CN104587457B - 一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，通过将难溶或不溶蛋白或多肽抗原进行离心收集、洗涤、均质、制粒等工艺处理，制得在常见生理溶液中较为稳定的抗原悬液。该方法大大简化了利用难溶或不溶蛋白或多肽进行疫苗制备的生产工艺，建立了一套利用难溶或不溶蛋白或多肽抗原直接进行疫苗制备的新方法，同时给出了应用该方法进行疫苗制备的佐剂可选范围；该工艺的应用可大幅减少利用难溶或不溶蛋白或多肽进行亚单位或多肽疫苗制备的生产环节、缩短生产时间，显著减低了疫苗生产成本。

Description

一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的 方法

技术领域

本发明涉及疫苗制备领域，具体涉及一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法。

背景技术

作为一种对动物群体疫病的有效控制手段，动物疫苗技术优化和新型动物疫苗技术开发得到世界各国相关研究机构的重视。据统计，到2013年底，我国通过兽药GMP认证的动物疫苗生产企业有88家，是2000年前疫苗生产企业数量的4倍。动物疫苗市场的巨大需求是动物疫苗行业发展源动力。长期以来，我国用于动物传染病预防的疫苗大多是传统疫苗，随着现代生物技术的发展、不同病原致病机理的深入研究及世界各国对动物性食品安全性的要求不断提高，传统疫苗制备技术已经不能满足疫苗企业和养殖业发展需求。

对于某些原核细胞或真核细胞过量表达的重组蛋白，或者人工合成的用于疫苗制备的多肽片段，经过纯化或多次沉淀和干燥，蛋白或多肽抗原常常难溶于性质温和的缓冲液中，蛋白、多肽抗原在未达到疫苗配制所需浓度时便大量析出，这一情况使疫苗制备工艺一方面使复杂化，限制了疫苗剂型，也增加了疫苗生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，其依次包括如下步骤：

a.取溶解于生理盐水或PBS缓冲液的抗原液，在相对离心力为7000-10000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；

b.将经过a步骤得到的沉淀物用100～150倍体积(W︰V)的生理盐水或PBS重悬(100-150倍体积(W:V)是指沉淀物的质量(g)与生理盐水或PBS的体积(ml)比为100-150)，接着搅拌使沉淀物均匀分散；然后在相对离心力为7000-10000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；将收集到的沉淀物用生理盐水或PBS重复洗涤3次；

c.将经过b步骤得到的沉淀物在相对离心力为7000-10000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；

d.接着将c步骤得到的沉淀物重悬于100～150倍体积(W︰V)的生理盐水或PBS中；接着，进行冰浴超声处理使沉淀物均匀分散，得到沉淀物悬液；

e.将d步骤获得的沉淀物悬液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机的上样容器中，在2～8℃、600～800bar的压力下进行均质，收集第一穿出液；接着，将第一穿出液在2～8℃、1000～1200bar的压力下进行制粒，重复两次制粒过程，收集第二穿出液；

f.将e步骤收集到的第二穿出液(即疫苗抗原)用生理盐水或PBS调整浓度到≥300μg/mL；

g.向经过f步骤处理得到的第二穿出液(即疫苗抗原)中加入佐剂，制得疫苗。f步骤处理得到的第二穿出液(即疫苗抗原)与佐剂进行乳化，制得疫苗。在实践中，可以根据疫苗制备剂型和佐剂使用说明对乳化方法进行调整。

本发明中，优选的方案为在g步骤中：在加入佐剂进行疫苗配制之前，根据《中国兽药典》附录方法对收集到的第二穿出液(即疫苗抗原)进行无菌检验、内毒素含量检验和纯度检验，然后将检验合格的第二穿岀液中加入佐剂进行疫苗配制。

本发明中，优选的方案为还包括步骤h：将g步骤制得的疫苗按照《中国兽药典》附录方法进行质量检验。

本发明中，优选的方案为所述e步骤中的制粒工艺制得的微粒的平均粒径为20-200nm。

本发明中，优选的方案为所述a步骤中的抗原液通过如下方法获得：将培养基中的工程菌进行酶解或机械裂解，离心，分别收集上清液和沉淀；将收集到的沉淀物重悬于100～150倍体积(W︰V)的的TNE-U缓冲液中，在超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声10-20min，使沉淀物均匀分散；接着加入体积为培养基体积1/100的TNE-U缓冲液，然后在温度为4℃的层析柜中振荡30min；接着离心收集沉淀，所述离心处理的相对离心力为7000xg、时间为15min；接着将收集到的沉淀重悬于体积为培养基体积1/100的TNE-T缓冲液中，超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声10-20min，使沉淀物均匀分散；接着加入体积为培养基体积1/100的TNE-T缓冲液，然后在温度为4℃的层析柜中振荡30min，得到抗原液；

所述TNE-U缓冲液由如下方法制成：将Tris-Base、NaCl、Urea和蒸馏水混合，然后经过0.45μm滤器过滤除菌处理，即得；其中Tris-Base的摩尔浓度为0.5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0.25mol/L、Urea的摩尔浓度为2-4mol/L，所述TNE-U缓冲液的pH值为7.4；

所述TNE-T缓冲液由如下方法制成：取脱氧胆酸和Triton X100的一种，然后与Tris-Base、NaCl和蒸馏水混合，然后经过0.45μm滤器过滤除菌处理，即得；其中Tris-Base的摩尔浓度为0.5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0.25mol/L、Triton X100的体积百分数为0.1-1％、脱氧胆酸的质量百分数为5-10％，所述TNE-T缓冲液的pH值为7.4。

本发明中，优选的方案为所述蛋白抗原为在生理溶液中溶解度较低的纯化蛋白或重组表达后为包涵体形式的蛋白；所述多肽抗原为人工合成、提纯后在生理溶液中难溶多肽或重组表达后不溶解的多肽物。

本发明中，优选的方案为：

所述TNE-U缓冲液中Tris-Base的摩尔浓度为0.5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0.25mol/L、Urea的摩尔浓度为2mol/L，pH值为7.4；

所述TNE-T缓冲液中Tris-Base的摩尔浓度为0.5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0.25mol/L、Triton X100的体积百分数为0.1-1％、脱氧胆酸的质量百分数为5-10％，pH值为7.4。

本发明中，优选的方案为所述a步骤中的相对离心力为10000xg，离心时间为15min。

本发明中，优选的方案为所述b步骤具体为：将经过a步骤得到的沉淀物重悬于100～150倍(W︰V)沉淀物体积的生理盐水或PBS中，然后在7000r/min的转速下搅拌15min使沉淀物均匀分散；在相对离心力为10000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；将收集到的沉淀物用生理盐水或PBS重复洗涤3次。

本发明中，优选的方案为所述d步骤具体为：接着将c步骤得到的沉淀物重悬于100～150倍(W︰V)沉淀体积的生理盐水或PBS中；接着，进行冰浴超声处理使沉淀物均匀分散，得到沉淀物悬液；其中，所述冰浴超声处理的功率为200w、时间为10-20min。

本发明中，优选的方案为所述e步骤具体为：将d步骤获得的沉淀物悬液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机的上样容器中，在2～8℃、800bar的压力下进行均质，收集第一穿出液；接着，将第一穿出液在2～8℃、1100bar的压力下进行制粒，重复两次制粒过程，收集第二穿出液(即为疫苗抗原)。

本发明中，优选的方案为所述超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声10min。

与现有技术相比，本发明的优点在于：经过本发明的纯化处理、均质和制粒处理等工艺，获得一种纯净度高、均质、稳定的蛋白微粒抗原；更重要的是，经此工艺制备的纳米抗原可选择制备油包水型(W/O)、水包油包水型(W/O/W)和水包油型(O/W)疫苗，扩大了疫苗佐剂可选择范围。应用该工艺制备的纳米级微粒抗原大大简化了此类疫苗生产工艺，缩短了疫苗生产时间，显著减低疫苗生产成本。微粒化的抗原更有利于吞噬细胞的吞噬及抗原呈递细胞的活化和将抗原呈递到T细胞等，蛋白或多肽抗原性的有效释放，同时大大降低了疫苗的抗原使用量。

下面结合附图及具体实施方式对本发明进行详细说明。

附图说明

下面结合附图进一步阐明本发明的实施例。

图1为实施例2中的SDS-PAGE方法测试蛋白纯度的电泳图；

图2为实施例2中显微镜下的抗原颗粒图；

图3为实施例2中显微镜下的抗原粒径分布图；

其中，图1中，M、蛋白Marker的泳道；1、为菌体裂解物的泳道；2、TNE-U洗涤后的沉淀的泳道；3、TNE-T洗涤后的沉淀(最终产物)的泳道；

图2中，黑色三角指示的是单个的颗粒，白色三角指示的是聚集的颗粒。

具体实施方式

实施例1

一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，依次包括如下步骤：

a.取溶解于生理盐水或PBS缓冲液的抗原液，在相对离心力为7000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；

b.将经过a步骤得到的沉淀物用100～150倍体积(W︰V)的生理盐水或PBS重悬，接着搅拌使沉淀物均匀分散；然后在相对离心力为7000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；将收集到的沉淀物用生理盐水或PBS重复洗涤3次；

c.将经过b步骤得到的沉淀物在相对离心力为7000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；

d.接着将c步骤得到的沉淀物重悬于100倍体积(W︰V)的生理盐水或PBS中；接着，进行冰浴超声处理使沉淀物均匀分散，得到沉淀物悬液；

e.将d步骤获得的沉淀物悬液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机的上样容器中，在5℃、800bar的压力下进行均质，收集第一穿出液；接着，将第一穿出液在5℃、1100bar的压力下进行制粒，重复两次制粒过程，收集第二穿出液；

f.将e步骤收集到的第二穿出液(即疫苗抗原)用生理盐水或PBS调整浓度到≥300μg/mL；

g.向经过f步骤处理得到的第二穿出液(即疫苗抗原)中加入佐剂，制得疫苗。f步骤处理得到的第二穿出液(即疫苗抗原)与佐剂进行乳化，制得疫苗；

所述a步骤中的抗原液通过如下方法骤获得：将培养基中的PCV2 Cap-pET21/Rosetta种子菌进行机械破碎，离心，分别收集上清液和沉淀。

所述种子菌为猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组大肠杆菌(PCV2 Cap-pET21/Rosetta，第5代生产种子)，代号为PCP11SU15；将收集到的沉淀物重悬于100倍体积(W︰V)的的TNE-U缓冲液中，在超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声15min，使沉淀物均匀分散；接着加入等体积的体积为培养基体积1/100的TNE-U缓冲液，然后在温度为4℃的层析柜中振荡30min；接着离心收集沉淀，所述离心处理的相对离心力为7000xg、时间为15min；接着将收集到的沉淀重悬于体积为培养基体积1/100的TNE-T缓冲液中，超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声15min，使沉淀物均匀分散；接着加入体积为培养基体积1/100的TNE-T缓冲液，然后在温度为4℃的层析柜中振荡30min，得到抗原液；

所述TNE-U缓冲液由如下方法制成：将Tris-Base、NaCl、Urea和蒸馏水混合，然后经过0.45μm滤器过滤除菌处理，即得；其中Tris-Base的摩尔浓度为0.5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0.25mol/L、Urea的摩尔浓度为2-4mol/L，所述TNE-U缓冲液的pH值为7.4；

所述TNE-T缓冲液由如下方法制成：取Triton X100、Tris-Base、NaCl和蒸馏水混合，然后经过0.45μm滤器过滤除菌处理，即得；其中Tris-Base的摩尔浓度为0.5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0.25mol/L、Triton X100的体积百分数为0.1％，所述TNE-T缓冲液的pH值为7.4。

实施例2

取少量由实施例1的d步骤得到的沉淀物悬液，应用SDS-PAGE分析沉淀中目的重组抗原的纯度，具体测试结果详见附图1；取经过e步骤获得的第二穿出液，用8mol/L尿素稀释4倍，37℃作用5分钟，作为待测样品；准确称取2.000g BSA干粉，用8mol/L尿素分别稀释至不同BSA浓度的溶液：1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml，以该BSA溶液为标准液；在紫外分光光度计上读取待测样品和标准液在波长280的吸光度(OD)，应用各标准品浓度(μg/ml)和吸光度(OD)绘制标准曲线，计算待测样品的浓度。结合SDS-PAGE蛋白浓度百分含量计算抗原重组抗原含量的计算，重组抗原含量＝待测样品浓度×稀释倍数×重组抗原的纯度。取经过f步骤获得的重组抗原，利用显微镜观察其中的抗原颗粒，并用粒径分析仪精确测试颗粒的粒径分布，具体结果详见附图2，可以看出制备的颗粒多为聚集状态，分散的抗原颗粒粒径在20-200nm。使用PBS调整重组抗原浓度至≥300μg/mL；按照佐剂乳化说明分别配制油包水型(W/O)、水包油包水型(W/O/W)和水包油型(O/W)疫苗。

将上述制得的3种不同剂型疫苗在转速为3000r/min的条件下离心5min，检测无分层，然后分别在4℃、20℃和37℃条件下检查疫苗稳定性，结果稳定性均良好。对于在生理溶液中不溶解的蛋白抗原，传统疫苗工艺需要对蛋白进行层析、变性、复性、透析等处理，本发明的方法大大简化利用此类抗原进行疫苗的生产工艺。

效果检测

1.安全评价

分别用非靶动物和靶动物对本实施例中制得的3种疫苗(即油包水型(W/O)、水包油包水型(W/O/W)和水包油型(O/W)疫苗)进行安全性质评价。非靶动物安全性检测方法为：选择用BALB/c小鼠10只，各皮下注射疫苗0.1mL，连续观察14日，均应健活。靶动物安全性检测方法为：用14-21日龄PCV2血清抗体阴性健康仔猪5头，各深部肌肉注射疫苗2mL，连续观察14日，接种猪均应无不良反应，且均健活。具体测试结果见表1：

表1猪圆环病毒2型亚单位疫苗安全检验

2.效力评价

取14-21日龄25头，随机分为5组，每组5头，第1-3组分别免疫W/O、W/O/W、O/W剂型的疫苗，各1.0mL/头。4组和5组分别为攻毒对照和空白对照。

分别在疫苗免疫后的第7、21和28日采集试验猪全血，分离血清后检测血清中PCV2抗体含量。攻毒前3日，对第1-4组试验猪均在两腋下及两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥孔血蓝蛋白(KLH-ICFA，KLH浓度为0.5mg/ml)，4ml/头，并经腹腔注射巯基乙酸培养基，10ml/头。组第5组不攻毒。攻毒当日对所有猪称重，记录攻毒后7日内猪的直肠体温，连续观察28日。观察期结束后，对所有试验猪进行称重,扑杀后剖检。采集每头猪的腹股沟淋巴结，按免疫组化法检测PCV2抗原。根据体温、相对日增重和免疫组化进行判定PCV2感染情况。

结果表明(表2)，免疫猪对致病量的PCV2攻击产生了有力的保护。免疫W/O、W/O/W、O/W三种剂型疫苗的第1、2、3组试验猪，攻毒后均未发现有连续3天体温超过40℃的情况；疫苗免疫后的猪发育良好，与对照组相比平均相对日增重与空白对照组无差异，试验猪剖解后病理学检测未见PCV2相关病变。三种剂型疫苗的攻毒保护率均为100％(5/5，5/5，5/5)；按照PCV2病症判定标准，未进行疫苗免疫的第4组(攻毒对照组)试验猪均呈PCV2感染阳性。应用本法制备的疫苗对PCV2感染起到良好的免疫作用。

表2：不同剂型疫苗的免疫攻毒实验

注^**：与空白对照组差异极显著，P值计算公式：

对于在生理溶液中不溶解的蛋白抗原，传统疫苗乳化工艺只能选择铝胶佐剂或矿物油佐剂制备油包水剂型(W/O)的疫苗，从上述实验数据可以看出，应用该工艺制备的纳米微粒抗原可用来制备多种剂型的疫苗，不同剂型疫苗的安全性和免疫效力良好，扩大了疫苗佐剂可选择范围。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，其特征在于依次包括如下步骤：

a．取溶解于生理盐水或PBS缓冲液的抗原液，在相对离心力为7000-10000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；

b．将经过a步骤得到的沉淀物用100～150倍体积（W︰V）的生理盐水或PBS重悬，接着搅拌使沉淀物均匀分散；然后在相对离心力为7000-10000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；将收集到的沉淀物用生理盐水或PBS重复洗涤3次；

c．将经过b步骤得到的沉淀物在相对离心力为7000-10000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；

d．接着将c步骤得到的沉淀物重悬于100～150倍体积（W︰V）的生理盐水或PBS中；接着，进行冰浴超声处理使沉淀物均匀分散，得到沉淀物悬液；

e．将d步骤获得的沉淀物悬液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机的上样容器中，在2～8℃、600～800bar的压力下进行均质，收集第一穿出液；接着，将第一穿出液在2～8℃、1000～1200bar的压力下进行制粒，重复两次制粒过程，收集第二穿出液；

f．将e步骤收集到的第二穿出液用生理盐水或PBS调整浓度到≥300µg/mL；

g．向经过f步骤处理得到的第二穿出液中加入佐剂，制得疫苗；

所述a步骤中的抗原液通过如下方法获得：将培养基中的工程菌进行酶解或机械裂解，离心，分别收集上清液和沉淀；将收集到的沉淀物重悬于100～150倍体积（W︰V）的TNE-U缓冲液中，在超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声10-20min，使沉淀物均匀分散；接着加入体积为培养基体积1/100的TNE-U缓冲液，然后在温度为4℃的层析柜中振荡30min；接着离心收集沉淀，所述离心处理的相对离心力为7000xg、时间为15min；接着将收集到的沉淀重悬于体积为培养基体积1/100的TNE-T缓冲液中，超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声10-20min，使沉淀物均匀分散；接着加入体积为培养基体积1/100的TNE-T缓冲液，然后在温度为4℃的层析柜中振荡30min，得到抗原液；

所述TNE-U缓冲液由如下方法制成：将Tris-Base、NaCl、Urea和蒸馏水混合，然后经过0.45µm滤器过滤除菌处理，即得；其中Tris-Base 的摩尔浓度为0.5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0.25mol/L、Urea的摩尔浓度为2-4mol/L，所述TNE-U缓冲液的pH值为7.4；

所述TNE-T缓冲液由如下方法制成：取脱氧胆酸和Triton X100的一种，然后与Tris-Base、NaCl和蒸馏水混合，然后经过0.45µm滤器过滤除菌处理，即得；其中Tris-Base 的摩尔浓度为0.5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0.25mol/L、Triton X100的体积百分数为0.1-1%、脱氧胆酸的质量百分数为5-10%，所述TNE-T缓冲液的pH值为7.4。

2.根据权利要求1所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，其特征在于：所述e步骤中的制粒工艺制得的微粒的平均粒径为20-200nm。

3.根据权利要求1所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，其特征在于：所述蛋白抗原为在生理溶液中溶解度较低的纯化蛋白或重组表达后为包涵体形式的蛋白；所述多肽抗原为人工合成、提纯后在生理溶液中难溶多肽或重组表达后不溶解的多肽物。

4.根据权利要求3所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，其特征在于：

所述TNE-U缓冲液中Tris-Base 的摩尔浓度为0.5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0.25mol/L、Urea的摩尔浓度为2mol/L，所述TNE-U缓冲液pH值为7.4；

所述TNE-T缓冲液中Tris-Base 的摩尔浓度为0.5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0.25mol/L、Triton X100的体积百分数为0.1-1%、脱氧胆酸的质量百分数为5-10%，所述TNE-T缓冲液pH值为7.4。

5.根据权利要求3所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，其特征在于：所述a步骤中的相对离心力为10000xg，离心时间为15min。

6.根据权利要求3所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，其特征在于所述b步骤具体为：将经过a步骤得到的沉淀物重悬于100～150倍（W︰V）沉淀物体积的生理盐水或PBS中，然后在7000 r/min的转速下搅拌15min使沉淀物均匀分散；在相对离心力为10000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；将收集到的沉淀物用生理盐水或PBS重复洗涤3次。

7.根据权利要求3所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，其特征在于所述d步骤具体为：接着将c步骤得到的沉淀物重悬于100～150倍（W︰V）沉淀体积的生理盐水或PBS中；接着，进行冰浴超声处理使沉淀物均匀分散，得到沉淀物悬液；其中，所述冰浴超声处理的功率为200w、时间为10-20min。

8.根据权利要求3所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，其特征在于所述e步骤具体为：将d步骤获得的沉淀物悬液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机的上样容器中，在2～8℃、800bar的压力下进行均质，收集第一穿出液；接着，将第一穿出液在2～8℃、1100bar的压力下进行制粒，重复两次制粒过程，收集第二穿出液。

9.根据权利要求3所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，其特征在于：所述超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声10min。