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JP2013531477A - 血清アルブミン結合性分子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、血清アルブミンに結合する第10フィブロネクチンIII型ドメイン（10Fn3）に基づく抗体様タンパク質に関する。本発明はさらに、診断的応用および治療的応用に使用するための異種タンパク質に接合された血清アルブミン結合性10Fn3を含む融合分子に関する。

Description

［関連出願］
本願は、米国特許出願第13/098,851号（2011年5月2日出願）および米国仮特許出願第61/330,672号（2010年5月3日出願）の利益を主張し、これらの出願は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。
［序論］
多くの治療薬、特にペプチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどの生物学的製剤の有用性は、不十分な血清中半減期によって損なわれる。このため、そのような治療薬は、治療効果にとって必要な血清中レベルを維持するために、より高頻度かつ/またはより高用量での投与、または徐放性製剤の使用が必要になる。薬物の頻繁な全身性投与は少なからぬ負の副作用を伴う。例えば頻繁な全身性注射は対象にとってかなり不快なものであり、投与関連感染のリスクを高め、特に治療薬が静脈内投与される場合には、入院または頻繁な通院が必要になることもある。そのうえ、長期処置では、日々の静脈内注射が、血管の反復的穿刺によって引き起こされる組織の瘢痕化および血管病変という、無視できない副作用につながりうる。例えば糖尿病者へのインスリンの投与、多発性硬化症を患う患者におけるインターフェロン薬の投与など、治療薬のどの頻繁な全身性投与についても、同様の課題が知られている。これらの要因はいずれも、患者のコンプライアンスの低下および医療制度のコスト増につながる。
本願は、さまざまな治療薬の血清中半減期を増加させる化合物、増加した血清中半減期を有する化合物、および治療薬の血清中半減期を増加させるための方法を提供する。治療薬の血清中半減期を増加させるためのそのような化合物および方法は、費用対効果の高い手法で製造することができ、望ましい生物物理学的性質（例えばTm、実質的に単量体であること、またはよくフォールディングされていること）を有し、サイズは組織透過が可能なほど十分に小さい。
［発明の概要］
本発明は、血清アルブミン結合性フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメイン、およびそれらの使用に関する。本明細書には、血清アルブミン結合性10Fn3を含む融合分子およびそれらの使用も開示する。
ある態様において、本発明は、フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインがヒト血清アルブミン（HSA）のドメインIまたはIIに1μM以下のKDで結合し、アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも5倍大きいポリペプチドを提供する。ある実施形態において、10Fn3ドメインは、野生型10Fn3ドメインと比較して、BC、DEおよびFGループの1つ以上に修飾されたアミノ酸配列を含む。
一定の実施形態では、10Fn3ドメインが、5.5〜7.4のpH範囲においてHSAに結合する。ある実施形態では、10Fn3ドメインが、5.5〜7.4のpH範囲において、200nM以下のKDで、HSAに結合する。もう一つの実施形態では、10Fn3ドメインが、pH5.5において、200nM以下のKDで、HSAに結合する。
いくつかの態様では、10Fn3ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインがHSAに結合し、かつ10Fn3ドメインが配列番号2と少なくとも70％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドが、ここに提供される。ある実施形態では、10Fn3ドメインが、配列番号5に示すアミノ酸配列を含むBCループ、配列番号6に示すアミノ酸配列を含むDEループ、および配列番号7に示すアミノ酸配列を含むFGループの1つ以上を含む。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、10Fn3ドメインは、アカゲザル血清アルブミン（RhSA）、カニクイザル（cynomolgous monkey）血清アルブミン（CySA）、またはマウス血清アルブミン（MuSA）の1つ以上にも結合する。一定の実施形態では、10Fn3ドメインが、RhSA、CySAまたはMuSAの1つ以上と交差反応しない。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、10Fn3ドメインは、1μM以下のKDでHSAに結合する。いくつかの実施形態では、10Fn3ドメインが、500nM以下のKDでHSAに結合する。別の実施形態では、10Fn3ドメインが、少なくとも200nM、100nM、50nM、20nM、10nM、または5nMのKDでHSAに結合する。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、10Fn3ドメインは、HSAのドメインIまたはIIに結合する。ある実施形態では、10Fn3ドメインが、HSAのドメインIとドメインIIの両方に結合する。いくつかの実施形態では、10Fn3ドメインが、5.5〜7.4のpH範囲においてHSAに結合する。別の実施形態では、10Fn3ドメインが、pH5.5において、200nM以下のKDで、HSAに結合する。もう一つの実施形態では、10Fn3ドメインが、5.5〜7.4のpH範囲において、少なくとも500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、10nM、または5nMのKDで、HSAに結合する。ある実施形態では、10Fn3ドメインが、pH5.5において、少なくとも500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、10nM、または5nMのKDで、HSAに結合する。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期は、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも2倍大きい。一定の実施形態では、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも5倍、7倍、10倍、12倍、15倍、20倍、22倍、25倍、27倍、または30倍大きい。いくつかの実施形態では、血清アルブミンが、HSA、RhSA、CySA、またはMuSAのいずれか1つである。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期は、少なくとも20時間である。一定の実施形態では、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が、少なくとも2時間、2.5時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、12時間、15時間、20時間、25時間、30時間、40時間、50時間、75時間、90時間、100時間、110時間、120時間、130時間、150時間、170時間、または200時間である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの半減期が、霊長類（例えばヒトまたはサル）またはマウスにおいて観察される。
ある態様において、本発明は、10Fn3ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインがHSAに結合し、かつ10Fn3ドメインが配列番号5に示すアミノ酸配列を含むBCループ、配列番号6に示すアミノ酸配列を含むDEループ、配列番号7に示すアミノ酸配列を含むFGループを含むポリペプチドを提供する。もう一つの態様では、10Fn3ドメインが、配列番号5に示すアミノ酸配列を含むBCループ、配列番号6に示すアミノ酸配列を含むDEループ、配列番号7に示すアミノ酸配列を含むFGループの1つ以上を含む。
ある態様において、本発明は、10Fn3ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインがHSAに結合し、かつ10Fn3ドメインが、配列番号9に示すアミノ酸配列を含むBCループ、配列番号10に示すアミノ酸配列を含むDEループ、および配列番号11に示すアミノ酸配列を含むFGループを含むポリペプチドを提供する。もう一つの態様では、10Fn3ドメインが、配列番号9に示すアミノ酸配列を含むBCループ、配列番号10に示すアミノ酸配列を含むDEループ、および配列番号11に示すアミノ酸配列を含むFGループの1つ以上を含む。
ある態様において、本発明は、10Fn3ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインがHSAに結合し、かつ10Fn3ドメインが配列番号13に示すアミノ酸配列を含むBCループ、配列番号14に示すアミノ酸配列を含むDEループ、および配列番号15に示すアミノ酸配列を含むFGループを含むポリペプチドを提供する。もう一つの態様では、10Fn3ドメインが、配列番号13に示すアミノ酸配列を含むBCループ、配列番号14に示すアミノ酸配列を含むDEループ、および配列番号15に示すアミノ酸配列を含むFGループの1つ以上を含む。
ある態様において、本発明は、10Fn3ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインがHSAに結合し、かつ10Fn3ドメインが配列番号17に示すアミノ酸配列を含むBCループ、配列番号18に示すアミノ酸配列を含むDEループ、および配列番号19に示すアミノ酸配列を含むFGループを含むポリペプチドを提供する。もう一つの態様では、10Fn3ドメインが、配列番号17に示すアミノ酸配列を含むBCループ、配列番号18に示すアミノ酸配列を含むDEループ、および配列番号19に示すアミノ酸配列を含むFGループの1つ以上を含む。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、10Fn3ドメインは、アカゲザル血清アルブミン（RhSA）、カニクイザル血清アルブミン（CySA）、またはマウス血清アルブミン（MuSA）の1つ以上にも結合する。いくつかの実施形態では、10Fn3ドメインが、RhSA、CySAまたはMuSAの1つ以上と交差反応しない。一定の実施形態では、10Fn3ドメインが、1μM以下のKDでHSAに結合する。別の実施形態では、10Fn3ドメインが、少なくとも1.5μM、1.2μM、1μM、700nM、500nM、300nM、200nM、100nM、75nM、50nM、25nM、10nM、または5nMのKDでHSAに結合する。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、10Fn3ドメインはHSAのドメインIまたはIIに結合する。一定の実施形態では、10Fn3ドメインがHSAのドメインIとドメインIIの両方に結合する。一定の実施形態では、10Fn3ドメインが、5.5〜7.4のpH範囲においてHSAに結合する。ある実施形態では、10Fn3ドメインが、pH5.5において、200nM以下のKDで、HSAに結合する。もう一つの実施形態では、10Fn3ドメインが、5.5〜7.4のpH範囲において、少なくとも500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、10nM、または5nMのKDでHSAに結合する。ある実施形態では、10Fn3ドメインが、pH5.5において、少なくとも500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、10nM、または5nMのKDで、HSAに結合する。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期は、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも2倍大きい。一定の実施形態では、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも5倍、7倍、10倍、12倍、15倍、20倍、22倍、25倍、27倍、または30倍大きい。いくつかの実施形態では、血清アルブミンが、HSA、RhSA、CySA、またはMuSAのいずれか1つである。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期は、少なくとも20時間である。一定の実施形態では、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が、少なくとも2時間、2.5時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、12時間、15時間、20時間、25時間、30時間、40時間、50時間、75時間、90時間、100時間、110時間、120時間、130時間、150時間、170時間、または200時間である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの半減期が、霊長類（例えばヒトまたはサル）またはマウスにおいて観察される。
ある態様において、本発明は、フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインと異種タンパク質とを含む融合ポリペプチドであって、10Fn3ドメインが1μM以下のKDでHSAに結合する融合ポリペプチドを提供する。一定の実施形態では、10Fn3ドメインが、配列番号4と少なくとも70％同一なアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、10Fn3ドメインが、配列番号5に示すアミノ酸配列を有するBCループ、配列番号6に示すアミノ酸配列を有するDEループ、および配列番号7に示すアミノ酸配列を有するFGループを含む。もう一つの実施形態では、10Fn3ドメインが、配列番号5に示すアミノ酸配列を有するBCループ、配列番号6に示すアミノ酸配列を有するDEループ、および配列番号7に示すアミノ酸配列を有するFGループの1つ以上を含む。
ある実施形態では、異種タンパク質が、線維芽細胞成長因子21（FGF21）、インスリン、インスリン受容体ペプチド、GIP（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド）、骨形成タンパク質9（BMP-9）、アミリン、ペプチドYY（PYY3-36）、膵ポリペプチド（PP）、インターロイキン21（IL-21）、グルカゴン様ペプチド1（GLP-1）、プレクタシン、プログラニュリン、オステオカルシン（OCN）、アペリン、または10Fn3ドメインを含むポリペプチドから選択される。別の実施形態では、異種タンパク質が、GLP-1、エキセンディン4、アディポネクチン、IL-1Ra（インターロイキン1受容体アンタゴニスト）、VIP（血管作動性腸ペプチド）、PACAP（下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド）、レプチン、INGAP（膵島新生関連タンパク質）、BMP（骨形成タンパク質）、およびオステオカルシン（OCN）から選択される。ある実施形態では、異種タンパク質が、配列番号118に示す配列を含む。
一定の実施形態では、異種タンパク質が、血清アルブミン以外のターゲットタンパク質に結合する第2の10Fn3ドメインを含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドが、さらに、ターゲットタンパク質に結合する第3の10Fn3ドメインを含む。ある実施形態では、第3の10Fn3ドメインが、第2の10Fn3ドメインと同じターゲットに結合する。別の実施形態では、第3の10Fn3ドメインが、第2の10Fn3ドメインとは異なるターゲットに結合する。
ある実施形態では、融合ポリペプチドの10Fn3ドメインが、アカゲザル血清アルブミン（RhSA）、カニクイザル血清アルブミン（CySA）、またはマウス血清アルブミン（MuSA）の1つ以上にも結合する。別の実施形態では、10Fn3ドメインが、RhSA、CySAまたはMuSAの1つ以上と交差反応しない。
一定の実施形態では、融合ポリペプチドの10Fn3ドメインが、1μM以下のKDでHSAに結合する。いくつかの実施形態では、10Fn3ドメインが、500nM以下のKDでHSAに結合する。別の実施形態では、10Fn3ドメインが、少なくとも200nM、100nM、50nM、20nM、10nM、または5nMのKDでHSAに結合する。
別の実施形態では、融合ポリペプチドの10Fn3ドメインが、HSAのドメインIまたはIIに結合する。ある実施形態では、10Fn3ドメインが、HSAのドメインIとドメインIIの両方に結合する。いくつかの実施形態では、10Fn3ドメインが、5.5〜7.4のpH範囲においてHSAに結合する。別の実施形態では、10Fn3ドメインが、pH5.5において、200nM以下のKDで、HSAに結合する。もう一つの実施形態では、10Fn3ドメインが、5.5〜7.4のpH範囲において、少なくとも500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、10nM、または5nMのKDで、HSAに結合する。ある実施形態では、10Fn3ドメインが、pH5.5において、少なくとも500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、10nM、または5nMのKDで、HSAに結合する。
いくつかの実施形態では、血清アルブミンの存在下における融合ポリペプチドの血清中半減期が、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも5倍大きい。一定の実施形態では、血清アルブミンの存在下における融合ポリペプチドの血清中半減期が、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも2倍、5倍、7倍、10倍、12倍、15倍、20倍、22倍、25倍、27倍、または30倍大きい。いくつかの実施形態では、血清アルブミンが、HSA、RhSA、CySA、またはMuSAのいずれか1つである。
一定の実施形態では、血清アルブミンの存在下における融合ポリペプチドの血清中半減期が、少なくとも20時間である。一定の実施形態では、血清アルブミンの存在下における融合ポリペプチドの血清中半減期が、少なくとも2時間、2.5時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、12時間、15時間、20時間、25時間、30時間、40時間、50時間、75時間、90時間、100時間、110時間、120時間、130時間、150時間、170時間、または200時間である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの半減期が、霊長類（例えばヒトまたはサル）またはマウスにおいて観察される。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、10Fn3ドメインは、配列番号8、12、16、20、および24〜44から選択される配列を含む。
ある態様において、本発明は、フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、（i）野生型10Fn3ドメインと比較して、AB、BC、CD、DE、EFおよびFGループの1つ以上に修飾されたアミノ酸配列を含み、（ii）野生型10Fn3ドメインによって結合されないターゲット分子に結合し、かつ（iii）配列(ED)nを有するC末端テール（ここで、nは3〜7の整数である）を含む、ポリペプチドを提供する。一定の実施形態では、10Fn3ドメインが、配列番号1の残基9〜94に示すアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、C末端テールが、そのN末端にE、IまたはEIを、さらに含む。いくつかの実施形態では、C末端テールが、ポリペプチドの溶解度を向上させ、かつ/またはポリペプチドの凝集を減少させる。
一定の実施形態では、10Fn3ドメインが、野生型10Fn3ドメインと比較して、BC、DEおよびFGループのそれぞれに修飾されたアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドが、1μM以下のKDでターゲットに結合する。
いくつかの態様において、本発明は、前述の態様および実施形態のいずれかのポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。一定の実施形態では、医薬組成物が、コハク酸、グリシン、およびソルビトールを含む。例示的実施形態では、組成物が、pH6.0で、5nM〜30mMのコハク酸、5％〜15％のソルビトール、および2.5％〜10％のグリシンを含む。一定の実施形態では、組成物が、pH6.0で、10mMコハク酸、8％ソルビトール、および5％グリシンを含む。別の実施形態では、医薬組成物が、生理学上許容される担体をさらに含む。
マウスにおける生体内HSA半減期。20m/kg（図1A）または50mg/kg（図1B）のHSAをマウスに注射した。 マウスにおけるSABA1〜4の半減期決定。図2A：SABA1.1；図2B：SABA2.1；図2C：SABA3.1；および図2D：SABA4.1。 HSAと同時注射した時のSABA1〜4のマウスにおける半減期向上の要約を表すグラフ。 カニクイザルにおけるSABA1.1（図4A）およびSABA5.1（図4B）に関する半減期決定。 直接結合ELISAアッセイによるヒト、マウスおよびラット由来のアルブミンへのSABA1.2の結合。 SABA1.1とHSAの化学量論の決定。SABA1.1とHSAは1：1の化学量論で結合する。 HSAの組換えドメインフラグメントへのSABA1.2結合のBiacore分析。 1mpkおよび10mpkの用量で投与されたサルにおけるSABA1.2の薬物動態プロファイル。 1mpkの用量で静脈内または皮下に投与されたサルにおけるSABA1.2の薬物動態プロファイル。 FGF21とSABAの融合物の生産的発現に使用したpET29bベクターのプラスミドマップ。 PBSバッファー中、37℃における、HSAによるSABA-FGF21v1融合物の代表的な等温滴定熱量測定。このアッセイにおいて決定された値は、N＝0.87；KD＝3.8×10-9M；ΔH＝-15360カロリー/モルである。 SABA1-FGF21v1のHSA（A）、CySA（B）、およびMuSA（C）への結合、またはSABA1-FGF21v3のHSA（D）、CySA（E）、およびMuSA（F）への結合に関するSPRセンサーグラムデータ。 ヒト血清アルブミンの存在下での、HEKβ-クロトー細胞中のpERK1/2レベルの刺激における、Hisタグ付きFGF21の活性とSABA1-FGF21v1の活性の比較。 HEK親細胞中およびHEKβ-クロトー細胞中のpERK1/2レベルの刺激における、FGF1、His6タグ付きFGF21およびSABA1-FGF21v1の活性の比較。HEK親細胞（図14A）およびHEKβ-クロトー発現細胞（図14B）におけるpERK1/2レベルの用量応答刺激の代表的グラフ。データを三重試料の平均±semとしてプロットする。 図１５AおよびBは糖尿病ob/obマウスにおけるSABA1-FGF21v1の生体内効力の調査及び食後血漿中グルコースレベルを示す。 サルにおいて、SABAとFGF21の融合物は、Hisタグ付きFGF21と比較して、t1/2を約27倍増加させた。 HuSA/SABA1.2複合体を2方向から見た図を表し、2つめの図（図17B）は1つめの図（図17A）から鉛直軸を中心に70°回転させた図である。HuSAを表面表示で示し、SABA1.2をカートゥーンとして、すなわち、βストランドを矢印で、ループをひもで表している。SABA1.2上の多様化されたループを黒色で示し、HuSA上の接触残基を、それより明るい灰色の陰で示す。HuSAの3つの構造ドメインに印を付ける（すなわち、I、IIおよびIII）。 用量漸増および処置コホートの図解（実施例A9参照）。試験週数は試験の総継続時間を示す。各コホート内の週数（Wk）は、そのコホートにおける処置の開始時点からの継続時間を示す。（a）所与のコホートにおける処置は、PK分析が可能であるように、先のコホートにおける最後の被験者が29日目の来院を完了した後、約4週間は開始されないであろう。（b）各コホートにおける行1、2、または3は、1週間ずらして開始されるサブグループを示す（コホート1におけるサブグループ1と2の間は15日の間隔）。グループ1は、1人のSABA1.2処置被験者と1人のプラセボ被験者を含み；グループ2は、4人のSABA1.2処置被験者と1人のプラセボ被験者を含み；グループ3は、5人（コホート1の場合）または4人（コホート2および3の場合）のSABA1.2処置被験者と1人（全てのコホート）のプラセボ被験者を含むであろう。矢印（↑）は処置を示し（各群について1日目と15日目）；実線（−）は積極的観察期間を示し；点線（…）は安全性追跡調査を示す。 SABA1-FGF21v1による14日間の処置後のob/obマウスにおけるHbA1cのレベル。 サルにおける時間に対する平均血漿中濃度のプロファイル（平均±SD）。 固相ペプチド合成において使用するためのオルソゴナルに保護されたアミノ酸の例（上）。固相合成に役立つ他のビルディングブロックも図解する（下）。
［発明の詳細な説明］
定義
本明細書において使用される次の用語および語句は、以下に示す意味を有する。本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、別段の定義がある場合を除いて、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。
単数形「ある」および「その」（「a」「an」および「the」）は、文脈上別段の必要がある場合を除いて、複数の指示対象を包含する。
「を含む」および「を含んでいる」（「comprise」および「comprising」）という用語は、包括的、非限定的な意味で使用され、すなわち追加の要素が含まれていてもよい。
「を包含する」（「icluding」）という用語は、「を包含するが、それに限定されるわけではない」（「including but not limited to」）を意味する。「を包含する」と「を包含するが、それに限定されるわけではない」とは可換的に使用される。
「抗体様タンパク質」という用語は、「免疫グロブリン様フォールド」を有する、すなわちβシートを形成する一組のβまたはβ様ストランドに構造的に組織化される約80〜150個のアミノ酸残基を含み、そのβまたはβ様ストランドが介在するループ部分によってつながれている、非免疫グロブリンタンパク質を指す。βシートは抗体様タンパク質の安定なコアを形成すると同時に、βまたはβ様ストランドをつなぐループで構成された2つの「面」を作り出す。本明細書において説明するとおり、これらのループを変異させることで、カスタマイズされたリガンド結合部位を作り出すことができ、そのような変異はタンパク質の総合的安定性を破壊することなく生成させることができる。そのような抗体様タンパク質の一例は「フィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質」であり、これは、フィブロネクチンIII型ドメイン（Fn3）に基づくポリペプチドを意味する。ある態様では、抗体様タンパク質が第10フィブロネクチンIII型ドメイン（10Fn3）に基づく。
「ポリペプチド」とは、長さ、翻訳後修飾、または機能を問わず、2つ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。「ポリペプチド」「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書においては可換的に使用される。
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、本明細書においては、どの保存的置換も配列同一性の一部であるとは見なさずに、最大のパーセント配列同一性が得られるように、配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後に、第2配列中のアミノ酸残基と同一である、第1配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性の決定を目的とするアラインメントは、当技術分野における技量の範囲内にあるさまざまな手法で、例えば公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどを使って、達成することができる。当業者は、アラインメントをはかるための適当なパラメータを、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、決定することができる。ただし、ここでの目的には、％アミノ酸配列同一性値が、後述のように、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはGenentech, Inc.によって作成され、米国著作権局（Washington D.C., 20559）に利用者向け文書と共に登録申請されて、米国著作権登録番号TXU510087として登録されており、Genentech, Inc.（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）を通して公的に入手することができる。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはdigital UNIX V4.0D上で使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータはALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。
ここでの目的には、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bへの、または所与のアミノ酸配列Bとの、または所与のアミノ酸配列Bに対する％アミノ酸配列同一性（これは、所与のアミノ酸配列Bに、または所与のアミノ酸配列Bと、または所与のアミノ酸配列Bに対して、一定の％アミノ酸配列同一性を有する、または含む、所与のアミノ酸配列Aと、言い換えることもできる）は、以下のように算出される：100×分率X/Y（ここで、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN-2が、そのプログラムによるAとBのアラインメントにおいて、完全一致（identical match）とスコアリングしたアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合に、Bに対するAの％アミノ酸配列同一性が、Aに対するBの％アミノ酸配列同一性と等しくなくなることは、理解されるであろう。
「治療有効量」という用語は、哺乳動物における疾患または障害を処置し、かつ/またはその障害に関連する症状の1つ以上をある程度緩和するのに有効な、薬物の量を指す。
「SABA」という用語は、血清アルブミン結合性（Serum Albumin Binding）Adnectin（商標）を指す。Adnectin（商標）（Adnexus, a Bristol-Myers Squibb R&D Company）は、第10フィブロネクチンIII型ドメイン、すなわちFn3の第10モジュール（10Fn3）に基づく、リガンド結合性スキャフォールドタンパク質である。
アミノ酸配列または化合物の半減期（t1/2）は、一般に、ポリペプチドの血清中濃度が、例えばその配列もしくは化合物の分解および/または自然の機序によるその配列もしくは化合物の浄化もしくは隔離などにより、生体内で50％減少するのに要する時間と定義することができる。半減期は、当技術分野において知られている任意の手法で、例えば薬物動態分析によって決定することができる。例えばM GibaldiおよびD Perron著「Pharmacokinetics」Marcel Dekker刊、改訂第2版（1982）を参照されたい。半減期は、t1/2-α、t1/2-βおよび曲線下面積（AUC）などのパラメータを使って表すことができる。「半減期の増加」とは、これらのパラメータの任意の1つ、これらのパラメータの任意の2つ、またはこれらのパラメータの3つ全ての増加を指す。一定の実施形態では、半減期の増加がt1/2-βの増加を指し、t1/2-αもしくはAUCの増加またはその両方の増加を伴っても、伴わなくてもよい。
「PK」という用語は「pharmokinetic（薬物動態の）」の頭文字であり、例えば吸収、分布、代謝、および対象による排除などといった化合物の性質を包含する。「PK調整タンパク質」または「PK部分」は、生物活性分子に融合するか生物活性分子と一緒に投与した場合にその生物活性分子の薬物動態的性質に影響を及ぼす任意のタンパク質、ペプチド、または部分を指す。
概略
Fn3とはフィブロネクチン由来のIII型ドメインを指す。Fn3ドメインは小さく、単量体であり、可溶性であり、安定である。これはジスルフィド結合を欠き、それゆえに、還元条件下で安定である。Fn3の全体的構造は免疫グロブリンフォールドと類似している。Fn3ドメインは、N末端からC末端に向かって、順に、βまたはβ様ストランドA；ループAB；βまたはβ様ストランドB；ループBC；βまたはβ様ストランドC；ループCD；βまたはβ様ストランドD；ループDE；βまたはβ様ストランドE；ループEF；βまたはβ様ストランドF；ループFG；およびβまたはβ様ストランドGを含む。7本の逆平行βストランドは2つのβシートとして配置され、それらが安定なコアを形成すると同時に、βまたはβ様ストランドをつなぐループで構成された2つの「面」を作り出す。ループAB、CD、およびEFは一方の面に位置し、ループBC、DE、およびFGは反対面に位置する。ループAB、BC、CD、DE、EFおよびFGのいずれかまたは全てが、リガンド結合に関与しうる。Fn3のモジュールは少なくとも15種類あり、モジュール間の配列相同性は低いが、三次構造は、全てが高い類似性を共有している。
Adnectin（商標）（Adnexus, a Bristol-Myers Squibb R&D Company）は、第10フィブロネクチンIII型ドメイン、すなわちFn3の第10モジュール（10Fn3）に基づく、リガンド結合性スキャフォールドタンパク質である。天然ヒト10Fn3のアミノ酸配列を配列番号1に示す：
Figure 2013531477
 （配列番号1）（AB、CDおよびEFループに下線を付し、BC、FG、およびDEループを太字で強調している）。配列番号1では、ABループが残基15〜16に対応し、BCループが残基21〜30に対応し、CDループが残基39〜45に対応し、DEループが残基51〜56に対応し、EFループが残基60〜66に対応し、FGループが残基76〜87に対応する（Xuら, Chemistry & Biology 2002 9:933-942）。BC、DEおよびFGループは、分子の一方の面に沿って並び、AB、CDおよびEFループは分子の反対面に沿って並ぶ。配列番号1では、βストランドAが残基9〜14に対応し、βストランドBが残基17〜20に対応し、βストランドCが残基31〜38に対応し、βストランドDが残基46〜50に対応し、βストランドEが残基57〜59に対応し、βストランドFが残基67〜75に対応し、βストランドGが残基88〜94に対応する。ストランドは、例えばストランドAとBが、ループABにより、ストランドA、ループAB、ストランドBの構成でつながれるというように、対応するループによって互いにつながれる。配列番号1の最初の8アミノ酸（上記の配列では斜体）は、分子の結合活性を保ったまま、欠失させることができる。疎水性コアの形成に関与する残基（「コアアミノ酸残基」）には、次に挙げる配列番号1のアミノ酸が包含される：L8、V10、A13、L18、I20、W22、Y32、I34、Y36、F48、V50、A57、I59、L62、Y68、I70、V72、A74、I88、I90およびY92（ここでは、コアアミノ酸残基を、1文字アミノ酸記号とそれに続く配列番号1内でのその位置によって表している）。例えばDickinsonら, J. Mol. Biol. 236:1079-1092 (1994)を参照されたい。
10Fn3は、抗体に、具体的には抗体の可変領域に、構造的にも機能的にも類似している。10Fn3ドメインは「抗体模倣物質」または「抗体様タンパク質」と記述することができるが、これらには従来の抗体より有利な点がいくつかある。特にこれらは、抗体と比べて、より良いフォールディング特性および熱安定性特性を示し、一定の条件下で適正なフォールディングを妨害または防止することが知られているジスルフィド結合を欠く。例示的な10Fn3ベースの血清アルブミン結合物質は、主として、平均約65℃のTmを有する単量体型である。
10Fn3のBC、DE、およびFGループは、免疫グロブリンの相補性決定領域（CDR）に類似している。これらのループ領域中のアミノ酸配列の改変は、10Fn3の結合特異性を変化させる。所望のターゲットに結合する分子を作製するために、AB、CDおよびEFループ中に修飾を有する10Fn3ドメインを作ることもできる。ループ外のタンパク質配列は、免疫グロブリンのフレームワーク領域に類似しており、10Fn3の構造コンフォメーションにおいて役割を果たす。10Fn3のフレームワーク様領域における改変は、リガンド結合が破壊されるほど構造コンフォメーションが改変されない限り、許容される。10Fn3リガンド特異的結合物質を生成させるための方法は、高アフィニティTNFα結合物質を開示するPCT公開番号WO 00/034787、WO 01/64942、およびWO 02/032925、高アフィニティVEGFR2結合物質を開示するPCT公開番号WO 2008/097497、ならびに高アフィニティIGFIR結合物質を開示するPCT公開番号WO 2008/066752に記載されている。10Fn3結合物質および結合物質の選択方法を議論しているさらなる参考文献には、PCT公開番号WO 98/056915、WO 02/081497、およびWO 2008/031098、ならびに米国特許出願公開第2003186385号が包含される。
上述のように、配列番号1の残基21〜30、51〜56、および76〜87に対応するアミノ酸残基は、それぞれBC、DEおよびFGループを規定する。しかし、ヒト血清アルブミンなどの所望のターゲットに対して強いアフィニティを有する10Fn3結合物質を獲得するために、ループ領域内のあらゆる残基を修飾する必要があるわけではないことを、理解すべきである。例えば、本明細書に記載する実施例の多くでは、高アフィニティ10Fn3結合物質を作製するために、BCループのアミノ酸23〜30およびDEループのアミノ酸52〜55に対応する残基だけが修飾された。したがって、一定の実施形態では、BCループを配列番号1の残基23〜30に対応するアミノ酸によって規定し、DEループを、配列番号1の残基52〜55に対応するアミノ酸によって規定することができる。さらにまた、ループ領域中に挿入および欠失を加えてもなお、高アフィニティ10Fn3結合物質を作製することができる。例えば配列番号4（SABA1）は、FGループが4つのアミノ酸欠失を含有する（すなわち配列番号1のアミノ酸21〜29に対応する11残基が7つのアミノ酸で置き換えられている）HSA結合物質の一例である。配列番号113は、FGループがアミノ酸挿入を含有する（すなわち配列番号1のアミノ酸21〜29に対応する11残基が12個のアミノ酸で置き換えられている）HSA結合物質の一例である。
したがって、いくつかの実施形態において、BC、DE、およびFGから選択される1つ以上のループは、野生型ヒト10Fn3中の対応するループと比較して、長さが伸長または短縮されていてもよい。いくつかの実施形態において、ループの長さは、2〜25アミノ酸分、伸長されていてもよい。いくつかの実施形態において、ループの長さは、1〜11アミノ酸分、減少していてもよい。特に、10Fn3のFGループが12残基長であるのに対して、抗体重鎖中の対応するループは4〜28残基の範囲にある。それゆえ、抗原結合を最適化するには、10Fn3のFGループの長さを、抗原結合において最大限のフレキシビリティおよびアフィニティを得るために、長さも、配列も、4〜28残基のCDR3範囲を網羅するように改変することができる。いくつかの実施形態では、インテグリン結合モチーフ「アルギニン-グリシン-アスパラギン酸」（RGD）を、極性アミノ酸-中性アミノ酸−酸性アミノ酸配列（N末端からC末端に向かって）で置き換えることができる。
10Fn3は一般に、配列番号1の1番目に対応するアミノ酸残基で始まる。しかし本発明にはアミノ酸欠失を有するドメインも包含される。いくつかの実施形態では、配列番号1の最初の8アミノ酸に対応するアミノ酸残基が欠失している。N末端またはC末端に追加の配列を付加することもできる。例えば、10Fn3のN末端に、追加のMG配列を置くことができる。通常、Mは切り離されて、N末端にGが残るであろう。いくつかの実施形態では、10Fn3ドメインのC末端に伸長配列、例えばEIDKPSQ（配列番号54）、EIEKPSQ（配列番号60）、またはEIDKPSQLE（配列番号61）を、置くことができる。そのようなC末端配列を、ここではテールまたは伸長部といい、本明細書においてさらに説明する。いくつかの実施形態では、His6タグをN末端またはC末端に置くことができる。
10Fn3の非リガンド結合配列、すなわち「10Fn3スキャフォールド」は、その10Fn3がリガンド結合機能および/または構造安定性を保持するという条件の下で、改変することができる。いくつかの実施形態では、Asp7、Glu9、およびAsp23の1つ以上が、別のアミノ酸で、例えば非陰性荷電アミノ酸（例えばAsn、Lysなど）で置き換えられる。これらの変異は、野生型と比べて中性pHにおける変異型10Fn3のより高い安定性を増進する効果を有すると報告されている（PCT公開番号WO 02/04523参照）。10Fn3スキャフォールドにおける追加の改変であって、有益または中立であるものは、種々開示されている。例えばBatoriら, Protein Eng. 2002 15(12):1015-20；Koideら, Biochemistry 2001 40(34):10326-33を参照されたい。
10Fn3スキャフォールドは、1つ以上の保存的置換によって修飾することができる。保存的置換により、リガンドに対する10Fn3のアフィニティを実質的に改変することなく、10Fn3スキャフォールド中のアミノ酸の5％、10％、20％、さらには30％以上ものアミノ酸を改変することができる。例えば、スキャフォールドの修飾による、リガンドに対する10Fn3結合物質の結合アフィニティの減少は、好ましくは、100倍、50倍、25倍、10倍、5倍、または2倍未満である。そのような変化は生体内での10Fn3の免疫原性を改変するかもしれない。そして免疫原性が減少する場合、そのような変化は望ましいであろう。本明細書にいう「保存的置換」とは、対応する基準残基に物理的または機能的に類似する残基である。すなわち、保存的置換とその基準残基とは、類似するサイズ、形状、電荷、（共有結合または水素結合を形成する能力などといった）化学的性質などを有する。好ましい保存的置換は、Dayhoffら, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352（1978 & Supp.）において許容される点突然変異に関して規定された基準を満たすものである。保存的置換の例は次のグループ内での置換である：（a）バリン、グリシン；（b）グリシン、アラニン；（c）バリン、イソロイシン、ロイシン；（d）アスパラギン酸、グルタミン酸；（e）アスパラギン、グルタミン；（f）セリン、スレオニン；（g）リジン、アルギニン、メチオニン；および（h）フェニルアラニン、チロシン。
一定の実施形態では、10Fn3スキャフォールドに基づく抗体様タンパク質を、次の配列：
EVVAAT(X)a SLLI(X)x YYRITYGE(X)b QEFTV(X)y ATI(X)c DYTITVYAV(X)z ISINYRT（配列番号2）
によって、広く定義することができる。配列番号2では、ABループがXaで表され、CDループがXbで表され、EFループがXcで表され、BCループがXxで表され、DEループがXyで表され、FGループがXzで表される。Xは任意のアミノ酸を表し、Xに続く下付き文字はアミノ酸数の整数を表す。特に、aは、1〜15、2〜15、1〜10、2〜10、1〜8、2〜8、1〜5、2〜5、1〜4、2〜4、1〜3、2〜3、または1〜2アミノ酸ぐらいであることができ、b、c、x、yおよびzは、それぞれ独立して、2〜20、2〜15、2〜10、2〜8、5〜20、5〜15、5〜10、5〜8、6〜20、6〜15、6〜10、6〜8、2〜7、5〜7、または6〜7アミノ酸ぐらいであることができる。好ましい実施形態では、aが2アミノ酸、bが7アミノ酸、cが7アミノ酸、xが9アミノ酸、yが6アミノ酸、そしてzが12アミノ酸である。βストランドの配列は、配列番号1に示す対応するアミノ酸と比較して、7つ全てのスキャフォールド領域全体にわたって、0〜10、0〜8、0〜6、0〜5、0〜4、0〜3、0〜2、または0〜1個ぐらいの置換、欠失または付加を有することができる。例示的一実施形態において、βストランドの配列は、配列番号1に示す対応するアミノ酸と比較して、7つ全てのスキャフォールド領域全体にわたって、0〜10、0〜8、0〜6、0〜5、0〜4、0〜3、0〜2、または0〜1個ぐらいの保存的置換を有することができる。一定の実施形態では、コアアミノ酸残基が固定され、置換、保存的置換、欠失または付加はいずれも、コアアミノ酸残基以外の残基に存在する。例示的実施形態では、それぞれ(X) x 、(X) y 、および(X) z で表されるBC、DE、およびFGループが、下記の表2に示すHSA結合物質（すなわち、表2の配列番号4、8、12、16、20、および24〜44）のいずれかに由来するBC、DEおよびFGループ配列を含むポリペプチドで置き換えられる。
一定の実施形態では、10Fn3スキャフォールドに基づく抗体様タンパク質を、配列：
EVVAATPTSLLI(X)x YYRITYGETGGNSPVQEFTV(X)y ATISGLKPGVDYTITVYAV(X)z ISINYRT（配列番号3）によって、広く定義することができる。配列番号3では、BCループがXxで表され、DEループがXyで表され、FGループがXzで表される。Xは任意のアミノ酸を表し、Xに続く下付き文字はアミノ酸数の整数を表す。特にx、yおよびzは、それぞれ独立して、2〜20、2〜15、2〜10、2〜8、5〜20、5〜15、5〜10、5〜8、6〜20、6〜15、6〜10、6〜8、2〜7、5〜7、または6〜7アミノ酸ぐらいであることができる。好ましい実施形態では、xが9アミノ酸、yが6アミノ酸、そしてzが12アミノ酸である。βストランドの配列は、配列番号1に示す対応するアミノ酸と比較して、7つ全てのスキャフォールド領域全体にわたって、0〜10、0〜8、0〜6、0〜5、0〜4、0〜3、0〜2、または0〜1個ぐらいの置換、欠失または付加を有することができる。例示的一実施形態において、βストランドの配列は、配列番号1に示す対応するアミノ酸と比較して、7つ全てのスキャフォールド領域全体にわたって、0〜10、0〜8、0〜6、0〜5、0〜4、0〜3、0〜2、または0〜1個ぐらいの保存的置換を有することができる。一定の実施形態では、コアアミノ酸残基が固定され、置換、保存的置換、欠失または付加はいずれも、コアアミノ酸残基以外の残基に存在する。例示的実施形態では、それぞれ(X)x、(X)y、および(X)zで表されるBC、DE、およびFGループが、下記の表2に示すHSA結合物質（すなわち、表2の配列番号4、8、12、16、20、および24〜44）のいずれかに由来するBC、DEおよびFGループ配列を含むポリペプチドで置き換えられる。
EDテールを有する 10 Fn3ドメイン
ある態様において、本発明は、フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、（i）野生型10Fn3ドメインと比較して、AB、BC、CD、DE、EFおよびFGループの1つ以上に修飾されたアミノ酸配列を含み、（ii）野生型10Fn3ドメインによって結合されないターゲット分子に結合し、かつ（iii）配列(ED)nを有するC末端テール（ここで、nは、2〜10、2〜8、2〜5、3〜10、3〜8、3〜7、3〜5、もしくは4〜7の整数であるか、またはnは、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10である）を含む、ポリペプチドを提供する。
一定の実施形態では、10Fn3ドメインが、配列番号1の残基9〜94に示すアミノ酸配列と少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、10Fn3ドメインが配列番号1、2または3を含む。一定の実施形態では、10Fn3ドメインが、配列番号1のアミノ酸9〜94を含む。
一定の実施形態では、EDテールを有する10Fn3ドメインが、C末端かつEDリピートの直前に、E、IまたはEIを含む。いくつかの実施形態では、EDリピートが、10Fn3ドメインの溶解度を向上させ、かつ/または10Fn3ドメインの凝集を減少させる。
一定の実施形態では、EDテールを有する10Fn3ドメインが、野生型10Fn3ドメインと比較して、BC、DEおよびFGループのそれぞれに、修飾されたアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、EDテールを有する10Fn3ドメインが、1μM以下のKDで、所望のターゲットに結合する。
血清アルブミン結合物質
10Fn3ドメインは、サイズが約10kDaと小さいため、腎臓濾過および分解によって、循環から迅速に浄化される（マウスにおいてt1/2＝15〜45分；サルにおいて3時間）。一定の態様において、本願は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（HSA）に特異的に結合することで10Fn3ドメインのt1/2を引き延ばす、10Fn3ドメインを提供する。
HSAは、ヒトでは600μMの血清中濃度および19日のt1/2を有する。HSAの長いt1/2は、新生児型Fc受容体（FcRn）によるそのリサイクリングが一因であると考えられている。HSAは、内皮細胞内へのエンドソーム取り込み後に、pH依存的にFcRnに結合する。この相互作用が再びHSAを血流へとリサイクルさせることで、HSAをリソソーム分解から遠ざけている。FcRnは、広く発現しており、このリサイクリング経路は構成的であると考えられる。大部分の細胞タイプでは、大半のFcRnが細胞内ソーティングエンドソーム中に存在する。HSAは、液相飲作用の非特異的機序によって容易にインターナライズされ、FcRnにより、リソソームにおける分解からレスキューされる。エンドソームに見いだされる酸性pHでは、FcRnに対するHSAのアフィニティが増加する（pH6.0において5μM）。FcRnに結合すると、HSAは、リソソーム分解経路から遠ざけられ、ひとたび細胞表面へのトランスサイトーシスを受けて、細胞表面で放出される。
ある態様において、本開示は、血清アルブミン結合性10Fn3ドメインを含む抗体様タンパク質を提供する。例示的実施形態において、本明細書に記載する血清アルブミン結合性10Fn3タンパク質は、3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、100pM、50pMまたは10pM未満のKDで、HSAに結合する。一定の実施形態において、本明細書に記載する血清アルブミン結合性10Fn3タンパク質は、5.5〜7.4のpH範囲、25℃または37℃において、3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、100pM、50pMまたは10pM未満のKDで、HSAに結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載する血清アルブミン結合性10Fn3タンパク質は、7.4以上のpHでのHSAに対する結合アフィニティと比べて、7.4未満のpHでは、HSAに、より強固に結合する。
一定の実施形態において、本明細書に記載するHSA結合性10Fn3タンパク質は、サル、ラット、またはマウスの1つ以上に由来する血清アルブミンにも結合しうる。一定の実施形態において、本明細書に記載する血清アルブミン結合性10Fn3タンパク質は、3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pMまたは100pM未満のKDで、アカゲザル血清アルブミン（RhSA）またはカニクイザル血清アルブミン（CySA）に結合する。
一定の実施形態において、本明細書に記載する血清アルブミン結合性10Fn3タンパク質は、HSAのドメインIおよび/またはドメインIIに結合する。ある実施形態では、本明細書に記載する血清アルブミン結合性10Fn3タンパク質は、HSAのドメインIIIに結合しない。
一定の実施形態では、血清アルブミン結合性10Fn3（SABA）が、野生型10Fn3ドメイン（配列番号1）に対して少なくとも40％、50％、60％、70％、75％、80％または85％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、BC、DE、またはFGループの少なくとも1つが、野生型10Fn3ドメインと比較して修飾されている。もう一つの実施形態では、BC、DE、またはFGループの少なくとも2つが、野生型10Fn3ドメインと比較して修飾されている。もう一つの実施形態では、BC、DE、およびFGループの3つ全てが、野生型10Fn3ドメインと比較して修飾されている。別の実施形態では、SABAが、表2に示す26のコアSABA配列（すなわち配列番号4、8、12、16、20、および24〜44）のいずれか1つまたは表2に示す伸長されたSABA配列（すなわち配列番号89〜116、6×HISタグを除く）のいずれか1つに対して、少なくとも40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本明細書に記載するSABAは、それぞれ(X)x、(X)y、および(X)zで表されるBC、DE、およびFGループが、26のコアSABA配列（すなわち、表2の配列番号4、8、12、16、20、および24〜44）のいずれかに由来する明示されたBC、DE、およびFGループの各セットまたはそれら26のコアSABA配列のBC、DEおよびFGループ配列と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％同一な配列で置き換えられている、配列番号2または3に示す配列を含んでもよい。例示的実施形態において、本明細書に記載するSABAは配列番号3によって規定され、26のコアSABA配列（すなわち表2の配列番号4、8、12、16、20、および24〜44）のいずれかに由来する一組のBC、DEおよびFGループ配列を有する。そのようなSABAのスキャフォールド領域は、配列番号1のスキャフォールドアミノ酸残基と比較して、0〜20、0〜15、0〜10、0〜8、0〜6、0〜5、0〜4、0〜3、0〜2、または0〜1個ぐらいの置換、保存的置換、欠失または付加を有しうる。例えばSABA1は配列番号4に示すコア配列を有し、それぞれ配列番号5〜7に示すBC、DE、およびFGループを含む。それゆえに、SABA1コアに基づくSABAは、(X)xが配列番号5を含み、(X)yが配列番号6を含み、かつ(X)zが配列番号7を含む配列番号2または3を含みうる。他のSABAコア配列に由来するBC、DEおよびFGループのセットを利用して、同様のコンストラクトが考えられる。そのようなSABAのスキャフォールド領域は、配列番号1のスキャフォールドアミノ酸残基と比較して、0〜20、0〜15、0〜10、0〜8、0〜6、0〜5、0〜4、0〜3、0〜2、または0〜1個ぐらいの置換、保存的置換、欠失または付加を含みうる。そのSABAが所望のKDで血清アルブミン、例えばHSAに結合する能力を有する限り、そのようなスキャフォールド修飾を施すことができる。
一定の実施形態では、SABA（例えば上述のSABAコア配列またはそれに基づく配列）を修飾して、N末端伸長配列および/またはC末端伸長配列を含むようにすることができる。例示的な伸長配列を表2に示す。例えば、SABA1.1と呼ばれる配列番号89は、コアSABA1配列（配列番号4）を含み、N末端配列MGVSDVPRDLE（配列番号45、AdNT1と呼ばれる）とC末端配列EIDKPSQ（配列番号54、AdCT1と呼ばれる）とを伴う。SABA1.1は、さらに、C末端にHis6タグを含むが、His6タグは全く随意であって、N末端またはC末端伸長配列内のどこにおいてもよいと理解すべきである。さらに、表2に掲載する任意の所与のSABAコア配列を修飾するために、表2に掲載する例示的N末端またはC末端伸長配列（配列番号45〜64および215）およびその変異体を、どれでも使用することができる。一定の実施形態では、表2に掲載するリンカー配列（配列番号65〜88、216〜221および397）を、C末端テール配列として、単独で、または配列番号54〜64または215の一つと組み合わせて、使用することができる。
一定の実施形態において、C末端伸長配列（「テール」とも呼ぶ）は、EおよびD残基を含み、8〜50、10〜30、10〜20、5〜10、および2〜4アミノ酸長であることができる。いくつかの実施形態では、テール配列は、配列がEDのタンデムリピートを含んでいるEDベースのリンカーを包含する。例示的実施形態において、テール配列は、2〜10、2〜7、2〜5、3〜10、3〜7、3〜5、3、4または5個のEDリピートを含む。一定の実施形態では、EDベースのテール配列が、例えばEI、EID、ES、EC、EGS、およびEGCなどといった追加のアミノ酸残基も包含する。そのような配列は、部分的に、既知のAdnectin（商標）テール配列に基づき、例えば残基DおよびKが除去されているEIDKPSQ（配列番号54）である。例示的実施形態において、EDベースのテールは、EDリピートの前にE、IまたはEI残基を含む。
別の実施形態では、例えばEIEDEDEDEDEDがGSGSGSGSと接合されている配列番号147（SABA1-FGF21v16）など、SABA融合分子を設計する際に、テール配列を、必要に応じて他の既知リンカー配列（例えば表2の配列番号65〜88、216〜221および397）と組み合わせることができる。
血清アルブミン結合性Adnectin（商標）（SABA）の融合物
本発明の一態様は、血清アルブミン結合性10Fn3（SABA）と少なくとも1つの追加部分とを含むコンジュゲートを提供する。追加部分は、任意の診断、イメージング、または治療目的に役立ちうる。
一定の実施形態では、SABAに融合される部分の血清中半減期が、SABAにコンジュゲートされていない当該部分の血清中半減期と比較して増加する。一定の実施形態では、SABA融合物の血清中半減期が、SABAに融合されていない当該部分の血清中半減期と比較して、少なくとも20、40、60、80、100、120、150、180、200、400、600、800、1000、1200、1500、1800、1900、2000、2500、または3000％長い。別の実施形態では、SABA融合物の血清中半減期が、SABAに融合されていない当該部分の血清中半減期より、少なくとも1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍、または50倍大きい。いくつかの実施形態では、SABA融合物の血清中半減期が、少なくとも2時間、2.5時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、15時間、20時間、25時間、30時間、35時間、40時間、50時間、60時間、70時間、80時間、90時間、100時間、110時間、120時間、130時間、135時間、140時間、150時間、160時間、または200時間である。
一定の実施形態では、SABA融合タンパク質が、3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、100pM、50pMまたは10pM未満のKDで、HSAに結合する。一定の実施形態では、SABA融合タンパク質が、5.5〜7.4のpH範囲、25℃または37℃において、3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、100pM、50pMまたは10pM未満のKDで、HSAに結合する。いくつかの実施形態では、SABA融合タンパク質が、pH7.4における結合と比較して、7.4未満のpHでは、HSAに、より強固に結合する。
したがって本明細書に記載するSABA融合分子は、治療部分とSABAとの融合物を作り出すことによって、治療部分（例えばFGF21）の半減期を増加させるのに有用である。そのような融合分子は、その融合物に含有される治療部分の生物学的活性に応答する状態を処置するのに使用することができる。本発明では、次に挙げるタンパク質または分子のいずれかの調節不全によって引き起こされる疾患における、SABA融合分子の使用が考えられる。
異種部分
いくつかの実施形態では、SABAが、小さな有機分子、核酸、またはタンパク質である第2の部分に融合される。いくつかの実施形態では、SABAが、受容体、受容体リガンド、ウイルスコートタンパク質、免疫系タンパク質、ホルモン、酵素、抗原、または細胞シグナリングタンパク質をターゲットとする治療部分に融合される。融合物は、第2部分をSABA分子のどちらか一方の端に、すなわちSABA-治療分子の配置または治療分子-SABAの配置で取り付けることによって、形成させることができる。
例示的実施形態では、治療部分が、VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2、VEGF-R3、Her-1、Her-2、Her-3、EGF-I、EGF-2、EGF-3、α3、cMet、ICOS、CD40L、LFA-I、c-Met、ICOS、LFA-I、IL-6、B7.1、Wl.2、OX40、IL-Ib、TACI、IgE、BAFFまたはBLys、TPO-R、CD19、CD20、CD22、CD33、CD28、IL-I-R1、TNF-α、TRAIL-R1、補体受容体1、FGFa、オステオポンチン、ビトロネクチン、エフリンA1-A5、エフリンB1-B3、α-2-マクログロブリン、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CXCL16、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、PDGF、TGFb、GMCSF、SCF、p40（IL12/IL23)、ILIb、ILIa、IL1Ra、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、IL10、IL12、IL15、IL23、Fas、FasL、Flt3リガンド、41BB、ACE、ACE-2、KGF、FGF-7、SCF、ネトリン1，2、IFNa，b，g、カスパーゼ2，3，7，8，10、ADAM S1，S5，8，9，15，TS1，TS5；アディポネクチン、ALCAM、ALK-I、APRIL、アネキシンV、アンギオゲニン、アンフィレギュリン、アンジオポエチン1，2，4、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1、B7-H2、B7-H3、Bcl-2、BACE-I、BAK、BCAM、BDNF、bNGF、bECGF、BMP2，3，4，5，6，7，8；CRP、カドヘリン6，8，11；カテプシンA，B，C，D，E，L，S，V，X；CD11a/LFA-1、LFA-3、GP2b3a、GH受容体、RSV Fタンパク質、IL-23（p40、p19）、IL-12、CD80、CD86、CD28、CTLA-4、α4-β1、α4-β7、TNF/リンフォトキシン、IgE、CD3、CD20、IL-6、IL-6R、BLYS/BAFF、IL-2R、HER2、EGFR、CD33、CD52、ジゴキシン、Rho(D)、水痘（Varicella）、肝炎（Hepatitis）、CMV、破傷風（Tetanus）、ワクシニア（Vaccinia）、抗毒素（Antivenom）、ボツリヌス（Botulinum）、Trail-R1、Trail-R2、cMet、TNF-Rファミリー、例えばLA NGF-R、CD27、CD30、CD40、CD95、リンフォトキシンa/b受容体、WsI-I、TL1A/TNFSF15、BAFF、BAFF-R/TNFRSF13C、TRAIL R2/TNFRSF10B、TRAIL R2/TNFRSF10B、Fas/TNFRSF6 CD27/TNFRSF7、DR3/TNFRSF25、HVEM/TNFRSF14、TROY/TNFRSF19、CD40リガンド/TNFSF5、BCMA/TNFRSF17、CD30/TNFRSF8、LIGHT/TNFSF14、4-1BB/TNFRSF9、CD40/TNFRSF5、GITR/[γ]NFRSF18、オステオプロテゲリン/TNFRSF1 IB、RANK/TNFRSF11A、TRAIL R3/TNFRSF10C、TRAIL/TNFSF10、TRANCE/RANK L/TNFSF11、4-1BBリガンド/TNFSF9、TWEAK/TNFSF12、CD40リガンド/TNFSFS、Fasリガンド/TNFSF6、RELT/TNFRSF19L、APRIL/TNFSF13、DcR3/TNFRSF6B、TNF RI/TNFRSFIA、TRAIL R1/TNFRSF10A、TRAIL R4/TNFRSF10D、CD30リガンド/TNFSF8、GITRリガンド/TNFSF18、TNFSF18、TACI/TNFRSF13B、NGF R/TNFRSF16、OX40リガンド/TNFSF4、TRAIL R2/TNFRSF10B、TRAIL R3/TNFRSF10C、TWEAK R/TNFRSF12、BAFF/BLyS/TNFSF13、DR6/TNFRSF21、TNF-α/TNFSF1 A、Pro-TNF-α/TNFSF1A、リンフォトキシンβ R/TNFRSF3、リンフォトキシンβ R(LTbR)/Fcキメラ、TNF RI/TNFRSFIA、TNF-β/TNFSF1B、PGRP-S、TNF RI/TNFRSFIA、TNF RII/TNFRSFIB、EDA-A2、TNF-α/TNFSFIA、EDAR、XEDAR、TNF RI/TNFRSFIAである。
特に興味深いのは、精製された形態で市販されているヒトターゲットタンパク質、ならびにこれらのターゲットタンパク質に結合するタンパク質である。以下はその例である：4EBP1、14-3-3ζ、53BP1、2B4/SLAMF4、CCL21/6Ckine、4-1BB/TNFRSF9、8D6A、4-1BBリガンド/TNFSF9、8-オキソ-dG、4-アミノ-1,8-ナフタルイミド、A2B5、アミノペプチダーゼLRAP/ERAP2、A33、アミノペプチダーゼN/ANPEP、Aag、アミノペプチダーゼP2/XPNPEP2、ABCG2、アミノペプチダーゼP1/XPNPEP1、ACE、アミノペプチダーゼPILS/ARTS1、ACE-2、アムニオンレス（Amnionless）、アクチン、アンフィレギュリン、β-アクチン、AMPKα1/2、アクチビンA、AMPKα1、アクチビンAB、AMPKα2、アクチビンB、AMPKβ1、アクチビンC、AMPKβ2、アクチビンRIA/ALK-2、アンドロゲンR/NR3C4、アクチビンRIB/ALK-4、アンギオゲニン、アクチビンRIIA、アンジオポエチン-1、アクチビンRIIB、アンジオポエチン-2、ADAM8、アンジオポエチン-3、ADAM9、アンジオポエチン-4、ADAM10、アンジオポエチン様1、ADAM12、アンジオポエチン様2、ADAM15、アンジオポエチン様3、TACE/ADAM17、アンジオポエチン様4、ADAM19、アンジオポエチン様7/CDT6、ADAM33、アンジオスタチン、ADAMTS4、アネキシンA1/アネキシンI、ADAMTS5、アネキシンA7、ADAMTS1、アネキシンA10、ADAMTSL-1/パンクチン（Punctin）、アネキシンV、アディポネクチン/Acrp30、ANP、AEBSF、APサイト（AP Site）、アグリカン、APAF-I、アグリン、APC、AgRP、APE、AGTR-2、APJ、AIF、APLP-I、Akt、APLP-2、Aktl、アポリポタンパク質AI、Akt2、アポリポタンパク質B、Akt3、APP、血清アルブミン、APRIL/TNFSF13、ALCAM、ARC、ALK-I、アルテミン、ALK-7、アリールスルファターゼAJARSA、アルカリホスファターゼ、ASAH2/N-アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ-2、α2u-グロブリン、ASC、α-1-酸性糖タンパク質、ASGR1、α-フェトプロテイン、ASK1、ALS、ATM、エナメル芽細胞ATRIP、AMICA/JAML、オーロラ（Aurora）A、AMIGO、オーロラB、AMIGO2、アキシン（Axin）-1、AMIGO3、AxI、アミノアシラーゼ/ACY1、アズロシジン/CAP37/HBP、アミノペプチダーゼA/ENPEP、B4GALT1、BIM、B7-1/CD80、6-ビオチン-17-NAD、B7-2/CD86、BLAME/SLAMF8、B7-H1/PD-L1、CXCL13/BLC/BCA-1、B7-H2、BLIMP1、B7-H3、BIk、B7-H4、BMI-I、BACE-I、BMP-1/PCP、BACE-2、BMP-2、Bad、BMP-3、BAFF/TNFSF13B、BMP-3b/GDF-10、BAFF R/TNFRSF 13C、BMP-4、Bag-1、BMP-5、BAK、BMP-6、BAMBI/NMA、BMP-7、BARD1、BMP-8、Bax、BMP-9、BCAM、BMP-10、Bcl-10、BMP-15/GDF-9B、Bcl-2、BMPR-IA/ALK-3、Bcl-2関連タンパク質A1、BMPR-IB/ALK-6、Bcl-w、BMPR-II、Bcl-x、BNIP3L、Bcl-xL、BOC、BCMA/TNFRSF17、BOK、BDNF、BPDE、ベンズアミド、ブラキュリ（Brachyury）、共通β鎖、B-Raf、βIG-H3、CXCL14/BRAK、ベータセルリン、BRCA1、β-ディフェンシン2、BRCA2、BID、BTLA、バイグリカン、Bub-1、Bik様キラータンパク質、c-jun、CD90/Thy1、c-Rel、CD94、CCL6/C10、CD97、CIq R1/CD93、CD151、CIqTNFl、CD160、C1qTNF4、CD163、C1qTNF5、CD164、補体成分CIr、CD200、補体成分CIs、CD200 R1、補体成分C2、CD229/SLAMF3、補体成分C3a、CD23/FcεRII、補体成分C3d、CD2F-10/SLAMF9、補体成分C5a、CD5L、カドヘリン-4/R-カドヘリン、CD69、カドヘリン-6、CDC2、カドヘリン-8、CDC25A、カドヘリン-11、CDC25B、カドヘリン-12、CDCP1、カドヘリン-13、CDO、カドヘリン-17、CDX4、E-カドヘリン、CEACAM-1/CD66a、N-カドヘリン、CEACAM-6、P-カドヘリン、サーベラス（Cerberus）1、VE-カドヘリン、CFTR、カルビンディンD、cGMP、カルシニューリンA、Chem R23、カルシニューリンB、ケマリン、カルレティキュリン-2、ケモカインサンプラーパック、CaMキナーゼII、キチナーゼ3様1、cAMP、キトトリオシダーゼ/CHIT1、カンナビノイドR1、Chk1、カンナビノイドR2/CB2/CNR2、Chk2、CAR/NR1I3、CHL-1/L1CAM-2、炭酸脱水酵素I、コリンアセチルトランスフェラーゼ/CbAT、炭酸脱水酵素II、コンドロレクチン、炭酸脱水酵素III、コーディン、炭酸脱水酵素IV、コーディン様1、炭酸脱水酵素VA、コーディン様2、炭酸脱水酵素VB、CINC-I、炭酸脱水酵素VI、CINC-2、炭酸脱水酵素VII、CINC-3、炭酸脱水酵素VIII、クラスピン、炭酸脱水酵素IX、クローディン-6、炭酸脱水酵素X、CLC、炭酸脱水酵素XII、CLEC-I、炭酸脱水酵素XIII、CLEC-2、炭酸脱水酵素XIV、CLECSF13/CLEC4F、カルボキシメチルリジン、CLECSF8、カルボキシペプチダーゼA1/CPA1、CLF-I、カルボキシペプチダーゼA2、CL-P1/COLEC12、カルボキシペプチダーゼA4、クラスタリン、カルボキシペプチダーゼB1、クラスタリン様1、カルボキシペプチダーゼE/CPE、CMG-2、カルボキシペプチダーゼX1、CMV UL146、カルジオトロフィン-1、CMV UL147、カルノシンジペプチダーゼ1、CNP、カロンテ（Caronte）、CNTF、CART、CNTF Rα、カスパーゼ、凝固第II因子/トロンビン、カスパーゼ-1、凝固第III因子/組織因子、カスパーゼ-2、凝固第VII因子、カスパーゼ-3、凝固第X因子、カスパーゼ-4、凝固第XI因子、カスパーゼ-6、凝固第XIV因子/プロテインC、カスパーゼ-7、COCO、カスパーゼ-8、コヒーシン、カスパーゼ-9、コラーゲンI、カスパーゼ-10、コラーゲンII、カスパーゼ-12、コラーゲンIV、カスパーゼ-13、共通γ鎖/IL-2 Rγ、カスパーゼペプチドインヒビター、COMP/トロンボスポンジン-5、カタラーゼ、補体成分CIrLP、β-カテニン、補体成分CIqA、カテプシン1、補体成分CIqC、カテプシン3、補体因子D、カテプシン6、補体因子I、カテプシンA、補体MASP3、カテプシンB、コネキシン43、カテプシンC/DPPI、コンタクチン-1、カテプシンD、コンタクチン-2/TAG1、カテプシンE、コンタクチン-4、カテプシンF、コンタクチン-5、カテプシンH、コリン（Corin）、カテプシンL、コルヌリン（Cornulin）、カテプシンO、CORS26/C1qTNF，3、カテプシンS、ラット皮質幹細胞、カテプシンV、コルチゾール、カテプシンXITJ?、COUP-TF I/NR2F1、CBP、COUP-TF II/NR2F2、CCI、COX-I、CCK-A R、COX-2、CCL28、CRACC/SLAMF7、CCR1、C反応性タンパク質、CCR2、クレアチンキナーゼ筋型/CKMM、CCR3、クレアチニン、CCR4、CREB、CCR5、CREG、CCR6、CRELD1、CCR7、CRELD2、CCR8、CRHBP、CCR9、CRHR-I、CCR10、CRIM1、CD155/PVR、クリプト（Cripto）、CD2、CRISP-2、CD3、CRISP-3、CD4、クロスベインレス（Crossveinless）-2、CD4＋/45RA-、CRTAM、CD4＋/45RO-、CRTH-2、CD4＋/CD62L-/CD44、CRY1、CD4＋/CD62L＋/CD44、クリプティック（Cryptic）、CD5、CSB/ERCC6、CD6、CCL27/CTACK、CD8、CTGF/CCN2、CD8＋/45RA-、CTLA-4、CD8＋/45RO-、キュビリン、CD9、CX3CR1、CD14、CXADR、CD27/TNFRSF7、CXCL16、CD27リガンド/TNFSF7、CXCR3、CD28、CXCR4、CD30/TNFRSF8、CXCR5、CD30リガンド/TNFSF8、CXCR6、CD31/PECAM-1、シクロフィリンA、CD34、Cyr61/CCN1、CD36/SR-B3、シスタチンA、CD38、シスタチンB、CD40/TNFRSF5、シスタチンC、CD40リガンド/TNFSF5、シスタチンD、CD43、シスタチンE/M、CD44、シスタチンF、CD45、シスタチンH、CD46、シスタチンH2、CD47、シスタチンS、CD48/SLAMF2、シスタチンSA、CD55/DAF、シスタチンSN、CD58/LFA-3、シトクロムc、CD59、アポシトクロムc、CD68、ホロシトクロムc、CD72、サイトケラチン8、CD74、サイトケラチン14、CD83、サイトケラチン19、CD84/SLAMF5、サイトニン、D6、DISP1、DAN、Dkk-1、DANCE、Dkk-2、DARPP-32、Dkk-3、DAX1/NR0B1、Dkk-4、DCC、DLEC、DCIR/CLEC4A、DLL1、DCAR、DLL4、DcR3/TNFRSF6B、d-ルシフェリン、DC-SIGN、DNAリガーゼIV、DC-SIGNR/CD299、DNAポリメラーゼβ、DcTRAIL R1/TNFRSF23、DNAM-I、DcTRAIL R2/TNFRSF22、DNA-PKcs、DDR1、DNER、DDR2、ドーパデカルボキシラーゼ/DDC、DEC-205、DPCR-I、デカペンタプレジック、DPP6、デコリン、DPP A4、デクチン-1/CLEC7A、DPPA5/ESG1、デクチン-2/CLEC6A、DPPII/QPP/DPP7、DEP-1/CD148、DPPIV/CD26、デザートヘッジホッグ、DR3/TNFRSF25、デスミン、DR6/TNFRSF21、デスモグレイン-1、DSCAM、デスモグレイン-2、DSCAM-L1、デスモグレイン-3、DSPG3、ディシェベルド-1、Dtk、ディシェベルド-3、ダイナミン、EAR2/NR2F6、EphA5、ECE-I、EphA6、ECE-2、EphA7、ECF-L/CHI3L3、EphA8、ECM-I、EphB1、エコチン、EphB2、EDA、EphB3、EDA-A2、EphB4、EDAR、EphB6、EDG-I、エフリン、EDG-5、エフリン-A1、EDG-8、エフリン-A2、eEF-2、エフリン-A3、EGF、エフリン-A4、EGF R、エフリン-A5、EGR1、エフリン-B、EG-VEGF/PK1、エフリン-B1、eIF2α、エフリン-B2、eIF4E、エフリン-B3、EIk-I、エピジェン（Epigen）、EMAP-II、エピモルフィン/シンタキシン2、EMMPRIN/CD147、エピレギュリン、CXCL5/ENA、EPR-1/Xa受容体、エンドカン（Endocan）、ErbB2、エンドグリン/CD105、ErbB3、エンドグリカン（Endoglycan）、ErbB4、エンドヌクレアーゼIII、ERCC1、エンドヌクレアーゼIV、ERCC3、エンドヌクレアーゼV、ERK1/ERK2、エンドヌクレアーゼVIII、ERK1、エンドレペリン（Endorepellin）/パーレカン、ERK2、エンドスタチン、ERK3、エンドセリン-1、ERK5/BMK1、エングレイルド（Engrailed）-2、ERRα/NR3B1、EN-RAGE、ERRβ/NR3B2、エンテロペプチダーゼ/エンテロキナーゼ、ERRγ/NR3B3、CCL11/エオタキシン、エリスロポエチン、CCL24/エオタキシン-2、エリスロポエチンR、CCL26/エオタキシン-3、ESAM、EpCAM/TROP-1、ERα/NR3A1、EPCR、ERβ/NR3A2、Eph、エキソヌクレアーゼIII、EphA1、エキソストシン（Exostosin）様2/EXTL2、EphA2、エキソストシン様3/EXTL3、EphA3、FABP1、FGF-BP、FABP2、FGF R1-4、FABP3、FGF R1、FABP4、FGF R2、FABP5、FGF R3、FABP7、FGF R4、FABP9、FGF R5、補体因子B、Fgr、FADD、FHR5、FAM3A、フィブロネクチン、FAM3B、フィコリン-2、FAM3C、フィコリン-3、FAM3D、FITC、線維芽細胞活性化タンパク質α/FAP、FKBP38、Fas/TNFRSF6、Flap、Fasリガンド/TNFSF6、FLIP、FATP1、FLRG、FATP4、FLRT1、FATP5、FLRT2、FcγRI/CD64、FLRT3、FcγRIIB/CD32b、Flt-3、FcγRIIC/CD32c、Flt-3リガンド、FcγRIIA/CD32a、フォリスタチン、FcγRIII/CD16、フォリスタチン様1、FcRH1/IRTA5、FosB/G0S3、FcRH2/IRTA4、FoxD3、FcRH4/IRTA1、FoxJ1、FcRH5/IRTA2、FoxP3、Fc受容体様3/CD16-2、Fpg、FEN-I、FPR1、フェチュインA、FPRL1、フェチュインB、FPRL2、酸性FGF、CX3CL1/フラクタルカイン、塩基性FGF、フリズルド（Frizzled）-1、FGF-3、フリズルド-2、FGF-4、フリズルド-3、FGF-5、フリズルド-4、FGF-6、フリズルド-5、FGF-8、フリズルド-6、FGF-9、フリズルド-7、FGF-10、フリズルド-8、FGF-11、フリズルド-9、FGF-12、Frk、FGF-13、sFRP-1、FGF-16、sFRP-2、FGF-17、sFRP-3、FGF-19、sFRP-4、FGF-20、フューリン、FGF-21、FXR/NR1H4、FGF-22、Fyn、FGF-23、G9a/EHMT2、GFRα-3/GDNF Rα-3、GABA-A-Rα1、GFRα-4/GDNF Rα-4、GABA-A-Rα2、GITR/TNFRSF18、GABA-A-Rα4、GITRリガンド/TNFSF18、GABA-A-Rα5、GLI-I、GABA-A-Rα6、GLI-2、GABA-A-Rβ1、GLP/EHMT1、GABA-A-Rβ2、GLP-I R、GABA-A-Rβ3、グルカゴン、GABA-A-Rγ2、グルコサミン（N-アセチル)-6-スルファターゼ/GNS、GABA-B-R2、GluR1、GAD1/GAD67、GluR2/3、GAD2/GAD65、GluR2、GADD45α、GluR3、GADD45β、Glut1、GADD45γ、Glut2、ガレクチン-1、Glut3、ガレクチン-2、Glut4、ガレクチン-3、Glut5、ガレクチン-3BP、グルタレドキシン1、ガレクチン-4、グリシンR、ガレクチン-7、グリコホリンA、ガレクチン-8、グリピカン2、ガレクチン-9、グリピカン3、GalNAc4S-6ST、グリピカン5、GAP-43、グリピカン6、GAPDH、GM-CSF、Gas1、GM-CSF Rα、Gas6、GMF-β、GASP-1/WFIKKNRP、gp130、GASP-2/WFIKKN、グリコーゲンホスホリラーゼBB/GPBB、GATA-I、GPR15、GATA-2、GPR39、GATA-3、GPVI、GATA-4、GR/NR3C1、GATA-5、Gr-1/Ly-6G、GATA-6、グラニュライシン、GBL、グランザイムA、GCNF/NR6A1、グランザイムB、CXCL6/GCP-2、グランザイムD、G-CSF、グランザイムG、G-CSF R、グランザイムH、GDF-I、GRASP、GDF-3 GRB2、GDF-5、グレムリン（Gremlin）、GDF-6、GRO、GDF-7、CXCL1/GROα、GDF-8、CXCL2/GROβ、GDF-9、CXCL3/GROγ、GDF-11、成長ホルモン、GDF-15、成長ホルモンR、GDNF、GRP75/HSPA9B、GFAP、GSK-3α
/β、GFI-I、GSK-3α、GFRα-1/GDNF Rα-1、GSK-3β、GFRα-2/GDNF Rα-2、EZFIT、H2AX、ヒスチジン、H60、HM74A、HAI-I、HMGA2、HAI-2、HMGB1、HAI-2A、TCF-2/HNF-1β、HAI-2B、HNF-3β/FoxA2、HAND1、HNF-4α/NR2 A1、HAPLN1、HNF-4γ/NR2A2、気道トリプシン様プロテアーゼ/HAT、HO-1/HMOX1/HSP32、HB-EGF、HO-2/HMOX2、CCL14a/HCC-1、HPRG、CCL14b/HCC-3、Hrk、CCL16/HCC-4、HRP-I、αHCG、HS6ST2、Hck、HSD-I、HCR/CRAM-A/B、HSD-2、HDGF、HSP10/EPF、ヘモグロビン、HSP27、ヘパソシン（Hepassocin）、HSP60、HES-1、HSP70、HES-4、HSP90、HGF、HTRA/プロテアーゼDo、HGF活性化因子、HTRA1/PRSS11、HGF R、HTRA2/Omi、HIF-Iα、HVEM/TNFRSF14、HIF-2α、ヒアルロナン、HIN-1/セクレトグロブリン（Secretoglobulin）3A1、4-ヒドロキシノネナール、Hip、CCL1/I-309/TCA-3、IL-10、cIAP（汎（pan））、IL-10 Rα、cIAP-1/HIAP-2、IL-10 Rβ、cIAP-2/HIAP-1、IL-11、IBSP/シアロタンパク質II、EL-11 Rα、ICAM-1/CD54、IL-12、ICAM-2/CD102、IL-12/IL-23 p40、ICAM-3/CD50、IL-12 Rβ1、ICAM-5、IL-12 Rβ2、ICAT、IL-13、ICOS、IL-13 Rα1、イズロン酸2-スルファターゼ/EOS、IL-13 Rα2、EFN、IL-15、IFN-α、IL-15 Rα、IFN-α1、IL-16、IFN-α2、IL-17、IFN-α4b、IL-17 R、IFN-αA、IL-17 RC、IFN-α B2、IL-17 RD、IFN-α C、IL-17B、IFN-α D、IL-17B R、IFN-α F、IL-17C、IFN-α G、IL-17D、IFN-α H2、IL-17E、IFN-α I、IL-17F、IFN-α J1、IL-18/IL-1F4、IFN-α K、IL-18 BPa、IFN-α WA、IL-18 BPc、IFN-α/β R1、IL-18 BPd、IFN-α/β R2、IL-18 R α/IL-1 R5、IFN-β、IL-18 R β/IL-1 R7、IFN-γ、IL-19、IFN-γ R1、IL-20、IFN-γ R2、IL-20 Rα、ＩＦＮ−ω、IL-20 Rβ、IgE、IL-21、IGFBP-I、IL-21 R、IGFBP-2、IL-22、IGFBP-3、IL-22 R、IGFBP-4、IL-22BP、IGFBP-5、IL-23、IGFBP-6、IL-23 R、IGFBP-L1、IL-24、IGFBP-rp1/IGFBP-7、IL-26/AK155、IGFBP-rP10、IL-27、IGF-I、EL-28A、IGF-I R、IL-28B、IGF-II、IL-29/EFN-λ1、IGF-II R、IL-31、IgG、EL-31 RA、IgM、IL-32α、IGSF2、IL-33、IGSF4A/SynCAM、ILT2/CD85J、IGSF4B、ILT3/CD85k、IGSF8、ILT4/CD85d、IgY、ILT5/CD85a、IkB-β、ILT6/CD85e、IKKα、インディアンヘッジホッグ、IKKε、INSRR、EKKγ、インスリン、IL-Iα/IL-1F1、インスリンR/CD220、IL-Iβ/IL-1F2、プロインスリン、IL-1ra/IL-1F3、インスリジン/EDE、IL-1F5/FIL1δ、インテグリンα2/CD49b、IL-1F6/FIL1ε、インテグリンα3/CD49c、IL-1F7/FIL1ζ、インテグリンα3β1/VLA-3、IL-1F8/FIL1η、インテグリンα4/CD49d、IL-1F9/IL-1 H1、インテグリンα5/CD49e、IL-1F10/IL-1HY2、インテグリンα5β1、IL-I RI、インテグリンα6/CD49f、IL-I RII、インテグリンα7、IL-I R3/IL-1 R AcP、インテグリンα9、IL-I R4/ST2、インテグリンαE/CD103、IL-I R6/IL-1 R rp2、インテグリンαL/CD11a、IL-I R8、インテグリンαLβ2、IL-I R9、インテグリンαM/CD11b、IL-2、インテグリンαMβ2、IL-2 Rα、インテグリンαV/CD51、IL-2 Rβ、インテグリンαVβ5、IL-3、インテグリンαVβ3、IL-3 Rα、インテグリンαVβ6、IL-3 Rβ、インテグリンαX/CD11c、IL-4、インテグリンβ1/CD29、IL-4 R、インテグリンβ2/CD18、IL-5、インテグリンβ3/CD61、IL-5 Rα、インテグリンβ5、IL-6、インテグリンβ6、IL-6 R、インテグリンβ7、IL-7、CXCL10/EP-10/CRG-2、IL-7 Rα/CD127、IRAKI、CXCR1/IL-8 RA、IRAK4、CXCR2/IL-8 RB、ERS-I、CXCL8/IL-8、Islet-1、IL-9、CXCL11/I-TAC、IL-9 R、ジャギド（Jagged）1、JAM-4/IGSF5、ジャギド2、JNK、JAM-A、JNK1/JNK2、JAM-B/VE-JAM、JNK1、JAM-C、JNK2、キニノーゲン、カリクレイン3/PSA、キニノスタチン（Kininostatin）、カリクレイン4、KER/CD158、カリクレイン5、KER2DL1、カリクレイン6/ニューロシン、KIR2DL3、カリクレイン7、KIR2DL4/CD158d、カリクレイン8/ニューロプシン、KIR2DS4、カリクレイン9、KIR3DL1、血漿カリクレイン/KLKB1、KER3DL2、カリクレイン10、Kirrel2、カリクレイン11、KLF4、カリクレイン12、KLF5、カリクレイン13、KLF6、カリクレイン14、クロトー（クロトー）、カリクレイン15、クロトーβ、KC、KＯＲ、Ｋｅａｐ１、クレメン（Ｋｒｅｍｅｎ）−１、ＫｅＩＩ、クレメン−２、ＫＧＦ／ＦＧＦ−７、ＬＡＧ−３、ＬＩＮＧＯ−2、LAIR1、リピン2、LAIR2、リポカリン-1、ラミニンα4、リポカリン-2/NGAL、ラミニンγ1、5-リポキシゲナーゼ、ラミニンI、LXRα/NR1H3、ラミニンS、LXRβ/NR1H2、ラミニン-1、リビン（Livin）、ラミニン-5、LEX、LAMP、LMIR1/CD300A、ランゲリン、LMIR2/CD300c、LAR、LMIR3/CD300LF、ラテキシン（Latexin）、LMIR5/CD300LB、レーイリン（Layilin）、LMIR6/CD300LE、LBP、LMO2、LDL R、LOX-1/SR-EI、LECT2、LRH-1/NR5A2、LEDGF、LRIG1、レフティー（Lefty）、LRIG3、レフティー-1、LRP-I、レフティー-A、LRP-6、レグマイン（Legumain）、LSECtin/CLEC4G、レプチン、ルミカン、レプチンR、CXCL15/ラングカイン（Lungkine）、ロイコトリエンB4、XCLl/リンフォタクチン、ロイコトリエンB4 R1、リンフォトキシン、LEF、リンフォトキシンβ/TNFSF3、LIF Rα、リンフォトキシンβR/TNFRSF3、LIGHT/TNFSF14、Lyn、リミチン（Limitin）、Lyp、LIMPII/SR-B2、リジルオキシダーゼホモログ2、LIN-28、LYVE-I、LINGO-I、α2-マクログロブリン、CXCL9/MIG、MAD2L1、ミメカン（Mimecan）、MAdCAM-1、ミンディン、MafB、鉱質コルチコイドR/NR3C2、MafF、CCL3L1/MIP-1αアイソフォームLD78β、MafG、CCL3/MIP-1α、MafK、CCL4L1/LAG-1、MAG/シグレック-4a、CCL4/MIP-1β、MANF、CCL15/MEP-1δ、MAP2、CCL9/10/MIP-1γ、MAPK、MIP-2、マラプシン（Marapsin）/パンクレアシン（Pancreasin）、CCL19/MIP-3β、MARCKS、CCL20/MIP-3α、MARCO、MIP-I、Mash1、MIP-II、マトリリン-2、MIP-III、マトリリン-3、MIS/AMH、マトリリン-4、MIS RII、マトリプターゼ/ST14、MIXL1、MBL、MKK3/MKK6、MBL-2、MKK3、メラノコルチン3R/MC3R、MKK4、MCAM/CD146、MKK6、MCK-2、MKK7、Mcl-1、MKP-3、MCP-6、MLH-I、CCL2/MCP-1、MLK4α、MCP-11、MMP、CCL8/MCP-2、MMP-1、CCL7/MCP-3/MARC、MMP-2、CCL13/MCP-4、MMP-3、CCL12/MCP-5、MMP-7、M-CSF、MMP-8、M-CSF R、MMP-9、MCV-II型、MMP-10、MD-I、MMP-11、MD-2、MMP-12、CCL22/MDC、MMP-13、MDL-1/CLEC5A、MMP-14、MDM2、MMP-15、MEA-I、MMP-16/MT3-MMP、MEK1/MEK2、MMP-24/MT5-MMP、MEK1、MMP-25/MT6-MMP、MEK2、MMP-26、メルシン（Melusin）、MMR、MEPE、MOG、メプリンα、CCL23/MPIF-1、メプリンβ、M-Ras/R-Ras3、Mer、Mre11、メソテリン、MRP1 メテオリン（Meteorin）、MSK1/MSK2、メチオニンアミノペプチダーゼ1、MSK1、メチオニンアミノペプチダーゼ、MSK2、メチオニンアミノペプチダーゼ2、MSP、MFG-E8、MSP R/Ron、MFRP、Mug、MgcRacGAP、MULT-I、MGL2、ムサシ（Musashi）-1、MGMT、ムサシ-2、MIA、MuSK、MICA、MutY DNAグリコシラーゼ、MICB、MyD88、MICL/CLEC12A、ミエロペルオキシダーゼ、β2ミクログロブリン、ミオカルディン、ミッドカイン、ミオシリン、MIF、ミオグロビン、NAIP NGFI-Bγ/NR4A3、ナノグ（Nanog）、NgR2/NgRH1、CXCL7/NAP-2、NgR3/NgRH2、Nbs1、ナイドジェン-1/エンタクチン、NCAM-1/CD56、ナイドジェン-2、NCAM-L1、一酸化窒素、ネクチン-1、ニトロチロシン、ネクチン-2/CD112、NKG2A、ネクチン-3、NKG2C、ネクチン-4、NKG2D、ネオゲニン、NKp30、ネプリライシン/CD10、NKp44、ネプリライシン-2/MMEL1/MMEL2、NKp46/NCR1、ネスチン、NKp80/KLRF1、NETO2、NKX2.5、ネトリン-1、NMDA R、NR1サブユニット、ネトリン-2、NMDA R、NR2Aサブユニット、ネトリン-4、NMDA R、NR2Bサブユニット、ネトリン-G1a、NMDA R、NR2Cサブユニット、ネトリン-G2a、N-Me-6,7-diOH-TIQ、ニューレグリン-1/NRG1、ノーダル（Nodal）、ニューレグリン-3/NRG3、ノギン、ニューリチン（Neuritin）、Nogo受容体、NeuroD1、Nogo-A、ニューロファシン、NOMO、ニューロゲニン-1、ノープ（Nope）、ニューロゲニン-2、ノリン（Norrin）、ニューロゲニン-3、eNOS、ニューロリシン、iNOS、ニューロフィジンII、nNOS、ニューロピリン-1、ノッチ-1、ニューロピリン-2、ノッチ-2、ニューロポエチン（Neuropoietin）、ノッチ-3、ニューロトリミン（Neurotrimin）、ノッチ-4、ニュールツリン、NOV/CCN3、NFAM1、NRAGE、NF-H、NrCAM、NFkB1、NRL、NFkB2、NT-3、NF-L、NT-4、NF-M、NTB-A/SLAMF6、NG2/MCSP、NTH1、NGF R/TNFRSF16、ヌクレオステミン（Nucleostemin）、β-NGF、Nurr-1/NR4A2、NGFI-Bα/NR4A1、OAS2、オレキシンB、OBCAM、OSCAR、OCAM、OSF-2/ペリオスチン、OCIL/CLEC2d、オンコスタチンM/OSM、OCILRP2/CLEC2i、OSM Rβ、Oct-3/4、オステオアクチビン/GPNMB、OGG1、オステオアドヘリン（Osteoadherin）、Olig1，2，3、オステオカルシン、Olig1、オステオクリン（Osteocrin）、Olig2、オステオポンチン、Olig3、オステオプロテゲリン/TNFRSF11B、乏突起膠細胞マーカーO1、Otx2、乏突起膠細胞マーカーO4、OV-6、OMgp、OX40/TNFRSF4、オプチシン（Opticin）、OX40リガンド/TNFSF4、オレキシンA、OAS2、オレキシンB、OBCAM、OSCAR、OCAM、OSF-2/ペリオスチン、OCIL/CLEC2d、オンコスタチンM/OSM、OCILRP2/CLEC2i、OSM Rβ、Oct-3/4、オステオアクチビン/GPNMB、OGG1、オステオアドヘリン、Olig1，2，3、オステオカルシン、Olig1、オステオクリン、Olig2、オステオポンチン、Olig3、オステオプロテゲリン/TNFRSF11B、乏突起膠細胞マーカーO1、Otx2、乏突起膠細胞マーカーO4、OV-6、OMgp、OX40/TNFRSF4、オプチシン、OX40リガンド/TNFSF4、オレキシンA、RACK1、Ret、Rad1、REV-ERBα/NR1D1、Rad17、REV-ERBβ/NR1D2、Rad51、Rex-1、Rae-1、RGM-A、Rae-1α、RGM-B、Rae-1β、RGM-C、Rae-1δ、Rheb、Rae-1ε、リボソームタンパク質S6、Rae-1γ、RIP1、Raf-1、ROBO1、RAGE、ROBO2、RalA/RalB、ROBO3、RalA、ROBO4、RalB、ROR/NR1F1-3（汎）、RANK/TNFRSF11A、RORα/NR1F1、CCL5/RANTES、RORγ/NR1F3、Rap1A/B、RTK様オーファン受容体1/ROR1、RARα/NR1B1、RTK様オーファン受容体2/ROR2、RARβ/NR1B2、RP105、RARγ/NR1B3、RP A2、Ras、RSK（汎）、RBP4、RSK1/RSK2、RECK、RSK1、Reg2/PAP、RSK2、Reg I、RSK3、Reg II、RSK4、Reg III、R-スポンジン1、Reg IIIa、R-スポンジン2、Reg IV、R-スポンジン3、リラキシン-1、RUNX1/CBFA2、リラキシン-2、RUNX2/CBFA1、リラキシン-3、RUNX3/CBFA3、RELMα、RXRα/NR2B1、RELMβ、RXRβ/NR2B2、RELT/TNFRSF19L、RXRγ/NR2B3、レジスチン、S100A10、SLITRK5、S100A8、SLPI、S100A9、SMAC/ディアブロ（Diablo）、S100B、Smad1、S100P、Smad2、SALL1、Smad3、δ-サルコグリカン、Smad4、Sca-1/Ly6、Smad5、SCD-I、Smad7、SCF、Smad8、SCF R/c-kit、SMC1、SCGF、α-平滑筋アクチン、SCL/Tall、SMUG1、SCP3/SYCP3、Snail、CXCL12/SDF-1、ナトリウム・カルシウム交換輸送体1、SDNSF/MCFD2、Soggy-1、α-セクレターゼ、ソニックヘッジホッグ、γ-セクレターゼ、SorCS1、β-セクレターゼ、SorCS3、E-セレクチン、ソルチリン、L-セレクチン、SOST、P-セレクチン、SOX1、セマフォリン3A、SOX2、セマフォリン3C、SOX3、セマフォリン3E、SOX7、セマフォリン3F、SOX9、セマフォリン6A、SOX10、セマフォリン6B、SOX17、セマフォリン6C、SOX21 セマフォリン6D、SPARC、セマフォリン7A、SPARC様1、セパラーゼ、SP-D、セリン/スレオニンホスファターゼ基質I、スピネシン（Spinesin）、セルピンA1、F-スポンジン、セルピンA3、SR-AI/MSR、セルピンA4/カリスタチン、Src、セルピンA5/プロテインCインヒビター、SREC-I/SR-F1、セルピンA8/アンジオテンシノゲン、SREC-II、セルピンB5、SSEA-I、セルピンC1/アンチトロンビン-III、SSEA-3、セルピンD1/ヘパリン補因子II、SSEA-4、セルピンE1/PAI-1、ST7/LRP12、セルピンE2、スタビリン（Stabilin）-1、セルピンF1、スタビリン-2、セルピンF2、スタニオカルシン1、セルピンG1/C1インヒビター、スタニオカルシン2、セルピン12、STAT1、血清アミロイドA1、STAT2、SF-1/NR5A1、STAT3、SGK、STAT4、SHBG、STAT5a/b、SHIP、STAT5a、SHP/NR0B2、STAT5b、SHP-I、STAT6、SHP-2、VE-スタチン、SIGIRR、ステラ（Stella）/Dppa3、シ
グレック（Siglec）-2/CD22、STRO-I、シグレック-3/CD33、サブスタンスP、シグレック-5、スルファミダーゼ/SGSH、シグレック-6、スルファターゼ修飾因子1/SUMF1、シグレック-7、スルファターゼ修飾因子2/SUMF2、シグレック-9、SUMO1、シグレック-10、SUMO2/3/4、シグレック-11、SUMO3、シグレック-F、スーパーオキシドジスムターゼ、SIGNR1/CD209、スーパーオキシドジスムターゼ-1/Cu-Zn SOD、SIGNR4、スーパーオキシドジスムターゼ-2/Mn-SOD、SIRPβ1、スーパーオキシドジスムターゼ-3/EC-SOD、SKI、サバイビン、SLAM/CD150、シナプシンI、スリーピング・ビューティ（Sleeping Beauty）トランスポザーゼ、シンデカン-I/CD138、Slit3、シンデカン-2、SLITRK1、シンデカン-3、SLITRK2、シンデカン-4、SLITRK4、TACI/TNFRSF13B、TMEFF1/トモレギュリン（Tomoregulin）-1、TAO2、TMEFF2、TAPP1、TNF-α/TNFSF IA、CCL17/TARC、TNF-β/TNFSF1B、タウ、TNF RI/TNFRSFIA、TC21/R-Ras2、TNF RII/TNFRSF1B、TCAM-I、TOR、TCCR/WSX-1、TP-I、TC-PTP、TP63/TP73L、TDG、TR、CCL25/TECK、TRα/NR1A1、テネイシンC、TRβ1/NR1A2、テネイシンR、TR2/NR2C1、TER-119、TR4/NR2C2、TERT、TRA-1-85、テスティカン（Testican）1/SPOCK1、TRADD、テスティカン2/SPOCK2、TRAF-1、テスティカン3/SPOCK3、TRAF-2、TFPI、TRAF-3、TFPI-2、TRAF-4、TGF-α、TRAF-6、TGF-β、TRAIL/TNFSF10、TGF-β1、TRAIL R1/TNFRSF10A、LAP（TGF-β1）、TRAIL R2/TNFRSF10B、潜在型TGF-β1、TRAIL R3/TNFRSF10C、TGF-β1.2、TRAIL R4/TNFRSF10D、TGF-β2、TRANCE/TNFSF11、TGF-β3、TfR（トランスフェリンR）、TGF-β5、アポ-トランスフェリン、潜在型TGF-β bp1、ホロ-トランスフェリン、潜在型TGF-β bp2、トラッピン（Trappin）-2/エラフィン、潜在型TGF-β bp4、TREM-1、TGF-βRI/ALK-5、TREM-2、TGF-βRII、TREM-3、TGF-βRIIb、TREML1/TLT-1、TGF-βRIII、TRF-I、サーモライシン、TRF-2、チオレドキシン-1、TRH分解エクトエンザイム/TRHDE、チオレドキシン-2、TRIM5、チオレドキシン-80、トリペプチジル-ペプチダーゼI、チオレドキシン様5/TRP14、TrkA、THOP1、TrkB、トロンボモジュリン/CD141、TrkC、トロンボポエチン、TROP-2、トロンボポエチンR、トロポニンIペプチド3、トロンボスポンジン-1、トロポニンT、トロンボスポンジン-2、TROY/TNFRSF19、トロンボスポンジン-4、トリプシン1、サイモポエチン、トリプシン2/PRSS2、胸腺ケモカイン-1、トリプシン3/PRSS3、Tie-1、トリプターゼ-5/Prss32、Tie-2、トリプターゼα/TPS1、TIM-I/KIM-I/HAVCR、トリプターゼβ-1/MCPT-7、TIM-2、トリプターゼβ-2/TPSB2、TIM-3、トリプターゼε/BSSP-4、TIM-4、トリプターゼγ-1/TPSG1、TIM-5、トリプトファンヒドロキシラーゼ、TIM-6、TSC22、TIMP-I、TSG、TIMP-2、TSG-6、TIMP-3、TSK、TIMP-4、TSLP、TL1A/TNFSF15、TSLP R、TLR1、TSP50、TLR2、β-IIIチューブリン、TLR3、TWEAK/TNFSF12、TLR4、TWEAK R/TNFRSF12、TLR5、Tyk2、TLR6、ホスホ-チロシン、TLR9、チロシンヒドロキシラーゼ、TLX/NR2E1、チロシンホスファターゼ基質I、ユビキチン、UNC5H3、Ugi、UNC5H4、UGRP1、UNG、ULBP-I、uPA、ULBP-2、uPAR、ULBP-3、URB、UNC5H1、UVDE、UNC5H2、バニロイドR1、VEGF R、VASA、VEGF R1/Flt-1、バソヒビン、VEGF R2/KDR/Flk-1、バソリン（Vasorin）、VEGF R3/FU-4、バソスタチン、バーシカン、Vav-1、VG5Q、VCAM-I、VHR、VDR/NR1I1、ビメンチン、VEGF、ビトロネクチン、VEGF-B、VLDLR、VEGF-C、vWF-A2、VEGF-D、シヌクレイン-α、Ku70、WASP、Wnt-7b、WIF-I、Wnt-8a WISP-1/CCN4、Wnt-8b、WNK1、Wnt-9a、Wnt-1、Wnt-9b、Wnt-3a、Wnt-10a、Wnt-4、Wnt-10b、Wnt-5a、Wnt-11、Wnt-5b、wnvNS3、Wnt7a、XCR1、XPE/DDB1、XEDAR、XPE/DDB2、Xg、XPF、XIAP、XPG、XPA、XPV、XPD、XRCC1、Yes、YY1、EphA4。
数多くのヒトイオンチャネルはとりわけ興味深いターゲットである。非限定的な例には、次に挙げるものが包含される：5-ヒドロキシトリプタミン3受容体Bサブユニット、5-ヒドロキシトリプタミン3受容体前駆体、5-ヒドロキシトリプタミン受容体3サブユニットC、AAD14タンパク質、アセチルコリン受容体タンパク質、αサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、βサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、δサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、εサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、γサブユニット前駆体、酸感受性イオンチャネル3スプライス変異体b、酸感受性イオンチャネル3スプライス変異体c、酸感受性イオンチャネル4、ADP-リボースピロホスファターゼ，ミトコンドリア前駆体、α1A電位依存性カルシウムチャネル、アミロライド感受性カチオンチャネル1，神経性、アミロライド感受性カチオンチャネル2、神経性アミロライド感受性カチオンチャネル4アイソフォーム2、アミロライド感受性ナトリウムチャネル、アミロライド感受性ナトリウムチャネルαサブユニット、アミロライド感受性ナトリウムチャネルβサブユニット、アミロライド感受性ナトリウムチャネルδサブユニット、アミロライド感受性ナトリウムチャネルγ-サブユニット、アネキシンA7、アピカル（Apical）様タンパク質、ATP感受性内向き整流カリウムチャネル1、ATP感受性内向き整流カリウムチャネル10、ATP感受性内向き整流カリウムチャネル11、ATP感受性内向き整流カリウムチャネル14、ATP感受性内向き整流カリウムチャネル15、ATP感受性内向き整流カリウムチャネル8、カルシウムチャネルα12.2サブユニット、カルシウムチャネルα12.2サブユニット、カルシウムチャネルα1Eサブユニット・デルタ19デルタ40デルタ46スプライス変異体、カルシウム活性化カリウムチャネルαサブユニット1、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット1、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット2、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット3、カルシウム依存性クロライドチャネル-1、カチオンチャネルTRPM4B、CDNA FLJ90453 fis，クローンNT2RP3001542，カリウムチャネル四量体化ドメイン含有6に高度に類似、CDNA FLJ90663 fis，クローンPLACE1005031，細胞内クロライドチャネルタンパク質5に高度に類似、CGMP作動性カチオンチャネルβサブユニット、クロライドチャネルタンパク質、クロライドチャネルタンパク質2、クロライドチャネルタンパク質3、クロライドチャネルタンパク質4、クロライドチャネルタンパク質5、クロライドチャネルタンパク質6、クロライドチャネルタンパク質ClC-Ka、クロライドチャネルタンパク質ClC-Kb、クロライドチャネルタンパク質、骨格筋、細胞内クロライドチャネル6、細胞内クロライドチャネルタンパク質3、細胞内クロライドチャネルタンパク質4、細胞内クロライドチャネルタンパク質5、CHRNA3タンパク質、Clcn3eタンパク質、CLCNKBタンパク質、CNGA4タンパク質、カリン-5、サイクリックGMP作動性カリウムチャネル、環状ヌクレオチド作動性カチオンチャネル4、環状ヌクレオチド作動性カチオンチャネルα3、環状ヌクレオチド作動性カチオンチャネルβ3、環状ヌクレオチド作動性嗅覚チャネル、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子、シトクロムB-245重鎖、ジヒドロピリジン感受性L型、カルシウムチャネルα-2/δサブユニット前駆体、FXYDドメイン含有イオン輸送調節因子3前駆体、FXYDドメイン含有イオン輸送調節因子5前駆体、FXYDドメイン含有イオン輸送調節因子6前駆体、FXYDドメイン含有イオン輸送調節因子7、FXYDドメイン含有イオン輸送調節因子8前駆体、Gタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル1、Gタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル2、Gタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル3、Gタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル4、γ-アミノ酪酸受容体α-1サブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体α2サブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体α3サブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体α4サブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体α5サブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体α6サブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体β1サブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体β2サブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体β3サブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体δサブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体εサブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体γ-1サブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体γ-3サブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体πサブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体ρ1サブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体ρ2サブユニット前駆体、γ-アミノ酪酸受容体θサブユニット前駆体、GluR6カイニン酸受容体、グルタミン酸受容体1前駆体、グルタミン酸受容体2前駆体、グルタミン酸受容体3前駆体、グルタミン酸受容体4前駆体、グルタミン酸受容体7、グルタミン酸受容体B、グルタミン酸受容体δ1サブユニット前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型1前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型2前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型3前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型4前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型5前駆体、グルタミン酸［NMDA］受容体サブユニット3A前駆体、グルタミン酸［NMDA］受容体サブユニット3B前駆体、グルタミン酸［NMDA］受容体サブユニットε1前駆体、グルタミン酸［NMDA］受容体サブユニットε2前駆体、グルタミン酸［NMDA］受容体サブユニットε4前駆体、グルタミン酸［NMDA］受容体サブユニットζ1前駆体、グリシン受容体α1鎖前駆体、グリシン受容体α2鎖前駆体、グリシン受容体α3鎖前駆体、グリシン受容体β鎖前駆体、H/ACAリボ核タンパク質複合体サブユニット1、高親和性免疫グロブリンε受容体βサブユニット、仮想（Hypothetical）タンパク質DKFZp31310334、仮想タンパク質DKFZp761M1724、仮想タンパク質FLJ12242、仮想タンパク質FLJ14389、仮想タンパク質FLJ14798、仮想タンパク質FLJ14995、仮想タンパク質FLJ16180、仮想タンパク質FLJ16802、仮想タンパク質FLJ32069、仮想タンパク質FLJ37401、仮想タンパク質FLJ38750、仮想タンパク質FLJ40162、仮想タンパク質FLJ41415、仮想タンパク質FLJ90576、仮想タンパク質FLJ90590、仮想タンパク質FLJ90622、仮想タンパク質KCTD15、仮想タンパク質MGC15619、イノシトール1,4,5-三リン酸受容体1型、イノシトール1,4,5-三リン酸受容体2型、イノシトール1,4,5-三リン酸受容体3型、中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質4、内向き整流カリウムチャネル13、内向き整流カリウムチャネル16、内向き整流カリウムチャネル4、内向き整流K(＋)チャネル負調節因子Kir2.2v、カイニン酸受容体サブユニットKA2a、KCNH5タンパク質、KCTD17タンパク質、KCTD2タンパク質、ケラチノサイト関連膜貫通タンパク質1、Kvチャネル相互作用タンパク質4、メラスタチン1、膜タンパク質MLC1、MGC15619タンパク質、ムコリピン（Mucolipin）-1、ムコリピン-2、ムコリピン-3、多剤耐性関連タンパク質4、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体2Cサブユニット前駆体、NADPHオキシダーゼホモログ1、Nav1.5、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α10サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α2サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α3サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α4サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α5サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α6サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α7サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α9サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質β2サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質β3サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質β4サブユニット前駆体、神経性電位依存性カルシウムチャネルα2Dサブユニット、P2Xプリン受容体1、P2Xプリン受容体2、P2Xプリン受容体3、P2Xプリン受容体4、P2Xプリン受容体5、P2Xプリン受容体6、P2Xプリン受容体7、膵カリウムチャネルTALK-Ib、膵カリウムチャネルTALK-Ic、膵カリウムチャネルTALK-Id、ホスホレマン前駆体、プラスモリピン（Plasmolipin）、多発性嚢胞腎2関連タンパク質、多発性嚢胞腎2様1タンパク質、多発性嚢胞腎2様2タンパク質、PKDREJ（Polycystic kidney and receptor for egg jelly related protein）前駆体、ポリシスチン-2、カリウムチャネル調節因子、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー1、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー10、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー12、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー13、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー15、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー16、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー17、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー2、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー3、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー4、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー5、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー6、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー7、カリウムチャネルサブファミリーKメンバー9、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有3、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質12、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質14、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質2、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質4、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質5、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有10、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質13、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有1、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーAメンバー1、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーAメンバー2、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーAメンバー4、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーAメンバー5、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーAメンバー6、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーBメンバー1、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーBメンバー2、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーCメンバー1、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーCメンバー3、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーCメンバー4、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーDメンバー1、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーDメンバー2、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーDメンバー3、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーEメンバー1、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーEメンバー2、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーEメンバー3、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーEメンバー4、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーFメンバー1、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーGメンバー1、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーGメンバー2、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーGメンバー3、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーGメンバー4、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーHメンバー1、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーHメンバー2、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーHメンバー3、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーHメンバー4、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーHメンバー5、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーHメンバー6、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーHメンバー7、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーHメンバー8、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーKQTメンバー1、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーKQTメンバー2、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーKQTメンバー3、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーKQTメンバー4、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーKQTメンバー5、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーSメンバー1、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーSメンバー2、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーS
メンバー3、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーVメンバー2、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーHメンバー7アイソフォーム2、カリウム/ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル1、カリウム/ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル2、カリウム/ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル3、カリウム/ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル4、予想（Probable）ミトコンドリア搬入受容体サブユニットTOM40ホモログ、プリン作動性受容体P2X5アイソフォームA、推定（Putative）4リピート電位作動性イオンチャネル、推定クロライドチャネルタンパク質7、推定GluR6カイニン酸受容体、推定イオンチャネルタンパク質CATSPER2変異体1、推定イオンチャネルタンパク質CATSPER2変異体2、推定イオンチャネルタンパク質CATSPER2変異体3、推定カリウムチャネル調節因子タンパク質変異体1、推定チロシン-プロテインホスファターゼTPTE、リアノジン受容体1、リアノジン受容体2、リアノジン受容体3、SH3KBP1結合タンパク質1、短型（Short）一過性受容体電位チャネル1、短型一過性受容体電位チャネル4、短型一過性受容体電位チャネル5、短型一過性受容体電位チャネル6、短型一過性受容体電位チャネル7、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質1、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質2アイソフォームb、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質3アイソフォームb、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルSK2、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルSK3、ナトリウムチャネル、ナトリウムチャネルβ-1サブユニット前駆体、ナトリウムチャネルタンパク質II型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質III型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質IV型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質IX型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質V型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質VII型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質VIII型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質X型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質XI型αサブユニット、ナトリウム・クロライド活性化ATP感受性カリウムチャネル、ナトリウム/カリウム輸送ATPアーゼγ鎖、精子関連カチオンチャネル1、精子関連カチオンチャネル2アイソフォーム4、シンタキシン-1B1、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーAメンバー1、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーMメンバー2、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーMメンバー3、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーMメンバー6、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーMメンバー7、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーVメンバー1、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーVメンバー2、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーVメンバー3、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーVメンバー4、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーVメンバー5、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーVメンバー6、一過性受容体電位チャネル4εスプライス変異体、一過性受容体電位チャネル4ζスプライス変異体、一過性受容体電位チャネル7γスプライス変異体、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質1内皮性、2ポアカルシウムチャネルタンパク質2、VDAC4タンパク質、電位作動性カリウムチャネルKv3.2b、電位作動性ナトリウムチャネルβ1Bサブユニット、電位依存性アニオンチャネル、電位依存性アニオンチャネル2、電位依存性アニオン選択的チャネルタンパク質1、電位依存性アニオン選択的チャネルタンパク質2、電位依存性アニオン選択的チャネルタンパク質3、電位依存性カルシウムチャネルγ1サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ2サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ3サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ4サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ5サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ6サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ7サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ8サブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルα1Cサブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルα1Dサブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルαISサブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルβ1サブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルβ2サブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルβ3サブユニット、電位依存性L型カルシウムチャネルβ4サブユニット、電位依存性N型カルシウムチャネルα1Bサブユニット、電位依存性P/Q型カルシウムチャネルα1Aサブユニット、電位依存性R型カルシウムチャネルα1Eサブユニット、電位依存性T型カルシウムチャネルα1Gサブユニット、電位依存性T型カルシウムチャネルα1Hサブユニット、電位依存性T型カルシウムチャネルα1Iサブユニット、電位作動性L型カルシウムチャネルα1サブユニット、電位作動性カリウムチャネルβ1サブユニット、電位作動性カリウムチャネルβ2サブユニット、電位作動性カリウムチャネルβ3サブユニット、電位作動性カリウムチャネルKCNA7。ヒト電位作動性ナトリウムチャネルのNavl.xファミリーも特に有望なターゲットである。このファミリーには、例えばチャネルNavl.6およびNavl.8が包含される。
別の実施形態では、治療タンパク質がGタンパク質共役受容体（GPCR）であってもよい。例示的GPCRには、次に挙げるものが包含されるが、これらに限定されるわけではない：クラスAロドプシン様受容体、例えばムスカリン性（Muse.）アセチルコリン脊椎動物1型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物2型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物3型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物4型；アドレノセプター（αアドレノセプター1型、αアドレノセプター2型、βアドレノセプター1型、βアドレノセプター2型、βアドレノセプター3型、ドーパミン脊椎動物1型、ドーパミン脊椎動物2型、ドーパミン脊椎動物3型、ドーパミン脊椎動物4型、ヒスタミン1型、ヒスタミン2型、ヒスタミン3型、ヒスタミン4型、セロトニン1型、セロトニン2型、セロトニン3型、セロトニン4型、セロトニン5型、セロトニン6型、セロトニン7型、セロトニン8型、セロトニンの他のタイプ、微量アミン、アンジオテンシン1型、アンジオテンシン2型、ボンベシン、ブラジキニン、C5aアナフィラトキシン、Fmet-leu-phe、APJ様、インターロイキン8タイプA、インターロイキン8タイプB、インターロイキン8の他のタイプ、C-Cケモカイン1型〜11型および他のタイプ、C-X-Cケモカイン（2型〜6型および他のタイプ）、C-X3-Cケモカイン、コレシストキニンCCK、CCKタイプA、CCKタイプB、他のCCK、エンドセリン、メラノコルチン（メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラノコルチンホルモン）、ダッフィ抗原、プロラクチン放出ペプチド（GPR10）、神経ペプチドY（1型〜7型）、神経ペプチドY、他の神経ペプチドY、ニューロテンシン、オピオイド（D、K、M、X型）、ソマトスタチン（1型〜5型）、タキキニン（サブスタンスP（NK1）、サブスタンスK（NK2）、ニューロメジンK（NK3）、タキキニン様1、タキキニン様2、バソプレシン/バソトシン（1型〜2型）、バソトシン、オキシトシン／メソトシン、コノプレッシン、ガラニン様、プロテイナーゼ活性化様、オレキシンおよび神経ペプチドFF、QRFP、ケモカイン受容体様、ニューロメジンU様（ニューロメジンU、PRXアミド）、ホルモンタンパク質（卵胞刺激ホルモン、ルトロピン-絨毛性性腺刺激ホルモン、サイロトロピン、ゴナドトロピンI型、ゴナドトロピンII型）、オプシン（ロドプシン）、ロドプシン脊椎動物（1〜5型）、ロドプシン脊椎動物5型、ロドプシン節足動物、ロドプシン節足動物1型、ロドプシン節足動物2型、ロドプシン節足動物3型、ロドプシン軟体動物、ロドプシン，嗅覚（嗅覚IIファミリー1〜13）、プロスタグランジン（プロスタグランジンE2サブタイプEP1、プロスタグランジンE2/D2サブタイプEP2、プロスタグランジンE2サブタイプEP3、プロスタグランジンE2サブタイプEP4、プロスタグランジンF2-α、プロスタサイクリン、トロンボキサン、アデノシン1型〜3型、プリン受容体、プリン受容体P2RY1-4，6，11 GPR91、プリン受容体P2RY5，8，9，10 GPR35，92，174、プリン受容体P2RY12-14 GPR87（UDP-グルコース）、カンナビノイド、血小板活性化因子、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモンI型、性腺刺激ホルモン放出ホルモンII型、脂質動員ホルモン様、コラゾニン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンおよび分泌促進物質、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質、成長ホルモン分泌促進物質様、脱皮トリガリングホルモン（ETHR）、メラトニン、リゾスフィンゴリピドおよびLPA（EDG）、スフィンゴシン1-リン酸Edg-1、リゾホスファチジン酸Edg-2、スフィンゴシン1-リン酸Edg-3、リゾホスファチジン酸Edg-4、スフィンゴシン1-リン酸Edg-5、スフィンゴシン1-リン酸Edg-6、リゾホスファチジン酸Edg-7、スフィンゴシン1-リン酸Edg-8、他のEdg、ロイコトリエンB4受容体、ロイコトリエンB4受容体BLT1、ロイコトリエンB4受容体BLT2、クラスAオーファン/その他、推定神経伝達物質、SREB、Masがん原遺伝子およびMas関連（MRG）、GPR45様、システイニルロイコトリエン、Gタンパク質共役胆汁酸受容体、遊離脂肪酸受容体（GP40、GP41、GP43）、クラスBセクレチン様、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、胃抑制ペプチド、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、PACAP、セクレチン、血管作用性腸管ポリペプチド、ラトロフィリン、ラトロフィリン1型、ラトロフィリン2型、ラトロフィリン3型、ETL受容体、脳特異的血管新生インヒビター（BAI）、メトセラ（Methuselah）様タンパク質（MTH）、カドヘリンEGF LAG（CELSR）、超高分子（Very large）Gタンパク質共役受容体、クラスC代謝型グルタミン酸/フェロモン、代謝型グルタミン酸グループI〜III、カルシウム感知様、細胞外カルシウム感知、フェロモン、他のカルシウム感知様、推定フェロモン受容体、GABA-B、GABA-Bサブタイプ1、GABA-Bサブタイプ2、GABA-B様、オーファンGPRC5、オーファンGPCR6、ブライド・オブ・セブンレス（Bride of sevenless）タンパク質（BOSS）、味覚受容体（TlR）、クラスD真菌フェロモン、真菌フェロモンA因子様（STE2、STE3）、真菌フェロモンB様（BAR、BBR、RCB、PRA）、クラスE cAMP受容体、眼白子症タンパク質、フリズルド/スムースンド（Smoothened）ファミリー、フリズルドグループA（Fz1および2および4および5および7〜9）、フリズルドグループB（Fz3および6）、フリズルドグループC（その他）、鋤鼻受容体、線虫化学受容体、昆虫匂い受容体、およびクラスZ古細菌/細菌/真菌オプシン。
別の実施形態において、本明細書に記載するSABA融合物は、次に挙げる活性ポリペプチドをどれでも含むことができる：ボトックス（BOTOX）、マイオブロック（Myobloc）、ニューロブロック（Neurobloc）、ディスポート（Dysport）（または他の血清型のボツリヌス神経毒）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、YH-16、絨毛性ゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン-2、アルデスロイキン、テセロイキン、デニロイキンジフチトクス、インターフェロンアルファ-n3（注射剤）、インターフェロンアルファ-n1、DL-8234、インターフェロン、サントリー（Suntory）（ガンマ-Ia）、インターフェロンガンマ、チモシンアルファ1、タソネルミン、DigiFab、ViperaTAb、EchiTAb、CroFab、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、レビフ（Rebif）、エプトテルミンアルファ、テリパラチド（骨粗鬆症）、カルシトニン注射用（骨疾患）、カルシトニン（点鼻用、骨粗鬆症）、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー（hemoglobin glutamer）250（ウシ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト上皮成長因子（局所外用ゲル、創傷治癒）、DWP-401、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、モノニン（Mononine）、エプタコグアルファ（活性型）、組換え第VIII因子＋VWF、リコネイト（Recombinate）、組換え第VIII因子、第VIII因子（組換え）、アルファネート（Alphanate）、オクトコグアルファ、第VIII因子、パリフェルミン、インディキナーゼ（Indikinase）、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ（nateplase）、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、rFSH、hpFSH、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エクセナチド、プラムリンチド、イミグルセラーゼ、ガルスルファーゼ、ロイコトロピン（Leucotropin）、モルグラモスチム、酢酸トリプトレリン、ヒストレリン（皮下インプラント、ハイドロン（Hydron））、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド徐放性デポー（アトリゲル（ATRIGEL））、ロイプロリドインプラント（デュロス（DUROS））、ゴセレリン、ソマトロピン、ユートロピン（Eutropin）、KP-102プログラム（program）、ソマトロピン、ソマトロピン、メカセルミン（成長不全）、エンフビルチド、Org-33408、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入薬）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル、インスリン（バッカル剤、RapidMist）、メカセルミンリンファベート（mecasermin rinfabate）、アナキンラ、セルモロイキン、99mTc-アプシタイド（apcitide）注射剤、ミエロピド（myelopid）、ベータセロン（Betaseron）、酢酸グラチラマー、ゲポン（Gepon）、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、ビリブ（Bilive）、インスリン（組換え）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン、ロフェロン（Roferon）-A、インターフェロン-アルファ2、アルファフェロン（Alfaferone）、インターフェロンアルファコン-1、インターフェロンアルファ、アボネックス（Avonex）組換えヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ（Zemaira）、CTC-111、シャンバック（Shanvac）-B、HPVワクチン（四価）、NOV-002、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅（局所外用ゲル）、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、アクティミューン、PEG-イントロン、トリコミン（Tricomin）、組換えヒョウヒダニアレルギー脱感作注射剤、組換えヒト副甲状腺ホルモン（PTH）1-84（皮下、骨粗鬆症）、エポエチンデルタ、トランスジェニックアンチトロンビンIII、グランジトロピン（Granditropin）、ビトラーゼ（Vitrase）、組換えインスリン、インターフェロン-アルファ（経口口中錠）、GEM-2 IS、バプレオチド、イデュルスルファーゼ、オマパトリラート、組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴール、グルカルピダーゼ、ヒト組換えC1エステラーゼインヒビター（血管性浮腫）、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド（無針注射剤、Biojector 2000）、VGV-I、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル（吸入型、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン（omiganan）、オーログラブ（Aurograb）、酢酸ペキシガナン、ADI-PEG-20、LDI-200、デガレリクス、シントレデキン・ベスドトクス（cintredekin besudotox）、FavId、MDX-1379、ISAtx-247、リラグルチド、テリパラチド（骨粗鬆症）、チファコギン（tifacogin）、AA-4500、T4N5リポソームローション、カツマキソマブ、DWP-413、ART-123、クリサリン（Chrysalin）、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンアルファ、TH-9507、テデュグルチド（teduglutide）、ディアミド（Diamyd）、DWP-412、成長ホルモン（徐放性注射剤）、組換えG-CSF、インスリン（吸入型、AIR）、インスリン（吸入型、テクノスフェア（Technosphere））、インスリン（吸入型、AERx）、RGN-303、DiaPep277、インターフェロンベータ（C型肝炎ウイルス感染（HCV））、インターフェロンアルファ-n3（経口）、ベラタセプト、経皮インスリン貼付薬、AMG-531、MBP-8298、キセレセプト（Xerecept）、オペバカン、エイズバックス（AIDSVAX）、GV-1001、リンフォスキャン（LymphoScan）、ランピルナーゼ、リポキシサン（Lipoxysan）、ルスプルチド、MP52（β-リン酸三カルシウム運搬体、骨再生）、黒色腫ワクチン、シプロイセルT、CTP-37、インセジア（Insegia）、ビテスペン、ヒトトロンビン（凍結物、手術による出血）、トロンビン、TransMID、アルフィメプラーゼ、プリカーゼ（Puricase）、テルリプレシン（静脈内、肝腎症候群）、EUR-1008M、組換えFGF-I（注射用、血管疾患）、BDM-E、ロチガプチド、ETC-216、P-113、MBI-594AN、デュラマイシン（duramycin）（吸入型、嚢胞性線維症）、SCV-07、OPI-45、エンドスタチン、アンジオスタチン、ABT-510、ボウマン・バーク・インヒビター・コンセントレート、XMP-629、99mTc-Hynic-アネキシンV、カハラライドF、CTCE-9908、テベレリクス（teverelix）（持続放出）、オザレリクス（ozarelix）、ロミデプシン、BAY-50-4798、インターロイキン-4、PRX-321、ペプスキャン（Pepscan）、イボクタデキン（iboctadekin）、rhラクトフェリン、TRU-015、IL-21、ATN-161、シレンジチド（cilengitide）、アルブフェロン（Albuferon）、Biphasix、IRX-2、オメガインターフェロン、PCK-3145、CAP-232、パシレオチド（pasireotide）、huN901-DM1、卵巣がん免疫療法ワクチン、SB-249553、Oncovax-CL、OncoVax-P、BLP-25、CerVax-16、マルチエピトープペプチド黒色腫ワクチン（MART-I、gp100、チロシナーゼ）、ネミフィチド、rAAT（吸入型）、rAAT（皮膚科用）、CGRP（吸入型、喘息）、ペグスネルセプト、チモシンβ-4、プリチデプシン、GTP-200、ラモプラニン、GRASPA、OBI-I、AC-100、サケカルシトニン（経口、エリジェン（eligen））、カルシトニン（経口、骨粗鬆症）、エクサモレリン（examorelin）、カプロモレリン、Cardeva、ベラフェルミン、131I-TM-601、KK-220、TP-10、ウラリチド、デペレスタット、ヘマチド（hematide）、クリサリン（Chrysalin）（局所外用）、rNAPc2、組換え第VIII因子（PEG化リポソーム）、bFGF、PEG化組換えスタフィロキナーゼ変異体、V-10153、SonoLysis Prolyse、NeuroVax、CZEN-002、島細胞新生療法、rGLP-1、BIM-51077、LY-548806、エクセナチド（放出制御剤、Medisorb）、AVE-0010、GA-GCB、アボレリン（avorelin）、AOD-9604、酢酸リナクロチオド、CETi-I、ヘモスパン（Hemospan）、VAL（注射用）、速効性インスリン（注射用、Viadel）、鼻腔内インスリン、インスリン（吸入型）、インスリン（経口、エリジェン（eligen））、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ（皮下注射剤、湿疹）、ピトラキンラ（吸入用乾燥粉末、喘息）、マルチカイン（Multikine）、RG-1068、MM-093、NBI-6024、AT-001、PI-0824、Org-39141、Cpn10（自己免疫疾患/炎症）、タラクトフェリン（talactoferrin）（局所外用）、rEV-131（眼科用）、rEV-131（呼吸器疾患）、経口組換えヒトインスリン（糖尿病）、RPI-78M、オプレルベキン（経口）、CYT-99007 CTLA4-Ig、DTY-001、バラテグラスト、インターフェロンアルファ-n3（局所外用）、IRX-3、RDP-58、タウフェロン（Tauferon）、胆汁酸塩刺激リパーゼ、メリスパーゼ（Merispase）、アルカリホスファターゼ、EP-2104R、メラノタン-II、ブレメラノチド、ATL-104、組換えヒトマイクロプラスミン、AX-200、SEMAX、ACV-I、Xen-2174、CJC-1008、ダイノルフィンA、SI-6603、LAB GHRH、AER-002、BGC-728、マラリアワクチン（ビロゾーム、PeviPRO）、ALTU-135、パルボウイルスB19ワクチン、インフルエンザワクチン（組換えノイラミニダーゼ）、マラリア/HBVワクチン、炭疽ワクチン、Vacc-5q、Vacc-4x、HIVワクチン（経口）、HPVワクチン、Tatトキソイド、YSPSL、CHS-13340、PTH(1-34)リポソームクリーム（Novasome）、オスタボリン（Ostabolin）-C、PTHアナログ（局所外用、乾癬）、MBRI-93.02、MTB72Fワクチン（結核）、MVA-Ag85 Aワクチン（結核）、FAR-404、BA-210、組換えペストF1Vワクチン、AG-702、OxSODrol、rBetVl、Der-pl/Der-p2/Der-p7アレルゲンターゲティングワクチン（チリダニアレルギー）、PR1ペプチド抗原（白血病）、変異型rasワクチン、HPV-16 E7リポペプチドワクチン、ラビリンシン（labyrinthin）ワクチン（腺癌）、CMLワクチン、WT1-ペプチドワクチン（がん）、IDD-5、CDX-110、ペントリス（Pentrys）、ノレリン（Norelin）、CytoFab、P-9808、VT-111、イクロカプチド、テルベルミン（皮膚科、糖尿病性足病変潰瘍）、ルピントリビル、レティキュロース（reticulose）、rGRF、P1A、α-ガラクトシダーゼA、ACE-011、ALTU-140、CGX-1160、アンジオテンシン治療用ワクチン、D-4F、ETC-642、APP-018、rhMBL、SCV-07（経口、結核）、DRF-7295、ABT-828、ErbB2特異的イムノトキシン（抗がん）、DT388IL-3、TST-10088、PRO-1762、コンボトックス（Combotox）、コレシストキニン-B/ガストリン受容体結合ペプチド、111In-hEGF、AE-37、トラスツズマブ-DM1、アンタゴニストG、IL-12（組換え）、PM-02734、IMP-321、rhIGF-BP3、BLX-883、CUV-1647（局所外用）、L-19に基づく放射免疫治療薬（がん）、Re-188-P-2045、AMG-386、DC/I540/KLHワクチン（がん）、VX-001、AVE-9633、AC-9301、NY-ESO-Iワクチン（ペプチド）、NA17.A2ペプチド、黒色腫ワクチン（パルス抗原治療薬）、前立腺がんワクチン、CBP-501、組換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、FX-06、AP-214、WAP-8294A2（注射用）、ACP-HIP、SUN-11031、ペプチドYY[3-36]（肥満、鼻腔内）、FGLL、アタシセプト、BR3-Fc、BN-003、BA-058、ヒト副甲状腺ホルモン1-34（点鼻用、骨粗鬆症）、F-18-CCR1、AT-1001（セリアック病/糖尿病）、JPD-003、PTH(7-34)リポソームクリーム（Novasome）、デュラマイシン（眼科用、ドライアイ）、CAB-2、CTCE-0214、グリコPEG化（GlycoPEGylated）エリスロポエチン、EPO-Fc、CNTO-528、AMG-114、JR-013、第XIII因子、アミノキャンディン（Aminocandin）、PN-951、716155、SUN-E7001、TH-0318、BAY-73-7977、テベレリクス（即放性）、EP-51216、hGH（放出制御剤、バイオスフェア（Biosphere））、OGP-I、シフビルチド（sifuvirtide）、TV-4710、ALG-889、Org-41259、rhCCIO、F-991、チモペンチン（肺疾患）、r(m)CRP、肝選択的インスリン、スバリン（subalin）、L19-IL-2融合タンパク質、エラフィン、NMK-150、ALTU-139、EN-122004、rhTPO、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少性障害）、AL-108、AL-208、神経成長因子アンタゴニスト（疼痛）、SLV-317、CGX-1007、INNO-105、経
口テリパラチド（エリジェン（eligen））、GEM-OS1、AC-162352、PRX-302、LFn-p24融合ワクチン（セラポア（Therapore））、EP-1043、肺炎レンサ球菌小児用ワクチン、マラリアワクチン、B群髄膜炎菌ワクチン、新生児B群連鎖球菌ワクチン、炭疽ワクチン、HCVワクチン（gpEl＋gpE2＋MF-59）、中耳炎治療、HCVワクチン（コア抗原＋ISCOMATRIX）、hPTH(1-34)（経皮、ViaDerm）、768974、SYN-101、PGN-0052、アビスクミン（aviscumine）、BIM-23190、結核ワクチン、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、がんワクチン、エンカスチム（enkastim）、APC-8024、GI-5005、ACC-001、TTS-CD3、血管標的TNF（固形腫瘍）、デスモプレシン（口腔粘膜放出制御剤）、オネルセプト、TP-9201。
他の例示的実施形態では、SABAが、次に挙げるもの（ただしこれらに限るわけではない）から選択される部分に融合される：FGF21（線維芽細胞成長因子21）、GLP-1（グルカゴン様ペプチド1）、エキセンディン4、インスリン、インスリン受容体ペプチド、GIP（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド）、アディポネクチン、IL-1Ra（インターロイキン1受容体アンタゴニスト）、VIP（血管作動性腸ペプチド）、PACAP（下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド）、レプチン、INGAP（膵島新生関連タンパク質）、BMP-9（骨形成タンパク質-9）、アミリン、PYY3-36（ペプチドYY3-36）、PP（膵ポリペプチド）、IL-21（インターロイキン21）、プレクタシン、PRGN（プログラニュリン）、アトストリン（Atstrrin）、IFN（インターフェロン）、アペリンおよびオステオカルシン（OCN）。
他の例示的実施形態では、SABAが、1つ以上の追加10Fn3ドメインに融合される。例えばSABAは、1つ、2つ、3つ、4つまたはそれ以上の追加10Fn3ドメインに融合することができる。追加10Fn3ドメインは、血清アルブミン以外の同じまたは異なるターゲットに結合することができる。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-YまたはY-X1-SABA［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1 はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには、例えば配列番号65〜88、216〜221または397の任意の1つが包含される）であり、Yは本明細書に記載する治療部分である］によって表すことができるSABA-Y融合物を提供する。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-Cys-X2-YまたはY-X1-Cys-X2-SABA［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1は随意のポリペプチドリンカー（適切なリンカーには、例えば配列番号65〜88、216〜221または397の任意の1つが包含される）であり、Cysはシステイン残基であり、X2は化学的に誘導されたスペーサー（適切なスペーサーの例を表1に示す）であり、Yは本明細書に記載する治療部分である］によって表すことができるSABA-Y融合物を提供する。例示的実施形態では、化学的に誘導されたスペーサーがマレイミド部分を含有し、これを使って、本明細書においてさらに説明するマイケル付加反応により、治療部分をSABAポリペプチドのC末端Cysにコンジュゲートするか、またはSABAポリペプチドを治療部分のC末端にコンジュゲートすることができる。
別の態様では、SABAを2つ以上の治療部分に結合してもよい。例えば2つの部分を、例えば融合物配列のN末端からC末端に向かって次に挙げるようなさまざまな配置で、SABAに結合することができる：X-Y-SABA、X-SABA-Y、またはSABA-X-Y（式中、XおよびYは2つの異なる治療部分を表す）。2つの異なる治療部分は、本明細書に開示する部分のどれからでも選択することができる。
1．FGF21
線維芽細胞成長因子21（FGF21）は、シグナリングタンパク質のFGFファミリーのメンバーである。これらのタンパク質は、細胞表面チロシンキナーゼファミリーのメンバーであるFGF受容体に結合し、それを活性化することによって機能する。FGF21は、ヘパリンには結合しないが、活性には補助受容体として、1回膜貫通タンパク質であるβ-クロトー（klotho）を必要とするので、このファミリーの非定型的メンバーである。これらの受容体は幅広い組織分布を有するが、β-クロトー発現は一定の組織（肝臓、脂肪および膵臓）に限られ、FGF21に対するターゲット特異性を付与するのはβ-クロトーの組織選択的発現である。白色脂肪組織および肝臓では、それぞれFGFR1c（FGFR1のアイソフォーム）およびFGFR4が好ましい受容体であることが、インビトロ研究によって示される。
FGF21は代謝調整物質として機能し、FGF21の調節不全はさまざまな代謝障害につながりうる。FGF21は、ERKリン酸化およびGLUT1発現を誘導することによって、3T3-L1脂肪細胞および初代ヒト脂肪細胞培養物におけるグルコース取り込みを増加させる。INS-1E細胞および単離された島では、FGF21がERKおよびAKTリン酸化を誘導する。肝臓細胞株では、FGF21が、典型的FGFシグナリング（ERKリン酸化）を刺激し、グルコース生産を減少させた。以下にさらに説明するとおり、本明細書に記載するSABA-FGF21融合物は、さまざまな代謝性疾患および代謝性障害を処置または防止するために使用することができる。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性10Fn3（すなわちSABA）に融合されたFGF21、および本明細書においてFGF21-SABA融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。FGF21-SABA融合物は、例えばSABA-FGF21、FGF21-SABA、FGF21-SABA-FGF21などといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的コンストラクトを表2に示す。ただし、本明細書に開示するFGF21には、FGF21の機能的活性を保持しているFGF21の変異体、切断型（trancate）、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するFGF-21には、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および1つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がFGF21の生物学的活性を保持している限り包含される。
例えば、野生型完全長FGF21を配列番号117に示す。表2に掲載するFGF21変異体は全て、配列番号118に示すコアFGF21配列を含有している。さまざまなN末端配列、例えば配列番号119〜124のいずれか1つに示すものを、コアFGF21配列（配列番号118）のN末端に付加し、機能的活性を保持することができる。加えて、His6タグをN末端に付加してもよい（例えば配列番号128〜131）。コアFGF21配列はC末端セリンを欠き、このC末端セリンはコア配列のC末端に付加しても付加しなくてもよく、その活性には影響しない。さらにまた、FGF21とSABAの融合分子は、FGF21の機能的活性には影響を及ぼすことなく、FGF21-SABAまたはSABA-FGF21（本明細書に記載する、および当技術分野において知られている、任意の、随意の末端伸長部およびリンカー配列を包含する）の順序で、接合することができる（例えば実施例B6を参照されたい）。
例示的実施形態において、本願は、FGF21部分が配列番号117〜118もしくは125〜131の配列、または配列番号117〜118もしくは125〜131のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む、SABA-FGF21融合物を提供する。一定の実施形態では、SABA-FGF21融合物が、配列番号132〜174のいずれか1つの配列、または配列番号132〜174のいずれか１つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、もしくは99％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-FGF21またはFGF21-X1-SABA［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、216〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、FGF21は本明細書に記載するFGF21ペプチドである］によって表すことができるSABA-FGF21融合物を提供する。
2．インスリン
もう一つの態様において、本発明は、SABAとインスリンとの融合分子を記載する。インスリンは、身体におけるエネルギー代謝およびグルコース代謝を調節するホルモンである。このポリペプチドは膵β島細胞によって血中に分泌され、血中では、肝臓、筋および脂肪細胞による血液からのグルコース取り込みを刺激し、グリコーゲン生成および脂質生成を促進する。インスリンの分泌および/または作用のいずれかのステップの機能不全は、酸素利用、脂肪生成、グリコーゲン生成、脂質生成、グルコース取り込み、タンパク質合成、熱産生、および基礎代謝率の維持の調節不全などといった、多くの障害につながりうる。この機能不全は、高インスリン血症、インスリン抵抗性、インスリン欠乏、高血糖、高脂質血症、高ケトン血、真性糖尿病、および糖尿病性腎症などといった（ただしこれらに限るわけではない）疾患および/または障害をもたらす。したがって、本明細書に記載するSABA-インスリン融合ポリペプチドは、そのような疾患および/または障害を有する対象を処置するのに役立ちうる。
例示的実施形態において、本発明に応用することができるインスリン部分には、天然インスリン、生合成インスリン、インスリン誘導体およびインスリンアナログが包含される。インスリンアナログは、ヒトインスリンまたは動物型インスリンなどの天然インスリンタンパク質のアナログであって、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換、付加および/または除去されているものである。そのようなアミノ酸は合成または修飾アミノ酸であることができる。インスリン誘導体は、例えば1つ以上のアミノ酸への1つ以上の特別な化学基の付加などによって化学修飾されている、天然インスリンまたはインスリンアナログのどちらかの誘導体である。例示的インスリンアナログは、引用によりそのまま本明細書に組み込まれる米国特許第7,476,652号に記載されている。
3．インスリン受容体ペプチド
ある態様において、本発明は、SABAとインスリン受容体ペプチドとの融合分子を記載する。一定の実施形態では、インスリン受容体ペプチドが、インスリン受容体のアミノ酸687〜710（KTDSQILKELEESSFRKTFEDYLH；配列番号175）を含む。インスリン受容体は、ホルモンであるインスリンによって活性化される膜貫通受容体チロシンキナーゼである。インスリン受容体の活性化は、最終的には細胞表面へのグルコース輸送体の輸送をもたらして細胞が血液からグルコースを取り込むことができるようにするシグナリングカスケードの引き金を引く。グルコースの取り込みは、主として脂肪細胞および筋細胞で起こる。インスリン受容体の機能障害は、細胞がグルコースを取り込むことができなくなった時に起こる2型真性糖尿病および他の合併症にしばしばつながるインスリン非感受性またはインスリン抵抗性と関連する。インスリン受容体遺伝子中の変異と関連する他の障害には、ドナヒュー症候群およびラブソン-メンデンホール症候群が包含される。それゆえに、本明細書に記載するSABA-インスリン受容体ペプチド融合物の例示的使用には、2型真性糖尿病または不十分な細胞グルコース取り込みに関連する他の障害、ドナヒュー症候群およびラブソン-メンデンホール症候群のような障害を有する対象の処置が包含されうる。
4．BMP-9
一定の態様において、本発明は、SABAとBMP-9との融合分子を記載する。さまざまなBMP-9組成物が、引用により本明細書にそのまま組み込まれる米国特許第5,661,007号および同第6,287,816号に記述されている。骨形成タンパク質（BMP）は、成長因子およびサイトカインのTGF-βファミリーに属する。BMPは骨および軟骨の形成を誘導し、他の多くの組織における形態形成変化を媒介する。BMPシグナリングは、胚発生ならびに出生後組織の成長および維持には不可欠である。シグナリング経路は、脊椎障害から、がん、逆流性食道炎等まで、多岐にわたる疾患にも関連付けられている。
20を越えるBMPが発見されている。これらの分子のうち、BMP-9は、主として非実質性肝臓細胞において発現しており、肝細胞の増殖と機能、特に肝グルコース生産に関係づけられている。BMP-9は、がん細胞のアポトーシス、内皮細胞におけるシグナリング、骨形成、軟骨形成、認知等において、他の役割も果たすようである。したがって、本明細書に記載するSABA-BMP-9融合ポリペプチドは、さまざまな疾患および障害、例えばさまざまなタイプの創傷および肝臓の変性を示す疾患などを処置するのに役立つと共に、骨および/または軟骨欠損、歯周病ならびにさまざまながんを包含する他の疾患および/または障害の処置にも役立つ。
5．アミリン
いくつかの態様において、本発明は、SABAとアミリンとの融合分子を記載する。アミリン（または島アミロイドポリペプチド、IAPP）は、膵β細胞によって分泌される37アミノ酸の小さいペプチドホルモンである。アミリンはインスリンと同時に分泌され、インスリン分泌、グルコースホメオスタシス、胃内容排出、および満腹シグナルの脳への伝達を制御する役割を果たすと考えられている。アミリンは、膵β細胞のアポトーシス細胞死に関係づけられているフィブリルを形成する。この知見と合致して、2型真性糖尿病を患っている患者または神経内分泌腫瘍であるインスリノーマを抱える患者の膵島には、アミリンがよく見いだされる。
アミリンは、真性糖尿病を有する患者のための治療薬として使用することができる。アミリンペプチドの調製は、引用により本明細書にそのまま組み込まれる米国特許第5,367,052号に記載されている。同様に、米国特許第6,610,824号および同第7,271,238号（これらは引用により本明細書にそのまま組み込まれる）には、低血糖状態を処置または防止するために使用することができる、Asn、Serおよび/またはThr残基のグリコシル化によって形成されたアミリンのアゴニストアナログが記載されている。したがって本明細書において記載するSABA-アミリン融合ポリペプチドは、例えば、低血糖、肥満、糖尿病、摂食障害、インスリン抵抗性症候群、および心血管疾患を有する対象の処置に役立ちうる。SABA-アミリン融合物の調製については実施例で説明する。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性10Fn3（すなわちSABA）に融合されたアミリン、および本明細書においてSABA-アミリン融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。SABA-アミリン融合物は、例えばアミリンおよびアミリン-SABAなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。例示的実施形態では、SABA-アミリン融合物が、アミリンペプチドのC末端が遊離であるような配置をとり、これにより、カルボキシ末端のアミド化が可能になる。一定の例示的SABA-アミリン融合物コンストラクトを表2に示す。ただし、本明細書に開示するアミリンには、アミリンの機能的活性を保持しているアミリンの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するアミリンには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および1つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がアミリンの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的アミリン配列を、表2に配列番号296〜303として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、アミリン部分が配列番号296〜303のいずれか1つの配列、または配列番号296〜303のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む、SABA-アミリン融合物を提供する。一定の実施形態では、SABA-アミリン融合物が、配列番号304〜328のいずれか1つの配列、または配列番号304〜328のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-アミリン［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、216〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、アミリンは本明細書に記載するアミリンペプチドである］によって表すことができるSABA-アミリン融合物を提供する。好ましくはアミリンペプチドはC末端がアミド化されている。アミリンペプチドは、Cys1,7またはCys2,7ジスルフィド結合を、さらに含んでもよい。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-Cys-X2-アミリン［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1は随意のポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、215〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、Cysはシステイン残基であり、X2は化学的に誘導されたスペーサー（適切なスペーサーの例を表1に示す）であり、アミリンは本明細書に記載するアミリンペプチドである］によって表すことができるSABA-アミリン融合物を提供する。好ましくは、アミリンペプチドはC末端がアミド化されている。アミリンペプチドは、Cys1,7またはCys2,7ジスルフィド結合を、さらに含んでもよい。例示的実施形態において、化学的に誘導されたスペーサーはマレイミド部分を含有し、これを使って、本明細書においてさらに説明するマイケル付加反応により、アミリンペプチドをSABAポリペプチドのC末端Cysにコンジュゲートすることができる。
6．PYY 3-36
別の態様において、本発明はSABAとPYYとの融合分子を記載する。ペプチドYY（PYY、ペプチドチロシンチロシン、または膵ペプチドYYとも呼ばれている）は、摂食に呼応して回腸および大腸中の細胞によって放出される36アミノ酸タンパク質である。PYYは膵臓において分泌されて、例えばインスリンなどの膵分泌を阻害することで血中グルコースレベルの増加をもたらし、摂食量を減らす必要を知らせることによって、エネルギーホメオスタシスの制御を助ける。PYYには2つの主要形態、完全長型（1-36）と切断型（3-36）がある。循環PYY免疫反応性の最も一般的な形態はPYY3-36である。PYY3-36はY2受容体に対してPYY1-36より高いアフィニティを有する。加えて、PYY13-36もY2受容体において同様の高い力価を有することから、残基4〜12は、この受容体では重要でないことが示唆される（K.McCreaら「2-36[K4,RYYSA(19-23)]PP a novel Y5-receptor preferring ligand with strong stimulatory effect on food intake」Regul. Pept 87 1-3 (2000), pp.47-58）。さらにまた、他のNPY受容体（Y1、Y4およびY5）との比較でY2選択性を示す、PYY(22-36)および(25-36)の構造に基づくさらに短いPYYフラグメントアナログも記載されている。例えば、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第5,604,203号および同第6,046,167号を参照されたい。反応性基にカップリングされたPYYペプチドおよび機能的誘導体は、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第7,601,691号に記載されている。
PYYは、栄養の取り込み、細胞増殖、リポリーシス、および血管収縮などといった、いくつかの生理学的活動に関係づけられている。特にPYY3-36は、ヒトにおいて食欲および食物摂取を減少させることが示されている（例えばBatterhamら, Nature 418:656-654, 2002を参照されたい）。したがって、本明細書に記載するSABA-PYY融合ポリペプチドの例示的使用には、肥満、糖尿病、摂食障害、インスリン抵抗性症候群、および心血管疾患の処置が包含されうる。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性10Fn3（すなわちSABA）に融合されたPYY、および本明細書においてSABA-PYY融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。SABA-PYY融合物は、例えばSABA-PYYおよびPYY-SABAなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。例示的実施形態では、SABA-PYY融合物が、PYYペプチドのC末端が遊離であるような配置をとり、これにより、カルボキシ末端のアミド化が可能になる。一定の例示的SABA-PYY融合物コンストラクトを表2に示す。ただし、本明細書に記載するPYYには、PYYの機能的活性を保持しているPYYの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するPYYには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および1つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がPYYの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的PYY配列を表2に配列番号329〜337および408〜418として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、PYY部分が、配列番号329〜337もしくは408〜418のいずれか1つの配列；配列番号329〜337もしくは408〜418のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列；配列番号329〜333もしくは335〜337のいずれか1つの残基3〜36、13〜36、21〜36、22〜36、24〜36、または25〜36を有する配列；配列番号329〜333もしくは335〜337のいずれか1つの残基3〜36、13〜36、21〜36、22〜36、24〜36、または25〜36を有する配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列；またはV31L置換を有する前述の配列のいずれか1つを含む、SABA-PYY融合物を提供する。一定の実施形態では、SABA-PYY融合物が、配列番号338〜344のいずれか1つの配列、または配列番号338〜344のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-PYY［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、216〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、PYYは本明細書に記載するPYYペプチドである］によって表すことができるSABA-PYY融合物を提供する。好ましくは、PYYペプチドはC末端がアミド化されている。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-Cys-X2-PYY［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1は随意のポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、215〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、Cysはシステイン残基であり、X2は化学的に誘導されたスペーサー（適切なスペーサーの例を表1に示す）であり、PYYは本明細書に記載するPYYペプチドである］によって表すことができるSABA-PYY融合物を提供する。好ましくは、PYYペプチドはC末端がアミド化されている。例示的実施形態において、化学的に誘導されたスペーサーはマレイミド部分を含有し、これを使って、本明細書においてさらに説明するマイケル付加反応により、PYYペプチドをSABAポリペプチドのC末端Cysにコンジュゲートすることができる。
7．膵ポリペプチド
いくつかの態様において、本発明は、SABAと膵ポリペプチドとの融合分子を記載する。膵ポリペプチド（PP）は膵ポリペプチドホルモンファミリーのメンバーであり、このファミリーには、神経ペプチドY（NPY）およびペプチドYY（PYY）も包含される。PPは、食事、運動、および絶食に呼応して膵ポリペプチド細胞によって放出される36アミノ酸タンパク質である。PPは、膵臓、消化管、およびCNSに見いだされ、そこでは、胆嚢収縮、膵分泌、腸の運動性、ならびにグリコーゲン分解および脂質レベルの低下などといった代謝機能に影響を及ぼす。PPは、食物摂取、エネルギー代謝、ならびに視床下部ペプチドおよび胃グレリンの発現にも関係づけられている。加えて、PPは、食物摂取量の増加を伴う状態では減少する。PPは、膵ペプチド細胞のまれな悪性腫瘍などの腫瘍形成にも関与しうる。PPは、例えば肝グルコース生産を減少させるために、患者に投与することができる（米国特許第5,830,434号）。本明細書に開示するSABA-PP融合ポリペプチドの例示的使用には、肥満、糖尿病、摂食障害、インスリン抵抗性症候群、および心血管疾患の処置が包含されうる。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性10Fn3（すなわちSABA）に融合されたPP、および本明細書においてSABA-PP融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。SABA-PP融合物は、例えばSABA-PPおよびPP-SABAなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。例示的実施形態では、SABA-PP融合物が、PPペプチドのC末端が遊離であるような配置をとり、これにより、カルボキシ末端のアミド化が可能になる。一定の例示的SABA-PP融合物コンストラクトを表2に示す。ただし、本明細書に開示するPPには、PPの機能的活性を保持しているPPの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するPPには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および1つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がPPの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的PP配列を、表2に配列番号345〜357として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、PP部分が、配列番号345〜357のいずれか1つの配列、または配列番号345〜357のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む、SABA-PP融合物を提供する。一定の実施形態では、SABA-PP融合物が、配列番号358〜364のいずれか1つの配列、または配列番号358〜364のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-PP［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、216〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、PPは本明細書に記載するPPペプチドである］によって表すことができるSABA-PP融合物を提供する。好ましくは、PPペプチドはC末端がアミド化されている。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-Cys-X2-PP［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1は随意のポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、215〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、Cysはシステイン残基であり、X2は化学的に誘導されたスペーサー（適切なスペーサーの例を表1に示す）であり、PPは本明細書に記載するPPペプチドである］によって表すことができるSABA-PP融合物を提供する。好ましくは、PPペプチドはC末端がアミド化されている。例示的実施形態において、化学的に誘導されたスペーサーはマレイミド部分を含有し、これを使って、本明細書においてさらに説明するマイケル付加反応により、PPペプチドをSABAポリペプチドのC末端Cysにコンジュゲートすることができる。
8．インターロイキン21（IL-21）
もう一つの態様において、本発明は、SABAとIL-21との融合分子を記載する。IL-21は、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、およびIL-15と共通する受容体γ鎖を有するI型サイトカインである。IL-21は、活性化ヒトCD4＋ T細胞において発現し、Tヘルパー細胞のTh2およびTh17サブセット、濾胞性T細胞およびNK T細胞においてアップレギュレートされる。このサイトカインは、これら全ての細胞タイプの機能を調節する役割を有する。B細胞もIL-21によって調節される。IL-21は、共刺激シグナルとの相互関係およびB細胞の発生段階に依存して、マウスでもヒトでも、増殖、Ig生産形質細胞への分化、またはアポトーシスを誘導することができる。IL-21は、単独で、またはTh細胞由来サイトカインとの組合せで、IgG、IgA、またはIgEアイソタイプへのクラススイッチ組換えを調節することができ、これは、IL-21が、B細胞のエフェクター機能を形作る上で重要な役割を持つことを示している。このように、IL-21は、免疫細胞に対するその複数の効果により、正常な免疫応答の多くの側面において役割を果たす。
免疫系の調節物質として、免疫系のアップレギュレーションが望まれる状況における数ある使用法の中でもとりわけ、がん治療用の免疫刺激物質としての（単独での、または他の治療法との組合せでの）IL-21の使用、免疫療法の補助としての使用、およびウイルス治療としての使用が研究されている。臨床的にも前臨床的にも処置されたことがある具体的がんは、転移性黒色腫、腎細胞癌、大腸癌、膵癌、乳癌、胸腺腫（thyoma）、頭頸部扁平上皮細胞癌、および神経膠腫である（総説としてSondergaard and Skak, Tissue Antigens, 74(6):467-479, 2009を参照されたい）。加えて、IL-21のアップレギュレーションは、例えばクローン病（CD）、潰瘍性大腸炎、主要な形態の炎症性腸疾患（IBD）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）関連胃炎、セリアック病、アトピー性皮膚炎（AD）、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erthyematosus）、関節リウマチ、および乾癬などといった、T細胞が媒介するまたはT細胞と連関するさまざまなヒト炎症性病変とも結びつけられている（総説としてMonteleoneら, Trends Pharmacol Sci, 30(8), 441-7, 2009を参照されたい）。例示的IL-21タンパク質は、米国特許第6,307,024号および同第7,473,765号に記載されており、これらは引用により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載するSABA-IL21融合ポリペプチドの例示的使用には、一定のタイプのがん、ウイルス関連疾患、ならびにT細胞が媒介するまたはT細胞と連関するさまざまな炎症性障害、例えばクローン病（CD）、潰瘍性大腸炎、主要な形態の炎症性腸疾患（IBD）、ヘリコバクター・ピロリ関連胃炎、セリアック病、アトピー性皮膚炎（AD）、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erthyematosus）、関節リウマチ、および乾癬の処置などが包含される。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性10Fn3（すなわちSABA）に融合されたIL-21、および本明細書においてSABA-IL21融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。SABA-IL21融合物は、例えばSABA-IL-21およびIL21-SABAなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的SABA-IL21融合物コンストラクトを表2に示す。ただし、本明細書に開示するIL-21には、IL-21の機能的活性を保持しているIL-21の変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するIL-21には、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および1つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がIL-21の生物学的活性を保持している限り包含される。例示的IL-21配列を、表2に配列番号286〜287として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、IL-21部分が、配列番号286〜287のいずれか1つの配列、または配列番号286〜287のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む、SABA-IL21融合物を提供する。一定の実施形態では、SABA-IL21融合物が、配列番号290〜295のいずれか1つの配列、または配列番号290〜295のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-IL21またはIL21-X1-SABA［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、216〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、IL21は本明細書に記載するIL-21ペプチドである］によって表すことができるSABA-IL21融合物を提供する。
9．グルカゴン様ペプチド1（GLP-1）/エキセンディン-4
もう一つの態様において、本発明は、SABAとGLP-1との融合分子を記載する。グルカゴン様ペプチド1（GLP-1）は、栄養摂取に呼応して腸内分泌L細胞から放出される30アミノ酸または31アミノ酸のペプチド（配列番号226および227）である。このホルモンは、複数の機序で作用して、グルコースホメオスタシスを調整し、抗糖尿病効果を発揮する。GLP-1シグナリングは、動物モデルにおいて、グルコース依存的インスリン分泌を高め、グルカゴン分泌をグルコース依存的に阻害し、胃内容排出を遅らせ、食物摂取と体重の減少をもたらし、β細胞塊の増加を引き起こす。
ネイティブGLP-1の治療的有用性は、それが遍在性プロテアーゼであるジペプチジルペプチダーゼIV（DPP-IV）によって迅速に分解されるせいで半減期が2分未満であることから、限定されている。DPP-IVは、2番目の位置にアラニンまたはプロリンを有するアミノ末端ジペプチドを優先的に切断するので、半減期を増加させるための戦略の一つは、活性GLP-1における2番目のアミノ酸（位置8）を、ペプチドがもはやDPP-IV基質ではなくなるように改変することである。位置8におけるアラニンを、例えばグリシン、セリン、スレオニン、またはバリンなどといった、多種多様な天然（または非天然アミノ酸で置き換えることで、DPP-IV耐性GLP-1アナログを作製することができる。しかし、DPP-IV耐性GLP-1アナログは、腎クリアランスによって排除されるので、依然として比較的短い薬物動態半減期を有する。例えば、強力なDPP-IV耐性GLP-1受容体アゴニストである合成エキセンディン-4（配列番号228；バイエッタ（Byetta）の活性医薬成分）は、腎臓によって迅速に浄化されるので、ヒト糖尿病患者では、依然として毎日2回投与しなければならない。
持効性GLP-1受容体アゴニストを作製するためのもう一つのアプローチは、DPP-IV耐性GLP-1アナログを、アルブミンまたはトランスフェリンなどの長命タンパク質と同じオープンリーディングフレームで発現させることであった。そのような融合タンパク質の一つ、ヒト血清アルブミンに融合されたDPP-IV耐性GLP-1アナログであるアルビグルチドは、現在、第III相臨床治験において評価されているところである。報告された症例のすべてにおいて、活性な融合タンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端にDPP-IV耐性GLP-1受容体アゴニストを有しており、c末端融合物は力価が著しく低い。
例示的実施形態において、SABA-GLP-1融合タンパク質は、N末端からC末端に向かって、DPP-IV耐性GLP-1受容体アゴニスト（GLP-1またはエキセンディン-4に基づく配列を潜在的に包含する）、リンカー、およびSABAを含む。
SABA-GLP-1およびSABA-エキセンディン融合ポリペプチドの例示的使用には、糖尿病、肥満、過敏性腸症候群（initable bowel syndrome）の処置、ならびに血漿中グルコースを低下させること、胃および/または腸の運動を阻害すること、ならびに胃および/または腸排出を阻害すること、または食物摂取を阻害することによって利益が得られるであろう他の状態の処置が包含される。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性10Fn3（すなわちSABA）に融合されたGLP-1またはエキセンディン、および本明細書においてSABA-GLP-1またはSABA-エキセンディン融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。SABA-GLP-1またはSABA-エキセンディン融合物は、例えばSABA-GLP-1、GLP-1-SABA、SABA-エキセンディンおよびエキセンディン-SABAなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的SABA-GLP-1およびSABA-エキセンディン融合物コンストラクトを表2に示す。ただし、本明細書に開示するGLP-1およびエキセンディンには、GLP-1またはエキセンディンの機能的活性を保持しているGLP-1およびエキセンディンの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するGLP-1およびエキセンディンには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および1つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がGLP-1またはエキセンディンの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的GLP-1配列を表2に配列番号226〜227として掲載し、例示的エキセンディン配列を表2に配列番号228として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、GLP-1部分が、配列番号226〜227のいずれか1つの配列、または配列番号226〜227のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む、SABA-GLP-1融合物を提供する。一定の実施形態では、SABA-GLP-1融合物が、配列番号229〜232のいずれか1つの配列、または配列番号229〜232のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-GLP-1またはGLP-1-X1-SABA［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、216〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、GLP-1は本明細書に記載するGLP-1ペプチドである］によって表すことができるSABA-GLP-1融合物を提供する。
例示的実施形態において、本願は、エキセンディン部分が、配列番号228、または配列番号228に対して少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む、SABA-エキセンディン融合物を提供する。一定の実施形態では、SABA-エキセンディン融合物が、配列番号233〜236のいずれか1つの配列、または配列番号233〜236のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-エキセンディンまたはエキセンディン-X1-SABA［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、216〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、エキセンディンは本明細書に記載するエキセンディンペプチドである］によって表すことができるSABA-エキセンディン融合物を提供する。
10．プレクタシン
もう一つの態様において、本発明は、SABAとプレクタシンとの融合分子を記載する。プレクタシンは、真菌である腐性子嚢菌クロチャワンタケ（Pseudoplectania nigrella）から単離された新規殺細菌性抗微生物ペプチドである。インビトロで、プレクタシンは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）および肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumonia）を、通常の抗生物質に対して耐性である数多くの株を含めて、バンコマイシンにもペニシリンにも匹敵する速度で迅速に殺すことができるが、哺乳動物細胞に対する細胞傷害効果は伴わない。生体内でも、プレクタシンは、マウスにおいて極めて低い毒性を示し、肺炎レンサ球菌が引き起こす腹膜炎および肺炎をバンコマイシンおよびペニシリンと同じぐらい有効に治癒させることができる。例えばMygind PHら「Plaectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus」Nature 437:975-980 (2005)；Brinch KSら「Plectasin shows intracellular activity against Staphylococcus aureus in human THP-1 monocytes and in the mouse peritonitis model」Antimicrob Agents Chemother 53:4801-4808 (2009)；3. Hara Sら「Plectasin has antibacterial activity and no effect on cell viability or IL-8 production」Biochem Biophys Res Commun 374:709-713 (2008)；およびOstergaard Cら「High cerebrospinal fluid (CSF) penetration and potent bactericidal activity in CSF of NZ2114, a novel plectasin variant, during experimental pneumococcal meningitis」Antimicrob Agents Chemother 53:1581-1585 (2009)を参照されたい。これらの特徴を考えると、プレクタシンは、有望な抗生物質製品として役立つ魅力的な候補である。例えばXiao-Lan Jら「High-Level Expression of the Antimicrobial Peptide Plectasin in Escherichia coli」Curr Microbiol 61:197-202 (2010)を参照されたい。したがって、本明細書に記載するSABA-プレクタシン融合ポリペプチドは、抗細菌剤として使用することができる。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性10Fn3（すなわちSABA）に融合されたプレクタシン、および本明細書においてSABA-プレクタシン融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。SABA-プレクタシン融合物は、例えばSABA-プレクタシンおよびプレクタシン-SABAなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的SABA-プレクタシン融合物コンストラクトを表2に示す。ただし、本明細書に開示するプレクタシンには、プレクタシンの機能的活性を保持しているプレクタシンの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するプレクタシンには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および1つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がプレクタシンの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的プレクタシン配列を表2に配列番号237として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、プレクタシン部分が、配列番号237、または配列番号237と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む、SABA-プレクタシン融合物を提供する。一定の実施形態では、SABA-プレクタシン融合物が、配列番号238〜239のいずれか1つの配列、または配列番号238〜239のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-プレクタシンまたはプレクタシン-X1-SABA［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、216〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、プレクタシンは本明細書に記載するプレクタシンペプチドである］によって表すことができるSABA-プレクタシン融合物を提供する。
11．プログラニュリン（PRGN）およびアトストリン
もう一つの態様において、本発明は、SABAとプログラニュリンまたはSABAとアトストリンの融合分子を記載する。プログラニュリンと、プログラニュリン由来の3フラグメントを含む改変タンパク質であるアトストリンは、TNFシグナリングを拮抗する腫瘍壊死因子（TNF）受容体結合物質である。プログラニュリンおよびアトストリンは、関節炎のマウスモデルにおいて、炎症を防止する。例えばTang, W.ら「The Growth Factor Progranulin Binds to TNF Receptors and Is Therapeutic Against Inflammatory Arthritis in Mice」Science, ScienceExpress,March 10, 2011, Supplementary Materialを参照されたい。どちらのタンパク質のSABA融合物も、TNFαが媒介する疾患のための潜在的治療薬でありうる。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性10Fn3（すなわちSABA）に融合されたプログラニュリンまたはアトストリン、および本明細書においてSABA-PRGNまたはSABA-アトストリン融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。SABA-PRGNまたはSABA-アトストリン融合物は、例えばSABA-PRGN、PRGN-SABA、SABA-アトストリンおよびアトストリン-SABAなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的SABA-PRGNおよびSABA-アトストリン融合物コンストラクトを表2に示す。ただし、本明細書に開示するプログラニュリンおよびアトストリンには、プログラニュリンまたはアトストリンの機能的活性を保持しているプログラニュリンおよびアトストリンの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するプログラニュリンおよびアトストリンには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および1つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がプログラニュリンまたはアトストリンの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的プログラニュリン配列を、表2に配列番号240〜241として掲載し、例示的アトストリン配列を表2に配列番号242として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、PRGN部分が、配列番号240〜241のいずれか1つの配列、または配列番号240〜241のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む、SABA-PRGN融合物を提供する。一定の実施形態では、SABA-PRGN融合物が、配列番号243〜246のいずれか1つの配列、または配列番号243〜246のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-PRGNまたはPRGN-X1-SABA［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、216〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、PRGNは本明細書に記載するプログラニュリンペプチドである］によって表すことができるSABA-PRGN融合物を提供する。
例示的実施形態において、本願は、アトストリン部分が、配列番号242、または配列番号242に対して少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む、SABA-アトストリン融合物を提供する。一定の実施形態では、SABA-アトストリン融合物が、配列番号247〜250のいずれか1つの配列、または配列番号247〜250のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-アトストリンまたはアトストリン-X1-SABA［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、216〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、アトストリンは本明細書に記載するアトストリンペプチドである］によって表すことができるSABA-アトストリン融合物を提供する。
12．オステオカルシン（OCN）
一定の態様において、本発明は、SABAとオステオカルシンとの融合分子を記載する。オステオカルシン（OCN；骨Glaタンパク質、またはBGPとも呼ばれている）は、骨芽細胞によって生産される49アミノ酸タンパク質であり、血流および骨基質中に分泌される。血漿中OCNレベルは、概日周期、季節、性別、年齢および月経周期などといった生物学的変動の影響を受ける。OCNは、カルボキシル化型、非カルボキシル化型および低カルボキシル化型として存在し、非カルボキシル化型と低カルボキシル化型は、インスリン分泌、膵β細胞増殖を刺激し、インスリン感受性を高める（これは部分的にアディポネクチンによって媒介される）ことによって、エネルギー代謝の調節に関与している。インスリンは骨リモデリングを促進し、骨芽細胞におけるそのシグナリングは、循環への非カルボキシル化および/または低カルボキシル化OCNの放出を増加させ、ひいてはそれが、グルコースの取扱いを改善する。したがって、本明細書に記載するSABA-OCN融合ポリペプチドは、酸素利用、脂肪生成、グリコーゲン生成、脂質生成、グルコース取り込み、タンパク質合成、熱産生、および基礎代謝率の維持の調節不全などといった、インスリン関連障害の処置に使用することができる。この機能不全は、高インスリン血症、インスリン抵抗性、インスリン欠乏、高血糖、高脂質血症、高ケトン血、真性糖尿病、および糖尿病性腎症などといった（ただしこれらに限るわけではない）疾患および/または障害をもたらす。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性10Fn3（すなわちSABA）に融合されたOCN、および本明細書においてSABA-OCN融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。SABA-OCN融合物は、例えばSABA-OCNおよびOCN-SABAなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的SABA-OCN融合物コンストラクトを表2に示す。ただし、本明細書に開示するOCNには、OCNの機能的活性を保持しているOCNの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するOCNには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および1つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がOCNの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的OCN配列を、表2に配列番号365〜378として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、OCN部分が、配列番号365〜378のいずれか1つの配列、または配列番号365〜378のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む、SABA-OCN融合物を提供する。一定の実施形態では、SABA-OCN融合物が、配列番号379〜396のいずれか1つの配列、または配列番号379〜396のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-OCNまたはOCN-X1-SABA［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、216〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、OCNは本明細書に記載するOCNペプチドである］によって表すことができるSABA-OCN融合物を提供する。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-Cys-X2-OCNまたはOCN-X1-Cys-X2-SABA［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1は随意のポリペプチドリンカー（適切なリンカーには、例えば配列番号65〜88、216〜221または397の任意の1つが包含される）であり、Cysはシステイン残基であり、X2は化学的に誘導されたスペーサー（適切なスペーサーの例を表1に示す）であり、OCNは本明細書に記載するOCNペプチドである］によって表すことができるSABA-OCN融合物を提供する。例示的実施形態において、化学的に誘導されたスペーサーはマレイミド部分を含有し、これを使って、本明細書においてさらに説明するマイケル付加反応により、OCNペプチドをSABAポリペプチドのC末端Cysにコンジュゲートするか、またはSABAポリペプチドをOCNペプチドのC末端Cysにコンジュゲートする事ができる。
13．インターフェロンラムダ（IFNλ）
もう一つの態様において、本発明は、SABAとインターフェロン-ラムダ（IFN-λ）との融合分子を記載する。ヒトインターフェロン（IFN）は、3つの主要タイプ、すなわちI型、II型およびIII型に分類される。I型IFNは、ウイルス感染に対する防御の最前線として発現する。I型IFNの主な役割は、ウイルス感染の最初の数日間におけるウイルスの蔓延を制限することで、その感染に対する強力な適応免疫応答が生成するための十分な時間を確保することである。II型およびIII型IFNは、I型IFNの抗ウイルス特性の一部を示す。
IFN-λはIII型IFNである。ヒトは、3つのIFN-λ分子、すなわちIFN-λ1（IL-29）、IFN-λ2（IL-28A）およびIFN-λ3（IL-28B）をコードしている。US7,135,170に記載されているように、IL-28およびIL-29は、肝炎ウイルス感染の処置に有用であることが示されている。重要なことに、IL-28およびIL-29は、既知のIFN治療法の使用に付随する毒性の一部を伴わずにこれらの抗ウイルス活性を有することが示された。I型IFN治療に関係する毒性の一つは骨髄抑制である。これはI型IFNによる骨髄前駆細胞の抑制に起因している。IL-29は、I型IFN処置で見られるように骨髄細胞の拡充またはB細胞の増殖を有意に抑制することがないので、IL-29には、処置に関連する毒性が少ないだろう。同様の結果が、IL-28AおよびIL-28Bでも予期されるだろう。
したがって、本明細書に記載するSABA-IFN-λ融合ポリペプチドの例示的使用には、例えばA型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、およびD型肝炎などのウイルス感染を含むウイルス感染を有する対象の処置が包含される。本明細書に記載するSABA-IFN-λ融合ポリペプチドは、呼吸器合胞体ウイルス、ヘルペスウイルス、エプシュタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、ワクシニアウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ピチンデウイルスおよびポリオウイルスに関連するウイルス感染を処置するための抗ウイルス剤として使用することもできる。本明細書に記載するSABA-IFN-λ融合ポリペプチドは、慢性または急性ウイルス感染のどちらかを有する対象を処置するために使用することができる。
一定の実施形態において、本明細書に記載するSABA-IFNλ融合物は、他の薬物動態部分、例えばPEGなどに融合されたIFNλポリペプチドより有益でありうる。特に、ここに提供するSABA-IFNλ融合物は、PEG-IFNλコンジュゲートと比べて、IFNλ分子の血清中半減期の有意な改善をもたらしうる。そのような半減期の増加により、頻度を下げた投与レジメンが可能になり、例えばSABA-IFNλ融合物は、PEG-IFNλコンジュゲートのような他のIFNλ治療薬での、より頻繁な投薬、例えば週に1回の投薬と比べて、月に1回の投薬を可能にしうる。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性10Fn3（すなわちSABA）に融合されたIFNλ、および本明細書においてSABA-IFNλ融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。SABA-IFNλ融合物は、例えばSABA-IFNλおよびIFNλ-SABAなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的SABA-IFNλ融合物コンストラクトを表2に示す。ただし、本明細書に開示するIFNλには、IFNλの機能的活性を保持しているIFNλの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するIFNλには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および1つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がIFNλの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的IFNλ配列を、表2に配列番号251〜257として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、IFNλ部分が、配列番号251〜257のいずれか1つの配列、または配列番号251〜257のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む、SABA-IFNλ融合物を提供する。一定の実施形態では、SABA-IFNλ融合物が、配列番号258〜285のいずれか1つの配列、または配列番号258〜285のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-IFNλまたはIFNλ-X1-SABA［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、216〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、IFNλは本明細書に記載するIFNλペプチドである］によって表すことができるSABA-IFNλ融合物を提供する。
14．アペリン
もう一つの態様において、本願は、SABAとアペリンとの融合分子を提供する。アペリンは、Gタンパク質共役受容体APJの内在性リガンドである。アペリン遺伝子は、より短い活性フラグメントに切断される77アミノ酸のプレプロタンパク質をコードしている。完全長成熟ペプチドはアペリン-36であるが、アペリン-17およびアペリン-13も活性である（M Kleinzら, Pharmacol. Ther. 107:198-211 (2005)）。アペリンは、中枢神経系および末梢組織において広く発現しており、細胞発現には内皮細胞および脂肪細胞が包含される（前掲）。アペリンは、血管拡張をもたらし、心不全を有する患者の血行力学および心臓プロファイルを改善すると共に、前臨床モデルにおいてアテローム性動脈硬化を防止することが示されている（AG Jappら, Circ. 121:1818-1827 (2010)；およびHY Chunら, J. Clin. Invest. 118: 3343-3354 (2008)）。加えて、アペリン投与は、糖尿病の前臨床モデルにおけるインスリン感受性の改善と関連する（C Drayら, Cell Metabolism 8:437-445 (2008)）。したがって、本明細書に記載するSABA-アペリン融合ポリペプチドの例示的使用には、糖尿病、肥満、摂食障害、インスリン抵抗性症候群および心血管疾患（例えば心不全、アテローム性動脈硬化、および高血圧）の処置がが包含されうる。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性10Fn3（すなわちSABA）に融合されたアペリン、および本明細書においてSABA-APLN融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。SABA-APLN融合物は、例えばSABA-APLNおよびAPLN-SABAなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的SABA-APLN融合物コンストラクトを表2に示す。ただし、本明細書に開示するアペリンには、アペリンの機能的活性を保持しているアペリンの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するアペリンには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および1つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がアペリンの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的アペリン配列を、表2に配列番号419〜423として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、アペリン部分が、配列番号419〜423のいずれか1つの配列、または配列番号419〜423のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む、SABA-APLN融合物を提供する。一定の実施形態では、SABA-APLN融合物が、配列番号424〜430のいずれか1つの配列、または配列番号424〜430のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：SABA-X1-APLNまたはAPLN-X1-SABA［式中、SABAは本明細書に記載するSABAポリペプチド（任意のN末端および/またはC末端伸長部を包含する）であり、X1はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号65〜88、216〜221または397のいずれか1つが包含される）であり、APLNは本明細書に記載するAPLNペプチドである］によって表すことができるSABA-APLN融合物を提供する。
15．他のAdnectin（商標）
一定の態様において、本願は、血清アルブミン（例えばHSA）以外のターゲット分子に結合する10Fn3ドメインに融合されて、SABA-10Fn3または10Fn3-SABA構成のAdnectin（商標）二量体融合分子をもたらしている、SABAを提供する。別の態様において、本願は、2つ以上の10Fn3ドメインに融合されて多量体を形成しているSABAを提供する。例えば、ある実施形態において、本願は、2つの10Fn3ドメイン、すなわち10Fn3aと10Fn3bとに融合されたSABAであって、各10Fn3aおよび10Fn3bが異なるターゲット分子に結合し、どちらも血清アルブミン（例えばHSA）には結合しないものを提供する。その結果生じるAdnectin（商標）三量体の構成は、SABA-10Fn3a-10Fn3b、10Fn3a-SABA-10Fn3b、または10Fn3a-10Fn3b-SABAであることができる。
例示的実施形態では、SABAが、配列番号1〜3のいずれか1つ、または配列番号1〜3のいずれか1つと少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む10Fn3ドメインに融合され、ここで、BC、DEおよびFGループはそれぞれ野生型BC、DEおよびFGループの配列と比較して修飾されており、かつ10Fn3ドメインは500μM未満のKDで（インテグリン以外の）ターゲットに結合する。10Fn3ドメインは、本明細書に記載するN末端および/またはC末端伸長部を、さらに含むことができる。一定の実施形態では、10Fn3ドメインが、本明細書に記載する治療部分であるターゲットに結合する。例示的実施形態では、追加の10Fn3ドメインを1つ含む融合物において、10Fn3ドメインがVEGFR2、TNFα、IGF1R、またはEGFRに結合する。例示的実施形態では、追加の10Fn3ドメインを2つ含む融合物において、10Fn3ドメインがVEGFR2およびIGF1RまたはEGFRおよびIGF1Rに結合する。
コンジュゲーション/リンカー
SABA融合物は共有結合で連結するか、非共有結合で連結することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーを介して、血清アルブミン結合性10Fn3を、異種分子に直接または間接的に連結することができる。SABAを目的のタンパク質に接合するための適切なリンカーは、別々のドメインが、互いに独立にフォールディングして、融合タンパク質のどちらのメンバーの機能も破壊しない三次元構造を形成することを可能にするものである。例示的リンカーを表2に配列番号65〜88、216〜221および397として掲載する。
この開示は、グリシン-セリンベースのリンカー、グリシン-プロリンベースのリンカー、ならびにアミノ酸配列PSTSTST（配列番号85）を有するリンカーなどといった、いくつかの適切なリンカーを提供する。いくつかの実施形態では、リンカーがグリシン-セリンベースのリンカーである。これらのリンカーはグリシン残基とセリン残基を含み、8〜50、10〜30、および10〜20アミノ酸長であることができる。例には、アミノ酸配列(GS)7（配列番号72）、G(GS)6（配列番号67）、およびG(GS)7G（配列番号69）を有するリンカーが包含される。別のリンカーはグルタミン酸を含有し、これには例えば、(GSE)5（配列番号74）およびGGSE GGSE（配列番号78）が包含される。別の例示的グリシン-セリンリンカーには、(GS)4（配列番号71）、(GGGGS)7（配列番号80）、(GGGGS)5（配列番号81）、および(GGGGS)3G（配列番号82）が包含される。いくつかの実施形態では、リンカーがグリシン-プロリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシン残基とプロリン残基を含み、3〜30、10〜30、および3〜20アミノ酸長であることができる。例には、アミノ酸配列(GP)3G（配列番号83）、(GP)5G（配列番号84）、およびGPGを有するリンカーが包含される。別の実施形態において、リンカーは、3〜30、10〜30、および3〜20アミノ酸の長さを有するプロリン-アラニンベースのリンカーであることができる。プロリンアラニンベースのリンカーの例には、例えば(PA)3（配列番号86）、(PA)6（配列番号87）および(PA)9（配列番号88）が包含される。最適なリンカーの長さとアミノ酸組成は、当技術分野において周知の方法による日常的な実験で決定することができると考えられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する融合物が、血中またはターゲット組織中のプロテアーゼによって切断されうるプロテアーゼ部位を有するポリペプチドリンカーを介してSABAに連結される。より良い送達特性もしくは治療特性のために、またはより効率的な生産のために、そのような実施形態を使って治療タンパク質を放出させることができる。
さらなるリンカーまたはスペーサーを、Fn3ドメインのC末端、Fn3ドメインとポリペプチドリンカーの間に導入してもよい。さらなるリンカーまたはスペーサーを、Fn3ドメインのN末端、Fn3ドメインとポリペプチドリンカーの間に導入してもよい。
いくつかの実施形態では、ポリマーリンカーを介して、治療部分をSABAに直接または間接的に連結することができる。ポリマーリンカーは、融合物の各構成要素間の距離を最適に変化させることで次に挙げる特徴の1つ以上を有するタンパク質融合物を作り出すために使用することができる：1）目的のタンパク質に結合するときの、1つ以上のタンパク質ドメインの結合の、減少または増加した立体障害、2）増加したタンパク質安定性または溶解度、3）減少したタンパク質凝集、および4）タンパク質の増加した総アビディティまたはアフィニティ。
いくつかの実施形態では、治療部分が、ポリマー糖などの生体適合性ポリマーを介してSABAに連結される。ポリマー糖は、血中またはターゲット組織中の酵素によって切断されうる酵素的切断部位を包含することができる。より良い送達特性もしくは治療特性のために、またはより効率的な生産のために、そのような実施形態を使って治療タンパク質を放出させることができる。
SABA-神経ペプチド融合物
一定の実施形態において、本願は、SABA-神経ペプチド融合物を提供する。例示的神経ペプチドには、例えばアミリン、PYYおよびPPが包含される。SABA-神経ペプチド融合物は、ポリペプチド融合物として構築するか、化学的に誘導されたスペーサーを介して連結されたコンジュゲートとして構築することができる。ある実施形態では、SABA-神経ペプチド融合物が、SABA、アミノ酸リンカー、および神経ペプチドを含むポリペプチド融合物である。多くの神経ペプチドはC末端がアミド化されているので、融合タンパク質の例示的配置は、N末端からC末端に向かって、SABA、アミノ酸リンカー、および神経ペプチドである。もう一つの実施形態では、SABA-神経ペプチド融合物が、SABAを神経ペプチドに連結する化学的に誘導されたスペーサーを含有する。SABA-神経ペプチドコンジュゲートの例示的配置は、次のとおりである：（1）SABA-Cys-化学的に誘導されたスペーサー-神経ペプチド、または（2）SABA-アミノ酸リンカー-Cys-化学的に誘導されたスペーサー-神経ペプチド。本明細書においてさらに説明するように、SABA-神経ペプチド融合物は、微生物または哺乳動物細胞などの宿主細胞内で生産することができる。化学的に誘導されたスペーサーによって連結されたSABA-神経ペプチド融合物のペプチド構成要素は、宿主細胞によって、もしくは化学合成によって、またはそれらの組合せによって、生産することができる。例示的実施形態では、化学的に誘導されたスペーサーによって連結されたSABA-神経ペプチド融合物が、宿主細胞（例えば大腸菌（E. coli））中で生産されたSABAと、化学合成によって生産された神経ペプチドとから組み立てられる。SABA-神経ペプチド融合物の生産に関するさらなる詳細を以下に記載すると共に、実施例にも記載する。
多くの神経ペプチドは、その生物学的活性にとって重要なC末端α-アミド基を含有する。例えばアミリン、PYYおよびPPペプチドは全て、C末端アミド化されている。哺乳動物細胞では、αアミド化が、ペプチジルグリシン基質のα-アミド化生成物への転化を触媒する二機能性酵素であるペプチジル-グリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼ（PAM）によってプロセシングされうる。
C末端アミド化ペプチドを生産するための技法は種々存在する。例えば、ペプチド前駆体（C末端-グリシンもしくは-グリシン-リジン-アルギニンまたは他の伸長部を伴うもの）を、精製PAM酵素により、インビトロでプロセシングすることができる。PAMと、PAMを使ってC末端アミド化ペプチドを生産するための方法は、当業者には知られている。例えばUS4,708,934、US5,789,234およびUS6,319,685を参照されたい。C末端アミド化は、内在性PAMを発現する哺乳類発現系でも達成することができる。融合タンパク質は、-グリシンまたは-グリシン-リジン-アルギニン配列によって伸長された前駆体分子として発現させることができる。真核細胞（例えばCHO、NIH 3T3およびBHK）において分泌タンパク質として発現させた場合、そのタンパク質は内在性PAM酵素によって切断されて、C末端カルボキシアミドをもたらしうる。例えばEndocrinology (1991) V129:553-555 (1991)；およびMolecular and Cellular Endocrinology 91:135-141 (1993)を参照されたい。C末端アミド化は、ヒトPAMが同時発現する哺乳類発現系において達成することもできる。例えばChinese Journal of Biotechnology (2002) v18:20-24 (2002)を参照されたい。
インビトロでのPAM酵素によるCOOHのCONH2への転化の他に、目的のタンパク質上のカルボキサミド末端は、メリフィールド合成を使って作り出すこともできる。メリフィールド合成では、メリフィールド合成プロセス中に、ペプチドのN末端にマレイミド部分を取り付けることが可能である。このマレイミド部分は、2つのポリペプチドドメインの間に置かれたスペーサーとして役立ちうるさまざまな非アミノ酸部分を使って、（例えばSABAとカルボキシアミド化神経ペプチドなどといった）2つのアミノ酸配列間でのコンジュゲートを作り出すことを可能にする。スペーサーとして使用することができる適切な非アミノ酸部分の例を下記の表1に示す。マレイミドコンジュゲーション反応の利点は、タンパク質上で容易に行うことができ、タンパク質分子にとって好ましい穏やかな条件下で高い収率を与え、高度に特異的で、副生成物をほとんど伴わないことである。
［表1］N末端にマレイミド部分を有するペプチドにSABA分子をコンジュゲートするためのリンカー/スペーサーの実例
Figure 2013531477
いくつかの実施形態では、ペプチドのマレイミド誘導体（典型的にはペプチドのN末端にマレイミド基を持つもの）への、SABAのC末端Cysのスルフヒドリル基のマイケル付加反応で、安定なチオエーテル結合を得ることにより、本明細書に記載するC末端アミド化合成ペプチドを、C末端Cys残基を含有するSABAと、溶液中でコンジュゲートすることができる。同じコンジュゲーションを、ペプチドのハロアルキル誘導体（例えばブロモ酢酸またはヨード酢酸を使ったアシル化によってペプチド上に導入されたブロモメチル基またはヨードメチル基）による、SABAのCysスルフヒドリルのアルキル化によって達成することもできる。このタイプのペプチド-タンパク質コンジュゲーションは、例えばG.T. Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press（カリフォルニア州サンディエゴ, 1996）に記載されているようなバイオコンジュゲーション法など、いくつかの異なる方法を使って達成できることは、当業者であればわかるであろう。
もう一つの実施形態では、中性リンカーまたはスペーサーを、ペプチド上のチオール反応性基と、ネイティブまたは変性ペプチド配列との間に置く。リンカーまたはスペーサーは、立体障害の低下をもたらし、ペプチドの、そのコグネイト受容体またはタンパク質パートナーへの結合を容易にしうる。適切なリンカーには、表1に記載するリンカーが包含されるが、これらに限るわけではない。チオール反応性マレイミドまたはヨードアセチル基を有するリンカー8〜11が示されており、これらは、当技術分野において記載されている対応N-スクシンイミジル活性エステルを使って、ペプチドにカップリングすることができる。
本明細書に記載するペプチドおよびペプチドアナログは、化学合成により、さまざまな固相技法、例えばG. BaranyおよびR.B.Merrifield「The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology」；Volume 2「Special Methods in Peptide Synthesis, Part A」pp.3-284（E.GrossおよびJ.Meienhofer編, Academic Press, ニューヨーク, 1980）；またはW.C.ChanおよびP.D.White「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach」Oxford University Press., 英国オックスフォード, 2000に記載されているものなどを使って作製することができる。ペプチド合成のための例示的戦略は、α-アミノ基を一時的に保護するためのFmoc（9-フルオレニルメチルメチルオキシカルボニル）基と、アミノ酸側鎖を一時的に保護するためのtert-ブチル基との組合せに基づく（例えば「The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology」中のE.AthertonおよびR.C.Sheppard「The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group」；Volume 9「Special Methods in Peptide Synthesis, Part C」pp.1-38（S.UndenfriendおよびJ.Meienhofer編, Academic Press, サンディエゴ, 1987）を参照されたい）。
ペプチドは、不溶性ポリマー支持体（「レジン」ともいう）上で、ペプチドのカルボキシ末端から出発して段階的に合成することができる。合成は、ペプチドのC末端アミノ酸をアミドまたはエステル結合の形成を介してレジンに添加することによって開始される。これにより、結果として生じたペプチドを最終的にそれぞれC末端アミドまたはカルボン酸として放出させることが可能になる。
C末端アミノ酸および合成に使用される他のアミノ酸は全て、好ましくは、合成中にα-アミノ保護基を選択的に除去することができるように、差異的に保護されたα-アミノ基と側鎖官能基（存在する場合）とを有する。アミノ酸のカップリングは、そのカルボキシル基を活性エステルとして活性化し、それを、レジンに添加されたN末端アミノ酸の、ブロックされていないα-アミノ基と反応させることによって行われる。α-アミノ基脱保護およびカップリングのサイクルを、ペプチド配列全体が組み立てられるまで繰り返す。次に、副反応を制限するために通常は適当なスカベンジャーの存在下で、ペプチドをレジンから切り離すと同時に、側鎖官能基を脱保護する。その結果得られたペプチドは、逆相分取用HPLCで精製することができる。
最終ペプチドへの前駆体として使用されるペプチジル-レジンの合成には、市販の架橋ポリスチレンポリマーレジン（Novabiochem、カリフォルニア州サンディエゴ）またはChemMatrix PEGポリマーレジン（PCAS BioMatrix、カナダ・ケベックシティー）を利用することができる。好ましい固形支持体には、例えば次に挙げるものが包含される：C末端カルボキサミド用の、4-(2',4'-ジメトキシフェニル-Fmoc-アミノメチル)-フェノキシアセチル-p-メチルベンズヒドリルアミンレジン（RinkアミドMBHAレジン）；9-Fmoc-アミノ-キサンテン-3-イルオキシ-メリフィールドレジン（Sieberアミドレジン）；4-(9-Fmoc)アミノメチル-3,5-ジメトキシフェノキシ)バレリル-アミノメチル-メリフィールドレジン（PALレジン）、および対応するChemMatrix PEGベースレジン。第1アミノ酸およびそれ以降のアミノ酸のカップリングは、DIC/HOBt、HBTU/HOBt、またはDIC/6-Cl-HOBtもしくはHCTU/6-Cl-HOBtからそれぞれ作製されるHOBtまたは6-Cl-HOBt活性エステルを使って達成することができる。
本明細書に記載するペプチドおよびペプチドアナログは、Libertyマイクロウェーブペプチドシンセサイザー（CEM Corp.、ノースカロライナ州マシューズ）などの自動ペプチド合成装置を使って行うことができる。実施例で述べるFmoc/t-ブチル保護戦略を使って、段階的固相ペプチド合成を行うことができる。いくつかの実施形態では、図21に示すFmocアミノ酸誘導体を使用することができる。
アミリン誘導体の場合、Acm保護Cys残基間のジスルフィド結合（例えばCys2,7またはCys1,7）は、レジン上でのヨウ素媒介参加によって形成させることができる（ChanおよびWhite, 2000）。各ペプチドのペプチジル-レジン前駆体は、任意の標準的手法を使って、切断し、脱保護することができる（例えばD.S.Kingら, Int. J. Peptide Protein Res. 36:255-266 (1990)）。いくつかの実施形態では、スカベンジャーとしての水、TISおよびフェノールの存在下で、TFAを使用する。典型的には、ペプチジル-レジンを、TFA/水/TIS（94：3：3，v：v：v；1mL/100mg-ペプチジルレジン）またはTFA/水/フェノール（90：5：5；v：v：w）中、室温で、2〜3時間撹拌する。次に、使用済みのレジンを濾去し、TFA溶液を減圧下で濃縮または乾燥する。その結果得られた粗ペプチドは、Et2Oで沈殿させ洗浄するか、あるいは分取用HPLCによる精製のためにDMSO、DMFまたは50％水性AcCNに直接再溶解することができる。
望ましい純度を有するペプチドは、例えば島津モデルLC-8A液体クロマトグラフでの分取用HPLCを使った精製によって得ることができる。例えば、粗ペプチドの溶液をPhenomenex Luna C18（5μm, 21.2×250mm）カラムに注入し、どちらも0.1％TFAで緩衝化した水中のMeCNの直線的勾配で、14〜20mL/分の流速を使って、220nmにおけるUV吸光度で流出液のモニタリングを行いながら溶出させることができる。精製されたペプチドの構造は、エレクトロスプレーLCMS分析によって確認することができる。例えば、ペプチド試料は、Waters Acquity超高速液体クロマトグラフ（UPLC）に接続されたWaters ZQ 2000シングル四重極質量分析計（マサチューセッツ州ミルフォード）でのLC/MSによって分析することができる。クロマトグラフィー分離は、2.1×50mm、1.7μm、300Å、Acquity BEH300 C18カラム（Waters、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して、0.8mL/分の勾配溶出で達成することができる。カラム温度は50℃にすることができる。移動相Aは、0.05％TFAを含む98：2 水：アセトニトリルにすることができ、移動相Bは、0.04％TFAを含むアセトニトリルにすることができる。直線的勾配は、1、2、または5分かけて2％の移動相Bから80％の移動相Bまで形成させることができる。2μLの注入を使用して、m/z 500からm/z 1500まで、またはm/z 1000からm/z 2000までのESI MSデータを取得することができる。機器はユニット分解能で稼働させることができる。
結合ポリペプチドの脱免疫化
血清アルブミン結合物質およびそれらの融合物のアミノ酸配列は、1つ以上のB細胞エピトープまたはT細胞エピトープを排除するために改変してもよい。本明細書に記載するSABA融合物などのタンパク質は、それを、所与の種に対して非免疫原性にするか、免疫原性を低下させるために、脱免疫化することができる。脱免疫化はタンパク質の構造改変によって達成することができる。当業者に知られている脱免疫化技法はどれでも使用することができる。例えばWO 00/34317（この文献の開示は引用によりそのまま本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ある実施形態では、血清アルブミン結合物質およびそれらの融合物の配列を、MHCクラスII結合モチーフの存在について分析することができる。例えば、MHC結合モチーフのデータベースとの比較を、例えばワールドワイドウェブサイトwehil.wehi.edu.au上の「モチーフ」データベースを検索することなどによって行うことができる。あるいは、MHCクラスII結合ペプチドを、コンピュータスレッディング（computational threading）法、例えばポリペプチド由来の連続するオーバーラッピングペプチドを、MHCクラスIIタンパク質への結合エネルギーについて調べる、Altuviaらが考案したものなど（J. Mol. Biol. 249 244-250 (1995)）を使って、同定することができる。コンピュータ結合予測アルゴリズムには、iTope（商標）、Tepitope、SYFPEITHI、EpiMatrix（EpiVax）、およびMHCpredが包含される。MHCクラスII結合ペプチドの同定を支援するために、うまく提示されるペプチドに関係する関連配列特徴、例えば両親媒性およびRothbardモチーフ、ならびにカテプシンBおよび他のプロセシング酵素の切断部位などを検索することができる。
潜在的（例えばヒト）T細胞エピトープが同定されたら、次に、T細胞エピトープを排除するのに必要な1つ以上のアミノ酸の改変を行うことによって、これらのエピトープを排除する。通常、これは、T細胞エピトープそのものの中の1つ以上のアミノ酸の改変を伴うであろう。これは、タンパク質の一次構造から見てエピトープに近接するアミノ酸、または一次構造では近接していないが、その分子の二次構造では近接しているものを改変することを伴いうる。考えられる通常の改変はアミノ酸置換であるだろうが、一定の状況では、アミノ酸の付加または欠失が適当である場合もありうる。全ての改変は、組換えDNA技術によって達成することができるので、最終的な分子は、組換え宿主からの発現により、例えば確立された方法によって調製することができるが、タンパク質化学または他の任意の分子改変手段も使用することができる。
同定されたT細胞エピトープを除去したら、新しいT細胞エピトープが作り出されていないことを保証し、新しいエピトープが作り出されている場合には、そのエピトープを欠失させることができるように、脱免疫化された配列を再び分析することができる。
計算上同定されたT細胞エピトープの全てを除去する必要はない。特定のエピトープの「強さ」、もっと正確に言えば潜在的免疫原性の重要性は、当業者には理解されるであろう。さまざまな計算方法によって潜在的エピトープに関するスコアが生成される。高スコアのエピトープだけを除去すればよい場合がありうることは、当業者にはわかるであろう。また、潜在的エピトープの除去とそのタンパク質の結合アフィニティまたは他の生物学的活性の維持との間にバランスがあることも、当業者にはわかるであろう。それゆえに、一つの戦略は、SABAまたはSABA融合タンパク質中に置換を逐次的に導入し、次に、ターゲット結合性または他の生物学的活性および免疫原性について調べることである。
ある態様において、脱免疫化されたSABAまたはSABA融合タンパク質は、ヒト対象において、元のタンパク質よりも免疫原性が低い（もっと正確に言えば、誘発されるHAMA応答が弱くなる）。免疫原性を決定するためのアッセイは、当業者にはよく知られている。当技術分野において認識されている、免疫応答を決定するための方法を実施することで、特定の対象における、または臨床試験中の、HAMA応答をモニタリングすることができる。脱免疫化されたタンパク質を投与した対象には、当該治療の施行の開始時および施行中のあらゆる時点で、免疫原性評価を加えることができる。HAMA応答は、例えば、対象から採取した血清試料中の、脱免疫化タンパク質に対する抗体を、表面プラズモン共鳴技術（BIAcore）および/または固相ELISA分析などといった当業者に知られている方法を使って検出することによって測定される。あるいは、T細胞活性化イベントを測定するために設計されたインビトロアッセイも、免疫原性を示す。
さらなる修飾
一定の実施形態において、血清アルブミン結合物質およびそれらの融合物は、さらに翻訳後修飾を含みうる。例示的翻訳後タンパク質修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、ADP-リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、SUMO化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が包含される。結果として、修飾された血清アルブミン結合物質およびそれらの融合物は、脂質、多糖または単糖、およびリン酸基などの非アミノ酸要素を含有しうる。好ましい形態のグリコシル化は、1つ以上のシアル酸部分がポリペプチドにコンジュゲートするシアリル化である。シアル酸部分は溶解性および血清中半減期を改善すると同時に、タンパク質の考えうる免疫原性も減少させる。例えばRajuら, Biochemistry. 2001 Jul 31;40(30):8868-76を参照されたい。そのような非アミノ酸要素が血清アルブミン結合物質またはそれらの融合物の機能性に及ぼす効果を、特定の血清アルブミン（例えばHSAまたはRhSA）に結合するそれらの能力に関して、および/または融合物の場合には具体的な非10Fn3部分によって付与される機能的役割（例えばFGF21がグルコース取り込みに及ぼす効果）に関して、調べることができる。
ベクターおよびポリヌクレオチドの実施形態
この開示には、本明細書に記載するタンパク質のいずれかをコードする核酸配列も包含される。当業者には理解されるように、第3塩基の縮重ゆえに、ほとんどすべてのアミノ酸は、コードしているヌクレオチド配列中で、2つ以上のトリプレットコドンによって表されうる。加えて、軽微な塩基対変化は、コードされるアミノ酸配列における保存的置換をもたらす場合もあるが、遺伝子産物の生物学的活性は実質的に改変させないと予想される。それゆえに、本明細書に記載するタンパク質をコードする核酸配列は、配列をわずかに修飾してもなお、それぞれの遺伝子産物をコードすることができる。血清アルブミン結合物質およびそれらの融合物をコードする一定の例示的核酸には、表3に示す配列を有する核酸が包含される。
本明細書に開示するさまざまなタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成することができる。細胞内での発現が改善されるようにコドン使用頻度を選択することができる。そのようなコドン使用頻度は選択した細胞タイプに依存するであろう。大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞に、それぞれ特化したコドン使用頻度パターンが開発されている。例えばMayfieldら, Proc Natl Acad Sci USA. 2003 100(2):438-42；Sinclairら, Protein Expr Purif. 2002 (1):96-105；Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001 (5):446-9；Makridesら, Microbiol Rev. 1996 60(3):512-38；およびSharpら, Yeast. 1991 7(7):657-78を参照されたい。
核酸操作のための一般技法は当業者の知るところであり、例えばSambrookら「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第1〜3巻（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版, 1989）またはF. Ausubelら「Current Protocols in Molecular Biology」（Green Publishing and Wiley-Interscience：ニューヨーク、198）とその定期改訂版にも記載されており、これらは引用により本明細書に組み込まれる。タンパク質をコードするDNAは、哺乳動物遺伝子、ウイルス遺伝子または昆虫遺伝子に由来する適切な転写または翻訳調節要素に作動的に連結される。そのような調節要素には、転写プロモーター、転写を制御するための随意のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が包含される。宿主中で複製する能力（通常は複製起点によって付与される）および形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子が、さらに組み込まれる。適切な調節要素は当技術分野ではよく知られている。
本明細書に記載するタンパク質および融合タンパク質は、異種ポリペプチド（好ましくはシグナル配列であるか、成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドであるもの）との融合タンパク質として作製することができる。好ましく選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識されプロセシングされる（すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。ネイティブシグナル配列を認識しプロセシングしない原核宿主細胞の場合は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、または耐熱性エンテロトキシンIIリーダーの群などから選択される原核生物シグナル配列で、シグナル配列を置換する。酵母分泌のためには、ネイティブシグナル配列を、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス（Saccharomyces）およびクリベロミセス（Kluyveromyces）のα因子リーダーを包含する）、または酸性ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）グルコアミラーゼリーダー、またはPCT公開番号WO 90/13646に記載のシグナルで置換することができる。哺乳動物細胞発現においては、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルを利用することができる。そのような前駆体領域のDNAは、タンパク質をコードするDNAに読み枠を合わせてライゲートすることができる。
真核宿主細胞（例えば酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結およびmRNAの安定化に必要な配列も含有するであろう。そのような配列は、一般に、真核生物またはウイルスのDNAまたはcDNAの5'非翻訳領域、また時には3'非翻訳領域から、入手することができる。これらの領域は、多価抗体をコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。有用な転写終結構成要素の一つは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。PCT公開番号WO 94/11026とそこに開示されている発現ベクターを参照されたい。
組換えDNAは、タンパク質の生成に役立ちうる任意のタイプのタンパク質タグ配列も包含することができる。タンパク質タグの例には、ヒスチジンタグ、FLAGタグ、mycタグ、HAタグ、またはGSTタグが包含されるが、これらに限るわけではない。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、「Cloning Vectors: A Laboratory Manual」（Elsevier, ニューヨーク, 1985）に見いだすことができ、この文献の関連する開示は引用により本明細書に組み込まれる。
発現コンストラクトは、当業者には明白であるだろうように、その宿主細胞に適した方法を使って、宿主細胞に導入される。エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；および感染（この場合、ベクターは感染性因子である）など（ただしこれらに限るわけではない）、宿主細胞中に核酸を導入するためのさまざまな方法が、当技術分野では知られている。
適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞が包含される。適切な細菌には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス属（Bacillus spp.）が包含される。酵母、好ましくは、サッカロミセス属の酵母、例えばサッカロミセス・セレビシア（S. cerevisiae）なども、ポリペプチドの生産に使用することができる。さまざまな哺乳動物細胞培養系または昆虫細胞培養系も、組換えタンパク質を発現させるために使用することができる。昆虫細胞中で異種タンパク質を生産するためのバキュロウイルス系については、LuckowおよびSummersによる総説（Bio/Technology, 6:47, 1988）がある。いくつかの例では、例えばグリコシル化のために、脊椎動物細胞においてタンパク質を生産することが望ましいであろうが、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、既に日常的な手法になっている。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、内皮細胞、COS-7サル腎臓細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、ヒト胎児腎臓細胞、HeLa、293、293T、およびBHK細胞株が包含される。多くの応用では、本明細書に記載するタンパク質多量体のサイズが小さいことから、大腸菌が好ましい発現方法になるであろう。
タンパク質生産
宿主細胞は、タンパク質生産のために、本明細書に記載する発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択肢、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適宜、変更が加えられた従来の栄養培地において培養される。
本発明のタンパク質を生産するために使用される宿主細胞は、さまざまな培地中で培養することができる。ハムF10（Sigma）、最小必須培地（（MEM），Sigma）、RPMI-1640（Sigma）、およびダルベッコ変法イーグル培地（（DMEM），Sigma）などの市販培地は、宿主細胞を培養するのに適している。加えて、Hamら, Meth. Enz. 58:44 (1979)、 Barnesら, Anal. Biochem.102:255 (1980)、米国特許第4,767,704号；同第4,657,866号；同第4,927,762号；同第4,560,655号；または同第5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；または米国再発行特許発明第30,985号に記載された培地はどれでも、宿主細胞用の培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモンおよび/または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、バッファー（HEPESなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬など）、微量元素（通常はマイクロモル濃度域の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは等価なエネルギー源を補足することができる。他の必要な補足物も、当業者には知られているであろう適当な濃度で含めることができる。例えば温度、pHその他の培養条件は、発現用に選択した宿主細胞で以前使用されたものであり、当業者には明白であるだろう。
本明細書に開示するタンパク質は、細胞翻訳系を使って生産することもできる。そのような目的には、インビトロ転写によるmRNAの生産が可能になるように、そしてまた、利用するその無細胞系におけるmRNAの無細胞翻訳が可能になるように、タンパク質をコードする核酸を修飾しなければならない。例示的真核生物無細胞翻訳系には、例えば哺乳動物または酵母無細胞翻訳系が包含され、例示的原核生物無細胞翻訳系には、例えば細菌無細胞翻訳系が包含される。
本明細書に開示するタンパク質は、化学合成によって（例えば「Solid Phase Peptide Synthesis」（第2版，1984，The Pierce Chemical Co.，イリノイ州ロックフォード）に記載の方法によって）生産することもできる。タンパク質への修飾も化学合成によって加えることができる。
本明細書に開示するタンパク質は、タンパク質化学の分野において広く知られているタンパク質の単離/精製法によって精製することができる。非限定的な例には、抽出、再結晶、塩析（例えば硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウム）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配法またはこれらの任意の組合せが包含される。精製後に、濾過および透析などといった（ただしこれらに限るわけではない）当技術分野において知られているさまざまな方法のいずれかによって、タンパク質を異なるバッファーへと交換し、かつ/または濃縮することができる。
精製されたタンパク質は、好ましくは、少なくとも85％の純度、より好ましくは少なくとも95％の純度、最も好ましくは少なくとも98％の純度を有する。純度の正確な数値がどうであれ、タンパク質は、医薬製品としての使用にとっては、十分に純粋である。
イメージング、診断および他の応用
ここに提供するSABA融合物は、SABAに融合された異種分子の実体に基づいて、さまざまな疾患および障害を処置するために使用することができる。当業者は、当技術分野における知識および本明細書に記載する情報に基づいて、SABA融合物の応用を決定することができる。さまざまなSABA融合タンパク質の使用を本明細書において詳述する。SABA融合物は、ヒトとヒト以外の生物の両方を包含する任意の哺乳動物対象または患者に投与することができる。
本明細書に記載する血清アルブミン結合物質および融合分子は、検出可能に標識することができ、イメージング応用または診断応用のために、例えばその融合分子によって結合されるタンパク質を発現する細胞と接触させる目的で使用することができる。タンパク質を検出可能部分にコンジュゲートするための当技術分野において知られる方法は、Hunterら, Nature 144:945 (1962)；Davidら, Biochemistry 13:1014 (1974)；Painら, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981)；およびNygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)に記載されている方法を含めて、どれでも使用することができる。
一定の実施形態では、本明細書に記載する血清アルブミン結合物質および融合分子を、さらに、検出することができるラベルに取り付ける（例えば、ラベルは、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であることができる）。ラベルは、放射性物質、例えば鉄キレート化合物などの放射性重金属、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート化合物、酸素、窒素、鉄、炭素、またはガリウムの陽電子放出体、43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、123I、125I、131I、132I、または99Tcであることができる。そのような部分に付加された血清アルブミン結合物質または融合分子は、イメージング剤として使用することができ、ヒトなどの哺乳動物における診断的使用のために有効量で投与された後、イメージング剤の局在化および蓄積が検出される。イメージング剤の局在化および蓄積は、ラジオシンチグラフィ、核磁気共鳴イメージング、コンピュータ断層撮影法または陽電子放射断層撮影法によって検出することができる。当業者には明らかであるだろうように、投与すべき放射性同位体の量は放射性同位体に依存する。当業者であれば、投与すべきイメージング剤の量を、放射能部分として使用される所与の放射性核種の比放射能およびエネルギーに基づいて、容易に処方することができる。
血清アルブミン結合物質および融合分子は、アフィニティ精製剤としても有用である。このプロセスでは、当技術分野において周知の方法を使って、Sephadex樹脂または濾紙などの適切な支持体上にタンパク質が固定化される。タンパク質は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどといった、任意の既知アッセイ法で使用することができる（Zola「Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques」pp.147-158（CRC Press, Inc., 1987））。
SABA-FGF21融合物の例示的使用
ここに提供するSABA-FGF21融合物は、下記の1つ以上の処置または防止に使用することができる：糖尿病、高血糖、耐糖能異常、妊娠糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、網膜症、ニューロパシー、ネフロパシー、創傷治癒、アテローム性動脈硬化およびその続発症（急性冠症候群、心筋梗塞、狭心症、末梢血管疾患、間欠性跛行、心筋虚血、脳卒中、心不全）、メタボリック症候群、高血圧、肥満、異常脂質血症、高脂質血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、低HDL、高LDL、血管再狭窄、末梢動脈疾患、脂質障害、骨疾患（骨粗鬆症を包含する）、PCOS、HIVプロテアーゼ関連リポジストロフィー、緑内障および炎症性疾患、例えば乾癬、関節リウマチおよび変形性関節症、ならびに糖尿病、リポジストロフィーおよび骨粗鬆症に関係するコルチコステロイド処置による副作用の処置。一定の実施形態において、ここに提供するSABA-FGF21融合物は、対象において、肥満を処置または防止するため、体重を減少させるため、または体重増加を防止するために使用することができる。例示的一実施形態では、25〜29.9のBMIを有する対象において、体重を減少させるためまたは体重増加を防止するために、SABA-FGF21融合物を使用することができる。もう一つの例示的実施形態では、≧30のBMIを有する対象において、体重を減少させるためまたは体重増加を防止するために、SABA-FGF21融合物を使用することができる。もう一つの実施形態では、≧200mg/dLの総コレステロールレベルおよび/または≧150mg/dLのトリグリセリドレベルを有する対象を処置するために、SABA-FGF21融合物を使用することができる。別の実施形態では、インスリン抵抗性を処置または低下させ、かつ/または脂肪組織におけるグルコース取り込みを増加させるために、SABA-FGF21融合物を使用することができる。別の実施形態では、前糖尿病対象における糖尿病の進行を遅らせるために、SABA-FGF21融合物を使用することができる。別の実施形態では、対象における血中グルコースレベルを低下させ、トリグリセリドレベルを低下させ、コレステロールレベルを低下させ、エネルギー消費を増加させ、脂肪利用を増加させ、かつ/または脂質排出を増加させるために、SABA-FGF21融合物を使用することができる。
本明細書にいう疾患または障害を「防止する」とは、無処置対照サンプルと比較して、統計サンプルにおける疾患状態の発生の確率を低下させること、または無処置対照サンプルと比較して、その疾患または障害の1つ以上の症状の発生を遅延させるか、前記症状の重篤度を低減することを指す。患者は、一般集団と比べて臨床的疾患状態を患うリスクを増加させることが知られている要因に基づいて、予防的治療のために選択することができる。本明細書において使用する「処置する」という用語は、（a）疾患状態を阻害すること、すなわちその発達を阻むこと；および/または（b）疾患状態を緩和すること、すなわち疾患状態が樹立された時にその退縮を引き起こすことを包含する。
一定の実施形態において、本願は、活性成分として治療有効量のSABA-FGF21融合物を、単独で、または医薬担体と組み合わせて含む、医薬組成物を提供する。場合により、SABA-FGF21融合物は、単独で使用するか、本明細書に記載する他の融合物と組み合わせて、または1つ以上の他の治療剤、例えば抗糖尿病剤もしくは他の医薬活性物質と組み合わせて使用することができる。
一定の実施形態では、SABA-FGF21融合物を、単独で、または1つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与することができる。「組み合わせて投与」または「併用療法」とは、SABA-FGF21融合物と1つ以上のさらなる治療剤とが、処置される哺乳動物に並行して投与されることを意味する。組み合わせて投与される場合、各構成要素は同時に投与されてもよいし、異なる時点において任意の順序で逐次的に投与されてもよい。したがって各構成要素は、別々に、ただし所望の治療効果が得られるように十分に近い時間間隔で、投与することができる。
ここに提供するSABA-FGF21融合物は、抗糖尿病剤、抗高血糖剤、抗高インスリン血症剤、抗網膜症剤、抗ニューロパシー剤、抗ネフロパシー剤、抗アテローム性動脈硬化剤、抗虚血剤、抗高血圧剤、抗肥満剤、抗異常脂質血症剤、抗異常脂質血症剤、抗高脂血症剤、抗高トリグリセリド血症剤、抗高コレステロール血症剤、抗再狭窄剤、抗膵臓剤（anti-pancreatic agent）、脂質低下剤、食欲抑制剤、記憶増強剤、抗認知症剤、または認知促進剤、食欲抑制剤、心不全のための処置、末梢動脈疾患のための処置、および抗炎症剤と組み合わせて使用することができる。
SABA-FGF21融合物と組み合わせて使用される抗糖尿病剤には、インスリン分泌促進物質またはインスリン抵抗性改善薬、GPR40受容体調整物質、または他の抗糖尿病剤が包含されるが、これらに限るわけではない。これらの薬剤には、ジペプチジルペプチダーゼIV（DP4）阻害剤（例えばシタグリプチン、サクサグリプチン、アログリプチン、ビルダグリプチンなど）、ビグアニド剤（例えばメトホルミン、フェンホルミンなど）、スルホニル尿素剤（例えばグリブリド（gliburide）、グリメピリド、グリピジドなど）、グルコシダーゼ阻害剤（例えばアカルボース、ミグリトール、など）、チアゾリジンジオン類などのPPARγアゴニスト（例えばロシグリタゾン、ピオグリタゾンなど）、PPARα/γ二重アゴニスト（例えばムラグリタザル、テサグリタザル、アレグリタザルなど）、グルコキナーゼ活性化因子（引用により本明細書に組み込まれるFyfe,M.C.T.ら, Drugs of the Future, 34(8):641-653 (2009)に記載されているもの）、GPR119受容体調整物質（MBX-2952、PSN821、APD597など）、SGLT2阻害剤（ダパグリフロジン、カナグリフロジン、レマグリフロジン（remagliflozin）など）、プラムリンチドなどのアミリンアナログ、および/またはインスリンが包含されるが、これらに限るわけではない。糖尿病を処置するための現在の治療法および注目を集めつつある治療法に関する総説は、Mohler,M.L.ら, Medicinal Research Reviews, 29(1):125-195 (2009)、およびMizuno,C.S.ら, Current Medicinal Chemistry, 15:61-74 (2008)に見いだすことができる。
SABA-FGF21融合物は、場合により、1つ以上の食欲減退剤、例えばジエチルプロピオン、フェンジメトラジン、フェンテルミン、オルリスタット、シブトラミン、ロルカセリン、プラムリンチド、トピラマート、MCHR1受容体アンタゴニスト、オキシントモジュリン、ナルトレキソン、アミリンペプチド、NPY Y5受容体調整物質、NPY Y2受容体調整物質、NPY Y4受容体調整物質、セチリスタット、5HT2c受容体調整物質などと組み合わせて使用することもできる。SABA-FGF21融合物は、注射によって投与するか、鼻腔内に投与するか、経皮デバイスまたはバッカルデバイスによって投与することができるグルカゴン様ペプチド-1受容体（GLP-1 R）のアゴニスト、例えばエクセナチド、リラグルチド、GPR-1(1-36)アミド、GLP-1(7-36)アミド、GLP-1(7-37)（Habenerの米国特許第5,614,492号に開示されているもの；この特許文献の開示は引用により本明細書に組み込まれる）などと組み合わせて使用することもできる。肥満を処置するための現在の治療法および注目を集めつつある治療法に関する総説は、Melnikova, I.ら, Nature Reviews Drug Discovery, 5:369-370 (2006)；Jones, D., Nature Reviews: Drug Discovery, 8:833-834 (2009)；Obici, S., Endocrinology, 150(6):2512-2517 (2009)；およびElangbam, C.S., Vet. Pathol., 46(1):10-24 (2009)に見いだすことができる。
一定の実施形態では、SABA-FGF21融合物が、約10ng〜20mg、10ng〜5mg、10ng〜2mg、10ng〜1mg、100ng〜20mg、100ng〜5mg、100ng〜2mg、100ng〜1mg、1μg〜20mg、1μg〜5mg、1μg〜2mg、1μg〜1mg、10μg〜20mg、10μg〜5mg、10μg〜2mg、10μg〜1mg、0.01〜20mg、0.01〜10mg、0.1〜20mg、0.1〜10mg、0.01〜5mg、0.1〜5mg、もしくは0.7〜5mg、または約10ng、100ng、1μg、10μg、100μg、または約1、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10mgの用量で投与される。一定の実施形態では、SABA-FGF21融合物が、約100pg/kg〜200μg/kg、100pg/kg〜50μg/kg、100pg/kg〜20μg/kg、100pg/kg〜10μg/kg、1ng/kg〜200μg/kg、1ng/kg〜50μg/kg、1ng/kg〜20μg/kg、1ng/kg〜10μg/kg、10ng/kg〜200μg/kg、10ng/kg〜50μg/kg、10ng/kg〜20μg/kg、10ng/kg〜10μg/kg、100ng/kg〜200μg/kg、100ng/kg〜50μg/kg、100ng/kg〜20μg/kg、100ng/kg〜10μg/kg、0.1〜200μg/kg、0.1〜100μg/kg、1〜200μg/kg、1〜100μg/kg、0.1〜50μg/kg、1〜50μg/kg、もしくは7〜50μg/kg、または約100pg/kg、1ng/kg、10ng/kg、100ng/kg、または1、2、5、10、20、25、30、40、50、60、75、100、125、150、200もしくは250μg/kgの用量で投与される。SABA-FGF21融合物は毎日（例えば毎日1回、2回、3回、または4回）与えてもよいし、それより低い頻度で（例えば2日に1回、週または月に1回または2回）与えてもよい。例示的実施形態では、SABA-FGF21融合物が、1週間あたり約0.01〜20mg、約0.01〜10mg、約0.1〜20mg、約0.1〜10mg、約0.01〜5mg、約0.1〜5mg、もしくは約0.7〜5mg、または約1、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10mgの用量で投与される。例示的実施形態では、SABA-FGF21融合物が、1週間あたり約0.1〜200μg/kg、約0.1〜100μg/kg、約1〜200μg/kg、約1〜100μg/kg、約0.1〜50μg/kg、約1〜50μg/kg、もしくは約7〜50μg/kg、または約1、2、5、10、20、25、30、40、50、60、75、100、125、150、200もしくは250μg/kgの用量で投与される。例示的実施形態では、SABA-FGF21融合物が、1日あたり約10ng〜20mg、約10ng〜5mg、約10ng〜2mg、約10ng〜1mg、約10ng〜500μg、約10ng〜200μg、約100ng〜20mg、約100ng〜5mg、約100ng〜2mg、約100ng〜1mg、約100ng〜500μg、約100ng〜200μg、約1μg〜20mg、約1μg〜5mg、約1μg〜2mg、約1μg〜1mg、約1μg〜500μg、約1μg〜200μg、約10μg〜20mg、約10μg〜5mg、約10μg〜2mg、約10μg〜1mg、約10μg〜500μg、約10μg〜200μg、または約10ng、100ng、1μg、10μg、100μg、200μg、500μg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、もしくは5mgの用量で投与される。例示的実施形態では、SABA-FGF21融合物が、1日あたり約100pg/kg〜200μg/kg、約100pg/kg〜50μg/kg、約100pg/kg〜20μg/kg、約100pg/kg〜5μg/kg、約100pg/kg〜2μg/kg、約1ng/kg〜200μg/kg、約1ng/kg〜50μg/kg、約1ng/kg〜20μg/kg、約1ng/kg〜5μg/kg、約1ng/kg〜2μg/kg、約10ng/kg〜200μg/kg、約10ng/kg〜50μg/kg、約10ng/kg〜20μg/kg、約10ng/kg〜5μg/kg、約10ng/kg〜2μg/kg、約100ng/kg〜200μg/kg、約100ng/kg〜50μg/kg、約100ng/kg〜20μg/kg、約100ng/kg〜5μg/kg、約100ng/kg〜2μg/kg、約1μg/kg〜200μg/kg、約1μg/kg〜50μg/kg、約1μg/kg〜20μg/kg、約1μg/kg〜5μg/kg、約1μg/kg〜2μg/kg、約10μg/kg〜200μg/kg、約10μg/kg〜50μg/kg、もしくは約10μg/kg〜20μg/kg、または約100pg/kg、1ng/kg、10ng/kg、100ng/kg、500ng/kg、1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、100μg/kgもしくは200μg/kgの用量で投与される。加えて、当技術分野では知られているとおり、年齢ならびに体重、全身の健康状態、性別、食餌、投与の時間、薬物相互作用、および疾患の重症度に合わせた調節が必要であるだろうが、当業者は、それらを日常的な実験で確かめることができるであろう。
治療用製剤および投与様式
本願は、SABAに融合された治療部分を投与するための方法であって、SABAに融合されると治療部分の半減期が延長される方法を提供する。融合コンストラクトを投与するための技法および投薬量は、SABAに融合される治療部分のタイプおよび処置される具体的状態に依存して変動するであろうが、当業者であればすぐに決定することができる。一般に、規制当局は、治療薬として使用されるタンパク質試薬については、含まれる発熱性物質のレベルが許容される程度に低くなるように製剤化されることを要求する。したがって、治療用製剤は一般に、それらが実質的に発熱性物質を含まないという点で、または少なくとも、適当な規制当局（例えばFDA）によって決定される許容されるレベルを超える発熱性物質を含有しないという点で、他の製剤とは区別されるであろう。一定の実施形態では、SABAおよびそれらの融合分子の医薬製剤が、例えばpH4.0〜7.0で、1〜20mMコハク酸、2〜10％ソルビトール、および1〜10％グリシンを含む。例示的一実施形態では、SABAおよびそれらの融合分子の医薬製剤が、例えばpH6.0で、10mMコハク酸、8％ソルビトール、および5％グリシンを含む。
いくつかの実施形態では、SABAおよびその融合物が、哺乳動物、特にヒトにとって、医薬上許容される。「医薬上許容される」ポリペプチドとは、動物に投与しても際立った有害な医学的結果を伴わないポリペプチドを指す。医薬上許容されるSABAおよびその融合物の例には、本質的にエンドトキシンを含まないか、極めて低いエンドトキシンレベルしか持たない、インテグリン結合ドメイン（RGD）を欠く10Fn3ドメイン、およびSABAまたはSABA融合物の組成物が包含される。
治療用組成物は、医薬上許容される希釈剤、担体、または賦形剤と共に、単位剤形で投与することができる。投与は、非限定的な例として、非経口（例えば静脈内、皮下）投与、経口投与、または局所外用投与であることができる。組成物は、経口投与用の丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤、または徐放性錠剤；静脈内、皮下または非経口投与用の液剤；または局所外用投与のためのゲル剤、ローション剤、軟膏、クリーム剤、またはポリマーもしくは他の徐放性媒体の形態をとることができる。
製剤を製造するための当技術分野において周知の方法は、例えば「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」（第20版、A.R.Gennaro AR.編、2000、Lippincott Williams & Wilkins、ペンシルベニア州フィラデルフィア）に見いだされる。非経口投与用の製剤は、例えば賦形剤、滅菌水、食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、または水素化ナフタレン（hydrogenated napthalenes）を含有しうる。化合物の放出を制御するために、生体適合性生分解性ラクチドポリマー、ラクチド/グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマーを使用することができる。化合物の体内分布を制御するためにナノ粒子状製剤（例えば生分解性ナノ粒子、固形脂質ナノ粒子、リポソーム）を使用することができる。他の潜在的に有用な非経口送達システムには、エチレン-酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、植え込み型注入システム、およびリポソームが包含される。製剤中の化合物の濃度は、投与すべき薬物の投薬量や投与経路などといった、いくつかの要因に依存して変動する。
ポリペプチドは、場合により、医薬上許容される塩、例えば無毒性酸付加塩として、または医薬品業界においてよく使用される金属錯体として投与することができる。酸付加塩の例には、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはトリフルオロ酢酸などの有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどのポリマー酸；および塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸が包含される。金属錯体には、亜鉛、鉄などが包含される。ある例では、ポリペプチドが、熱安定性を増加させるために酢酸ナトリウムの存在下で製剤化される。
経口使用のための製剤には、無毒性の医薬上許容される賦形剤と混合された活性成分を含有する錠剤が包含される。これらの賦形剤は、例えば不活性希釈剤または充填剤（例えばスクロースおよびソルビトール）、潤滑剤、流動促進剤、および粘着防止剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油、またはタルク）であることができる。
経口使用のための製剤は、咀嚼錠として、または活性成分が不活性固形希釈剤と混合されている硬ゼラチンカプセル剤として、または活性成分が水または油性媒質と混合されている軟ゼラチンカプセル剤として提供することもできる。
治療有効量とは、その投与の目的である治療効果をもたらす用量を指す。正確な用量は処置される障害に依存するであろうが、当業者であれば、既知の技法を使って確かめることができる。一般に、SABAまたはSABA融合物は、1日あたり約0.01μg/kg〜約50mg/kg、好ましくは1日あたり0.01mg/kg〜約30mg/kg、最も好ましくは1日あたり0.1mg/kg〜約20mg/kgの用量で投与される。ポリペプチドは、毎日（例えば毎日1回、2回、3回、または4回）与えてもよいし、それより低い頻度で（例えば2日に1回、週または月に1回または2回）与えてもよい。加えて、当技術分野では知られているとおり、年齢ならびに体重、全身の健康状態、性別、食餌、投与の時間、薬物相互作用、および疾患の重症度に合わせた調節が必要になりうるが、当業者は、それらを日常的な実験で確かめることができるであろう。
例示
ここに概説した発明は、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろうが、これらは、本発明の一定の態様および実施形態を例証するために記載するに過ぎず、決して本発明の限定を意図するものではない。
配列の要約
本願において言及する配列の多くを以下の表2に要約する。別段の指定がある場合を除き、全てのN末端伸長部を一重下線で示し、全てのC末端テール/伸長部を二重下線で示し、リンカー配列を四角い枠で囲む。各コアSABA配列についてはループ領域BC、DEおよびFGに影を付ける。
［表2］例示的配列の要約
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［表3］一定の例示的核酸配列（配列番号176〜214および397〜407）
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A．血清アルブミン結合性Adnectin（商標）（SABA）
実施例A1．候補血清アルブミン結合性Adnectin（商標）のスクリーニングと選択
概略
PROfusionと呼ばれる選択技法（例えばRobertsおよびSzostak, Proc Natl Acad Sci USA. 94(23):12297-302, 1997ならびにWO 2008/066752を参照されたい）を、10Fn3のBC、DEおよびFGループにデザインされた可変領域を有するDNAライブラリーに応用した。1013を越える分子のランダムライブラリーをこのデザインから作り出し、ビオチン化型のHSAに対して選択圧をかけることで、所望の結合特性を有する候補血清アルブミン結合性Adnectin（商標）（SABA）を単離した。
高スループットタンパク質生産（HTTP）プロセス
高スループットタンパク質生産プロセス（HTPP）を使ってさまざまなHSA結合性Adnectins（商標）を精製した。選ばれた結合物質を、HIS6タグを含有するpET9dベクター中にクローニングし、大腸菌BL21(DE3)pLysS細胞に形質転換した。形質転換された細胞を、50μg/mLカナマイシンを含有するLB培地5mlに、24ウェルフォーマットで接種し、37℃で終夜成長させた。終夜培養物から200μlを吸引し、それを適当なウェルに吐出することによって、誘導発現用に、新鮮な5mL LB培地（50μg/mLカナマイシン）培養を調製した。培養をA6000.6〜0.9まで37℃で成長させた。1mMイソプロピル-β-チオガラクトシド（IPTG）による誘導後に、培養を30℃でさらに4時間成長させ、4℃、3220×gで10分間の遠心分離によって収穫した。細胞ペレットを−80℃で凍結した。
450μlの溶解バッファー（50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、1×Complete（商標）プロテアーゼインヒビターカクテル-EDTAフリー（Roche）、1mM PMSF、10mM CHAPS、40mMイミダゾール、1mg/mlリゾチーム、30μg/ml DNAse、2μg/mlアプロトニン（aprotonin）、pH8.0）に再懸濁することによって細胞ペレット（24ウェルフォーマット）を溶解し、室温で1時間振とうした。96ウェルの650μlキャッチプレートに装着した96ウェルWhatman GF/Dユニフィルターに移すことによって、溶解物を清澄化すると共に96ウェルフォーマットに装填し直し、200×gで5分間遠心分離した。清澄化した溶解物を、平衡化バッファー（50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、10mM CHAPS、40mMイミダゾール、pH8.0）で平衡化させておいた96ウェルNiキレートプレートに移し、5分間インキュベートした。結合していない物質を除去した。樹脂を、0.3ml/ウェル×2の洗浄バッファー#1（50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、5mM CHAPS、40mMイミダゾール、pH8.0）で洗浄した。次に、樹脂を0.3ml/ウェル×3のPBSで洗浄した。溶出に先だって、各ウェルを50μlの溶出バッファー（PBS＋20mM EDTA）で洗浄し、5分間インキュベートし、この洗浄液を減圧によって捨てた。さらに100μlの溶出バッファーを各ウェルに適用することによってタンパク質を溶出させた。室温で30分間のインキュベーション後に、プレートを200×gで5分間遠心分離し、溶出したタンパク質を、Niプレートの底に固定された5μlの0.5M MgCl2が入っている96ウェルキャッチプレートに集めた。溶出したタンパク質は、SGE（対照Adnectin（商標））をタンパク質標準にして、BCAプロテインアッセイを使って定量した。SGE Adnectinは、インテグリン結合ドメイン（位置78〜80のアミノ酸RGD）がSGEで置き換えられている野生型10Fn3ドメイン（配列番号1）である。
HSA、RhSAおよびMuSA直接結合ELISA
HSAへの直接結合物質をアッセイするために、Maxisorp（商標）プレート（Nunc International、ニューヨーク州ロチェスター）を、4℃において、PBS中の10μg/mL HSA（Sigma、ミズーリ州セントルイス）で、終夜コーティングした後、カゼインブロックバッファー（Thermo Scientific、イリノイ州ロックフォード）中、室温で1〜3時間ブロッキングした。1点スクリーニングアッセイのために、精製HTPP Adnectin（商標）をカゼインブロックバッファーに1：20希釈し、室温で1時間、各ウェル中のHSAに結合させた。用量応答アッセイには、0.1nMから1μMまでの範囲にわたる濃度を使用した。未結合のAdnectin（商標）を除去するためにPBST中で洗浄した後、カゼインブロックバッファーに1：2500希釈した抗His mAb-HRPコンジュゲート（R&D Systems、ミネソタ州）を、結合しているHisタグ付きAdnectin（商標）に、室温で1時間加えた。PBSTで洗浄することによって過剰のコンジュゲートを除去し、TMB検出試薬（BD Biosciences）を製造者の指示に従って使用することにより、結合しているAdnectin（商標）を検出した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィーによる凝集測定
HTPPで得られたSABAに対してサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を行った。HTPP由来物質のSECは、Superdex 200 5/150またはSuperdex 75 5/150カラム（GE Healthcare）を使って、Agilent 1100または1200 HPLCシステムにより、A214nmおよびA280nmにおけるUV検出ならびに蛍光検出（励起＝280nm、蛍光＝350nm）で行った。100mM硫酸ナトリウム、100mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH6.8のバッファーを、SECカラムに適した流速で使用した。分子量キャリブレーションにはゲル濾過標準（Bio-Rad Laboratories、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用した。
HTPP精製SABAに関するSECの結果は、主として単量体であること、および球状ゲル濾過標準（BioRad）との対比で10kDaの概略範囲に溶出することを示した。
5．候補血清アルブミン結合性Adnectin（商標）（SABA）の同定
HSA/RhSA/MuSA結合および生物物理学的基準に関するスクリーニングの結果として、マウスにおいてその半減期を評価するために、4つのユニークな血清アルブミン結合性Adnectin（商標）（SABA）が同定され、選択された。インビトロおよびインビボでの特徴づけを行うために、これらの4つのSABAについて中規模生産を行った。表2に、PROfusionによって同定された26のユニークなSABAコア配列（SABA1〜26と名付けた）の配列を掲載する。SABA4は、中規模生産の前に固定されたスキャフォールド変異を有していた。SABA4のスキャフォールド完全版はSABA5である。SABA4とSABA5は、BC、DE、およびFGループでは同一の配列を有する。
実施例A2．候補SABAの生産と製剤化
SABAの中規模タンパク質生産
実施例A1に記載の選ばれたSABA（His6タグが後続しているもの）をpET9dベクターにクローニングし、大腸菌BL21(DE3)pLysS細胞で発現させた（SABA1.1、SABA2.1、SABA3.1、およびSABA5.1と名付けられた各Hisタグ付きSABA配列については表2を参照されたい）。20mlの種菌培養（単一平板培養コロニーから生成させたもの）を使って、50μg/mLカナマイシンを含有する1リットルのLB培地に接種した。培養をA6000.6〜1.0まで37℃で成長させた。1mMイソプロピル-β-チオガラクトシド（IPTG）による誘導後に、培養を30℃でさらに4時間成長させ、4℃、≧10,000×gで30分間の遠心分離によって収穫した。細胞ペレットを−80℃で凍結した。細胞ペレットを、25mLの溶解バッファー（20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、1×Complete（商標）プロテアーゼインヒビターカクテル-EDTAフリー（Roche）、pH7.4）に、氷上でUltra-turraxホモジナイザー（IKA works）を使って再懸濁した。細胞溶解は、モデルM-110Sマイクロフルイダイザー（Microfluidics）を使った高圧ホモジナイゼーション（≧18,000psi）によって達成した。可溶性画分を、4℃、23,300×gで30分間の遠心分離によって分離した。上清を0.45μmフィルターで清澄化した。清澄化した溶解物を、20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、pH7.4で前平衡化したHisTrapカラム（GE）にローディングした。次にカラムを25カラム体積の20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、pH7.4で洗浄した後、20カラム体積の20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、25mMイミダゾール、pH7.4で洗浄し、次に35カラム体積の20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、40mMイミダゾール、pH7.4で洗浄した。タンパク質を15カラム体積の20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、500mMイミダゾール、pH7.4で溶出させ、A280における吸光度に基づいてフラクションをプールし、1×PBS、50mMトリス、150mM NaCl、pH8.5または50mM NaOAc；150mM NaCl；pH4.5に対して透析した。0.22μmで濾過することにより、沈殿物をすべて除去した。
中規模での発現および精製により、可溶型で発現され、細菌細胞質ゾルの可溶性画分から精製された、高度に純粋で活性なAdnectin（商標）を得た。100mM NaPO4、100mM NaSO4、150mM NaCl、pH6.8の移動相におけるSuperdex 200またはSuperdex 75 10/30GLでのSEC分析（GE Healthcare）により、主として単量体型であるAdnectin（商標）が実証された。
SABA1.2の製剤
予備的製剤化スクリーンには、一つの具体的SABA、SABA1.2（配列番号80）を選んだ。SABA1.2は、10Fn3の「コア1」配列上に(ED)5伸長部を含んでいる。SABA1.2については、10mMコハク酸、8％ソルビトール、5％グリシン、pH6.0で、製品濃度5mg/mLの安定な製剤が同定された。この製剤では、タンパク質融解温度は、1.25mg/mLのタンパク質濃度を使った示差走査熱量測定（DSC）による決定で、75℃であった。この製剤は4℃および25℃で良好な物理的および化学的安定性をもたらし、初期凝集物レベルは1.2％だった。1ヶ月間安定性を保った後も、凝集のレベルは極めて低かった（4℃で1.6％、25℃で3.8％）。タンパク質は、この製剤では、−80℃および−20℃から周囲温度まで推移する5サイクルの凍結融解後も安定であった。加えて、この製剤では、SABA1.2は、4℃および周囲温度において、少なくとも20mg/mLタンパク質濃度まで可溶であり、沈殿も凝集の増加も起こらなかった。
実施例A3．候補SABAの生物物理学的特徴づけ
サイズ排除クロマトグラフィー
中規模プロセスによって得られた候補SABAに対して標準的サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を行った。中規模生産材料のSECは、Superdex 200 10/30またはSuperdex 75 10/30カラム（GE Healthcare）を使って、Agilent 1100または1200 HPLCシステムにより、A214nmおよびA280nmにおけるUV検出ならびに蛍光検出（励起＝280nm、蛍光＝350nm）で行った。100mM硫酸ナトリウム、100mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH6.8のバッファーを、SECカラムに適した流速で使用した。分子量キャリブレーションにはゲル濾過標準（Bio-Rad Laboratories、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用した。
中規模生産精製SABAでのSECの結果は、主として単量体型であるAdnectin（商標）と、球状ゲル濾過標準（BioRad）との対比で10kDaの概略範囲における溶出とを示した。
熱安定性
中規模生産SABAの示差走査熱量測定（DSC）分析を行うことで、それぞれのTmを決定した。1mg/ml溶液を、N-DSC II熱量計（Calorimetry Sciences Corp）において、3気圧下で、温度を5℃から95℃まで毎分1度の速度で昇温させることによって走査した。データは、Orgin Software（OrginLab Corp）を使用し、ベストフィットを使って、適当なバッファーの対照ランと対比して分析した。SEC分析およびDSC分析の結果を表4に要約する。
［表4］候補SABAに関するSEC分析およびDSC分析の要約
Figure 2013531477
実施例A4．血清アルブミンへの候補SABA1結合の特徴づけ
各血清アルブミン（HSA/RhSA/MuSA）をBiasensor CM5チップの表面に固定化し、参照セルと固定化したアルブミンの両方に一連の濃度のSABAを流すことにより、実施例A1およびA2で述べたHTPP材料および中規模生産材料から精製した選ばれたSABAクローンのキネティクスを決定した。加えて、アルブミンへの結合を、pH5.5からpH7.4までの範囲にあるさまざまなpH条件下で行った。HSA結合性Adnectin（商標）SABA2.1、SABA3.1、SABA4.1（SABA5.1）およびSABA1.1は、RhSAと交差反応したが、MuSAとは交差反応しなかった。SABA2およびSABA4の結合がpH感受性であるのに対し、クローンSABA3は、下はpH6.0まで、HSAに対してpH耐性の結合を示した。SABA1.1は、下はpH5.5まで、pH耐性およびアフィニティ/キネティクスの生化学的基準を満たす。
Biacoreによってドメインマッピングを行った。HSA、またはHSAドメインIおよびIIだけもしくはHSAドメインIIIだけからなるコンストラクトをBiasensor CM5チップの表面に固定化し、参照フローセルと固定化したアルブミンとの両方に一連の濃度のSABAを流すことにより、HTPP材料および/または中規模生産材料から精製した選ばれたSABAクローンについて決定した。クローンSABA2およびSABA1はHSAおよびHSAドメインI-IIコンストラクトに結合したが、HSAドメインIIIコンストラクトには結合しなかった。クローンSABA3およびSABA4はHSAには結合したが、HSAドメインI-IIコンストラクトにもHSAドメインIIIコンストラクトにも結合しなかった。これらの結果を表5に要約する。
［表5］候補SABA（SABA1.1、2.1、3.1および4.1）の結合アフィニティおよびキネティクス
Figure 2013531477
実施例A5．候補SABAの生体内t 1/2 の調査
HSA結合性Adnectin（商標）はMuSAと交差反応しないので、マウスにおいてHSA結合性Adnectin（商標）を評価することが可能になるように、マウスにおけるHSAの半減期を決定した。HSAを、約6週齢のNcrヌード雌マウスの尾静脈に、20mg/kg（図1A）および50mg/kg（図1B）の用量で注射し、注射後に間隔をおいて採取した血液試料中のHSAの濃度をELISAによって決定した。WinNonlinソフトウェアおよび非コンパートメントモデリングを使って、20mg/kgおよび50mg/kgの量でマウスに注射されたHSAのt1/2は、それぞれ約24時間および約20時間であると決定された。
マウスにおけるSABA1〜4の半減期決定
HSA結合性クローンSABA1.1、SABA2.1、SABA3.1、およびSABA4.1の1リットル大腸菌培養物を調製し、精製し、エンドトキシンを除去した。各SABA変異体をHSAと共にまたはHSAを伴わずにマウスの尾静脈に注射し、注射後に間隔をおいて採取した血液試料中の濃度を、血漿試料中のAdnectin（商標）を検出するために開発された定量的ELISAベースアッセイを使って決定した。WinNonlinソフトウェアによる非コンパートメントモデリングを使って、各Adnectin（商標）の薬物動態パラメータを決定した。
各SABAの薬物動態プロファイルを、約6週齢のNcrヌード雌マウスにおいて、HSAの存在下または非存在下で比較した。結合性クローンはHSAおよびRhSAに対して選択的であり、マウス血清アルブミンには結合しなかったので、HSAとの同時注射を行ったマウスには、各SABAと予め混合されたHSA（3〜4モル過剰のHSA）を与えた。マウス血漿におけるSABA1.1の半減期が0.56時間であったのに対し、HSAと同時注射されたSABA1.1の半減期は5.6時間と、半減期が約10倍増加した（図2A）。マウス血漿におけるSABA2.1の半減期が0.24時間であったのに対し、HSAと同時注射されたSABA2.1の半減期は2.8時間と、半減期が約12倍増加した（図2B）。マウス血漿におけるSABA3.1の半減期が0.28時間であったのに対し、HSAと同時注射されたSABA3.1の半減期は0.53時間と、半減期が約2倍増加した（図2C）。マウス血漿におけるSABA4.1の半減期が0.66時間であったのに対し、HSAと同時注射されたSABA4の半減期は4.6時間と、半減期が約7倍増加した（図2D）。この実施例の要約を図3に示す。表6に、SABA1.1、SABA2.1、SABA3.1、SABA4.1およびSABA5.1について、類似するデータを要約する；利用できる場合はカニクイザル（cyno）における半減期と比較する。
［表6］マウスおよびサルにおけるSABA1.1、SABA2.1、SABA3.1、SABA4.1およびSABA5.1に関するデータ
Figure 2013531477
カニクイザルにおけるSABA1.1およびSABA5.1の半減期決定
SABA1.1（図4A）およびSABA5.1（図4B）の3週間単回投与概念証明研究をカニクイザルで行うことで、2匹のカニクイザルにおいて1mg/kg（mpk）用量でのIV投与時の薬物動態を評価した。薬物動態は、血漿試料中のAdnectin（商標）を検出するために開発された定量的ELISAベースアッセイを使って評価した。SABA1.1は、96〜137時間の範囲にある半減期を有する（図4Aおよび表7）。SABA5.1は、約12時間の半減期を有し、ELISAでは120時間までしか測定できなかった（図4Bおよび表8）。SABA1.1に関するデータを表7に要約し、SABA5.1に関するデータを表8に要約する。
［表7］SABA1.1に関するデータ
Figure 2013531477
 ［表8］SABA5.1に関するデータ
Figure 2013531477
実施例A6．血清アルブミンへのSABA1結合の特徴づけ
SABA1.1および1.2はHSAおよびRhSAに結合する
(ED)5伸長部（配列番号90）を含む「コア1」10Fn3であるSABA1.2は、中性pHおよび25℃において、8.21E+03M-1s-1の平均会合速度定数（ka）および4.43E-04s-1の平均解離速度定数（kd）でヒト血清アルブミン（HSA）に結合し、平均KDの計算値は55.3nMになる（表9）。アカゲザル血清アルブミン（RhSA）の場合、測定された平均会合速度定数は6.6E＋03M-1s-1であり、解離速度定数は3.78E-03s-1であったことから、平均KDの計算値は580nMになった。SABA1.2とマウスまたはラット血清アルブミンの間の測定可能な相互作用は1μMまで観察されなかった（表9および図5）。37℃ではkaおよびkdが2〜5倍増加して、HSAに対するアフィニティーが約2倍増加し、RhSAに対するアフィニティーが1/2になった（表9）。
［表9］HBS-PバッファーにおけるアルブミンへのSABA1.2結合に関する速度論的パラメータ
Figure 2013531477
さらに、SABA1とHSAの間の化学量論を決定するために熱量滴定を行った。この研究には、His6伸長部を含む「コア1」10Fn3であるSABA1.1（配列番号89）を使用した。濃度8.1μMのSABA1.1を含有している熱量測定用セルに、HSA（注入1回につき10μlの115μMタンパク質溶液）を注入した。実験は、pH7.4のPBSバッファー中、37℃で行った。図6は、SABA1.1が1：1の化学量論でHSAに結合することを示している。
SABA1.2は低いpHでHSAに強く結合する
アルブミンの長い半減期（例えばHSAのt1/2は19日である）は、エンドソームの内部に存在する低pH条件下でそれらが新生児型Fc受容体FcRnに結合することによってエンドサイトーシス経路からリサイクルされるという事実に、かなりの部分、起因している。表10に示すように、SABA1.2は5.5のエンドソームpHにおいてHSAに強く結合したことから、ひとたびHSAに結合すれば、SABA1のt1/2も、FcRnリサイクリング機構の恩恵を受けるであろうことが示唆される。
［表10］MESバッファー中、pH7.4および5.5における、アルブミン結合キネティクスの比較
Figure 2013531477
SABA1.2はHSAのドメインIおよびIに結合するがドメインIIIには結合しない
SABA1.2に対するアルブミン上の結合部位は、組換えHSAフラグメントを使って、N末端ドメインIまたはIIにマッピングされ、ドメインIIIへの検出可能な結合はなかった（図7）。ドメインIIIは主としてFcRnと相互作用するHSAのドメインであるから、SABA1.2が、FcRnへのHSA結合に関して競合する可能性は低く、ここでも、リサイクリング機構を活用して半減期を向上させる可能性が増加する。
実施例A7．SABA1.2の生体内薬理
SABA1.2の4週間単回投与前毒性研究をカニクイザルで行うことで、2つの異なる用量レベルにおける薬物動態を評価した。薬物動態およびバイオアベイラビリティも、静脈内投与アームと皮下投与アームの両方を包含する3週間単回投与前毒性研究において評価した。これらの研究のそれぞれでは、血漿試料中のSABA1.2を検出するために開発された定量的ELISAベースアッセイをWinNonlinソフトウェアによる非コンパートメントモデリングと組み合わせて使用することによって、SABA1.2の薬物動態を評価した。
SABA1.2を1mpkおよび10mpk IVでサルに投与した。WinNonlinソフトウェアを使った非コンパートメント分析を行うことで、薬物動態パラメータを評価した。図20および後述のパラメータに示すように、濃度時間曲線下面積（area under the concentration-time curve：AUC）評価によって決定したところ、この研究において、SABA1.2は、用量依存的薬物動態を示した。10mpkのSABA1.2については、クリアランス（CL）が0.15ml/時間/kg、β相半減期（t1/2）は143時間、分布容積（Vz）は30mL/kg、そして総薬物曝露量（AUCall）は5,609,457時間*nmol/Lであった（表11）。1mpkのSABA1.2については、クリアランス（CL）が0.4ml/時間/kg、半減期（t1/2）が124時間、分布容積（Vz）が72mL/kg、そして総薬物曝露量（AUCall）が214,636時間*nmol/Lであった（表11）。
SABA1.2のSCまたはIV投与後はβ相薬物動態プロファイルが類似していた（図9）。1mpk IVのSABA1.2については、クリアランス（CL）が0.22ml/時間/kg、β相半減期（t1/2）が125時間、分布容積（Vz）が40mL/kg、そして総薬物曝露量（AUCall）が時間*nmol/Lだった（表11）。1mpk SCのSABA1.2については、クリアランス（CL）が0.32ml/時間/kg、β相半減期（t1/2）が134時間、分布容積（Vz）が62mL/kg、そして総薬物曝露量（AUCall）が251,339時間*nmol/Lであった（表11）。IVと比較したSCの相対的バイオアベイラビリティ（F）は0.7だった。
［表11］サルにおけるSABA1.2に関する薬物動態パラメータ
Figure 2013531477
実施例A8．SABA1.2との複合体におけるヒト血清アルブミンの構造
ヒト血清アルブミンとSABA1.2との複合体は、Proteros Biostructures GmbHによって、100mM酢酸Na、pH4.75、100mM NaCl、および28％PEG200から結晶化された。Free Mounting System（FMS）を使って結晶からの回折を最適化し、オイル下でフラッシュ冷却した。
データは、Proteros Biostructures GmbHにより、Swiss Light SourceビームラインPXI/X06SAにおいて、100Kに維持された結晶を使って収集された。波長は1.0015Åであり、検出器はPilatus 6M（Dectris）だった。データをXDSおよびXSCALE（W. Kabsch (2010)「XDS」Acta Crystallogr. Sect. D 66, 125-132；W. Kabsch (2010)「Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement」Acta Crystallogr. Sect. D 66, 133-144）で処理し、以下の統計量を得た：空間群：P212121；単位格子：a＝６１．６Å；ｂ＝１２４．１Å；ｃ＝１００．０Å。
［表12］結晶データの要約
Figure 2013531477
分子置換のためのプログラムMOLREP（Vagin, A.およびTeplyakov, A. (1997)「MOLREP: an Automated Program for Molecular Replacement」J. App. Crystallogr., 30, 1022-1025）と、検索モデルとしてPDBエントリー1BM0とを使用して、ヒト血清アルブミンの構造を決定した。Adnectin部分の構造は、PDBエントリー1FNF残基1423〜1502に基づく検索モデルから、分子置換プログラムPHASER（A.J.McCoy, R.W. Grosse-Kunstleve, P.D. Adams,M.D. Winn, L.C. StoroniおよびR.J. Read (2007)「Phaser Crystallographic Software」J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674）を使って決定した。
モデルの精密化は、BUSTER/TNT（Blanc, E., Roversi, P., Vonrhein, C., Flensburg, C., Lea, S.M.およびBricogne, G. (2004)「Refinement of severely incomplete structures with maximum likelihood in BUSTER/TNT」Acta Crystallogr. Sect. D 60, 2210-2221）を使って行い、モデル構築はCOOT（Emsley, P.およびCowtan, K. (2004)「Coot: model-building tools for molecular graphics」Acta Crystallogr Sect. D 60:2126-2132；Emsley, P., Lokhamp, B., Scott, W.G.およびCowtan, K. (2010)「Features and Development of Coot」Acta Crystallogr Sect. D 66:486-501）で行った。表示用の図は、PyMol（DeLano, W.L. (2002), The PyMol Molecular graphics System, DeLano Scientific、米国カリフォルニア州サンカルロス；ワールドワイドウェブのpymol.orgにおいて入手可能）で作成した。
精密化の最終ラウンドによって表13に示す統計量が得られた。
［表13］精密化の最終ラウンドから得られた統計量
Figure 2013531477
構造の説明
SABA1.2に対する結合部位は、厳密に、ヒト血清アルブミン（HuSA）のドメイン1上にある（図17AおよびB）。次に挙げるHuSAの残基がAdnectinと接触していた（シグナルおよびプロペプチド領域を欠く成熟HuSA配列に基づくナンバリング）：Pro35、Phe36、Glu37、Pro113、Arg114、Leu115、Arg117、Pro118、Glu119、Val122、Met123、Phe134、Lys137、Tyr140、Glu141、Arg144、Arg145、およびTyr161（Sheriff, S., Hendrickson, W. A.およびSmith, J.L. (1987)「Structure of Myohemerythrin in the Azidoｍｅｔ Ｓｔａｔｅ ａｔ １．７／１．３ Å Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」J. Mol. Biol. 197, 273-296；Sheriff, S. (1993)「Some methods for examining the interactions between two molecules」Immunomethods 3, 191-196）。より広義の相互作用残基は、少なくとも部分的に埋没しているものであり、これには、接触している残基として上に列挙したものに加えて、次に挙げる残基が包含される：Asp38、Thr125、Ala126、Asp129、Thr133、Tyr138、およびLeu182。
AdnectinはBC、DE、およびFGループを介して相互作用し、次に挙げる残基がHuSAと接触している：（SABA1.2、例えば配列番号90の）His25、Ser26、Tyr27、Glu29、Gln30、Asn31、Pro53、Tyr54、Ser55、Thr57、Tyr78、Tyr83、およびTyr84）。先に列挙した残基に加えて、次に挙げる残基も、相互作用によって少なくとも部分的には埋没している：（SABA1.2、例えば配列番号90の）Trp24、Ser32、Tyr33、Gln56、Gly79、およびLys81。
実施例A9．第I相SABA安全性試験の計画
健常男性ボランティアにおいて、静脈内投与されたSABA1.2の第1相部分盲検プラセボ対照薬物動態試験が行われる。ボランティアは、処方せん薬または一般用医薬品による処置を現在受けていない、プロトコールに定められた健康状態および臓器機能に関する制限に合致する、18〜60歳の健常成人男性被験者とする。SABA1.2は、ヒト血清アルブミン（HSA）に対する結合アフィニティを有する非治療用Adnectinである。これは、そのままでは迅速に排除されるであろう別個の治療用Adnectinまたは他のタンパク質と共に単一のポリペプチド鎖に組み込まれた時に、血清中半減期（T-HALF）を延長させるためのアルブミン結合物質として役立つことを意図したものである。被験者のコホートは、0.1、0.3、または1.0mg/kgのSABA1.2またはプラセボで、2週間に1回、合計2回の投薬で処置される。
試験計画．ボランティア被験者にはSABA1.2またはプラセボのどちらか一方がランダムに与えられ、それぞれのランダム化された処置の投与が、14日の間隔を空けて2回、それぞれに1時間の注入として施行され、その後、2週間の試料収集および観察期間が設けられる。また、2回目の観察期間後、被験者はさらに4週間にわたって、安全性に関して追跡される。処置（SABA1.2またはプラセボ）は1日目および15日目に施行される。
SABA1.2の用量レベルを漸増させて、3つの逐次的コホートがリクルートされる。個々の用量コホートはさらに、部分盲検的（被験者および治験スタッフは輸液剤の実体について盲検化され、薬剤師は盲検化されない）にSABA1.2またはプラセボに逐次的に曝露される3つのサブグループに分割される（図18参照）。各コホートの第1サブグループは、リスクを最小限に抑えるために、活性薬処置被験者を1人だけ含む。
コホート1の全ての被験者がそれぞれの29日目の来院を完了し、PK所見が評価された後（最大4週間と予想される）に、所定の最大無毒性量（no observed adverse event level：NOAEL）を上回る基準がコホート1では認められなかったと仮定して（下記参照）、コホート2が試験を開始する。同様に、NOAELを上回らなかったと仮定して、コホート2の完了とPK評価までは、コホート3を開始しない。
NOAELは、a）2人以上の積極的処置（非プラセボ）被験者が何らかのグレード2国立癌研究所（National Cancer Institute：NCI；米国）-有害事象共通用語基準（Common Terminology Criteria for Adverse Events：CTCAE v4.03）SABA1.2関連毒性を経験するか、b）少なくとも1人の積極的処置被験者が、何らかのグレード≧3 SABA1.2関連毒性を経験する最低用量レベルよりも、1レベル低い用量レベルと定義される。これらの基準のどちらも満たさない場合は、完了した最も高い用量レベルをNOAELとする。コホート2または3においてNOAEL基準を上回った場合は、その次に低いコホートがNOAELと宣言され、残りの被験者は全員がNOAELで処置され、この試験では合計37人（SABA1.2を投与される28人とプラセボを投与される9人）が処置されることになる。これは、薬物動態（PK）および免疫原性評価を裏付けるために要求される統計精度を維持するため、および安全性観察を受ける被験者の数を十分な数に維持するためである。コホート1の用量レベルがNOAELを越えることが分かった場合は、さらなる被験者への投与は行わず、試験は終了されることになる。
試験評価および主要評価項目．試験の主要評価項目はPKであり、全ての用量にわたる平均T-HAL、最高血漿中濃度（Cmax）、全身クリアランス（CL）、投薬から投薬間隔終了時点までの濃度時間曲線下面積（AUCtlast）、および定常状態における分布容積（VSS）が包含されるであろう。PK分析用の連続試料は、試験1日目および15日目の各注入の開始前と、開始後0.5（注入中）、1（注入終了時）、1.5、2、3、5、7、24、48、72、96または120、および168時間の時点で収集される。加えて、SABA1.2血漿中濃度のための単一ランダム試料を29日目（15日目の投与の336時間後の標本）、36日目、43日目、50日目、および57日目に収集する。
安全性評価には、バイタルサイン、理学的検査、心電図、臨床検査室評価、および有害事象が包含される。加えて、抗薬物抗体（ADA）、自己免疫の血清指標（抗核抗体［ANA］、C3、およびC4）の測定、および臨床観察（例えば発疹、輸液反応、筋痛または関節痛など）によって、免疫原性が評価される。観察された何らかの免疫原性の機序を理解するための試みとして、HLAタイピングおよびT細胞刺激アッセイが行われるであろう。
統計的方法．被験者が25人の場合、133.159時間以上のT-HALF観測値については、片側95％信頼区間（CI）の下限が120時間に及ぶことはないであろう。25人の積極的処置完了者を得るために、積極的処置被験者が合計28人になるように、1用量コホートあたり1人の追加被験者を含める。
血漿PKパラメータについて、用量別に、および用量間で、要約統計量を製表する。PKパラメータは、時間に対するSABA1.2血漿中濃度から、非コンパートメント法を使って導き出される。正当な理由があるなら、消長をさらに理解するために、コンパートメントアプローチを使用してもよい。平均T-HALFは95％CIによって推定される。Cmax、AUCtlast、R、およびCLについては幾何平均およびCVが報告され、Tmaxについては中央値（最小、最大）が報告され、他のパラメータについては平均および標準偏差が報告される。SABA1.2の用量比例性が評価される。線形混合効果モデリングを使って対数変換AUCおよびCmaxが対数変換用量にフィッティングされる。関係の傾きに関して対称漸近95％CIが構築される。95％CIが1.0の値を包含するのであれば、用量比例性が結論されることになる。逆に、95％CIが1.0の値を包含しないのであれば、非比例性が結論されることになる。
安全性結果は、用量レベル別に、および包括的に、記述的に要約されるであろう。
開始用量の理論的根拠．週に2回、5回にわたって投与した場合、カニクイザルにおけるNOEL（No observed effective level：無作用量）は、30mg/kg IVである。体表面積から見た用量によれば、このヒト臨床治験におけるSABA1.2の開始用量（0.1mg/kg）は、サルにおけるNOELより低く、100倍の安全係数に相当し、この試験における最も高い計画用量（1mg/kg）は10倍の安全係数に相当する。予測されるヒトCmaxおよびAUCによれば、この臨床試験における開始用量は、サルNOELにおける15日目のサルCmaxおよびAUCに対して、それぞれ約600倍および200倍の安全係数に相当し、一方、この試験における最も高い計画用量によれば、予測されるヒトCmaxおよびAUCは、15日目のサル・パラメータに対して、それぞれおよそ50倍および20倍の安全係数に相当する。このように、この試験における用量レベルについては、十分な安全係数が考慮されている。
B．FGF21-SAB融合物分子
実施例B1．FGF21-SABA融合分子の調製
概略
本明細書において開示するFGF21-SABA DNA配列は全て、市販の発現ベクターpET29b（EMD Biosciences、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に入れた。リボソーム結合部位のすぐ下流にあるプラスミドベクターのNDEI制限エンドヌクレアーゼ部位とXHOI制限エンドヌクレアーゼ部位の間に、配列を適切に配置した（図10）。
それらの発現ベクターを宿主株BL21(DE3)（EMD Bioscineces）に形質転換したところ、封入体としてさまざまなレベルに発現した。あるいは、それらを大腸菌株の酸化性株、例えば「Origami（商標）」（EMD Biosciences）に形質転換することもできる。後者の宿主株は、チオレドキシンレダクターゼ（trxB）遺伝子とグルタチオンレダクターゼ（gor）遺伝子の両方に変異を含有し、これらの変異は大腸菌細胞質におけるジスルフィド結合の形成を著しく強化する。適切な配慮を払って、さまざまなFGF21-SABA融合物、例えば表2に記載するものを発現させた。
精製したプラスミドDNA発現ベクターを、当業者に広く知られている標準的形質転換法により、上記の大腸菌に組み込んだ、すなわち「形質転換」した。簡単に述べると、市販のコンピテント細胞（EMD Biosciences）を氷上で融解し、細胞が均等に懸濁されていることを保証するために、静かに混合した。これらの細胞を、氷上で予冷しておいた1.5mlポリプロピレン製微量遠心チューブに、20μlずつピペッティングした。約1μlの精製プラスミドDNA（1〜10ng/μlプラスミド）を細胞に直接加え、混合するために静かに振とうした。チューブを氷上に5分間保った後、正確に30秒間、42℃の水浴で加熱した。加熱したチューブを直ちに氷上に置き、2分間休ませた。80μlの室温SOCまたはLB培地を各チューブに加えた。形質転換体の選択は、pET29bプラスミドがコードする薬物耐性用に、カナマイシンを含有する培地で平板培養することによって達成した。
形質転換された細胞の終夜スターター培養を成長させることにより、Origami2細胞株における可溶性FGF21-SABA融合ポリペプチドの発現を開始した。細胞を、それぞれ1リットルのLB培地（ルリアブロス）が入っている2リットル振とうフラスコの接種に使用し、250〜300RPMで激しく振とうしながら、O.D.600nmが0.6〜0.8に達するまで、37℃で成長させた。この時点で、T7 RNAポリメラーゼ誘導を開始するために0.1mM IPTG（イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド）を加え、振とうインキュベータの温度を18℃に低下させた。発酵を12〜16時間継続し、遠心分離によって細胞を収穫し、圧縮湿細胞ペーストとして−80℃で凍結した。
BL21(DE3)細胞株における封入体（IB）としてのFGF21-SABA融合ポリペプチドの発現も、形質転換された細胞の終夜スターター培養を成長させることから開始した。細胞を、それぞれ1リットルのOvernight Express（商標）培地（EMD Biosciences、およびNature Methods 2, 233-235, 2005）が入っている2リットル振とうフラスコの接種に使用した。封入体形成のためには、発酵温度を低下させる必要がなく、その代わりに細胞を37℃で12〜16時間成長させてから、遠心分離によって収穫した。収穫された細胞は、圧縮湿細胞ペーストとして−80℃で凍結した。
記載したFGF21-SABA変異体の精製は、使用したその配列変異体と、タンパク質をOrigami細胞株において細胞質ゾル可溶型として発現させるかどうか、またはBL21細胞株において封入体として発現させるかどうかとに依存して、さまざまである。方法は、配列が精製を助けるための6×ヒスチジンタグを含有するかどうかにも依存する。しかし一般に、精製法には、当業者にはよく知られる共通の技法が含まれる。以下は、精製法の詳細な説明である。
細胞溶解および封入体（IB）ペレットの調製
細胞を、圧縮細胞ペースト1部に対してバッファー8〜10部の希釈度で、溶解バッファーに懸濁した。Avestin C-5ホモジナイザー（Avestin Inc.、カナダ・オンタリオ州オタワ）を使って、2000PSIで2回通すことにより、細胞を機械的に溶解した。溶解後に、溶解物を遠沈した（4,000RPMで20〜30分間）。可溶性画分は捨てる。細胞片を除去するために封入体ペレットを0.5％Triton X-100で洗浄し、その懸濁液を再び遠心分離した。このプロセスを、ペレットが均一な白色に見えるまで（典型的には2回または3回）繰り返した。次に、その結果得られた濃縮IB調製体ペレットをPBSバッファーで洗浄することで、過剰の界面活性剤を除去した。
封入体の可溶化
次に、洗浄し界面活性剤を枯渇させたIBペレットを、50mMトリス-HCl（pH8.0）と500mM NaClで緩衝化した6Mグアニジン-HClに可溶化した。この方法で調製した材料の大半は、自由に溶液相に入るが、少量の細胞片が残るので、SS-34ローター中、16,000RPMで1時間の遠心分離によって、これを除去した。リフォールディングおよび酸化ステップのために、上清をとっておいた。あるいは、この段階で、金属キレーションクロマトグラフィーステップ（IMAC）を使って、6×Hisタグを含有するタンパク質融合物変異体を捕捉して、さらに精製することができる。カオトロープで変性させた材料をカラムに結合させ、夾雑物を洗浄してから、イミダゾールを補足した変性バッファーの存在下で溶出させることができる。
リフォールディングと酸化
グアニジン-HClで可溶化した材料を約1mg/mLタンパク質（280nMの吸光度で推定）に希釈し、3.5MWCO透析チューブに入れた。次に、透析デバイス中の試料を、4Lのリフォールドバッファー（50mMトリス、150mM NaCl、1mM EDTA、pH9.0）に、4℃で終夜、静かに撹拌しながら浮かせた。透析リフォールドバッファーは、翌朝に、新鮮なリフォールドバッファーと交換する。このプロセスの間に、融合タンパク質のFGF21ドメイン中のジスルフィド橋が、容易に空気酸化される。この簡便な透析法は便利であり、必要であればいくつかの試料を一度に処理することができる。あるいは、グアニジン-HClの代わりに尿素中でタンパク質を変性させることもできる。あるいは、高いカオトロピック塩濃度から低い塩濃度への分子の急速希釈を使って、リフォールディングと酸化を行うこともできる。あるいは、空気酸化の代わりに、還元型および酸化型グルタチオン（GSH/GSSG）の所定の酸化還元混合物を使って、系をリフォールディングさせることもできる。
あるいは、上述のように透析または急速希釈によって自由拡散相でこれらのタンパク質をリフォールディングさせる代わりに、クロマトグラフィー樹脂に結合している間に、これらをリフォールディングさせてもよい。バルク凝集と収量損失につながりうるリフォールディング相中のタンパク質相互作用が最小限に抑えられるので、この方法には利点があり、収率が改善されることが多い。
沈殿剤（precipitant）の除去
これらの条件下でのリフォールドおよび酸化ステップの終わりに、タンパク質の全てが可溶性のままであるわけではない。分子の一部は、凝集した状態で存在し、沈殿物（precpitatant）として溶液から容易に降下する。これを、SS-34ローターで1時間、16,000RPMで遠心分離することによって除去した。そして、典型的には、クロマトグラフィーに先だって、これを0.2μmシリンジフィルターで濾過する。
クロマトグラフィー分離
DNAおよび他の夾雑物を除去するために、リフォールディングされたFGF21-SABA融合物を、Resource Qまたは類似のイオン交換媒体系（GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使って精製することができる。40mL Resource Qカラムをリフォールドバッファー（150mM NaCl、1mM EDTAを含む50mMトリス、pH9.0）中で平衡化し、清澄化したリフォールディングされた材料を、そのカラムに通す。これらの条件下で、FGF21-SABA変異体の大部分は、結合せずに樹脂ベッドを通過する。洗浄された封入体からのDNAおよび他の細胞片は、カラム樹脂上に保持される。あるいは、6×Hisタグを含有するフォールディングされたタンパク質融合物変異体を、この時点で、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）ステップを使って捕捉し、イミダゾールまたはヒスチジンの勾配で溶出させることもできる。
濃縮
次に、第1クロマトグラフィーステップで富化されたタンパク質試料を、Pellicon（登録商標）XLデバイスおよびLabscale（商標）タンジェンシャルフロー濾過（TFF）システム（Millipore Inc.、マサチューセッツ州ビルリカ）を使って、約4mg/mLまで濃縮した。
サイズ排除クロマトグラフィー
次に、PBSバッファー（pH7.2）中で前平衡化した26/60 Sephacryl S100または26/60 Superdex 75サイズ排除カラム（GE Healthcare、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使って、FGF21-SABA融合物の約4mg/mL試料をさらに精製した。単量体型タンパク質融合物に対応する試料をプールし、必要であれば試料を1〜2mg/mlに希釈してから、−80℃で凍結した。この方法を使って、封入体を生産した元の自己誘導培地100mLにつき、20mgまでのFGF21-SABA融合物を精製することができる。
実施例B2．血清アルブミンへのFGF21-SABA融合物結合の特徴づけ
Microcal VP-ITC機器（Microcal Inc.、米国マサチューセッツ州アマースト）での等温滴定熱量測定を使って、ヒト血清アルブミンへのFGF21-SABA融合物変異体の結合能力および熱力学的特徴づけを行った。さらに、ヒト血清アルブミン（HSA、Sigma #A3782、米国ミズーリ州セントルイス）、カニクイザル血清アルブミン（CySA、Equitech-Bio #CMSA、米国テキサス州カーヴィル）、およびマウス血清アルブミン（MuSA、Sigma#A3559）へのFGF21-SABA1融合物変異体の結合能力および速度論的特徴づけを、Biacore T100機器（GE Healthcare Inc.、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で行った。詳細な実験条件を以下に述べる。
熱量測定アッセイには、FGF21-SABA変異体SABA1-FGF21v1（配列番号132）を使用した。37℃における代表的滴定曲線を図11に示す。KDは3.8nMと計算された。SPR研究では、SABA1-FGF21v1およびSABA1-FGF21v3（配列番号134）を調べた。ヒト由来（HSA）、カニクイザル由来（CySA）およびマウス由来（MuSA）の血清アルブミンへの1000、500、250、125、および62.5nM融合物の結合に関するSPRセンサーグラムデータを、図12に示す。HSA、CySA、およびMuSAへのこれらの融合物の結合に関する速度論的データを、表14に要約する。
［表14］HSA、CySA、およびMuSAへのSABA1-FGF21v1およびSABA1-FGF21v3の結合に関するSPR速度論的データ
Figure 2013531477
詳細なプロトコール
等温滴定熱量測定
実験のための適正な溶媒マッチングを保証するために、精製SABA1-FGF21融合タンパク質および市販のヒト血清アルブミン（HSA、Sigma #A3782、米国ミズーリ州セントルイス）を、別々の3,500MW透析バッグで、PBSバッファー（10mMリン酸ナトリウム、130mM塩化ナトリウム、pH7.1）に対して透析した。SABA-FGF21融合タンパク質＋バッファーを、0.4〜1.0mg/mLタンパク質の濃度範囲で、機器試料セルに入れた。整合するバッファーを参照セルに入れた。純粋なタンパク質のタンパク質配列から算出された吸光係数を使って、濃度を決定した。機器反応セルを37℃で平衡化した。反応セルへの各10μlの反復注入を注入シリンジから行い、HSA1モルあたりの過剰の熱を監視した。得られたデータセットからベースラインを差し引き、セルに注入したHSAの希釈熱について補正した。その結果得られたサーモグラムデータを、Origin（商標）評価ソフトウェアパッケージ（Microcal Inc.）バージョン2.0.2を使ってフィッティングすることで、タンパク質-タンパク質結合反応の化学量論、エンタルピー、および平衡解離定数（KD）を推定した。
表面プラズモン共鳴
血清アルブミンをPBSバッファー（10mMリン酸ナトリウム、130mM塩化ナトリウム、pH7.1）に10mg/mlの濃度で溶解してから、固定化のために10mM酢酸ナトリウム（pH5.0）に8〜10μg/mlまで希釈した。HBS-EP＋ランニングバッファー中、25℃で、標準的エチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）/N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）ケミストリーを使用し、製造者の一般的指針に従って、血清アルブミンを、Series S CM5センサーチップ上に固定化した。フローセル1はEDC/NHSで活性化し、エタノールアミンでブロッキングした。フローセル2、3および4は、それぞれEDC/NHSで活性化した後、8〜10μg/ml血清アルブミンの固定化を行い、エタノールアミンでブロッキングすることで、700RU HSA（フローセル2）、1100RU CySA（フローセル3）、および1050RU MuSA（フローセル4）の表面密度を得た。速度論的実験は、0.05％ Tween-20を含有するPBSバッファー（ランニングバッファー）中、25℃または37℃で行った。PBS pH7.2中のSABA1-FGF21v3（15.3μM）またはSABA1-FGF21v1（40.6μM）の原液をPBSランニングバッファーで1μMまで希釈してから、段階希釈（2：1）を行うことで、各タンパク質について1.0μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM、0.063μMの濃度系列を作成した。物質輸送限界をチェックするために、これらの試料を、フローセル1〜4を横切るように、30μl/分または60μl/分の流速で300秒間注入し、解離時間を420秒とした。全ての表面を、30μl/分で30秒間の10mMグリシン（pH2.0）のパルス2回で再生させた。フローセル1データをフローセル2、3または4のデータから差し引いた後、別個のバッファーサイクルを各センサーグラムから差し引くことにより、生センサーグラムを「二重準拠（double-referenced）」にした。この二重準拠センサーグラムデータを、Biacore T100評価ソフトウェアバージョン2.0.2を使って1：1ラングミュアモデルにフィッティングすることで、会合速度定数（ka）、解離速度定数（kd）、および平衡解離定数（KD）を決定した。
実施例B3．HEK-β-クロトー細胞におけるSABA1-FGF21融合物のインビトロ活性
FGF21はβ-クロトーの存在下でERKリン酸化を誘導する。そこで、FGF21-SABA融合物の機能的活性をインビトロで調べるために、本HEK-β-クロトーアッセイ系を構築した。具体的に述べると、非融合Hisタグ付きFGF21（「FGFv1」；配列番号125）をコンパレーターとして使用して、HEKβ-クロトー発現安定細胞pERK1/2アッセイで測定されるインビトロ活性、力価（potency）（EC50）および効力（efficacy）（SABAに融合されていないFGF21分子で観察される最大活性に対するパーセンテージとして）を、SABA1-FGF21v1（配列番号132）融合タンパク質について決定した。
図13に示すように、SABA1-FGF21v1は、ヒトβ-クロトーを安定に発現するHEK細胞におけるpERK1/2レベルを、用量依存的に刺激する。力価（EC50）は、Hisタグ付きFGF21と比較して約15倍右方シフトし、効力はHisタグ付きFGF21の62％である（下記表15参照）。したがってSABA1-FGF21v1は、ヒト血清アルブミンに結合している時でも、FGF21活性を保っている。
［表15］対照FGF21と比べたSABA-FGF21融合物の力価
Figure 2013531477
 *HEKβ-クロトー発現安定細胞pERK1/2アッセイにおいて測定される化合物の力価（EC50）および効力（His6タグ付きFGF21最大活性に対する％）。N≧4の独立したアッセイから平均±標準偏差として与えられる複数の実験から集計されたデータ。
βクロトーを内在的に発現しない親HEK細胞における特異性アッセイでは、Hisタグ付きFGF21とSABA1-FGF21v1はどちらもpERK1/2レベルを刺激しなかったが、陽性対照FGF1は刺激した（図14A）。タンパク質希釈液は同じだが標準アッセイHEKβ-クロトー安定細胞を使用する並行実験では、3つ全てのタンパク質が活性を示した（図14B）。したがってSABA1-FGF21v1は、アルブミンに結合している時でも、FGF21の特異性を保っている。
この細胞ベースアッセイでは、pERKリン酸化経路を活性化するのに必要な薬物の濃度を、まず最初に決定する必要があった。この目的のために、細胞培地中、HSAの存在下および非存在下で、細胞に融合タンパク質を滴定した。HSAを加える場合には、血流中に見いだされる生理的濃度（30〜40mg/mL、約500μMのHSA）で加えた。この濃度は、全てのFGF21-SABA融合タンパク質を飽和させるのに必要な濃度より数千倍高い。FGF21-SABA-HSA溶液結合定数は約4nMである（図11参照）。HSAの存在とは関わりなくアッセイ中のタンパク質融合物の活性に変化はなかったことから、融合タンパク質がHSAと複合体を形成している時もFGF21ドメインの活性は変化しないことが示された。
以下は実験方法の詳細な説明である。
HEK-β-クロトー安定細胞株の構築
ヒトβ-クロトーを安定に発現するHEK細胞株を構築した。ヒトβ-クロトーコンストラクトは、CMVプロモーターの制御下にあって、C末端FLAGタグを伴う、完全長タンパク質をコードしていた。Lipofectamine 2000（Invitrogenカタログ番号11668027）を製造者のプロトコールに従って使用し、標準的技法を使って、HEK293細胞を、線状化したcDNAでトランスフェクトした。L-グルタミン、Hepesを含有する高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（Invitrogenカタログ番号12430054）および10％FBS（HyCloneカタログ番号SH30071）中、600μg/mlのジェネティシン（Invitrogenカタログ番号10131）における14日間の選択後に、陽性クローンが単離された。陽性安定クローンを、ウェスタンブロット分析およびAlphaScreen（Perkin Elmerカタログ番号TGRES50K）分析によるp-ERK活性化によって、さらに特徴づけた。
HEKβ-クロトーpERK1/2アッセイ
ヒトβ-クロトーを安定に発現するHEK細胞を、96ウェル組織培養プレートにおいて、10％（v/v）FBS（Hyclone）および600μg/ml G418（Gibco）を含有するDMEM高グルコース培地（Gibco）中、20,000細胞/ウェルの密度でプレーティングした。翌日、培地を除去し、血清を含まないDMEM高グルコース培地で置き換え、細胞を終夜インキュベートした。3日目の朝、無血清培地を除去し、細胞を、3％（w/v）脂肪酸フリーヒト血清アルブミンを含有するPBS中に作成したタンパク質の希釈液と共に、合計7分間インキュベートした。希釈液は、三つ一組にして、3つのプレートのそれぞれで1ウェルずつ試験した。7分間のインキュベーションの終了時に、タンパク質希釈液を除去し、1ウェルにつき100μlの1×AlphaScreen溶解バッファー（Perkin-Elmer）を加え、振とうしながら約10〜15分間インキュベートした。細胞溶解物が入っているプレートを、-80℃で、少なくとも30分間またはアッセイの準備ができるまで凍結した。融解した細胞溶解物の各ウェルからの4μlを、384ウェル白色Proxiplate（Perkin Elmer）を使用し、Surefire AlphaScreen pERK1/2キット（Perkin Elmer）を製造者の指示に従って使用することにより、pERK1/2について分析した。プレートを暗所、室温で、2時間インキュベートしてから、Envision 2103マルチプレートリーダー（Perkin Elmer）で読み取った。Graph Pad Prismソフトウェアを使用し、非線形回帰分析を使って、データを分析した。
選択性アッセイは、β-クロトーを内在的に発現しない親HEK細胞化を使って、上記のように行った。これらの実験ではFGF1を陽性対照として使用した。
実施例B4．3T3-L1脂肪細胞におけるSABA1-FGF21v1のインビトロ活性
3T3-L1細胞（ATCC番号CL-173）は、マウス脂肪細胞に分化することができるマウス線維芽細胞である。β-クロトーは分化した3T3-L1細胞でしか発現しないので、実施例B3で述べたβ-クロトーpERK1/2アッセイを行う前に、それらをまず分化させる必要があった。HEK系におけるその活性と同様に、SABA1-FGF21v1は、3T3-L1脂肪細胞でもERKをリン酸化する能力を保持しており、この活性はHisタグ付きFGF21に匹敵する。結果を表16に示す。
［表16］3T3-L1脂肪細胞においてSABA1-FGF21v1活性はHisタグ付きFGF21に匹敵する
Figure 2013531477
以下は実験方法の詳細な説明である。
3T3-L1脂肪細胞の分化
細胞を、10％高品質（characterized）ウシ胎児血清（Hyclone #SH30071.03）および1×抗生物質-抗真菌剤（Gibco #15240-096）を補足したDMEM培地（Invitrogen #12430-054）中で成長させた。細胞は、37℃のインキュベーター中、5％CO2で培養した。トリプシン-EDTA溶液の代わりにTrypLE Express（Gibco #12605）を使用した点以外は、ATCCの製品情報シートに記載されている継代培養の手法に従った。
分化の約68時間前に、1ウェルあたり（培地150μl中）5500個の細胞を96ウェルプレート（Falcon #353072）に播種した。細胞数は播種の時間とそれらの倍加時間に応じて調節できるであろうが、分化手法を開始した時点で細胞は100％コンフルエントであった。分化を開始させるために、細胞上清を注意深く吸引し、200μlの新鮮な分化培地I（IBMX 500μM、デキサメタゾン100nM、インスリン240nMを含有する成長培地；全てSigma製）を各細胞ウェルに加えた。次に、細胞を41〜48時間インキュベートしてから、細胞上清を注意深く吸引し、200μlの分化培地II（240nMのインスリンを含有する成長培地）を各細胞ウェルに加えた。細胞を再び48時間インキュベートした後、細胞上清を注意深く吸引し、200μlの通常成長培地を各ウェルに加えた。次に、細胞をさらに48〜72時間インキュベートした。この時点で、細胞は脂肪細胞へと十分に分化しているだろう。
3T3-L1脂肪細胞におけるpERKアッセイの確立
分化の9日目から10日目に、成長培地を細胞から吸引除去し、細胞を、2％ウシ胎児血清を含む200μlのDMEM（Invitrogen #12320-032）で飢餓処理した。翌日、プレート中の96ウェル全てへの同時添加が保証されるようにTomtec Quadraを使って、飢餓細胞を、試験剤（FGF21またはその変異体の一つ）または対照としてのPBSを含有する100μlのDMEM＋0.1％脂肪酸フリーBSA（Sigma #A6003）で処理した。次に、プレートを、95％空気/5％CO2の37℃インキュベーター中で、7分間インキュベートした。7分後に、処置培地を細胞から除去し、100μlの溶解バッファーを各ウェルに加えた。溶解バッファー原液は、0.5mM DTT（Sigma、D9779）、5mMピロリン酸ナトリウム（Sigma、S6422）、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム（Sigma S6508）およびRocheのプロテアーゼインヒビタータブレット（#04693159001）を補足したPerkinElmerのAlphaScreen SureFire p-ERK1/2アッセイキット（カタログ番号TGRES10K）であった。検出プロトコールはアッセイキットに基づいた。すなわち、溶解バッファーを含むプレートをプレート振とう器上で約15分間撹拌し、−80℃で30分間凍結した。プレートを室温で融解し（約40分）、完全な溶解を保証するために融解物を（ピペットで20回上下させることにより）撹拌した。次に、各ウェルから4μlの溶解物を384ウェルプレートに移し、7μlの反応ミックス（キットのプロトコールに従って混合した活性化バッファーならびにIgG検出ドナーおよびアクセプタービーズ［PerkinElmer #6760617M］）を各ウェルに加えた。プレートを封止し、1〜2分間撹拌した後、遮光エリアにおいて22℃で2時間インキュベートした。最後に、PerkinElmer Envision 2103 Multilabel Readerで、標準的Alpha Screening設定を使って、プレートを読み取った。
実施例B5．糖尿病ob/obマウスにおけるSABA1-FGF21v1の生体内効力
FGF21は、3T3-L1脂肪細胞および初代ヒト脂肪細胞培養におけるグルコース取り込みを増加させることが示されている。したがって、糖尿病ob/obマウスにおける血漿中グルコースレベルを監視することは、FGF21-SABA融合タンパク質の機能的活性の評価を可能にする一方法になる。8週齢から始めて、7日間にわたって、糖尿病ob/obマウスに毎日、皮下投与を行った（1群あたりn＝8）。プロトコールは全てBMS ACUC委員会によって承認された。午前8:00から始まる7日目の投与の24時間後と3時間後の両方で、摂食時グルコースレベルを調べた。Hisタグ付きFGF21およびSABA1-FGF21v1はPBS中に製剤化し、それぞれ0.3mg/kgおよび1.0mg/kgの用量で投与した。
ヒトアルブミンに結合しているSABA1-FGF21v1の効力を評価するために、融合タンパク質（1mg/kg）をモル過剰のヒト血清アルブミン（6mg/kg）と共にインキュベートし、その混合物をもう一つの群に注射した（q.d.、s.c.、7日間）。もう一つの対照群としてヒト血清アルブミン（6mg/kg）を使用した。
図15に示す結果は、SABA1-FGF21v1が投与の3時間後にPBS媒体対照と比べてグルコースを29％低下させ、この低下は7日目のHisタグ付きFGF21によるそれに匹敵することを示している（図15A）。これに対し、SABA1-FGF21v1とヒトアルブミンの組合せは、HSA対照と比べて血漿中グルコースレベルを46％低下させた。
投与の24時間後は、SABA1-FGF21v1によるグルコース低下の強さが7％であるのに対し、SABA1-FGF21v1とHSAの組合せは41％だったので、7日目の最後の投与後24時間は持続したことになる（図15B）。したがってSABA1-FGF21v1は、ヒト血清アルブミンに結合している時にも、ob/obマウスにおける血漿中グルコースレベルを低下させるのに、極めて有効であった。ヒトアルブミンを伴うおよびヒトアルブミンを伴わないSABA1-FGF21v1の曝露を表17および18に示す。SABA1-FGF21v1の曝露は、ヒト血清アルブミンの存在下の方が、その非存在下より大きい。
［表17］投与の3時間後のHisタグ付きFGF21およびSABA1-FGF21v1の血漿中濃度
Figure 2013531477
 SD：標準偏差
［表18］投与の24時間後のHisタグ付きFGF21およびSABA1-FGF21v1の血漿中濃度
Figure 2013531477
 ＜LLOQは定量下限未満である。
実施例B6．マウスおよびサルにおけるSABA1-FGF21v1の血漿中t 1/2 の測定
Hisタグ付きFGF21およびSABA1-FGF21v1の薬物動態を特徴づけるために、マウスおよびサルにおいて、さまざまな生体内研究を行った。ELISAベースのリガンド結合アッセイを使って、全てのマウスおよびサル血漿試料中のHisタグ付きFGF21およびSABA1-FGF21v1を測定した。
静脈内投与および皮下投与後のマウスにおけるHisタグ付きFGF21およびSABA1-FGF21v1の薬物動態
Hisタグ付きFGF21
CD-1マウスにおける静脈内投与（1mg/kg）後、Hisタグ付きFGF21の定常状態分布容積（Vss）は0.27L/kgだった。全身血漿クリアランス（CLTp）値は12mL/分/kgだった。終末相半減期（T1/2）は0.5時間だった。皮下投与後、Hisタグ付きFGF21はよく吸収された。絶対皮下バイオアベイラビリティは約100％だった。見掛けの皮下終末相半減期（T1/2）は0.6時間だった。
SABA1-FGF21v1
CD-1マウスにおける静脈内投与（1.6mg/kg）後、SABA1-FGF21v1の定常状態分布容積（Vss）は0.12L/kgだった。全身血漿クリアランス（CLTp）値は2.9mL/分/kgだった。終末相半減期（T1/2）は1.9時間で、Hisタグ付きFGF21（0.5h）より長かった。皮下投与後、SABA1-FGF21v1はよく吸収された。見掛けの皮下終末相半減期（T1/2）は1.9時間だった。
また、SABA1-FGF21v1をヒト血清アルブミン（6mg/kg）との前混合後に1mg/kgの用量でob/obマウスに皮下投与した。見掛けの皮下終末相半減期（T1/2）はさらに9時間に増加した。
静脈内投与および皮下投与後のサルにおけるHisタグ付きFGF21およびSABA1-FGF21v1の薬物動態
Hisタグ付きFGF21
静脈内投与（0.5mg/kg）後、Hisタグ付きFGF21の定常状態分布容積（Vss）は1L/kgだった。全身血漿クリアランス（CLTp）値は6.4mL/分/kgだった。終末相半減期（T1/2）は1.9時間だった。皮下投与後、Hisタグ付きFGF21はよく吸収された。絶対皮下バイオアベイラビリティは65％だった。見掛けの皮下終末相半減期（T1/2）は4.3時間だった。
SABA1-FGF21v1
静脈内投与（0.08mg/kg）後、SABA1-FGF21v1の定常状態分布容積（Vss）は0.08L/kgだった。全身血漿クリアランス（CLTp）値は0.012mL/分/kgだった。終末相半減期（T1/2）は97時間だった。皮膚投与後、SABA1-FGF21v1はよく吸収された。絶対皮下バイオアベイラビリティは68％だった。見掛けの皮下終末相半減期（T1/2）は67時間だった。
図16は、例示的融合物であるSABA1-FGF21v3（配列番号134）と、SABA部分がFGF21のC末端にあるFGF21-SABA1v1（配列番号171）の、サルにおけるt1/2を、Hisタグ付きFGF21と比較して示している。これらの結果は、FGF21のみと比較して、融合物がt1/2を約27倍増加させたことを示している。データを下記表19に要約する。
［表19］SABA-FGF21融合物に関する薬物動態データ
Figure 2013531477
実施例B7．SABA1-FGF21v1はob/obマウスにおけるHbA1cを低下させる
SABA1-FGF21v1のさらなる急性および慢性効果を糖尿病ob/obマウスにおいて調べた。毎日の処置を3週間にわたって行った後の研究終了時に、血漿中グルコース、インスリン、および総コレステロールを観察した。血漿中アラニンアミノトランスフェラーゼは低下し、β-ヒドロキシ酪酸レベルは上昇した。経口ブドウ糖負荷試験において、SABA1-FGF21v1処置動物は、グルコース負荷を処理する能力の増加を示した。
もう一つの実験は、SABA1-FGF21v1の3つの異なる用量（0.01または0.1または1mg/kg）のうちの1つをヒト血清アルブミン（6mg/kgのHSA）と前もって混合し、それを14日間にわたって注射（s.c.、q.d.）した糖尿病ob/obマウス（1群あたりn＝8）において行った。対照群にはHSA（PBS中の6mg/kg）だけを与えた。最後の投与の24時間後に、血漿試料中のHbA1cを測定した（図19参照）。対照群（HSAのみを与えたもの）は、ベースライン値と比べてHbA1cレベルの低下を示さなかった。最も低い用量（0.01mg/kg）は低下を示さず、中間用量（0.1mg/kg）は統計的に有意でない0.39％の低下を示した。最も高い用量である1mg/kg（すなわちmpk）は、HbA1cに、ベースラインに対して0.9％、媒体との比較で0.94％の低下を示し、これらは統計的に有意だった。したがって、ヒトアルブミンと同時注射したSABA1-FGF21v1は、糖尿病マウスにおけるHbA1cレベルを低下させるのに有効であった。
0.01、0.1および1mg/kg用量での血漿中SABA1-FGF21v1レベルは、最後の投与の24時間後に、それぞれ3.85、2.28および28.73ng/mlだった。
実施例B8．カニクイザルにおけるSABA1-FGF21v1の薬物動態
静脈内（IV）投与後、SABA1-FGF21v1の定常状態分布容積（Vss）は0.076L/kgだった。この値は血漿体積より大きいが細胞外液の体積よりは小さかったことから、SABA1-FGF21v1は主に細胞外間隙に存在することが示された。SABA1-FGF21v1の全身血漿クリアランスは低く（0.71mL/時間/kg）、サル血清アルブミンへの高アフィニティ結合と合致していた。終末相半減期（T1/2）は97時間だった（図20および表20参照）。さらにまた、SABA1-FGF21v1はサルにおいて良好な皮下（SC）バイオアベイラビリティを示した（図20および表20参照）。絶対SCバイオアベイラビリティは68％だった。
［表20］サルにおけるSABA1-FGF21v1の単回投与薬物動態パラメータ（平均±SD）
Figure 2013531477
 *3匹のうちの1匹では投与の24時間後の血漿試料が収集されなかった；サル：N＝2（IV）および3（SC）。
C．SABA-合成ペプチド融合物分子
実施例C1．化学的に誘導されたスペーサーによって連結されたSABA-合成ペプチド融合物分子に使用するためのSABAポリペプチドの調製
合成的に誘導されたペプチドにコンジュゲートしてSABA融合タンパク質を形成させるためのSABA1.7-(ED)5G-Cysポリペプチドを、以下に述べる方法を使って作製した。このプロセスは、ポリペプチドリンカーによって共有結合されたSABA-ペプチド融合物を作製するためにも使用することができる。
(ED)5G C末端テール（配列番号397）とC末端His残基とを伴うSABA1.7（配列番号225）（SABA1.7-(ED)5G-Cys）をコードするDNA配列を、市販の発現ベクターpET29b（EMD Biosciences、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に入れた。リボソーム結合部位のすぐ下流にあるプラスミドベクターのNDEI制限エンドヌクレアーゼ部位とXHOI制限エンドヌクレアーゼ部位の間に、配列を適切に配置した（図10）。発現ベクターを宿主株BL21(DE3)（EMD Biosciences）に形質転換し、封入体として発現させた。
精製したプラスミドDNA発現ベクターを、当業者に広く知られている標準的形質転換法により、上記の大腸菌に組み込んだ、すなわち「形質転換」した。簡単に述べると、市販のコンピテント細胞（EMD Biosciences）を氷上で融解し、細胞が均等に懸濁されていることを保証するために、静かに混合した。これらの細胞を、氷上で予冷しておいた1.5mlポリプロピレン製微量遠心チューブに、20μlずつピペッティングした。約1μlの精製プラスミドDNA（1〜10ng/μlプラスミド）を細胞に直接加え、混合するために静かに振とうした。チューブを氷上に5分間保った後、正確に30秒間、42℃の水浴で加熱した。加熱したチューブを直ちに氷上に置き、2分間休ませた。80μlの室温SOCまたはLB培地を各チューブに加えた。形質転換体の選択は、pET29bプラスミドがコードする薬物耐性用に、カナマイシンを含有する培地で平板培養することによって達成した。
形質転換された細胞の終夜スターター培養を成長させることにより、大腸菌における可溶性SABA1.7-(ED)5G-Cysの発現を開始した。細胞を、それぞれ1リットルのOvernight Express（商標）培地（EMD Biosciences、およびNature Methods 2, 233-235, 2005）が入っている2リットル振とうフラスコの接種に使用した。可溶物収量を改善するために、振とうインキュベータの温度を18℃まで低下させることができる。発酵を12〜16時間継続させ、遠心分離によって細胞を収穫し、圧縮湿細胞ペーストとして−80℃で凍結した。タンパク質封入体（IB）の形成は、それが保護と、宿主細胞プロテアーゼ切断を最小限に抑えることに役立つので、好ましいことがわかった。
細胞溶解および封入体（IB）ペレットの調製
細胞を融解し、圧縮細胞ペースト1部に対してバッファー8〜10部の希釈度で、溶解バッファーに懸濁した。Avestin C-5ホモジナイザー（Avestin Inc.、カナダ・オンタリオ州オタワ）を使って、2000PSIで2回通すことにより、細胞を機械的に溶解した。溶解後に、溶解物を遠沈した（4,000RPMで20〜30分間）。可溶性画分は捨てる。細胞片を除去するために封入体ペレットを0.5％Triton X-100で洗浄し、その懸濁液を再び遠心分離した。このプロセスを（典型的には2回または3回）繰り返した後は、ペレットが均一な白色に見える。次に、その結果得られた濃縮IB調製体ペレットをPBSバッファーで洗浄することで、過剰の界面活性剤を除去した。
封入体の可溶化
次に、洗浄し界面活性剤を枯渇させたIBペレットを、50mMトリス-HCl（pH8.0）と500mM NaClで緩衝化した6Mグアニジン-HClに可溶化した。この方法で調製した材料の大半は、自由に溶液相に入るが、少量の細胞片が残るので、SS-34ローター中、16,000RPMで1時間の遠心分離によって、これを除去した。リフォールディングおよび酸化ステップのために、上清をとっておいた。あるいは、この段階で、金属キレーションクロマトグラフィーステップ（IMAC）を使って、6×Hisタグを含有するタンパク質を捕捉して、さらに精製することができる。カオトロープで変性させた材料をカラムに結合させ、夾雑物を洗浄してから、イミダゾールを補足した変性バッファーの存在下で溶出させることができる。
リフォールディング（および酸化の制御）
グアニジン-HClで可溶化した材料を約1mg/mLタンパク質（280nMの吸光度で推定）に希釈し、3.5MWCO透析チューブに入れた。次に、透析デバイス中の試料を、4Lのリフォールドバッファー（50mMトリス、150mM NaCl、1mM EDTA、pH9.0）に、4℃で終夜、静かに撹拌しながら浮かせた。透析リフォールドバッファーは、翌朝に、新鮮なリフォールドバッファーと交換する。
このプロセスの間に、融合タンパク質のジスルフィド酸化および/または架橋形成の調整を、必要に応じて達成することができる。適正な最終形態に到達するには、ジスルフィド橋がそのポリペプチド配列中の2つのシステイン残基間に形成されることを必要とするアミリンなどのペプチドの場合は、透析プロセス中に系を空気酸化させる。後で目的のペプチドにマレイミドコンジュゲートすることができるように還元型でなければならない単一のシステイン残基を含有するSABA1.7-(ED)5G-Cysの場合は、リフォールドプロセスの最後に還元剤（例えばTCEP、トリス[2-カルボキシエチル]ホスフィン（TCEP）、またはジチオスレイトール（DTT））を添加することによって、酸化を最小限に抑えることができる。酸化を極力伴わないリフォールディングは、Cysアミノ酸のチオラートアニオンが生じてジスルフィド橋形成を開始することが容易ではないpH4.5におけるリフォールディングによって達成することもできる。
この簡便な透析法は便利であり、必要であればいくつかの試料を一度に処理することができる。あるいは、グアニジン-HClの代わりに尿素中でタンパク質を変性させることもできる。あるいは、高いカオトロピック塩濃度から低い塩濃度への分子の急速希釈を使って、リフォールディングと酸化を行うこともできる。あるいは、空気酸化の代わりに、還元型および酸化型グルタチオン（GSH/GSSG）の所定の酸化還元混合物を使って、系をリフォールディングさせることもできる。あるいは、上述のように透析または急速希釈によって自由拡散相でこれらのタンパク質をリフォールディングさせる代わりに、クロマトグラフィー樹脂に結合している間に、これらをリフォールディングさせてもよい。バルク凝集と収量損失につながりうるリフォールディング相中のタンパク質相互作用が最小限に抑えられるので、この方法では収率が改善されることが多い。
沈殿剤（precipitant）の除去
リフォールドステップ（および必要であれば酸化ステップ）の終わりに、タンパク質の全てが可溶性のままであるわけではない。分子の一部は、凝集した状態で存在し、沈殿物（precpitatant）として溶液から容易に降下する。この物質を、SS-34ローターで1時間、16,000RPMで遠心分離することによって除去した。そして、典型的には、クロマトグラフィーに先だって、これを0.2μmシリンジフィルターで濾過する。
クロマトグラフィー分離
DNAおよび他の夾雑物を除去するために、リフォールディングされたSABA1.7-(ED)5G-Cysを、Resource Qまたは類似のイオン交換媒体系（GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使って精製することができる。40mL Resource Qカラムをリフォールドバッファー（150mM NaCl、1mM EDTAを含む50mMトリス、pH9.0）中で平衡化し、清澄化したリフォールディングされた材料を、そのカラムに通す。これらの条件下で、ポリペプチドの大部分は、結合せずに樹脂ベッドを通過する。洗浄された封入体からのDNAおよび他の細胞片は、カラム樹脂上に保持される。あるいは、6×Hisタグを含有するフォールディングされたポリペプチドを、この時点で、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）ステップを使って捕捉し、イミダゾールまたはヒスチジンの勾配で溶出させることもできる。
サイズ排除クロマトグラフィー
次に、PBSバッファー（pH7.2）中で前平衡化した26/60 Sephacryl S100または26/60 Superdex 75サイズ排除カラム（GE Healthcare、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使って、SABA1.7-(ED)5G-Cysをさらに精製することができる。単量体型タンパク質に対応する試料をプールし、必要であれば試料を1〜2mg/mlに希釈してから、−80℃で凍結した。ここで発現し精製されるタンパク質の発現および精製収率はさまざまである。これらの方法を使って、封入体を生産した元の自己誘導培地1Lにつき、0.5〜10mg以上の精製収量を得ることができる。
実施例C2．化学的に誘導されたスペーサーによって連結されたSABA-神経ペプチド融合物分子に使用するための神経ペプチドの化学合成
実施例C2-1：3-マレイミドプロピオニル-PEG 20 -ラットアミリン：Mal-(PEG) 20 -KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY-NH 2 の合成
ペプチドは、Libertyマイクロウェーブペプチドシンセサイザー（CEM Corp.、ノースカロライナ州マシューズ）を使って、固相合成によって調製した。Fmoc脱保護およびカップリングステップは、20Wの電力パルス印加シーケンスによってもたらされるマイクロ波加熱を使って、75℃で行った。反応容器中に挿入した光ファイバープローブで反応温度を監視した。合成は、50mLポリプロピレン容器に入れた0.25mmolのFmoc保護PAL-PEGレジン（0.34mmol/g）から開始した。製造者によって提供された0.25mmolスケール法を使ってアミノ酸をカップリングした。各カップリングステップの最初に、0.1M HOBtを含有するDMF中の5％ピペラジンによる5分間の処置を2回行うことによって、Fmoc基を除去した。20mLのDMFによる洗浄を5回行った後、DMF中の0.5M HCTU（4当量）とNMP中の2M DIEA（8当量）で活性化することによって、必要なFmoc-アミノ酸を逐次的にカップリングした。各カップリングの最後に、レジンを20mLのDMF洗浄液で5回洗浄した。Fmoc-PEG20のカップリングに先だって、ペプチジル-レジン（0.125mmol）の半分を取り除き、Fmoc-PEG20を上述のように合成装置でカップリングした。Fmoc脱保護ペプチジル-レジンを、フリット付きポリプロピレンリアクターに移し、HOAt/DIC（5当量）による16時間の活性化によって、3-マレイミドプロピオン酸を手作業でカップリングした。ペプチジル-レジンをDMF（5mL×4）およびDCM（5mL×4）で洗浄し、再びDMF（5mL×4）で洗浄した。I2（20当量）のDMF（10mL）溶液を加え、その混合物を1時間撹拌した。レジンをDMF（5mL×5）およびDCM（5mL×3）で洗浄することにより、所望のラットアミリンペプチド誘導体Mal-(PEG)20-KCNTATCATQ RLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2(アミド)を、環状ジスルフィド生成物として得た。
TFA/水/フェノール（90：5：5；v：v：w）（15mL）を使って室温で90分間処理することにより、ペプチドを脱保護し、リジンから遊離させた。使用済みのレジンを濾去し、追加の切断溶液（2.5mL×2）ですすいだ。合わせた濾液を約4mLまでエバポレートし、Et2O（35mL）の添加によって生成物を沈殿させた。沈殿した生成物を遠心分離によって集め、追加のEt2Oで洗浄し、乾燥することで、オフホワイトの固形物（理論値の50％）を得た。
次に述べるように島津モデルLC-8A液体クロマトグラフィーでの分取用RP-HPLCによって、粗ペプチドを精製した。ペプチドを水/AcCN/TFA（60：40：0.1）に溶解し、0.45ミクロンフィルターで濾過し、一度に30mgをPhenomenex Luna C18カラム（21.2×100mm；5μ）に注入した。45分にわたるA中の25−45％Bの勾配を使って、15mL/分で生成物を溶出させた（220nmにおけるUV検出）。溶媒A：水中の0.1％TFA；溶媒B：AcCN中の0.1％TFA。分析用HPLCによる決定できれいな生成物を含有するフラクションを合わせて凍結乾燥することで、純度が少なくとも95％の生成物を白色凍結乾燥物として得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのLC/MS分析によって確認した。実測されたm/zイオン(M＋3H)3＋/3＝1464.0および(M＋4H)4＋/4＝1097.9は、分子量計算値4389.9Dと合致している。
実施例C2-2：3-マレイミドプロピオニル-(GS) 5 -ラットアミリン：Mal-GSGSGSGSGS-KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY-NH 2 の合成
実施例C2-1に記載したものと同じ固相カップリングおよびジスルフィド環化法を使ってペプチドを調製することにより、所望のラットアミリンペプチド誘導体Mal-GSGSGSGSGS-KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2(アミド)を環状ジスルフィド生成物として得た。脱保護とレジンからの遊離後に、40分にわたるA中の10-55％Bの勾配を使ってペプチドを溶出した点以外は実施例C2-1で述べたとおりに、分取用RP-HPLCで粗ペプチドを精製することにより、純度が少なくとも98％の生成物を得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのLC/MS分析によって確認した。実測されたm/zイオン(M＋3H)3＋/3＝1598.3および(M＋4H)4＋/4＝1199.3から導き出される4792.2Dという分子量は、分子量計算値4791.2Dの1ダルトン以内にある。
実施例C2-3：3-マレイミドプロピオニル-Ahx-マウスPYY(3-36)：Mal-Ahx-AKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH 2 の合成
実施例C2-1に記載したものと同じ固相法を使ってこのペプチドを調製することにより、所望のマウスPYY(3-36)ペプチド誘導体Mal-Ahx-AKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2を得た。Ala12-Ser13残基対とAla22-Ser23残基対は、Fmoc-Ala-Ser(ΨMe,Mepro)-OHシュードプロリンジペプチド（EMD Chemicals, Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ）としてカップリングした。脱保護およびレジンからの遊離後に、45分にわたるA中の5-50％Bの勾配を使ってペプチドを溶出した点以外は実施例C2-1で述べたとおりに、分取用RP-HPLCで粗ペプチドを精製することにより、純度が少なくとも97％の生成物を得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのLC/MS分析によって確認した。実測されたm/zイオン(M＋3H)3＋/3＝1415.8および(M＋4H)4＋/4＝1062.2は、分子量計算値4244.7Dと合致している。
実施例C2-4：3-マレイミドプロピオニル-PEG 20 -マウスPYY(3-36)：Mal-PEG 20 -AKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH 2 の合成
Fmoc-6-Ahx-OHの代わりにFmoc-PEG20-OHをカップリングした点以外は実施例C2-3に記載したものと同じ固相カップリング法を使ってこのペプチドを調製することにより、所望のマウスPYY(3-36)ペプチド誘導体Mal-PEG20-AKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2を得た。脱保護およびレジンからの遊離後に、実施例C2-3に記載したように分取用RP-HPLCで粗ペプチドを精製することにより、純度が少なくとも86％の生成物を得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのLC/MS分析によって確認した。実測されたm/zイオン(M＋3H)3＋/3＝1484.8および(M＋4H)4＋/4＝1113.5は、分子量計算値4449.9Dと合致している。
実施例C2-5：3-マレイミドプロピオニル-(GS) 5 -マウスPYY(3-36)：Mal-GSGSGSGSGS-AKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH 2 の合成
このペプチドは、GenScript USA, Inc.（ニュージャージー州ピスカタウェイ）により、実施例C2-3に記載したものと同様の固相法を使ってカスタム合成され、所望のマウスPYY(3-36)ペプチド誘導体Mal-GSGSGSGSGS-AKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQ RY-NH2を95％の純度で得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのLC/MS分析によって確認した。実測されたm/zイオン(M＋3H)3＋/3＝1618.5および(M＋4H)4＋/4＝1214.1は、分子量計算値4852.2Dと合致している。
実施例C2-6：3-マレイミドプロピオニル-Ahx-マウスPP：Mal-Ahx-APLEPMYPGDYATPEQMAQYETQLRRYINTLTRPRY-NH 2 の合成
実施例C2-3に記載したものと同じ固相法を使ってこのペプチドを調製することにより、所望のマウスPPペプチド誘導体Mal-Ahx-APLEPMYPGDYATPEQMAQYETQLRRYINTLTRPRY-NH2(アミド)を得た。Ala12-Thr13残基対は、Fmoc-Ala-Thr(ΨMe,Mepro)-OHシュードプロリンジペプチド（EMD Chemicals, Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ）としてカップリングした。脱保護およびレジンからの遊離後に、実施例C2-3で述べたとおりに分取用RP-HPLCで粗ペプチドを精製することにより、純度が少なくとも99％の生成物を得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのLC/MS分析によって確認した。実測されたm/zイオン(M＋3H)3＋/3＝1533.5および(M＋4H)4＋/4＝1150.4から導き出される4597.5Dの分子量は、分子量計算値4598.2Dの1ダルトン以内にある。
実施例C2-7：3-マレイミドプロピオニル-PEG 20 -マウスPP：Mal-PEG 20 -APLEPMYPGDYATPEQMAQYETQLRRYINTLTRPRY-NH 2 の合成
Fmoc-6-Ahx-OHの代わりにFmoc-PEG20-OHをカップリングした点以外は実施例C2-6に記載したものと同じ固相法を使ってこのペプチドを調製することにより、所望のマウスPPペプチド誘導体Mal-PEG20-APLEPMYPGDYATPEQMAQYETQLRRYINTLTRPRY-NH2(アミド)を得た。脱保護およびレジンからの遊離後に、実施例C2-3で述べたとおりに分取用RP-HPLCで粗ペプチドを精製することにより、純度が少なくとも91％の生成物を得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのLC/MS分析によって確認した。実測されたm/zイオン(M＋3H)3＋/3＝1601.9および(M＋4H)4＋/4＝1201.7から導き出される4803.0Dの分子量は、分子量計算値4803.4Dの1ダルトン以内にある。
実施例C2-8：3-マレイミドプロピオニル-(GS) 5 -マウスPP：Mal-GSGSGSGSGS-APLEPMYPGDYATPEQMAQYETQLRRYINTLTRPRY-NH 2 の合成
このペプチドは、GenScript USA, Inc.（ニュージャージー州ピスカタウェイ）により、実施例C2-6に記載したものと同様の固相法を使ってカスタム合成され、所望のマウスPPペプチド誘導体Mal-GSGSGSGSGS-APLEPMYPGDYATPEQMAQYETQLRRYINTLTR PRY-NH2(アミド)を、90％の純度で得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのLC/MS分析によって確認した。実測されたm/zイオン(M＋4H)4＋/4＝1302.5および(M＋5H)5＋/5＝1042.1は、分子量計算値5205.7Dと合致している。
実施例C2-9：ヒトオステオカルシン：YLYQWLGAPVPYPDPLEPRREVCELNPDCDELADHIGFQEAYRRFYGPV（Cys 23 -Cys 29 ジスルフィドによって環化したもの）の合成
線状ペプチドは、GenScript USA, Inc.（ニュージャージー州ピスカタウェイ）により、実施例C2-6に記載したものと同様の固相法を使ってカスタム合成され、ヒトOCNの所望の線状前駆体を87％の純度で得た。ペプチドの酸化的ジスルフィド環化は、50mMトリスバッファー（pH8.1）、5mM還元型グルタチオンおよび0.5mM酸化型グルタチオン中の線状ペプチドの溶液（0.5mg/mL；20mL）を室温で4日間撹拌することによって達成した。その溶液をロータリーエバポレーションによって10mLまで濃縮し、40分にわたるA中の20-50％Bの勾配を溶出に使用した点以外は実施例C2-1で述べたとおりに、分取用HPLCでペプチドを精製した。これにより、所望の環状ヒトOCNペプチドを99％の純度で得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのLC/MS分析によって確認した。実測されたm/zイオン(M＋3H)3＋/3＝1933.3および(M＋4H)4＋/4＝1449.8は、分子量計算値5797.4Dと合致している。
実施例C2-10：マウスオステオカルシン：YLGASVPSPDPLEPT REQCELNPACDELSDQYGLKTAYKRIYGITI（Cys 19 -Cys 25 ジスルフィドによって環化したもの）の合成
線状ペプチドは、GenScript USA, Inc.（ニュージャージー州ピスカタウェイ）により、実施例C2-9に記載したものと同様の固相法を使ってカスタム合成され、マウスOCNの所望の線状前駆体を90％の純度で得た。このペプチドを、実施例C2-9で述べたように環化し、分取用HPLCで精製することにより、環状マウスOCNペプチドを98％の純度で得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのLC/MS分析によって確認した。実測されたm/zイオン(M＋3H)3＋/3＝1705.3および(M＋4H)4＋/4＝1279.5は、分子量計算値5114.7Dと合致している。
実施例C2-11：ラットオステオカルシン：YLNNGLGAPAPYPDPLEPH REVCELNPNCDELADHIGFQDAYKRIYGTTV（Cys 23 -Cys 29 ジスルフィドによって環化したもの）の合成
このジスルフィド環状ペプチドは、GenScript USA, Inc.（ニュージャージー州ピスカタウェイ）により、実施例C2-9に記載したものと同様の固相法および酸化的環化法を使ってカスタム合成され、所望の環状ラットOCNを96％の純度で得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのLC/MS分析によって確認した。実測されたm/zイオン(M＋3H)3＋/3＝1862.5および(M＋4H)4＋/4＝1397.5は、分子量計算値5586.1Dと合致している。
実施例C3．化学的に誘導されたスペーサーにより、マレイミドコンジュゲーション反応を使って連結された、SABA-アミリン、SABA-PYYおよびSABA-PP融合物分子の形成
Q Sepharoseカラム（GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で上に概説したように精製したSABA1.7-(ED)5G-Cysタンパク質を0.5mM TCEPで還元した。50mM酢酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH5.2中で平衡化したSuperdex75カラム（GE Healthcare）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、TCEPを除去し、タンパク質をさらに精製した。溶出したSABA1.7-(ED)5G-Cysタンパク質を、このバッファー中で、モル比1：1のマレイミド-PEG20-アミリン-CONH2、マレイミド-PEG20-PYY-CONH2またはマレイミド-PEG20-PP-CONH2合成ペプチドと合わせ、静かに振とうしながら4℃で終夜インキュベートした。インキュベーション後に、反応混合物を0.2μmフィルターで濾過し、PBS pH7.4中のSuperdex75 SECカラムを使って、修飾タンパク質SABA1.7-(ED)5G-Cys-PEG20-アミリン-CONH2（配列番号328）、SABA1.7-(ED)5G-Cys-PEG20-PYY-CONH2（配列番号344）またはSABA1.7-(ED)5G-Cys-PEG20-PP-CONH2（配列番号364）を、遊離の反応物から単離した。
実施例C4．ヒト血清アルブミンへのSABA-神経ペプチド（アミリン、PYYおよびPP）融合物の結合効力
表面プラズモン共鳴（SPR）は、分子相互作用をリアルタイムに観察することができる直接結合技法である。これらの実験では、ProteOn XPR36機器（BioRad Laboratories）を使ってSPR結合研究を行った。ランニングバッファーであるリン酸緩衝食塩水0.05％ Tween20 pH7.4はTeknovaから購入し（カタログ番号P1192）、全ての実験を25℃で行った。ヒト血清アルブミンは、BioRad Laboratoriesから購入したアミンカップリング試薬を使用し、製造者の指針に従って、アミンカップリングにより、BioRad GLCチップ上に直接固定化した。ヒト血清アルブミンはNovozymesから購入した（Recombumin（商標））。約5000レゾナンスユニット（RU）のヒト血清アルブミンを、GLCチップ表面の別々の4レーン上に固定化した。各分析物について、15.6nMから250nMまでの範囲にわたる5つの濃度を、30μl/分で、240秒間、表面上に注入した。解離を600秒間監視した。表面を100mM HClで再生した。その結果得られたデータを、ProteOn Managerソフトウェアを使って、ラングミュア1：1結合モデルにフィッティングした。異なる濃度範囲で実験を繰り返した。この第2の実験では、500nMから32nMまでの範囲にわたる5つの濃度を表面上に注入し、上記のようにデータを分析した。これらの実験の結果を平均し、表21に示す。KDは解離定数である。小さい数字は血清アルブミンへの強固な結合を示す。血清アルブミンに結合するSABAに共有結合された分子は、SABA-FGF-21融合物に関して先に述べたように、より長い生体内薬物動態半減期を示す。
［表21］ヒト血清アルブミンへの結合に関するSABA-神経ペプチド融合物のKon、KoffおよびKD値
Figure 2013531477
実施例C5．SABA-合成ペプチド融合物のインビトロ活性
実施例C5-1：SABA-アミリン融合物のインビトロ活性
アミリンは、Gs共役GPCRであるアミリン受容体を活性化することによって細胞環状アデノシン一リン酸（cAMP）生産を誘導する。したがって細胞cAMP生産は、アミリンアゴニストのインビトロでの機能的活性の読出しとして使用される。具体的には、力価（EC50）および効力（アミリンペプチドで観察される最大活性に対するパーセンテージとして）などといったインビトロ活性を、SABA1-AMYv25（配列番号328）タンパク質について決定した。
下記表22に示すように、SABA1-AMYv25は、アミリン受容体を安定に発現するHEK細胞におけるcAMP生産を刺激する。SABA1-AMYv25の力価（EC50）は12.2nMであり、効力はアミリンペプチドの約119％である。したがってSABA1-AMYv25は、SABAに連結されていても、インビトロアッセイにおいて完全なアミリンの機能的活性を保っている。さらなる実験において、ラットアミリンとSABA1-AMYv25はどちらもHEK親細胞におけるcAMPレベルに対して有意な効果を持たなかったことから、アミリン受容体に対するそれらの特異性が実証された。
アミリン受容体安定細胞株の構築
アミリン受容体は、カルシトニン受容体（CT）と受容体活性調節タンパク質（RAMP）の一つとのヘテロ二量体である。チンパンジーCT(a)とヒト受容体活性調節タンパク質3（RAMP3）との両方をHEK-293細胞に安定にトランスフェクトすることにより、組換えアミリン受容体細胞株を作製した。ラットアミリン、サケカルシトニン、ヒトカルシトニンおよびヒトCGRPなどといったいくつかのアミリンアゴニストペプチドを使って、これらの組換え受容体細胞株を選択し、特徴づけた。安定細胞株は、300μg/mlネオマイシンおよび250μg/mlハイグロマイシンを含む完全DMEM中、37℃および5％CO2で培養した。
SABA1-AMYv25活性を評価するためのインビトロ環状AMP（cAMP）機能アッセイ
Cisbio（マサチューセッツ州ベッドフォード）製のHTRF（登録商標）cAMPアッセイキットを使ってcAMPアッセイを行った。アミリン受容体安定細胞を、BD Falcon（商標）75cm2フラスコ（BD Biosciences、マサチューセッツ州ベッドフォード）において、培地（10％FBS、300μg/mlネオマイシンおよび250μg/mlハイグロマイシンを含むDMEM）中、37℃および5％CO2で成長させた。Invitrogen製の細胞解離バッファー（酵素フリー）を使って細胞をフラスコから収穫した。PBSバッファーで1回洗浄した後、細胞をアッセイバッファー（HBSSバッファー、2.5mM HEPES、pH7.5、100μM IBMX）に再懸濁し、96ウェルアッセイプレートにローディングした（約2,000細胞/ウェル）。次に細胞を、アミリンペプチドまたはSABA-アミリンと共に、37℃で30分間インキュベートした。細胞中のcAMP量を製造者のプロトコール（Cisbio）に従って決定した。
実施例C5-2：SABA-PYY 3-36 およびSABA-PP融合物のインビトロ活性
ペプチドYY（PYY）および膵ポリペプチド（PP）は、摂食に呼応してそれぞれ腸および膵臓から分泌される天然の満腹因子であり、絶食すると減少する。PYYおよびPPは、どちらも、36残基ペプチドアミドである完全長型で単離することができる。PYYは、酵素DPPIVによってさらに切断されて、より短い生物活性型PYY(3-36)にもなりうる。PYY(3-36)またはPPの末梢注射は、動物モデルおよびヒトにおいて、食物摂取量と体重の低下を引き起こす。病的肥満を有する患者では、基礎および食餌刺激時PYY(3-36)および/またはPPレベルが、どちらも低下している。対照的に、食欲不振またはバイパス手術後の体重減少を伴う患者では、血漿中PYY(3-36)および/またはPPが正常より高い。PYY(3-36)およびPPのアゴニズムは、肥満および代謝性疾患の処置に大きな治療的価値を有する。NPY Y2およびY4は、それぞれPYY(3-36)およびPPに対して最も高いアフィニティを有する受容体である。NPY受容体はG-タンパク質共役受容体ファミリーに属する。アゴニスト刺激を受けると、NPY受容体は、下流のG-タンパク質を刺激して、その結合型GDPをGTPと交換しうる。競合結合アッセイを使って、それぞれの受容体に対するSABA1-PYYv7（配列番号344）およびSABA1-PPv7（配列番号364）の結合アフィニティを測定し、GTPγS結合アッセイを使って、最初期の受容体媒介イベントの一つにおける受容体占有の機能的結果を測定した。
表22に示すように、記載のアッセイにおいて測定された力価（EC50）は、PYY3-36については0.6nMであり、SABA1-PYYv7融合物については52nMである。記載のアッセイにおいて測定された力価（EC50）は、PPについては1.7nMであり、SABA1-PPv7融合物については＞1μMである。SABA1-PPv7融合物に関する力価の減少は、SABAとPPポリペプチドをコンジュゲートするために使用したPEG20リンカーによるのかもしれない。PEG20リンカーはこのコンストラクトでは最適とは言えないかもしれないので、SABA-PP融合物の力価を改善するには、代替リンカーを持つコンストラクトが使用されるであろう。
受容体膜調製：
ヒトNPY Y2またはY4受容体を過剰発現する組換えCHO細胞のT150フラスコ1本を、0.5mg/mlのG418を含むF-12培地（L-グルタミン酸を含むHAM）でコンフルエントになるまで成長させた。収穫前に細胞をPBS（Ca2＋およびMg2＋を含まないもの）で洗浄し、次に、細胞解離溶液を使って剥離した。遠心分離後に、細胞ペレットを1mlの溶解バッファー（20mMトリス-Cl pH7.5、1mM EDTAおよびプロテイナーゼインヒビター）に再懸濁し、ポリトロンホモジナイザーを使ってホモジナイズした（5に設定、10秒×2）。ホモジナイズされた細胞を1,000gで10分間遠心分離した。上清を集め、ペレットを1mlの溶解バッファーに再懸濁し、ホモジナイズし、再び1,000gで10分間、遠心分離した。両方の遠沈で得た上清をプールし、100,000gで60分間遠心分離した。その結果得られた膜ペレットを250μlのアッセイバッファー（TBS pH7.4、1mM MgCl2、2.5mM CaCl2）に再懸濁した。タンパク質濃度を測定し、小分けしたものを使用時まで−80℃で保存した。
競合結合アッセイ：
アッセイは、96ウェルプレートにおいて、総体積250μlのアッセイバッファー（TBS pH7.4、1mM MgCl2、2.5mM CaCl2）で行った。反応混合物は、アッセイ試料（SABA1-PYYv7/SABA1-PPv7、対照PP/PYY(3-36)、対照培地）、膜、および0.025nMの125I-hPYYまたは125I-hPP（2200Ci/mmol、PerkinElmer）からなった。試薬添加の順序は、150μlのアッセイ試料、50μlの125I-PYYまたは125I-hPP、次に50μlの膜（アッセイバッファー中、1〜3μg/ウェル）であった。結合混合物を室温で120分間インキュベートした。Packardセルハーベスターを使って反応をGF/Cプレート（0.5％ポリエチレンイミンおよび0.1％BSAに予浸したもの）上に移すことにより、結合反応を停止させた。次に、フィルタープレートを、氷冷50mMトリスバッファー（pH7.4）で、200ml×4回洗浄した。洗浄後に、40μlのMicroScint20を各ウェルに加え、Packard TopCountシンチレーション計数器で、プレートをカウントした。
GTPγS結合アッセイ
アッセイは、96ウェルプレート上、100μlの総体積で行った。まず最初に、10μlのユニバーサルバッファー（20mM HEPES pH7.4、100mM NaCl、1mM MgCl2、10μM GDP、0.1％BSA）を各ウェルに加えた。次に、10μlの試験試料を加え、続いて40μlの膜（アッセイバッファー中、1〜3μg/ウェル）を加え、よく混合した。反応を25℃で振とうしながら30分間インキュベートした。次に、35S-GTP（0.25μCi/ml）を含む40μlのSPAビーズ（0.5mg/ウェル）を加え、振とうしながら25℃でさらに60分間インキュベートした。1000rpmで5分間の遠沈によって反応を停止させた。
［表22］SABA-アミリン、SABA-PYY3-36およびSABA-PP融合物の機能的活性
Figure 2013531477
 *ネイティブペプチドリガンド最大活性に対する試験化合物の％として表したもの。結果を、1回の実験で得た三つ一組の測定の平均±SEMとして表す。
D．他のSAB融合物分子
実施例D1：SABA-オステオカルシン融合物のインビトロ活性
オステオカルシン（OCN）は膵β細胞におけるインスリン分泌を刺激するので、齧歯類動物の島からのインスリン生産が、インビトロでオステオカルシン（OCN）の生物学的機能を評価するための読出しとして使用される。齧歯類動物の島を、ネイティブヒトOCN（hOCN）およびAdnectin SABA融合ヒトOCN（SABA-hOCN）で処理し、各コンストラクトに関連するインスリン分泌の強化の程度を決定する。
実施例D2：SABA-アペリン融合物
SABA-APLNv2は、6×His タグおよび(GS)7リンカーを介してAPLNv4に融合されたSABA1.6の融合物である。麻酔したラットにおいて、APLNv4は、60μg/kgの静脈内送達で、ロバストな血圧降下作用を示した。SABA-APLNv2は15,000の分子量を示すので、APLNv4は融合タンパク質の質量の10％に相当する。SABA-APLNv2を、麻酔したラットに600μg/kgの用量で静脈内送達しても、血圧には影響がなかった。SABA-APLNv2コンストラクトに活性がなかったことの考えうる説明には、生産的衝突頻度の減少、立体障害、またはペプチド-PKEアニーリングによる、力価の減損が包含されうる。SABA-APLNv2がHSAに結合するかどうかを決定するための試験は行わなかった。

Claims (65)

  1. フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインがヒト血清アルブミンのドメイン1または2に1μM以下のKDで結合し、アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも5倍大きいポリペプチド。
  2. 10Fn3ドメインが、野生型10Fn3ドメインと比較して、BC、DEおよびFGループの1つ以上に修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
  3. 10Fn3ドメインが5.5〜7.4のpH範囲において血清アルブミンに結合する、請求項1または2に記載のポリペプチド。
  4. 10Fn3ドメインがpH5.5において200nM以下のKDでHSAに結合する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインがヒト血清アルブミンに結合し、かつ10Fn3ドメインが配列番号2と少なくとも70％同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  6. 10Fn3ドメインが、配列番号5に示すアミノ酸配列を含むBCループ、配列番号6に示すアミノ酸配列を含むDEループ、および配列番号7に示すアミノ酸配列を含むFGループの1つ以上を含む、請求項5に記載のポリペプチド。
  7. 10Fn3ドメインが、配列番号8、12、16、20、および24〜44から選択される配列を含む、請求項5に記載のポリペプチド。
  8. 10Fn3ドメインが、アカゲザル血清アルブミン（RhSA）、カニクイザル血清アルブミン（CySA）、またはマウス血清アルブミン（MuSA）の1つ以上にも結合する、請求項5〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. 10Fn3ドメインが、RhSA、CySAまたはMuSAの1つ以上と交差反応しない、請求項5〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 10Fn3ドメインが1μM以下のKDでHSAに結合する、請求項5〜9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 10Fn3ドメインが500nM以下のKDでHSAに結合する、請求項5〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. 10Fn3ドメインがHSAのドメインIまたはIIに結合する、請求項5〜11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. 10Fn3ドメインが5.5〜7.4のpH範囲において血清アルブミンに結合する、請求項5〜12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  14. 10Fn3ドメインがpH5.5において200nM以下のKDでHSAに結合する、請求項5〜13のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. 血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも5倍大きい、請求項5〜14のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  16. 血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が少なくとも2時間である、請求項5〜15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  17. フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインがヒト血清アルブミンに結合し、かつ10Fn3ドメインが、配列番号5に示すアミノ酸配列を含むBCループ、配列番号6に示すアミノ酸配列を含むDEループ、および配列番号7に示すアミノ酸配列を含むFGループを含む、ポリペプチド。
  18. 10Fn3ドメインが、アカゲザル血清アルブミン（RhSA）、カニクイザル血清アルブミン（CySA）、またはマウス血清アルブミン（MuSA）の1つ以上にも結合する、請求項17に記載のポリペプチド。
  19. 10Fn3ドメインが、RhSA、CySAまたはMuSAの1つ以上と交差反応しない、請求項17に記載のポリペプチド。
  20. 10Fn3ドメインが1μM以下のKDでHSAに結合する、請求項17〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  21. 10Fn3ドメインが500nM以下のKDでHSAに結合する、請求項17〜20のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  22. 10Fn3ドメインがHSAのドメインIまたはIIに結合する、請求項17〜21のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  23. 10Fn3ドメインが5.5〜7.4のpH範囲において血清アルブミンに結合する、請求項17〜22のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  24. 10Fn3ドメインがpH5.5において200nM以下のKDでHSAに結合する、請求項17〜23のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  25. 血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも5倍大きい、請求項17〜24のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  26. 血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が少なくとも2時間である、請求項17〜25のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  27. フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインと異種タンパク質とを含む融合ポリペプチドであって、10Fn3ドメインが1μM以下のKDでヒト血清アルブミンに結合する、融合ポリペプチド。
  28. 10Fn3ドメインが、配列番号4と少なくとも70％同一なアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の融合ポリペプチド。
  29. 10Fn3ドメインが、配列番号8、12、16、20、および24〜44から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項27または28に記載の融合ポリペプチド。
  30. 10Fn3ドメインが、配列番号5に示すアミノ酸配列を有するBCループ、配列番号6に示すアミノ酸配列を有するDEループ、および配列番号7に示すアミノ酸配列を有するFGループを含む、請求項27または28に記載の融合ポリペプチド。
  31. 異種タンパク質が、線維芽細胞成長因子21（FGF21）、インスリン、インスリン受容体ペプチド、骨形成タンパク質9（BMP-9）、アミリン、ペプチドYY（PYY3-36）、膵ポリペプチド（PP）、インターロイキン21（IL-21）、グルカゴン様ペプチド1（GLP-1）、プレクタシン、プログラニュリン、アトストリン、オステオカルシン（OCN）、アペリン、または10Fn3ドメインを含むポリペプチドから選択される、請求項27〜30のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  32. 異種タンパク質がFGF21である、請求項31に記載の融合ポリペプチド。
  33. 異種タンパク質が配列番号118に示す配列を含む、請求項32に記載の融合ポリペプチド。
  34. 異種タンパク質が、HSA以外のターゲットタンパク質に結合する第2の10Fn3ドメインを含む、請求項27〜30のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  35. ターゲットタンパク質に結合する第3の10Fn3ドメインをさらに含む、請求項34に記載の融合ポリペプチド。
  36. 第3の10Fn3ドメインが、第2の10Fn3ドメインと同じターゲットに結合する、請求項35に記載の融合ポリペプチド。
  37. 第3の10Fn3ドメインが、第1および第2の10Fn3ドメインとは異なるターゲットに結合する、請求項35に記載の融合ポリペプチド。
  38. 10Fn3ドメインが、アカゲザル血清アルブミン（RhSA）、カニクイザル血清アルブミン（CySA）、またはマウス血清アルブミン（MuSA）の1つ以上にも結合する、請求項27〜37のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  39. 10Fn3ドメインが、RhSA、CySAまたはMuSAの1つ以上と交差反応しない、請求項27〜37のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  40. 10Fn3ドメインが1μM以下のKDでHSAに結合する、請求項27〜39のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  41. 10Fn3ドメインがHSAのドメインIまたはIIに結合する、請求項27〜40のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  42. 10Fn3ドメインが5.5〜7.4のpH範囲において血清アルブミンに結合する、請求項27〜41のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  43. 10Fn3ドメインがpH5.5において200nM以下のKDでHSAに結合する、請求項27〜42のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  44. 血清アルブミンの存在下における融合物の半減期が、異種タンパク質単独の半減期より少なくとも5倍大きい、請求項27〜43のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  45. 血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が少なくとも2時間である、請求項27〜44のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  46. フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、（i）野生型10Fn3ドメインと比較して、AB、BC、CD、DE、EFおよびFGループの1つ以上に修飾されたアミノ酸配列を含み、（ii）野生型10Fn3ドメインによって結合されないターゲット分子に結合し、かつ（iii）配列(ED)nを有するC末端テール（ここで、nは3〜7の整数である）を含む、ポリペプチド。
  47. 10Fn3ドメインが、配列番号1の残基9〜94に示すアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項46に記載のポリペプチド。
  48. C末端テールがN末端にE、IまたはEIをさらに含む、請求項46または47に記載のポリペプチド。
  49. C末端テールが、ポリペプチドの溶解度を向上させるか、ポリペプチドの凝集を減少させるか、またはその両方である、請求項46〜48のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  50. 10Fn3ドメインが、野生型10Fn3ドメインと比較して、BC、DEおよびFGループのそれぞれに修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項46〜49のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  51. 1μM以下のKDでターゲットに結合する、請求項46〜50のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  52. 配列番号132〜174から選択される配列を含む、請求項32に記載の融合ポリペプチド。
  53. 異種タンパク質がPYY3〜36、PPまたはアミリンである、請求項31に記載の融合ポリペプチド。
  54. フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインがヒト血清アルブミンに結合し、かつ10Fn3ドメインが、配列番号8、12、16、20、および24〜44と少なくとも70％同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  55. 請求項1〜54のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
  56. 生理学上許容される担体をさらに含む、請求項55に記載の医薬組成物。
  57. 糖尿病を処置し、インスリン抵抗性を処置するか低下させ、肥満を処置し、体重を減少させるか体重増加を防止し、異常脂質血症を処置し、脂肪組織におけるグルコース取り込みを増加させ、または糖尿病の進行を遅らせるための方法であって、請求項32〜33または52のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドの治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  58. 低血糖、肥満、糖尿病、摂食障害、インスリン抵抗性症候群、または心血管疾患を処置するための方法であって、請求項53に記載の融合ポリペプチドの治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  59. 請求項1〜26、45〜51または53のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項27〜45または52のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸。
  60. 表3に示す配列を含む、請求項58に記載の核酸。
  61. 請求項59または60の核酸を含むベクター。
  62. 発現ベクターである、請求項61のベクター。
  63. 請求項61または62のベクターを含む宿主細胞。
  64. 細菌細胞である、請求項63に記載の宿主細胞。
  65. 哺乳動物細胞である、請求項63に記載の宿主細胞。
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