미닌-1, 리빈, 라미닌-5, LEX, LAMP, LMIR1/CD300A, 랑게린, LMIR2/CD300c, LAR, LMIR3/CD300LF, 라텍신, LMIR5/CD300LB, 라일린, LMIR6/CD300LE, LBP, LM02, LDL R, LOX-1/SR-E1, LECT2, LRH-1/NR5A2, LEDGF, LRIG1, 레프티, LRIG3, 레프티-1, LRP-I, 레프티-A, LRP-6, 레구마인, LSECtin/CLEC4G, 렙틴, 루미칸, 렙틴 R, CXCL15/렁카인, 류코트리엔 B4, XCLl/림포탁틴, 류코트리엔 B4 Rl, 림프독소, LEF, 림프독소 베타/TNFSF3, LIF R 알파, 림프독소 베타 R/TNFRSF3, LIGHT/TNFSF14, Lyn, 리미틴, Lyp, LIMPII/SR-B2, 리실 옥시다제 동족체 2, LIN-28, LYVE-I, LINGO-I, 알파 2-거대글로불린, CXCL9/MIG, MAD2L1, 미메칸, MAdCAM-1, 민딘, MafB, 무기질코르티코이드 R/NR3C2, MafF, CCL3L1/MIP-1 알파 동형 LD78 베타, MafG, CCL3/MIP-1 알파, MafK, CCL4L1/LAG-1, MAG/시글렉-4a, CCL4/MIP-1 베타, MANF, CCL15/MEP-1 델타, MAP2, CCL9/10/MIP-1 감마, MAPK, MIP-2, 마랍신/판크레아신, CCL19/MIP-3 베타, MARCKS, CCL20/MIP-3 알파, MARCO, MIP-I, Mashl, MIP-II, 마트릴린-2, MIP-III, 마트릴린-3, MIS/AMH, 마트릴린-4, MIS RII, 마트립타제/ST14, MIXL1, MBL, MKK3/MKK6, MBL-2, MKK 3, 멜라노코르틴 3R/MC3R, MKK4, MCAM/CD146, MKK6, MCK-2, MKK7, Mcl-1, MKP-3, MCP-6, MLH-I, CCL2/MCP-1, MLK4 알파, MCP-11, MMP, CCL8/MCP-2, MMP-1, CCL7/MCP-3/MARC, MMP-2, CCL13/MCP-4, MMP-3, CCL12/MCP-5, MMP-7, M-CSF, MMP-8, M-CSF R, MMP-9, MCV-유형 II, MMP-10, MD-I, MMP-11, MD-2, MMP-12, CCL22/MDC, MMP-13, MDL-1/CLEC5A, MMP-14, MDM2, MMP-15, MEA-I, MMP-16/MT3-MMP, MEK1/MEK2, MMP-24/MT5-MMP, MEK1, MMP-25/MT6-MMP, MEK2, MMP-26, 멜루신, MMR, MEPE, MOG, 메프린 알파, CCL23/MPIF-1, 메프린 베타, M-Ras/R-Ras3, Mer, Mrel 1, 메소텔린, MRP1 메테오린, MSK1/MSK2, 메티오닌 아미노펩티다제 1, MSK1, 메티오닌 아미노펩티다제, MSK2, 메티오닌 아미노펩티다제 2, MSP, MFG-E8, MSP R/Ron, MFRP, Mug, MgcRacGAP, MULT-I, MGL2, 무사시-1, MGMT, 무사시-2, MIA, MuSK, MICA, MutY DNA 글리코실라제, MICB, MyD88, MICL/CLEC12A, 미엘로퍼옥시다제, 베타 2 마이크로글로불린, 마이오카르딘, 미드카인, 마이오실린, MIF, 마이오글로빈, NAIP NGFI-B 감마/NR4A3, 나노그, NgR2/NgRHl, CXCL7/NAP-2, NgR3/NgRH2, Nbsl, 니도겐-1/엔탁틴, NCAM-1/CD56, 니도겐-2, NCAM-L1, 산화 질소, 넥틴-1, 니트로티로신, 넥틴-2/CDl 12, NKG2A, 넥틴-3, NKG2C, 넥틴-4, NKG2D, 네오제닌, NKp30, 네프리리신/CDIO, NKp44, 네프리리신-2/MMEL1/MMEL2, NKp46/NCRl, 네스틴, NKp80/KLRFl, NETO2, NKX2.5, 네트린-1, NMDA R, NR1 하위단위, 네트린-2, NMDA R, NR2A 하위단위, 네트린-4, NMDA R, NR2B 하위단위, 네트린-Gla, NMDA R, NR2C 하위단위, 네트린-G2a, N-Me-6,7-디OH-TIQ, 뉴레귤린-1/NRG1, 노달, 뉴레귤린-3/NRG3, 노긴, 뉴리틴, Nogo 수용체, 뉴로Dl, Nogo-A, 뉴로파씬, NOMO, 뉴로제닌-1, Nope, 뉴로제닌-2, 노린, 뉴로제닌-3, eNOS, 뉴로리신, iNOS, 뉴로파이신 II, nNOS, 뉴로필린-1, 노치-1, 뉴로필린-2, 노치-2, 뉴로포이에틴, 노치-3, 뉴로트리민, 노치-4, 뉴르튜린, NOV/CCN3, NFAM1, NRAGE, NF-H, NrCAM, NFkBl, NRL, NFkB2, NT-3, NF-L, NT-4, NF-M, NTB-A/SLAMF6, NG2/MCSP, NTH1, NGF R/TNFRSF16, 뉴클레오스테민, 베타-NGF, Nurr-1/NR4A2, NGFI-B 알파/NR4Al, OAS2, 오렉신 B, OBCAM, OSCAR, OCAM, OSF-2/페리오스타틴, OCIL/CLEC2d, 온코스타틴 M/OSM, OCILRP2/CLEC2i, OSM R 베타, Oct-3/4, 오스테오액티빈/GPNMB, OGGl, 오스테오아데린, Olig 1, 2, 3, 오스테오칼신, Olig1, 오스테오크린, 0lig2, 오스테오폰틴, 0lig3, 오스테오프로테게린/TNFRSFl IB, 올리고덴드로사이트 마커 O1, Otx2, 올리고덴드로사이트 마커 O4, OV-6, OMgp, OX40/TNFRSF4, 옵티신, OX40 리간드/TNFSF4, 오렉신 A, OAS2, 오렉신 B, OBCAM, OSCAR, OCAM, OSF-2/페리오스틴, 0CIL/CLEC2d, 온코스타틴 M/OSM, OCILRP2/CLEC2i, OSM R 베타, Oct-3/4, 오스테오액티빈/GPNMB, OGG1, 오스테오아데린, Olig 1, 2, 3, 오스테오칼신, Olig1, 오스테오크린, 0lig2, 오스테오폰틴, 0lig3, 오스테로프로테게린/TNFRSFl IB, 올리고덴드로사이트 마커 01, Otx2, 올리고덴드로사이트 마커 04, OV-6, OMgp, OX40/TNFRSF4, 옵티신, OX40 리간드/TNFSF4, 오렉신 A, RACKl, Ret, Radl, REV-ERB 알파/NRlDl, Radl7, REV-ERB 베타/NRlD2, Rad51, Rex-1, Rae-1, RGM-A, Rae-1 알파, RGM-B, Rae-1 베타, RGM-C, Rae-1 델타, Rheb, Rae-1 엡실론, 리보솜 단백질 S6, Rae-1 감마, RIPl, Raf-1, ROBO1, RAGE, R0B02, RalA/RalB, R0B03, RalA, ROBO4, RaIB, ROR/NRlFl-3 (pan), RANK/TNFRSF11A, ROR 알파/NRlFl, CCL5/RANTES, ROR 감마/NRlF3, RaplA/B, RTK-유사 오르판 수용체 1/RORl, RAR 알파/NRlBl, RTK-유사 오르판 수용체 2/ROR2, RAR 베타/NRlB2, RP105, RAR 감마/NRlB3, RP A2, Ras, RSK (pan), RBP4, RSK1/RSK2, RECK, RSK1, Reg 2/PAP, RSK2, Reg I, RSK3, Reg II, RSK4, Reg III, R-스폰딘 1, Reg Ilia, R-스폰딘 2, Reg IV, R-스폰딘 3, 릴랙신-1, RUNX1/CBFA2, 릴랙신-2, RUNX2/CBFA1, 릴랙신-3, RUNX3/CBFA3, RELM 알파, RXR 알파/NR2Bl, RELM 베타, RXR 베타/NR2B2, RELT/TNFRSF19L, RXR 감마/NR2B3, 레지스틴, SlOOAlO, SLITRK5, Sl00A8, SLPI, Sl00A9, SMAC/디아블로, SlOOB, Smadl, SlOOP, Smad2, SALLl, Smad3, 델타-사르코글리칸, Smad4, Sca-1/Ly6, Smad5, SCD-I, Smad7, SCF, Smad8, SCF R/c-kit, SMCl, SCGF, 알파-평활근 액틴, SCL/Tall, SMUGl, SCP3/SYCP3, 스네일(Snail), CXCL12/SDF-1, 나트륨 칼슘 교환제 1, SDNSF/MCFD2, Soggy-1, 알파-세크레타제, 음향 헤지호그, 감마-세크레타제, SorCSl, 베타-세크레타제, SorCS3, E-셀렉틴, 소르틸린, L-셀렉틴, SOST, P-셀렉틴, SOX1, 세마포린 3A, SOX2, 세마포린 3C, SOX3, 세마포린 3E, SOX7, 세마포린 3F, SOX9, 세마포린 6A, SOXlO, 세마포린 6B, SOX 17, 세마포린 6C, SOX21 세마포린 6D, SPARC, 세마포린 7A, SPARC-유사체 1, 세파라제, SP-D, 세린/트레오닌 포스파타제 기질 I, 스피네신, 세르핀 Al, F-스폰딘, 세르핀 A3, SR-AI/MSR, 세르핀 A4/칼리스타틴, Src, 세르핀 A5/단백질 C 억제제, SREC-I/SR-F1, 세르핀 A8/안지오텐쇼노겐, SREC-II, 세르핀 B5, SSEA-I, 세르핀 Cl/항트롬빈-III, SSEA-3, 세르핀 Dl/헤파린 보조인자 II, SSEA-4, 세르핀 El/PAI-1, ST7/LRP12, 세르핀 E2, 스태빌린-l, 세르핀 Fl, 스태빌린-2, 세르핀 F2, 스태니오칼신 1, 세르핀 Gl/Cl 억제제, 스태니오칼신 2, 세르핀 12, STAT1, 혈청 아밀로이드 Al, STAT2, SF-1/NR5A1, STAT3, SGK, STAT4, SHBG, STAT5a/b, SHIP, STAT5a, SHP/NR0B2, STAT5b, SHP-I, STAT6, SHP-2, VE-스타틴, SIGIRR, 스텔라/Dppa3, 시글렉-2/CD22, STRO-I, 시글렉-3/CD33, 물질 P, 시글렉-5, 술파미다제/SGSH, 시글렉-6, 술파타제 변형 인자 1/SUMFl, 시글렉-7, 술파타제 변형 인자 2/SUMF2, 시글렉-9, SUMOl, 시글렉-10, SUM02/3/4, 시글렉-11, SUM03, 시글렉-F, 수퍼옥시드 디스뮤타제, SIGNR1/CD209, 수퍼옥시드 디스뮤타제-l/Cu-Zn SOD, SIGNR4, 수퍼옥시드 디스뮤타제-2/Mn-SOD, SIRP 베타 1, 수퍼옥시드 디스뮤타제-3/EC-SOD, SKI, 수르비빈, SLAM/CD150, 시납신 I, 수면 미용 트랜스포사제, 신데칸-I/CD 138, Slit3, 신데칸-2, SLITRK1, 신데칸-3, SLITRK2, 신데칸-4, SLITRK4, TACI/TNFRSF13B, TMEFF 1/토모레귤린-l, TAO2, TMEFF2, TAPP1, TNF-알파/TNFSF IA, CCL17/TARC, TNF-베타/TNFSFlB, 타우, TNF RI/TNFRSFIA, TC21/R-Ras2, TNF RII/TNFRSF1B, TCAM-I, TOR, TCCR/WSX-1, TP-I, TC-PTP, TP63/TP73L, TDG, TR, CCL25/TECK, TR 알파/NRlAl, 테나씬 C, TR 베타 1/NR1A2, 테나씬 R, TR2/NR2C1, TER-119, TR4/NR2C2, TERT, TRA-1-85, 테스티칸 1/SPOCKl, TRADD, 테스티칸 2/SPOCK2, TRAF-1, 테스티칸 3/SPOCK3, TRAF-2, TFPI, TRAF-3, TFPI-2, TRAF-4, TGF-알파, TRAF-6, TGF-베타, 트레일/TNFSF10, TGF-베타 1, 트레일 Rl/TNFRSFIOA, LAP (TGF-베타 1), 트레일 R2/TNFRSF10B, 잠재성 TGF-베타 1, 트레일 R3/TNFRSF10C, TGF-베타 1.2, 트레일 R4/TNFRSF10D, TGF-베타 2, TRANCE/TNFSFl 1, TGF-베타 3, TfR (트랜스페린 R), TGF-베타 5, 아포-트랜스페린, 잠재성 TGF-베타 bp 1, 홀로-트랜스페린, 잠재성 TGF-베타 bp2, 트래핀-2/엘라핀, 잠재성 TGF-베타 bp4, TREM-1, TGF-베타 RI/ALK-5, TREM-2, TGF-베타 RII, TREM-3, TGF-베타 RIIb, TREML1/TLT-1, TGF-베타 RIII, TRF-I, 써모리신, TRF-2, 티오레독신-1, TRH-분해성 외부효소/TRHDE, 티오레독신-2, TRIM5, 티오레독신-80, 트리펩티딜-펩티다제 I, 티오레독신-유사체 5/TRP14, TrkA, THOP1, TrkB, 트롬보모듈린/CD141, TrkC, 트롬보포이에틴, TROP-2, 트롬보포이에틴 R, 트로포닌 I 펩티드 3, 트롬보스폰딘-1, 트로포닌 T, 트롬보스폰딘-2, TROY/TNFRSF19, 트롬보스폰딘-4, 트립신 1, 티모포이에틴, 트립신 2/PRSS2, 흉선 케모카인-1, 트립신 3/PRSS3, Tie-1, 트립타제-5/Prss32, Tie-2, 트립타제 알파/TPS1, TIM-I/KIM-I/HAVCR, 트립타제 베타-1/MCPT-7, TIM-2, 트립타제 베타-2/TPSB2, TIM-3, 트립타제 엡실론/BSSP-4, TIM-4, 트립타제 감마-1/TPSGl, TIM-5, 트립토판 히드록실라제, TIM-6, TSC22, TIMP-I, TSG, TIMP-2, TSG-6, TIMP-3, TSK, TIMP-4, TSLP, TL1A/TNFSF15, TSLP R, TLR1, TSP50, TLR2, 베타-III 튜불린, TLR3, TWEAK/TNFSF12, TLR4, TWEAK R/TNFRSF 12, TLR5, Tyk2, TLR6, 포스포-티로신, TLR9, 티로신 히드록실라제, TLX/NR2E1, 티로신 포스파타제 기질 I, 유비퀴틴, UNC5H3, Ugi, UNC5H4, UGRP1, UNG, ULBP-I, uPA, ULBP-2, uPAR, ULBP-3, URB, UNC5H1, UVDE, UNC5H2, 바닐로이드 Rl, VEGF R, VASA, VEGF Rl/Flt-1, 바소히빈, VEGF R2/KDR/Flk-1, 바소린, VEGF R3/FU-4, 바소스타틴, 베르시칸, Vav-1, VG5Q, VCAM-I, VHR, VDR/NRlIl, 비멘틴, VEGF, 비트로넥틴, VEGF-B, VLDLR, VEGF-C, vWF-A2, VEGF-D, 시누클레인-알파, Ku70, WASP, Wnt-7b, WIF-I, Wnt-8a WISP-1/CCN4, Wnt-8b, WNK1, Wnt-9a, Wnt-1, Wnt-9b, Wnt-3a, Wnt-10a, Wnt-4, Wnt-10b, Wnt-5a, Wnt-11, Wnt-5b, wnvNS3, Wnt7a, XCR1, XPE/DDB1, XEDAR, XPE/DDB2, Xg, XPF, XIAP, XPG, XPA, XPV, XPD, XRCC1, Yes, YY1, EphA4.
수많은 인간 이온 채널들이 특히 중요한 표적이다. 비제한적인 예로는 5-히드록시트립타민 3 수용체 B 하위단위, 5-히드록시트립타민 3 수용체 전구체, 5-히드록시트립타민 수용체 3 하위단위 C, AAD 14 단백질, 아세틸콜린 수용체 단백질, 알파 하위단위 전구체, 아세틸콜린 수용체 단백질, 베타 하위단위 전구체, 아세틸콜린 수용체 단백질, 델타 하위단위 전구체, 아세틸콜린 수용체 단백질, 엡실론 하위단위 전구체, 아세틸콜린 수용체 단백질, 감마 하위단위 전구체, 산 감지 이온 채널 3 스플라이스 변이체 b, 산 감지 이온 채널 3 스플라이스 변이체 c, 산 감지 이온 채널 4, ADP-리보스 피로포스파타제, 미토콘드리아 전구체, 알파1 A-전압-의존성 칼슘 채널, 아밀로리드-민감성 양이온 채널 1, 뉴런, 아밀로리드-민감성 양이온 채널 2, 뉴런 아밀로리드-민감성 양이온 채널 4, 동형 2, 아밀로리드-민감성 나트륨 채널, 아밀로리드-민감성 나트륨 채널 알파-하위단위, 아밀로리드-민감성 나트륨 채널 베타-하위단위, 아밀로리드-민감성 나트륨 채널 델타-하위단위, 아밀로리드-민감성 나트륨 채널 감마-하위단위, 아넥신 A7, 선단-유사(Apical-like) 단백질, ATP-민감성 내향 정류기(inward rectifier) 칼륨 채널 1, ATP-민감성 내향 정류기 칼륨 채널 10, ATP-민감성 내향 정류기 칼륨 채널 11, ATP-민감성 내향 정류기 칼륨 채널 14, ATP-민감성 내향 정류기 칼륨 채널 15, ATP-민감성 내향 정류기 칼륨 채널 8, 칼슘 채널 알파12.2 하위단위, 칼슘 채널 알파12.2 하위단위, 칼슘 채널 알파1E 하위단위, 델타19 델타40 델타46 스플라이스 변이체, 칼슘-활성화 칼륨 채널 알파 하위단위 1 , 칼슘-활성화 칼륨 채널 베타 하위단위 1, 칼슘-활성화 칼륨 채널 베타 하위단위 2, 칼슘-활성화 칼륨 채널 베타 하위단위 3, 칼슘-의존성 클로라이드 채널-1, 양이온 채널 TRPM4B, CDNA FLJ90453 fis, 칼륨 채널 사량체화 도메인 함유 6과 고도로 유사한 클론 NT2RP3001542, CDNA FLJ90663 fis, 클로라이드 세포내 채널 단백질 5와 고도로 유사한 클론 PLACE 1005031, CGMP-개폐형(gated) 양이온 채널 베타 하위단위, 클로라이드 채널 단백질, 클로라이드 채널 단백질 2, 클로라이드 채널 단백질 3, 클로라이드 채널 단백질 4, 클로라이드 채널 단백질 5, 클로라이드 채널 단백질 6, 클로라이드 채널 단백질 ClC-Ka, 클로라이드 채널 단백질 ClC-Kb, 클로라이드 채널 단백질, 골격근, 클로라이드 세포내 채널 6, 클로라이드 세포내 채널 단백질 3, 클로라이드 세포내 채널 단백질 4, 클로라이드 세포내 채널 단백질 5, CHRNA3 단백질, Clcn3e 단백질, CLCNKB 단백질, CNGA4 단백질, 큘린-5, 고리형 GMP 개폐형 칼륨 채널, 고리형-뉴클레오티드-개폐형 양이온 채널 4, 고리형-뉴클레오티드-개폐형 양이온 채널 알파 3, 고리형-뉴클레오티드-개폐형 양이온 채널 베타 3, 고리형-뉴클레오티드-개폐형 후각 채널, 낭성 섬유증 막횡단 전도도 조절인자, 시토크롬 B-245 중쇄, 디히드로피리딘-민감성 L-유형, 칼슘 채널 알파-2/델타 하위단위 전구체, FXYD 도메인-함유 이온 수송 조절인자 3 전구체, FXYD 도메인-함유 이온 수송 조절인자 5 전구체, FXYD 도메인-함유 이온 수송 조절인자 6 전구체, FXYD 도메인-함유 이온 수송 조절인자 7, FXYD 도메인-함유 이온 수송 조절인자 8 전구체, G 단백질-활성화 내향 정류기 칼륨 채널 1, G 단백질-활성화 내향 정류기 칼륨 채널 2, G 단백질-활성화 내향 정류기 칼륨 채널 3, G 단백질-활성화 내향 정류기 칼륨 채널 4, 감마-아미노부티르-산 수용체 알파-1 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 알파-2 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 알파-3 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 알파-4 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 알파-5 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 알파-6 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 베타-1 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 베타-2 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 베타-3 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 델타 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 엡실론 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 감마-1 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 감마-3 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 파이 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 로-1 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 로-2 하위단위 전구체, 감마-아미노부티르-산 수용체 세타 하위단위 전구체, GluR6 카이네이트 수용체, 글루타메이트 수용체 1 전구체, 글루타메이트 수용체 2 전구체, 글루타메이트 수용체 3 전구체, 글루타메이트 수용체 4 전구체, 글루타메이트 수용체 7, 글루타메이트 수용체 B, 글루타메이트 수용체 델타-1 하위단위 전구체, 글루타메이트 수용체, 이온향성(ionotropic) 카이네이트 1 전구체, 글루타메이트 수용체, 이온향성 카이네이트 2 전구체, 글루타메이트 수용체, 이온향성 카이네이트 3 전구체, 글루타메이트 수용체, 이온향성 카이네이트 4 전구체, 글루타메이트 수용체, 이온향성 카이네이트 5 전구체, 글루타메이트 [NMDA] 수용체 하위단위 3A 전구체, 글루타메이트 [NMDA] 수용체 하위단위 3B 전구체, 글루타메이트 [NMDA] 수용체 하위단위 엡실론 1 전구체, 글루타메이트 [NMDA] 수용체 하위단위 엡실론 2 전구체, 글루타메이트 [NMDA] 수용체 하위단위 엡실론 4 전구체, 글루타메이트 [NMDA] 수용체 하위단위 제타 1 전구체, 글리신 수용체 알파-1 사슬 전구체, 글리신 수용체 알파-2 사슬 전구체, 글리신 수용체 알파-3 사슬 전구체, 글리신 수용체 베타 사슬 전구체, H/ACA 리보뉴클레오단백질 복합체 하위단위 1, 고친화성 이뮤노글로불린 엡실론 수용체 베타-하위단위, 추정(hypothetical) 단백질 DKFZp31310334, 추정 단백질 DKFZp761M1724, 추정 단백질 FLJ12242, 추정 단백질 FLJ14389, 추정 단백질 FLJ14798, 추정 단백질 FLJ14995, 추정 단백질 FLJ16180, 추정 단백질 FLJ16802, 추정 단백질 FLJ32069, 추정 단백질 FLJ37401, 추정 단백질 FLJ38750, 추정 단백질 FLJ40162, 추정 단백질 FLJ41415, 추정 단백질 FLJ90576, 추정 단백질 FLJ90590, 추정 단백질 FLJ90622, 추정 단백질 KCTD15, 추정 단백질 MGC15619, 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 수용체 유형 1, 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 수용체 유형 2, 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 수용체 유형 3, 중간 전도도 칼슘-활성화 칼륨 채널 단백질 4, 내향 정류기 칼륨 채널 13, 내향 정류기 칼륨 채널 16, 내향 정류기 칼륨 채널 4, 내향 정류 K(+) 채널 음성 조절인자 Kir2.2v, 카이네이트 수용체 하위단위 KA2a, KCNH5 단백질, KCTD 17 단백질, KCTD2 단백질, 각질세포 관련 막횡단 단백질 1, Kv 채널-상호작용 단백질 4, 멜라스타틴 1, 막 단백질 MLC1, MGC 15619 단백질, 뮤코리핀-1, 뮤코리핀-2, 뮤코리핀-3, 다중약물 내성-관련 단백질 4, N-메틸-D-아스파르테이트 수용체 2C 하위단위 전구체, NADPH 옥시다제 동족체 1, Nav1.5, 뉴런 아세틸콜린 수용체 단백질, 알파-10 하위단위 전구체, 뉴런 아세틸콜린 수용체 단백질, 알파-2 하위단위 전구체, 뉴런 아세틸콜린 수용체 단백질, 알파-3 하위단위 전구체, 뉴런 아세틸콜린 수용체 단백질, 알파-4 하위단위 전구체, 뉴런 아세틸콜린 수용체 단백질, 알파-5 하위단위 전구체, 뉴런 아세틸콜린 수용체 단백질, 알파-6 하위단위 전구체, 뉴런 아세틸콜린 수용체 단백질, 알파-7 하위단위 전구체, 뉴런 아세틸콜린 수용체 단백질, 알파-9 하위단위 전구체, 뉴런 아세틸콜린 수용체 단백질, 베타-2 하위단위 전구체, 뉴런 아세틸콜린 수용체 단백질, 베타-3 하위단위 전구체, 뉴런 아세틸콜린 수용체 단백질, 베타-4 하위단위 전구체, 뉴런 전압-의존성 칼슘 채널 알파 2D 하위단위, P2X 퓨린수용체(purinoceptor) 1, P2X 퓨린수용체 2, P2X 퓨린수용체 3, P2X 퓨린수용체 4, P2X 퓨린수용체 5, P2X 퓨린수용체 6, P2X 퓨린수용체 7, 췌장 칼륨 채널 TALK-Ib, 췌장 칼륨 채널 TALK-Ic, 췌장 칼륨 채널 TALK-Id, 포스포레만(Phospholemman) 전구체, 플라스모리핀, 다낭성 신장 질환 2 관련 단백질, 다낭성 신장 질환 2-유사체 1 단백질, 다낭성 신장 질환 2-유사체 2 단백질, 다낭성 신장 질환 및 에그 젤리 관련 단백질 전구체에 대한 수용체, 폴리시스틴-2, 칼륨 채널 조절인자, 칼륨 채널 하위패밀리 K 구성원 1, 칼륨 채널 하위패밀리 K 구성원 10, 칼륨 채널 하위패밀리 K 구성원 12, 칼륨 채널 하위패밀리 K 구성원 13, 칼륨 채널 하위패밀리 K 구성원 15, 칼륨 채널 하위패밀리 K 구성원 16, 칼륨 채널 하위패밀리 K 구성원 17, 칼륨 채널 하위패밀리 K 구성원 2, 칼륨 채널 하위패밀리 K 구성원 3, 칼륨 채널 하위패밀리 K 구성원 4, 칼륨 채널 하위패밀리 K 구성원 5, 칼륨 채널 하위패밀리 K 구성원 6, 칼륨 채널 하위패밀리 K 구성원 7, 칼륨 채널 하위패밀리 K 구성원 9, 칼륨 채널 사량체화 도메인 함유 3, 칼륨 채널 사량체화 도메인 함유 단백질 12, 칼륨 채널 사량체화 도메인 함유 단백질 14, 칼륨 채널 사량체화 도메인 함유 단백질 2, 칼륨 채널 사량체화 도메인 함유 단백질 4, 칼륨 채널 사량체화 도메인 함유 단백질 5, 칼륨 채널 사량체화 도메인 함유 10, 칼륨 채널 사량체화 도메인 함유 단백질 13, 칼륨 채널 사량체화 도메인-함유 1, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 A 구성원 1, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 A 구성원 2, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 A 구성원 4, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 A 구성원 5, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 A 구성원 6, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 B 구성원 1, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 B 구성원 2, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 C 구성원 1, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 C 구성원 3, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 C 구성원 4, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 D 구성원 1, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 D 구성원 2, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 D 구성원 3, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 E 구성원 1, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 E 구성원 2, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 E 구성원 3, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 E 구성원 4, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 F 구성원 1, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 G 구성원 1, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 G 구성원 2, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 G 구성원 3, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 G 구성원 4, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 H 구성원 1, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 H 구성원 2, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 H 구성원 3, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 H 구성원 4, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 H 구성원 5, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 H 구성원 6, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 H 구성원 7, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 H 구성원 8, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 KQT 구성원 1, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 KQT 구성원 2, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 KQT 구성원 3, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 KQT 구성원 4, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 KQT 구성원 5, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 S 구성원 1, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 S 구성원 2, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 S 구성원 3, 칼륨 전압-개폐형 채널 하위패밀리 V 구성원 2, 칼륨 전압-개폐형 채널, 하위패밀리 H, 구성원 7, 동형 2, 칼륨/나트륨 과다분극-활성화 고리형 뉴클레오티드-개폐형 채널 1, 칼륨/나트륨 과다분극-활성화 고리형 뉴클레오티드-개폐형 채널 2, 칼륨/나트륨 과다분극-활성화 고리형 뉴클레오티드-개폐형 채널 3, 칼륨/나트륨 과다분극-활성화 고리형 뉴클레오티드-개폐형 채널 4, 추정 미토콘드리아 내수송 수용체 하위단위 TOM40 동족체, 퓨린계 수용체 P2X5, 동형 A, 추정 4 반복체 전압-개폐형 이온 채널, 추정 클로라이드 채널 단백질 7, 추정 GluR6 카이네이트 수용체, 추정 이온 채널 단백질 CATSPER2 변이체 1, 추정 이온 채널 단백질 CATSPER2 변이체 2, 추정 이온 채널 단백질 CATSPER2 변이체 3, 칼륨 채널 단백질 변이체 1의 추정 조절인자, 추정 티로신-단백질 포스파타제 TPTE, 리아노딘 수용체 1, 리아노딘 수용체 2, 리아노딘 수용체 3, SH3KBP1 결합 단백질 1, 짧은 일시적 수용체 전위 채널 1, 짧은 일시적 수용체 전위 채널 4, 짧은 일시적 수용체 전위 채널 5, 짧은 일시적 수용체 전위 채널 6, 짧은 일시적 수용체 전위 채널 7, 소전도도 칼슘-활성화 칼륨 채널 단백질 1, 소전도도 칼슘-활성화 칼륨 채널 단백질 2, 동형 b, 소전도도 칼슘-활성화 칼륨 채널 단백질 3, 동형 b, 소-전도도 칼슘-활성화 칼륨 채널 SK2, 소-전도도 칼슘-활성화 칼륨 채널 SK3, 나트륨 채널, 나트륨 채널 베타-1 하위단위 전구체, 나트륨 채널 단백질 유형 II 알파 하위단위, 나트륨 채널 단백질 유형 III 알파 하위단위, 나트륨 채널 단백질 유형 IV 알파 하위단위, 나트륨 채널 단백질 유형 IX 알파 하위단위, 나트륨 채널 단백질 유형 V 알파 하위단위, 나트륨 채널 단백질 유형 VII 알파 하위단위, 나트륨 채널 단백질 유형 VIII 알파 하위단위, 나트륨 채널 단백질 유형 X 알파 하위단위, 나트륨 채널 단백질 유형 XI 알파 하위단위, 나트륨- 및 클로라이드-활성화 ATP-민감성 칼륨 채널, 나트륨/칼륨-수송 ATPase 감마 사슬, 정자-관련 양이온 채널 1, 정자-관련 양이온 채널 2, 동형 4, 신택신-lBl, 일시적 수용체 전위 양이온 채널 하위패밀리 A 구성원 1, 일시적 수용체 전위 양이온 채널 하위패밀리 M 구성원 2, 일시적 수용체 전위 양이온 채널 하위패밀리 M 구성원 3, 일시적 수용체 전위 양이온 채널 하위패밀리 M 구성원 6, 일시적 수용체 전위 양이온 채널 하위패밀리 M 구성원 7, 일시적 수용체 전위 양이온 채널 하위패밀리 V 구성원 1, 일시적 수용체 전위 양이온 채널 하위패밀리 V 구성원 2, 일시적 수용체 전위 양이온 채널 하위패밀리 V 구성원 3, 일시적 수용체 전위 양이온 채널 하위패밀리 V 구성원 4, 일시적 수용체 전위 양이온 채널 하위패밀리 V 구성원 5, 일시적 수용체 전위 양이온 채널 하위패밀리 V 구성원 6, 일시적 수용체 전위 채널 4 엡실론 스플라이스 변이체, 일시적 수용체 전위 채널 4 제타 스플라이스 변이체, 일시적 수용체 전위 채널 7 감마 스플라이스 변이체, 종양 괴사 인자, 알파-유도 단백질 1, 내피, 2-세공 칼슘 채널 단백질 2, VDAC4 단백질, 전압 개폐형 칼륨 채널 Kv3.2b, 전압 개폐형 나트륨 채널 베타1B 하위단위, 전압-의존성 음이온 채널, 전압-의존성 음이온 채널 2, 전압-의존성 음이온-선택성 채널 단백질 1, 전압-의존성 음이온-선택성 채널 단백질 2, 전압-의존성 음이온-선택성 채널 단백질 3, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-1 하위단위, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-2 하위단위, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-3 하위단위, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-4 하위단위, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-5 하위단위, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-6 하위단위, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-7 하위단위, 전압-의존성 칼슘 채널 감마-8 하위단위, 전압-의존성 L-유형 칼슘 채널 알파-1C 하위단위, 전압-의존성 L-유형 칼슘 채널 알파-1D 하위단위, 전압-의존성 L-유형 칼슘 채널 알파-IS 하위단위, 전압-의존성 L-유형 칼슘 채널 베타-1 하위단위, 전압-의존성 L-유형 칼슘 채널 베타-2 하위단위, 전압-의존성 L-유형 칼슘 채널 베타-3 하위단위, 전압-의존성 L-유형 칼슘 채널 베타-4 하위단위, 전압-의존성 N-유형 칼슘 채널 알파-1B 하위단위, 전압-의존성 P/Q-유형 칼슘 채널 알파-1A 하위단위, 전압-의존성 R-유형 칼슘 채널 알파-1E 하위단위, 전압-의존성 T-유형 칼슘 채널 알파-1G 하위단위, 전압-의존성 T-유형 칼슘 채널 알파-1H 하위단위, 전압-의존성 T-유형 칼슘 채널 알파-1I 하위단위, 전압-개폐형 L-유형 칼슘 채널 알파-1 하위단위, 전압-개폐형 칼륨 채널 베타-1 하위단위, 전압-개폐형 칼륨 채널 베타-2 하위단위, 전압-개폐형 칼륨 채널 베타-3 하위단위, 전압-개폐형 칼륨 채널 KCNA7이 포함된다. 인간 전압-개폐형 나트륨 채널의 Navl.x 패밀리 역시 특히 가능성이 있는 표적이다. 상기 패밀리에는 예를 들면 채널 Navl.6 및 Navl.8이 포함된다.
다른 실시양태에서, 치료 단백질은 G-단백질 커플링 수용체(G-Protein Coupled Receptor) (GPCR)일 수 있다. 대표적인 GPCR에는 클래스 A 로돕신 유사 수용체 예컨대 무스카틴성(Muscatinic) (Muse.) 아세틸콜린 척추동물 유형 1, Muse, 아세틸콜린 척추동물 유형 2, Muse, 아세틸콜린 척추동물 유형 3, Muse, 아세틸콜린 척추동물 유형 4; 아드레날린수용체 (알파 아드레날린수용체 유형 1, 알파 아드레날린수용체 유형 2, 베타 아드레날린수용체 유형 1, 베타 아드레날린수용체 유형 2, 베타 아드레날린수용체 유형 3, 도파민 척추동물 유형 1, 도파민 척추동물 유형 2, 도파민 척추동물 유형 3, 도파민 척추동물 유형 4, 히스타민 유형 1, 히스타민 유형 2, 히스타민 유형 3, 히스타민 유형 4, 세로토닌 유형 1, 세로토닌 유형 2, 세로토닌 유형 3, 세로토닌 유형 4, 세로토닌 유형 5, 세로토닌 유형 6, 세로토닌 유형 7, 세로토닌 유형 8, 기타 세로토닌 유형들, 미량 아민, 안지오텐신 유형 1, 안지오텐신 유형 2, 봄베신, 브라디키닌, C5a 아나필락시스독소, Fmet-leu-phe, APJ 유사체, 인터류킨-8 유형 A, 인터류킨-8 유형 B, 인터류킨-8 유형 기타, C-C 케모카인 유형 1 내지 유형 11 및 기타 유형들, C-X-C 케모카인 (유형 2 내지 6 및 기타), C-X3-C 케모카인, 콜레시스토키닌 CCK, CCK 유형 A, CCK 유형 B, CCK 기타, 엔도텔린, 멜라노코르틴 (멜라닌세포 자극 호르몬, 부신피질자극 호르몬, 멜라노코르틴 호르몬), 더피(Duffy) 항원, 프로락틴-방출 펩티드 (GPRlO), 뉴로펩티드 Y (유형 1 내지 7), 뉴로펩티드 Y, 뉴로펩티드 Y 기타, 뉴로텐신, 아편유사제 (유형 D, K, M, X), 소마토스타틴 (유형 1 내지 5), 태키키닌 (물질 P (NK1), 물질 K (NK2), 뉴로메딘 K (NK3)), 태키키닌 유사체 1, 태키키닌 유사체 2, 바소프레신/바소토신 (유형 1 내지 2), 바소토신, 옥시토신/메소토신, 코노프레씬, 갈라닌 유사체, 프로테이나제-활성화 유사체, 오렉신 & 뉴로펩티드 FF.QRFP, 케모카인 수용체-유사체, 뉴로메딘 U 유사체 (뉴로메딘 U, PRX아미드), 호르몬 단백질 (소포 자극 호르몬, 루트로핀-융모생식샘자극 호르몬, 티로트로핀, 고나도트로핀 유형 I, 고나도트로핀 유형 II), (로드)옵신((Rhod)opsin), 로돕신 척추동물 (유형 1-5), 로돕신 척추동물 유형 5, 로돕신 절지동물, 로돕신 절지동물 유형 1, 로돕신 절지동물 유형 2, 로돕신 절지동물 유형 3, 로돕신 연체동물, 로돕신, 후각 (후각 II fam 1 내지 13), 프로스타글란딘 (프로스타글란딘 E2 하위유형 EP1, 프로스타글란딘 E2/D2 하위유형 EP2, 프로스타글란딘 E2 하위유형 EP3, 프로스타글란딘 E2 하위유형 EP4, 프로스타글란딘 F2-알파), 프로스타시클린, 트롬복산, 아데노신 유형 1 내지 3, 퓨린수용체, 퓨린수용체 P2RY1-4,6,11 GPR91, 퓨린수용체 P2RY5,8,9,10 GPR35,92,174, 퓨린수용체 P2RY12-14 GPR87 (UDP-글루코스), 칸나비노이드, 혈소판 활성화 인자, 고나도트로핀-방출 호르몬, 고나도트로핀-방출 호르몬 유형 I, 고나도트로핀-방출 호르몬 유형 II, 지방동원(Adipokinetic) 호르몬 유사체, 코라조닌, 티로트로핀-방출 호르몬 & 분비촉진제, 티로트로핀-방출 호르몬, 성장 호르몬 분비촉진제, 성장 호르몬 분비촉진제 유사체, 탈피-촉발 호르몬 (ETHR), 멜라토닌, 리소스핑고지질(Lysosphingolipid) & LPA (EDG), 스핑고신 1-포스페이트 Edg-1, 리소포스파티드산 Edg-2, 스핑고신 1-포스페이트 Edg-3, 리소포스파티드산 Edg-4, 스핑고신 1-포스페이트 Edg-5, 스핑고신 1-포스페이트 Edg-6, 리소포스파티드산 Edg-7, 스핑고신 1-포스페이트 Edg-8, Edg 기타 류코트리엔 B4 수용체, 류코트리엔 B4 수용체 BLT1, 류코트리엔 B4 수용체 BLT2, 클래스 A 오르판/기타, 추정 신경전달물질, SREB, Mas 원-종양유전자 & Mas-관련물질 (MRGs), GPR45 유사체, 시스테인계 류코트리엔, G-단백질 결합 담즙산 수용체, 유리 지방산 수용체 (GP40,GP41,GP43), 클래스 B 세크레틴 유사체, 칼시토닌, 코르티코트로핀 방출 인자, 위 억제 펩티드, 글루카곤, 성장 호르몬-방출 호르몬, 부갑상선 호르몬, PACAP, 세크레틴, 혈관활성 장 폴리펩티드, 라트로필린, 라트로필린 유형 1, 라트로필린 유형 2, 라트로필린 유형 3, ETL 수용체, 뇌-특이적 혈관형성 억제제 (BAI), 므두셀라(Methuselah)-유사 단백질 (MTH), 카드헤린 EGF LAG (CELSR), 초대형 G-단백질 커플링 수용체, 클래스 C 대사향성(Metabotropic) 글루타메이트/페로몬, 대사향성 글루타메이트 군 I 내지 III, 칼슘-감지 유사체, 세포외 칼슘-감지, 페로몬, 칼슘-감지 유사체 기타, 추정 페로몬 수용체, GABA-B, GABA-B 하위유형 1, GABA-B 하위유형 2, GABA-B 유사체, 오르판 GPRC5, 오르판 GPCR6, 브라이드 오브 세븐레스(Bride of sevenless) 단백질 (BOSS), 미각 수용체 (T1R), 클래스 D 진균 페로몬, 진균 페로몬 A-인자 유사체 (STE2.STE3), 진균 페로몬 B 유사체 (BAR,BBR,RCB,PRA), 클래스 E cAMP 수용체, 눈 백색증 단백질, 프리즐드/스무튼드 패밀리(Frizzled/Smoothened family), 프리즐드 군 A (Fz 1&2&4&5&7-9), 프리즐드 군 B (Fz 3&6), 프리즐드 군 C (기타), 보습코(Vomeronasal) 수용체, 선충 화학수용체, 곤충 방향물질 수용체, 및 클래스 Z 고세균/박테리아/진균 옵신이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서 기술되는 SABA 융합체는 하기의 활성 폴리펩티드들 중 어느 것을 포함할 수 있다: 보톡스, 마이오블록, 뉴로블록, 다이스포트 (또는 보툴리눔 뉴로톡신(botulinum neurotoxin)의 기타 혈청형), 알글루코시다제 알파, 다프토마이신, YH-16, 코리오고나도트로핀 알파, 필그라스팀, 세트로렐릭스, 인터류킨-2, 알데스류킨, 테세류킨, 데니류킨 디프티톡스, 인터페론 알파-n3 (주사용), 인터페론 알파-n1, DL-8234, 인터페론, 선토리 (감마-Ia), 인터페론 감마, 티모신 알파 1, 타소네르민, DigiFab, ViperaTAb, EchiTAb, CroFab, 네시리티드, 아바타셉트, 알레파셉트, 레비프, 엡토테르민 알파, 테리파라티드 (골다공증), 주사가능 칼시토닌 (골 질환), 칼시토닌 (비, 골다공증), 엔타네르셉트, 헤모글로빈 글루타머 250 (소), 드로트레코긴 알파, 콜라게나제, 카르페리티드, 재조합 인간 표피 성장 인자 (국소용 겔, 상처 치유), DWP-401, 다르베포에틴 알파, 에포에틴 오메가, 에포에틴 베타, 에포에틴 알파, 데시루딘, 레피루딘, 비발리루딘, 노나코그 알파, 모노닌, 엡타코그 알파 (활성화된 것), 재조합 인자 VIII+VWF, 재조합체, 재조합 인자 VIII, 인자 VIII (재조합), 알파네이트, 옥토코그 알파, 인자 VIII, 팔리페르민, 인디키나제, 테넥테플라제, 알테플라제, 파미테플라제, 레테플라제, 네이트플라제, 몬테플라제, 폴리트로핀 알파, rFSH, hpFSH, 미카푼진, 페그필그라스팀, 레노그라스팀, 나르토그라스팀, 세르모렐린, 글루카곤, 엑세나티드, 프람린티드, 이미글루세라제, 갈술파제, 류코트로핀, 몰그라모스팀, 트립토렐린 아세테이트, 히스트렐린 (피하 이식, 하이드론), 데슬로렐린, 히스트렐린, 나파렐린, 류프롤리드 지속 방출 데포(depot) (아트리겔), 류프롤리드 이식체 (듀로스), 고세렐린, 소마트로핀, 유트로핀, KP-102, 프로그램, 소마트로핀, 소마트로핀, 메카세르민 (성장 부전), 엔푸비르티드, Org-33408, 인슐린 글라르긴, 인슐린 글룰리신, 인슐린 (흡입용), 인슐린 리스프로, 인슐린 데테미르, 인슐린 (협측용, 라피드미스트), 메카세르민 린파베이트, 아나킨라, 셀모류킨, 99mTc-압시티드 주사, 미엘로피드, 베타세론, 글라티라머 아세테이트, 게폰, 사르그라모스팀, 오프렐베킨, 인간 백혈구-유래 알파 인터페론, 빌리브, 인슐린 (재조합), 재조합 인간 인슐린, 인슐린 아스파르트, 메카세르민, 로페론-A, 인터페론-알파 2, 알파페론, 인터페론 알파콘-1, 인터페론 알파, 아보넥스 재조합 인간 황체형성 호르몬, 도르나제 알파, 트라페르민, 지코노티드, 탈티렐린, 디보테르민 알파, 아토시반, 베카플레르민, 엡티피바티드, 제마이라, CTC-111, 샨박-B, HPV 백신 (4가), NOV-002, 옥트레오티드, 란레오티드, 안세스팀, 아갈시다제 베타, 아갈시다제 알파, 라로니다제, 프레자티드 구리 아세테이트 (국소용 겔), 라스뷰리카제, 라니비주맙, 악티뮨, PEG-인트론, 트리코민, 재조합 가정용 먼지 응애 알레르기 탈민감화 주사, 재조합 인간 부갑상선 호르몬 (PTH) 1-84 (sc, 골다공증), 에포에틴 델타, 유전자이전 항트롬빈 III, 그란디트로핀, 비트라제, 재조합 인슐린, 인터페론-알파 (경구용 로젠지), GEM-2 IS, 바프레오티드, 이두르술파제, 오마파트릴라트, 재조합 혈청 알부민, 세르톨리주맙 페골, 글루카르피다제, 인간 재조합 Cl 에스테라제 억제제 (혈관부종), 라노테플라제, 재조합 인간 성장 호르몬, 엔푸비르티드 (무-바늘 주사용, 바이오젝터 2000), VGV-I, 인터페론 (알파), 루시낙탄트, 아비프타딜 (흡입용, 폐 질환), 이카티반트, 에칼란티드, 오미가난, 아우로그라브, 펙시가난 아세테이트, ADI-PEG-20, LDI-200, 데가렐릭스, 신트레데킨 베수도톡스, FavId, MDX-1379, ISAtx-247, 리라글루티드, 테리파라티드 (골다공증), 티파코긴, AA-4500, T4N5 리포솜 로션, 카투막소맙, DWP-413, ART-123, 크리살린, 데스모테플라제, 아메디플라제, 코리폴리트로핀 알파, TH-9507, 테두글루티드, 디아미드, DWP-412, 성장 호르몬 (지속 방출 주사용), 재조합 G-CSF, 인슐린 (흡입용, AIR), 인슐린 (흡입용, 테크노스피어), 인슐린 (흡입용, AERx), RGN-303, DiaPep277, 인터페론 베타 (C형 간염 바이러스 감염 (HCV)), 인터페론 알파-n3 (경구용), 벨라타셉트, 경피 인슐린 패치, AMG-531, MBP-8298, 크세레셉트, 오페바칸, 에이즈박스, GV-1001, 림포스캔, 란피르나제, 리폭시산, 루수풀티드, MP52 (베타-트리칼슘포스페이트 비히클, 골 재생), 흑색종 백신, 시풀류셀-T, CTP-37, 인세기아, 비테스펜, 인간 트롬빈 (냉동, 외과적 출혈), 트롬빈, 트랜스MID, 알피메프라제, 퓨리카제, 테를리프레씬 (정맥내용, 간신 증후군), EUR-1008M, 재조합 FGF-I (주사가능, 혈관 질환), BDM-E, 로티가프티드, ETC-216, P-113, MBI-594AN, 듀라마이신 (흡입용, 낭성 섬유증), SCV-07, OPI-45, 엔도스타틴, 안지오스타틴, ABT-510, 보우만 버크 억제제 농축물, XMP-629, 99mTc-하이닉-아넥신 V, 카할랄리드 F, CTCE-9908, 테베렐릭스 (연장 방출), 오자렐릭스, 로미뎁신, BAY-50-4798, 인터류킨-4, PRX-321, 펩스칸, 이복타데킨, rh 락토페린, TRU-015, IL-21, ATN-161, 실렝기티드, 알부페론, 비파식스, IRX-2, 오메가 인터페론, PCK-3145, CAP-232, 파시레오티드, huN901-DM1, 난소암 면역치료 백신, SB-249553, 온코박스-CL, 온코박스-P, BLP-25, 서박스-16, 다중-에피토프 펩티드 흑색종 백신 (MART-I, gp100, 티로시나제), 네미피티드, rAAT (흡입용), rAAT (피부과용), CGRP (흡입용, 천식), 페그수네르셉트, 티모신 베타-4, 플리티뎁신, GTP-200, 라모플라닌, GRASPA, OBI-I, AC-100, 연어 칼시토닌 (경구용, 엘리겐), 칼시토닌 (경구용, 골다공증), 엑사모렐린, 카프로모렐린, 카르데바, 벨라페르민, 131I-TM-601, K-220, TP-10, 울라리티드, 데펠레스타트, 헤마티드, 크리살린 (국소용), rNAPc2, 재조합 인자 VIII (페길화 리포솜성), bFGF, 페길화 재조합 스태필로키나제 변이체, V-10153, 소놀리시스 프롤리세, 뉴로박스, CZEN-002, 섬 세포 신생 요법, rGLP-1, BIM-51077, LY-548806, 엑세나티드 (조절 방출, 메디소르브), AVE-0010, GA-GCB, 아보렐린, AOD-9604, 리나클로티드 아세테이트, CETi-I, 헤모스판, VAL (주사가능), 신속-작용 인슐린 (주사가능, 비아델), 비내 인슐린, 인슐린 (흡입용), 인슐린 (경구용, 엘리겐), 재조합 메티오닐 인간 렙틴, 피트라킨라 피하 주사 (습진), 피트라킨라 (흡입용 건조 분말, 천식), 멀티카인, RG-1068, MM-093, NBI-6024, AT-001, PI-0824, Org-39141, CpnlO (자가면역 질환/염증), 탈락토페린 (국소용), rEV-131 (안과용), rEV-131 (호흡기 질환), 경구용 재조합 인간 인슐린 (당뇨병), RPI-78M, 오프렐베킨 (경구용), CYT-99007 CTLA4-Ig, DTY-001, 발라테그라스트, 인터페론 알파-n3 (국소용), IRX-3, RDP-58, 타우페론, 담즙산 염 자극 리파제, 메리스파제, 알칼리성 포스파타제, EP-2104R, 멜라노탄-II, 브레멜라노티드, ATL-104, 재조합 인간 미세플라스민, AX-200, SEMAX, ACV-I, Xen-2174, CJC-1008, 디노르핀 A, SI-6603, LAB GHRH, AER-002, BGC-728, 말라리아 백신 (비로좀, PeviPRO), ALTU-135, 파르보바이러스 B 19 백신, 인플루엔자 백신 (재조합 뉴라미니다제), 말라리아/HBV 백신, 탄저병 백신, Vacc-5q, Vacc-4x, HIV 백신 (경구용), HPV 백신, Tat 톡소이드, YSPSL, CHS-13340, PTH(1-34) 리포솜 크림 (노바솜), 오스타볼린-C, PTH 유사체 (국소용, 건선), MBRI-93.02, MTB72F 백신 (결핵), MVA-Ag85 A 백신 (결핵), FAR-404, BA-210, 재조합 흑사병 F1V 백신, AG-702, OxSODrol, rBetVl, Der-pl/Der-p2/Der-p7 알레르기원-표적 백신 (먼지 응애 알레르기), PR1 펩티드 항원 (백혈병), 돌연변이 ras 백신, HPV-16 E7 지질펩티드 백신, 라비린틴 백신 (아데노암종), CML 백신, WTl-펩티드 백신 (암), IDD-5, CDX-110, 펜트리스, 노렐린, CytoFab, P-9808, VT-111, 이크로캅티드, 텔베르민 (피부과용, 당뇨병 족부 궤양), 루핀트리비르, 레티큘로스, rGRF, PlA, 알파-갈락토시다제 A, ACE-011, ALTU-140, CGX-1160, 안지오텐신 치료 백신, D-4F, ETC-642, APP-018, rhMBL, SCV-07 (경구용, 결핵), DRF-7295, ABT-828, ErbB2-특이적 면역독소 (항암), DT388IL-3, TST-10088, PRO-1762, 콤보톡스, 콜레시스토키닌-B/가스트린-수용체 결합 펩티드, l l lln-hEGF, AE-37, 트라스투주맙-DMl, 길항제 G, IL-12 (재조합), PM-02734, IMP-321, rhIGF-BP3, BLX-883, CUV-1647 (국소용), L-19 기재 방사성면역치료제 (암), Re-188-P-2045, AMG-386, DC/I540/KLH 백신 (암), VX-001, AVE-9633, AC-9301, NY-ESO-I 백신 (펩티드), NA17.A2 펩티드, 흑색종 백신 (맥동성 항원 치료제), 전립샘암 백신, CBP-501, 재조합 인간 락토페린 (건조안), FX-06, AP-214, WAP-8294A2 (주사가능), ACP-HIP, SUN-11031, 펩티드 YY [3-36] (비만, 비내), FGLL, 아타시셉트, BR3-Fc, BN-003, BA-058, 인간 부갑상선 호르몬 1-34 (비, 골다공증), F-18-CCR1, AT-1001 (복강 질환/당뇨병), JPD-003, PTH(7-34) 리포솜 크림 (노바솜), 듀라마이신 (안과용, 건조안), CAB-2, CTCE-0214, 글리코페길화 에리트로포이에틴, EPO-Fc, CNTO-528, AMG-114, JR-013, 인자 XIII, 아미노칸딘, PN-951, 716155, SUN-E7001, TH-0318, BAY-73-7977, 테베렐릭스 (즉시 방출), EP-51216, hGH (조절 방출, 바이오스피어), OGP-I, 시푸비르티드, TV-4710, ALG-889, Org-41259, rhCCIO, F-991, 티모펜틴 (폐 질환), r(m)CRP, 간선택성 인슐린, 수발린, L 19-IL-2 융합 단백질, 엘라핀, NMK-150, ALTU-139, EN-122004, rhTPO, 트롬보포이에틴 수용체 효능제 (저혈소판 장애), AL-108, AL-208, 신경 성장 인자 길항제 (통증), SLV-317, CGX-1007, INNO-105, 경구용 테리파라티드 (엘리겐), GEM-OS1, AC-162352, PRX-302, LFn-p24 융합 백신 (테라포어), EP-1043, S 폐렴 소아과 백신, 말라리아 백신, 네이쎄리아 메닝기티디스 군 B 백신, 신생아 군 B 스트렙토코쿠스 백신, 탄저병 백신, HCV 백신 (gpE1+gpE2+MF-59), 중이염 요법, HCV 백신 (코어 항원+이스코매트릭스), hPTH(1-34) (경피용, 비아덤), 768974, SYN-101, PGN-0052, 아비스큐민, BIM-23190, 결핵 백신, 다중-에피토프 티로시나제 펩티드, 암 백신, 엔카스팀, APC-8024, GI-5005, ACC-OOl, TTS-CD3, 혈관-표적 TNF (고형 종양), 데스모프레씬 (협측용 조절-방출), 오네르셉트, TP-9201.
다른 대표적인 실시양태에서, SABA는 하기에서 선택된 모이어티에 융합되나, 이에 제한되는 것은 아니다: FGF21 (섬유모세포 성장 인자 21), GLP-1 (글루카곤-유사 펩티드 1), 엑센딘 4, 인슐린, 인슐린 수용체 펩티드, GIP (글루코스-의존성 인슐린자극 폴리펩티드), 아디포넥틴, IL-1Ra (인터류킨 1 수용체 길항제), VIP (혈관활성 장 펩티드), PACAP (뇌하수체 아데닐레이트 시클라제-활성화 폴리펩티드), 렙틴, INGAP (섬 신생 관련 단백질), BMP-9 (골 형태형성 단백질-9), 아밀린, PYY3-36 (펩티드 YY3 -36), PP (췌장 폴리펩티드), IL-21 (인터류킨 21), 플렉타신, PRGN (프로그래뉼린), 아트스트린, IFN (인터페론), 아펠린 및 오스테오칼신 (OCN).
다른 대표적인 실시양태에서, SABA는 하나 이상의 추가적인 10Fn3 도메인에 융합된다. 예를 들면, SABA는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 추가적인 10Fn3 도메인에 융합될 수 있다. 추가적인 10Fn3 도메인은 동일하거나, 또는 혈청 알부민이 아닌 다른 상이한 표적에 결합될 수 있다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기의 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-Y 융합체를 제공한다: SABA-X1-Y 또는 Y-X1-SABA (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, Y는 본원에서 기술되는 바와 같은 치료 모이어티임).
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기의 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-Y 융합체를 제공한다: SABA-X1-Cys-X2-Y 또는 Y-X1-Cys-X2-SABA (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 임의의 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, Cys는 시스테인 잔기이며, X2는 화학적으로 유도되는 스페이서(spacer) (적합한 스페이서의 예는 표 1에 나타내었음)이고, Y는 본원에서 기술되는 바와 같은 치료 모이어티임). 대표적인 실시양태에서, 화학적으로 유도되는 스페이서는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같은 마이클 부가(Michael addition)에 의해 치료 모이어티를 SABA 폴리펩티드의 C-말단 Cys에 결합시키거나, 또는 SABA 폴리펩티드를 치료 모이어티의 C-말단 Cys에 결합시키는 데에 사용될 수 있는 말레이미드 모이어티를 포함한다.
다른 측면에서, SABA는 2종 이상의 치료 모이어티에 결합될 수 있다. 예를 들면, 2종의 모이어티가 다양한 배열로 SABA에 결합될 수 있는데, 예를 들자면, N-말단으로부터 C-말단의 융합 순서로, 하기와 같다: X-Y-SABA, X-SABA-Y, 또는 SABA-X-Y (식 중, X 및 Y는 2종의 상이한 치료 모이어티를 나타냄). 상기 2종의 상이한 치료 모이어티는 본원에서 개시되는 모이어티들 중 어느 것에서 선택될 수 있다.
1. FGF21
섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21)은 신호전달 단백질들 중 FGF 패밀리의 구성원이다. 이들 단백질은 세포 표면 티로신 키나제 패밀리의 구성원인 FGF 수용체에 결합하여 그것을 활성화시킴으로써 기능한다. FGF21은 전형적인 패밀리 구성원이 아닌데, 그것이 헤파린에 결합되지 않고, 대신 활성을 위한 보조-수용체로서 단일 통과 막횡단 단백질인 β-클로토를 필요로 하기 때문이다. 해당 수용체는 광범위한 조직 분포를 가지나, β-클로토 발현이 소정의 조직 (간, 지방 및 췌장)으로 제한되므로, FGF21에 대하여 표적 특이성을 부여하는 것은 β-클로토의 조직 선택성 발현이다. 시험관내 연구는 FGFR1c (FGFR1의 동형) 및 FGFR4가 각각 백색 지방 조직 및 간에서 바람직한 수용체임을 나타낸다.
FGF21은 대사 조절인자로 기능하기 때문에, FGF21의 조절장애는 다양한 대사 장애로 이어질 수 있다. FGF21은 3T3-L1 지방세포 및 1차 인간 지방세포 배양물에서 ERK 인산화 및 GLUT1 발현을 유도함으로써 글루코스 흡수를 증가시킨다. INS-1E 세포 및 단리된 섬(islet)에서, FGF21은 ERK 및 AKT 인산화를 유도한다. 간 세포주에서, FGF21은 통상적인 FGF 신호전달 (ERK 인산화)를 자극하고, 글루코스 생성을 감소시켰다. 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 본원에서 기술되는 SABA-FGF21 융합체는 다양한 대사 질환 및 장애를 치료 또는 예방하는 데에 사용될 수 있다.
일 측면에서, 본 출원은 혈청 알부민 결합성 10Fn3 (즉 SABA)에 융합된 FGF21, 및 해당 융합체 (본원에서는 일반적으로 FGF21-SABA 융합체로 지칭됨)의 용도를 제공한다. FGF21-SABA 융합체는 예를 들면 SABA-FGF21, FGF21-SABA, FGF21-SABA-FGF21 등을 포함하여, 다양한 배열을 갖는 융합체들을 지칭한다. 소정의 대표적인 구축물을 표 2에 나타내었다. 그러나, 본원에서 개시될 때의 FGF21에는 FGF21 변이체, 말단절단물, 및 FGF21의 기능적 활성을 유지하는 임의의 변형된 형태들이 포함된다는 것을 알아야 한다. 다시 말하자면, 본원에서 기술될 때의 FGF-21에는 변형된 형태가 FGF-21의 생물학적 활성을 유지한다는 전제하에, 단편은 물론, 소정 아미노산이 결실 또는 치환되어 있는 변이체, 그리고 하나 이상의 아미노산이 변형된 아미노산 또는 비-자연 발생 아미노산으로 변화되어 있는 변형체, 및 글리코실화물과 같은 변형체를 포함한 변형된 형태들 역시 포함된다.
예로써, 야생형 전체-길이 FGF21을 서열 117에 나타내었다. 표 2에 나타낸 모든 FGF21 변이체들은 서열 118에 제시되어 있는 코어 FGF21 서열을 포함한다. 서열 119-124 중 어느 하나에 제시되어 있는 것들과 같은 다양한 N-말단 서열들이 코어 FGF21 서열 (서열 118)의 N-말단에 첨가되면서도 기능적 활성을 유지할 수 있다. 또한, His6-태그가 N-말단에 첨가될 수 있다 (예컨대 서열 128-131). 코어 FGF21 서열에는 C-말단 세린이 결핍되어 있는데, 그것은 해당 활성에 영향을 주지 않으면서 코어 서열의 C-말단에 첨가되거나 첨가되지 않을 수 있다. 또한, FGF21 및 SABA 융합 분자는 FGF21의 기능적 활성에 영향을 주지 않으면서 FGF21-SABA 또는 SABA-FGF21 (본원에서 기술되는 바와 같으며 당업계에 알려져 있는 모든 임의의 말단 연장 및 링커 서열 포함)의 순서로 연결될 수 있다 (예컨대 실시예 B6 참조).
대표적인 실시양태에서, 본 출원은 FGF21 부분이 서열 117-118 또는 125-131의 서열, 또는 서열 117-118 또는 125-131 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, SABA-FGF21 융합체를 제공한다. 소정 실시양태에서, SABA-FGF21 융합체는 서열 132-174 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 132-174 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-FGF21 융합체를 제공한다: SABA-X1-FGF21 또는 FGF21-X1-SABA (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, FGF21은 본원에서 기술되는 바와 같은 FGF21 펩티드임).
2. 인슐린
또 다른 측면에서, 본 발명은 SABA 및 인슐린 융합 분자를 기술한다. 인슐린은 신체에서 에너지 및 글루코스 대사를 조절하는 호르몬이다. 상기 폴리펩티드는 췌장 β-섬 세포에 의해 혈액으로 분비되어, 간, 근육 및 지방 세포에 의한 혈액으로부터의 글루코스 흡수를 자극하며, 글리코겐생성 및 지질생성을 촉진한다. 인슐린 분비 및/또는 작용 중 임의 단계(들)에서의 기능장애는 산소 이용, 지방생성, 글리코겐생성, 지질생성, 글루코스 흡수, 단백질 합성, 열생성, 및 기초 대사율 유지의 조절장애를 포함한 여러 장애로 이어질 수 있다. 이와 같은 기능장애는 비제한적으로 고인슐린혈증, 인슐린 내성, 인슐린 결핍, 고혈당, 고지질혈증, 고케톤혈증, 당뇨병, 및 당뇨병성 신병증을 포함한 질환 및/또는 장애들을 초래한다. 따라서, 본원에서 기술되는 SABA-인슐린 융합 폴리펩티드는 이와 같은 질환 및/또는 장애에 걸린 대상체를 치료하는 데에 유용할 수 있다.
대표적인 실시양태에서, 본 발명에 적용될 수 있는 인슐린 모이어티에는 자연 발생 인슐린, 생합성 인슐린, 인슐린 유도체 및 유사체가 포함된다. 인슐린 유사체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 첨가 및/또는 제거된, 인간 인슐린 또는 동물 형태의 인슐린과 같은 자연-발생 인슐린 단백질의 유사체이다. 그와 같은 아미노산은 합성 또는 변형된 아미노산일 수 있다. 인슐린 유도체는 예를 들면 하나 이상 아미노산에 대한 하나 이상 특정 화학 기의 첨가에 의해 화학적으로 변형된, 자연-발생 인슐린 또는 인슐린 유사체 중 어느 하나의 유도체이다. 대표적인 인슐린 유사체들이 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 7,476,652에 기술되어 있다.
3. 인슐린 수용체 펩티드
일 측면에서, 본 발명은 SABA 및 인슐린 수용체 펩티드 융합 분자를 기술한다. 소정 실시양태에서, 인슐린 수용체 펩티드는 인슐린 수용체의 아미노산 687 내지 710 (KTDSQILKELEESSFRKTFEDYLH; 서열 175)을 포함한다. 인슐린 수용체는 호르몬인 인슐린에 의해 활성화되는 막횡단 수용체 티로신 키나제이다. 인슐린 수용체의 활성화는 신호전달 연속단계를 촉발하여, 최종적으로 글루코스 수송체의 세포 표면으로의 수송을 초래함으로써, 세포가 혈액으로부터 글루코스를 흡수할 수 있도록 한다. 글루코스의 흡수는 주로 지방세포 및 근육세포에서 이루어진다. 인슐린 수용체의 기능장애는 인슐린 불감증 또는 내성과 연관되며, 이는 종종 세포가 글루코스를 흡수할 수 없는 경우에 발생하는 당뇨병 유형 2 및 기타 합병증으로 이어진다. 인슐린 수용체 유전자의 돌연변이와 관련된 기타 장애에는 도나휴 증후군 및 랍슨-멘덴홀 증후군이 포함된다. 따라서, 본원에서 기술되는 SABA-인슐린 수용체 펩티드 융합체의 대표적인 용도에는 불충분한 세포 글루코스 흡수와 관련된 당뇨병 유형 2 또는 기타 장애, 도나휴 증후군 및 랍슨-멘덴홀 증후군과 같은 장애를 갖는 대상체의 치료가 포함될 수 있다.
4. BMP -9
소정 측면에서, 본 발명은 SABA 및 BMP-9 융합 분자를 기술한다. 다양한 BMP-9 조성물들이 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 5,661,007 및 6,287,816에 기술되어 있다. 골 형태형성 단백질 (BMP)은 TGF-β 패밀리의 성장 인자 및 시토카인에 속한다. BMP는 골 및 연골의 형성을 유도하며, 많은 다른 조직에서 형태형성 변화를 매개한다. BMP 신호전달은 배아 발생은 물론, 출생후 조직의 성장 및 유지에 필수적이다. 신호전달 경로는 척수 장애로부터 암 내지 역류-유도 식도염 등까지에 걸친 질환과도 연관되어 있다.
20종이 넘는 BMP들이 발견되었다. 이들 분자 중, BMP-9는 주로 비실질 간 세포에서 발현되며, 간세포의 증식 및 기능, 특히 간 글루코스 생성에 관련되어 있다. BMP-9는 또한 암 세포의 세포자멸사, 내피 세포에서의 신호전달, 골생성, 연골생성, 인지 등에서 다른 역할도 하는 것으로 보인다. 따라서, 본원에서 기술되는 SABA-BMP-9 융합 폴리펩티드는 예를 들면 간의 변성을 나타내는 다양한 유형의 상처 및 질환의 치료와 같은 다양한 질환 및 장애를 치료하는 데에는 물론, 골 및/또는 연골 결함, 치주 질환 및 다양한 암을 포함한 기타 질환 및/또는 장애의 치료에 유용할 수 있다.
5. 아밀린
일부 측면에서, 본 발명은 SABA 및 아밀린 융합 분자를 기술한다. 아밀린 (또는 섬 아밀로이드 폴리펩티드, IAPP)는 췌장 β-세포에 의해 분비되는 37개 아미노산의 소형 펩티드 호르몬이다. 아밀린은 인슐린과 동시에 분비되므로, 인슐린 분비, 글루코스 항상성, 위 배출(emptying), 및 뇌로의 포만 신호 전달의 조절에서 역할을 하는 것으로 여겨지고 있다. 아밀린은 췌장 β-세포의 세포자멸사 세포 사멸에 연관되어 있는 원섬유를 형성한다. 이와 같은 발견에 부합하여, 아밀린은 보통 당뇨병 유형 2에 걸려 있거나 신경내분비 종양인 인슐린종이 존재하는 환자의 췌장 섬에서 발견된다.
아밀린은 당뇨병에 걸린 환자를 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 아밀린 펩티드의 제조에 대해서는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 5,367,052에 기술되어 있다. 마찬가지로, U.S. 특허 번호 6,610,824 및 7,271,238 (그 전체가 본원에 참조로 포함됨)는 Asn, Ser 및/또는 Thr 잔기의 글리코실화에 의해 형성되며 저혈당증 이상을 치료 또는 예방하는 데에 사용될 수 있는 아밀린의 효능제 유사체에 대해 기술하고 있다. 따라서, 본원에서 기술되는 SABA-아밀린 융합 폴리펩티드는 예를 들면 저혈당증, 비만, 당뇨병, 섭식 장애, 인슐린-내성 증후군, 및 심혈관계 질환에 걸린 대상체의 치료에서 유용할 수 있다. SABA-아밀린 융합체의 제조에 대해서는 실시예에 기술되어 있다.
일 측면에서, 본 출원은 혈청 알부민 결합성 10Fn3 (즉 SABA)에 융합된 아밀린, 및 본원에서는 일반적으로 SABA-아밀린 융합체로 지칭되는 이와 같은 융합체의 용도를 제공한다. SABA-아밀린 융합체는 예를 들면 SABA-아밀린 및 아밀린-SABA를 포함한 다양한 배열을 갖는 융합체들을 지칭한다. 대표적인 실시양태에서, SABA-아밀린 융합체는 아밀린 펩티드의 C-말단이 자유로워서 카르복시 말단의 아미드화를 가능케 하도록 배열된다. 소정의 대표적인 SABA-아밀린 융합체 구축물을 표 2에 나타내었다. 그러나, 본원에서 개시될 때의 아밀린에는 아밀린의 기능적 활성을 유지하는 아밀린 변이체, 말단절단물, 및 임의의 변형된 형태들이 포함된다는 것을 알아야 한다. 다시 말하자면, 본원에서 기술될 때의 아밀린에는 변형된 형태가 아밀린의 생물학적 활성을 유지한다는 전제하에, 단편은 물론, 소정 아미노산이 결실 또는 치환되어 있는 변이체, 그리고 하나 이상의 아미노산이 변형 아미노산 또는 비-자연 발생 아미노산으로 변화되어 있는 변형체, 및 글리코실화물과 같은 변형체를 포함한 변형된 형태들 역시 포함된다. 대표적인 아밀린 서열을 표 2에 서열 296-303으로 나타내었다.
대표적인 실시양태에서, 본 출원은 아밀린 부분이 서열 296-303 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 296-303 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, SABA-아밀린 융합체를 제공한다. 소정 실시양태에서, SABA-아밀린 융합체는 서열 304-328 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 304-328 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-아밀린 융합체를 제공한다: SABA-X1-아밀린 (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, 아밀린은 본원에서 기술되는 바와 같은 아밀린 펩티드임). 바람직하게는, 아밀린 펩티드는 C-말단에서 아미드화된다. 아밀린 펩티드는 Cys1 ,7 또는 Cys2 ,7 디술피드 결합을 추가로 포함할 수 있다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-아밀린 융합체를 제공한다: SABA-X1-Cys-X2-아밀린 (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 임의의 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 215-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, Cys는 시스테인 잔기이며, X2는 화학적으로 유도되는 스페이서 (적합한 스페이서의 예는 표 1에 나타내었음)이고, 아밀린은 본원에서 기술되는 바와 같은 아밀린 펩티드임). 바람직하게는, 아밀린 펩티드는 C-말단에서 아미드화된다. 아밀린 펩티드는 Cys1 ,7 또는 Cys2 ,7 디술피드 결합을 추가로 포함할 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 화학적으로 유도되는 스페이서는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같은 마이클 부가에 의해 아밀린 펩티드를 SABA 폴리펩티드의 C-말단 Cys에 결합시키는 데에 사용될 수 있는 말레이미드 모이어티를 포함한다.
6. PYY 3 -36
다른 측면에서, 본 발명은 SABA 및 PYY 융합 분자를 기술한다. 펩티드 YY (PYY, 펩티드 티로신 티로신, 또는 췌장 펩티드 YY로도 알려져 있음)는 섭식에 반응하여 회장 및 결장의 세포에서 방출되는 36개-아미노산의 단백질이다. PYY는 췌장에서 분비되어, 예를 들면 인슐린과 같은 췌장 분비물의 억제를 통하여 에너지 항상성의 조절을 도움으로써, 증가된 혈중 글루코스 농도 및 섭식 감축 필요성의 신호전달을 초래한다. 전체-길이 형태 (1-36) 및 말단절단된 형태 (3-36)의 주요 2종 PYY 형태가 존재한다. 순환 PYY 면역반응성을 갖는 가장 보편적인 형태는 PYY3 -36이다. PYY3 -36은 PYY1 -36보다 Y2 수용체에 대하여 더 높은 친화성을 가진다. 또한, PYY13-36이 Y2 수용체에서 유사하게 높은 역가를 가짐으로써, 잔기 4-12는 해당 수용체에 있어서 중요하지 않음을 암시한다 (문헌 [K. McCrea, et al., 2-36[K4,RYYSA(19-23)]PP a novel Y5-receptor preferring ligand with strong stimulatory effect on food intake, Regul . Pept 87 1-3 (2000), pp. 47-58.]). 또한, PYY(22-36) 및 (25-36)의 구조를 기반으로 하는 더 짧은 PYY 단편 유사체도 다른 NPY 수용체 (Y1, Y4 및 Y5)를 능가하는 Y2 선택성을 나타내는 것으로 기술되어 있다. 예를 들면, 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 5,604,203, 및 6,046,167를 참조하라. PYY 펩티드 및 반응성 기에 커플링된 기능성 유도체들이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 7,601,691에 기술되어 있다.
PYY는 영양소 흡수, 세포 증식, 지질분해, 및 혈관수축을 포함한 수많은 생리적 활성에 연관되어 있다. 특히, PYY3 -36은 인간에서 식욕 및 음식물 섭취를 감소시키는 것으로 알려져 있다 (예를 들면 문헌 [Batterham et al., Nature 418:656-654, 2002] 참조). 따라서, 본원에서 기술되는 SABA-PYY 융합 폴리펩티드의 대표적인 용도에는 비만, 당뇨병, 섭식 장애, 인슐린-내성 증후군, 및 심혈관계 질환의 치료가 포함될 수 있다.
일 측면에서, 본 출원은 혈청 알부민 결합성 10Fn3 (즉 SABA)에 융합된 PYY, 및 본원에서 일반적으로 SABA-PYY 융합체로 지칭되는 해당 융합체의 용도를 제공한다. SABA-PYY 융합체는 예를 들면 SABA-PYY 및 PYY-SABA를 포함한 다양한 배열을 갖는 융합체를 지칭한다. 대표적인 실시양태에서, SABA-PYY 융합체는 PYY 펩티드의 C-말단이 자유로워서 카르복시 말단의 아미드화를 가능케 하도록 배열된다. 소정의 대표적인 SABA-PYY 융합체 구축물을 표 2에 나타내었다. 그러나, 본원에서 개시될 때의 PYY에는 PYY의 기능적 활성을 유지하는 PYY 변이체, 말단절단물, 및 임의의 변형된 형태들이 포함된다는 것을 알아야 한다. 다시 말하자면, 본원에서 기술될 때의 PYY에는 변형된 형태가 PYY의 생물학적 활성을 유지한다는 전제하에, 단편은 물론, 소정 아미노산이 결실 또는 치환되어 있는 변이체, 그리고 하나 이상의 아미노산이 변형 아미노산 또는 비-자연 발생 아미노산으로 변화되어 있는 변형체, 및 글리코실화물과 같은 변형체를 포함한 변형된 형태들 역시 포함된다. 대표적인 PYY 서열을 표 2에 서열 329-337 및 408-418로 나타내었다.
대표적인 실시양태에서, 본 출원은 PYY 부분이 서열 329-337 또는 408-418 중 어느 하나의 서열; 서열 329-337 또는 408-418 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열; 서열 329-333 또는 335-337 중 어느 하나의 잔기 3-36, 13-36, 21-36, 22-36, 24-36, 또는 25-36을 갖는 서열; 서열 329-333 또는 335-337 중 어느 하나의 잔기 3-36, 13-36, 21-36, 22-36, 24-36, 또는 25-36을 갖는 서열에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열; 또는 V31L 치환을 갖는 전기 서열들 중 어느 하나를 포함하는, SABA-PYY 융합체를 제공한다. 소정 실시양태에서, SABA-PYY 융합체는 서열 338-344 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 338-344 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-PYY 융합체를 제공한다: SABA-X1-PYY (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, PYY는 본원에서 기술되는 바와 같은 PYY 펩티드임). 바람직하게는, PYY 펩티드는 C-말단에서 아미드화된다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-PYY 융합체를 제공한다: SABA-X1-Cys-X2-PYY (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 임의의 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 215-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, Cys는 시스테인 잔기이며, X2는 화학적으로 유도되는 스페이서 (적합한 스페이서의 예는 표 1에 나타내었음)이고, PYY는 본원에서 기술되는 바와 같은 PYY 펩티드임). 바람직하게는, PYY 펩티드는 C-말단에서 아미드화된다. 대표적인 실시양태에서, 화학적으로 유도되는 스페이서는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같은 마이클 부가에 의해 PYY 펩티드를 SABA 폴리펩티드의 C-말단 Cys에 결합시키는 데에 사용될 수 있는 말레이미드 모이어티를 포함한다.
7. 췌장 폴리펩티드
일부 측면에서, 본 발명은 SABA 및 췌장 폴리펩티드 융합 분자를 기술한다. 췌장 폴리펩티드 (PP)는 뉴로펩티드 Y (NPY) 및 펩티드 YY (PYY)도 포함되는 췌장 폴리펩티드 호르몬 패밀리의 구성원이다. PP는 섭식, 운동, 및 공복에 반응하여 췌장 폴리펩티드 세포에 의해 방출되는 36개 아미노산의 단백질이다. PP는 췌장, 위장관로, 및 CNS에서 발견되며, 거기에서 담낭 수축, 췌장 분비, 장 운동성은 물론, 대사 기능 예컨대 글리코겐분해 및 지방산 수준의 감소에 영향을 준다. PP는 음식물 섭취, 에너지 대사, 및 시상하부 펩티드 및 위 그렐린의 발현과도 연관되어 있다. 또한, PP는 증가된 음식물 섭취와 관련된 이상에서 감소된다. PP는 또한 종양생성, 예컨대 췌장 펩티드 세포의 희귀 악성 종양과도 관련될 수 있다. PP는 예를 들면 간 글루코스 생성을 감소시키기 위하여 환자에게 투여될 수 있다 (U.S. 특허 번호 5,830,434). 본원에서 개시되는 SABA-PP 융합 폴리펩티드의 대표적인 용도에는 비만, 당뇨병, 섭식 장애, 인슐린-내성 증후군, 및 심혈관계 질환의 치료가 포함될 수 있다.
일 측면에서, 본 출원은 혈청 알부민 결합성 10Fn3 (즉 SABA)에 융합된 PP, 및 본원에서 일반적으로 SABA-PP 융합체로 지칭되는 해당 융합체의 용도를 제공한다. SABA-PP 융합체는 예를 들면 SABA-PP 및 PP-SABA를 포함한 다양한 배열을 갖는 융합체를 지칭한다. 대표적인 실시양태에서, SABA-PP 융합체는 PP 펩티드의 C-말단이 자유로워서 카르복시 말단의 아미드화를 가능케 하도록 배열된다. 소정의 대표적인 SABA-PP 융합체 구축물을 표 2에 나타내었다. 그러나, 본원에서 개시될 때의 PP에는 PP의 기능적 활성을 유지하는 PP 변이체, 말단절단물, 및 임의의 변형된 형태들이 포함된다는 것을 알아야 한다. 다시 말하자면, 본원에서 기술될 때의 PP에는 변형된 형태가 PP의 생물학적 활성을 유지한다는 전제하에, 단편은 물론, 소정 아미노산이 결실 또는 치환되어 있는 변이체, 그리고 하나 이상의 아미노산이 변형 아미노산 또는 비-자연 발생 아미노산으로 변화되어 있는 변형체, 및 글리코실화물과 같은 변형체를 포함한 변형된 형태들 역시 포함된다. 대표적인 PP 서열을 표 2에 서열 345-357로 나타내었다.
대표적인 실시양태에서, 본 출원은 PP 부분이 서열 345-357 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 345-357 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, SABA-PP 융합체를 제공한다. 소정 실시양태에서, SABA-PP 융합체는 서열 358-364 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 358-364 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-PP 융합체를 제공한다: SABA-X1-PP (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, PP는 본원에서 기술되는 바와 같은 PP 펩티드임). 바람직하게는, PP 펩티드는 C-말단에서 아미드화된다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-PP 융합체를 제공한다: SABA-X1-Cys-X2-PP (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 임의의 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 215-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, Cys는 시스테인 잔기이며, X2는 화학적으로 유도되는 스페이서 (적합한 스페이서의 예는 표 1에 나타내었음)이고, PP는 본원에서 기술되는 바와 같은 PP 펩티드임). 바람직하게는, PP 펩티드는 C-말단에서 아미드화된다. 대표적인 실시양태에서, 화학적으로 유도되는 스페이서는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같은 마이클 부가에 의해 PP 펩티드를 SABA 폴리펩티드의 C-말단 Cys에 결합시키는 데에 사용될 수 있는 말레이미드 모이어티를 포함한다.
8. 인터류킨 21 ( IL -21)
또 다른 측면에서, 본 발명은 SABA 및 IL-21 융합 분자를 기술한다. IL-21은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, 및 IL-15와 공통적인 수용체 γ-사슬을 공유하는 유형 I 시토카인이다. IL-21은 T 보조 세포, T 소포 세포 및 NK T 세포의 Th2 및 Th17 하위세트에서 상향-조절된 활성화 인간 CD4+ T 세포에서 발현된다. 상기 시토카인은 이러한 세포 유형 모두의 기능을 조절하는 데에 역할을 한다. B 세포 역시 IL-21에 의해 조절된다. 공동자극 신호와의 상호작용 및 B 세포의 발생 단계에 따라, IL-21은 마우스 및 인간 모두에서 증식, Ig-생산 혈장 세포로의 분화, 또는 세포자멸사를 유도할 수 있다. 단독으로, 또는 Th 세포-유도 시토카인과의 조합으로써, IL-21은 IgG, IgA, 또는 IgE 동형으로의 클래스 스위치 재조합을 조절할 수 있는데, 이는 B 세포의 이펙터 기능을 형성함에 있어서의 그의 중요한 역할을 표시해준다. 따라서, 면역 세포에 대한 그의 다중적인 효과를 통하여, IL-21은 정상적인 면역 반응의 많은 측면에서 역할을 한다.
면역 시스템의 조절인자와 같이, 면역 시스템의 상향-조절을 요하는 용도들 중에서도 특히, 단독 또는 다른 치료의 조합 중 어느 하나로써의 - 암 치료를 위한 면역자극제로서의 IL-21의 용도, 면역치료에 대한 보조제로서의 용도, 및 바이러스 치료제로서의 용도가 연구되어 왔다. 임상 및 전임상 모두에서 치료된 구체적인 암으로는 전이성 흑색종, 신장 세포 암종, 결장 암종, 췌장 암종, 유암종, 흉선종, 두부 및 경부 편평 세포 암종, 그리고 신경교종이 있다 (고찰을 위해서는, 문헌 [Sondergaard and Skak, Tissue Antigens, 74(6): 467-479, 2009] 참조). 또한, IL-21 상향-조절은 크론병 (CD), 궤양성 대장염, 주요 형태의 염증성 창자병 (IBD), 헬리코박터 파이로리-관련 위염, 복강병, 아토피 피부염 (AD), 전신성 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 및 건선을 포함한 다양한 인간 T 세포-매개 또는 T 세포-연관 염증성 병리와 연관되어 있다 (고찰을 위해서는, 문헌 [Monteleone et al, Trends Pharmacol Sci, 30(8), 441-7, 2009] 참조). 대표적인 IL-21 단백질들이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 6,307,024 및 7,473,765에 기술되어 있다.
본원에서 기술되는 SABA-IL21 융합 폴리펩티드의 대표적인 용도에는 소정 유형의 암, 바이러스-관련 질환은 물론, 크론병 (CD), 궤양성 대장염, 주요 형태의 염증성 창자병 (IBD), 헬리코박터 파이로리-관련 위염, 복강병, 아토피 피부염 (AD), 전신성 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 및 건선과 같은 다양한 T 세포-매개 또는 T 세포-연관 염증성 장애의 치료가 포함된다.
일 측면에서, 본 출원은 혈청 알부민 결합성 10Fn3 (즉 SABA)에 융합된 IL-21, 및 본원에서 일반적으로 SABA-IL21 융합체로 지칭되는 해당 융합체의 용도를 제공한다. SABA-IL21 융합체는 예를 들면 SABA-IL21 및 IL21-SABA를 포함한 다양한 배열을 갖는 융합체를 지칭한다. 소정의 대표적인 SABA-IL21 융합체 구축물을 표 2에 나타내었다. 그러나, 본원에서 개시될 때의 IL-21에는 IL-21의 기능적 활성을 유지하는 IL-21 변이체, 말단절단물, 및 임의의 변형된 형태들이 포함된다는 것을 알아야 한다. 다시 말하자면, 본원에서 기술될 때의 IL-21에는 변형된 형태가 IL-21의 생물학적 활성을 유지한다는 전제하에, 단편은 물론, 소정 아미노산이 결실 또는 치환되어 있는 변이체, 그리고 하나 이상의 아미노산이 변형 아미노산 또는 비-자연 발생 아미노산으로 변화되어 있는 변형체, 및 글리코실화물과 같은 변형체를 포함한 변형된 형태들 역시 포함된다. 대표적인 IL-21 서열을 표 2에 서열 286-287로 나타내었다.
대표적인 실시양태에서, 본 출원은 IL-21 부분이 서열 286-287 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 286-287 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, SABA-IL21 융합체를 제공한다. 소정 실시양태에서, SABA-IL21 융합체는 서열 290-295 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 290-295 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-IL21 융합체를 제공한다: SABA-X1-IL21 또는 IL21-X1-SABA (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, IL21은 본원에서 기술되는 바와 같은 IL-21 펩티드임).
9. 글루카곤-유사 펩티드 1 ( GLP -1)/ 엑센딘 -4
또 다른 측면에서, 본 발명은 SABA 및 GLP-1 융합 분자를 기술한다. 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1)은 영양소 섭취에 반응하여 장내분비(enteroendocrine) L 세포로부터 방출되는 30 또는 31개 아미노산 펩티드 (서열 226 및 227)이다. 이와 같은 호르몬은 다수의 기작에 의해 글루코스 항상성을 조절하고 항당뇨병 효과를 제공하는 작용을 할 수 있다. GLP-1 신호전달은 동물 모델에서 글루코스-의존성 인슐린 분비를 향상시키며, 글루코스-의존성 방식으로 글루카곤 분비를 억제하고, 위 배출을 지연시키며, 음식물 섭취 및 체중의 감소를 초래하고, 베타 세포 질량의 증가를 야기한다.
천연 GLP-1의 치료적 효용은 제한되는데, 도처에 존재하는 프로테아제인 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP-IV)에 의한 그의 빠른 분해로 인하여, 그것이 생체내에서 2분 미만의 반감기를 가지기 때문이다. DPP-IV는 우선적으로 두 번째 위치에 알라닌 또는 프롤린을 갖는 아미노 말단 디펩티드를 절단하므로, 반감기를 증가시키는 한 가지 전략은 활성 GLP-1에서 두 번째 아미노산 (위치 8)을 변경시킴으로써, 펩티드가 더 이상 DPP-IV 기질이 되지 않도록 하는 것이다. DPP-IV 내성 GLP-1 유사체를 생성시키기 위하여, 위치 8의 알라닌은 글리신, 세린, 트레오닌 또는 발린을 포함한 매우 다양한 자연 (또는 비자연) 아미노산으로 대체될 수 있다. 그러나, DPP-IV 내성 GLP-1 유사체는 여전히 비교적 짧은 약동학적 반감기를 갖는데, 그것이 신장 청소(renal clearance)를 통하여 제거되기 때문이다. 예를 들면, 그것이 신장에 의해 빠르게 청소되기 때문에, 인간 당뇨병 환자에서는, 강력하고 DPP-IV 내성인 GLP-1 수용체 효능제인 합성 엑센딘-4 (서열 228; 바이에타(Byetta)의 활성인 약제학적 성분)가 여전히 하루에 2회 투여되어야 한다.
장기-작용성 GLP-1 수용체 효능제를 생성시키기 위한 또 다른 접근법은 알부민 또는 트랜스페린과 같은 장기-생존 단백질과 동일한 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에서 DPP-IV 내성인 GLP-1 유사체를 발현시키는 것이었다. 한 가지 그와 같은 융합 단백질로써, 인간 혈청 알부민에 융합된 DPP-IV 내성 GLP-1 유사체인 알비글루티드(albiglutide)가 현재 단계 III 임상 시험에서 평가중이다. 보고된 모든 경우에서, 활성 융합 단백질은 융합 단백질의 아미노 말단에 DPP-IV 내성 GLP-1 수용체 효능제를 가졌으며; c-말단 융합체는 현저하게 덜 강력하였다.
대표적인 실시양태에서, SABA-GLP-1 융합 단백질은 N-말단으로부터 C-말단으로, 하기를 포함한다: DPP-IV 내성 GLP-1 수용체 효능제 (잠재적으로 GLP-1 또는 엑센딘-4 기반의 서열 포함), 링커, 및 SABA.
SABA-GLP-1 및 SABA-엑센딘 융합 폴리펩티드의 대표적인 용도에는 혈장 글루코스를 저하시키거나, 위 및/또는 장 운동성을 억제하고 위 및/또는 장 배출을 억제하거나, 또는 음식물 섭취를 억제함으로써 이익을 얻게 되는 당뇨병, 비만, 과민성 대장 증후군 및 기타 이상의 치료가 포함된다.
일 측면에서, 본 출원은 혈청 알부민 결합성 10Fn3 (즉 SABA)에 융합된 GLP-1 또는 엑센딘, 및 본원에서 일반적으로 SABA-GLP-1 또는 SABA-엑센딘 융합체로 지칭되는 해당 융합체의 용도를 제공한다. SABA-GLP-1 또는 SABA-엑센딘 융합체는 예를 들면 SABA-GLP-1, GLP-1-SABA, SABA-엑센딘 및 엑센딘-SABA를 포함한 다양한 배열을 갖는 융합체를 지칭한다. 소정의 대표적인 SABA-GLP-1 및 SABA-엑센딘 융합체 구축물을 표 2에 나타내었다. 그러나, 본원에서 개시될 때의 GLP-1 및 엑센딘에는 GLP-1 또는 엑센딘의 기능적 활성을 유지하는 GLP-1 및 엑센딘 변이체, 말단절단물, 및 임의의 변형된 형태들이 포함된다는 것을 알아야 한다. 다시 말하자면, 본원에서 기술될 때의 GLP-1 및 엑센딘에는 변형된 형태가 GLP-1 또는 엑센딘의 생물학적 활성을 유지한다는 전제하에, 단편은 물론, 소정 아미노산이 결실 또는 치환되어 있는 변이체, 그리고 하나 이상의 아미노산이 변형 아미노산 또는 비-자연 발생 아미노산으로 변화되어 있는 변형체, 및 글리코실화물과 같은 변형체를 포함한 변형된 형태들 역시 포함된다. 대표적인 GLP-1 서열을 표 2에 서열 226-227로 나타내었으며, 대표적인 엑센딘 서열을 표 2에 서열 228로 나타내었다.
대표적인 실시양태에서, 본 출원은 GLP-1 부분이 서열 226-227 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 226-227 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, SABA-GLP-1 융합체를 제공한다. 소정 실시양태에서, SABA-GLP-1 융합체는 서열 229-232 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 229-232 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-GLP-1 융합체를 제공한다: SABA-X1-GLP-1 또는 GLP-1-X1-SABA (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, GLP-1은 본원에서 기술되는 바와 같은 GLP-1 펩티드임).
대표적인 실시양태에서, 본 출원은 엑센딘 부분이 서열 228, 또는 서열 228과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, SABA-엑센딘 융합체를 제공한다. 소정 실시양태에서, SABA-엑센딘 융합체는 서열 233-236 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 233-236 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-엑센딘 융합체를 제공한다: SABA-X1-엑센딘 또는 엑센딘-X1-SABA (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, 엑센딘은 본원에서 기술되는 바와 같은 엑센딘 펩티드임).
10. 플렉타신
또 다른 측면에서, 본 발명은 SABA 및 플렉타신 융합 분자를 기술한다. 플렉타신은 진균인 부패성 자낭균류의 슈도플렉타니아 니그렐라( Pseudoplectania nigrella)로부터 단리되는 신규한 살박테리아성 항미생물 펩티드이다. 시험관 내에서, 플렉타신은 통상적인 항생제에 내성인 수많은 균주들을 포함하여, 스태필로코쿠스 아우레우스 ( Staphylococcus aureus ) 및 스트렙토코쿠스 뉴모 니아( Streptococcus pneumonia)를 포유동물 세포에 대한 세포독성 효과가 없으면서도 반코마이신 및 페니실린 모두에 필적할만한 속도로 빠르게 사멸시킬 수 있다. 생체 내에서도, 플렉타신은 마우스에서 극히 낮은 독성을 나타내며, S. 뉴모니아에(pneumoniae)에 의해 야기되는 복막염 및 폐렴을 반코마이신 및 페니실린만큼 효과적으로 치유할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Mygind PH, et al., Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus, Nature 437:975-980 (2005)]; [Brinch KS, et al., Plectasin shows intracellular activity against Staphylococcus aureus in human THP-1 monocytes and in the mouse peritonitis model, Antimicrob Agents Chemother 53:4801-4808 (2009)]; [3. Hara S, et al., Plectasin has antibacterial activity and no effect on cell viability or IL-8 production, Biochem Biophys Res Commun 374:709-713 (2008)]; 및 [Ostergaard C, et al., High cerebrospinal fluid (CSF) penetration and potent bactericidal activity in CSF of NZ2114, a novel plectasin variant, during experimental pneumococcal meningitis, Antimicrob Agents Chemother 53:1581-1585 (2009)]을 참조하라. 이와 같은 특징들로 볼 때, 플렉타신은 미래의 항생제 생성물로 사용하기 위한 매력적인 후보이다. 예를 들면, 문헌 [Xiao-Lan J, et al., High-Level Expression of the Antimicrobial Peptide Plectasin in Escherichia coli, Curr Microbiol 61:197-202 (2010)]을 참조하라. 따라서, 본원에서 기술되는 SABA-플렉타신 융합 폴리펩티드는 항박테리아제로서 사용될 수 있다.
일 측면에서, 본 출원은 혈청 알부민 결합성 10Fn3 (즉 SABA)에 융합된 플렉타신, 및 본원에서 일반적으로 SABA-플렉타신 융합체로 지칭되는 해당 융합체의 용도를 제공한다. SABA-플렉타신 융합체는 예를 들면 SABA-플렉타신 및 플렉타신-SABA를 포함한 다양한 배열을 갖는 융합체를 지칭한다. 소정의 대표적인 SABA-플렉타신 융합체 구축물을 표 2에 나타내었다. 그러나, 본원에서 개시될 때의 플렉타신에는 플렉타신의 기능적 활성을 유지하는 플렉타신 변이체, 말단절단물, 및 임의의 변형된 형태들이 포함된다는 것을 알아야 한다. 다시 말하자면, 본원에서 기술될 때의 플렉타신에는 변형된 형태가 플렉타신의 생물학적 활성을 유지한다는 전제하에, 단편은 물론, 소정 아미노산이 결실 또는 치환되어 있는 변이체, 그리고 하나 이상의 아미노산이 변형 아미노산 또는 비-자연 발생 아미노산으로 변화되어 있는 변형체, 및 글리코실화물과 같은 변형체를 포함한 변형된 형태들 역시 포함된다. 대표적인 플렉타신 서열을 표 2에 서열 237로 나타내었다.
대표적인 실시양태에서, 본 출원은 플렉타신 부분이 서열 237, 또는 서열 237에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, SABA-플렉타신 융합체를 제공한다. 소정 실시양태에서, SABA-플렉타신 융합체는 서열 238-239 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 238-239 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-플렉타신 융합체를 제공한다: SABA-X1-플렉타신 또는 플렉타신-X1-SABA (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, 플렉타신은 본원에서 기술되는 바와 같은 플렉타신 펩티드임).
11. 프로그래뉼린 ( PRGN ) 및 아트스트린
또 다른 측면에서, 본 발명은 SABA 및 프로그래뉼린, 또는 SABA 및 아트스트린 융합 분자를 기술한다. 프로그래뉼린, 및 프로그래뉼린으로부터의 3개 단편을 포함하는 조작된 단백질인 아트스트린은 종양 괴사 인자 (TNF) 신호전달을 길항하는 TNF 수용체 바인더이다. 프로그래뉼린 및 아트스트린은 마우스 관절염 모델에서 염증을 예방한다. 예를 들면 문헌 [Tang, W. et. al., The Growth Factor Progranulin Binds to TNF Receptors and Is Therapeutic Against Inflammatory Arthritis in Mice, Science, ScienceExpress, March 10, 2011, Supplementary Material]을 참조하라. 양 단백질의 SABA 융합체는 TNFα-매개 질환을 위한 잠재적인 치료제일 수 있다.
일 측면에서, 본 출원은 혈청 알부민 결합성 10Fn3 (즉 SABA)에 융합된 프로그래뉼린 또는 아트스트린, 및 본원에서 일반적으로 SABA-PRGN 또는 SABA-아트스트린 융합체로 지칭되는 해당 융합체의 용도를 제공한다. SABA-PRGN 또는 SABA-아트스트린 융합체는 예를 들면 SABA-PRGN, PRGN-SABA, SABA-아트스트린 및 아트스트린-SABA를 포함한 다양한 배열을 갖는 융합체를 지칭한다. 소정의 대표적인 SABA-PRGN 및 SABA-아트스트린 융합체 구축물을 표 2에 나타내었다. 그러나, 본원에서 개시될 때의 프로그래뉼린 및 아트스트린에는 프로그래뉼린 또는 아트스트린의 기능적 활성을 유지하는 프로그래뉼린 및 아트스트린 변이체, 말단절단물, 및 임의의 변형된 형태들이 포함된다는 것을 알아야 한다. 다시 말하자면, 본원에서 기술될 때의 프로그래뉼린 및 아트스트린에는 변형된 형태가 프로그래뉼린 또는 아트스트린의 생물학적 활성을 유지한다는 전제하에, 단편은 물론, 소정 아미노산이 결실 또는 치환되어 있는 변이체, 그리고 하나 이상의 아미노산이 변형 아미노산 또는 비-자연 발생 아미노산으로 변화되어 있는 변형체, 및 글리코실화물과 같은 변형체를 포함한 변형된 형태들 역시 포함된다. 대표적인 프로그래뉼린 서열을 표 2에 서열 240-241로 나타내었으며, 대표적인 아트스트린 서열을 표 2에 서열 242로 나타내었다.
대표적인 실시양태에서, 본 출원은 PRGN 부분이 서열 240-241 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 240-241 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, SABA-PRGN 융합체를 제공한다. 소정 실시양태에서, SABA-PRGN 융합체는 서열 243-246 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 243-246 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-PRGN 융합체를 제공한다: SABA-X1-PRGN 또는 PRGN-X1-SABA (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, PRGN은 본원에서 기술되는 바와 같은 프로그래뉼린 펩티드임).
대표적인 실시양태에서, 본 출원은 아트스트린 부분이 서열 242, 또는 서열 242에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, SABA-아트스트린 융합체를 제공한다. 소정 실시양태에서, SABA-아트스트린 융합체는 서열 247-250 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 247-250 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-아트스트린 융합체를 제공한다: SABA-X1-아트스트린 또는 아트스트린-X1-SABA (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, 아트스트린은 본원에서 기술되는 바와 같은 아트스트린 펩티드임).
12. 오스테오칼신 ( OCN )
소정 측면에서, 본 발명은 SABA 및 오스테오칼신 융합 분자를 기술한다. 오스테오칼신 (OCN, 골 Gla 단백질 또는 BGP로도 알려져 있음)은 골모세포에 의해 생성되어 혈류 및 골 기질로 분비되는 49개 아미노산의 단백질이다. 혈장 OCN 수준은 일일 주기, 계절, 성, 연령 및 월경 주기를 포함한 생물학적 변이들에 의해 좌우된다. OCN은 카르복실화, 비카르복실화 및 저카르복실화 형태로 존재하는데, 비카르복실화 및 저카르복실화 형태는 인슐린 분비를 자극하는 것을 통한 에너지 대사의 조절, 췌장 β-세포 증식, 및 부분적으로 아디포넥틴을 통하여 매개되는 인슐린 민감성의 향상과 연관되어 있다. 인슐린은 골 재형성을 촉진하며, 골모세포에서의 그의 신호전달은 순환계로의 비카르복실화 및/또는 저카르복실화 OCN의 방출을 증가시키고, 그것은 다시 글루코스 조작을 개선한다. 따라서, 본원에서 기술되는 SABA-OCN 융합 폴리펩티드는 산소 이용, 지방생성, 글리코겐생성, 지질생성, 글루코스 흡수, 단백질 합성, 열생성, 및 기초 대사율 유지의 조절장애를 포함한 인슐린 관련 장애들의 치료에 사용될 수 있다. 이와 같은 기능장애는 비제한적으로 고인슐린혈증, 인슐린 내성, 인슐린 결핍, 고혈당, 고지질혈증, 고케톤혈증, 당뇨병, 및 당뇨병성 신병증을 포함한 질환 및/또는 장애들을 초래한다.
일 측면에서, 본 출원은 혈청 알부민 결합성 10Fn3 (즉 SABA)에 융합된 OCN, 및 본원에서 일반적으로 SABA-OCN 융합체로 지칭되는 해당 융합체의 용도를 제공한다. SABA-OCN 융합체는 예를 들면 SABA-OCN 및 OCN-SABA를 포함한 다양한 배열을 갖는 융합체를 지칭한다. 소정의 대표적인 SABA-OCN 융합체 구축물을 표 2에 나타내었다. 그러나, 본원에서 개시될 때의 OCN에는 OCN의 기능적 활성을 유지하는 OCN 변이체, 말단절단물, 및 임의의 변형된 형태들이 포함된다는 것을 알아야 한다. 다시 말하자면, 본원에서 기술될 때의 OCN에는 변형된 형태가 OCN의 생물학적 활성을 유지한다는 전제하에, 단편은 물론, 소정 아미노산이 결실 또는 치환되어 있는 변이체, 그리고 하나 이상의 아미노산이 변형 아미노산 또는 비-자연 발생 아미노산으로 변화되어 있는 변형체, 및 글리코실화물과 같은 변형체를 포함한 변형된 형태들 역시 포함된다. 대표적인 OCN 서열을 표 2에 서열 365-378로 나타내었다.
대표적인 실시양태에서, 본 출원은 OCN 부분이 서열 365-378 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 365-378 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, SABA-OCN 융합체를 제공한다. 소정 실시양태에서, SABA-OCN 융합체는 서열 379-396 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 379-396 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-OCN 융합체를 제공한다: SABA-X1-OCN 또는 OCN-X1-SABA (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, OCN은 본원에서 기술되는 바와 같은 OCN 펩티드임).
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기의 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-OCN 융합체를 제공한다: SABA-X1-Cys-X2-OCN 또는 OCN-X1-Cys-X2-SABA (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 임의의 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, Cys는 시스테인 잔기이며, X2는 화학적으로 유도되는 스페이서 (적합한 스페이서의 예는 표 1에 나타내었음)이고, OCN은 본원에서 기술되는 바와 같은 OCN 펩티드임). 대표적인 실시양태에서, 화학적으로 유도되는 스페이서는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같은 마이클 부가에 의해 OCN 펩티드를 SABA 폴리펩티드의 C-말단 Cys에 결합시키거나, 또는 SABA 폴리펩티드를 OCN 펩티드의 C-말단 Cys에 결합시키는 데에 사용될 수 있는 말레이미드 모이어티를 포함한다.
13. 인터페론 람다 ( IFN λ)
또 다른 측면에서, 본 발명은 SABA 및 인터페론-람다 (IFNλ) 융합 분자를 기술한다. 인간 인터페론 (IFN)은 하기 3종의 주요 유형으로 분류된다: 유형 I, 유형 II 및 유형 III. 유형 I IFN은 바이러스 감염에 대한 1차 방어선으로 발현된다. 유형 I IFN의 주요 역할은 바이러스 감염의 처음 며칠 동안 바이러스 확산을 제한함으로써, 감염에 대한 강한 적응성 면역 반응의 발생을 위한 충분한 시간을 허용하는 것이다. 유형 II 및 유형 III IFN은 유형 I IFN의 항바이러스 특성 중 일부를 나타낸다.
IFN-λ는 유형 III IFN이다. 인간은 하기 3종의 IFN-λ 분자를 코딩하고 있다: IFN-λ1 (IL-29), IFN-λ2 (IL-28A) 및 IFN-λ3 (IL-28B). US 7,135,170에 기술되어 있는 바와 같이, IL-28 및 IL-29는 간염 바이러스 감염의 치료에 유용한 것으로 밝혀진 바 있다. 중요하게도, IL-28 및 IL-29는 이전에 알려져 있던 다른 IFN 요법의 사용시 연관되던 일부 독성 없이도 이러한 항바이러스 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 유형 I IFN 요법과 관련된 독성들 중 한 갖는 골수억제(myelosuppression)이다. 이는 골수 전구 세포의 유형 I IFN 억제로 인한 것이다. IL-29는 유형 I IFN 치료시 보이는 것과 같이 골수 세포 팽창 또는 B 세포 증식을 상당히 억제하지는 않기 때문에, IL-29는 치료와 연관된 독성을 덜 가지게 된다. IL-28A 및 IL-28B로도 유사한 결과가 기대될 수 있다.
따라서, 본원에서 기술되는 SABA-IFN-λ 융합 폴리펩티드의 대표적인 용도에는 예를 들면 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 및 D형 간염과 같은 바이러스 감염을 포함한 바이러스 감염에 걸린 대상체의 치료가 포함된다. 본원에서 기술되는 SABA-IFN-λ 융합 폴리펩티드는 호흡기 세포융합 바이러스, 헤르페스 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 리노 바이러스, 콕사키 바이러스, 우두 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스, 피친데 바이러스 및 폴리오 바이러스와 연관된 바이러스 감염을 치료하기 위한 항바이러스제로도 사용될 수 있다. 본원에서 기술되는 SABA-IFN-λ 융합 폴리펩티드는 만성 또는 급성 바이러스 감염 중 어느 하나를 갖는 대상체를 치료하는 데에 사용될 수 있다.
소정 실시양태에서, 본원에서 기술되는 SABA-IFNλ 융합체는 예를 들면 PEG와 같은 다른 약동학적 요소에 융합된 IFNλ 폴리펩티드에 비해 이점을 제공할 수 있다. 특히, 본원에서 제공되는 SABA-IFNλ 융합체는 PEG-IFNλ 접합체에 비해 IFNλ 분자의 혈청 반감기에 있어서 상당한 향상을 제공할 수 있다. 그와 같은 반감기의 증가는 감소된 빈도로 요법을 투여하는 것을 가능케 할 수 있는데, 예를 들면, SABA-IFNλ 융합체는 PEG-IFNλ 접합체와 같은 다른 IFNλ 치료제에서의 주당 1회 투여와 같은 더 빈번한 투여와 비교할 때, 1개월당 1회의 투여를 가능케 할 수 있다.
일 측면에서, 본 출원은 혈청 알부민 결합성 10Fn3 (즉 SABA)에 융합된 IFNλ, 및 본원에서 일반적으로 SABA-IFNλ 융합체로 지칭되는 해당 융합체의 용도를 제공한다. SABA-IFNλ 융합체는 예를 들면 SABA-IFNλ 및 IFNλ-SABA를 포함한 다양한 배열을 갖는 융합체를 지칭한다. 소정의 대표적인 SABA-IFNλ 융합체 구축물을 표 2에 나타내었다. 그러나, 본원에서 개시될 때의 IFNλ에는 IFNλ의 기능적 활성을 유지하는 IFNλ 변이체, 말단절단물, 및 임의의 변형된 형태들이 포함된다는 것을 알아야 한다. 다시 말하자면, 본원에서 기술될 때의 IFNλ에는 변형된 형태가 IFNλ의 생물학적 활성을 유지한다는 전제하에, 단편은 물론, 소정 아미노산이 결실 또는 치환되어 있는 변이체, 그리고 하나 이상의 아미노산이 변형 아미노산 또는 비-자연 발생 아미노산으로 변화되어 있는 변형체, 및 글리코실화물과 같은 변형체를 포함한 변형된 형태들 역시 포함된다. 대표적인 IFNλ 서열을 표 2에 서열 251-257로 나타내었다.
대표적인 실시양태에서, 본 출원은 IFNλ 부분이 서열 251-257 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 251-257 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, SABA-IFNλ 융합체를 제공한다. 소정 실시양태에서, SABA-IFNλ 융합체는 서열 258-285 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 258-285 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-IFNλ 융합체를 제공한다: SABA-X1-IFNλ 또는 IFNλ-X1-SABA (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, IFNλ는 본원에서 기술되는 바와 같은 IFNλ 펩티드임).
14. 아펠린
또 다른 측면에서, 본 출원은 SABA 및 아펠린 융합 분자를 제공한다. 아펠린은 G-단백질 커플링 수용체인 APJ에 대한 내생 리간드이다. 아펠린 유전자는 더 짧은 활성 단편들로 절단되는 77개 아미노산의 프리프로단백질(preproprotein)을 코딩하고 있다. 성숙한 전체-길이 펩티드는 아펠린-36이지만, 아펠린-17 및 아펠린-13 역시 활성이다 (문헌 [M Kleinz, et al., Pharmacol. Ther. 107:198-211 (2005)]). 아펠린은 중추 신경계 및 말초 조직에서 광범위하게 발현되며, 세포 발현에는 내피 세포 및 지방세포 (전기함)가 포함된다. 아펠린은 혈관확장을 야기하고, 심부전에 걸린 환자의 혈류역학 및 심장 프로필(cardiac profile)을 개선함은 물론, 전임상 모델에서 아테롬성동맥경화증을 예방하는 것으로 밝혀진 바 있다 (문헌 [AG Japp, et al., Circ. 121: 1818-1827 (2010)]; 및 [HY Chun, et al., J. Clin. Invest. 118: 3343-3354 (2008)]). 또한, 아펠린 투여는 당뇨병의 전임상 모델에서 인슐린 민감성의 개선과 연관된다 (문헌 [C Dray, et al., Cell Metabolism 8: 437-445 (2008)]). 따라서, 본원에서 기술되는 SABA-아펠린 융합 폴리펩티드의 대표적인 용도에는 당뇨병, 비만, 섭식 장애, 인슐린-내성 증후군 및 심혈관계 질환 (예컨대 심부전, 아테롬성동맥경화증, 및 고혈압)의 치료가 포함될 수 있다.
일 측면에서, 본 출원은 혈청 알부민 결합성 10Fn3 (즉 SABA)에 융합된 아펠린, 및 본원에서 일반적으로 SABA-APLN 융합체로 지칭되는 해당 융합체의 용도를 제공한다. SABA-APLN 융합체는 예를 들면 SABA-APLN 및 APLN-SABA를 포함한 다양한 배열을 갖는 융합체를 지칭한다. 소정의 대표적인 SABA-APLN 융합체 구축물을 표 2에 나타내었다. 그러나, 본원에서 개시될 때의 아펠린에는 아펠린의 기능적 활성을 유지하는 아펠린 변이체, 말단절단물, 및 임의의 변형된 형태들이 포함된다는 것을 알아야 한다. 다시 말하자면, 본원에서 기술될 때의 아펠린에는 변형된 형태가 아펠린의 생물학적 활성을 유지한다는 전제하에, 단편은 물론, 소정 아미노산이 결실 또는 치환되어 있는 변이체, 그리고 하나 이상의 아미노산이 변형 아미노산 또는 비-자연 발생 아미노산으로 변화되어 있는 변형체, 및 글리코실화물과 같은 변형체를 포함한 변형된 형태들 역시 포함된다. 대표적인 아펠린 서열을 표 2에 서열 419-423으로 나타내었다.
대표적인 실시양태에서, 본 출원은 아펠린 부분이 서열 419-423 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 419-423 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, SABA-APLN 융합체를 제공한다. 소정 실시양태에서, SABA-APLN 융합체는 서열 424-430 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 424-430 중 어느 하나에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 SABA-APLN 융합체를 제공한다: SABA-X1-APLN 또는 APLN-X1-SABA (식 중, SABA는 본원에서 기술되는 바와 같은 SABA 폴리펩티드 (임의의 N-말단 및/또는 C-말단 연장체 포함)이며, X1은 폴리펩티드 링커 (적합한 링커에는 예를 들면 서열 65-88, 216-221 또는 397 중 어느 하나가 포함됨)이고, APLN은 본원에서 기술되는 바와 같은 APLN 펩티드임).
15. 기타 애드넥틴 ™
소정 측면에서, 본 출원은 혈청 알부민 (예컨대 HSA)이 아닌 다른 표적 분자에 결합되는 10Fn3 도메인에 융합됨으로써 SABA-10Fn3 또는 10Fn3-SABA 배열구조의 애드넥틴™ 이량체 융합 분자를 초래하는 SABA를 제공한다. 다른 측면에서, 본 출원은 2개 이상의 10Fn3 도메인에 융합됨으로써 다량체를 형성하는 SABA를 제공한다. 예를 들면, 일 실시양태에서, 본 출원은 2개의 10Fn3 도메인인 10Fn3a 및 10Fn3b에 융합되며, 여기서 10Fn3a 및 10Fn3b 각각은 상이한 표적 분자에 결합되고, 어느 것도 혈청 알부민 (예컨대 HSA)에는 결합되지 않는 것인, SABA를 제공한다. 생성되는 애드넥틴™ 삼량체의 배열구조는 하기일 수 있다: SABA-10Fn3a-10Fn3b, 10Fn3a-SABA-10Fn3b, 또는 10Fn3a-10Fn3b-SABA.
대표적인 실시양태에서, SABA는 서열 1-3 중 어느 하나, 또는 서열 1-3 중 어느 하나에 대해 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하며, BC, DE 및 FG 루프가 각각 야생형 BC, DE 및 FG 루프 서열 대비 변형되어 있고, 500 μM 미만의 KD로 표적 (인테그린이 아닌 다른 것)에 결합되는 10Fn3 도메인에 융합된다. 상기 10Fn3 도메인은 본원에서 기술되는 바와 같은 N-말단 및/또는 C-말단 연장체를 추가로 포함할 수 있다. 소정 실시양태에서, 상기 10Fn3 도메인은 본원에서 기술되는 바와 같은 치료 모이어티인 표적에 결합된다. 대표적인 실시양태의 경우, 하나의 추가적인 10Fn3 도메인을 포함하는 융합체에서, 10Fn3 도메인은 VEGFR2, TNFα, IGF1R, 또는 EGFR에 결합된다. 대표적인 실시양태의 경우, 2개의 추가적인 10Fn3 도메인을 포함하는 융합체에서, 10Fn3 도메인은 VEGFR2 및 IGF1R, 또는 EGFR 및 IGF1R에 결합된다.
접합/링커
SABA 융합체는 공유 또는 비-공유로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청 알부민 결합성 10Fn3은 직접적으로, 또는 폴리펩티드 링커를 통하여 간접적으로 이종성 분자에 연결될 수 있다. 해당 단백질에 SABA를 연결하기 위한 적합한 링커는 별도의 도메인들이 서로 독립적으로 접힘으로써, 융합 단백질 중 어떠한 구성원의 기능성도 붕괴시키지 않는 3차원 구조를 형성하도록 해주는 것들이다. 대표적인 링커들이 표 2에 서열 65-88, 216-221 및 397로 제공되어 있다.
본 개시는 글리신-세린 기재 링커, 글리신-프롤린 기재 링커는 물론, PSTSTST (서열 85)의 아미노산 서열을 갖는 링커를 포함한 수많은 적합한 링커들을 제공한다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신-세린 기재의 링커이다. 이러한 링커는 글리신 및 세린 잔기를 포함하며, 길이가 8 내지 50, 10 내지 30, 및 10 내지 20개 아미노산 사이일 수 있다. 그 예에는 (GS)7 (서열 72), G(GS)6 (서열 67), 및 G(GS)7G (서열 69)의 아미노산 서열을 갖는 링커들이 포함된다. 다른 링커는 글루탐산을 포함하는데, 거기에는 예를 들면 (GSE)5 (서열 74) 및 GGSE GGSE (서열 78)이 포함된다. 다른 대표적인 글리신-세린 링커에는 (GS)4 (서열 71), (GGGGS)7 (서열 80), (GGGGS)5 (서열 81), 및 (GGGGS)3G (서열 82)가 포함된다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신-프롤린 기재 링커이다. 이러한 링커는 글리신 및 프롤린 잔기를 포함하며, 길이가 3 내지 30, 10 내지 30, 및 3 내지 20개 아미노산 사이일 수 있다. 그 예에는 (GP)3G (서열 83), (GP)5G (서열 84), 및 GPG의 아미노산 서열을 갖는 링커가 포함된다. 다른 실시양태에서, 링커는 3 내지 30, 10 내지 30, 및 3 내지 20개 아미노산 사이의 길이를 갖는 프롤린-알라닌 기재의 링커일 수 있다. 프롤린 알라닌 기재 링커의 예에는 예를 들면 (PA)3 (서열 86), (PA)6 (서열 87) 및 (PA)9 (서열 88)이 포함된다. 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의한 일상적인 실험에 의해 최적의 링커 길이 및 아미노산 조성이 결정될 수 있을 것으로 생각된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 융합체는 혈액 또는 표적 조직에서 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 부위를 갖는 폴리펩티드 링커를 통하여 SABA에 연결된다. 그와 같은 실시양태는 더 우수한 전달 또는 치료 특성, 또는 더 효율적인 생성을 위하여 치료 단백질을 방출하는 데에 사용될 수 있다.
추가적인 링커 또는 스페이서가 Fn3 도메인 C-말단의 Fn3 도메인과 폴리펩티드 링커 사이에 도입될 수 있다. 추가적인 링커 또는 스페이서는 Fn3 도메인 N-말단의 Fn3 도메인과 폴리펩티드 링커 사이에 도입될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 치료 모이어티는 직접적으로, 또는 중합체 링커를 통하여 간접적으로 SABA에 연결될 수 있다. 중합체 링커는 하기의 특징들 중 하나 이상을 갖는 단백질 융합체를 생성시키기 위하여 융합체 각 성분 사이의 거리를 최적으로 변화시키는 데에 사용될 수 있다: 1) 해당 단백질에 결합될 때, 하나 이상 단백질 도메인 결합의 감소 또는 증가된 입체 장애, 2) 증가된 단백질 안정성 또는 용해도, 3) 감소된 단백질 응집, 및 4) 증가된 단백질의 전체적 친화력 또는 친화성.
일부 실시양태에서, 치료 모이어티는 중합체성 당과 같은 생체적합성 중합체를 통하여 SABA에 연결된다. 중합체성 당은 혈액 또는 표적 조직에서 효소에 의해 절단될 수 있는 효소 절단 부위를 포함할 수 있다. 그와 같은 실시양태는 더 우수한 전달 또는 치료 특성, 또는 더 효율적인 생성을 위하여 치료 단백질을 방출하는 데에 사용될 수 있다.
SABA -뉴로펩티드 융합체
소정 실시양태에서, 본 출원은 SABA-뉴로펩티드 융합체를 제공한다. 대표적인 뉴로펩티드에는 예를 들면 아밀린, PYY 및 PP가 포함된다. SABA-뉴로펩티드 융합체는 폴리펩티드 융합체로서, 또는 화학적으로 유도된 스페이서를 통하여 연결되는 접합체로서 구성될 수 있다. 일 실시양태에서, SABA-뉴로펩티드 융합체는 SABA, 아미노산 링커, 및 뉴로펩티드를 포함하는 폴리펩티드 융합체이다. 많은 뉴로펩티드들이 C-말단에서 아미드화되어 있기 때문에, 융합 단백질의 대표적인 배열은 N-말단으로부터 C-말단으로 SABA, 아미노산 링커, 및 뉴로펩티드이다. 또 다른 실시양태에서, SABA-뉴로펩티드 융합체는 화학적으로 유도되며 SABA를 뉴로펩티드에 연결시키는 스페이서를 포함한다. SABA-뉴로펩티드 접합체의 대표적인 배열은 하기와 같다: (1) SABA-Cys-화학적으로 유도된 스페이서-뉴로펩티드, 또는 (2) SABA-아미노산 링커-Cys-화학적으로 유도된 스페이서-뉴로펩티드. SABA-뉴로펩티드 융합체는 숙주 세포, 예컨대 본원에서 추가로 기술되는 바와 같은 미생물 또는 포유동물 세포에서 생산될 수 있다. 화학적으로 유도되는 스페이서에 의해 연결되는 SABA-뉴로펩티드 융합체의 펩티드 성분은 숙주 세포 또는 화학적 합성 중 어느 하나, 또는 이들의 조합에 의해 생산될 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 화학적으로 유도되는 스페이서에 의해 연결되는 SABA-뉴로펩티드 융합체는 숙주 세포 (예컨대 이. 콜라이)에서 생산된 SABA 및 화학적 합성에 의해 생산된 뉴로펩티드로부터 조립된다. SABA-뉴로펩티드 융합체 생산에 대한 추가적인 세부사항은 하기 및 실시예에 기술되어 있다.
많은 뉴로펩티드들이 그의 생물학적 활성에 있어서 중요한 C-말단 α-아미드 기를 포함한다. 예를 들면, 아밀린, PYY 및 PP 펩티드 모두가 C-말단 아미드화를 가지고 있다. 포유동물 세포에서, α-아미드화는 펩티딜-글리신 기질의 α-아미드화 생성물로의 전환을 촉매촉진하는 2기능성 효소인 펩티딜 글리신 α-아미드화 모노옥시제나제 (PAM)에 의해 처리될 수 있다.
C-말단 아미드화 펩티드를 생성시키기 위한 다양한 기술들이 존재한다. 예를 들면, 시험관 내에서 정제된 PAM 효소에 의해 펩티드 전구체 (C-말단 -글리신 또는 -글리신-리신-아르기닌 또는 기타 연장체를 가짐)가 처리될 수 있다. PAM, 및 C-말단 아미드화 펩티드를 생성시키기 위한 PAM의 사용 방법에 대해서는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들면, US 4,708,934, US 5,789,234 및 US 6,319,685를 참조하라. 내인성 PAM을 발현하는 포유동물 발현 시스템에서 C-말단 아미드화가 이루어질 수도 있다. 융합 단백질은 -글리신 또는 -글리신-리신-아르기닌 서열에 의해 연장된 전구체 분자로서 발현될 수 있다. 진핵 세포 (예컨대 CHO, NIH 3T3 및 BHK)에서 분비성 단백질로서 발현될 경우에는, 단백질이 내인성 PAM 효소에 의해 절단됨으로써 C-말단 카르복시아미드를 초래할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Endocrinology (1991) V129:553-555 (1991)]; 및 [Molecular and Cellular Endocrinology 91:135-141 (1993)]을 참조하라. C-말단 아미드화는 인간 PAM이 공동-발현되는 포유동물 발현 시스템에서 이루어질 수도 있다. 예를 들면, 문헌 [Chinese Journal of Biotechnology (2002) v18:20-24 (2002)]을 참조하라.
COOH의 CONH2로의 시험관내 PAM 효소 전환 이외에도, 해당 단백질상 카르복스아미드 말단은 메리필드(Merrifield) 합성을 사용하여 생성될 수 있다. 메리필드 합성은 메리필드 합성 과정 동안 펩티드의 N-말단에 말레이미드 모이어티가 결합되는 것을 가능케 한다. 말레이미드 모이어티는 스페이서로 작용할 수 있는 2개의 폴리펩티드 도메인 사이에 위치되는 다양한 비-아미노산 잔기들을 사용하여, 2개 아미노산 서열 (예를 들면, SABA와 카르복시 아미드화 뉴로펩티드 포함)사이에서의 접합체의 생성을 가능케 한다. 스페이서로 사용될 수 있는 적합한 비-아미노산 모이어티의 예는 하기 표 1에 나타내었다. 말레이미드 접합 반응의 장점은 그것이 단백질상에서 용이하게 수행될 수 있고, 단백질 분자에 바람직한 온화한 조건하에서 높은 수율을 제공하며, 부산물이 거의 없이 고도로 특이적이라는 것이다.
<표 1>
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일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 C-말단 아미드화 합성 펩티드는, 용액 중에서, 통상적으로 펩티드 N-말단에 말레이미도 기를 갖는 펩티드의 말레이미도 유도체에 대한 SABA C-말단 Cys 술피드릴 기의 마이클 부가에 의해 C-말단 Cys 잔기를 포함하는 SABA와 접합됨으로써, 안정한 티오에테르 결합을 산출할 수 있다. 브로모- 또는 아이오도-아세트산을 사용한 아실화를 통하여 펩티드에 브로모- 또는 아이오도-메틸 기가 도입된 것과 같은 펩티드의 할로알킬 유도체를 사용한 SABA Cys 술피드릴의 알킬화에 의해 동일한 접합이 완성될 수도 있다. 당업자라면, 이러한 유형의 펩티드-단백질 접합이 예를 들면 문헌 [G.T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego, CA, 1996]에 기술되어 있는 것들과 같은 생체접합(bioconjugation) 절차와 같은 몇 가지 상이한 방법들을 사용하여 완성될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
또 다른 실시양태에서는, 중성인 링커 또는 스페이서가 펩티드상의 티올-반응성 기와 천연 또는 변형 펩티드 서열 사이에 위치된다. 상기 링커 또는 스페이서는 감소된 입체 장애를 제공하고, 해당 동족 수용체 또는 단백질 상대물에 대한 펩티드의 결합을 촉진할 수 있다. 적합한 링커에는 표 1에 기술되어 있는 링커들이 포함되나, 그에 제한되는 것은 아니다. 링커 8-11은 티올-반응성 말레이미도 또는 아이오도아세틸 기를 가지고 있는 것으로 나타나 있으므로, 당업계에 기술되어 있는 해당 N-숙신이미딜 활성 에스테르를 사용하여 펩티드에 결합될 수 있다.
본원에서 기술되는 펩티드 및 펩티드 유사체들은 문헌 [G. Barany and R.B. Merrifield, "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology"; Volume 2 "Special Methods in Peptide Synthesis, Part A", pp. 3-284, E. Gross and J. Meienhofer, Eds., Academic Press, New York, 1980]; 또는 [W.C. Chan and P.D. White, "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach", Oxford University Press., Oxford, UK, 2000]에 기술되어 있는 것들과 같은 다양한 고체-상 기술을 사용한 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 펩티드 합성을 위한 대표적인 전략은 아미노산 측쇄의 일시적인 보호를 위한 tert-부틸 기와 조합된 α-아미노 기의 일시적인 보호를 위한 Fmoc (9-플루오레닐메틸메틸옥시카르보닐) 기를 기반으로 한다 (예를 들면 문헌 [E. Atherton and R.C. Sheppard, "The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group", in "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology"; Volume 9 "Special Methods in Peptide Synthesis, Part C", pp. 1-38, S. Undenfriend and J. Meienhofer, Eds., Academic Press, San Diego, 1987] 참조).
펩티드는 불용성인 중합체 지지체 ("수지"로도 지칭됨)상에서 펩티드의 카르복시-말단으로부터 시작하여 단계적인 방식으로 합성될 수 있다. 합성은 아미드 또는 에스테르 결합의 형성을 통하여 펩티드의 C-말단 아미노산을 수지에 현수시키는 것에 의해 개시된다. 이는 결국 각각 C-말단 아미드 또는 카르복실산으로서의 생성 펩티드의 방출을 가능케 한다.
합성에 사용되는 C-말단 아미노산 및 모든 다른 아미노산은 바람직하게는 α-아미노 보호 기가 합성 동안 선택적으로 제거될 수 있도록 차별적으로 보호된 그의 α-아미노 기 및 측쇄 관능기 (존재할 경우)를 가진다. 아미노산의 커플링은 활성 에스테르로서의 그의 카르복실 기의 활성화, 및 수지에 현수된 N-말단 아미노산의 차단되지 않은 α-아미노 기와의 그의 반응에 의해 수행된다. 전체 펩티드 서열이 조립될 때까지, α-아미노 기 탈보호 및 커플링의 주기는 반복된다. 다음에, 펩티드는 보통 부반응을 제한하는 적절한 스캐빈저(scavenger)의 존재하에 동시적인 측쇄 관능기의 탈보호와 함께 수지로부터 방출된다. 생성 펩티드는 역상 정제용 HPLC에 의해 정제될 수 있다.
최종 펩티드로의 전구체로서 사용되는 펩티딜-수지의 합성은 상업적으로 입수가능한 가교-결합 폴리스티렌 중합체 수지 (노바바이오켐(Novabiochem) 사, 캘리포니아 샌디에고 소재), 또는 켐매트릭스(ChemMatrix) PEG 중합체 수지 (PCAS 바이오매트릭스(BioMatrix) 사, 캐나다 퀘벡 시티 소재)를 이용할 수 있다. 바람직한 고체 지지체에는 예를 들면 하기가 포함된다: 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세틸-p-메틸 벤즈히드릴아민 수지 (링크(Rink) 아미드 MBHA 수지); 9-Fmoc-아미노-크산텐-3-일옥시-메리필드 수지 (시에버(Sieber) 아미드 수지); 4-(9-Fmoc)아미노메틸-3,5-디메톡시페녹시)발레릴-아미노메틸-메리필드 수지 (PAL 수지) (C-말단 카르복스아미드용), 및 상응하는 켐매트릭스 PEG-기재 수지들. 첫 번째 및 이후 아미노산의 커플링은 각각 DIC/HOBt, HBTU/HOBt로부터, 또는 DIC/6-Cl-HOBt 또는 HCTU/6-Cl-HOBt로부터 생성되는 HOBt 또는 6-Cl-HOBt 활성 에스테르를 사용하여 수행될 수 있다.
본원에서 기술되는 펩티드 및 펩티드 유사체들의 합성은 리버티(Liberty) 마이크로파 펩티드 합성기 (CEM 코포레이션(CEM Corp.) 사, 노스 캐롤라이나 매튜스 소재)와 같은 자동화된 펩티드 합성기를 사용하여 수행될 수 있다. 실시예에 기술되어 있는 Fmoc/t-부틸 보호 전략을 사용하여, 단계적인 고체 상 펩티드 합성이 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 도 21에 나타낸 Fmoc 아미노산 유도체들이 사용될 수 있다.
아밀린 유도체의 경우, 수지상에서의 아이오딘-매개 산화를 통하여, Acm-보호된 Cys 잔기들 (예컨대 Cys2 ,7 또는 Cys1 ,7) 사이의 디술피드 결합이 형성될 수 있다 (문헌 [Chan and White, 2000]). 각 해당 펩티드용의 펩티딜-수지 전구체는 어떠한 표준적인 절차를 사용해서도 절단 및 탈-보호될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [D.S. King et al., Int. J. Peptide Protein Res. 36: 255-266 (1990)] 참조). 일부 실시양태에서는, 스캐빈저로서의 물, TIS 및 페놀의 존재하에 TFA가 사용된다. 통상적으로, 펩티딜-수지는 TFA/물/TIS (94:3:3, v:v:v; 1 mL/100 mg의 펩티딜 수지) 또는 TFA/물/페놀 (90:5:5; v:v:w)에서 실온으로 2-3시간 동안 교반된다. 다음에, 폐 수지를 여과 제거하고, TFA 용액을 감압하에서 농축 또는 건조한다. 생성되는 조 펩티드는 침전 후 Et2O로 세척되거나, 또는 정제용 HPLC에 의한 정제를 위하여 DMSO, DMF 또는 50% 수성 AcCN에 바로 재용해될 수 있다.
원하는 순도를 갖는 펩티드는 예를 들면 시마츠(Shimadzu) 모델 LC-8A 액체 크로마토그래프에서의 정제용 HPLC를 사용한 정제에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 조 펩티드의 용액은 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) C18 (5 ㎛, 21.2×250 mm) 칼럼에 주입된 후, 수 중 선형 구배의 MeCN (모두 0.1% TFA로 완충제링됨)을 사용하여, 14-20 mL/분의 유량으로 용리될 수 있으며, 용출물은 220 nm에서 UV 흡광도에 의해 모니터링된다. 정제된 펩티드의 구조는 전기분무 LCMS 분석에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 펩티드 샘플은 워터스 액퀴티(Waters Acquity) 초고성능 액체 크로마토그래프 (UPLC)에 인터페이싱된 워터스 ZQ 2000 단일 4중극 질량 분광측정기 (매사추세츠 밀포드)에서 LC/MS에 의해 분석될 수 있다. 크로마토그래피 분리는 2.1×50 mm, 1.7 ㎛, 300 Å, 액퀴티 BEH300 C18 칼럼 (워터스 사, 매사추세츠 밀포드 소재)을 사용하여, 0.8 mL/분에서의 구배 용리에 의해 달성될 수 있다. 칼럼 온도는 50℃일 수 있다. 이동상 A는 0.05%의 TFA를 포함하는 98:2의 물:아세토니트릴일 수 있으며, 이동상 B는 0.04%의 TFA를 포함하는 아세토니트릴일 수 있다. 선형 구배는 1, 2 또는 5분에 걸친 2% 내지 80%의 이동상 B로 형성될 수 있다. 2 μL의 주입량이 사용될 수 있으며, ESI MS 데이터는 m/z 500 내지 m/z 1500, 또는 m/z 1000 내지 m/z 2000으로부터 수득될 수 있다. 기기는 단일 해상도(unit resolution)로 운용될 수 있다.
결합성 폴리펩티드의 탈면역화
혈청 알부민 바인더 및 그의 융합체의 아미노산 서열은 하나 이상의 B- 또는 T-세포 에피토프를 제거하도록 변경될 수 있다. 본원에서 기술되는 SABA 융합체를 포함한 단백질은 주어진 종에 대하여 그것이 비-면역원성 또는 덜 면역원성이 되도록 탈면역화될 수 있다. 탈면역화는 단백질에 대한 구조적 변경을 통하여 달성될 수 있다. 당업자에게 알려져 있는 어떠한 탈면역화 기술도 사용될 수 있는데, 예를 들면 그의 개시내용이 전체적으로 본원에 포함되는 WO 00/34317을 참조하라.
일 실시양태에서, 혈청 알부민 바인더 및 그의 융합체의 서열은 MHC 클래스 II 결합성 모티프의 존재에 대하여 분석될 수 있다. 예를 들면, 월드와이드 웹의 sitewehil.wehi.edu.au에서 "모티프" 데이터베이스를 탐색하는 것과 같은 것에 의해, MHC-결합성 모티프 데이터베이스와 비교가 이루어질 수 있다. 다르게는, 알투비아(Altuvia) 등에 의해 개정된 것들 (문헌 [J. Mol. Biol. 249 244-250 (1995)])과 같은 컴퓨터에 의한 스레딩(threading) 방법 (폴리펩티드로부터의 연속 중복 펩티드가 MHC 클래스 II 단백질에 대한 그의 결합 에너지에 대하여 시험됨)을 사용하여, MHC 클래스 II 결합 특성이 확인될 수 있다. 컴퓨터에 의한 결합 예상 알고리즘에는 iTope™, Tepitope, SYFPEITHI, EpiMatrix (EpiVax), 및 MHCpred가 포함된다. MHC 클래스 II-결합성 펩티드의 확인을 돕기 위하여, 양쪽성 및 로트바드(Rothbard) 모티프, 그리고 카텝신 B 및 기타 프로세싱 효소를 위한 절단 부위와 같이 성공적으로 제시되는 펩티드와 관련되는 연관 서열 특징이 탐색될 수 있다.
잠재적인 (예컨대 인간) T-세포 에피토프가 확인되고난 다음, 해당 에피토프는 T-세포 에피토프를 제거하는 데에 필요한 만큼의 하나 이상 아미노산의 변경에 의해 제거된다. 보통, 그것은 T-세포 에피토프 자체 내 하나 이상 아미노산의 변경을 수반하게 된다. 이는 단백질의 1차 구조 면에서 에피토프에 인접한 아미노산, 또는 1차 구조에서는 인접하지 않으나 분자의 2차 구조에서는 인접하는 것을 변경하는 것을 수반할 수 있다. 보통 기획되는 변경은 아미노산 치환일 것이나, 소정의 상황에서는 아미노산 부가 또는 결실이 적절하게 될 수 있을 것이다. 모든 변경은 재조합 DNA 기술에 의해 완성될 수 있으며, 그에 따라 최종 분자는 예를 들면 잘 알려져 있는 방법에 의해 재조합 숙주로부터의 발현에 의해 제조될 수 있으나, 단백질 화학 또는 임의의 다른 분자 변경 수단의 사용 역시 사용될 수 있다.
일단 확인된 T-세포 에피토프가 제거되고 나면, 탈면역화된 서열은 새로운 T-세포 에피토프가 생성되지는 않았는지를 확인하기 위하여 다시 분석될 수 있으며, 그것이 존재하는 경우, 에피토프(들)이 결실될 수 있다.
컴퓨터에 의해 확인된 모든 T-세포 에피토프들이 제거될 필요가 있는 것은 아니다. 당업자라면, 특정 에피토프의 "강도"의 유의성 또는 상당하는 잠재적인 면역원성을 알고 있을 것이다. 다양한 컴퓨터에 의한 방법들이 잠재적 에피토프들에 대하여 점수를 산출하고 있다. 당업자라면, 높은 점수의 에피토프만이 제거될 필요가 있을 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 당업자라면, 잠재적 에피토프를 제거하는 것과 단백질의 결합 친화도 또는 기타 생물학적 활성을 유지하는 것 사이에 균형이 존재한다는 것 역시 알고 있을 것이다. 따라서, 한 가지 전략은 SABA 또는 SABA 융합 단백질에 순차적으로 치환을 도입한 다음, 표적 결합 또는 기타 생물학적 활성 및 면역원성을 시험하는 것이다.
일 측면에서, 탈면역화된 SABA 또는 SABA 융합 단백질은 원래의 단백질에 비해 인간 대상체에서 덜 면역원성이다 (또는 다르게는, 감소된 HAMA 반응을 도출한다). 면역원성을 확인하기 위한 검정은 거의 당업자의 지식 영역에 속한다. 특정 대상체에서, 또는 임상 시험 동안 HAMA 반응을 모니터링하는 데에는, 당업계에 알려져 있는 면역 반응 확인 방법들이 수행될 수 있다. 탈면역화된 단백질을 투여받은 대상체는 해당 요법의 개시시 및 투여 전체에 걸쳐 면역원성 평가에 적용될 수 있다. HAMA 반응은 예를 들면 표면 플라스몬 공명 기술 (비아코어(BIAcore)) 및/또는 고체-상 ELISA 검정을 포함한 당업자에게 알려져 있는 방법을 사용하여 대상체로부터의 혈청 샘플에서 탈면역화된 단백질에 대한 항체를 검출하는 것에 의해 측정된다. 다르게는, T-세포 활성화 사건을 측정하도록 설계된 시험관내 검정 역시 면역원성을 알려준다.
추가 변형
소정 실시양태에서, 혈청 알부민 바인더 및 그의 융합체는 번역-후 변형을 추가로 포함할 수 있다. 대표적인 번역-후 단백질 변형에는 인산화, 아세틸화, 메틸화, ADP-리보실화, 유비퀴틴화, 글리코실화, 카르보닐화, 수모화(sumoylation), 비오티닐화, 또는 폴리펩티드 측쇄 또는 소수성 기의 첨가가 포함된다. 결과적으로, 변형된 혈청 알부민 바인더 및 그의 융합체는 지질, 다당류 또는 단당류, 및 포스페이트와 같은 비-아미노산 요소를 포함할 수 있다. 글리코실화의 바람직한 형태는 하나 이상의 시알산 잔기를 폴리펩티드에 접합시키는 시알화(sialylation)이다. 시알산 잔기는 용해도 및 혈청 반감기를 향상시키는 동시에, 있을 수 있는 단백질의 면역원성도 감소시킨다. 예를 들면, 문헌 [Raju et al. Biochemistry. 2001 Jul 31;40(30):8868-76]을 참조하라. 혈청 알부민 바인더 또는 그의 융합체의 기능성에 대한 이와 같은 비-아미노산 요소들의 효과는 특정 혈청 알부민 (예컨대 HSA 또는 RhSA)에 결합되는 그의 능력, 및/또는 융합체의 맥락에서 특정 비-10Fn3 요소에 의해 제공되는 기능적 역할 (예컨대 글루코스 흡수에 대한 FGF21의 효과)로써 시험될 수 있다.
벡터 & 폴리뉴클레오티드 실시양태
역시 본 개시에 포함되는 것은 본원에서 기술되는 단백질 중 어느 것을 코딩하고 있는 핵산 서열이다. 당업자라면 알고 있을 바와 같이, 제3 염기 축퇴성으로 인하여, 뉴클레오티드 서열을 코딩함에 있어서 거의 모든 아미노산이 하나를 초과하는 3중자 코돈으로 표시될 수 있다. 또한, 미미한 염기 쌍 변화가 코딩되어 있는 아미노산 서열의 보존성 치환으로 이어질 수 있으나, 유전자 산물의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지는 않을 것으로 예상된다. 따라서, 본원에서 기술되는 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열이 약간 변형되면서도 여전히 각 해당 유전자 산물을 코딩하고 있을 수 있다. 본원에서 기술되는 혈청 알부민 바인더 및 그의 융합체를 코딩하고 있는 소정의 대표적인 핵산에는 표 3에 제시되어 있는 서열을 갖는 핵산들이 포함된다.
본원에서 개시되는 다양한 단백질 또는 폴리펩티드들 중 어느 것을 코딩하고 있는 핵산은 화학적으로 합성될 수 있다. 코돈 용법은 세포에서의 발현을 향상시키도록 선택될 수 있다. 그와 같은 코돈 용법은 선택되는 세포 유형에 따라 달라지게 된다. 이. 콜라이 및 기타 박테리아는 물론, 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 곤충 세포에 대하여, 특수화된 코돈 용법 패턴들이 개발되어 있다. 예를 들면 하기를 참조하라: 문헌 [Mayfield et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003 100(2):438-42]; [Sinclair et al. Protein Expr Purif. 2002 (1):96-105]; [Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001 (5):446-9]; [Makrides et al. Microbiol Rev. 1996 60(3):512-38]; 및 [Sharp et al. Yeast. 1991 7(7):657-78].
핵산 조작을 위한 일반적인 기술은 당업자의 영역에 속하며, 또한 예를 들면 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989], 또는 [F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987)] 및 그의 주기적 업데이트물에도 기술되어 있다. 단백질을 코딩하고 있는 DNA는 포유동물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래하는 적합한 전사 또는 번역 조절 요소와 작동적으로 연결된다. 그와 같은 조절 요소에는 전사를 조절하는 임의의 작동유전자 서열인 전사 프로모터, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 조절하는 서열이 포함된다. 보통 복제의 기원에 의해 제공되는 숙주 내에서의 복제 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하기 위한 선택 유전자가 추가로 도입된다. 적합한 조절 요소들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
본원에서 기술되는 단백질 및 융합 단백질은 바람직하게는 신호 서열이거나, 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특정 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드인 이종성 폴리펩티드를 갖는 융합 단백질로 생성될 수 있다. 선택되는 이종성 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다. 천연 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들면 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정성 장독소 II 리더(leader)의 군에서 선택된 원핵 신호 서열로 치환된다. 효모 분비의 경우, 천연 신호 서열은 예를 들면 효모 인버타제 리더, 팩터(factor) 리더 (사카로미세스 및 클루이베로미세스 알파-팩터 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 글루코아밀라제 리더, 또는 PCT 공개 번호 WO 90/13646에 기술되어 있는 신호로 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서는, 포유동물 신호 서열은 물론, 바이러스 분비 리더, 예를 들면 헤르페스 심플렉스 gD 신호가 가용하다. 그와 같은 전구체 영역의 DNA는 리딩 프레임에서 단백질을 코딩하고 있는 DNA에 연결될 수 있다.
진핵 숙주 세포 (예컨대 효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 기타 다세포 유기체로부터의 핵화된 세포)에서 사용되는 발현 벡터들 역시 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열들을 포함하게 된다. 그와 같은 서열은 보통 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5', 때로는 3' 비번역 영역으로부터 가용하다. 이들 영역은 다가의 항체를 코딩하고 있는 mRNA의 비번역 부분에 폴리아데닐화 단편으로 전사되어 있는 뉴클레오티드 분절을 포함한다. 한 가지 유용한 전사 종결 구성요소는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. PCT 공개 번호 WO 94/11026 및 거기에 개시되어 있는 발현 벡터를 참조하라.
재조합 DNA는 또한 단백질을 정제하는 데에 유용할 수 있는 임의 유형의 단백질 태그 서열을 포함할 수 있다. 단백질 태그의 예에는 히스티딘 태그, FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, 또는 GST 태그가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주에서 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터들은 그 관련 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York, 1985)]에서 찾아볼 수 있다.
당업자라면 알고 있을 바와 같이, 발현 구축물은 숙조 세포에 적절한 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입된다. 비제한적으로 전기천공; 염화 칼슘, 염화 루비듐, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 또는 기타 물질을 사용한 형질감염; 미세사출 충격(microprojectile bombardment); 리포펙션; 및 감염 (벡터가 감염성 인자임)을 포함하여, 숙주 세포에 핵산을 도입하기 위한 다양한 방법들이 당업계에 알려져 있다.
적합한 숙주 세포에는 원핵생물, 효모, 포유동물 세포, 또는 박테리아 세포가 포함된다. 적합한 박테리아에는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들면 이. 콜라이 또는 바실루스 속이 포함된다. 바람직하게는 에스. 세레비시아에(S. cerevisiae)와 같은 사카로미세스 종에 속하는 효모가 폴리펩티드의 생산에 사용될 수도 있다. 다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 또한 재조합 단백질을 발현하는 데에 사용될 수 있다. 곤충 세포에서의 이종성 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스(Baculovirus) 시스템이 문헌 [Luckow and Summers, (Bio/Technology, 6:47, 1988)]에 고찰되어 있다. 일부 경우에는, 글리코실화를 위한 것과 같이, 척추동물 세포에서 단백질을 생산하는 것이 바람직할 수 있는데, 배양액 중에서의 척추동물 세포의 번식 (조직 배양)은 일상적인 절차가 되어 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 내피 세포, COS-7 원숭이 신장 세포, CV-1, L 세포, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소 (CHO), 인간 배아 신장 세포, HeLa, 293, 293T, 및 BHK 세포주가 포함된다. 많은 적용분야에 있어서, 본원에서 기술되는 단백질 다량체의 작은 크기는 이. 콜라이가 바람직한 발현 방법이 되게 한다.
단백질 생산
숙주 세포는 본원에서 기술되는 단백질 생산용 발현 또는 클로닝 벡터에 의해 형질전환된 후, 필요에 따라 프로모터의 도입, 형질전환체의 선택, 또는 원하는 서열을 코딩하고 있는 유전자의 증폭을 위하여 변형된 통상적인 영양소 배지에서 배양된다.
본 발명의 단백질을 생산하는 데에 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 햄(Ham) F10 (시스마(Sigma) 사), 최소 필수 배지 ((MEM), 시그마 사), RPMI-1640 (시그마 사), 및 둘베코 변형 이글 배지 ((DMEM), 시그마 사)와 같이 상업적으로 입수가능한 배지들이 숙주 세포를 배양하는 데에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], U.S. 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 U.S. 특허 번호 Re. 30,985에 기술되어 있는 배지들 중 어느 것이 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용될 수 있다. 이들 배지 중 어느 것도 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 젠타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위로 최종 농축물에 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원이 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요 보충물들이 당업자에게 알려져 있을 적절한 농도로 포함될 수도 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건들은 발현에 선택된 숙주 세포에서 이전에 사용되던 것으로써, 당업자라면 알고 있을 것이다.
본원에서 개시되는 단백질은 세포-번역 시스템을 사용하여 생산될 수도 있다. 그와 같은 목적을 위하여, 단백질을 코딩하고 있는 핵산은 mRNA를 생산하기 위한 시험관내 전사를 허용하고, 이용되는 특정 무-세포 시스템에서의 mRNA의 무-세포 번역을 허용하도록 변형되어야 한다. 대표적인 진핵 무-세포 번역 시스템에는 예를 들면 포유동물 또는 효모 무-세포 번역 시스템이 포함되며, 대표적인 원핵 무-세포 번역 시스템에는 예를 들면 박테리아 무-세포 번역 시스템이 포함된다.
본원에서 개시되는 단백질은 화학적 합성 (예를 들면 문헌 [Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL]에 기술되어 있는 방법에 의함)에 의해 생산될 수도 있다. 단백질에 대한 변형 역시 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다.
본원에서 개시되는 단백질은 단백질 화학 분야에 일반적으로 알려져 있는 단백질용 단리/정제 방법에 의해 정제될 수 있다. 비제한적인 예로는 추출, 재결정화, 염석 (예컨대 황산암모늄 또는 황산나트륨 사용), 원심분리, 투석, 한외여과, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 정상상 크로마토그래피, 역-상 크로마토그래피, 겔 여과, 겔 투과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동, 대향류 분배 또는 이들의 임의 조합이 포함된다. 정제 후, 단백질은 상이한 완충제들로 교환되고/거나, 비제한적으로 여과 및 투석을 포함하여 당업계에 알려져 있는 다양한 방법들 중 어느 것에 의해 농축될 수 있다.
정제된 단백질은 바람직하게는 85% 이상의 순도, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 순도, 가장 바람직하게는 98% 이상의 순도를 가진다. 정확한 순도 숫자 값에 관계없이, 단백질은 제약 제품으로서 사용하기에 충분히 순수하다.
영상화, 진단 및 기타 적용분야
본원에서 제공되는 SABA 융합체는 SABA에 융합되는 이종 분자가 무엇인지에 따라 다양한 질환 및 장애를 치료하는 데에 사용될 수 있다. SABA 융합체의 적용분야는 당업계의 지식 및 본원에서 제공되는 정보를 기초로 하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 다양한 SABA 융합 단백질들의 용도가 본원에 상세하게 기술되어 있다. SABA 융합체는 인간 및 비-인간 유기체 모두를 포함한 임의의 포유동물 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다.
본원에서 기술되는 혈청 알부민 바인더 및 융합 분자는 검출가능하게 표지됨으로써, 영상화 또는 진단 적용분야를 위하여 예컨대 융합 분자에 의해 결합되는 단백질을 발현하는 세포와 접촉되는 데에 사용될 수 있다. 문헌 [Hunter, et al., Nature 144:945 (1962)]; [David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974)]; [Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981)]; 및 [Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)]에 기술되어 있는 방법들을 포함하여, 검출가능한 모이어티에 단백질을 접합시키기 위한 당업계에 알려져 있는 어떠한 방법도 사용될 수 있다.
소정 실시양태에서, 본원에서 기술되는 혈청 알부민 바인더 및 융합 분자는 검출될 수 있는 표지에 추가로 결합된다 (예를 들면, 상기 표지는 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조-인자일 수 있음). 표지는 하기와 같은 방사성 제제일 수 있다: 방사성 중금속 예컨대 철 킬레이트, 가돌리늄 또는 망간의 방사성 킬레이트, 산소, 질소, 철, 탄소 또는 갈륨의 양전자 방출제, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 123I, 125I, 131I, 132I, 또는 99Tc. 이와 같은 모이어티에 첨부된 혈청 알부민 바인더 또는 융합 분자는 조영제로서 사용될 수 있으므로, 인간과 같은 포유동물에서 진단 용도에 효과적인 양으로 투여된 다음, 조영제의 위치 및 축적이 검출된다. 조영제의 위치 및 축적은 방사성섬광조영술, 핵 자기 공명 영상화, 컴퓨터화 단층촬영 또는 양전자 방출 단층촬영에 의해 검출될 수 있다. 당업자라면 분명히 알고 있을 바와 같이, 투여되는 방사성동위원소의 양은 방사성동위원소에 따라 달라진다. 당업자라면, 활성 모이어티로 사용되는 해당 방사성핵종의 구체적인 활성 및 에너지를 기초로 투여될 조영제의 양을 용이하게 공식화할 수 있다.
혈청 알부민 바인더 및 융합 분자는 친화성 정제제로서도 유용하다. 해당 절차에서, 단백질은 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 세파덱스 수지 또는 여과 페이퍼와 같은 적합한 지지체 상에 고정된다. 단백질은 경쟁적 결합 검정, 직간접 샌드위치 검정, 및 면역침전 검정과 같은 임의의 알려져 있는 검정 방법에 사용될 수 있다 (문헌 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)]).
SABA - FGF21 융합체의 대표적인 용도
본원에서 제공되는 SABA-FGF21 융합체는 하기 중 하나 이상을 치료 또는 예방하는 데에, 그리고 코르티코스테로이드 치료에서 오는 당뇨병, 지방이상증 및 골다공증 관련 부작용의 치료에 사용될 수 있다: 당뇨병, 고혈당, 손상된 내당능, 임신 당뇨병, 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 망막병증, 신경병증, 신장병증, 상처 치유, 아테롬성동맥경화증 및 그의 후유증 (급성 관상 증후군, 심근 경색증, 협심증, 말초 혈관 질환, 간헐성 파행, 심근 허혈, 뇌졸중, 심부전), 대사 증후군, 고혈압, 비만, 이상지질혈증, 고지질혈증, 고중성지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 저 HDL, 고 LDL, 혈관 재협착, 말초 동맥 질환, 지질 장애, 골 장애 (골다공증 포함), PCOS, HIV 프로테아제 관련 지방이상증, 녹내장 및 염증성 질환, 예컨대 건선, 류마티스 관절염 및 골관절염. 소정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 SABA-FGF21 융합체는 대상체에서 비만을 치료 또는 예방하거나, 또는 체중을 감소시키거나 체중 증가를 예방하는 데에 사용될 수 있다. 대표적인 실시양태에서, SABA-FGF21 융합체는 25-29.9의 BMI를 갖는 대상체에서 체중을 감소시키거나 체중 증가를 예방하는 데에 사용될 수 있다. 또 다른 대표적인 실시양태에서, SABA-FGF21 융합체는 ≥30의 BMI를 갖는 대상체에서 체중을 감소시키거나 체중 증가를 예방하는 데에 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, SABA-FGF21 융합체는 ≥200 mg/dL의 총 콜레스테롤 농도 및/또는 ≥150 mg/dL의 트리글리세리드 농도를 갖는 대상체를 치료하는 데에 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, SABA-FGF21 융합체는 인슐린 내성을 치료하거나 저하시키는 데에, 및/또는 지방 조직에서 글루코스 흡수를 증가시키는 데에 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, SABA-FGF21 융합체는 당뇨병전증 대상체에서 당뇨병의 진행을 느리게 하는 데에 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, SABA-FGF21 융합체는 대상체에서 혈중 글루코스 수준을 낮추거나, 트리글리세리드 수준을 낮추거나, 콜레스테롤 수준을 낮추거나, 에너지 소모를 증가시키거나, 지방 이용을 증가시키고/거나, 지질 배설을 증가시키는 데에 사용될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 질환 또는 장애를 "예방하는 것"은 비처리 대조 샘플에 대비하여 통계적 샘플에서 질환-상태의 발생 가능성을 감소시키거나, 또는 비처리 대조 샘플에 대비하여 하나 이상의 질환 또는 장애 증상의 발병을 지연하거나 중증도를 감소시키는 것을 지칭한다. 환자는 일반 군집에 비해 임상적 질환 상태에 걸릴 위험성을 증가시키는 것으로 알려져 있는 요인에 근거하여 예방 치료용으로 선택될 수 있다. 본원에서 사용될 때의 "치료하는 것"이라는 용어에는 (a) 질환-상태를 억제하는 것, 즉 그의 발달을 중지시키는 것; 및/또는 (b) 질환-상태를 경감시키는 것, 즉 일단 그것이 발병되고난 후에 질환 상태의 회귀를 야기하는 것이 포함된다.
소정 실시양태에서, 본 출원은 활성 성분으로서, 치료 유효량의 SABA-FGF21 융합체를 단독, 또는 제약 담체와의 조합으로써 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 임의로, SABA-FGF21 융합체는 단독으로, 본원에서 기술되는 다른 융합체와의 조합으로써, 또는 1종 이상의 다른 치료제(들), 예컨대 항당뇨병제 또는 기타 약제학적 활성 물질과의 조합으로써 사용될 수 있다.
소정 실시양태에서, SABA-FGF21 융합체는 단독, 또는 1종 이상의 추가적인 치료제와의 조합으로써 투여될 수 있다. "조합으로써 투여되는" 또는 "조합 치료"는 SABA-FGF21 융합체 및 1종 이상의 추가적인 치료제가 치료되는 포유동물에게 함께 투여된다는 것을 의미한다. 조합으로써 투여되는 경우, 각 성분은 동시에, 또는 서로 다른 시점에 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 따라서, 각 성분은 별도로, 그러나 원하는 치료 효과를 제공하도록 시간적으로 충분히 근접하여 투여될 수 있다.
본원에서 제공되는 SABA-FGF21 융합체는 항-당뇨병제, 항-고혈당제, 항-고인슐린혈증제, 항-망막병증제, 항-신경병증제, 항-신장병증제, 항-아테롬성동맥경화증제, 항-허혈제, 항-고혈압제, 항-비만제, 항-이상지질혈증제, 항-이상지질혈증제, 항-고지질혈증제, 항-고중성지질혈증제, 항-고콜레스테롤혈증제, 항-재협착제, 항-췌장제, 지질 저하제, 식욕감퇴제, 기억 강화제, 항-치매제, 또는 인지 촉진제, 식욕 억제제, 심부전 치료제, 말초 동맥 질환 치료제 및 항-염증제와의 조합으로써 사용될 수 있다.
SABA-FGF21 융합체와의 조합으로써 사용되는 항당뇨병제에는 인슐린 분비촉진제 또는 인슐린 민감제, GPR40 수용체 조절인자, 또는 기타 항당뇨병제들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 작용제에는 디펩티딜 펩티다제 IV (DP4) 억제제 (예를 들면, 시타글립틴, 삭사글립틴, 알로글립틴, 빌다글립틴 등), 비구아니드 (예를 들면 메트포르민, 펜포르민 등), 술포닐 우레아 (예를 들면 글리부리드, 글리메피리드, 글리피지드 등), 글루코시다제 억제제 (예를 들면 아카르보스, 미글리톨 등), PPARγ 효능제 예컨대 티아졸리딘디온 (예를 들면 로시글리타존, 피오글리타존 등), PPAR α/γ 이중 효능제 (예를 들면 뮤라글리타자르, 테사글리타자르, 알레글리타자르 등), 글루코키나제 활성화제 (본원에 참조로 포함되는 문헌 [Fyfe, M.C.T. et al., Drugs of the Future, 34(8):641-653 (2009)]에 기술되어 있는 바와 같음), GPR119 수용체 조절인자 (MBX-2952, PSN821, APD597 등), SGLT2 억제제 (다파글리플로진, 카나글리플로진, 레마글리플로진 등), 아밀린 유사체 예컨대 프람린티드, 및/또는 인슐린이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 당뇨병의 치료를 위한 현행 및 신생 치료법들에 대한 고찰은 하기에서 찾아볼 수 있다: 문헌 [Mohler, M.L. et al., Medicinal Research Reviews , 29(1):125-195 (2009)], 및 [Mizuno, C.S. et al., Current Medicinal Chemistry , 15:61-74 (2008)].
SABA-FGF21 융합체는 임의로 디에틸프로피온, 펜디메트라진, 펜테르민, 오를리스타트, 시부트라민, 로르카세린, 프람린티드, 토피라메이트, MCHR1 수용체 길항제, 옥신토모듈린, 날트렉손, 아밀린 펩티드, NPY Y5 수용체 조절인자, NPY Y2 수용체 조절인자, NPY Y4 수용체 조절인자, 세틸리스타트, 5HT2c 수용체 조절인자 등과 같은 1종 이상 하이포페이직제(hypophagic agent)와의 조합으로써 사용될 수도 있다. SABA-FGF21 융합체는 또한 글루카곤-유사 펩티드-1 수용체의 효능제 (GLP-1 R), 예컨대 엑세나티드, 리라글루티드, GPR-1(1-36) 아미드, GLP-1(7-36) 아미드, GLP-1(7-37) (그의 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 하베너(Habener)의 U.S. 특허 번호 5,614,492에 개시되어 있는 바와 같음)와의 조합으로써 사용되며, 주사, 비내를 통하여, 또는 경피 또는 협측 장치에 의해 투여될 수 있다. 비만의 치료를 위한 현행 및 신생 치료법들에 대한 고찰을 하기에서 찾아볼 수 있다: 문헌 [Melnikova, I. et al., Nature Reviews Drug Discovery, 5:369-370 (2006)]; [Jones, D., Nature Reviews : Drug Discovery, 8:833-834 (2009)]; [Obici, S., Endocrinology, 150(6):2512-2517 (2009)]; 및 [Elangbam, C.S., Vet . Pathol ., 46(1): 10-24 (2009)].
소정 실시양태에서, SABA-FGF21 융합체는 약 10 ng 내지 20 mg, 10 ng 내지 5 mg, 10 ng 내지 2 mg, 10 ng 내지 1 mg, 100 ng 내지 20 mg, 100 ng 내지 5 mg, 100 ng 내지 2 mg, 100 ng 내지 1 mg, 1 ㎍ 내지 20 mg, 1 ㎍ 내지 5 mg, 1 ㎍ 내지 2 mg, 1 ㎍ 내지 1 mg, 10 ㎍ 내지 20 mg, 10 ㎍ 내지 5 mg, 10 ㎍ 내지 2 mg, 10 ㎍ 내지 1 mg, 0.01 내지 20 mg, 0.01 내지 10 mg, 0.1 내지 20 mg, 0.1 내지 10 mg, 0.01 내지 5 mg, 0.1 내지 5 mg, 또는 0.7 내지 5 mg, 또는 약 10 ng, 100 ng, 1 ㎍, 10 ㎍, 100 ㎍, 또는 약 1, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mg의 용량으로 투여된다. 소정 실시양태에서, SABA-FGF21 융합체는 약 100 pg/kg 내지 200 ㎍/kg, 100 pg/kg 내지 50 ㎍/kg, 100 pg/kg 내지 20 ㎍/kg, 100 pg/kg 내지 10 ㎍/kg, 1 ng/kg 내지 200 ㎍/kg, 1 ng/kg 내지 50 ㎍/kg, 1 ng/kg 내지 20 ㎍/kg, 1 ng/kg 내지 10 ㎍/kg, 10 ng/kg 내지 200 ㎍/kg, 10 ng/kg 내지 50 ㎍/kg, 10 ng/kg 내지 20 ㎍/kg, 10 ng/kg 내지 10 ㎍/kg, 100 ng/kg 내지 200 ㎍/kg, 100 ng/kg 내지 50 ㎍/kg, 100 ng/kg 내지 20 ㎍/kg, 100 ng/kg 내지 10 ㎍/kg, 0.1 내지 200 ㎍/kg, 0.1 내지 100 ㎍/kg, 1 내지 200 ㎍/kg, 1 내지 100 ㎍/kg, 0.1 내지 50 ㎍/kg, 1 내지 50 ㎍/kg, 또는 7 내지 50 ㎍/kg, 또는 약 100 pg/kg, 1 ng/kg, 10 ng/kg, 100 ng/kg, 또는 1, 2, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 200 또는 250 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. SABA-FGF21 융합체는 매일 (예컨대 매일 1회, 2회, 3회, 또는 4회), 또는 덜 빈번하게 (예컨대 2일마다 1회, 매주 1회 또는 2회, 또는 매달) 제공될 수 있다. 대표적인 실시양태에서, SABA-FGF21 융합체는 매주 기준 약 0.01 내지 20 mg, 약 0.01 내지 10 mg, 약 0.1 내지 20 mg, 약 0.1 내지 10 mg, 약 0.01 내지 5 mg, 약 0.1 내지 5 mg, 또는 약 0.7 내지 5 mg, 또는 약 1, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mg의 용량으로 투여된다. 대표적인 실시양태에서, SABA-FGF21 융합체는 매주 기준 약 0.1 내지 200 ㎍/kg, 약 0.1 내지 100 ㎍/kg, 약 1 내지 200 ㎍/kg, 약 1 내지 100 ㎍/kg, 약 0.1 내지 50 ㎍/kg, 약 1 내지 50 ㎍/kg, 또는 약 7 내지 50 ㎍/kg, 또는 약 1, 2, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 200 또는 250 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 대표적인 실시양태에서, SABA-FGF21 융합체는 매일 기준 약 10 ng 내지 20 mg, 약 10 ng 내지 5 mg, 약 10 ng 내지 2 mg, 약 10 ng 내지 1 mg, 약 10 ng 내지 500 ㎍, 약 10 ng 내지 200 ㎍, 약 100 ng 내지 20 mg, 약 100 ng 내지 5 mg, 약 100 ng 내지 2 mg, 약 100 ng 내지 1 mg, 약 100 ng 내지 500 ㎍, 약 100 ng 내지 200 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 20 mg, 약 1 ㎍ 내지 5 mg, 약 1 ㎍ 내지 2 mg, 약 1 ㎍ 내지 1 mg, 약 1 ㎍ 내지 500 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 200 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 20 mg, 약 10 ㎍ 내지 5 mg, 약 10 ㎍ 내지 2 mg, 약 10 ㎍ 내지 1 mg, 약 10 ㎍ 내지 500 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 200 ㎍, 또는 약 10 ng, 100 ng, 1 ㎍, 10 ㎍, 100 ㎍, 200 ㎍, 500 ㎍, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 또는 5 mg의 용량으로 투여된다. 대표적인 실시양태에서, SABA-FGF21 융합체는 매일 기준 약 100 pg/kg 내지 200 ㎍/kg, 약 100 pg/kg 내지 50 ㎍/kg, 약 100 pg/kg 내지 20 ㎍/kg, 약 100 pg/kg 내지 5 ㎍/kg, 약 100 pg/kg 내지 2 ㎍/kg, 약 1 ng/kg 내지 200 ㎍/kg, 약 1 ng/kg 내지 50 ㎍/kg, 약 1 ng/kg 내지 20 ㎍/kg, 약 1 ng/kg 내지 5 ㎍/kg, 약 1 ng/kg 내지 2 ㎍/kg, 약 10 ng/kg 내지 200 ㎍/kg, 약 10 ng/kg 내지 50 ㎍/kg, 약 10 ng/kg 내지 20 ㎍/kg, 약 10 ng/kg 내지 5 ㎍/kg, 약 10 ng/kg 내지 2 ㎍/kg, 약 100 ng/kg 내지 200 ㎍/kg, 약 100 ng/kg 내지 50 ㎍/kg, 약 100 ng/kg 내지 20 ㎍/kg, 약 100 ng/kg 내지 5 ㎍/kg, 약 100 ng/kg 내지 2 ㎍/kg, 약 1 ㎍/kg 내지 200 ㎍/kg, 약 1 ㎍/kg 내지 50 ㎍/kg, 약 1 ㎍/kg 내지 20 ㎍/kg, 약 1 ㎍/kg 내지 5 ㎍/kg, 약 1 ㎍/kg 내지 2 ㎍/kg, 약 10 ㎍/kg 내지 200 ㎍/kg, 약 10 ㎍/kg 내지 50 ㎍/kg, 또는 약 10 ㎍/kg 내지 20 ㎍/kg, 또는 약 100 pg/kg, 1 ng/kg, 10 ng/kg, 100 ng/kg, 500 ng/kg, 1 ㎍/kg, 5 ㎍/kg, 10 ㎍/kg, 20 ㎍/kg, 50 ㎍/kg, 100 ㎍/kg 또는 200 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 또한, 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 연령은 물론, 체중, 일반적인 건강, 성별, 섭식, 투여 시간, 약물 상호작용, 및 질환의 중증도에 대한 조정이 필요할 수 있는데, 당업자에 의한 일상적인 실험으로 확인가능할 것이다.
치료 제제 및 투여 양식
본 출원은 SABA에 융합되었을 때 치료 모이어티의 반감기가 연장되는, SABA에 융합된 치료 모이어티의 투여 방법을 제공한다. 융합 구축물의 투여를 위한 기술 및 투여량은 SABA에 융합되는 치료 모이어티의 유형, 및 치료되는 특정 상태에 따라 달라지게 될 것이나, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 규제 기관은 치료제로서 사용될 단백질 반응물이 허용가능하게 낮은 수준의 발열원을 가지도록 제제화될 것을 요구한다. 따라서, 치료 제제는 일반적으로 그것이 실질적으로 무발열원이거나, 또는 적어도 적절한 규제 기관 (예컨대 FDA)에서 측정하였을 때 허용가능한 수준 이하의 발열원을 함유한다는 점에서 다른 제제와 구별되게 된다. 소정 실시양태에서, SABA 및 그의 융합 분자의 제약 제제는 예를 들면 pH 4.0-7.0에서 1-20 mM의 숙신산, 2-10%의 소르비톨, 및 1-10%의 글리신을 포함한다. 대표적인 실시양태에서, SABA 및 그의 융합 분자의 약제학적 제제는 예를 들면 pH 6.0에서 10 mM의 숙신산, 8%의 소르비톨, 및 5%의 글리신을 포함한다.
일부 실시양태에서, SABA 및 그의 융합체는 포유동물, 특히 인간에 대하여 제약상 허용가능하다. "제약상 허용가능한" 폴리펩티드는 상당히 부정적인 의학적 결과 없이 동물에게 투여되는 폴리펩티드를 지칭한다. 제약상 허용가능한 SABA 및 그의 융합체의 예에는 인테그린-결합성 도메인 (RGD)이 결핍되어 있는 10Fn3 도메인, 및 본질적으로 무내독소이거나 매우 낮은 내독소 수준을 갖는 SABA 또는 SABA 융합체의 조성물이 포함된다.
치료 조성물은 제약상 허용가능한 희석제, 담체, 또는 부형제와 함께 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 투여는 비제한적인 예로서 비경구 (예컨대 정맥내, 피하), 경구, 또는 국소일 수 있다. 조성물은 경구 투여를 위한 환제, 정제, 캡슐, 액체, 또는 지속 방출 정제; 정맥내, 피하 또는 비경구 투여를 위한 액체; 또는 국소 투여를 위한 겔, 로션, 연고, 크림, 또는 중합체 또는 기타 지속 방출 비히클의 형태일 수 있다.
제제를 제조하기 위한 당업계에 잘 알려져 있는 방법은 예를 들면 문헌 ["Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A.R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)]에서 발견된다. 비경구 투여용 제제는 예를 들면 부형제, 멸균수, 염수, 폴리알킬렌 글리콜 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 또는 수소화 나프탈렌을 함유할 수 있다. 생체적합성의 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체는 화합물의 방출을 조절하는 데에 사용될 수 있다. 나노미립자 제제 (예컨대 생분해성 나노입자, 고형 지질 나노입자, 리포솜)는 화합물의 생체분포를 조절하는 데에 사용될 수 있다. 기타 잠재적으로 유용한 비경구 전달 시스템에는 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프, 이식가능 주입 시스템, 및 리포솜이 포함된다. 제제에서의 화합물의 농도는 투여될 약물의 투여량, 및 투여 경로를 포함한 수많은 인자들에 따라 달라진다.
폴리펩티드는 임의로 제약 업계에서 보편적으로 사용되는 비-독성의 산 부가염 또는 금속 착체와 같은 제약상 허용가능한 염으로서 투여될 수 있다. 산 부가염의 예에는 유기 산 예컨대 아세트산, 락트산, 파모산, 말레산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 숙신산, 벤조산, 팔미트산, 수베르산, 살리실산, 타르타르산, 메탄술폰산, 톨루엔술폰산, 또는 트리플루오로아세트산 등; 중합체성 산 예컨대 탄닌산, 카르복시메틸 셀룰로스 등; 및 무기 산 예컨대 염산, 브로민화수소산, 황산, 인산 등이 포함된다. 금속 착체에는 아연, 철 등이 포함된다. 일 예에서, 폴리펩티드는 열 안정성을 증가시키기 위하여 아세트산나트륨의 존재하에 제제화된다.
경구 용도의 제제에는 비-독성의 제약상 허용가능한 부형제와의 혼합물로서 활성 성분(들)을 함유하는 정제가 포함된다. 이러한 부형제는 예를 들면 불활성 희석제 또는 충전제 (예컨대 수크로스 및 소르비톨), 윤활제, 활택제, 및 항-부착제 (예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산아연, 스테아르산, 실리카, 수소화 식물성 오일, 또는 활석)일 수 있다.
경구 용도의 제제는 츄어블(chewable) 정제로, 또는 활성 성분이 불활성 고체 희석제와 혼합되어 있는 경질 젤라틴 캡슐로, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질과 혼합되어 있는 연질 젤라틴 캡슐로 제공될 수도 있다.
치료 유효 용량은 투여되는 대상체에 대하여 치료 효과를 산출하는 용량을 지칭한다. 정확한 용량은 치료될 장애에 따라 달라지게 되며, 공지의 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있다. 일반적으로, SABA 또는 SABA 융합체는 1일 당 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg, 바람직하게는 1일 당 0.01 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 가장 바람직하게는 1일 당 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg으로 투여된다. 폴리펩티드는 매일 (예컨대 매일 1회, 2회, 3회, 또는 4회), 또는 덜 빈번하게 (예컨대 2일마다 1회, 매주 1회 또는 2회, 또는 매달) 제공될 수 있다. 또한, 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 연령은 물론, 체중, 일반적인 건강, 성별, 섭식, 투여 시간, 약물 상호작용, 및 질환의 중증도에 대한 조정이 필요할 수 있는데, 당업자에 의한 일상적인 실험으로 확인가능할 것이다.
[ 실시예 ]
현재 일반적으로 기술되고 있는 본 발명은 하기의 실시예들을 참조함으로써 더욱 용이하게 이해될 것이며, 하기 실시예들은 단순히 본 발명 소정 측면 및 실시양태의 예시를 목적으로 포함된 것으로서 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
서열 요약
본 출원에서 언급된 많은 서열들을 하기 표 2에 요약한다. 다르게 특정되지 않는 한, 모든 N-말단 연장체는 단일 밑줄로 표시되며, 모든 C-말단 테일/연장체는 이중 밑줄로 표시되고, 링커 서열은 박스로 표시된다. 각 코어 SABA 서열에 있어서 루프 영역 BC, DE 및 FG는 음영처리된다.
<표 2>
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<표 3>
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A. 혈청 알부민-결합성 애드넥틴 ™ ( SABA )
실시예 A1. 후보 혈청 알부민-결합성 애드넥틴 ™의 스크리닝 및 선택
개관
10Fn3의 BC, DE 및 FG 루프로 설계된 가변 영역들을 갖는 DNA 라이브러리에 대하여 프로퓨젼(PROfusion) (예를 들면 문헌 [Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci U S A. 94(23):12297-302, 1997] 및 WO 2008/066752 참조)으로 알려져 있는 선택 기술을 적용하였다. 이와 같은 설계로부터 1013개를 초과하는 분자들의 무작위 라이브러리를 생성시킨 후, 비오티닐화된 형태의 HSA에 대하여 선택 압력을 가함으로써, 바람직한 결합 특성을 갖는 후보 혈청 알부민-결합성 애드넥틴™ (SABA)를 단리하였다.
고처리량 단백질 생산 ( HTTP ) 공정
고처리량 단백질 생산 공정 (HTPP)을 사용하여 다양한 HSA 결합성 애드넥틴™들을 정제하였다. 선택된 바인더는 HIS6 태그를 포함하는 pET9d 벡터에 클로닝한 후, 이. 콜라이 BL21(DE3)pLysS 세포로 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 50 ㎍/mL의 카나마이신을 함유하는 5 ml의 LB 배지에 24-웰 포맷으로 접종한 후, 37℃에서 밤새 성장시켰다. 밤샘 배양물로부터 200 μl를 흡인함으로써 유도가능 발현용으로 새로운 5 ml LB 배지 (50 ㎍/mL의 카나마이신) 배양물을 제조한 후, 그것을 적절한 웰에 분배하였다. 배양물을 0.6-0.9의 A600까지 37℃에서 성장시켰다. 1 mM의 이소프로필-β-티오갈락토시드 (IPTG)를 도입한 후, 배양물을 30℃에서 다시 4시간 동안 성장시키고, 3220×g에서 4℃로 10분 동안의 원심분리에 의해 수확하였다. -80℃에서 세포 펠릿을 냉동시켰다.
450 μl의 용해 완충제 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1x 콤플리트™ 프로테아제 억제제 칵테일-EDTA 프리 (Complete™ Protease Inhibitor Cocktail-EDTA free) (로슈(Roche) 사), 1 mM PMSF, 10 mM CHAPS, 40 mM 이미다졸, 1 mg/ml 리소자임, 30 ug/ml DNAse, 2 ug/ml 아프로토닌, pH 8.0)에 재현탁시킴으로써 세포 펠릿 (24-웰 포맷)을 용해하고, 실온에서 1시간 동안 진탕하였다. 용해물을 정화한 후, 96-웰의 650 μl 캐치 플레이트(catch plate)가 구비된 96-웰 와트만(Whatman) GF/D 유니필터(Unifilter)로 이동시킴으로써, 96-웰 포맷으로 재탑재한 후, 200×g로 5분 동안 원심분리하였다. 정화된 용해물을 평형화 완충제 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl,10 mM CHAPS, 40 mM 이미다졸, pH 8.0)를 사용하여 평형화된 96-웰 Ni-킬레이팅 플레이트로 이동시키고, 5분 동안 인큐베이션하였다. 비결합 물질을 제거하였다. 2×0.3 ml/웰의 세척 완충제 #1 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 5 mM CHAPS, 40 mM 이미다졸, pH 8.0)을 사용하여 수지를 세척하였다. 다음에, 3×0.3 ml/웰의 PBS로 수지를 세척하였다. 용리에 앞서, 각 웰을 50 μl의 용리 완충제 (PBS + 20 mM EDTA)로 세척한 후, 5분 동안 인큐베이션하였으며, 해당 세척물은 진공으로 제거하였다. 각 웰에 추가 100 μl의 용리 완충제를 적용함으로써, 단백질을 용리하였다. 실온에서 30분 인큐베이션 후, 플레이트(들)을 200×g로 5분 동안 원심분리하여, 5 μl의 0.5 M MgCl2을 포함하는 96-웰 캐치 플레이트에 수집된 용리 단백질을 Ni-플레이트의 저부에 고착시켰다. 단백질 표준으로서의 SGE (대조 애드넥틴™)과 함께, BCA 단백질 검정을 사용하여 용리된 단백질을 정량하였다. SGE 애드넥틴은 인테그린 결합성 도메인 (78-80 위치의 아미노산 RGD)이 SGE로 대체되어 있는 야생형 10Fn3 도메인 (서열 1)이다.
HSA , RhSA & MuSA 직접 결합 ELISA
HSA에 대한 직접 바인더를 검정하기 위하여, 맥시소르프(MaxiSorp)™ 플레이트 (눈크 인터내셔날(Nunc International) 사, 뉴욕 로체스터 소재)를 PBS 중 10 ug/mL HSA (시그마 사, 미주리 세인트루이스 소재)를 사용하여 4℃로 밤새 코팅한 후, 이어서 카제인 차단 완충제 (서모 사이언티픽(Thermo Scientific) 사, 일리노이 록포드 소재)에서 실온으로 1-3시간 동안 차단하였다. 단일점 스크리닝 검정(single-point screening assay)을 위하여, 정제된 HTPP 애드넥틴™을 카제인 차단 완충제 중에 1:20으로 희석한 후, 실온에서 1시간 동안 각 웰 중의 HSA에 결합시켰다. 용량 반응 검정에는, 0.1 nM 내지 1 μM 범위의 농도를 사용하였다. PBST 중에서 세척하여 비결합 애드넥틴™을 제거한 후, 카제인 차단 완충제 중에 1:2500으로 희석된 항-His mAb-HRP 접합체 (R&D 시스템즈(R&D Systems) 사, 미네소타 소재)를 실온에서 1시간 동안 결합된 His-태깅된 애드넥틴™에 첨가하였다. PBST로 세척함으로써 과량의 접합체를 제거한 후, TMB 검출 시약 (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences) 사)을 사용하여 제조자의 지침에 따라 결합된 애드넥틴™을 검출하였다.
분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의한 응집 측정
HTPP로부터 생성된 SABA에 대하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 수행하였다. HTPP 유래 물질의 SEC는 A214 nm 및 A280 nm에서의 UV 검출 및 형광 검출 (여기 = 280 nm, 방출 = 350 nm)을 동반하여, 애질런트(Agilent) 1100 또는 1200 HPLC 시스템에서 수퍼덱스(Superdex) 200 5/150 또는 수퍼덱스 75 5/150 칼럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare) 사)을 사용하여 수행하였다. 100 mM 황산나트륨, 100 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 6.8의 완충제를 적절한 SEC 칼럼 유량으로 사용하였다. 분자량 보정에는 겔 여과 표준 (바이오-래드 래보래토리즈(Bio-Rad Laboratories) 사, 캘리포니아 허큘레스 소재)을 사용하였다.
HTPP 정제 SABA에 대한 SEC의 결과는 주로 단량체성이며, 구체 겔 여과 표준 (바이오래드 사) 대비 대략 10 kDa의 범위에서 용리되는 것으로 나타났다.
5. 후보 혈청 알부민-결합성 애드넥틴 ™ ( SABA )의 확인
HSA/RhSA/MuSA 결합 및 생물물리학적 기준에 대한 스크리닝의 결과로서, 4종의 독특한 혈청 알부민-결합성 애드넥틴™ (SABA)가 확인되어, 마우스에서 그의 반감기를 평가하기 위해 선택되었다. 시험관내 및 생체내 특성화를 수행하기 위하여, 4종의 SABA에 대하여 중간규모화를 수행하였다. 표 2는 SABA 1-26으로 명명된, 프로퓨전으로부터 확인된 26종의 독특한 SABA 코어 서열들의 서열을 제공한다. SABA4는 중간규모화 전에 고정된 스캐폴드 돌연변이를 가졌다. SABA4의 완전-골격 버전은 SABA5이다. SABA4 및 SABA5는 BC, DE, 및 FG 루프에서 동일한 서열을 가진다.
실시예 A2. 후보 SABA 의 생산 및 제제화
SABA 의 중간규모 단백질 생산
실시예 A1에서 기술된 His6 태그가 이어지는 선택된 SABA를 pET 9d 벡터에 클로닝하고, 이. 콜라이 BL21(DE3)pLysS 세포에서 발현시켰다 (SABA1.1, SABA2.1, SABA3.1, 및 SABA5.1로 지칭되는 각 His-태깅된 SABA 서열에 대해서는 표 2 참조). 20 ml의 접종 배양물 (단일 플레이트 콜로니로부터 생성)을 사용하여 50 ㎍/mL의 카나마이신을 함유하는 LB 배지 1 리터를 접종하였다. 배양물을 0.6-1.0의 A600까지 37℃로 성장시켰다. 1 mM의 이소프로필-β-티오갈락토시드 (IPTG)를 도입한 후, 배양물을 30℃에서 다시 4시간 동안 성장시키고, ≥10,000×g, 4℃에서의 30분 동안의 원심분리에 의해 수확하였다. -80℃에서 세포 펠릿을 냉동시켰다. 얼음 상에서 울트라-투락스 균질화기 (이카 웍스(IKA works) 사)를 사용하여 세포 펠릿을 25 mL의 용해 완충제 (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1x 콤플리트™ 프로테아제 억제제 칵테일-EDTA 프리 (로슈 사), pH 7.4)에 재현탁하였다. 모델 M-110S 마이크로플루이다이저 (마이크로플루이딕스(Microfluidics) 사)를 사용한 고압 균질화 (≥18,000 psi)에 의해 세포 용해를 완성하였다. 23,300×g, 4℃에서의 30분 동안의 원심분리에 의해 가용성 분획을 분리하였다. 0.45 ㎛ 필터를 통하여 상청액을 정화하였다. 정화된 용해물을 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4로 사전-평형화된 히스트랩(HisTrap) 칼럼 (지이 사)에 적재하였다. 다음에, 25배 칼럼 부피의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4, 이어서 20배 칼럼 부피의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 25 mM 이미다졸 pH 7.4, 및 이후의 35배 칼럼 부피의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 40 mM 이미다졸 pH 7.4를 사용하여 칼럼을 세척하였다. 15배 칼럼 부피의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 500 mM 이미다졸 pH 7.4를 사용하여 단백질을 용리하고, A280에서의 흡광도를 기준으로 분획을 수집한 후, 1x PBS, 50 mM 트리스, 150 mM NaCl pH 8.5 또는 50 mM NaOAc; 150 mM NaCl; pH 4.5에 대하여 투석하였다. 모든 침전물을 0.22 ㎛에서의 여과에 의해 제거하였다.
중간규모 발현 및 정제는 가용성 형태로 발현되며 박테리아 시토졸의 가용성 분획으로부터 정제되는 고순도이며 활성인 애드넥틴™을 산출하였다. 100 mM NaPO4, 100 mM NaSO4, 150 mM NaCl, pH 6.8 (지이 헬스케어 사)을 이동상으로 하는 수퍼덱스 200 또는 수퍼덱스 75 10/30GL에서의 SEC 분석으로써, 주로 단량체성 애드넥틴™임이 확인되었다.
SABA1 .2의 제제
예비 제제 스크린용으로 일 특정 SABA인 SABA1.2 (서열 80)를 선택하였다. SABA1.2는 10Fn3의 "코어 1" 서열에 (ED)5 연장체를 포함한다. SABA1.2의 경우, pH 6.0 및 5 mg/mL의 생성물 농도에서 10 mM 숙신산, 8% 소르비톨, 5% 글리신의 안정한 제제가 확인되었다. 이와 같은 제제에서, 1.25 mg/mL의 단백질 농도를 사용하여 시차 주사 열량법 (DSC)로 측정하였을 때, 단백질 용융 온도는 75℃이었다. 4℃ 및 25℃에서, 1.2%의 개시 응집물 농도로써, 제제는 만족스러운 물리 및 화학적 안정성을 제공하였다. 1개월의 안정성 후에, 응집물 수준은 매우 낮았다 (4℃에서 1.6% 및 25℃에서 3.8%). 이와 같은 제제에서, 단백질은 -80℃ 및 -20℃로부터 주변 온도로의 전이와 같은 5회 주기의 냉동-해동 후에도 안정하였다. 또한, 이와 같은 제제에서, SABA1.2는 4℃ 및 주변 온도에서 침전 또는 응집의 증가 없이 20 mg/mL 이상의 단백질 농도까지 가용성이었다.
실시예 A3. 후보 SABA 의 생물물리학적 특성화
크기 배제 크로마토그래피
중간규모 과정으로부터 생성된 후보 SABA에 대하여 표준 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 수행하였다. A214 nm 및 A280 nm에서의 UV 검출 및 형광 검출 (여기 = 280 nm, 방출 = 350 nm)을 동반하는 애질런트 1100 또는 1200 HPLC 시스템 상의 수퍼덱스 200 10/30 또는 수퍼덱스 75 10/30 칼럼 (지이 헬스케어 사)을 사용하여 중간규모화 물질의 SEC를 수행하였다. 적절한 SEC 칼럼 유량의 100 mM 황산나트륨, 100 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 6.8 완충제를 사용하였다. 분자량 보정에는 겔 여과 표준 (바이오-래드 래보래토리즈 사, 캘리포니아 허큘레스 소재)을 사용하였다.
중간규모 정제 SABA에 대한 SEC의 결과는 주로 단량체성인 애드넥틴™으로 나타났으며, 구체 겔 여과 표준 (바이오래드 사) 대비 대략 10 kDa 범위에서의 용리를 나타내었다.
열안정성
중간규모화 SABA의 시차 주사 열량법 (DSC) 분석을 수행하여 그의 각 Tm을 측정하였다. N-DSC II 열량계 (칼로리메트리 사이언시즈 코포레이션(Calorimetry Sciences Corp) 사)에서 3 atm 압력하에 분 당 1 도의 속도로 5℃에서 95℃의 온도 구배에 의해 1 mg/ml의 용액을 스캐닝하였다. 오리진 소프트웨어(Orgin Software) (오리진랩 코포레이션(OrginLab Corp) 사)를 사용한 최고 적합도(best fit)를 사용하고 적절한 완충제의 대조 전개에 대비하여 데이터를 분석하였다. SEC 및 DSC 분석의 결과를 표 4에 요약하였다.
<표 4>
Figure 112012099393820-pct00062
실시예 A4. 혈청 알부민에 결합하는 후보 SABA1 의 특성화
비아센서(Biasensor) CM5 칩의 표면상에 각 혈청 알부민 (HSA/RhSA/MuSA)을 고정하고, 참조 유동 세포 및 고정된 알부민 모두 상에 일련 농도의 SABA를 유동시킴으로써, HTPP로부터 정제된 선택된 SABA 클론 및/또는 실시예 A1 및 A2에 기술되어 있는 중간규모화 물질의 동역학을 측정하였다. 또한, pH 5.5 내지 pH 7.4 범위의 다양한 pH 조건하에서 알부민에 대한 결합을 수행하였다. HSA-결합성 애드넥틴™인 SABA2.1, SABA3.1, SABA4.1 (SABA5.1) & SABA1.1은 RhSA와는 교차 반응하였으나, MuSA와는 교차 반응하지 않았다. SABA2 및 SABA4 결합은 pH 민감성이었던 반면, 클론 SABA3은 아래로 pH 6.0까지 HSA에 대하여 pH 저항성 결합성으로 나타났다. SABA1.1은 아래로 pH 5.5까지 pH 저항성 및 친화도/동역학에 대한 생화학적 기준을 충족하였다.
비아코어에 의해 도메인 맵핑(mapping)을 확인하였다. 비아센서 CM5 칩의 표면상에 HSA, 또는 HSA-도메인 I & II 또는 HSA-도메인 III만으로 구성되는 구축물을 고정하고, 참조 유동 세포 및 고정된 알부민 모두 상에 일련 농도의 SABA를 유동시킴으로써, HTPP로부터 정제된 선택된 SABA 클론 및/또는 중간규모화 물질을 측정하였다. 클론 SABA2 및 SABA1은 HSA 및 HSA-도메인 I-II 구축물에는 결합되었으나, HSA-도메인 III 구축물에는 결합되지 않았다. 클론 SABA3 및 SABA4는 HSA에는 결합되었으나, HSA-도메인 I-II 또는 HSA-도메인 III 구축물 중 어느 하나에는 결합되지 않았다. 결과를 표 5에 요약하였다.
<표 5>
Figure 112012099393820-pct00063
실시예 A5. 후보 SABA 의 생체내 t 1 /2 조사
HSA-결합성 애드넥틴™은 MuSA와 교차 반응하지 않으므로, 마우스에서의 HSA-결합성 애드넥틴™의 평가를 가능케 하기 위하여, 마우스에서의 HSA의 반감기를 측정하였다. 대략 6주령의 Ncr 누드 암컷 마우스의 꼬리 정맥에, 20 mg/kg (도 1a) 및 50 mg/kg (도 1b) 용량으로 HSA를 주사한 후, 주사-후 일정 간격으로 채취된 혈액 샘플 중 HSA의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 윈논린(WinNonlin) 소프트웨어 및 비-구획 모델링을 사용하여, 20 mg/kg 및 50 mg/kg으로 마우스에 주사된 HSA의 t1 /2을 각각 ~24시간 및 ~20시간까지 측정하였다.
마우스에서의 SABA1 -4의 반감기 측정
HSA 결합성 클론인 SABA1.1, SABA2.1, SABA3.1, 및 SABA4.1의 이. 콜라이 성장물 1 리터를 제조하여, 정제한 후, 내독소를 제거하였다. 각 SABA 변이체를 HSA와 함께 또는 그것 없이 마우스의 꼬리 정맥에 주사하고, 혈장 샘플에서의 애드넥틴™을 검출하도록 개발된 정량 ELISA-기반 검정을 사용하여 주사-후 일정 간격으로 채취된 혈액 샘플 중 농도를 측정하였다. 윈논린 소프트웨어와 함께 비-구획 모델링을 사용하여 각 애드넥틴™의 약동학적 파라미터들을 측정하였다.
대략 6주령인 Ncr 누드 암컷 마우스에서, HSA의 존재 또는 부재하에 각 SABA의 약동학적 프로필을 비교하였다. 결합성 클론이 HSA 및 RhSA에 대하여 선택적이고 마우스 혈청 알부민에는 결합되지 않기 때문에, HSA와 공동-주사된 마우스는 각 SABA와 사전혼합된 (HSA가 3-4 몰 과량) HSA를 가졌다. 마우스 혈장에서의 SABA1.1의 반감기는 0.56시간이었던 반면, HSA와 공동-주사된 SABA1.1의 반감기는 5.6시간으로써, 반감기가 ~10배 증가하였다 (도 2a). 마우스 혈장에서의 SABA2.1의 반감기는 0.24시간이었던 반면, HSA와 공동-주사된 SABA2.1의 반감기는 2.8시간으로써, 반감기가 ~12배 증가하였다 (도 2b). 마우스 혈장에서의 SABA3.1의 반감기는 0.28시간이었던 반면, HSA와 공동-주사된 SABA3.1의 반감기는 0.53시간으로써, 반감기가 ~2배 증가하였다 (도 2c). 마우스 혈장에서의 SABA4.1의 반감기는 0.66시간이었던 반면, HSA와 공동-주사된 SABA4의 반감기는 4.6시간으로써, 반감기가 ~7배 증가하였다 (도 2d). 본 샘플의 요약을 도 3에 나타내었다. SABA1.1, SABA2.1, SABA3.1, SABA4.1 및 SABA5.1에 대한 유사한 데이터를 표 6에 요약하였으며; 가용할 경우 시노몰구스(cyno)에서의 반감기와 비교하였다.
<표 6>
Figure 112012099393820-pct00064
시노몰구스 원숭이 에서의 SABA1 .1 및 SABA5 .1의 반감기 측정
2마리의 시노몰구스 원숭이에서 kg 당 1 mg (mpk) IV 용량에서의 약동학을 평가하기 위하여, SABA1.1 (도 4a) 및 SABA5.1 (도 4b) 개념 연구의 3주 단일 용량 시험을 시노몰구스 원숭이에서 수행하였다. 약동학은 혈장 샘플에서 애드넥틴™을 검출하기 위하여 개발된 정량 ELISA-기반 검정을 사용하여 평가하였다. SABA1.1은 96-137시간 범위의 반감기를 가졌다 (도 4a 및 표 7). SABA5.1은 대략 12시간의 반감기를 가졌으며, 120시간까지만 ELISA에서 측정가능하였다 (도 4b 및 표 8). SABA1.1에 대한 데이터를 표 7에 요약하였으며, SABA5.1에 대한 데이터는 표 8에 요약하였다.
<표 7>
Figure 112012099393820-pct00065
<표 8>
Figure 112012099393820-pct00066
실시예 A6. 혈청 알부민에 결합하는 SABA1 의 특성화
SABA1 .1 및 1.2는 HSA 및 RhSA 에 결합된다
(ED)5 연장체를 포함하는 "코어 1" 10Fn3인 SABA1.2 (서열 90)는 중성 pH 및 25℃에서 55.3 nM의 계산 평균 KD에 대하여 8.21E+03 M-1s-1의 평균 결합 속도 상수 (ka) 및 4.43E-04 s-1의 평균 해리 속도 상수 (kd)로 인간 혈청 알부민 (HSA)에 결합되었다 (표 9). 레서스 혈청 알부민 (RhSA)의 경우, 측정되는 평균 결합 속도 상수는 6.6E+03 M-1s-1이었으며, 해리 속도 상수는 3.78E-03 s-1로써, 580 nM의 계산 평균 KD를 산출하였다. SABA1.2와 마우스 또는 래트 혈청 알부민 사이의 측정가능한 상호작용은 1 μM까지 관찰할 수 없었다 (표 9 및 도 5). 37℃에서, ka 및 kd는 2 내지 5배 사이로 증가함으로써, HSA에 대한 친화도의 ~2배 증가 및 RhSA에 대한 친화도의 1/2로 이어졌다 (표 9).
<표 9>
Figure 112012099393820-pct00067
또한, SABA1과 HSA 사이의 화학량론을 측정하기 위하여, 열량계 적정을 수행하였다. 이와 같은 연구에는, His6 연장체를 포함하는 "코어 1" 10Fn3인 SABA1.1 (서열 89)을 사용하였다. HSA (115 μM의 단백질 용액 주사 당 10 μl)를 8.1 μM의 농도로 SABA1.1을 함유하는 열량계 셀에 주사하였다. 실험은 pH 7.4의 PBS 완충제 중에서 37℃로 수행하였다. 도 6은 SABA1.1이 1:1의 화학량론으로 HSA에 결합됨을 보여준다.
SABA1 .2는 낮은 pH 에서 강력하게 HSA 에 결합된다
알부민의 긴 반감기 (예컨대 HSA의 t1 /2은 19일임)는 많은 부분이 엔도솜 내에 존재하는 낮은 pH 조건하에서는 그것이 신생아 Fc 수용체인 FcRn에 결합됨으로써 세포내이입 경로로부터 재순환된다는 사실로 인한 것이다. 표 10에 나타낸 바와 같이, SABA1.2는 5.5의 엔도솜 pH에서는 강력하게 HSA에 결합됨으로써, 일단 HSA에 결합하고 나면, SABA1의 t1 /2 역시 FcRn 재순환 기작으로부터 이익을 얻게 된다는 것을 암시한다.
<표 10>
Figure 112012099393820-pct00068
SABA1 .2는 HSA 의 도메인 I 및 II 에는 결합되나 , 도메인 III 에는 결합되지 않는다
재조합 HSA 단편을 사용하여 알부민에 대한 SABA1.2 결합 부위를 N-말단 도메인 I 또는 II에 맵핑하였는데, 도메인 III에 대해서는 검출가능한 결합을 가지지 않았다 (도 7). 도메인 III는 주로 FcRn과 상호작용하는 HSA의 도메인이므로, SABA1.2가 FcRn에 대한 HSA 결합에 대하여 경쟁하게 될 가능성은 작고, 이것은 반감기를 향상시키기 위하여 재순환 기작을 크게 활용할 가능성을 증가시킨다.
실시예 A7. SABA1 .2의 생체내 약리학
2종의 상이한 용량 수준에서 약동학을 평가하기 위하여, 시노몰구스 원숭이에서 SABA1.2의 4주 단일 용량 예비-독성학(pre-toxicology) 연구를 수행하였다. 정맥내 및 피하 투여의 팔 모두를 포함한 3주의 단일-용량 예비-독성학 연구에서는 약동학 및 생체이용률도 평가하였다. 이들 연구 각각에서는, 윈논린 소프트웨어를 동반한 비-구획 모델링과의 조합으로써, 혈장 샘플에서의 SABA1.2를 검출하기 위하여 개발된 정량 ELISA-기반 검정을 사용하여 SABA1.2의 약동학을 평가하였다.
SABA1.2를 1 mpk 및 10 mpk IV로 원숭이에 투여하였다. 윈논린 소프트웨어를 사용한 비-구획 분석을 수행하여 약동학 파라미터들을 평가하였다. 도 20 및 하기의 파라미터들에 나타난 바와 같이, SABA1.2는 이와 같은 연구에서 농도-시간 곡선하 면적 (AUC) 평가에 의해 측정하였을 때 용량-의존성 약동학을 나타내었다. 10 mpk에서의 SABA1.2에 대한 청소율(clearance) (CL)은 0.15 mL/h/kg이었으며, 베타 단계 반감기 (t1 /2)는 143시간이었고, 분포 용적(volume of distribution) (Vz)은 30 mL/kg이었으며, 총 약물 노출 (AUCall)은 5,609,457 시간*nmol/L이었다 (표 11). 1 mpk에서의 SABA1.2에 대한 청소율 (CL)은 0.4 mL/h/kg이었으며, 반감기 (t1 /2)는 124시간이었고, 분포 용적 (Vz)은 72 mL/kg이었으며, 총 약물 노출 (AUCall)은 214,636 시간*nmol/L이었다 (표 11).
SABA1.2의 SC 또는 IV 투여 후, 베타-단계 약동학 프로파일
은 유사하였다 (도 9). 1 mpk IV에서의 SABA1.2에 대한 청소율 (CL)은 0.22 mL/h/kg이었으며, 베타 단계 반감기 (t1 /2)는 125시간이었고, 분포 용적 (Vz)은 40 mL/kg이었으며, 총 약물 노출 (AUCall)은 357,993 시간*nmol/L이었다 (표 11). 1 mpk SC에서의 SABA1.2에 대한 청소율 (CL)은 0.32 mL/h/kg이었으며, 베타 단계 반감기 (t1 /2)는 134시간이었고, 분포 용적 (Vz)은 62 mL/kg이었으며, 총 약물 노출 (AUCall)은 251,339 시간*nmol/L이었다 (표 11). IV에 비교한 SC 대비 생체이용률 (F)은 0.7이었다.
<표 11>
실시예 A8. SABA1 .2와의 복합체에서의 인간 혈청 알부민의 구조
프로테로스 바이오스트럭쳐(Proteros Biostructures) GmbH 사에 의해 100 mM Na-아세테이트, pH 4.75, 100 mM NaCl, 및 28% PEG200으로부터, 인간 혈청 알부민과 SABA1.2의 복합체를 결정화하였다. 자유 탑재 시스템(Free Mounting System) (FMS)을 사용하여 결정으로부터의 회절을 최적화하고, 오일하에서 급속-냉각하였다.
결정을 100 K로 유지하면서 스위스 라이트 소스 빔라인(Swiss Light Source beamline) PXI/X06SA에서 프로테로스 바이오스트럭쳐 GmbH 사에 의해 데이터를 수집하였다. 파장은 1.0015 Å이었으며, 검출기는 필라투스(Pilatus) 6M (덱트리스(Dectris) 사)이었다. XDS 및 XSCALE을 사용하여 데이터를 처리하여 (문헌 [W. Kabsch (2010), XDS. Acta Crystallogr . Sect. D 66, 125-132]; [W. Kabsch (2010), Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement, Acta Crystallogr . Sect . D 66, 133-144]), 하기의 통계를 산출하였다: 공간 군(Space Group): P212121; 단위 셀: a = 61.6 Å; b = 124.1 Å; c = 100.0 Å.
<표 12>
Figure 112012099393820-pct00070
인간 혈청 알부민의 구조를 분자 치환에 대해서는 프로그램 몰렙(MOLREP)을 (문헌 [Vagin, A., & Teplyakov, A. (1997), MOLREP: an Automated Program for Molecular Replacement. J. App . Crystallogr ., 30, 1022-1025]) 사용하고, 서치 모델로서 PDB 엔트리(entry) 1BM0을 사용하여 측정하였다. 애드넥틴 요소의 구조는 분자 치환 프로그램 페이서(PHASER)를 사용하여 (문헌 [A.J. McCoy, R.W. Grosse-Kunstleve, P.D. Adams, M.D. Winn, L.C. Storoni & R.J. Read (2007), Phaser Crystallographic Software, J. Appl . Crystallogr. 40, 658-674]) PDB 엔트리 1FNF 잔기 1423-1502 기반 서치 모델로부터 측정하였다.
모델의 정리는 버스터(BUSTER)/TNT를 사용하여 (문헌 [Blanc, E., Roversi, P., Vonrhein, C., Flensburg, C., Lea, S.M. & Bricogne, G. (2004), Refinement of severely incomplete structures with maximum likelihood in BUSTER/TNT, Acta Crystallogr. Sect . D 60, 2210-2221]) 수행하였으며, 모델 구축은 쿠트(COOT)를 사용하여 (문헌 [Emsley, P. & Cowtan, K. (2004), Coot: model-building tools for molecular graphics, Acta Crystallogr Sect . D 60: 2126-2132]; [Emsley, P., Lokhamp, B., Scott, W.G. & Cowtan, K. (2010), Features and Development of Coot, Acta Crystallogr Sect . D 66: 486-501]) 수행하였다. 디스플레이용 도면은 PyMol을 사용하여 (문헌 [DeLano, W.L. (2002), The PyMol Molecular graphics System, DeLano Scientific, San Carlos, CA, US]; 월드 와이드 웹 pymol.org에서 이용가능함]) 작성하였다.
최종 정련 단계에서 하기 표 13에 나타낸 통계를 산출하였다.
<표 13>
Figure 112012099393820-pct00071
구조의 설명
SABA1.2에 대한 결합 부위는 전적으로 인간 혈청 알부민 (HuSA)의 도메인 1에 있다 (도 17A 및 B). 하기의 HuSA 잔기들이 애드넥틴과 접촉되었다 (번호지정은 성숙한 HuSA 서열 기준이며, 신호 및 프로펩티드 영역은 생략): Pro 35, Phe 36, Glu 37, Pro 113, Arg 114, Leu 115, Arg 117, Pro 118, Glu 119, Val 122, Met 123, Phe 134, Lys 137, Tyr 140, Glu 141, Arg 144, Arg 145, 및 Tyr 161 (문헌 [Sheriff, S., Hendrickson, W.A. & Smith, J.L. (1987), Structure of Myohemerythrin in the Azidomet State at 1.7/1.3 Å Resolution, J. Mol . Biol. 197, 273-296]; [Sheriff, S. (1993), Some methods for examining the interactions between two molecules, Immunomethods 3, 191-196]). 상호작용하는 잔기에 대한 더 넓은 정의는 적어도 부분적으로 매몰되어 있으며, 접촉되는 것으로 상기에 목록화되어 있는 잔기 이외에 포함되는 것들로써, 하기의 잔기들일 수 있다: Asp 38, Thr 125, Ala 126, Asp 129, Thr 133, Tyr 138, 및 Leu 182.
애드넥틴은 BC, DE, 및 FG 루프를 통하여 상호작용하며, HuSA와 접촉되는 하기의 잔기들을 가진다: His 25, Ser 26, Tyr 27, Glu 29, Gln 30, Asn 31, Pro 53, Tyr 54, Ser 55, Thr 57, Tyr 78, Tyr 83, 및 Tyr 84 (SABA1.2, 예컨대 서열 90의 것). 전기에 목록화되어 있는 잔기들 이외에도, 하기의 잔기들이 적어도 부분적으로 상호작용에 의해 매몰되어 있다: Trp 24, Ser 32, Tyr 33, Gln 56, Gly 79, 및 Lys 81 (SABA1.2, 예컨대 서열 90의 것).
실시예 A9. SABA 안전성 연구의 단계 I 설계
건강한 남성 지원자에서의 SABA1.2 정맥내 투여의 단계 1, 부분 맹검, 위약-대조 약동학 연구가 수행될 것이다. 지원자들은 최근에 처방약 또는 비처방 약제를 사용한 치료를 받은 적이 없으며 건강 및 장기 기능에 대한 프로토콜 규정 제한을 충족하는 18 내지 60세 연령의 건강한 성인 남성 대상체일 것이다. SABA1.2는 인간 혈청 알부민 (HSA)에 대하여 결합 친화도를 갖는 비-치료적 애드넥틴이다. 그것은 별도의 치료용 애드넥틴 또는 아닐 경우 빠르게 제거될 기타 단백질과 단일 폴리펩티드 사슬로 통합되었을 때, 혈청 반감기 (T-절반)를 연장하기 위한 알부민 바인더로서 작용하게 된다. 대상체 코호트는 총 2회 약물 투여 동안 매 2주마다 1회 0.1, 0.3 또는 1.0 mg/kg의 SABA1.2 또는 위약을 사용하여 치료될 것이다.
연구 설계. 자원자 대상체는 SABA1.2 또는 위약 중 어느 하나를 투여받도록 무작위화될 것이며, 14일 간격으로 해당 무작위화 치료의 2회 용량을 투여받게 되는데, 매번 1-시간 주입후 2-주간의 샘플 수집 및 관찰 기간이 이어지고; 2차 관찰 기간 후에는, 대상체에 대하여 안전성을 위한 추가 4주가 이어지게 된다. 치료 (SABA1.2 또는 위약)는 1일차 및 15일차에 투여될 것이다.
점증하는 SABA1.2 용량 수준으로 3개의 순차 코호트가 모집될 것이다. 각 개별 용량 코호트는 추가로 부분적 맹검 (대상체 및 조사 요원은 주입물의 정체에 대하여 맹검일 것이며; 약사는 맹검이 아닐 것임) 방식으로 SABA1.2 또는 위약 중 어느 하나에 순차적으로 노출되는 3개의 하위군으로 분할될 것이다 (도 18 참조). 위험을 최소화하기 위하여, 각 코호트의 첫 번째 하위군은 1종의 활성 약물 처리된 대상체만을 포함하게 될 것이다.
코호트 1의 모든 대상체가 해당 29일차 방문을 완료하고, PK 탐색이 평가된 후 (4 주까지 예상)에는, 규정된 부작용 비관찰 수준(no observed adverse event level) (NOAEL)을 능가하는 기준이 코호트 1에서 충족되지 않았다는 가정하에 코호트 2가 연구를 시작할 것이다 (하기 참조). 마찬가지로, 코호트 3은 코호트 2의 완료 및 PK 평가 후, NOAEL이 능가되지 않았다는 가정하에 시작될 것이다.
NOAEL은 a) 2인 이상의 활성 치료된 (비-위약) 대상체가 국립 암 연구소(National Cancer Institute) (NCI; US)-유해 사례에 관한 일반적 용어 기준(Common Terminology Criteria for Adverse Events) (CTCAE v4.03) SABA1.2-관련 독성의 임의 등급 2를 겪거나, 또는 b) 1인 이상의 활성 치료된 대상체가 ≥3의 SABA1.2-관련 독성 임의 등급을 겪는 것 중 어느 하나인 최저 용량 수준 미만의 용량 수준 1 수준으로 규정될 것이다. 이들 기준 중 어느 것도 충족되지 않을 경우, NOAEL은 완료된 최고 용량 수준이 될 것이다. 코호트 2 또는 3에서 NOAEL 기준이 능가되는 경우, 다음으로 더 낮은 코호트가 NOAEL로 지정될 것이며, 나머지 모든 대상체들은 NOAEL에서 치료됨으로써, 총 37명의 대상체 (28명은 SABA1.2를 투여받고, 9명은 위약을 투여받음)이 연구에서 치료될 것이다. 이는 약동학 (PK) 및 면역원성 평가를 뒷받침하고, 적정한 수의 대상체가 안전성으로 관찰되도록 뒷받침하기 위하여 탐색되는 통계적 정밀도를 유지하기 위한 것이다. 코호트 1의 용량 수준이 NOAEL을 초과하는 것으로 발견될 경우라면, 투여되는 추가 대상체가 없을 것이며, 연구는 종료될 것이다.
연구 평가 및 일차 종료점 . 연구의 일차 종료점은 PK가 될 것이며, 모든 용량에 대한 평균 T-절반, 최대 혈장 농도 (Cmax), 전신적인 청소율 (CL), 투여로부터 투여 간격 종료까지까지의 농도-시간 곡선하 면적 (AUCtlast), 및 정상 상태에서의 분포 용적 (VSS)이 포함될 것이다. 연구 1 및 15 일차의 각 주입 개시 전, 그리고 0.5 (주입-중간), 1 (주입 종료), 1.5, 2, 3, 5, 7, 24, 48, 72, 96 또는 120, 및 168시간 후에, PK 분석을 위한 일련의 샘플이 수집될 것이다. 또한, 29 (15일차 투여에 이어지는 336시간 표본), 36, 43, 50, 및 57일차에, SABA1.2 혈장 농도용의 단일 무작위 샘플이 수집될 것이다.
안전성 평가에는 활력 징후, 물리적 조사, 심전도, 임상적 실험실 평가, 및 부작용이 포함될 것이다. 또한, 항약물 항체 (ADA), 자가면역의 혈청 지표 (항핵 항체 [ANA], C3, 및 C4), 그리고 임상적 관찰 (예컨대 발진, 주입 반응, 근육 또는 관절 통증 등)을 측정함으로써, 면역원성이 평가될 것이다. 임의의 관찰된 면역원성의 기작을 이해하기 위한 노력으로써, HLA 유형화 및 T-세포 자극 검정이 수행될 것이다.
통계적 방법. 25명의 대상체를 사용하며, 133.159시간 이상의 관찰된 T-절반에 대한 단일-측 95% 신뢰 구간 (CI)의 하부 경계는 120시간까지는 연장되지 않을 것이다. 25명의 활성 처리된 완료자를 얻기 위하여, 투여 코호트 당 1명의 잉여 대상체가 포함되어, 총 28명의 활성 처리 대상체가 될 것이다.
용량에 의해, 그리고 용량들에 걸쳐, 혈장 PK 파라미터에 대하여 요약 통계가 목록화될 것이다. PK 파라미터는 비-구획 방법을 사용하여 SABA1.2 혈장 농도 대 시간으로부터 유도될 것이다. 필요에 따라서는, 특성을 추가로 이해하기 위하여 구획 접근법이 사용될 수도 있다. 평균 T-절반은 95% CI에 의해 평가될 것이다. Cmax, AUCtlast, R, 및 CL에 대하여 기하 평균 및 CV가; Tmax에 대하여 중앙값 (최소, 최대)이; 그리고 기타 파라미터들에 대하여 평균 및 표준 편차가 기록될 것이다. SABA1.2의 용량 비례성이 평가될 것이다. 선형 혼합 효과 모델링을 사용하여, log-변형된 AUC 및 Cmax가 log-변형된 용량에 피팅될 것이다. 관계의 기울기에 대한 대칭적 점근 95% CI가 구축될 것이다. 95% CI에 1.0의 값이 포함될 경우, 용량 비례성으로 결론지어질 것이다. 반대로, 95% CI에 1.0의 값이 포함되지 않을 경우, 비-비례성으로 결론지어질 것이다.
안전성 결과는 용량 수준 및 전체에 의해 서술적으로 요약될 것이다.
개시 용량의 이론적 근거. 5회 투여 동안 매주 2회 투여될 때, 시노몰구스 원숭이에서의 NOEL (효과 비관찰 수준)은 30 mg/kg IV이다. 신체 표면적 면에서 표현된 용량 기준으로, 본 인간 임상 시험에서의 SABA1.2의 개시 용량 (0.1 mg/kg)은 원숭이에서의 NOEL의 100배 미만인 안전성 계수를 나타내는 반면; 본 연구에서 가장 높게 계획되는 용량 (1 mg/kg)은 10배 미만인 안전성 계수를 나타낸다. 투영된(projected) 인간 Cmax 및 AUC를 기준으로, 본 임상 연구의 개시 용량은 원숭이 NOEL에서의 15일차 원숭이 Cmax 및 AUC에 대하여 각각 대략 600배 및 200배의 안전성 계수를 나타내는 반면; 본 연구에서의 최고 계획 용량 기준으로, 투영된 인간 Cmax 및 AUC는 15일차 원숭이 파라미터들에 대하여 각각 대략 50배 및 20배의 안전성 계수를 나타낸다. 따라서, 본 연구에서는 용량 수준과 관련하여 광범위한 안전성 계수가 고려되었다.
B. FGF21 - SABA 융합 분자
실시예 B1. FGF21 - SABA 융합 분자의 제조
개관
본원에서 개시된 모든 FGF21-SABA DNA 서열들을 시중에서 입수가능한 발현 벡터인 pET29b (EMD 바이오사이언스 사, 미국 캘리포니아 샌디에고 소재)에 위치시켰다. 서열들은 플라스미드 벡터의 NDEI 및 XHOI 제한 엔도뉴클레아제 부위 사이, 리보솜 결합 부위로부터 바로 하류에 적절하게 위치되었다 (도 10).
상기 발현 벡터를 숙주 균주 BL21(DE3) (EMD 바이오사이언스 사)에 형질전환시키고, 봉입체로서 다양한 수준으로 발현시켰다. 다르게는, 그것은 "오리가미(Origami)™" (EMD 바이오사이언스 사)와 같은 이. 콜라이 균주의 산화성 균주로 형질전환될 수 있다. 후자의 숙주 균주는 티오레독신 리덕타제 (trxB) 및 글루타티온 리덕타제 (gor) 유전자 모두에 돌연변이를 포함하는데, 이들은 이. 콜라이 세포질에서 디술피드 결합 형성을 크게 향상시킨다. 적정하게 주의하면서, 표 2에 기술되어 있는 것들과 같은 다양한 FGF21-SABA 융합체들을 발현시켰다.
정제된 플라스미드 DNA 발현 벡터를 당업자에게 통상적으로 알려져 있는 표준 형질전환 방법에 의해 상기 언급된 이. 콜라이 숙주에 도입 또는 "형질전환"시켰다. 간단하게 말하자면, 시중에서 제조된 적격 세포 (EMD 바이오사이언스 사)를 얼음상에서 해동한 후, 세포가 균일하게 현탁되는 것이 보장되도록 약하게 혼합하였다. 20 μl 분취량의 이들 세포를 얼음상에서 얼음 예비-냉각된 1.5-ml 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브에 피페팅하였다. 대략 1 μl의 정제된 플라스미드 DNA (1-10 ng/μl 플라스미드)를 직접 세포에 첨가한 후, 약하게 교반하여 혼합하였다. 튜브를 얼음상에서 5분 동안 유지한 다음, 42 ℃ 수조에서 정확하게 30초 동안 가열하였다. 가열된 튜브를 즉시 얼음상에 위치시키고, 2분 동안 방치시켰다. 80 μl의 실온 SOC 또는 LB 배지를 각 튜브에 첨가하였다. 형질전환체의 선택은 pET29b 플라스미드-코딩된 약물 내성을 위하여 카나마이신을 함유하는 배지에 플레이팅함으로써 이루어졌다.
형질전환된 세포의 오버나잇 스타터(overnight starter) 배양물을 성장시킴으로써, 오리가미 2 세포주에서의 가용성 FGF21-SABA 융합 폴리펩티드의 발현을 개시하였다. 세포를 사용하여 각각 1 리터의 LB 배지 (루리아 브로스(Luria Broth) 사)를 함유하는 2 리터 진탕 플라스크를 접종하고, 250-300 RPM에서 37℃로 강하게 진탕하면서 0.6 내지 0.8의 O.D. 600 nm에 도달할 때까지 성장시켰다. 그 시점에, 0.1 mM IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드)를 첨가하여 T7 RNA 폴리머라제 유도를 개시하고, 진탕 인큐베이터의 온도를 18 ℃로 낮추었다. 12-16시간 동안 발효를 계속하고, 원심분리에 의해 세포를 수확한 후, -80℃에서 포장된 습윤 세포 페이스트로서 냉동시켰다.
형질전환된 세포의 오버나잇 스타터 배양물을 성장시킴으로써, BL21(DE3) 세포주에서의 봉입체 (IB)로서의 FGF21-SABA 융합 폴리펩티드의 발현도 개시하였다. 세포를 사용하여 각각 1 리터의 오버나잇 익스프레스(Overnight Express)™ 배지 (EMD 바이오사이언스 사, 문헌 [Nature Methods 2, 233-235, 2005])를 함유하는 2 리터 진탕 플라스크를 접종하였다. 봉입체 형성 목적의 경우, 발효 온도를 낮출 필요성은 없으며, 대신 원심분리에 의한 수확 전에 37℃에서 12-16시간 동안 세포를 성장시켰다. 수확된 세포는 -80℃에서 포장된 습윤 세포 페이스트로서 냉동시켰다.
기술된 FGF21-SABA 변이체의 정제는 사용되는 정확한 서열 변이, 및 단백질이 오리가미 세포주에서 세포액 가용성인 형태로 발현될 것인지, 또는 BL21 세포주에서 봉입체로 발현될 것인지 여부에 따라 달라진다. 방법은 또한 서열이 정제를 돕는 6x-히스티딘 태그를 함유하는지 여부에 따라 달라진다. 그러나, 일반적으로 정제 방법들은 당업자에게 친숙한 공통적인 기술들을 공유한다. 하기는 정제 방법에 대한 상세한 기술이다.
세포 용해 및 봉입체 ( IB ) 펠릿의 제조
1부의 포장된 세포 페이스트에 대하여 완충제 8-10부의 희석으로 용해 완충제에 세포를 현탁시켰다. 아베스틴(Avestin) C-5 균질화기 (아베스틴 인크. (Avestin Inc.) 사, 캐나다 온타리오 오타와 소재)를 사용하여 2000 PSI로 2회 통과시킴으로써 세포를 기계적으로 용해하였다. 용해 후, 용해물을 회전 침전시키고 (4,000 RPM으로 20-30분 동안), 가용성 분획은 폐기하였다. 봉입체 펠릿을 0.5% 트리톤 X-100으로 세척하여 세포 잔사를 제거한 후, 현탁액을 다시 원심분리하였다. 펠릿이 균질한 백색 색상으로 보일 때까지 이와 같은 과정을 반복하였다 (통상적으로 2 또는 3회). 다음에, 생성되는 풍부한 IB 조제물 몸체 펠릿을 PBS 완충제로 세척하여 과량의 세제를 제거하였다.
봉입체의 가용화
다음에, 세척 후 세제가 제거된 IB 펠릿을 50 mM 트리스-HCl pH 8.0 및 500 mM NaCl을 사용하여 완충된 6 M 구아니딘-HCl에서 가용화시켰다. 이와 같은 방식으로 제조된 대부분의 물질은 자유롭게 용액상으로 진입하지만, 소량의 세포 잔사가 잔류하므로, SS-34 로터에서 1시간 동안 16,000 RPM으로 원심분리함으로써 제거하였다. 재폴딩(refolding) 및 산화 단계를 위하여 상청액을 남겨두었다. 6xHis 태그를 포함하는 단백질 융합체 변이체는 다르게는 포획된 후, 이와 같은 단계에서 금속 킬레이트화 크로마토그래피 단계 (IMAC)를 사용하여 추가 연마될 수 있다. 무질서유발제(chaotrope) 변성 물질이 칼럼에 결합될 수 있으며, 오염물은 용리 전에 이미다졸이 보충된 변성 완충제의 존재하에 세척된다.
재폴딩 및 산화
구아니딘-HCl 가용화된 물질을 약 1 mg/mL 단백질 (280 nM에서의 흡광도에 의해 추정)까지 희석한 후, 3.5 MWCO 투석 관에 위치시켰다. 다음에, 투석 장치 내의 샘플을 4℃에서 약하게 교반하면서 밤새 4 L의 재폴딩 완충제 (50 mM 트리스, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 9.0)에서 부유시켰다. 투석 재폴딩 완충제는 다음날 아침에 새로운 재폴딩 완충제로 교체된다. 이와 같은 과정 동안, 융합 단백질 FGF21 도메인의 디술피드 가교는 용이하게 공기 산화된다. 이와 같은 단순 투석법은 편리하며, 필요에 따라서는 수개의 샘플이 한번에 처리될 수 있다. 다르게는, 단백질은 구아니딘-HCl 대신 우레아에서 변성될 수 있다. 다르게는, 재폴딩 및 산화는 염 농도를 낮추기 위하여 높은 무질서유발 염 농도로부터의 분자의 빠른 희석을 사용하여 수행될 수도 있다. 공기 산화 대신, 시스템은 다르게는 환원 및 산화 글루타티온 (GSH/GSSG)의 한정된 산화환원 혼합물을 사용하여 재폴딩될 수 있다.
다르게는, 자유 확산 상에서 상기한 바와 같은 투석 또는 빠른 희석을 통하여 해당 단백질을 재폴딩하는 대신, 크로마토그래피 수지 지지체에 결합되어 있는 동안 그것이 재폴딩될 수도 있다. 이와 같은 방법은 종종 장점 및 향상된 수율을 갖는데, 그것이 대량 응집 및 수율 손실로 이어질 수 있는 재폴딩 단계 동안의 단백질 상호작용을 최소화하기 때문이다.
침전물의 제거
이러한 조건하에서의 리폴드 및 산화 단계의 종결시, 모든 단백질이 가용성으로 유지되는 것은 아니다. 일부 분자는 응집된 상태로 존재하며, 침전물로서 용이하게 용액으로부터 탈락한다. 그것은 SS-34 로터에서의 16,000 RPM으로 1시간 동안의 원심분리를 통하여, 그리고 다음에 통상적으로 크로마토그래피 전에 0.2 ㎛ 주사기 필터를 통하여 여과시킴으로써 제거되었다.
크로마토그래피 분리
재폴딩된 FGF21-SABA 융합체는 리소스(Resource) Q 또는 유사 이온 교환 매질 시스템 (지이 헬스케어 사, 뉴저지 피스카타웨이 소재)의 사용을 통해 DNA 및 기타 오염물을 제거하기 위하여 연마될 수 있다. 40 mL 리소스 Q 칼럼을 재폴딩 완충제 (50 mM 트리스 pH 9.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 포함)에서 평형화하고 정화한 후, 재폴딩되는 물질을 칼럼으로 통과시킨다. 이러한 조건하에서, 대부분의 FGF21-SABA 변이체는 결합없이 수지 상을 통과한다. 세척된 봉입체로부터의 DNA 및 기타 세포 잔사는 칼럼 수지상에 유지된다. 6xHis 태그를 포함하는 폴딩된 단백질 융합체 변이체들은 다르게는 이 시점에 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 단계를 사용하여 포획된 후, 이미다졸 또는 히스티딘의 구배를 사용하여 용리될 수 있다.
농도
다음에, 첫 번째 크로마토그래피 단계에서 풍부화된 단백질 샘플은 펠리콘(Pellicon)® XL 장치 및 랩스케일(Labscale)™ 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템 (밀리포어 인크.(Millipore Inc.) 사, 매사추세츠 빌레리카 소재)을 사용하여 대략 4 mg/mL까지 농축된다.
크기 배제 크로마토그래피
다음에, ~4 mg/mL의 FGF21-SABA 융합체 샘플을 PBS 완충제 pH 7.2에서 예비-평형화된 26/60 세파크릴(Sephacryl) S100 또는 26/60 수퍼덱스 75 크기 배제 칼럼 (지이 헬스케어 사, 미국 뉴저지 피스카타웨이 소재)을 사용하여 추가로 정제하였다. 단량체성 단백질 융합체에 해당하는 샘플을 수집하고, 필요에 따라서는 -80℃에서의 냉동 전에 1-2 mg/ml까지 샘플을 희석하였다. 이와 같은 방법을 사용하여, 원래의 자동-유도 배지 생산 봉입체 100 mL 당 20 mg까지의 FGF21-SABA 융합체가 정제될 수 있다.
실시예 B2. 혈청 알부민에 결합하는 FGF21 - SABA 융합체의 특성화
마이크로칼(Microcal) VP-ITC 기기 (마이크로칼 인크.(Microcal Inc.) 사, 미국 매사추세츠 암허스트 소재)에서 등온 적정 열량법(Isothermal Titration Calorimetry)을 사용하여 인간 혈청 알부민에 대한 FGF21-SABA 융합체 변이체들의 결합 능력 및 열역학적 특성화를 수행하였다. 또한, 비아코어 T100 기기 (지이 헬스케어 인크 사, 뉴저지 피스카타웨이 소재)에서 인간 혈청 알부민 (HSA, 시그마 #A3782, 미국 미주리 세인트 루이스 소재), 시노몰구스 원숭이 혈청 알부민 (CySA, 이퀴테크-바이오(Equitech-Bio) #CMSA, 미국 텍사스 케르빌 소재), 및 뮤린 혈청 알부민 (MuSA, 시그마 #A3559)에 대한 FGF21-SABA1 융합체 변이체의 결합 능력 및 동역학적 특성화를 수행하였다. 상세한 실험 조건을 하기에 기술하였다.
열량법 검정에는, FGF21-SABA 변이체 SABA1-FGF21v1 (서열 132)을 사용하였다. 37℃에서의 대표적인 적정 곡선을 도 11에 나타내었는데, KD는 3.8 nM인 것으로 계산되었다. SPR 연구를 위해서는, SABA1-FGF21v1 및 SABA1-FGF21v3 (서열 134)를 조사하였다. 인간으로부터의 혈청 알부민 (HSA), 시노몰구스 원숭이 (CySA) 및 뮤린 (MuSA)에의 1000, 500, 250, 125, 및 62.5 nM 융합체의 결합에 대한 SPR 센소그램 데이터를 도 12에 나타내었다. 표 14에는 HSA, CySA, 및 MuSA에의 이들 융합체의 결합에 대한 동역학적 데이터를 요약하였다.
<표 14>
Figure 112012099393820-pct00072
상세한 프로토콜
등온 적정 열량법
실험을 위한 적당한 용매 적합성을 확보하기 위하여, 정제된 SABA1-FGF21 융합 단백질 및 시중에서 제조된 인간 혈청 알부민 (HSA, 시그마 #A3782, 미국 미주리 세인트 루이스 소재)을 별도의 3,500 MW 투석 백에서 PBS 완충제 (10 mM 인산나트륨, 130 mM 염화나트륨, pH 7.1)에 대하여 투석하였다. SABA-FGF21 융합체 단백질 더하기 완충제를 단백질 0.4 내지 1.0 mg/mL의 농도 범위로 기기 샘플 셀에 위치시켰다. 적합 완충제를 참조 셀에 위치시켰다. 순수 단백질의 단백질 서열로부터 계산된 흡광 계수를 사용하여 농도를 측정하였다. 기기 반응 셀을 37℃로 평형화하였다. 주사용 주사기로부터 반응 셀로 각각 10 μl의 반복 주사를 수행하고, HSA 몰 당 과량의 열을 모니터링하였다. 수득된 데이터 세트를 기준선-차감하고, 셀에 주사된 HSA의 희석열에 대하여 보정하였다. 오리진™ 평가 소프트웨어 패키지 (마이크로칼 인크. 사) 버전 2.0.2를 사용하여 생성된 열분석도 데이터를 피팅함으로써, 단백질-단백질 결합 반응의 화학량론, 엔탈피, 및 평형 해리 상수 (KD)를 평가하였다.
표면 플라스몬 공명
혈청 알부민을 10 mg/ml의 농도로 PBS 완충제 (10 mM 인산나트륨, 130 mM 염화나트륨, pH 7.1)에 용해시키고, 이어서 고정을 위하여 10 mM 아세트산나트륨 pH 5.0에 8-10 ㎍/ml로 희석하였다. HBS-EP+ 전개 완충제에서 25℃로 표준 에틸(디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)/N-히드록시숙신이미드 (NHS) 화학을 사용하여 일반 제조자 지침에 따라 혈청 알부민을 시리즈(Series) S CM5 센서 칩에 고정하였다. 유동 셀 1은 EDC/NHS를 사용하여 활성화하고, 에탄올아민을 사용하여 차단하였다. 유동 셀 2, 3 및 4는 각각 EDC/NHS로 활성화한 후, 이어서 8-10 ㎍/ml의 혈청 알부민을 고정하고, 에탄올아민을 사용하여 차단함으로써, 700 RU HSA (유동 셀 2), 1100 RU CySA (유동 셀 3), 및 1050 RU MuSA (유동 셀 4)의 표면 밀도를 달성하였다. 0.05%의 트윈-20 (전개 완충제)를 함유하는 PBS 완충제에서 25℃ 또는 37℃ 중 어느 하나로 동역학 실험을 수행하였다. PBS pH 7.2 중 SABA1-FGF21v3 (15.3 μM) 또는 SABA1-FGF21v1 (40.6 μM)의 모액을 PBS 전개 완충제를 사용하여 1 μM로 희석한 후, 이어서 연속 희석함으로써 (2:1), 단백질에 대하여 1.0 μM, 0.5 μM, 0.25 μM, 0.125 μM, 0.063 μM의 일련 농도를 생성시켰다. 이 샘플들을 420초의 해리 시간을 사용하여 300초 동안 30 μl/분 또는 60 μl/분의 유량으로 유동 셀 1-4에 대하여 주사함으로써, 질량 이동 한계를 점검하였다. 2 펄스의 10 mM 글리신 pH 2.0을 사용하여 30 μl/분으로 30초 동안 모든 표면을 재생하였다. 유동 셀 2, 3 또는 4 데이터로부터 유동 셀 1 데이터를 차감한 다음, 각 센소그램으로부터 별도의 완충제 주기를 차감함으로써, 미가공 센소그램을 "이중-참조"하였다. 비아코어 T100 평가 소프트웨어 버전 2.0.2를 사용하여 이중-참조된 센소그램 데이터를 1:1 랑뮈르(Langmuir) 모델에 피팅함으로써, 결합 속도 상수 (ka), 해리 속도 상수 (kd), 및 평형 해리 상수 (KD)를 측정하였다.
실시예 B3. HEK -β- 클로토 세포에서의 SABA1 - FGF21 융합체의 시험관내 활성
FGF21은 β-클로토의 존재하에 ERK 인산화를 유도한다. 따라서, 본 HEK-β-클로토 검정 시스템은 시험관 내에서의 FGF21-SABA 융합체의 기능적 활성을 조사하기 위하여 구축되었다. 구체적으로, 비교측정기로서 비-융합 His-태깅된 FGF21 ("FGFv1"; 서열 125)을 사용하는 HEK β-클로토 발현 안정 세포 pERK 1/2 검정에서 측정되는 것으로써, SABA1-FGF21v1 (서열 132) 융합 단백질에 대하여 시험관내 활성, 역가 (EC50) 및 효능 (SABA에 융합되지 않는 FGF21 분자로부터 관찰되는 최대 활성의 백분율로 나타냄)을 측정하였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, SABA1-FGF21v1은 인간 β-클로토를 안정하게 발현하는 HEK 세포에서 pERK 1/2 수준을 용량 의존성으로 자극한다. 역가 (EC50)는 His-태깅된 FGF21 대비 대략 15배 우향 이동되며, 효능은 His-태깅된 FGF21의 62%이다 (하기 표 15 참조). 따라서, SABA1-FGF21v1은 인간 혈청 알부민에 결합하는 경우에도 FGF21 활성을 유지한다.
<표 15>
Figure 112012099393820-pct00073
β-클로토를 내인적으로 발현하지 않는 모체 HEK 세포에서의 특이성 검정에서, His-태깅된 FGF21 또는 SABA1-FGF21v1 중 어느 것도 pERK 1/2 농도를 자극하지 않은 반면, 양성 대조인 FGF1은 자극하였다 (도 14a). 동일한 단백질 희석물을 사용하나 표준 검정 HEK β-클로토 안정 세포를 사용하는 평행 실험에서는, 모든 3종의 단백질이 활성을 나타내었다 (도 14b). 따라서, SABA1-FGF21v1은 알부민과 결합되는 경우에도 FGF21의 특이성을 유지한다.
본 세포-기반 검정에서는, 먼저 pERK 인산화 경로를 활성화하는 데에 필요한 약물의 농도를 측정할 필요가 있다. 이를 위하여, 세포 매체 중에서 HSA의 존재 및 부재하에 융합 단백질을 세포로 적정하였다. HSA가 첨가되는 경우, 그것은 혈류에서 발견되는 생리학적 농도 (30 내지 40 mg/mL ~500 μM HSA)로 첨가되었다. 이와 같은 농도는 모든 FGF21-SABA 융합 단백질을 포화시키는 데에 필요한 농도를 수천배 상회한다. FGF21-SABA-HSA 용액 결합 상수는 ~4 nM이다 (도 11 참조). HSA의 존재에 관계없이, 검정에서의 단백질 융합체의 활성에는 변화가 없어서, FGF21 도메인의 활성이 융합 단백질이 HSA와 복합체 상태인 경우에 변경되지 않음을 나타내었다.
하기는 실험 방법의 상세한 설명이다.
HEK -β- 클로토 안정 세포주 구축
인간 β-클로토를 안정하게 발현하는 HEK 세포주를 구축하였다. 인간 β-클로토 구축물은 C-말단 FLAG 태그를 갖는 CMV 프로모터 조절하의 전체 길이 단백질을 코딩하고 있다. 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 (인비트로젠(Invitrogen) 사 카탈로그 # 11668027)을 사용하여 표준 기술을 사용한 제조자 프로토콜에 따라, HEK 293 세포를 선형화된 cDNA로 형질감염시켰다. L-글루타민, Hepes (인비트로젠 사 카탈로그 # 12430054) 및 10% FBS (하이클론(HyClone) 사 카탈로그 # SH30071)를 함유하는 고글루코스의 둘베코 변형 이글 배지 중에서, 600 ug/ml의 제네티신 (인비트로젠 사 카탈로그 # 10131)에서의 14일의 선택 후 양성 클론을 단리하였다. 웨스턴 블롯 분석, 및 알파스크린(AlphaScreen) (퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 사 카탈로그 # TGRES50K) 분석에 의한 p-ERK 활성화에 의해, 양성의 안정한 클론을 추가로 특성화하였다.
HEK β- 클로토 pERK 1/2 검정
인간 β-클로토를 안정하게 발현하는 HEK 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트에서 10% (v/v) FBS (하이클론 사) 및 600 ㎍/ml G418 (기브코(Gibco) 사)을 함유하는 DMEM 고글루코스 배지 (기브코 사)에 20,000개 세포/웰로 플레이팅하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 혈청이 없는 DMEM 고글루코스 배지로 교체한 후, 세포를 밤새 인큐베이션하였다. 3일차 아침에, 무혈청 배지를 제거하고, 3% (w/v) 무지방산 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS 중에 제조된 단백질의 희석물과 함께 총 7분 동안 세포를 인큐베이션하였다. 3개의 플레이트 각각에서 하나의 웰씩 3반복으로 희석물을 시험하였다. 7분 인큐베이션 종료시, 단백질 희석물을 제거하고, 웰 당 100 μl의 1x 알파스크린 용해 완충제 (퍼킨-엘머 사)를 첨가한 후, 대략 10-15분 동안 진탕하면서 인큐베이션시켰다. 세포 용해물을 포함하는 플레이트를 30분 이상 동안, 또는 검정 준비될 때까지 -80℃에서 냉동시켰다. 슈어파이어 알파스크린(Surefire AlphaScreen) pERK 1/2 키트 (퍼킨 엘머 사)를 사용하고 384 웰 백색 프록시플레이트(Proxiplate) (퍼킨 엘머 사)를 사용하여 제조자의 지침에 따라, 각 웰로부터의 4 μl의 해동된 세포 용해물을 pERK 1/2에 대하여 분석하였다. 플레이트를 어둠 속에서 2시간 동안 실온으로 인큐베이션한 다음, 엔비젼(Envision) 2103 멀티플레이트(Multiplate) 판독기 (퍼킨 엘머 사)에서 판독하였다. 비-선형 회귀 분석을 사용하는 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Prism) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
β-클로토를 내인적으로 발현하지 않는 모체 HEK 세포주를 사용하여 상기와 같이 선택성 검정을 수행하였다. 해당 실험에서는 FGF1을 양성 대조로 사용하였다.
실시예 B4. 3 T3 - L1 지방세포에서의 SABA1 - FGF21v1 의 시험관내 활성
3T3-L1 세포 (ATCC #CL-173)는 마우스 지방세포로 분화될 수 있는 마우스 섬유모세포이다. β-클로토는 분화된 3T3-L1 세포에서만 발현되기 때문에, 실시예 B3에 기술되어 있는 바와 같은 β-클로토 pERK 1/2 검정을 수행하기 전에, 먼저 그것을 분화시킬 필요가 있다. HEK 시스템에서의 그의 활성과 유사하게, SABA1-FGF21v1은 3T3-L1 지방세포에서 ERK를 인산화하는 능력을 유지하는데, 이와 같은 활성은 His-태깅된 FGF21과 유사하다. 결과를 표 16에 나타내었다.
<표 16>
Figure 112012099393820-pct00074
하기는 실험 방법의 상세한 설명이다.
3 T3 L1 지방세포의 분화
10%의 특성화된 소 태아 혈청 (하이클론 사 # SH30071.03) 및 1X 안티바이오틱-안티마이코틱(Antibiotic-Antimycotic) (기브코 사 # 15240-096)이 보충된 DMEM 배지 (인비트로젠 사 # 12430-054)에서 세포를 성장시켰다. 5% CO2를 갖는 37℃의 인큐베이터에서 세포를 배양하였다. 계대배양 절차는 트립신-EDTA 용액 대신 트리플 익스프레스(TrypLE Express) (기브코 사 # 12605)를 사용한 것 이외에는 ATCC의 제품 정보 시트에 기술되어 있는 대로 따랐다.
대략 분화 68시간 전에, 웰 당 5500개 세포 (150 μl의 배지에)를 96 웰 플레이트 (팔콘(Falcon) 사 #353072)에 접종하였는데; 세포 수는 접종 시간 및 그의 배수화 시간에 따라 조정가능하였지만, 분화 절차가 개시된 시점에는 세포가 100% 융합성(confluent)이었다. 분화를 개시하기 위하여, 세포 상청액을 조심스럽게 흡인하고, 200 μl의 새로운 분화 배지 I (모두 시그마 사 제품인 IBMX 500 μM, 덱사메타손 100 nM, 인슐린 240 nM을 함유하는 성장 배지)을 각 세포 웰에 첨가하였다. 다음에, 41 내지 48시간 동안 세포를 인큐베이션한 후, 세포 상청액을 조심스럽게 흡인하고, 200 μL의 분화 배지 II (240 nM로 인슐린을 함유하는 성장 배지)를 각 세포 웰에 첨가하였다. 2차로 48시간의 기간 동안 세포를 인큐베이션한 후, 세포 상청액을 조심스럽게 흡인하고, 200 μl의 표준 성장 배지를 각 웰에 첨가하였다. 다음에, 세포를 다시 48 내지 72시간 동안 인큐베이션하였는데, 그 시점에 그것은 지방세포로 잘 분화되었었다.
3 T3 - L1 지방세포에서의 pERK 검정의 확립
분화 9일차 내지 10일차에, 성장 배지를 세포로부터 흡인 제거하고, 2% 소 태아 혈청을 포함하는 200 μl의 DMEM (인비트로젠 사 # 12320-032)을 사용하여 밤새 기아시켰다(starved). 다음날, 플레이트의 96개 웰 모두에 대한 동시 첨가를 보장하기 위하여 톰텍 콰드라(Tomtec Quadra)를 사용하고, 시험 효능제 (FGF21 또는 그의 변이체들 중 1종), 또는 대조로서의 PBS를 함유하는 100 μl의 DMEM + 0.1% 무지방산 BSA (시그마 사 #A6003)를 사용하여, 기아 세포를 자극하였다. 다음에, 95% 공기/5% CO2를 포함하는 37℃ 인큐베이터에서 7분 동안 플레이트를 인큐베이션하였다. 7분 후, 처리 배지를 세포로부터 제거하고, 100 μl의 용해 완충제를 각 웰에 첨가하였다. 용해 완충제 모액은 0.5 mM DTT (시그마 사, D9779), 5 mM 나트륨 피로포스페이트 (시그마 사, S6422), 1 mM 나트륨 오르소바나데이트 (시그마 사 S6508) 및 로슈 사의 프로테아제 억제제 정제 (#04693159001)가 보충된 퍼킨 엘머 사의 알파스크린 슈어파이어 p-ERK1/2 검정 키트 (Cat# TGRES10K)이었다. 검출 프로토콜은 검정 키트를 기반으로 하였다. 용해 완충제를 포함하는 플레이트를 대략 15분 동안 플레이트 진탕기에서 진탕시킨 후, -80℃에서 30분 동안 냉동시켰다. 플레이트를 실온에서 해동한 후 (대략 40분), 완전한 용해를 보장하기 위하여 용해물을 휘저었다 (상하향 피페팅 20회에 의함). 각 웰로부터의 4 μl의 용해물을 384 웰 플레이트로 이동시키고, 7 μl의 반응 혼합물 (키트 프로토콜에 따라 혼합된 활성화 완충제와 IgG 검출 공여체 및 수용체 비드 [퍼킨엘머 사 #6760617M])을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 1-2분 동안 진탕한 후, 이어서 광차단 영역에서 2시간 동안 22 ℃로 인큐베이션하였다. 플레이트를 최종적으로 표준 알파 스크리닝 설비를 사용하여 퍼킨엘머 엔비젼 2103 멀티라벨 판독기에서 판독하였다.
실시예 B5. 당뇨병 ob / ob 마우스에서의 SABA1 - FGF21v1 의 생체내 효능
FGF21은 3T3-L1 지방세포 및 일차 인간 지방세포 배양물에서 글루코스 흡수를 증가시키는 것으로 나타나 있다. 따라서, 당뇨병 ob / ob 마우스에서 혈장 글루코스 농도를 모니터링하는 것은 FGF21-SABA 융합 단백질의 기능적 활성이 평가될 수 있는 한 가지 방식을 나타낸다. 8주령에서 시작하여, 당뇨병 ob / ob 마우스를 7일 동안 매일 피하 투여하였다 (군 당 n=8). 모든 프로토콜은 BMS ACUC 위원회에 의해 승인되었다. 섭식 글루코스 수준은 7일차에 8:00 AM에 시작하여 투여-후 24시간 및 3시간 모두에서 조사되었다. PBS 중에서 His-태깅된 FGF21 및 SABA1-FGF21v1을 제제화하고, 각각 0.3 mg/kg, 및 1.0 mg/kg으로 투여하였다.
인간 알부민에 결합된 SABA1-FGF21v1의 효능을 평가하기 위하여, 몰 과량의 인간 혈청 알부민 (6 mg/kg)을 사용하여 융합 단백질 (1 mg/kg)을 인큐베이션하고, 추가 군에서 혼합물을 주사하였다 (매일 피하로 7일 동안). 인간 혈청 알부민 (6 mg/kg)을 추가 대조군으로 사용하였다.
도 15에 나타낸 결과는 SABA1-FGF21v1이 투여 3시간 후에 글루코스를 PBS 비히클 대조군에 비해 29% 낮춘다는 것을 표시하는데, 이와 같은 저하는 7일차에 His-태깅된 FGF21에 의한 것에 필적한다 (도 15a). 반면, SABA1-FGF21v1과 인간 알부민의 조합은 혈장 글루코스 수준을 HSA 대조군에 비해 46% 낮춘다.
7일차에, 투여 24시간 후, SABA1-FGF21v1에 의해 저하되는 글루코스의 크기는 7%인 반면, SABA1-FGF21v1과 HSA의 조합의 경우 41%이었으며, 그렇게 최종 투여 후 24시간을 지속하였다 (도 15b). 따라서, SABA1-FGF21v1은 인간 혈청 알부민에 결합하는 경우에도 ob / ob 마우스에서 혈장 글루코스 농도를 낮춤에 있어서 매우 효과적이었다. 인간 알부민의 존재 및 부재 하의 SABA1-FGF21v1의 노출에 대해서는 표 17 및 18에 나타내었다. SABA1-FGF21v1의 노출은 인간 혈청 알부민의 부재시에 비해 그의 존재시에 더 컸다.
<표 17>
Figure 112012099393820-pct00075
<표 18>
Figure 112012099393820-pct00076
실시예 B6. 마우스 및 원숭이에서의 SABA1 - FGF21v1 혈장 t 1 /2 의 측정
마우스 및 원숭이에서 다양한 생체내 연구를 수행하여 His-태깅된 FGF21 및 SABA1-FGF21v1의 약동학을 특성화하였다. 모든 마우스 및 원숭이 혈장 샘플에서 His-태깅된 FGF21 및 SABA1-FGF21v1을 측정하는 데에는 ELISA-기반 리간드 결합 검정을 사용하였다.
마우스에서의 정맥내 및 피하 투여 후 His -태깅된 FGF21 및 SABA1 - FGF21v1 의 약동학
His -태깅된 FGF21
CD-1 마우스에서의 정맥내 투여 (1 mg/kg) 후, His-태깅된 FGF21에 대한 정상-상태 분포 용적 (VSS)은 0.27 L/kg이었다. 총 신체 혈장 청소율 (CLTp) 값은 12 mL/min/kg이었다. 최종 반감기 (T1 /2)는 0.5시간이었다. 피하 투여 후, His-태깅된 FGF21은 잘 흡수되었다. 절대 피하 생체이용률은 ~100%이었다. 겉보기 피하 최종 반감기 (T1 /2)는 0.6시간이었다.
SABA1 - FGF21v1
CD-1 마우스에서의 정맥내 투여 (1.6 mg/kg) 후, SABA1-FGF21v1에 대한 정상-상태 분포 용적 (VSS)은 0.12 L/kg이었다. 총 신체 혈장 청소율 (CLTp) 값은 2.9 mL/min/kg이었다. 최종 반감기 (T1 /2)는 1.9시간으로서, His-태깅된 FGF21 (0.5시간)보다 더 길었다. 피하 투여 후, SABA1-FGF21v1은 잘 흡수되었다. 겉보기 피하 최종 반감기 (T1 /2)는 1.9시간이었다.
인간 혈청 알부민 (6 mg/kg)과의 사전-혼합 후, 1 mg/kg 피하로, ob / ob 마우스에도 SABA1-FGF21v1을 투여하였다. 겉보기 피하 최종 반감기 (T1 /2)는 9시간으로 더 증가되었다.
원숭이에서의 정맥내 및 피하 투여 후 His -태깅된 FGF21 및 SABA1 - FGF21v1 의 약동학
His -태깅된 FGF21
정맥내 투여 (0.5 mg/kg) 후, His-태깅된 FGF21에 대한 정상-상태 분포 용적 (VSS)은 1 L/kg이었다. 총 신체 혈장 청소율 (CLTp) 값은 6.4 mL/min/kg이었다. 최종 반감기 (T1 /2)는 1.9시간이었다. 피하 투여 후, His-태깅된 FGF21은 잘 흡수되었다. 절대 피하 생체이용률은 65%이었다. 겉보기 피하 최종 반감기 (T1/2)는 4.3시간이었다.
SABA1 - FGF21v1
정맥내 투여 (0.08 mg/kg) 후, SABA1-FGF21v1에 대한 정상-상태 분포 용적 (VSS)은 0.08 L/kg이었다. 총 신체 혈장 청소율 (CLTp) 값은 0.012 mL/min/kg이었다. 최종 반감기 (T1 /2)는 97시간이었다. 피하 투여 후, SABA1-FGF21v1은 잘 흡수되었다. 절대 피하 생체이용률은 68%이었다. 겉보기 피하 최종 반감기 (T1 /2)는 67시간이었다.
도 16은 대표적인 융합체로서 SABA1-FGF21v3 (서열 134), 및 SABA 모이어티가 FGF21 (서열 171)의 C-말단에 있는 FGF21-SABA1v1의 t1 /2을 원숭이에서 His-태깅된 FGF21과 비교하여 제시한다. 결과는 융합체가 t1 /2을 FGF21 단독에 비해 ~27배 증가시켰음을 나타낸다. 데이터를 하기 표 19에 요약하였다.
<표 19>
Figure 112012099393820-pct00077
실시예 B7. SABA1 - FGF21v1 은 ob / ob 마우스에서 HbA1c 를 낮춘다
당뇨병 ob/ob 마우스에서, 추가적인 SABA1-FGF21v1의 급성 및 만성 효과를 조사하였다. 매일 치료로 3주 후 연구 종료시, 혈장 글루코스, 인슐린 및 총 콜레스테롤의 감소를 관찰하였다. 혈장 아닐린 아미노트랜스퍼라제는 감소하였으며, β-히드록시부티레이트 수준은 상승하였다. 경구 내당능 검사에서, SABA1-FGF21v1 처리 동물은 증가된 글루코스 부하 관리 능력을 나타내었다.
당뇨병 ob/ob 마우스 (군 당 n=8)에서, 인간 혈청 알부민 (6 mg/kg의 HSA)과 사전혼합된 3종의 상이한 용량 중 하나의 SABA1-FGF21v1 (0.01, 또는 0.1 또는 1 mg/kg)을 투여받으며, 14일 동안 주사되는 (피하, 매일) 또 다른 실험을 수행하였다. 대조군은 HSA (PBS 중 6 mg/kg) 만을 투여받았다. 최종 투여 24시간 후, 혈장 샘플에서 HbA1c를 측정하였다 (도 19 참조). 대조군 (HSA만을 투여받음)은 기준선 값에 비해 HbA1c 수준에 감소를 나타내지 않았다. 최저 용량 (0.01 mg/kg)은 감소를 나타내지 않았으며, 중간 용량 (0.1 mg/kg)은 0.39%의 감소를 나타냄으로써, 통계적으로 유의성이 없었다. 1 mg/kg (또는 mpk)의 최고 용량은 HbA1c에서 기준선에 대하여 0.9%의 감소, 그리고 0.94%의 비히클 차감 감소를 나타냄으로써, 통계적으로 유의성이 있었다. 따라서, 인간 알부민과 공동-주사된 SABA1-FGF21v1은 당뇨병 마우스에서 HbA1c 수준을 낮추는 데에 효과적이었다.
0.01, 0.1 및 1 mg/kg 용량에서의 SABA1-FGF21v1 혈장 수준은 최종 투여 24시간 후에 각각 3.85, 2.28 및 28.73 ng/ml이었다.
실시예 B8. 시노몰구스 원숭이 에서의 SABA1 - FGF21v1 의 약동학
정맥내 (IV) 투여 후, SABA1-FGF21v1의 정상-상태 분포 용적 (VSS)은 0.076 L/kg이었다. 이와 같은 값은 혈장 부피에 비해서는 더 크나, 세포외 액체의 부피 미만이어서, SABA1-FGF21v1이 대부분 세포외 공간에 존재한다는 것을 표시한다. SABA1-FGF21v1의 총 신체 혈장 청소율은 낮아서 (0.71 mL/h/kg), 원숭이 혈청 알부민에 대한 고도 친화성 결합에 부합하였다. 최종 반감기 (T1/2)는 97시간이었다 (도 20 및 표 20 참조). 또한, SABA1-FGF21v1은 원숭이에서 우수한 피하 (SC) 생체이용률을 나타내었다 (도 20 및 표 20 참조). 절대 SC 생체이용률은 68%이었다.
<표 20>
Figure 112012099393820-pct00078
C. SABA -합성 펩티드 융합 분자
실시예 C1 . 화학적으로 유도되는 스페이서에 의해 연결되는 SABA -합성 펩티드 융합 분자에서 사용하기 위한 SABA 폴리펩티드의 제조
하기에 기술된 방법을 사용하여, 합성으로 유도되는 펩티드에 접합하여 SABA 융합 단백질을 형성시키기 위한 SABA1.7-(ED)5G-Cys 폴리펩티드를 생산하였다. 이와 같은 과정은 폴리펩티드 링커를 통하여 공유 결합되는 SABA-펩티드 융합체를 생산하는 데에도 사용될 수 있다.
(ED)5G C-말단 테일 (서열 397) 및 C-말단 His 잔기 (SABA1.7-(ED)5G-Cys)를 갖는 SABA1.7 (서열 225)을 코딩하는 DNA 서열을 상업적으로 입수가능한 발현 벡터 pET29b (EMD 바이오사이언스 사, 미국 캘리포니아 샌디에고 소재)에 삽입하였다. 서열은 플라스미드 벡터 리보솜 결합 부위 바로 하류의 NDEI 및 XHOI 제한 엔도뉴클레아제 부위 사이에 적절하게 위치되었다 (도 10). 상기 발현 벡터를 숙주 균주 BL21(DE3) (EMD 바이오사이언스 사)로 형질전환시키고, 봉입체로서 발현시켰다.
정제된 플라스미드 DNA 발현 벡터를 당업자에게 통상적으로 알려져 있는 표준 형질전환 방법에 의해 상기 언급된 이. 콜라이 숙주에 도입 또는 "형질전환"시켰다. 간단하게 말하자면, 시중에서 제조된 적격 세포 (EMD 바이오사이언스 사)를 얼음상에서 해동한 후, 세포가 균일하게 현탁되는 것이 보장되도록 약하게 혼합하였다. 20 μl 분취량의 이들 세포를 얼음상에서 얼음 예비-냉각된 1.5-ml 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브에 피페팅하였다. 대략 1 μl의 정제된 플라스미드 DNA (1-10 ng/μl 플라스미드)를 직접 세포에 첨가한 후, 약하게 교반하여 혼합하였다. 튜브를 얼음상에서 5분 동안 유지한 다음, 42 ℃ 수조에서 정확하게 30초 동안 가열하였다. 가열된 튜브를 즉시 얼음상에 위치시키고, 2분 동안 방치시켰다. 80 μl의 실온 SOC 또는 LB 배지를 각 튜브에 첨가하였다. 형질전환체의 선택은 pET29b 플라스미드-코딩된 약물 내성을 위하여 카나마이신을 함유하는 배지에 플레이팅함으로써 이루어졌다.
형질전환된 세포의 오버나잇 스타터 배양물을 성장시킴으로써, 이. 콜라이에서의 가용성 SABA1.7-(ED)5G-Cys의 발현을 개시하였다. 세포를 사용하여 각각 1 리터의 오버나잇 익스프레스™ 배지 (EMD 바이오사이언스 사, 문헌 [Nature Methods 2: 233-235 (2005)])를 함유하는 2 리터 진탕 플라스크를 접종하였다. 가용성 수율을 향상시키기 위하여, 진탕 인큐베이터의 온도 감소는 18 ℃까지 낮추어질 수 있다. 12-16시간 동안 발효를 계속하고, 원심분리에 의해 세포를 수확한 후, -80℃에서 포장된 습윤 세포 페이스트로서 냉동시켰다. 단백질 봉입체 (IB)의 형성이 바람직한 것으로 밝혀졌는데, 그것이 숙주 세포 프로테아제 절단을 방어하고 최소화하는 데에 도움을 주기 때문이다.
봉입체 ( IB ) 펠릿의 세포 용해 및 제조
세포를 해동하고, 1부의 포장된 세포 페이스트에 대하여 완충제 8-10부의 희석으로 용해 완충제에 현탁시켰다. 아베스틴 C-5 균질화기 (아베스틴 인크. 사, 캐나다 온타리오 오타와 소재)를 사용하여 2000 PSI로 2회 통과시킴으로써 세포를 기계적으로 용해하였다. 용해 후, 용해물을 회전 침전시키고 (4,000 RPM으로 20-30분 동안), 가용성 분획은 폐기하였다. 봉입체 펠릿을 0.5% 트리톤 X-100으로 세척하여 세포 잔사를 제거한 후, 현탁액을 다시 원심분리하였다. 이와 같은 과정을 반복하였으며 (통상적으로 2 또는 3회), 그 후 펠릿은 균질의 백색 색상으로 보였다. 다음에, 생성되는 풍부한 IB 조제물 몸체 펠릿을 PBS 완충제로 세척하여 과량의 세제를 제거하였다.
봉입체의 가용화
다음에, 세척 후 세제가 제거된 IB 펠릿을 50 mM 트리스-HCl pH 8.0 및 500 mM NaCl을 사용하여 완충된 6 M 구아니딘-HCl에서 가용화시켰다. 이와 같은 방식으로 제조된 대부분의 물질은 자유롭게 용액상으로 진입하지만, 소량의 세포 잔사가 잔류하므로, SS-34 로터에서 1시간 동안 16,000 RPM으로 원심분리함으로써 제거하였다. 재폴딩 및 산화 단계를 위하여 상청액을 남겨두었다. 6xHis 태그를 포함하는 단백질은 다르게는 포획된 후, 이와 같은 단계에서 금속 킬레이트화 크로마토그래피 단계 (IMAC)를 사용하여 추가 연마될 수 있다. 무질서유발제 변성 물질이 칼럼에 결합될 수 있으며, 오염물은 용리 전에 이미다졸이 보충된 변성 완충제의 존재하에 세척된다.
재폴딩 (및 산화의 조절)
구아니딘-HCl 가용화된 물질을 약 1 mg/mL 단백질 (280 nM에서의 흡광도에 의해 추정)까지 희석한 후, 3.5 MWCO 투석 관에 위치시켰다. 다음에, 투석 장치 내의 샘플을 4℃에서 약하게 교반하면서 밤새 4 L의 재폴딩 완충제 (50 mM 트리스, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 9.0)에서 부유시켰다. 투석 재폴딩 완충제는 다음날 아침에 새로운 재폴딩 완충제로 교체된다.
이와 같은 과정 동안, 필요에 따라서는 융합 단백질의 디술피드 산화 및/또는 가교 형성의 조절이 이루어질 수 있다. 적당한 최종 형태를 달성하기 위하여 그 폴리펩티드 서열 내에서 2개의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 가교가 형성될 필요가 있는 아밀린과 같은 펩티드의 경우, 투석 과정 동안 시스템이 공기 산화되도록 허용된다. 나중에 해당 펩티드로 말레이미드 접합될 수 있도록 환원되어야 하는 단일 시스테인 잔기를 함유하고 있는 SABA1.7-(ED)5G-Cys의 경우, 리폴드 과정 종료시에 환원제 (예컨대 TCEP 트리스[2-카르복시에틸] 포스파인 (TCEP) 또는 디티오트레이톨 (DTT))의 첨가에 의해 산화가 최소화될 수 있다. 최소한의 산화를 동반하는 재폴딩은 Cys 아미노산의 티올레이트 음이온이 용이하게 존재하여 디술피드 가교 형성을 개시하지 않는 pH 4.5에서의 재폴딩에 의해 이루어질 수도 있다.
이와 같은 단순 투석법은 편리하며, 필요에 따라서는 수개의 샘플이 한번에 처리될 수 있다. 다르게는, 단백질은 구아니딘-HCl 대신 우레아에서 변성될 수 있다. 다르게는, 재폴딩 및 산화는 염 농도를 낮추기 위하여 높은 무질서유발 염 농도로부터의 분자의 빠른 희석을 사용하여 수행될 수도 있다. 공기 산화 대신, 시스템은 다르게는 환원 및 산화 글루타티온 (GSH/GSSG)의 한정된 산화환원 혼합물을 사용하여 재폴딩될 수 있다. 다르게는, 자유 확산 상에서 상기한 바와 같은 투석 또는 빠른 희석을 통하여 해당 단백질을 재폴딩하는 대신, 크로마토그래피 수지 지지체에 결합되어 있는 동안 그것이 재폴딩될 수도 있다. 이와 같은 방법은 종종 향상된 수율을 갖는데, 그것이 대량 응집 및 수율 손실로 이어질 수 있는 재폴딩 단계 동안의 단백질 상호작용을 최소화하기 때문이다.
침전물의 제거
리폴드 단계 (및 필요에 따라서는 산화 단계)의 종결시, 모든 단백질이 가용성으로 유지되는 것은 아니다. 일부 단백질은 응집된 상태로 존재하며, 침전물로서 용이하게 용액으로부터 탈락한다. 이와 같은 물질은 SS-34 로터에서의 16,000 RPM으로 1시간 동안의 원심분리를 통하여, 그리고 다음에 통상적으로 크로마토그래피 전에 0.2 ㎛ 주사기 필터를 통하여 여과시킴으로써 제거되었다.
크로마토그래피 분리
재폴딩된 SABA1.7-(ED)5G-Cys는 리소스 Q 또는 유사 이온 교환 매질 시스템 (지이 헬스케어 사, 뉴저지 피스카타웨이 소재)의 사용을 통해 DNA 및 기타 오염물을 제거하기 위하여 연마될 수 있다. 40 mL 리소스 Q 칼럼을 재폴딩 완충제 (50 mM 트리스 pH 9.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 포함)에서 평형화하고 정화한 후, 재폴딩되는 물질을 칼럼으로 통과시킨다. 이러한 조건하에서, 대부분의 폴리펩티드는 결합없이 수지 상을 통과한다. 세척된 봉입체로부터의 DNA 및 기타 세포 잔사는 칼럼 수지상에 유지된다. 6xHis 태그를 포함하는 폴딩된 폴리펩티드는 다르게는 이 시점에 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 단계를 사용하여 포획된 후, 이미다졸 또는 히스티딘의 구배를 사용하여 용리될 수 있다.
크기 배제 크로마토그래피
다음에, SABA1.7-(ED)5G-Cys는 PBS 완충제 pH 7.2에서 예비-평형화된 26/60 세파크릴 S100 또는 26/60 수퍼덱스 75 크기 배제 칼럼 (지이 헬스케어 사, 미국 뉴저지 피스카타웨이 소재)을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 단량체성 단백질에 해당하는 샘플을 수집하고, 필요에 따라서는 -80℃에서의 냉동 전에 1-2 mg/ml까지 샘플을 희석하였다. 본원에서 발현 및 정제되는 단백질의 발현 및 정제 수율은 가변적이다. 이와 같은 방법을 사용하여, 원래의 자동-유도 배지 생산 봉입체 L 당 0.5 내지 10 mg 이상의 정제된 단백질의 정제 수율이 산출될 수 있다.
실시예 C2 . 화학적으로 유도되는 스페이서에 의해 연결되는 SABA -뉴로펩티드 융합 분자에서 사용하기 위한 뉴로펩티드의 화학적 합성
실시예 C2 -1: 3- 말레이미도프로피오닐 - PEG 20 - 래트 아밀린의 합성: Mal -( PEG ) 20 - KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY - NH 2
리버티 마이크로파 펩티드 합성기 (CEM 코포레이션 사, 노스 캐롤라이나 매튜스 소재)를 사용한 고체상 합성에 의해 펩티드를 제조하였다. Fmoc 탈보호 및 커플링 단계는 20 W의 파워 펄싱 시퀀스(power pulsing sequence)에 의해 제공되는 마이크로파 가열을 사용하여 75℃에서 수행되었다. 반응 온도는 반응 용기에 삽입된 섬유광학 프로브를 사용하여 모니터링하였다. 50 mL 폴리프로필렌 용기에 위치된 0.25 mmol의 Fmoc-보호 PAL-PEG 수지 (0.34 mmol/g)으로부터 합성을 개시하였다. 아미노산은 제조자에 의해 제공되는 0.25 mmol 스케일법(scale method)를 사용하여 커플링시켰다. 각 커플링 단계 개시시에는, 0.1 M HOBt를 함유하는 DMF 중 5% 피페라진을 사용한 2회의 5분 처리에 의해 Fmoc 기를 제거하였다. 5회의 20 mL DMF 세척 후, DMF 중 0.5 M HCTU (4 당량) 및 NMP 중 2 M DIEA (8 당량)을 사용한 활성화에 의해 5분 동안 필요한 Fmoc-아미노산을 연속적으로 커플링시켰다. 각 커플링 종료시에는, 5회의 20 mL DMF 세척을 사용하여 수지를 세척하였다. Fmoc-PEG20의 커플링 전에, 펩티딜-수지 (0.125 mmol)의 절반을 제거한 후, 상기한 바와 같은 합성기에서 Fmoc-PEG20을 커플링시켰다. Fmoc-탈보호된 펩티딜-수지를 프릿(fritted) 폴리프로필렌 반응기로 이동시키고, HOAt/DIC (5 당량)를 사용한 활성화에 의해 16시간 동안 3-말레이미도 프로피온산을 수동으로 커플링시켰다. DMF (4×5 mL) 및 DCM (4×5 mL) 및 다시 DMF (4×5 mL)를 사용하여 펩티딜-수지를 세척하였다. DMF 10 mL 중 I2 (20 당량)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. DMF (5×5 mL) 및 DCM (3×5 mL)을 사용하여 수지를 세척함으로써, 원하는 래트 아밀린 펩티드 유도체 Mal-(PEG)20-KCNTATCATQ RLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2 (아미드)를 고리형 디술피드 생성물로서 산출하였다.
펩티드를 탈보호한 후, 실온에서 90분 동안 TFA/물/페놀 (90:5:5; v:v:w) (15 mL)을 사용한 처리에 의해 수지로부터 방출시켰다. 폐 수지는 여과 분리하여, 추가적인 절단 용액 (2×2.5 mL)로 세정하였다. 합쳐진 여과물을 ~4 mL로 증발시키고, Et2O (35 mL)의 첨가에 의해 생성물을 침전시켰다. 원심분리에 의해 침전된 생성물을 수집한 후, 추가 Et2O를 사용하여 세척하고 건조하여, 회백색 색상의 고체를 산출하였다 (이론치의 50%).
시마츠 모델 LC-8A 액체 크로마토그래피에서 정제용 RP-HPLC에 의해 하기와 같이 조 펩티드를 정제하였다. 펩티드를 물/AcCN/TFA (60:40:0.1)에 용해시키고, 0.45 마이크로미터 필터를 통해 여과한 후, 적시에 30 mg을 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) C18 칼럼 (21.2×100 mm; 5 μ)에 주사하였다. 220 nm에서의 UV 검출을 동반하여, 45분에 걸쳐 A 중 B 25-45%의 구배를 사용하여 15 mL/분으로 생성물을 용리하였다. 용매 A: 수 중 0.1% TFA; 용매 B: AcCN 중 0.1% TFA. 분석용 HPLC로 측정하였을 때 순수한 생성물을 함유하는 분획들을 합쳐 동결건조함으로써, 백색의 동결건조물로서 95% 이상 순수한 생성물을 산출하였다. 펩티드의 정체는 LC/MS 분석에 의해 전기분무 양식으로 확인하였다. 실험적으로 관찰된 m/z 이온 (M+3H)3+/3 = 1464.0 및 (M+4H)4+/4 = 1097.9는 계산된 분자량 4389.9 D에 부합하였다.
실시예 C2 -2: 3- 말레이미도프로피오닐 -( GS ) 5 - 래트 아밀린의 합성: Mal - GSGSGSGSGS - KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY - NH 2
실시예 C2-1에서 기술된 동일한 고체상 커플링 및 디술피드 고리화 방법을 사용하여 펩티드를 제조함으로써, 고리형 디술피드 생성물로서 원하는 래트 아밀린 펩티드 유도체 Mal-GSGSGSGSGS-KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2 (아미드)를 산출하였다. 탈보호 및 수지로부터의 방출 후, 40분에 걸쳐 A 중 B 10-55%의 구배를 사용하여 펩티드를 용리하였다는 것 이외에는 실시예 C2-1에 기술되어 있는 바과 같이 정제용 RP-HPLC에 의해 조 펩티드를 정제함으로써, 98% 이상 순수한 생성물을 산출하였다. 펩티드의 정체는 LC/MS 분석에 의해 전기분무 양식으로 확인하였다. 실험적으로 관찰된 m/z 이온 (M+3H)3+/3 = 1598.3 및 (M+4H)4+/4 = 1199.3으로부터 유도된 4792.2 D의 분자량은 계산된 분자량 4791.2 D의 1 달톤 이내이다.
실시예 C2 -3: 3- 말레이미도프로피오닐 - Ahx -마우스 PYY (3-36)의 합성: Mal - Ahx - AKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY - NH 2
실시예 C2-1에서 기술된 동일한 고체상 절차를 사용하여 본 펩티드를 제조함으로써, 원하는 마우스 PYY(3-36) 펩티드 유도체 Mal-Ahx-AKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2를 산출하였다. Ala12-Ser13 및 Ala22-Ser23 잔기 쌍들을 Fmoc-Ala-Ser(ψMe , Mepro)-OH 슈도프롤린 디펩티드 (EMD 케미칼즈 인크.(EMD Chemicals, Inc.) 사, 캘리포니아 샌디에고 소재)로 커플링시켰다. 탈-보호 및 수지로부터의 방출 후, 45분에 걸쳐 A 중 B 5-50%의 구배를 사용하여 펩티드를 용리하였다는 것 이외에는 실시예 C2-1에 기술되어 있는 바과 같이 정제용 RP-HPLC에 의해 조 펩티드를 정제함으로써, 97% 이상 순수한 생성물을 산출하였다. 펩티드의 정체는 LC/MS 분석에 의해 전기분무 양식으로 확인하였다. 실험적으로 관찰된 m/z 이온 (M+3H)3+/3 = 1415.8 및 (M+4H)4+/4 = 1062.2는 계산된 분자량 4244.7 D에 부합하였다.
실시예 C2 -4: 3- 말레이미도프로피오닐 - PEG 20 -마우스 PYY (3-36)의 합성: Mal - PEG 20 - AKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY - NH 2
Fmoc-6-Ahx-OH 대신 Fmoc-PEG20-OH가 결합되었다는 것 이외에는, 실시예 C2-3에서 기술된 동일한 고체상 커플링 절차를 사용하여 본 펩티드를 제조함으로써, 원하는 마우스 PYY(3-36) 펩티드 유도체 Mal-PEG20-AKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2을 산출하였다. 탈-보호 및 수지로부터의 방출 후, 실시예 C2-3에 기술되어 있는 바과 같이 정제용 RP-HPLC에 의해 조 펩티드를 정제함으로써, 86% 이상 순수한 생성물을 산출하였다. 펩티드의 정체는 LC/MS 분석에 의해 전기분무 양식으로 확인하였다. 실험적으로 관찰된 m/z 이온 (M+3H)3+/3 = 1484.8 및 (M+4H)4+/4 = 1113.5는 계산된 분자량 4449.9 D에 부합하였다.
실시예 C2 -5: 3- 말레이미도프로피오닐 -( GS ) 5 -마우스 PYY (3-36)의 합성: Mal - GSGSGSGSGS - AKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY - NH 2
본 펩티드는 젠스크립트 USA, 인크.(GenScript USA, Inc.) 사 (뉴저지 피스카타웨이 소재)에 의해 실시예 C2-3에 기술되어 있는 것과 유사한 고체상 절차를 사용하여 주문 합성됨으로써, 95% 순도의 원하는 마우스 PYY(3-36) 펩티드 유도체 Mal-GSGSGSGSGS-AKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2를 산출하였다. 펩티드의 정체는 LC/MS 분석에 의해 전기분무 양식으로 확인하였다. 실험적으로 관찰된 m/z 이온 (M+3H)3+/3 = 1618.5 및 (M+4H)4+/4 = 1214.1은 계산된 분자량 4852.2 D에 부합하였다.
실시예 C2 -6: 3- 말레이미도프로피오닐 - Ahx -마우스 PP 의 합성: Mal - Ahx - APLEPMYPGDYATPEQMAQYETQLRRYINTLTRPRY - NH 2
실시예 C2-3에서 기술된 동일한 고체상 절차를 사용하여 본 펩티드를 제조함으로써, 원하는 마우스 PP 펩티드 유도체 Mal-Ahx-APLEPMYPGDYATPEQMAQYETQLRRYINTLTRPRY-NH2 (아미드)를 산출하였다. Ala12-Thr13 잔기 쌍을 Fmoc-Ala-Thr(ψMe , Mepro)-OH 슈도프롤린 디펩티드 (EMD 케미칼즈 인크. 사, 캘리포니아 샌디에고 소재)로 결합시켰다. 탈-보호 및 수지로부터의 방출 후, 실시예 C2-3에 기술되어 있는 바과 같이 정제용 RP-HPLC에 의해 조 펩티드를 정제함으로써, 99% 이상 순수한 생성물을 산출하였다. 펩티드의 정체는 LC/MS 분석에 의해 전기분무 양식으로 확인하였다. 실험적으로 관찰된 m/z 이온 (M+3H)3+/3 = 1533.5 및 (M+4H)4+/4 = 1150.4로부터 유도된 4597.5 D의 분자량은 계산된 분자량 4598.2 D의 1 달톤 이내이다.
실시예 C2 -7: 3- 말레이미도프로피오닐 - PEG 20 -마우스 PP 의 합성: Mal - PEG 20 - APLEPMYPGDYATPEQMAQYETQLRRYINTLTRPRY - NH 2
Fmoc-6-Ahx-OH 대신 Fmoc-PEG20-OH가 결합되었다는 것 이외에는, 실시예 C2-6에서 기술된 동일한 고체상 절차를 사용하여 본 펩티드를 제조함으로써, 원하는 마우스 PP 펩티드 유도체 Mal-PEG20-APLEPMYPGDYATPEQMAQYETQLRRYINTLTRPRY-NH2 (아미드)를 산출하였다. 탈-보호 및 수지로부터의 방출 후, 실시예 C2-3에 기술되어 있는 바과 같이 정제용 RP-HPLC에 의해 조 펩티드를 정제함으로써, 91% 이상 순수한 생성물을 산출하였다. 펩티드의 정체는 LC/MS 분석에 의해 전기분무 양식으로 확인하였다. 실험적으로 관찰된 m/z 이온 (M+3H)3+/3 = 1601.9 및 (M+4H)4+/4 = 1201.7로부터 유도된 4803.0 D의 분자량은 계산된 분자량 4803.4 D의 1 달톤 이내이다.
실시예 C2 -8: 3- 말레이미도프로피오닐 -( GS ) 5 -마우스 PP 의 합성: Mal - GSGSGSGSGS - APLEPMYPGDYATPEQMAQYETQLRRYINTLTRPRY - NH 2
본 펩티드는 젠스크립트 USA, 인크. 사 (뉴저지 피스카타웨이 소재)에 의해 실시예 C2-6에 기술되어 있는 것과 유사한 고체상 절차를 사용하여 주문 합성됨으로써, 90% 순도의 원하는 마우스 PP 펩티드 유도체 Mal-GSGSGSGSGS-APLEPMYPGDYATPEQMAQYETQLRRYINTLTRPRY-NH2 (아미드)를 산출하였다. 펩티드의 정체는 LC/MS 분석에 의해 전기분무 양식으로 확인하였다. 실험적으로 관찰된 m/z 이온 (M+4H)4+/4 = 1302.5 및 (M+5H)5+/5 = 1042.1은 계산된 분자량 5205.7 D에 부합하였다.
실시예 C2 -9: 인간 오스테오칼신의 합성: YLYQWLGAPVPYPDPLEPRREVCELNPDCDELADHIGFQEAYRRFYGPV, Cys 23 - Cys 29 디술피드를 통하여 고리화됨
본 선형 펩티드는 젠스크립트 USA, 인크. 사 (뉴저지 피스카타웨이 소재)에 의해 실시예 C2-6에 기술되어 있는 것과 유사한 고체상 절차를 사용하여 주문 합성됨으로써, 87% 순도의 원하는 인간 OCN 선형 전구체를 산출하였다. 펩티드의 산화성 디술피드 고리화는 50 mM 트리스 완충제 (pH 8.1), 5 mM 환원 글루타티온 및 0.5 mM 산화 글루타티온 중 선형 펩티드 (0.5 mg/mL; 20 mL)의 용액을 실온에서 4일 동안 교반함으로써 수행되었다. 용액을 회전 증발기에 의해 10 mL로 농축한 후, 40분에 걸쳐 A 중 B 20-50%의 구배를 사용하여 용리하였다는 것 이외에는, 실시예 C2-1에 기술되어 있는 바와 같이 정제용 HPLC에 의해 펩티드를 정제하였다. 이는 99% 순도의 원하는 고리형 인간 OCN 펩티드를 산출하였다. 펩티드의 정체는 LC/MS 분석에 의해 전기분무 양식으로 확인하였다. 실험적으로 관찰된 m/z 이온 (M+3H)3+/3 = 1933.3 및 (M+4H)4+/4 = 1449.8은 계산된 분자량 5797.4 D에 부합하였다.
실시예 C2 -10: 마우스 오스테오칼신의 합성: YLGASVPSPDPLEPTREQCELNPACDELSDQYGLKTAYKRIYGITI, Cys 19 - Cys 25 디술피드를 통하여 고리화됨
본 선형 펩티드는 젠스크립트 USA, 인크. 사 (뉴저지 피스카타웨이 소재)에 의해 실시예 C2-9에 기술되어 있는 것과 유사한 고체상 절차를 사용하여 주문 합성됨으로써, 90% 순도의 원하는 마우스 OCN 선형 전구체를 산출하였다. 실시예 C2-9에 기술되어 있는 바와 같이 정제용 HPLC에 의해 펩티드를 고리화 및 정제함으로써, 98% 순도의 고리형 마우스 OCN 펩티드를 산출하였다. 펩티드의 정체는 LC/MS 분석에 의해 전기분무 양식으로 확인하였다. 실험적으로 관찰된 m/z 이온 (M+3H)3+/3 = 1705.3 및 (M+4H)4+/4 = 1279.5는 계산된 분자량 5114.7 D에 부합하였다.
실시예 C2 -11: 래트 오스테오칼신의 합성: YLNNGLGAPAPYPDPLEPHREVCELNPNCDELADHIGFQDAYKRIYGTTV, Cys 23 - Cys 29 디술피드를 통하여 고리화됨
본 디술피드 고리형 펩티드는 젠스크립트 USA, 인크. 사 (뉴저지 피스카타웨이 소재)에 의해 실시예 C2-9에 기술되어 있는 것과 유사한 고체상 및 산화성 고리화 절차를 사용하여 주문 합성됨으로써, 96% 순도의 원하는 고리형 래트 OCN을 산출하였다. 펩티드의 정체는 LC/MS 분석에 의해 전기분무 양식으로 확인하였다. 실험적으로 관찰된 m/z 이온 (M+3H)3+/3 = 1862.5 및 (M+4H)4+/4 = 1397.5는 계산된 분자량 5586.1 D에 부합하였다.
실시예 C3 . 말레이미드 접합 반응을 사용한, 화학적으로 유도되는 스페이서에 의해 연결된 SABA - 아밀린 , SABA - PYY 및 SABA - PP 융합 분자의 형성
0.5 mM TCEP를 사용하여, Q 세파로스 칼럼 (지이 헬스케어 사, 뉴저지 피스카타웨이 소재)에서 상기에 개괄한 바와 같이 정제된 SABA1.7-(ED)5G-Cys 단백질을 환원시켰다. TCEP를 제거하고, 크기 배제 크로마토그래피를 통하여 50 mM 아세트산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 5.2에서 평형화된 수퍼덱스75 칼럼 (지이 헬스케어 사)에서 단백질을 추가 연마하였다. 상기 완충제 중에서, 용리된 SABA1.7-(ED)5G-Cys 단백질을 1:1 몰 비의 말레이미드-PEG20-아밀린-CONH2, 말레이미드-PEG20-PYY-CONH2, 또는 말레이미드-PEG20-PP-CONH2 합성 펩티드와 합친 후, 약하게 진탕하면서 4℃로 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 반응 혼합물을 0.2 ㎛로 여과하고, PBS pH 7.4 중에서 수퍼덱스75 SEC 칼럼을 사용하여 자유 반응물로부터 변형된 단백질인 SABA1.7-(ED)5G-Cys-PEG20-아밀린-CONH2 (서열 328), SABA1.7-(ED)5G-Cys-PEG20-PYY-CONH2 (서열 344) 또는 SABA1.7-(ED)5G-Cys-PEG20-PP-CONH2 (서열 364)를 단리하였다.
실시예 C4 . 인간 혈청 알부민에 대한 SABA -뉴로펩티드 ( 아밀린 , PYY 및 PP ) 융합체의 결합 효능
표면 플라스몬 공명 (SPR)은 분자 상호작용이 실시간으로 관찰될 수 있는 직접 결합 기술이다. 본 실험을 위하여, 프로테온(ProteOn) XPR36 기기 (바이오래드 래보래토리즈 사)를 사용하여 SPR 결합 연구를 수행하였다. 전개 완충제인 포스페이트 완충 염수 0.05% 트윈 20 pH 7.4는 테크노바(Teknova) 사 (cat #P1192)로부터 구매하였으며, 모든 실험은 25℃에서 진행하였다. 바이오래드 래보래토리즈 사로부터 구매한 아민 커플링 시약을 사용하여 제조자의 지침에 따라 아민 커플링을 통해, 인간 혈청 알부민을 직접 바이오래드 GLC 칩상에 고정시켰다. 인간 혈청 알부민은 노보자임스(Novozymes) 사 (레콤부민(Recombumin)™)로부터 구매하였다. 약 5000 공명 단위 (RU)의 인간 혈청 알부민을 GLC 칩 표면의 4개 별도 레인 상에 고정시켰다. 각 분석물에 대하여 15.6 nM 내지 250 nM 범위의 5개 농축물을 240초 동안 30 μl/분으로 표면 상에 주사하였다. 600초 동안 해리를 모니터링하였다. 100 mM의 HCl을 사용하여 표면을 재생하였다. 생성 데이터는 프로테온 매니저 소프트웨어를 사용하여 랑뮈르 1:1 결합 모델에 피팅하였다. 상이한 농도 범위로 실험을 반복하였다. 이와 같은 2차 실험에서는, 500 nM 내지 32 nM 범위의 5개 농축물을 표면 상에 주사하고, 상기와 같이 데이터를 분석하였다. 이러한 실험의 결과를 평균하여, 표 21에 나타내었다. KD는 해리 상수이다. 더 작은 수는 혈청 알부민에 대한 더 견고한 결합을 표시한다. 혈청 알부민에 결합하는 SABA에 공유 결합된 분자는 SABA-FGF-21 융합체와 관련하여 전기에 기술된 바와 같이 더 긴 생체내 약동학적 반감기를 나타낸다.
<표 21>
Figure 112012099393820-pct00079
실시예 C5 . SABA -합성 펩티드 융합체의 시험관내 활성
실시예 C5 -1: SABA - 아밀린 융합체의 시험관내 활성
아밀린은 Gs-커플링 GPCR인 아밀린 수용체를 활성화함으로써 세포의 고리형 아데노신 모노포스페이트 (cAMP) 생산을 유도한다. 따라서, 세포 cAMP 생산량은 아밀린 효능제에 있어서의 시험관내 기능적 활성의 해독치로 사용된다. 구체적으로, SABA1-AMYv25 (서열 328) 단백질에 대하여 역가 (EC50) 및 효능 (아밀린 펩티드로부터 관찰되는 최대 활성의 백분율로 나타냄)을 포함한 시험관내 활성을 측정하였다.
하기 표 22에 나타낸 바와 같이, SABA1-AMYv25는 아밀린 수용체를 안정하게 발현하는 HEK 세포에서 cAMP 생산을 자극한다. SABA1-AMYv25의 역가 (EC50)는 12.2 nM이며, 효능은 아밀린 펩티드의 약 119%이다. 따라서, SABA1-AMYv25는 시험관내 검정에서 그것이 SABA에 결합되는 경우에도 완전한 아밀린 기능 활성을 유지한다. 추가적인 실험에서, 래트 아밀린 및 SABA1-AMYv25 모두는 HEK 모 세포에서 cAMP 수준에 대하여 유의성 있는 효과를 가지지 않음으로써, 그의 아밀린 수용체에 대한 특이성을 나타내었다.
아밀린 수용체 안정 세포주 구축
아밀린 수용체는 칼시토닌 수용체 (CT)와 수용체 활성 변형 단백질 (RAMP) 중 1종의 이종이량체이다. HEK-293 세포에 침팬지 CT(a) 및 인간 수용체 활성 변형 단백질 3 (RAMP3) 양자를 안정하게 형질감염시킴으로써 재조합 아밀린 수용체 세포주를 생성시켰다. 이러한 재조합 수용체 세포주를 선택한 후, 래트 아밀린, 연어 칼시토닌, 인간 칼시토닌 및 인간 CGRP를 포함한 수종의 아밀린 효능제 펩티드를 사용하여 특성화하였다. 10% FBS, 300 ㎍/ml 네오마이신 및 250 ㎍/ml 하이그로마이신을 포함하는 완전 DMEM에서 37℃ 및 5% CO2로 안정 세포주를 배양하였다.
SABA1 - AMYv25 활성의 평가를 위한 시험관내 고리형 AMP ( cAMP ) 기능 검정
시스바이오(Cisbio) 사 (매사추세츠 베드포드 소재)의 HTRF® cAMP 검정 키트를 사용하여 cAMP 검정을 수행하였다. BD 팔콘™ 75 cm2 플라스크 (BD 바이오사이언스 사, 매사추세츠 벤드포드 소재)에서, 아밀린 수용체 안정 세포를 배지 (10% FBS, 300 ㎍/ml 네오마이신 및 250 ㎍/ml 하이그로마이신을 함유하는 DMEM) 중에서 37℃ 및 5% CO2로 성장시켰다. 인비트로젠 사의 세포 해리 완충제(Cell Dissociation Buffer) (무효소)를 사용하여 플라스크로부터 세포를 수확하였다. PBS 완충제를 사용하여 1회 세척한 후, 세포를 검정 완충제 (HBSS 완충제, 2.5 mM HEPES, pH 7.5, 100 μM IBMX)에 재-현탁하고, 96-웰 검정 플레이트 (~2,000개 세포/웰)에 로딩하였다. 다음에, 아밀린 펩티드 또는 SABA-아밀린 중 어느 하나와 함께 37℃에서 30분 동안 세포를 인큐베이션하였다. 제조자의 프로토콜 (시스바이오 사)에 따라 세포 중 cAMP 양을 측정하였다.
실시예 C5 -2: SABA - PYY 3 -36 및 SABA - PP 융합체의 시험관내 활성
펩티드 YY (PYY) 및 췌장 폴리펩티드 (PP)는 음식물 섭취에 반응하여 각각 장 및 췌장에서 분비되는 천연 포만 인자로써, 공복시 감소된다. PYY 및 PP는 모두 36개-잔기 펩티드 아미드인 그의 전체-길이 형태로 단리될 수 있다. PYY는 효소 DPPIV에 의해 더 짧으며 생물학적으로 활성인 형태 PYY(3-36)으로 추가 절단될 수도 있다. PYY(3-36) 또는 PP의 말초 주사는 동물 모델 및 인간에서 음식물 섭취 및 체중의 감소를 야기한다. 병적 비만을 갖는 환자는 기본 및 식사-자극 모두에서 감소된 PYY(3-36) 및/또는 PP 수준을 가진다. 반면, 식욕부진 또는 우회로 조정술(bypass surgery) 후 체중 감소를 겪는 환자는 정상 혈장에 비해 더 높은 PYY(3-36) 및/또는 PP를 가진다. PYY(3-36) 및 PP의 효능작용은 비만 및 대사 질환을 치료함에 있어서 대단히 큰 치료적 가치를 가진다. NPY Y2 및 Y4는 각각 PYY(3-36) 및 PP에 대하여 최고의 친화도를 갖는 수용체이다. NPY 수용체는 G-단백질 커플링 수용체 패밀리에 속한다. 효능제 자극시, NPY 수용체는 하류의 G-단백질을 자극함으로써 그의 결합 GDP를 GTP로 교체할 수 있다. 경쟁 결합 검정을 사용하여 각각의 해당 수용체에 대한 SABA1-PYYv7 (서열 344) 및 SABA1-PPv7 (서열 364)의 결합 친화도를 측정하였으며, GTPγS 결합 검정을 사용하여 초기 수용체-매개 사건들 중 하나에서의 수용체 점유의 기능적 결과를 측정하였다.
표 22에 나타낸 바와 같이, 기술된 검정에서의 측정된 역가 (EC50)는 PYY3 -36의 경우 0.6 nM, SABA1-PYYv7 융합체의 경우 52 nM이다. 기술된 분석에서의 측정된 역가 (EC50)는 PP의 경우 1.7 nM, SABA1-PPv7 융합체의 경우 >1 μM이다. SABA1-PPv7 융합체에 있어서의 역가의 감소는 SABA와 PP 폴리펩티드를 접합하는 데에 사용된 PEG20 링커로 인한 것일 수 있다. PEG20 링커는 이와 같은 구축물에 최적 이하일 수 있으므로, SABA-PP 융합체의 역가를 향상시키기 위해서는 대안적인 링커를 갖는 구축물이 사용될 것이다.
수용체 막 제조:
인간 NPY Y2 또는 Y4 수용체를 과발현하는 일 T150 플라스크의 재조합 CHO 세포를 F-12 배지 (HAM, L-글루타민 함유)에서 0.5 mg/ml의 G418과 함께 융합시까지 성장시켰다. 수확 전에, 세포를 PBS (Ca2 + 및 Mg2 + 부재)로 1회 세척한 다음, 세포 해리 용액을 사용하여 분리시켰다. 원심분리 후, 세포 펠릿을 1 ml의 용해 완충제 (20 mM 트리스-Cl pH 7.5, 1 mM EDTA 및 프로테이나제 억제제)에 재현탁시키고, 폴리트론 균질화기 (설정 5, 10초 × 2)를 사용하여 균질화하였다. 균질화된 세포를 1,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 펠릿을 1 ml의 용해 완충제에 재현탁한 후, 균질화하고, 다시 1,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 양 회전으로부터의 상청액을 수집하여, 100,000 g에서 60분 동안 원심분리하였다. 생성되는 막 펠릿을 250 μl의 검정 완충제 (TBS pH 7.4, 1 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2)에 재현탁시켰다. 단백질 농도를 측정하고, 분취량을 사용시까지 -80℃에서 저장하였다.
경쟁 결합 검정:
96-웰 플레이트에서, 총 부피 250 μl의 검정 완충제 (TBS pH 7.4, 1 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2)에서 검정을 수행하였다. 반응 혼합물은 검정 샘플 (SABA1-PYYv7/SABA1-PPv7, 대조 PP/PYY(3-36), 대조 매질), 막, 및 0.025 nM의 125I-hPYY 또는 125I-hPP (2200 Ci/mmol, 퍼킨엘머 사)로 구성되었다. 시약 첨가 순서는 하기와 같다: 150 μl의 검정 샘플, 50 μl의 125I-PYY 또는 125I-hPP, 이어서 50 μl의 막 (검정 완충제 중 1-3 ㎍/웰). 결합 혼합물을 실온에서 120분 동안 인큐베이션하였다. 패커드 세포 수확기(Packard Cell Harvester)를 사용하여 GF/C 플레이트 (0.5% 폴리에틸렌이민 및 0.1% BSA를 사용하여 사전-침지됨)로 반응액을 이동시킴으로써 결합 반응을 종료하였다. 다음에, 필터 플레이트를 빙냉 50 mM 트리스 완충제 (pH 7.4)를 사용하여 4×200 ml로 세척하였다. 세척 후, 40 μl의 마이크로신트20(MicroScint20)을 각 웰에 첨가하고, 패커드 탑카운트(Packard TopCount) 섬광 계수기에서 플레이트를 계수하였다.
GTP γS 결합 검정:
총 부피 100 μl로 96-웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 먼저 10 μl의 범용 완충제 (20 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 10 μM GDP, 0.1% BSA)를 각 웰에 첨가하였다. 다음에, 10 μl의 시험 샘플, 이어서 40 μl의 막 (검정 완충제 중 1-3 ㎍/웰)을 첨가하고, 잘 혼합하였다. 25℃에서 진탕하면서 30분 동안 반응액을 인큐베이션하였다. 다음에, 35S-GTP (0.25 μCi/ml)를 포함하는 40 μl의 SPA 비드 (0.5 mg/웰)를 첨가하고, 25℃에서 진탕하면서 다시 60분 동안 인큐베이션하였다. 1000 rpm에서 5분 동안 회전시킴으로써 반응을 종료하였다.
<표 22>
Figure 112012099393820-pct00080
D. 기타 SABA 융합 분자
실시예 D1 : SABA - 오스테오칼신 융합체의 시험관내 활성
오스테오칼신 (OCN)은 췌장 β 세포에서 인슐린 분비를 자극하며, 그에 따라 설치류 섬으로부터의 인슐린 생산은 시험관 내에서 오스테오칼신 (OCN)의 생물학적 기능을 평가하기 위한 해독치로 사용된다. 천연 인간 OCN (hOCN) 및 애드넥틴 SABA-융합 인간 OCN (SABA-hOCN)을 사용하여 설치류 섬을 처리하고, 각 구축물과 관련된 인슐린 분비의 향상도를 측정한다.
실시예 D2 : SABA - 아펠린 융합체
SABA-APLNv2는 6XHis 태그 및 (GS)7 링커를 통하여 APLNv4에 융합된 SABA1.6의 융합체이다. 마취된 래트에서, APLNv4는 정맥내로 전달된 60 ㎍/kg에서 강력한 강압 효과를 나타내었다. SABA-APLNv2는 15,000의 분자량을 나타내며, APLNv4는 융합 단백질 질량의 10%를 나타낸다. 마취된 래트에 600 ㎍/kg의 용량으로 SABA-APLNv2를 정맥내 전달하였는데, 혈압에 영향을 주지 않았다. SABA-APLNv2 구축물에서의 활성의 부재에 대한 잠재적인 설명으로는 저조한 생산적 충돌 빈도(productive collision frequency), 입체 장애, 또는 펩티드-PKE 어닐링으로 인한 역가의 감소가 포함될 수 있다. SABA-APLNv2에 대해서는 그것이 HSA에 결합하는지를 측정하는 시험을 하지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> GOSSELIN, MICHAEL L. FABRIZIO, DAVID SWAIN, JOANNA F. MITCHELL, TRACY CAMPHAUSEN, RAY CLOAD, SHARON T. FURFINE, ERIC MORIN, PAUL E. MUKHERJEE, RANJAN TAYLOR, SIMEON I. <120> SERUM ALBUMIN BINDING MOLECULES <130> COTH-529-101 <140> PCT/US11/034998 <141> 2011-05-03 <150> 61/330,672 <151> 2010-05-03 <160> 444 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp 65 70 75 80 Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 2 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(21) <223> Any amino acid and this region may encompass 1-15, 2-15, 1-10, 2-10, 1-8, 2-8, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1-3, 2-3, or 1-2 residues <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(45) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(73) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues <220> <221> MOD_RES <222> (79)..(98) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues <220> <221> MOD_RES <222> (102)..(121) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues <220> <221> MOD_RES <222> (131)..(150) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues <220> <223> see specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 2 Glu Val Val Ala Ala Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Leu Leu Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Arg 35 40 45 Ile Thr Tyr Gly Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Glu Phe Thr Val Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Ala Thr Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr 115 120 125 Ala Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 145 150 155 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(32) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(72) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(111) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues <220> <223> see specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 3 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 65 70 75 80 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile 100 105 110 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 115 <210> 4 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser 1 5 10 15 Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr 65 70 75 80 Arg Thr <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser 1 5 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Tyr Ser Gln Thr 1 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Tyr 1 5 <210> 8 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Pro Lys 1 5 10 15 Tyr Asp Lys Thr Gly His Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Thr Arg Gln Thr Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Ser Lys Asp Asp Tyr Tyr Pro His Glu His Arg Pro Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Pro Lys Tyr Asp Lys Thr Gly His 1 5 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Thr Arg Gln Thr 1 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Ser Lys Asp Asp Tyr Tyr Pro His Glu His Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asn 1 5 10 15 Asp Gly Pro Gly Leu Ser Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Ser Ser Gln Thr Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Ser Tyr Tyr Thr Lys Lys Ala Tyr Ser Ala Gly Pro Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Ser Asn Asp Gly Pro Gly Leu Ser 1 5 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Ser Ser Gln Thr 1 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Ser Tyr Tyr Thr Lys Lys Ala Tyr Ser Ala Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 16 Glu Met Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Glu Asp 1 5 10 15 Asp Ser Tyr Tyr Ser Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Ser Asp Leu Tyr Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Thr Asp Leu Ile Met His Glu Pro Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Glu Asp Asp Ser Tyr Tyr Ser Arg 1 5 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Ser Asp Leu Tyr 1 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Tyr Asp Val Thr Asp Leu Ile Met His Glu 1 5 10 <210> 20 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 20 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Glu Asp 1 5 10 15 Asp Ser Tyr Tyr Ser Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Ser Asp Leu Tyr Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Thr Asp Leu Ile Met His Glu Pro Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Glu Asp Asp Ser Tyr Tyr Ser Arg 1 5 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Ser Asp Leu Tyr 1 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Tyr Asp Val Thr Asp Leu Ile Met His Glu 1 5 10 <210> 24 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Tyr Met 1 5 10 15 Asp Glu Tyr Asp Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Asn Tyr Tyr Asn Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Arg Ile Lys Ala Asn Asn Tyr Met Tyr Gly Pro Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 25 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asn His 1 5 10 15 Leu Glu His Val Ala Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro 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Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Arg Tyr His His Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Gln Ala Gln Glu His Tyr Gln Pro Pro Ile Ser Ile 65 70 75 80 Asn Tyr Arg Thr <210> 28 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 28 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asn Ser 1 5 10 15 Tyr Tyr His Ser Ala Asp Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Tyr Pro Pro Thr Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Tyr Ser Ala Lys Ser Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr 65 70 75 80 Arg Thr <210> 29 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Lys 1 5 10 15 Tyr Ser Lys His Gly His Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Ser Gly Asn Ala Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Glu Asp Thr Asn Asp Tyr Pro His Thr His Arg Pro Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 30 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Gly 1 5 10 15 Glu Pro Asp Gln Thr Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Pro Tyr Arg Arg Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Ser Gly Tyr Thr Gly His Tyr Gln Pro Ile Ser Ile 65 70 75 80 Asn Tyr Arg Thr <210> 31 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Lys 1 5 10 15 Tyr Ser Lys His Gly His Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Ser Gly Asn Ala Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Glu Asp Thr Asn Asp Tyr Pro His Thr His Arg Pro Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 36 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Tyr Glu 1 5 10 15 Pro Gly Ala Ser Val Tyr Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Ser Tyr Tyr His Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Tyr Gly Tyr Tyr Glu Tyr Glu Pro Ile Ser Ile Asn Tyr 65 70 75 80 Arg Thr <210> 37 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Gln Ser 1 5 10 15 Tyr Tyr Ala His Ser Asp Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Tyr Pro Pro Gln Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Tyr Ala Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr 65 70 75 80 Arg Thr <210> 38 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Gly His 1 5 10 15 Tyr Arg Arg Ser Gly His Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Asp Pro Ser Ser Tyr Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Ser Lys Asp Asp Tyr Tyr Pro His Glu His Arg Pro Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 39 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 39 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Pro Glu 1 5 10 15 Pro Gly Thr Pro Val Tyr Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Ala Tyr Tyr Gly Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Tyr Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ser Pro Ile Ser Ile Asn Tyr 65 70 75 80 Arg Thr <210> 40 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 40 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Tyr Arg 1 5 10 15 Tyr Glu Lys Thr Gln His Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Pro Glu Ser Gly Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Tyr Ala Gly Tyr Glu Tyr Pro His Thr His Arg Pro Ile 65 70 75 80 Ser 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Val Pro Arg Asp Leu 1 5 <210> 51 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Pro Arg Asp Leu 1 <210> 52 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Arg Asp Leu 1 <210> 53 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Asp Leu 1 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln 1 5 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Glu Ile Asp Lys Pro Ser 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Glu Ile Asp Lys Pro Cys 1 5 <210> 57 <211> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Glu Ile Glu Lys Pro Ser Gln Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu 1 5 10 15 Asp <210> 64 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Glu Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 65 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Gly Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 15 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Synthetic peptide <400> 74 Gly Ser Glu Gly Ser Glu Gly Ser Glu Gly Ser Glu Gly Ser Glu 1 5 10 15 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Pro Ala Ser Pro Ala Ser Pro Ala Ser Pro Ala Ser Pro Ala Ser 1 5 10 15 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro 1 5 10 15 <210> 77 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Gly Ser Thr Val Ala Ala Pro Ser Thr Val Ala Ala Pro Ser 1 5 10 <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 78 Gly Gly Ser Glu Gly Gly Ser Glu 1 5 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 79 Ser Thr Ser Thr Ser 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly 1 5 10 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 85 Pro Ser Thr Ser Thr Ser Thr 1 5 <210> 86 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 <210> 87 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 <210> 88 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 88 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 15 Pro Ala <210> 89 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 89 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala 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<400> 97 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asn His Leu Glu His Val Ala Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Glu Tyr Pro Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Ile Thr 65 70 75 80 Met Leu Lys Tyr Pro Thr Gln Ser Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln His His His His His His 100 105 <210> 98 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 98 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Gly His Tyr Arg Arg Ser Gly His 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Asp Pro Ser Ser Tyr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ser Lys 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 105 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Lys Tyr Ser Lys His Gly His 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Ser Gly Asn Ala Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ser Asp Asp 65 70 75 80 Asn Lys Tyr Tyr His Gln His Arg Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln His His His His His His 100 105 <210> 106 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 106 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Gly His Tyr Arg Arg Ser Gly His 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Asp Pro Ser Ser Tyr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 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Synthetic polypeptide <400> 116 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Pro Asp Pro Tyr Tyr Lys Pro Asp 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Arg Asp Tyr Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 Tyr Gly Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Ile Asp Lys 85 90 95 Pro Ser Gln His His His His His His 100 105 <210> 117 <211> 208 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro Asp 20 25 30 Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu 35 40 45 Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu 50 55 60 Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu 65 70 75 80 Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 141 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr Gly Ser 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Ile Gly Gly 85 90 95 Ser Gly Ser Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly 100 105 110 Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu 115 120 125 Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp 130 135 140 Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val 145 150 155 160 Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro 165 170 175 Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser 180 185 190 Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn 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Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 180 185 190 Gly Ser Gly Ser Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val 195 200 205 Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu 210 215 220 Gln Asn Ser Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser 225 230 235 240 Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile 245 250 255 Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val 260 265 270 Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu 275 280 285 Ile Glu Lys Pro Ser Gln 290 <210> 174 <211> 489 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 174 Met His His His His His His Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln 1 5 10 15 Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln 20 25 30 Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly 35 40 45 Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys 65 70 75 80 Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu 85 90 95 Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr 100 105 110 Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser 115 120 125 Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu 130 135 140 Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro 145 150 155 160 Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro 165 170 175 Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 180 185 190 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu 195 200 205 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser 210 215 220 Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 225 230 235 240 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr 245 250 255 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 260 265 270 Tyr Ala Val Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser 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<211> 24 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Insulin receptor peptide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic Insulin receptor peptide <400> 175 Lys Thr Asp Ser Gln Ile Leu Lys Glu Leu Glu Glu Ser Ser Phe Arg 1 5 10 15 Lys Thr Phe Glu Asp Tyr Leu His 20 <210> 176 <211> 897 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 176 atgggtgttt ctgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta attctccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tgtatgcagt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag cattaattat cgcaccgaaa ttgataaacc gagccagcat 300 catcatcacc atcatggtag cggtagcggt tcaggtagcg gttctggttc tggtagccat 360 ccgattccgg atagctctcc gctgctgcag tttggtggtc aggttcgtca gcgttatctg 420 tataccgatg atgcacagca gaccgaagca catctggaaa ttcgtgaaga tggcaccgtt 480 ggtggtgcag cagatcagtc tccggaaagc ctgctgcagc tgaaagcact gaagccaggt 540 gttattcaga ttctgggtgt taaaaccagc cgttttctgt gtcagcgtcc ggatggtgca 600 ctgtatggta gcctgcattt tgatccggaa gcatgcagct ttcgtgaact gctgctggaa 660 gatggctata atgtgtatca gagcgaagca catggtctgc cgctgcattt acctggtaat 720 aaatctccgc atcgtgatcc ggcaccgcgt ggtccggcac gtttcctgcc tctgcctggt 780 ctgcctccgg cactgccaga acctccgggt attctggcac cgcagcctcc ggatgttggt 840 agcagcgatc cgctgtctat ggttggtccg agccagggtc gtagcccgag ctatgca 897 <210> 177 <211> 897 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 177 atgggtgttt ctgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta attctccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tgtatgcagt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag cattaattat cgcaccgaaa ttgataaacc gagccagcat 300 catcatcacc atcatggtag cggtagcggt tcaggtagcg gttctggttc tggtagcccg 360 attccggata gctctccgct gctgcagttt ggtggtcagg ttcgtcagcg ttatctgtat 420 accgatgatg cacagcagac cgaagcacat ctggaaattc gtgaagatgg caccgttggt 480 ggtgcagcag atcagtctcc ggaaagcctg ctgcagctga aagcactgaa gccaggtgtt 540 attcagattc tgggtgttaa aaccagccgt tttctgtgtc agcgtccgga tggtgcactg 600 tatggtagcc tgcattttga tccggaagca tgcagctttc gtgaactgct gctggaagat 660 ggctataatg tgtatcagag cgaagcacat ggtctgccgc tgcatttacc tggtaataaa 720 tctccgcatc gtgatccggc accgcgtggt ccggcacgtt tcctgcctct gcctggtctg 780 cctccggcac tgccagaacc tccgggtatt ctggcaccgc agcctccgga tgttggtagc 840 agcgatccgc tgtctatggt tggtccgagc cagggtcgta gcccgagcta tgcaagc 897 <210> 178 <211> 897 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 178 atgggtgttt ctgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta attctccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tgtatgcagt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag cattaattat cgcaccgaaa ttgataaacc gagcggtggt 300 agcggtagcg gttcaggtag cggttctggt tctggtagcc cgattccgga tagctctccg 360 ctgctgcagt ttggtggtca ggttcgtcag cgttatctgt ataccgatga tgcacagcag 420 accgaagcac atctggaaat tcgtgaagat ggcaccgttg gtggtgcagc agatcagtct 480 ccggaaagcc tgctgcagct gaaagcactg aagccaggtg ttattcagat tctgggtgtt 540 aaaaccagcc gttttctgtg tcagcgtccg gatggtgcac tgtatggtag cctgcatttt 600 gatccggaag catgcagctt tcgtgaactg ctgctggaag atggctataa tgtgtatcag 660 agcgaagcac atggtctgcc gctgcattta cctggtaata aatctccgca tcgtgatccg 720 gcaccgcgtg gtccggcacg tttcctgcct ctgcctggtc tgcctccggc actgccagaa 780 cctccgggta ttctggcacc gcagcctccg gatgttggta gcagcgatcc gctgtctatg 840 gttggtccga gccagggtcg tagcccgagc tatgcaagcc atcatcatca ccatcat 897 <210> 179 <211> 897 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 179 atgggtgttt ctgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta attctccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tgtatgcagt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag cattaattat cgcaccgaaa ttgataaacc gagcggtggt 300 agcggtagcg gttcaggtag cggttctggt tctggtagcc atccgattcc ggatagctct 360 ccgctgctgc agtttggtgg tcaggttcgt cagcgttatc tgtataccga tgatgcacag 420 cagaccgaag cacatctgga aattcgtgaa gatggcaccg ttggtggtgc agcagatcag 480 tctccggaaa gcctgctgca gctgaaagca ctgaagccag gtgttattca gattctgggt 540 gttaaaacca gccgttttct gtgtcagcgt ccggatggtg cactgtatgg tagcctgcat 600 tttgatccgg aagcatgcag ctttcgtgaa ctgctgctgg aagatggcta taatgtgtat 660 cagagcgaag cacatggtct gccgctgcat ttacctggta ataaatctcc gcatcgtgat 720 ccggcaccgc gtggtccggc acgtttcctg cctctgcctg gtctgcctcc ggcactgcca 780 gaacctccgg gtattctggc accgcagcct ccggatgttg gtagcagcga tccgctgtct 840 atggttggtc cgagccaggg tcgtagcccg agctatgcac atcatcatca ccatcat 897 <210> 180 <211> 900 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 180 atgccgattc cggatagctc tccgctgctg cagtttggtg gtcaggttcg tcagcgttat 60 ctgtataccg atgatgcaca gcagaccgaa gcacatctgg aaattcgtga agatggcacc 120 gttggtggtg cagcagatca gtctccggaa agcctgctgc agctgaaagc actgaaaccg 180 ggtgttattc agattctggg tgttaaaacc agccgttttc tgtgtcagcg tccggatggt 240 gcactgtatg gtagcctgca ttttgatccg gaagcatgca gctttcgtga actgctgctg 300 gaagatggct ataatgtgta tcagagcgaa gcacatggtc tgccgctgca tctgcctggt 360 aataaatctc cgcatcgtga tccggcaccg cgtggtccgg cacgtttcct gccgctgcct 420 ggtctgcctc cggcactgcc agaacctccg ggtattctgg caccgcagcc tccggatgtt 480 ggtagcagcg atccgctgtc tatggttggt ccgagccagg gtcgtagccc gagctatgca 540 agcggtggta gcggtagcgg ttctggtagc ggttcaggtt ctggttctgg tgtttctgat 600 gttccgcgtg atctggaagt tgttgcagca accccgacca gcctgctgat tagctggcat 660 agctattatg aacagaatag ctattatcgc attacctatg gtgaaaccgg tggtaattct 720 ccggttcagg aatttaccgt tccgtatagc cagaccaccg caaccattag cggtctgaag 780 cctggtgtgg attataccat taccgtgtat gcagtttatg gcagcaaata ttattatccg 840 attagcatta attatcgcac cgaaattgat aaaccgagcc agcatcatca tcaccatcat 900 <210> 181 <211> 912 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 181 atgggtgttt ctgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct gggaagatga tagctattat agccgctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta attctccggt tcaggaattt accgttccga gcgatctgta taccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgactat accattaccg tttatgccgt tacctatgac 240 gttaccgatc tgattatgca tgaaccgatc agcattaatt atcgcaccga gattgataaa 300 ccgagcggtg gtagcggtag cggttctggt agcggttcag gttcaggtag cccgattccg 360 gatagctctc cgctgctgca gtttggtggt caggttcgtc agcgttatct gtatactgat 420 gatgcacagc agaccgaagc acatctggaa attcgtgaag atggcaccgt tggtggtgca 480 gcagatcagt ctccggaaag cctgctgcag ctgaaagcac tgaaacctgg tgttattcag 540 attctgggtg ttaaaaccag ccgttttctg tgtcagcgtc cggatggtgc actgtatggt 600 agcctgcatt ttgatccgga agcatgcagc tttcgtgaac tgctgctgga agatggctat 660 aatgtgtatc agagcgaagc acatggtctg ccgctgcatc tgcctggtaa taaatctccg 720 catcgtgatc cggcaccgcg tggtccggca cgttttctgc cgctgcctgg tctgcctccg 780 gcactgcctg aaccgcctgg tattctggca ccgcagcctc cggatgttgg tagcagcgat 840 ccgctgtcta tggttggtcc gagccagggt cgtagcccga gctatgcaag ccatcatcat 900 catcaccatt ga 912 <210> 182 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 182 atgcatcatc atcatcacca tgatagctct ccgctgctgc agtttggtgg tcaggttcgt 60 cagcgttatc tgtataccga tgatgcacag cagaccgaag cacatctgga aattcgtgaa 120 gatggcaccg ttggtggtgc agcagatcag tctccggaaa gcctgctgca gctgaaagca 180 ctgaaaccgg gtgttattca gattctgggt gttaaaacca gccgttttct gtgtcagcgt 240 ccggatggtg cactgtatgg tagcctgcat tttgatccgg aagcatgcag ctttcgtgaa 300 ctgctgctgg aagatggcta taatgtgtat cagagcgaag cacatggcct gccgctgcat 360 ctgcctggta ataaatctcc gcatcgtgat ccggcaccgc gtggtccggc acgttttctg 420 ccgctgcctg gtctgcctcc ggcactgcct gaaccgcctg gtattctggc accgcagcct 480 ccggatgttg gtagcagcga tccgctgtct atggttggtc cgagccaggg tcgtagcccg 540 agctatgcaa gctga 555 <210> 183 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 183 atgcatcacc accatcatca tattccggat agcagtccgc tgctgcagtt tggtggtcag 60 gttcgtcagc gttatctgta taccgatgat gcacagcaga ccgaagccca tctggaaatt 120 cgtgaagatg gcaccgttgg tggtgcagca gatcagagtc cggaaagcct gctgcagctg 180 aaagcactga aaccgggtgt tattcagatt ctgggtgtta aaaccagccg ttttctgtgt 240 cagcgtccgg atggtgcact gtatggtagc ctgcattttg atccggaagc atgtagcttt 300 cgtgaactgc tgctggaaga tggttataat gtttatcaga gcgaagcaca tggtctgccg 360 ctgcatctgc ctggtaataa aagtccgcat cgtgatccgg caccgcgtgg tccggcacgt 420 tttctgccgc tgcctggtct gcctccggca ctgcctgaac cgcctggtat tctggcaccg 480 cagcctccgg atgttggtag cagcgatccg ctgagcatgg ttggtccgag ccagggtcgt 540 agcccgagct atgcaagcgg tagcggttca ggtagcggta gtggtagcgg cagcggtagc 600 gttagtgatg ttccgcgtga tctggaagtt gttgcagcaa ccccgaccag cctgctgatt 660 agctggcata gctattatga acagaatagc tattatcgca ttacctatgg tgaaaccggt 720 ggtaatagtc cggttcagga atttaccgtt ccgtatagcc agaccaccgc aaccattagc 780 ggtctgaaac ctggtgttga ttataccatt accgtgtatg cagtgtatgg cagcaaatat 840 tattatccga ttagcatcaa ttatcgcacc gaaattgata aaccgagcgg tggtagcggt 900 tctggttcag gttcaggtag tggttctggt agtccggata gctcacctct gctgcagttt 960 ggtggccagg tgcgccagcg ctatctgtac acagatgatg cccagcagac agaagcccat 1020 ctggaaatcc gcgaagatgg tacagtgggt ggcgctgccg atcagtcacc ggaatcactg 1080 ctgcagctga aagccctgaa acctggcgtg atccagatcc tgggcgtgaa aacctcacgc 1140 tttctgtgcc agcgtcctga tggcgctctg tatggctcac tgcattttga tcctgaagcc 1200 tgctcatttc gcgaactgct gctggaagat ggctataacg tgtatcagtc tgaagcccat 1260 ggcttacctc tgcatctgcc aggcaacaaa tcacctcatc gtgatcctgc ccctcgcggt 1320 cctgctcgct ttctgccact gccaggcctg cctccagccc tgccagaacc tccaggcatc 1380 ctggcacctc agccacctga tgtgggttca agtgatccgc tgtcaatggt gggtccgtca 1440 cagggtcgta gtccgtctta tgccagctga 1470 <210> 184 <211> 882 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 184 atgggtgttt ctgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta attctccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tgtatgcagt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag cattaattat cgcaccgaaa ttgaaaaacc gagccagggt 300 agcggtagcg gttcaggtag cggttctggt tctggtagcc cgattccgga tagctctccg 360 ctgctgcagt ttggtggtca ggttcgtcag cgttatctgt ataccgatga tgcacagcag 420 accgaagcac atctggaaat tcgtgaagat ggcaccgttg gtggtgcagc agatcagtct 480 ccggaaagcc tgctgcagct gaaagcactg aagccaggtg ttattcagat tctgggtgtt 540 aaaaccagcc gttttctgtg tcagcgtccg gatggtgcac tgtatggtag cctgcatttt 600 gatccggaag catgcagctt tcgtgaactg ctgctggaag atggctataa tgtgtatcag 660 agcgaagcac atggtctgcc gctgcattta cctggtaata aatctccgca tcgtgatccg 720 gcaccgcgtg gtccggcacg tttcctgcct ctgcctggtc tgcctccggc actgccagaa 780 cctccgggta ttctggcacc gcagcctccg gatgttggta gcagcgatcc gctgtctatg 840 gttggtccga gccagggtcg tagcccgagc tatgcaagct ga 882 <210> 185 <211> 852 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 185 atgggcgtta gtgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta atagtccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tttatgcggt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag catcaattat cgcaccgaaa tcggtggtag cggtagcggt 300 tcaggtagcc cgattccgga tagcagtccg ctgctgcagt ttggtggtca ggttcgtcag 360 cgttatctgt ataccgatga tgcacagcag accgaagcac atctggaaat tcgtgaagat 420 ggcaccgttg gtggtgcagc agatcagagt ccggaaagcc tgctgcagct gaaagcactg 480 aaacctggtg ttattcagat tctgggtgtt aaaaccagcc gttttctgtg tcagcgtccg 540 gatggtgcac tgtatggtag cctgcatttt gatccggaag catgtagctt tcgtgaactg 600 ctgctggaag atggttataa tgtttatcag agcgaagctc atggtctgcc gctgcatctg 660 cctggtaata aaagtccgca tcgtgatccg gcaccgcgtg gtccggcacg ttttctgcct 720 ctgcctggtt tacctccggc actgcctgaa ccgcctggta ttctggcacc gcagcctccg 780 gatgttggta gcagcgatcc gctgagcatg gttggtccga gccagggtcg tagcccgagc 840 tatgcaagct ga 852 <210> 186 <211> 840 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 186 atgggcgtta gtgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta atagtccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tttatgcggt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag catcaattat cgcaccgaaa tcggtggtag cggtagcccg 300 attccggata gcagtccgct gctgcagttt ggtggtcagg ttcgtcagcg ttatctgtat 360 accgatgatg cacagcagac cgaagcacat ctggaaattc gtgaagatgg caccgttggt 420 ggtgcagcag atcagagtcc ggaaagcctg ctgcagctga aagcactgaa acctggtgtt 480 attcagattc tgggtgttaa aaccagccgt tttctgtgtc agcgtccgga tggtgcactg 540 tatggtagcc tgcattttga tccggaagca tgtagctttc gtgaactgct gctggaagat 600 ggttataatg tttatcagag cgaagctcat ggtctgccgc tgcatctgcc tggtaataaa 660 agtccgcatc gtgatccggc accgcgtggt ccggcacgtt ttctgcctct gcctggttta 720 cctccggcac tgcctgaacc gcctggtatt ctggcaccgc agcctccgga tgttggtagc 780 agcgatccgc tgagcatggt tggtccgagc cagggtcgta gcccgagcta tgcaagctga 840 <210> 187 <211> 825 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 187 atgggcgtta gtgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta atagtccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tttatgcggt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag catcaattat 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attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tttatgcggt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag catcaattat cgcaccgaaa tccatcacca ccatcatcat 300 ggtagcggta gcggttcagg tagcccgatt ccggatagca gtccgctgct gcagtttggt 360 ggtcaggttc gtcagcgtta tctgtatacc gatgatgcac agcagaccga agcacatctg 420 gaaattcgtg aagatggcac cgttggtggt gcagcagatc agagtccgga aagcctgctg 480 cagctgaaag cactgaaacc tggtgttatt cagattctgg gtgttaaaac cagccgtttt 540 ctgtgtcagc gtccggatgg tgcactgtat ggtagcctgc attttgatcc ggaagcatgt 600 agctttcgtg aactgctgct ggaagatggt tataatgttt atcagagcga agctcatggt 660 ctgccgctgc atctgcctgg taataaaagt ccgcatcgtg atccggcacc gcgtggtccg 720 gcacgttttc tgcctctgcc tggtttacct ccggcactgc ctgaaccgcc tggtattctg 780 gcaccgcagc ctccggatgt tggtagcagc gatccgctga gcatggttgg tccgagccag 840 ggtcgtagcc cgagctatgc aagctga 867 <210> 189 <211> 855 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 189 atgggcgtta gtgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta atagtccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tttatgcggt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag catcaattat cgcaccgaaa tccatcacca ccatcatcat 300 ggtagcggta gcccgattcc ggatagcagt ccgctgctgc agtttggtgg tcaggttcgt 360 cagcgttatc tgtataccga tgatgcacag cagaccgaag cacatctgga aattcgtgaa 420 gatggcaccg ttggtggtgc agcagatcag agtccggaaa gcctgctgca gctgaaagca 480 ctgaaacctg gtgttattca gattctgggt gttaaaacca gccgttttct gtgtcagcgt 540 ccggatggtg cactgtatgg tagcctgcat tttgatccgg aagcatgtag ctttcgtgaa 600 ctgctgctgg aagatggtta taatgtttat cagagcgaag ctcatggtct gccgctgcat 660 ctgcctggta ataaaagtcc gcatcgtgat ccggcaccgc gtggtccggc acgttttctg 720 cctctgcctg gtttacctcc ggcactgcct gaaccgcctg gtattctggc accgcagcct 780 ccggatgttg gtagcagcga tccgctgagc atggttggtc cgagccaggg tcgtagcccg 840 agctatgcaa gctga 855 <210> 190 <211> 843 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 190 atgggcgtta gtgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta atagtccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tttatgcggt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag catcaattat cgcaccgaaa tccatcacca ccatcatcat 300 ccgattccgg atagcagtcc gctgctgcag tttggtggtc aggttcgtca gcgttatctg 360 tataccgatg atgcacagca gaccgaagca catctggaaa ttcgtgaaga tggcaccgtt 420 ggtggtgcag cagatcagag tccggaaagc ctgctgcagc tgaaagcact gaaacctggt 480 gttattcaga ttctgggtgt taaaaccagc cgttttctgt gtcagcgtcc ggatggtgca 540 ctgtatggta gcctgcattt tgatccggaa gcatgtagct ttcgtgaact gctgctggaa 600 gatggttata atgtttatca gagcgaagct catggtctgc cgctgcatct gcctggtaat 660 aaaagtccgc atcgtgatcc ggcaccgcgt ggtccggcac gttttctgcc tctgcctggt 720 ttacctccgg cactgcctga accgcctggt attctggcac cgcagcctcc ggatgttggt 780 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gcacgttttc tgcctctgcc tggtttacct ccggcactgc ctgaaccgcc tggtattctg 780 gcaccgcagc ctccggatgt tggtagcagc gatccgctga gcatggttgg tccgagccag 840 ggtcgtagcc cgagctatgc aagctga 867 <210> 198 <211> 849 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 198 atgggcgtta gtgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta atagtccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tttatgcggt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag catcaattat cgcaccgaaa tcggtggtag cgaaggtggt 300 agtgaaccga ttccggatag cagtccgctg ctgcagtttg gtggtcaggt tcgtcagcgt 360 tatctgtata ccgatgatgc acagcagacc gaagcacatc tggaaattcg tgaagatggc 420 accgttggtg gtgcagcaga tcagagtccg gaaagcctgc tgcagctgaa agcactgaaa 480 cctggtgtta ttcagattct gggtgttaaa accagccgtt ttctgtgtca gcgtccggat 540 ggtgcactgt atggtagcct gcattttgat ccggaagcat gtagctttcg 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360 ggtcaggttc gtcagcgtta tctgtatacc gatgatgcac agcagaccga agcacatctg 420 gaaattcgtg aagatggcac cgttggtggt gcagcagatc agagtccgga aagcctgctg 480 cagctgaaag cactgaaacc tggtgttatt cagattctgg gtgttaaaac cagccgtttt 540 ctgtgtcagc gtccggatgg tgcactgtat ggtagcctgc attttgatcc ggaagcatgt 600 agctttcgtg aactgctgct ggaagatggt tataatgttt atcagagcga agctcatggt 660 ctgccgctgc atctgcctgg taataaaagt ccgcatcgtg atccggcacc gcgtggtccg 720 gcacgttttc tgcctctgcc tggtttacct ccggcactgc ctgaaccgcc tggtattctg 780 gcaccgcagc ctccggatgt tggtagcagc gatccgctga gcatggttgg tccgagccag 840 ggtcgtagcc cgagctatgc aagctga 867 <210> 201 <211> 855 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 201 atgggcgtta gtgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta atagtccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tttatgcggt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag catcaattat cgcaccgaaa tcgaaaaacc gagccaaggt 300 ggttcaggta gcccgattcc ggatagcagt ccgctgctgc agtttggtgg tcaggttcgt 360 cagcgttatc tgtataccga tgatgcacag cagaccgaag cacatctgga aattcgtgaa 420 gatggcaccg ttggtggtgc agcagatcag agtccggaaa gcctgctgca gctgaaagca 480 ctgaaacctg gtgttattca gattctgggt gttaaaacca gccgttttct gtgtcagcgt 540 ccggatggtg cactgtatgg tagcctgcat tttgatccgg aagcatgtag ctttcgtgaa 600 ctgctgctgg aagatggtta taatgtttat cagagcgaag ctcatggtct gccgctgcat 660 ctgcctggta ataaaagtcc gcatcgtgat ccggcaccgc gtggtccggc acgttttctg 720 cctctgcctg gtttacctcc ggcactgcct gaaccgcctg gtattctggc accgcagcct 780 ccggatgttg gtagcagcga tccgctgagc atggttggtc cgagccaggg tcgtagcccg 840 agctatgcaa gctga 855 <210> 202 <211> 840 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 202 atgggcgtta gtgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta atagtccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tttatgcggt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag catcaattat cgcaccgaaa tcgaaaaacc gagccaaccg 300 attccggata gcagtccgct gctgcagttt ggtggtcagg ttcgtcagcg ttatctgtat 360 accgatgatg cacagcagac cgaagcacat ctggaaattc gtgaagatgg caccgttggt 420 ggtgcagcag atcagagtcc ggaaagcctg ctgcagctga aagcactgaa acctggtgtt 480 attcagattc tgggtgttaa aaccagccgt tttctgtgtc agcgtccgga tggtgcactg 540 tatggtagcc tgcattttga tccggaagca tgtagctttc gtgaactgct gctggaagat 600 ggttataatg tttatcagag cgaagctcat ggtctgccgc tgcatctgcc tggtaataaa 660 agtccgcatc gtgatccggc accgcgtggt ccggcacgtt ttctgcctct gcctggttta 720 cctccggcac tgcctgaacc gcctggtatt ctggcaccgc agcctccgga tgttggtagc 780 agcgatccgc tgagcatggt tggtccgagc cagggtcgta gcccgagcta tgcaagctga 840 <210> 203 <211> 882 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 203 atgggcgtta gtgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta atagtccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tttatgcggt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag catcaattat cgcaccgaaa tcgaaaaacc gagccaacat 300 caccaccatc atcatggtag cggtagcggt tcaggtagcc cgattccgga tagcagtccg 360 ctgctgcagt ttggtggtca ggttcgtcag cgttatctgt ataccgatga tgcacagcag 420 accgaagcac atctggaaat tcgtgaagat ggcaccgttg gtggtgcagc agatcagagt 480 ccggaaagcc tgctgcagct gaaagcactg aaacctggtg ttattcagat tctgggtgtt 540 aaaaccagcc gttttctgtg tcagcgtccg gatggtgcac tgtatggtag cctgcatttt 600 gatccggaag catgtagctt tcgtgaactg ctgctggaag atggttataa tgtttatcag 660 agcgaagctc atggtctgcc gctgcatctg cctggtaata aaagtccgca tcgtgatccg 720 gcaccgcgtg gtccggcacg ttttctgcct ctgcctggtt tacctccggc actgcctgaa 780 ccgcctggta ttctggcacc gcagcctccg gatgttggta gcagcgatcc gctgagcatg 840 gttggtccga gccagggtcg tagcccgagc tatgcaagct ga 882 <210> 204 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 204 atgggcgtta gtgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta atagtccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tttatgcggt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag catcaattat cgcaccgaaa tcgaaaaacc gagccaacat 300 caccaccatc atcatggttc aggtagcccg attccggata gcagtccgct gctgcagttt 360 ggtggtcagg ttcgtcagcg ttatctgtat accgatgatg cacagcagac cgaagcacat 420 ctggaaattc gtgaagatgg caccgttggt ggtgcagcag atcagagtcc ggaaagcctg 480 ctgcagctga aagcactgaa acctggtgtt attcagattc tgggtgttaa aaccagccgt 540 tttctgtgtc agcgtccgga tggtgcactg tatggtagcc tgcattttga tccggaagca 600 tgtagctttc gtgaactgct gctggaagat ggttataatg tttatcagag cgaagctcat 660 ggtctgccgc tgcatctgcc tggtaataaa agtccgcatc gtgatccggc 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cattttgatc cggaagcatg tagctttcgt 600 gaactgctgc tggaagatgg ttataatgtt tatcagagcg aagctcatgg tctgccgctg 660 catctgcctg gtaataaaag tccgcatcgt gatccggcac cgcgtggtcc ggcacgtttt 720 ctgcctctgc ctggtttacc tccggcactg cctgaaccgc ctggtattct ggcaccgcag 780 cctccggatg ttggtagcag cgatccgctg agcatggttg gtccgagcca gggtcgtagc 840 ccgagctatg caagctga 858 <210> 206 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 206 atgggcgtta gtgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta atagtccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tttatgcggt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag catcaattat cgcaccgaaa tcgaaaaacc gagccaagaa 300 gatgaggacg aggacgaaga tgaggatccg attccggata gcagtccgct gctgcagttt 360 ggtggtcagg ttcgtcagcg ttatctgtat accgatgatg cacagcagac cgaagcacat 420 ctggaaattc gtgaagatgg 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209 atgggcgtta gtgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta atagtccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tttatgcggt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag catcaattat cgcaccgaaa tcgaaaaacc gagccaaggt 300 agcgaaggta gtgaaggttc agaaggttct gaaggtagcg aaccgattcc ggatagcagt 360 ccgctgctgc agtttggtgg tcaggttcgt cagcgttatc tgtataccga tgatgcacag 420 cagaccgaag cacatctgga aattcgtgaa gatggcaccg ttggtggtgc agcagatcag 480 agtccggaaa gcctgctgca gctgaaagca ctgaaacctg gtgttattca gattctgggt 540 gttaaaacca gccgttttct gtgtcagcgt ccggatggtg cactgtatgg tagcctgcat 600 tttgatccgg aagcatgtag ctttcgtgaa ctgctgctgg aagatggtta taatgtttat 660 cagagcgaag ctcatggtct gccgctgcat ctgcctggta ataaaagtcc gcatcgtgat 720 ccggcaccgc gtggtccggc acgttttctg cctctgcctg gtttacctcc ggcactgcct 780 gaaccgcctg gtattctggc accgcagcct ccggatgttg gtagcagcga tccgctgagc 840 atggttggtc 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atccgattag catcaattat cgcaccgaaa tcgaaaaacc gagccaaggt 300 ggtagcgaag gtggtagtga accgattccg gatagcagtc cgctgctgca gtttggtggt 360 caggttcgtc agcgttatct gtataccgat gatgcacagc agaccgaagc acatctggaa 420 attcgtgaag atggcaccgt tggtggtgca gcagatcaga gtccggaaag cctgctgcag 480 ctgaaagcac tgaaacctgg tgttattcag attctgggtg ttaaaaccag ccgttttctg 540 tgtcagcgtc cggatggtgc actgtatggt agcctgcatt ttgatccgga agcatgtagc 600 tttcgtgaac tgctgctgga agatggttat aatgtttatc agagcgaagc tcatggtctg 660 ccgctgcatc tgcctggtaa taaaagtccg catcgtgatc cggcaccgcg tggtccggca 720 cgttttctgc ctctgcctgg tttacctccg gcactgcctg aaccgcctgg tattctggca 780 ccgcagcctc cggatgttgg tagcagcgat ccgctgagca tggttggtcc gagccagggt 840 cgtagcccga gctatgcaag ctga 864 <210> 214 <211> 861 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 214 atgggcgtta gtgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta atagtccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tttatgcggt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag catcaattat cgcaccgaaa tcgaaaaacc gagccaaagc 300 accagcacca gtaccggtcc gattccggat agcagtccgc tgctgcagtt tggtggtcag 360 gttcgtcagc gttatctgta taccgatgat gcacagcaga ccgaagcaca tctggaaatt 420 cgtgaagatg gcaccgttgg tggtgcagca gatcagagtc cggaaagcct gctgcagctg 480 aaagcactga aacctggtgt tattcagatt ctgggtgtta aaaccagccg ttttctgtgt 540 cagcgtccgg atggtgcact gtatggtagc ctgcattttg atccggaagc atgtagcttt 600 cgtgaactgc tgctggaaga tggttataat gtttatcaga gcgaagctca tggtctgccg 660 ctgcatctgc ctggtaataa aagtccgcat cgtgatccgg caccgcgtgg tccggcacgt 720 tttctgcctc tgcctggttt acctccggca ctgcctgaac cgcctggtat tctggcaccg 780 cagcctccgg atgttggtag cagcgatccg ctgagcatgg ttggtccgag ccagggtcgt 840 agcccgagct atgcaagctg a 861 <210> 215 <211> 1 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 215 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Synthetic peptide <400> 221 Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 222 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 222 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr Gly Ser Lys 65 70 75 80 Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu 85 90 <210> 223 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 223 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 228 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 229 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 229 Met His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 1 5 10 15 Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 50 55 60 Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser Tyr Tyr 65 70 75 80 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 85 90 95 Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 100 105 110 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr Gly Ser Lys Tyr 115 120 125 Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 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Synthetic polypeptide <400> 235 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr Gly Ser 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg 115 120 125 Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro 130 135 140 Pro Pro Ser 145 <210> 236 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 236 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser 20 25 30 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 245 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr Gly Ser 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Arg Cys Pro 100 105 110 Asp Gly Gln Phe Cys Pro Val Ala Cys Cys Leu Asp Pro Gly Gly Ala 115 120 125 Ser Tyr Ser Cys Cys Arg Pro Leu Leu Asp Lys Trp Pro Thr Thr Leu 130 135 140 Ser Arg His Leu Gly Gly Pro Cys Gln Val Asp Ala His Cys Ser Ala 145 150 155 160 Gly His Ser Cys Ile Phe Thr Val Ser Gly Thr Ser Ser Cys Cys Pro 165 170 175 Phe Pro Glu Ala Val Ala Cys Gly Asp Gly His His Cys Cys Pro Arg 180 185 190 Gly Phe His Cys Ser Ala Asp Gly Arg Ser Cys 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 283 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr Gly Ser 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Glu Asp Glu 85 90 95 Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys 100 105 110 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala Ser Phe 115 120 125 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 130 135 140 Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 145 150 155 160 Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 165 170 175 Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu 180 185 190 Asp Gln Pro Leu His Thr Leu 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 328 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr Gly Ser 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Ile Glu Asp 85 90 95 Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Gly Cys 100 105 <210> 329 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 329 Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 330 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 330 Tyr Pro Ile Lys Pro 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 385 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr Gly Ser 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Glu Asp Glu 85 90 95 Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro 100 105 110 Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Glu Val Cys Glu Leu 115 120 125 Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala 130 135 140 Tyr Gln Arg Phe Tyr Gly Pro Val 145 150 <210> 386 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 386 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May or may not be present <400> 394 Met Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro 1 5 10 15 Leu Glu Pro Arg Arg Glu Val Cys Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu 20 25 30 Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Gln Arg Phe Tyr Gly 35 40 45 Pro Val Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Gly Val Ser Asp 50 55 60 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu 65 70 75 80 Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser Tyr Tyr Arg Ile Thr 85 90 95 Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro 100 105 110 Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp 115 120 125 Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Tyr Pro 130 135 140 Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu 145 150 <210> 395 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May or may not be present <400> 395 Met Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro 1 5 10 15 Leu Glu Pro Arg Arg Glu Val Cys Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu 20 25 30 Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Gln Arg Phe Tyr Gly 35 40 45 Pro Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 65 70 75 80 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser 85 90 95 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 100 105 110 Glu Phe Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 115 120 125 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr Gly Ser 130 135 140 Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu 145 150 155 <210> 396 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May or may not be present <400> 396 Met Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu 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ggcaacaaaa gcccgcatcg tgatccggca ccgcgtggtc cggcacgttt tctgccgctg 420 ccgggtctgc cgccagcact gccggaaccg ccgggtattc tggcaccgca gccgccggat 480 gttggtagca gcgatccgct gtctatggtg ggtccgagcc agggtcgtag cccgagctat 540 gcgcatcatc atcatcacca ttaataa 567 <210> 399 <211> 570 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 399 atgcatccga ttccggatag cagcccgctg ctgcagtttg gcggccaggt gcgtcagcgt 60 tatctgtata ccgatgatgc gcagcagacc gaagcgcatc tggaaattcg tgaagatggc 120 accgtgggcg gtgcggcgga tcagagcccg gaaagcctgc tgcagctgaa agcgctgaaa 180 ccgggcgtga ttcagattct gggcgtgaaa accagccgtt ttctgtgcca gcgtccggat 240 ggcgcgctgt atggcagcct gcattttgat ccggaagcgt gcagctttcg tgaactgctg 300 ctggaagatg gctataacgt gtatcagagc gaagcgcatg gcctgccgct gcatctgccg 360 ggcaacaaaa gcccgcatcg tgatccggca ccgcgtggtc cggcacgttt tctgccgctg 420 ccgggtctgc cgccagcact gccggaaccg ccgggtattc tggcaccgca gccgccggat 480 gttggtagca gcgatccgct gtctatggtg ggtccgagcc agggtcgtag 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ctgatgttcc gcgtgatctg gaagttgttg cagcaacccc gaccagcctg 60 ctgattagct ggcatagcta ttatgaacag aatagctatt atcgcattac ctatggtgaa 120 accggtggta attctccggt tcaggaattt accgttccgt atagccagac caccgcaacc 180 attagcggtc tgaaaccggg tgttgattat accattaccg tgtatgcagt gtatggcagc 240 aaatattatt atccgattag cattaattat cgcaccgaaa ttgataaacc gagcggtggt 300 agcggtagcg gttcaggtag cggttctggt tctggtagcc cgattccgga tagctctccg 360 ctgctgcagt ttggtggtca ggttcgtcag cgttatctgt ataccgatga tgcacagcag 420 accgaagcac atctggaaat tcgtgaagat ggcaccgttg gtggtgcagc agatcagtct 480 ccggaaagcc tgctgcagct gaaagcactg aagccaggtg ttattcagat tctgggtgtt 540 aaaaccagcc gttttctgtg tcagcgtccg gatggtgcac tgtatggtag cctgcatttt 600 gatccggaag catgcagctt tcgtgaactc tgctggaaga tggctataat gtgtatcaga 660 gcgaagcaca tggtctgccg ctgcatttac ctggtaataa atctccgcat cgtgatccgg 720 caccgcgtgg tccggcacgt ttcctgcctc tgcctggtct gcctccggca ctgccagaac 780 ctccgggtat tctggcaccg cagcctccgg atgttggtag cagcgatccg ctgtctatgg 840 ttggtccgag ccagggtcgt agcccgagct 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140 Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe 145 150 155 <210> 428 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 428 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr Gly Ser 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Ile Asp Lys 85 90 95 Pro Ser Gln Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 100 105 110 Ser Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln 115 120 125 Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys 130 135 140 Gly Pro Met Pro Phe 145 <210> 429 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May or may not be present <400> 429 Met Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Val Ser Asp 20 25 30 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu 35 40 45 Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser Tyr Tyr Arg Ile Thr 50 55 60 Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro 65 70 75 80 Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp 85 90 95 Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Tyr Pro 100 105 110 Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu 115 120 <210> 430 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May or may not be present <400> 430 Met Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln 1 5 10 15 Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys 20 25 30 Gly Pro Met Pro Phe Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Ser Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala 50 55 60 Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln 65 70 75 80 Asn Ser Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro 85 90 95 Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile Ser 100 105 110 Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr 115 120 125 Gly Ser Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu 130 135 140 <210> 431 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 431 His His His His His His 1 5 <210> 432 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(20) <223> This sequence may encompass 2-10, 2-8, 2-5, 3-10, 3-8, 3-7, 3-5, 4-7, or 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 "Glu-Asp" repeating units <400> 432 Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp 1 5 10 15 Glu Asp Glu Asp 20 <210> 433 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(20) <223> This sequence may encompass 2-10, 2-7, 2-5, 3-10, 3-7, 3-5, 3, 4 or 5 "Glu-Asp" repeating units <400> 433 Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp 1 5 10 15 Glu Asp Glu Asp 20 <210> 434 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Pancreatic peptide <400> 434 Arg Tyr Tyr Ser Ala 1 5 <210> 435 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 435 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 436 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 436 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Ser Tyr Tyr Glu Gln Asn Ser Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Tyr Gly Ser Lys 65 70 75 80 Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu 85 90 <210> 437 <211> 567 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 437 atgcatcatc atcatcacca tccgattccg gatagcagcc cgctgctgca gtttggcggc 60 caggtgcgtc agcgttatct gtataccgat gatgcgcagc agaccgaagc gcatctggaa 120 attcgtgaag atggcaccgt gggcggtgcg gcggatcaga gcccggaaag cctgctgcag 180 ctgaaagcgc tgaaaccggg cgtgattcag attctgggcg tgaaaaccag ccgttttctg 240 tgccagcgtc cggatggcgc gctgtatggc agcctgcatt ttgatccgga agcgtgcagc 300 tttcgtgaac tgctgctgga agatggctat aacgtgtatc agagcgaagc gcatggcctg 360 ccgctgcatc tgccgggcaa caaaagcccg catcgtgatc cggcaccgcg tggtccggca 420 cgttttctgc cgctgccggg tctgccgcca gcactgccgg aaccgccggg tattctggca 480 ccgcagccgc cggatgttgg tagcagcgat ccgctgtcta tggtgggtcc gagccagggt 540 cgtagcccga gctatgcgag ctaataa 567 <210> 438 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 438 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Lys Cys Asn Thr Ala Thr 1 5 10 15 Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val Arg Ser Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly Ser Asn Thr Tyr 35 40 45 <210> 439 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Ahx <400> 439 Xaa Ala Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Ser Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 440 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 440 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ala Lys Pro Glu Ala Pro 1 5 10 15 Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu 20 25 30 Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 35 40 <210> 441 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Ahx <400> 441 Xaa Ala Pro Leu Glu Pro Met Tyr Pro Gly Asp Tyr Ala Thr Pro Glu 1 5 10 15 Gln Met Ala Gln Tyr Glu Thr Gln Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Thr Leu 20 25 30 Thr Arg Pro Arg Tyr 35 <210> 442 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 442 Ala Pro Leu Glu Pro Met Tyr Pro Gly Asp Tyr Ala Thr Pro Glu Gln 1 5 10 15 Met Ala Gln Tyr Glu Thr Gln Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Thr Leu Thr 20 25 30 Arg Pro Arg Tyr 35 <210> 443 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 443 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ala Pro Leu Glu Pro Met 1 5 10 15 Tyr Pro Gly Asp Tyr Ala Thr Pro Glu Gln Met Ala Gln Tyr Glu Thr 20 25 30 Gln Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Thr Leu Thr Arg Pro Arg Tyr 35 40 45 <210> 444 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(14) <223> This sequence may encompass 3 to 7 "Glu-Asp" repeating units <400> 444 Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp 1 5 10

Claims (65)

  1. 피브로넥틴 유형 III 제10 (10Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드이며, 여기서 10Fn3 도메인은 1 μM 이하의 KD로 인간 혈청 알부민의 도메인 I 또는 II에 결합하고, 알부민 존재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기가 혈청 알부민 부재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기보다 5배 이상 더 크며, 10Fn3 도메인의 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프의 아미노산 서열은 서열 4 및 8로부터 선택되는 10Fn3 도메인의 상응하는 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프의 아미노산 서열로 이루어진 것인 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 10Fn3 도메인이 서열 4의 아미노산 서열로 이루어진 것인 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 10Fn3 도메인이 서열 8의 아미노산 서열로 이루어진 것인 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 10Fn3 도메인의 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프가
    (a) 서열 5에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 BC 루프, 서열 6에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DE 루프, 및 서열 7에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 FG 루프, 및
    (b) 서열 9에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 BC 루프, 서열 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DE 루프, 및 서열 11에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 FG 루프
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 10Fn3 도메인이 5.5 내지 7.4의 pH 범위에서 인간 혈청 알부민에 결합하는 것인 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 10Fn3 도메인이 pH 5.5에서 200 nM 이하의 KD로 인간 혈청 알부민에 결합하는 것인 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 10Fn3 도메인이 또한 레서스 혈청 알부민 (RhSA), 시노몰구스 원숭이 혈청 알부민 (CySA), 및 뮤린 혈청 알부민 (MuSA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에도 결합하는 것인 폴리펩티드.
  8. 피브로넥틴 유형 III 제10 (10Fn3) 도메인 및 이종성 단백질로 이루어진 융합 폴리펩티드이며, 여기서 10Fn3 도메인은 1 μM 이하의 KD로 인간 혈청 알부민의 도메인 I 또는 II에 결합하고, 알부민 존재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기가 혈청 알부민 부재하에서의 폴리펩티드의 혈청 반감기보다 5배 이상 더 크며, 10Fn3 도메인의 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 서열은 서열 4 및 8로부터 선택되는 10Fn3 도메인의 BC 루프, DE 루프 및 FG 루프 서열로 이루어진 것인 융합 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, BC 루프가 서열 5에 제시된 아미노산 서열로 이루어지고, DE 루프가 서열 6에 제시된 아미노산 서열로 이루어지고, 및 FG 루프가 서열 7에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 것인 융합 폴리펩티드.
  10. 제8항에 있어서, BC 루프가 서열 9에 제시된 아미노산 서열로 이루어지고, DE 루프가 서열 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어지고, 및 FG 루프가 서열 11에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 것인 융합 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제4항 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물.
  12. 제1항 내지 제4항 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
  13. 제12항의 핵산을 포함하는 벡터.
  14. 제13항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
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