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CN111521812B - 视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组及其应用和蛋白芯片、试剂盒 - Google Patents

视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组及其应用和蛋白芯片、试剂盒 Download PDF

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CN111521812B CN201911357003.XA CN201911357003A CN111521812B CN 111521812 B CN111521812 B CN 111521812B CN 201911357003 A CN201911357003 A CN 201911357003A CN 111521812 B CN111521812 B CN 111521812B
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Abstract

本发明属于生物医药的技术领域，尤其涉及视视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组及其应用和蛋白芯片、试剂盒。本申请提供了视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组，其特征在于，包括：单核细胞趋化蛋白‑3、LIGHT、巨噬细胞炎性蛋白‑1δ、胰岛素样生长因子结合蛋白‑2、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体、血小板生成素和疱疹病毒进入介质；其中，LIGHT为T细胞上可诱导表达的，与HSV的糖蛋白D竞争结合HVEM的淋巴毒素类似物。本申请填补了目前临床没有可靠的、准确的诊断鉴别视神经脊髓炎谱系疾病的产品和方法的空缺。

Description

视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组及其应用和蛋白芯片、 试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药的技术领域，尤其涉及视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组及其应用和蛋白芯片、试剂盒。
背景技术
中枢神经系统脱髓鞘疾病是以中枢神经系统多病灶性及炎性脱髓鞘为主的一种自身免疫系统疾病，其临床特征主要包括反复发作、多次缓解及复发。目前中枢神经系统脱髓鞘疾病尚无有效的治疗方法，主要原因在于脱髓鞘及髓鞘再生的机制不清楚。在我国视神经脊髓炎谱系疾病的发病率位居中枢神经系统脱髓鞘疾病之首，视视神经脊髓炎谱系疾病包括经典视视神经脊髓炎(NMO)及视视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)，是一种主要累及视神经、脊髓和大脑特殊部位的罕见的、严重的中枢神经系统免疫相关性脱髓鞘疾病，临床以视神经炎和长节段脊髓炎为主要特征，其复发率及病残率极高，患者需要终身服用免疫抑制剂进行治疗和防止复发。
NMOSD与MS(多发性硬化，multiple sclerosis，MS)都属于中枢神经系统脱髓鞘疾病，且这两种疾病的临床症状有一定的相似，但在临床诊断中，明确区分诊断这两种疾病尤为重要，因为两种疾病的治疗方案完全不同：对MS治疗效果很好的药物(如IFN-β，natalizumab,oral fingolimod等)不仅对NMOSD治疗无效反而会加重NMOSD的病情。NMOSD的患病率在全球各个地区均比较接近，约为(1-5)/(10万人/年)，但在非白种人中更为易感，东亚和非洲人群中患NMOSD的风险高于MS，而在白种人群中，MS的发病率约为NMOSD的40倍；在性别构成上，女性居多，女男患病比例高达(9-11):1；NMOSD为高复发、高致残性疾病，90％以上患者为多时相病程，亚洲相对多见，约60％的患者在1年内复发，90％的患者在3年内复发，多数患者遗留有严重的视力障碍和或肢体功能障碍、尿便障碍等。NMOSD的预后较MS差，5年内约有半数患者单眼视力严重损伤甚至失明，约有50％复发性NMOSD患者发病5年后不能独立行走。
NMOSD在临床上的诊断步骤十分复杂及繁琐，病人血清中AQP4-IgG抗体滴度检测在NMOSD该种疾病诊断中起尤为关键的作用。AQP4-IgG是NMOSD的免疫标志物，是鉴别NMOSD与MS的重要参考依据之一，需反复检测。此外，NMOSD患者NMO-IgG强阳性其复发可能性较大，其抗体滴度有可能作为复发与治疗疗效的评价指标。但仍有近30％的NMOSD患者血清AQP4-IgG阴性，尽管血清AQP4-IgG阳性和阴性的NMOSD患者在临床表现及治疗原则上没有差别，但这些患者的潜在发病机制尚不清楚且给临床诊断带来很大的挑战，因此寻找NMOSD疾病新的分子标记物尤为重要。
目前临床上，没有可靠的能在健康人群中准确诊断鉴别视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)的生物标记物，以及蛋白芯片和试剂盒。
发明内容
本申请针对目前临床没有可靠的、准确的诊断鉴别视神经脊髓炎谱系疾病的生物标记物，以及蛋白芯片和试剂盒的不足，本发明提供了一种高通量、高灵敏度、高特异性和低成本的能诊断鉴别视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)的生物标记物。
有鉴于此，本申请第一方面提供了视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组，包括：单核细胞趋化蛋白-3、LIGHT、巨噬细胞炎性蛋白-1δ、胰岛素样生长因子结合蛋白-2、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体、血小板生成素和疱疹病毒进入介质；
其中，LIGHT为T细胞上可诱导表达的，与HSV的糖蛋白D竞争结合HVEM的淋巴毒素类似物。
需要说明的是，单核细胞趋化蛋白-3(monocyte chemoattractant protein-3，MCP-3)是一种多效性的趋化因子，能与多种趋化因子受体结合,激活多个信号通路促进肿瘤的发生、发展。MCP-3通过介导细胞免疫反应加速对基质降解，促进肿瘤的恶化。MCP-3还是间质细胞与肿瘤细胞相互作用的重要调节因子，它不仅参与肿瘤的发生，而且还诱导单核细胞进入肿瘤边缘,有利于形成适合肿瘤发展的微环境。
T细胞上可诱导表达的，与HSV的糖蛋白D竞争结合HVEM的淋巴毒素类似物(Lymphotoxin-like,exhibits inducible expression,and competes with HSVglycoprotein D(gD)for HVEM,a receptor expressed by T lymphocytes，LIGHT)又名肿瘤坏死因子配体超家族成员14(tumor necrosis factor superfamily 14，TNFSF14)或HEVEM-L(Herpesvirus entry mediator Ligand)是TNF超家族的第14个成员，LIGHT以三聚体的形式诱导表达于活化的T细胞、NK细胞，选择性地表达于未成熟的树突状细胞(DCs)上。
巨噬细胞炎性蛋白-1δ(MIP-1delta，也称CC基序趋化因子15，CCL15)是一种趋化因子，与受体结合后，可以发挥趋化和促进炎症的生物学作用，能引起多种炎症性疾病。
胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)是能与胰岛素样生长因子(IGFs)结合的调节蛋白，调节IGFs与其受体(IGFR)的结合能力，影响IGFR下游信号转导通路中信号强度，调控靶细胞的生长和增殖。
糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid-induced tumornecrosis factor receptor,GITR)是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)中的第18个成员，是胸腺来源的CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)上的一个表面分子，其配体为GITRL。
血小板生成素(thrombopoietin，TPO)是哺乳动物调节血小板生成的主要细胞因子,具有刺激巨核细胞集落生成的功能.体外实验表明,TPO既可以促进早期巨核细胞分化。
疱疹病毒进入介质(Herpesvirus entry mediator，HVEM)是肿瘤坏死因子及其受体超家族(TNF/TNFRSF)成员，其可以以配体及受体结合的形式结合多种协同刺激分子成员，发挥其生物学功能。HVEM在T淋巴细胞的免疫应答过程中通过结合不同的受体发挥的不同的作用，HVEM与自身免疫性疾病、炎症反应及肿瘤等多种复杂疾病都具有相关性。
需要说明的是，单核细胞趋化蛋白-3、LIGHT、巨噬细胞炎性蛋白-1δ、胰岛素样生长因子结合蛋白-2、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体和血小板生成素组成视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组；单核细胞趋化蛋白-3、LIGHT、巨噬细胞炎性蛋白-1δ、胰岛素样生长因子结合蛋白-2、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体和血小板生成素为视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物。
视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组用于制备诊断视神经脊髓炎谱系疾病的产品中的应用，所述视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组包括：单核细胞趋化蛋白-3、LIGHT、巨噬细胞炎性蛋白-1δ、胰岛素样生长因子结合蛋白-2、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体和血小板生成素；其中，LIGHT为T细胞上可诱导表达的，与HSV的糖蛋白D竞争结合HVEM的淋巴毒素类似物。
作为优选，所述视神经脊髓炎谱系疾病的受检样品为血清或血浆。
本申请第二方面提供了一种由视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物的第一抗体组成的用于诊断视神经脊髓炎谱系疾病的蛋白芯片，用于诊断视神经脊髓炎谱系疾病的蛋白芯片，包括所述视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体，或所述应用的视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体和载体，所述视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体有序地固定在所述载体，每个所述视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物的第一抗体特异性结合对应每个所述视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物。
其中，所述载体可以为载玻片或其他用于蛋白芯片的物质。
需要说明的是，为了能定量检测多个视神经脊髓炎谱系疾病的标志物，本发明提供的一种能同时定量检测多个标志物的蛋白芯片和蛋白芯片试剂盒，蛋白芯片和蛋白芯片试剂盒可以为现有常规的蛋白芯片和蛋白芯片试剂盒。本发明的蛋白芯片包括同时固定有视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体的玻片和视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体，其中，视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组包括单核细胞趋化蛋白-3、LIGHT、巨噬细胞炎性蛋白-1δ、胰岛素样生长因子结合蛋白-2、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体和血小板生成素；其中，LIGHT为T细胞上可诱导表达的，与HSV的糖蛋白D竞争结合HVEM的淋巴毒素类似物。
使用时，视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体每一个单独固定于玻片形成若干个独立识别位点，视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。受检样品作为抗原，即为抗原，若受检样品存在视神经脊髓炎谱系疾病生物标记组，受检样品的视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组会作为抗原与蛋白芯片的每个视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体发生抗体-抗原反应，然后可以通过多重夹心ELISA方法检测受检样品中是否存在能够与特异性视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组发生抗体-抗原反应的物质。
具体的，载玻片的独立识别位点上可以固定有单一浓度的每个视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体，载玻片的每个独立识别位点上也可以固定一种或者一种以上的浓度的每个生物标记物的第一抗体。
具体的，视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体的固定含量为0.02ng～2ng。
具体的，采用蛋白芯片技术，能够检测多个视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、需有费仪器、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。
本申请第三方面提供了一种由视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体组成的用于诊断视神经脊髓炎谱系疾病的蛋白芯片试剂盒，包括所述视神经脊髓炎谱系疾病蛋白芯片和用于蛋白芯片的检测试剂，每种所述检测试剂特异性结合对应的每个所述视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物。
作为优选，所述检测试剂包含对应每个所述视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物的第二抗体和可检测的标记成分，对应每个所述视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物的第二抗体与所述可检测的标记成分偶联。使得受检样品的生物标记物与视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物的第一抗体特异性结合，受检样品的生物标记物与视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物的第二抗体特异性结合，从而形成夹心结构，通过检测试剂上的可检测的标记成分对受检样品的生物标记物进行定性和定量检测。
作为优选，所述可检测的标记成分包括酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质或放射活性物质中的一种。
本申请第四方面提供了一种由视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物的第一抗体组成的用于诊断视神经脊髓炎谱系疾病的ELISA试剂盒，包括所述视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体，或所述应用的视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体和用于酶联免疫吸附反应的试剂。
在本发明的优选实施方案中，所述检测试剂上标记有生物素。更优地，所述检测试剂还包括识别生物素标记的链霉亲和素，所述检测试剂还包括识别生物素标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素标记有荧光染料，荧光染料为Cy3或具类似吸收波长的荧光染料。
在本发明的优选实施方案中，所述检测试剂还包括蛋白标准品，所述蛋白标准品为具有梯级浓度所述若干种生物标记物组的混合物。不同种生物标记物组通过一定的量比混合在一起，分装后用冷冻抽干的方法干燥。每个蛋白标准品单独与蛋白芯片的对应的生物标记物的第一抗体反应抗原-抗体反应，构建蛋白荧光的标准曲线，以便定量和定性检测受检样品中的生物标记物组。
在本发明还提供一种用于诊断视神经脊髓炎谱系疾病的蛋白芯片试剂盒的制备方法，包括将视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体固定于玻片的步骤，该步骤包括：
(1)将100－1000皮升的含0.02-2ng视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物的第一抗体的PBS缓冲液(含有0.01-10g/100ml牛白蛋白)点样于玻片上；
(2)将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，于2℃到8℃保存备用。
其中，步骤(1)中采用全自动点样仪完成点样操作，每个生物标记物的第一抗体以芯片点阵排布于所述玻片。
由于本发明的方法中，采用点样液的优良特性，在结合本发明的视神经脊髓炎谱系疾病蛋白芯片试剂盒在检测生物标记物组时的使用方法与现有技术的区别性，使本发明的方法中，将视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物的第一抗体固定于玻片的步骤得到了极大的简化，无须现有技术中普遍采用的点样后封闭玻片上的有效成分的操作步骤。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)的点样操作中，采用美国铂金艾尔默(PerkinElmer)公司生产的全自动点样仪器。每个视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体点阵排布于玻片，而在具体的操作过程中，各视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组的第一抗体的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的蛋白芯片排布阵列，控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。
采用本发明的蛋白芯片试剂盒，实现了多样本多指标的联合检测，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、需有费仪器、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。本发明的蛋白芯片试剂盒可用于人群普查，有利于建立基线资料。监测本发明的生物标记物组的变化有利于及早发现病变，给与相应的措施。及时发现，早期治疗，将大大提高治愈率，减低医疗费用。本申请能采用高通量的蛋白质芯片检测视神经脊髓炎谱系疾病患者血清中生物标记物组的蛋白。
需要说明的是，本申请的视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组可以直接诊断视神经脊髓炎谱系疾病，无需检测患者的AQP-4蛋白的浓度即可准确的诊断视神经脊髓炎谱系疾病。
从以上技术方案可以看出，本申请具有以下优点：
本申请提供了视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组用于制备诊断视神经脊髓炎谱系疾病的产品中的应用，能可靠、准确和快速的诊断鉴别视神经脊髓炎谱系疾病患者，视神经脊髓炎谱系疾病患者与健康患者的血清中单核细胞趋化蛋白-3、LIGHT、巨噬细胞炎性蛋白-1δ、胰岛素样生长因子结合蛋白-2、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体、血小板生成素和疱疹病毒进入介质的7个蛋白的表达量有显著差异，本申请可以利用这六个生物标记物在蛋白水平上诊断鉴别视神经脊髓炎谱系疾病患者。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例提供的蛋白标准品梯度稀释的原理图；
图2为本申请实施例提供的采用蛋白芯片的检测流程图；
图3为本申请提供视神经脊髓炎谱系疾病生物标志物的分析示意图；
图4为本申请实施例公开的200种蛋白在健康对照组和NMOSD组的显著性和倍数变化的log2转化的分布的火山图；
图5为本申请实施例公开的健康对照组和NMOSD组的差异蛋白的聚类图；
图6为本申请实施例公开的200种蛋白在健康对照组和MS组的显著性和倍数变化的log2转化的分布的火山图；
图7为本申请实施例公开的健康对照组和MS组的差异蛋白的层次聚类分析图；
图8为本申请实施例公开的NMOSD-Specific差异蛋白的P值对数的散点图：健康对照组与MS组的P值对数和健康对照组与NMOSD组的P值对数的散点图；
图9为本申请实施例公开的NMOSD-Specific差异蛋白的GO功能分析；
图10为本申请实施例公开的NMOSD-Specific差异蛋白相关的疾病通路分析图；
图11为本申请实施例公开的NMOSD-Specific差异蛋白的蛋白相互作用关系图；
图12为本申请实施例公开的NMOSD-Specific差异蛋白重要性得分和特征等级分析；
图13为本申请实施例公开的NMOSD-Specific差异蛋白Importance score排序靠前的7个蛋白的单独的ROC曲线；
图14为本申请实施例提供的NMOSD疾病组与健康对照组ROC曲线图；
图15为本申请实施例公开的NMOSD-Specific差异蛋白Importance score排序靠前的7个蛋白进行监督的SVM模型建模预测分析结果。
具体实施方式
本发明提供了生物标记物组的应用及其蛋白芯片、蛋白芯片试剂盒和ELISA试剂盒，生物标记物组用于制备诊断中枢神经系统脱髓鞘疾病的产品中的应用，用于解决目前临床中，高通量、高灵敏度、高特异性和低成本的能诊断鉴别视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)的产品的技术缺陷。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中，图3为本申请提供视神经脊髓炎谱系疾病生物标志物的分析示意图。
以下实施例所用的试剂和溶剂均为市售或自制；
实施例1的视神经脊髓炎谱系疾病患者(NMOSD)的诊断标准如下：
AQP4-IgG阳性诊断标准：
1.符合至少1项核心临床症状；
2.AQP4-IgG阳性(基于细胞的检测方法)；
3.排除其他可能的诊断；
AQP4-IgG阴性或者未检测诊断标准：
1.在1次或多次临床发作中，符合至少2项核心临床特征，且必须符合下述所有要求：
a.至少1项核心临床特征必须是视神经炎、急性脊髓炎(MRI上为LETM)、或极后区综合征；
b.空间多发性(出现2项或以上核心临床特征)；
c.满足附加的MRI要求(视实际情况)；
2.使用能获得的最灵敏的检测手段AQP4-IgG阴性或未检测；
3.排除其他可能的诊断；
核心临床特征：
1.视神经炎；
2.急性脊髓炎；
3.极后区综合征：无法用其他原因解释的呃逆或恶心、呕吐；
4.急性脑干症状群；
5.有症状的发作性睡病或急性间脑症状群伴MRI上典型NMOSD间脑病灶；
6.大脑症状群伴典型NMOSD大脑病灶；
大片、融合、单侧或双侧、皮质下或深部白质病灶；
长(≥1/2胼胝体长度)、弥散、不均匀或水肿性胼胝体病灶；
长皮质脊髓束病灶，单侧或双侧、连续累及内囊和大脑脚；
广泛室管膜周围病灶，通常有强化。
AQP4-IgG阴性或者未检测附件MRI要求：
1.急性视神经炎：要求头部MRI(a)正常或仅有非特异性白质病灶，或(b)视神经MRI有T2高信号病灶或T1增强病灶，视神经病灶的长度>视神经总长的1/2，或累及视交叉；
2.急性脊髓炎：脊髓MRI提示病灶≥3个相邻节段(LETM)或对于既往有脊髓炎病史者，存在长度≥3个相邻节段局灶性脊髓萎缩；
3.极后区综合征：需要有相应的延髓背侧/极后区病灶；
4.急性脑干症状群：需要有相应的室管膜周围的脑干病灶。
实施例1
本发明实施例为血清样品制备过程，具体步骤如下：
1、共收集34例健康对照血清样本，41例NMOSD病人血清样本(包括32例AQP4抗体阳性血清，9例AQP4抗体阴性血清)，12例MS病人血清样本。按照标准程序处理所有血清样品：在vacutainer血清管中收集全血，在室温静置30分钟，然后在4℃离心机2000rpm离心15分钟。收集上清液并在-80℃冷冻直至使用。本研究中使用的所有临床血清样本均经广州医科大学附属第二医院(中国，广州)人体受试者的伦理审查委员会批准。表1为NMOSD病人血清样本、MS病人血清样本和健康对照血清样本的临床资料。
表1
Control NMOSD MS
Age(Mean±SEM) 41.88±2.385 41.20±2.429 32.83±4.071
Number 34 41 12
Gender,female:male 17:17 36:5 4:8
EDSS n/a 2.83 1.83
AQP-4postivity％ n/a 78.05％ 0％
实施例2
本发明实施例为检测实施例1的血清的蛋白表达水平，具体步骤如下：
1、使用基于夹心的抗体微阵列测量血清中的蛋白质水平。使用RayBiotech HumanCytokine Antibody Array Q4000(QAH-CAA-4000，RayBiotech，Inc.，Norcross，GA)进行蛋白质筛选，其包含5个非重叠阵列的组合，以定量测量200种人细胞因子。
蛋白芯片技术测定检测实施例1的34例健康对照血清样本，41例NMOSD病人血清样本，12例MS病人血清样本的血清中200种蛋白的表达水平：使用基于夹心的抗体微阵列测量血清中的蛋白质水平。使用RayBiotech Human Cytokine Antibody Array Q4000(QAH-CAA-4000，RayBiotech，Inc.，Norcross，GA)进行蛋白质筛选，其包含5个非重叠阵列的组合，以定量测量200种人类细胞因子。
本申请的蛋白芯片的制备步骤如下：
1、玻片芯片的完全干燥：将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。
2、蛋白标准品的梯度稀释：
2.1、参阅图1，图1为本申请实施例提供的蛋白标准品梯度稀释的原理图。添加500μl的PBS样品稀释液到标准品混合物(200种人类细胞因子的标准品)的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速地离心，轻轻地上下抽打溶解粉末，标记这个小管为Std1。
2.2、分别标记6个干净的离心管为Std2、Std3到Std7，添加200μl的样品稀释液到每个小管中。
2.3、抽取100μl的Std1加入到Std2中轻轻混合，然后从Std2中抽取100μl加入到Std3中，如此梯度稀释至Std7。
2.4、抽取100μl的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为CNTRL，作为阴性对照。
3、芯片操作流程
3.1、参阅图2，图2为本申请实施例提供的采用蛋白芯片的检测流程图。
每个孔中加100μl的样品稀释液，室温摇床上孵育30分钟，封闭定量蛋白芯片。
3.2、抽去每个孔中的样品稀释液，添加100μl的标准液(200种人类细胞因子的标准品)和样品到孔中，在摇床上4℃过夜孵育。样品为静脉采血后自然析出的血清(健康对照血清、NMOSD病人血清和MS病人血清)，使用前，样品用稀释液1:1稀释。
3.3、清洗：抽去每个孔中的标准液或样品，IX洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的IX洗液I，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液I。抽去每个孔中的IX洗液I，加入IX洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的IX洗液II，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液II。IX洗液I和IX洗液II为现有常规的蛋白芯片洗液。
3.4、检测抗体混合液的孵育：离心检测抗体混合液小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。
3.5、清洗：抽去每个孔中的检测抗体，IX洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的I X洗液I，每次清洗要抽干净洗液，然后加入I X洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的IX洗液II，每次清洗要抽干净洗液。
3.6、Cy3-链霉亲和素的孵育：离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80ul的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。Cy3标记的链霉亲和素为现有常规的蛋白芯片检测试剂。
3.7、清洗：抽去每个孔中的Cy3-链霉亲和素，IX洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的IX洗液I，每次清洗要抽干净洗液，然后加入IX洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的IX洗液II，每次清洗要抽干净洗液。
3.8、荧光检测
1)将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。
2)将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的IX洗液I，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去IX洗液I，添加约30ml的IX洗液II，在室温摇床上震荡5min。
3)去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。
4)采用激光扫描仪例如Innopsys扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率为532nm)。
3.9、芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析。
1)用Mapix软件来读取生物芯片的荧光值。芯片的微阵列参数用14(行)×12(列)，点的直径用140μm。
2)读数后选用的数值为除掉周围背景的中间值读数(F532Median-LocalBackground)。用特定的定量芯片计算软件QAH-CAA-Q4000来做每个重组蛋白的标准曲线。
在计算不同样品(健康对照血清、NMOSD病人血清和MS病人血清)不同靶标的蛋白(本申请的7个生物标记物)浓度前使用每个芯片上相同的两个阳性对照点(记为POSl和POS2)做参照系进行数据的标准化处理。两个阳性对照的信号值大约相差4倍。在进行标准化之前先计算出每个芯片的阳性对照值POS＝(POSl+4×POS2)/2。然后再用该值对所有的数据进行标准化处理：校正值＝原先值×(样品平均POS)/POS。
实施例3
本申请实施例提供对蛋白数据转换和图形生成，具体步骤如下：
根据蛋白质芯片特定软件计算出本申请的7个生物标记物的浓度后，数据分析前先进行数据转换，转换公式为：log2(X+1)。X为各样本对应的不同蛋白的浓度。转化后的数据用于后续的数据分析，包括"主成分分析,主分量分析"(PCA)，相关热图，模型构建和加权基因共表达网络分析(WGCNA)。所有数据处理和统计测试均在R语言包(R Foundation forStatistical Computing，Vienna，Austria。URL https://www.R-project.org/)和RStudio(RStudio，Inc.，Boston，MAURL http)中进行。所有数据直接在RStudio中生成，然后使用Illustrator CC5(Adobe，San Diego，CA)将图片进行整合。
实施例4
本申请实施例提供对差异蛋白质表达谱分析，具体步骤如下：
为了鉴定不同血清样本(健康对照组和NMOSD组)中显著变化的蛋白质(基于基于Log2转化值)，使用R studio中的p.adjust功能通过非参数p值分析计算每种蛋白质的假发现率(False-Discovery Rates,FDR)。不同血清样本间差异表达的蛋白(differentexpression proteins,DEP)被定义为具有FDR<0.2和绝对log2 fold change>0.263的那些蛋白，使用R studio中的ggplot函数功能将所有蛋白FDR和log2 fold change的情况做成火山图，表达有差异的蛋白用蓝色点表示，表达无差异的蛋白用红色的表示。使用R语言中的“pROC”包进行ROC分析。结果如图4-图5，图4为本申请实施例公开的200种蛋白在健康对照组和NMOSD组的显著性和倍数变化的log2转化的分布的火山图，图5为本申请实施例公开的健康对照组和NMOSD组的差异蛋白的聚类图。在分析的200种细胞因子中，112种细胞因子的水平在NMOSD和健康对照血清之间不同(FDR<0.2且倍数变化>1.2，如图4中所示，蓝点)。112种不同蛋白质的聚类说明了NMOSD和健康对照之间的明显差异(图5)。单个蛋白质在组群之间可以显示出非常显着的差异。
实施例5
本申请实施例提供对差异蛋白进行热图分析和层次聚类分析，具体步骤如下：
欧几里得群热图和监督支持向量机(supervised Support Vector Machine,SVM)模型进行两组样本间的分类分析。热图用于分析两组之间的聚类情况(R包“gplots”)。使用ROC曲线分析(学习矢量量化，LVQ)对每种差异蛋白质进行特征排序以估计重要性(具有3倍交叉验证和5次重复)。选择重要性高于60的蛋白质来构建分类模型。使用R包“caret”对受控健康对照的NMOSD患者进行监督的SVM模型。使用具有5次重复的3倍交叉验证方案构建SVM模型。使用AUC分析和模型预测的混淆矩阵评估模型性能。
为了排除中枢神经系统其他脱髓鞘疾病对筛选到的NMOSD特异性差异蛋白的影响，本申请实施例分析了12例MS病人血清中相同的200个蛋白的表达水平，并将MS组跟健康对照组的血清学结果进行比较分析，结果如图6-7所示，图6为本申请实施例公开的200种蛋白在健康对照组和MS组的显著性和倍数变化的log2转化的分布的火山图，图7为本申请实施例公开的健康对照组和MS组的差异蛋白的层次聚类分析图。按照FDR<0.2及fold change>1.2的标准，筛选到97个蛋白在MS组跟健康对照组间有显著差异(图6，蓝色点)；将这97个差异蛋白进行层次聚类分析，热图聚类结果显示MS组与healthy control组能很清楚的区分开(图7)。
实施例6
本申请实施例提供对健康对照组、MS组和NMOSD组的差异蛋白进行散点分析、功能注释和蛋白相互作用网络分析，具体过程如下：
用R语中“WGCNA”分析包来分析NMOSD患者蛋白质表达谱与其临床特征的关系。该分析方法旨在寻找协同表达的基因/蛋白模块(module)，并探索基因/蛋白网络与关注的表型/临床特征之间的关联关系，以及网络中的核心基因/蛋白。然后，通过R语音中“clusterProfiler”和“DOSE”分析包进行蛋白质功能性注释分析，包括生物过程本体论(biological process ontology,BP)和疾病本体论(disease ontology,DO)。为了将蛋白因子与生物学信号通路联系起来，使用Cytoscape 3.6.0(www.cytoscape.org)中的GeneMANIA-app将这些蛋白质定位到已知的蛋白相互作用网络上。结果如图8-11所示。
图8为本申请实施例提供的健康对照组与MS组的P值对数和健康对照组与NMOSD组的P值对数的散点图。将所检测的200个蛋白的NMOSD组VS healthy control组的P值、MS组VS healthy control组的P值取对数后，作图成散点图，发现了39个差异蛋白是NMOSD-Specific(图8，红色框)，24个差异蛋白是MS-specific(图10，蓝色框)，73个蛋白是NMOSD和MS都有差异的(图8，绿色弧线)。
图9为本申请实施例公开的NMOSD-Specific差异蛋白的GO功能分析。对这39个NMOSD-Specific差异蛋白进行GO功能分析，结果显示NMOSD-Specific差异蛋白跟白细胞/淋巴细胞的趋化及迁移、ERK通路、肿瘤坏死因子应激等生物学功能有关(图9)。
图10为本申请实施例公开的NMOSD-Specific差异蛋白的疾病通路分析。对这39个NMOSD-Specific差异蛋白进行疾病通路分析发现这些差异蛋白跟淋巴细胞性白血病、风湿性疾病、肝炎等疾病相关(图10)。
图11为本申请实施例公开的NMOSD-Specific差异蛋白的蛋白相互作用关系图。为了探讨NMOSD-Specific差异蛋白相互作用关系，我们用Gene MANIA-app分析出这39个NMOSD-Specific差异蛋白的相互作用网络主要集中在两个中心，一个网络中心集中在CC基序趋化因子15(CCL15/MIP-1delta)，血小板生成素(TPO)，单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)，胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)，而另一个集中于肿瘤坏死因子配体超家族成员14(TNFSF 14/LIGHT)，肿瘤坏死因子受体超家族成员18(GITR)和14(HVEM)(图11)。
实施例6
本申请实施例提供了验证生物标记物组可行性试验，步骤如下：
为了验证实施例5筛选到的39个NMOSD-Specific差异蛋白是否能用于判别NMOSD疾病组与健康对照组的准确性，本实施例首先利用学习矢量量化(LVQ，Learning VectorQuantization)模型计算出这39个蛋白的重要性评分(importance score)，如图12所示，图12为图10的NMOSD-Specific差异蛋白重要性得分和特征等级分析，图12中显示了39种差异蛋白质重要性得分和特征等级；NMOSD特异性不同蛋白质的前7位是MCP-3，LIGHT，MIP-1delta，IGFBP-2，GITR、TPO和HVEM。如图13所示，图13为图10的NMOSD-Specific差异蛋白Importance score排序靠前的7个蛋白的单独的ROC曲线。ROC分析是用于描述诊断测试或预测模型的辨别准确度的工具。Importance score排序靠前的7个蛋白的单独的ROC曲线如图13所示；下一步，将排序靠前的7个蛋白进行监督的SVM模型建模预测分析，如图14-15所示，图14为本申请实施例提供的NMOSD疾病组与健康对照组的重要性评分结果，图15为图12的NMOSD-Specific差异蛋白Importance score排序靠前的7个蛋白进行监督的SVM模型建模预测分析结果，结果显示这7个蛋白预测NMOSD疾病的阳性符合率达92％，阴性符合率达88％(图14和图15)。
综上所述，通过定量蛋白质芯片技术，将NMOSD疾病组样本蛋白质表达谱跟健康正常对照组样本及MS疾病组样本比较完后，本申请实施例筛到39个NMOSD疾病特异性表达差异蛋白，这些靶标蛋白在NMOSD发病中起到重要作用，可为该种疾病的诊断，药物靶点筛选及治疗提供研究基础，并可能作为该种疾病的分子标记物用于临床诊断。通过LVQ建模分析预测出MCP-3，LIGHT，MIP-1delta，IGFBP-2，GITR、TPO和HVEM这七种蛋白用于在健康人群中预测NMOSD疾病的阳性符合率达92％，阴性符合率达88％。可见，本申请提供的视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组用于诊断视神经脊髓炎谱系疾病的准确率高。
本申请的说明书及上述附图中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等(如果存在)是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例例如能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组用于制备诊断视神经脊髓炎谱系疾病的产品中的应用；
单核细胞趋化蛋白-3、LIGHT、巨噬细胞炎性蛋白-1δ、胰岛素样生长因子结合蛋白-2、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体、血小板生成素和疱疹病毒进入介质组成所述视神经脊髓炎谱系疾病生物标记物组；其中，LIGHT为T细胞上可诱导表达的，与HSV的糖蛋白D竞争结合HVEM的淋巴毒素类似物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述视神经脊髓炎谱系疾病的受检样品为血清或/和血浆。
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