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KR101653122B1 - 스클레로스틴 결합제 - Google Patents

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KR101653122B1
KR101653122B1 KR1020157026845A KR20157026845A KR101653122B1 KR 101653122 B1 KR101653122 B1 KR 101653122B1 KR 1020157026845 A KR1020157026845 A KR 1020157026845A KR 20157026845 A KR20157026845 A KR 20157026845A KR 101653122 B1 KR101653122 B1 KR 101653122B1
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KR
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seq
antibody
sclerostin
amino acid
acid sequence
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크리스토퍼 파스즈티
마틴 킴 로빈슨
케빈 그라함
알리스테어 제임스 헨리
켈리 수 호프만
존 라쌈
알래스테어 로슨
시엥 센 루
앤디 포플웰
웬얀 셴
데이비드 윙클러
아론 조지 윈터스
Original Assignee
유씨비 파마, 에스.에이.
암젠 인크
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Publication date
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Abstract

본 발명은 스클레로스틴 단백질의 에피토프 및 스클레로스틴 결합제, 예를 들면 스클레로스틴과 결합할 수 있는 항체와 관련된 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

스클레로스틴 결합제 {SCLEROSTIN BINDING AGENTS}
본 발명은 일반적으로 인간 스클레로스틴(sclerostin) 단백질을 비롯한 스클레로스틴 단백질의 에피토프, 및 스클레로스틴 또는 그의 단편에 결합할 수 있는 결합제 (예를 들어 항체)에 관한 것이다.
개인의 일생에 걸쳐 골 질량에 있어서의 2회 또는 3회의 별개의 변화기가 발생한다 (문헌 [Riggs, West J, Med. 154:63-77 (1991)] 참조). 제1기는 남성과 여성 둘다에서 발생하며, 최고의 골 질량 달성으로 진행된다. 이러한 제1기는 연골내 성장판의 선형 성장 및 골막 부착 속도에 따른 방사형(radial) 성장을 통해 달성된다. 제2기는 골 소주(小注) (척추 및 골반 등과 같은 평평한 뼈)의 경우에는 약 30세 정도, 피질골 (예를 들어, 사지에 존재하는 긴 뼈)의 경우에는 약 40세 정도에 시작되어 노령까지 지속된다. 이 시기는 느린 골 소실을 특징으로 하며, 남성과 여성 둘다에서 발생한다. 여성의 경우, 골 소실의 제3기가 또한 발생하며, 대개는 폐경후 에스트로겐 결핍으로 인한다고 여겨진다. 이 시기만 보면, 이 동안에 여성은 피질골 및 소주 구획 (문헌 [Riggs, 상기 문헌] 참조)으로부터 추가의 골 질량을 소실할 수 있다.
골 무기질 함량의 소실은 매우 다양한 조건에 의해 야기될 수 있으며, 유의한 의학적 문제가 초래될 수 있다. 예를 들어, 골다공증은 인간에서의 허약화 질환이며, 골격골 질량 및 무기질 밀도에 있어서의 현저한 감소, 골 미세구조의 붕괴 및 상응하는 골 취약성 증가 (즉, 골 강도의 감소) 등을 비롯한 뼈의 구조적 퇴행, 및 골다공증에 걸린 개인에서 골절에 대한 감수성을 특징으로 한다. 일반적으로, 인간에서의 골다공증은 미국에서 대략 2천 5백만 명의 사람들에서 발견되는 상태인 임상적 골감소증 (골 무기질 밀도가 젊은 성인 뼈의 평균 값보다 표준 편차 1 초과 내지 2.5 미만으로 부족함)이 먼저 일어난다. 미국에서는 또다른 7백만 내지 8백만 명의 환자가 임상적 골다공증 (골 무기질 함량이 장년 성인 뼈보다 2.5 표준 편차 초과가 부족한 것으로 정의됨)으로 진단되었다. 인간 집단에서의 골다공증 빈도는 연령에 따라 증가한다. 백인 중에서는 골다공증이 여성에서 우세하며, 미국에서는 골다공증 환자 전체 중 80％가 여성이다. 나이든 사람에서 골격골의 골절에 대한 취약성 및 감수성 증가는 이 집단에서 넘어질 위험이 더 크다는 것으로 악화된다. 둔부, 손목 및 척추의 골절이 골다공증과 관련된 가장 흔한 상해이다. 특히 둔부 골절은 환자에게 매우 불편하고 비용이 많이 들며, 여성의 경우에는 높은 비율의 사망률 및 이환률과 상관관계가 있다.
골다공증은 골 질량 감소로 인한 골절 위험의 증가로 간주되어 왔지만, 현재 이용할 수 있는 골격 장애의 치료법 중 성인의 골 밀도를 증가시킬 수 있는 것은 거의 없고, 현재 이용할 수 있는 치료법 대개가 새로운 골 형성을 자극하는 것이 아니라 주로 추가의 골 흡수를 억제하는 작용을 한다. 골 소실을 지연시키는데는 현재 에스트로겐이 처방되고 있다. 그러나, 환자에게 임의의 장기간 이익이 있는지 여부 및 에스트로겐이 75세가 넘는 환자에게 임의의 효과가 있는지 여부에 대하여는 약간의 논란이 있다. 추가로, 에스트로겐의 사용은 유방암 및 자궁내막암의 위험을 증가시킨다고 여겨진다. 칼시토닌, 오스테오칼신 및 비타민 K, 또는 비타민 D가 함유되거나 함유되지 않은 고용량의 식이 칼슘도 폐경후 여성을 위해 제안된 바 있다. 그러나, 고용량의 칼슘은 종종 원치않는 위장 부작용을 일으키고, 혈청 및 뇨의 칼슘 수준이 지속적으로 모니터링되어야 한다 (예를 들어, 문헌 [Khosla and Riggs, Mayo Clin. Proc. 70:978982, 1995] 참조).
골다공증에 대한 다른 현행 치료 접근법은 비스포스포네이트 (예를 들어, 포사맥스(Fosamax)™, 액토넬(Actonel)™, 본비바(Bonviva)™, 조메타(Zometa)™, 올파드로네이트, 네리드로네이트, 스켈리드, 보네포스 등), 부갑상선 호르몬, 칼시라이틱스(calcilytics), 칼슘모방체(calcimimetics) (예를 들어, 시나칼세트(cinacalcet)), 스타틴, 동화성 스테로이드, 란탄 및 스트론튬 염, 및 불화나트륨을 포함한다. 그러나, 이러한 치료제는 종종 바람직하지 않은 부작용과 관련이 있다 (문헌 [Khosla and Riggs, 상기 문헌] 참조).
골 과다성장 및 매우 치밀한 골을 특징으로 하는 골격 질환인 경화협착증(sclerosteosis)에는 SOST 유전자 생성물인 스클레로스틴이 없다 (문헌 ([Brunkow et al., Am. J. Hum. Genet., 68:577-589, 2001], [Balemans et al., Hum. Mol. Genet., 10:537-543, 2001])). 인간 스클레로스틴의 아미노산 서열은 문헌 [Brunkow et al. 동일 문헌]에 보고되어 있고, 본원에서 서열 1로 개시되어 있다.
발명의 간단한 요약
본원에서는, 골 형성, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량, 골 질량, 골 질 및 골 강도 중 1종 이상의 증가에 사용될 수 있어서, 골 형성, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량, 골 질량, 골 질 및 골 강도 중 1종 이상의 증가가 바람직한 매우 다양한 상태의 치료에 이용될 수 있는 조성물 및 방법을 개시한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 다른 관련 잇점도 제공한다.
본 발명은 인간 스클레로스틴에서 본원에 개시된 결합제에 의해 인식되는 영역 (에피토프), 이들 에피토프의 사용 방법, 및 이러한 에피토프의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 스클레로스틴에서 루프(Loop) 2로 동정된 영역에 특이적인 에피토프, 및 상기 영역에 특이적으로 결합하는 결합제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 스클레로스틴의 시스틴-노트(cystine-knot) 영역에 특이적인 에피토프, 및 상기 영역에 특이적으로 결합하는 결합제, 예를 들어 항체에 관한 것이다.
본 발명은 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 결합제, 예를 들어 항체에 관한 것이다. 상기 결합제는 본원에 개시된 1종 이상의 항체가 스클레로스틴에 결합하는 것을 교차-차단하는(cross-block) 능력, 및/또는 본원에 개시된 1종 이상의 항체에 의해 스클레로스틴과의 결합으로부터 교차-차단되는 능력을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 항체 및 기타 결합제는 본원에 개시된 "인간 스클레로스틴 펩티드 에피토프 경쟁 결합 검정"에서 인간 스클레로스틴 펩티드에 대한 결합 패턴을 특징으로 할 수도 있다.
본 발명은 포유동물에서 골 형성, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량, 골 질량, 골 질 및 골 강도 중 1종 이상을 증가시킬 수 있는 결합제, 예를 들어 항체에 관한 것이다.
본 발명은 세포 기재의 무기질침착 검정에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단할 수 있는 결합제, 예를 들어 항체에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 스클레로스틴의 시스틴-노트 영역의 코어 영역을 대표하는, 1개 이상의 디술피드 결합에 의해 연결된 2개, 3개 또는 4개의 폴리펩티드 단편을 포함하는 폴리펩티드 구조물, 및 그에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다.
본 발명은 포유동물에서 스클레로스틴에 특이적으로 결합할 수 있는 결합제, 예를 들어 항체를 생성하는데 면역원으로 사용하기에 적합한 에피토프의 수득 방법에 관한 것이며, 특정 실시양태에서는 생성된 상기 결합제가 스클레로스틴 활성을 생체내 중화시킬 수 있다.
본 발명은 서열 6, 서열 63, 서열 64, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68 또는 서열 69의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 동물에게 투여시에 스클레로스틴에 특이적인 항체를 유발하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열 2, 서열 3, 서열 4 또는 서열 5의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어진 1종 이상의 폴리펩티드를 포함하는, 동물에게 투여시에 스클레로스틴에 특이적인 항체를 유발하기 위한 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 서열 2, 서열 3, 서열 4 및 서열 5의 아미노산 서열 중 2종 이상 또는 3종 이상을 포함할 수 있고, 상기 조성물은 서열 2, 서열 3, 서열 4 및 서열 5의 아미노산 서열 4종 모두를 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 서열 2, 서열 3, 서열 4 및 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 서열 2 및 서열 4는 서열 1로 언급하면 아미노산 위치 57 및 111에서의 디술피드 결합에 의해 연결되어 있고, 서열 3 및 서열 5는 (a) 서열 1로 언급하면 아미노산 위치 82 및 142에서의 디술피드 결합, 및 (b) 서열 1로 언급하면 아미노산 위치 86 및 144에서의 디술피드 결합 중 1개 이상에 의해 연결되어 있으며, 상기 폴리펩티드가 서열 1의 인간 스클레로스틴의 상응하는 폴리펩티드 영역의 3차 구조를 보유할 수 있는, 동물에게 투여시에 스클레로스틴에 특이적인 항체를 유발하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열 1의 여러회 말단절단(truncation)된 인간 스클레로스틴 단백질로 본질적으로 이루어지고, 서열 1의 아미노산 1 내지 50, 65 내지 72, 91 내지 100, 118 내지 137, 및 150 내지 190이 없는 폴리펩티드 T20.6에 관한 것이며, 상기 폴리펩티드는 인간 스클레로스틴의 트립신 소화로 수득될 수 있고, 상기 단백질은 HPLC 분획화로 단리될 수 있다.
본 발명은 추가로 서열 1의 아미노산 51 내지 64, 73 내지 90, 101 내지 117, 및 138 내지 149를 포함하고,
(a) 아미노산 57과 111 사이의 디술피드 결합,
(b) 아미노산 82와 142 사이의 디술피드 결합, 및
(c) 아미노산 86과 144 사이의 디술피드 결합
중 1개 이상을 포함하는 인간 스클레로스틴의 면역원성 부분 T20.6에 관한 것이며, 상기 면역원성 부분은 이들 디술피드 결합 중 2개 이상을 가질 수 있고, 상기 면역원성 부분은 상기 디술피드 결합 3개 모두를 가질 수 있다.
본 발명은 추가로 서열 1의 아미노산 57 내지 64, 73 내지 86, 111 내지 117, 및 138 내지 144를 포함하고,
(a) 아미노산 57과 111 사이의 디술피드 결합,
(b) 아미노산 82와 142 사이의 디술피드 결합, 및
(c) 아미노산 86과 144 사이의 디술피드 결합
중 1개 이상을 포함하는 인간 스클레로스틴의 면역원성 부분 T20.6 유도체에 관한 것이며, 상기 면역원성 부분은 이들 디술피드 결합 중 2개 이상을 가질 수 있고, 상기 면역원성 부분은 상기 디술피드 결합 3개 모두를 가질 수 있다.
본 발명은 추가로 C-말단부 및 N-말단부에서 말단절단된 서열 1의 인간 스클레로스틴 단백질로 본질적으로 이루어지고, 서열 1의 아미노산 1 내지 85 및 112 내지 190이 없는 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열 1의 아미노산 86 내지 111을 포함하는 인간 스클레로스틴의 면역원성 부분에 관한 것이며, 상기 면역원성 부분은 연속 아미노산 CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (서열 6)로 본질적으로 이루어질 수 있다.
본 발명은 추가로 서열 98의 아미노산 92 내지 109를 포함하는 래트 스클레로스틴의 면역원성 부분에 관한 것이며, 상기 면역원성 부분은 연속 아미노산 PNAIGRVKWWRPNGPDFR (서열 96)로 본질적으로 이루어질 수 있다.
본 발명은 추가로 서열 98의 아미노산 99 내지 120을 포함하는 래트 스클레로스틴의 면역원성 부분에 관한 것이며, 상기 면역원성 부분은 연속 아미노산 KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (서열 97)로 본질적으로 이루어질 수 있다.
본 발명은
(a) 인간 스클레로스틴을 완전한 트립신 소화가 달성되도록 처리하는 단계,
(b) 평균 분자량이 7,122.0 달톤 (이론적 질량 7121.5 달톤)이거나, 또는 0.05％ TFA 중 0.05％ 트리플루오로아세트산에서 90％ 아세토니트릴로의 선형 구배를 0.2 mL/분의 유속으로 이용한 역상 HPLC 컬럼으로부터의 용출로 측정시에 체류 시간이 약 20.6분인 트립신 소화 샘플을 수집하는 단계, 및
(c) 면역원성 부분을 정제하는 단계
를 포함하는, 인간 스클레로스틴의 면역원성 부분의 생성 방법에 관한 것이다.
본 발명은
(a) 동물을 서열 6, 서열 63, 서열 64, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69, 서열 96 또는 서열 97의 폴리펩티드를 포함하는 조성물로 면역화하는 단계,
(b) 상기 동물로부터 혈청을 수집하는 단계, 및
(c) 상기 혈청으로부터 스클레로스틴에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 단리하는 단계
를 포함하는, 스클레로스틴에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 생성 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
(a) 동물을 폴리펩티드 T20.6 또는 T20.6의 유도체를 포함하는 조성물로 면역화하는 단계,
(b) 상기 동물로부터 혈청을 수집하는 단계, 및
(c) 상기 혈청으로부터 스클레로스틴에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 단리하는 단계
를 포함하는, 스클레로스틴에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 생성 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은
(a) 생물학적 샘플을, 항-스클레로스틴 항체와 서열 6, 서열 63, 서열 64, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69, 서열 96 또는 서열 97로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드 사이의 복합체 형성을 허용하는 조건하에 서열 6, 서열 63, 서열 64, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69, 서열 96 또는 서열 97로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및
(b) 상기 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
를 포함하며, 여기서 상기 복합체의 존재가 상기 생물학적 샘플이 항-스클레로스틴 항체를 함유함을 지시하는 것인, 생물학적 샘플 중 항-스클레로스틴 항체의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한
(a) 생물학적 샘플을, 항-스클레로스틴 항체와 폴리펩티드 T20.6 또는 T20.6의 유도체 사이의 복합체 형성을 허용하는 조건하에 폴리펩티드 T20.6 또는 T20.6의 유도체와 접촉시키는 단계, 및
(b) 상기 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
를 포함하며, 여기서 상기 복합체의 존재가 상기 생물학적 샘플이 항-스클레로스틴 항체를 함유함을 지시하는 것인, 생물학적 샘플 중 항-스클레로스틴 항체의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C 또는 Ab-D 중 1종 이상이 스클레로스틴 단백질에 결합하는 것을 교차-차단하는 스클레로스틴 결합제, 예를 들어 항체에 관한 것이다. 스클레로스틴 결합제는 또한 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C 또는 Ab-D 중 1종 이상이 스클레로스틴에 결합하는 것을 교차-차단할 수도 있다. 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체 등일 수 있다.
본 발명은 추가로 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C 또는 Ab-D 중 1종 이상이 스클레로스틴에 결합하는 것을 교차-차단하는 스클레로스틴 결합제, 예를 들어 항체에 관한 것이다. 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체 등일 수 있다.
본 발명은 추가로 항체 1 내지 24 (Ab-1 내지 Ab-24) 중 1종 이상이 스클레로스틴 단백질에 결합하는 것을 교차-차단하는 스클레로스틴 결합제, 예를 들어 항체에 관한 것이다. 스클레로스틴 결합제는 또한 항체 1 내지 24 (Ab-1 내지 Ab-24) 중 1종 이상이 스클레로스틴에 결합하는 것을 교차-차단할 수도 있다. 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
본 발명은 추가로 항체 1 내지 24 (Ab-1 내지 Ab-24) 중 1종 이상이 스클레로스틴에 결합하는 것을 교차-차단하는 스클레로스틴 결합제, 예를 들어 단리된 항체에 관한 것이며, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체일 수 있다.
본 발명은 추가로 "인간 스클레로스틴 펩티드 에피토프 경쟁 결합 검정"에서 인간 스클레로스틴 펩티드에 대해 나타내는 결합 패턴이 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C 또는 Ab-D 중 1종 이상에 의해 나타나는 결합 패턴과 유사한 결합제, 예를 들어 단리된 항체에 관한 것이며, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
본 발명은 추가로 낮은 골 형성, 낮은 골 무기질 밀도, 낮은 골 무기질 함량, 낮은 골 질량, 낮은 골 질 및 낮은 골 강도 중 1종 이상과 관련이 있는 골 장애의 치료가 필요한 포유동물 대상체에게 골 형성, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량, 골 질량, 골 질 및 골 강도 중 1종 이상을 증가시키는데 충분한 양의 항-스클레로스틴 결합제를 제공하는 단계를 포함하고, 상기 항-스클레로스틴 결합제는 항체 또는 그의 스클레로스틴-결합 단편을 포함하는 것인, 포유동물 대상체에서 낮은 골 형성, 낮은 골 무기질 밀도, 낮은 골 무기질 함량, 낮은 골 질량, 낮은 골 질 및 낮은 골 강도 중 1종 이상과 관련이 있는 골 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 단리된 스클레로스틴 폴리펩티드 또는 그의 단편에 관한 것이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 6개의 보존된 시스테인 잔기를 함유하고, 그의 단편은 서열 2의 7개 내지 14개 아미노산, 서열 3의 8개 내지 17개 아미노산, 서열 4의 8개 내지 18개 잔기, 및 서열 5의 6개 내지 12개 잔기를 포함하며, 상기 폴리펩티드 또는 그의 단편은 서열 2와 서열 4 사이의 디술피드 결합, 및 서열 3과 서열 5 사이의 디술피드 결합에 의해 안정화되고, 상기 폴리펩티드 또는 단편은 서열 2의 10개 내지 14개 아미노산, 서열 3의 14개 내지 17개 아미노산, 서열 4의 13개 내지 18개 아미노산, 및 서열 5의 8개 내지 12개 잔기를 포함할 수 있으며, 상기 폴리펩티드 또는 단편은 서열 2, 서열 3, 서열 4 및 서열 5를 포함할 수 있다.
본 발명은 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 상기 항체는 본원에 개시된 1종 이상의 항체가 인간 스클레로스틴에 결합하는 것을 교차-차단하는 능력, 및/또는 인간 스클레로스틴이 본원에 개시된 1종 이상의 항체에 의해 결합되는 것을 교차-차단하는 능력을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 포유동물에서 골 형성, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량, 골 질량, 골 질 및 골 강도 중 1종 이상을 증가시킬 수 있는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 세포 기재의 무기질침착 검정에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단할 수 있는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하고, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 78, 서열 79, 서열 80, 서열 81, 서열 99, 서열 100, 서열 101, 서열 102, 서열 103, 서열 104, 서열 105, 서열 106, 서열 107, 서열 108, 서열 109, 서열 110, 서열 111, 서열 112, 서열 113, 서열 114, 서열 115, 서열 116, 서열 237, 서열 238, 서열 239, 서열 240, 서열 241, 서열 242, 서열 243, 서열 244, 서열 245, 서열 246, 서열 247, 서열 248, 서열 249, 서열 250, 서열 251, 서열 252, 서열 253, 서열 254, 서열 255, 서열 256, 서열 257, 서열 258, 서열 259, 서열 260, 서열 261, 서열 262, 서열 263, 서열 264, 서열 265, 서열 266, 서열 267, 서열 268, 서열 269, 서열 270, 서열 271, 서열 272, 서열 273, 서열 274, 서열 275, 서열 276, 서열 277, 서열 278, 서열 279, 서열 280, 서열 281, 서열 282, 서열 283, 서열 284, 서열 285, 서열 286, 서열 287, 서열 288, 서열 289, 서열 290, 서열 291, 서열 292, 서열 293, 서열 294, 서열 295, 서열 296, 서열 297, 서열 298, 서열 351, 서열 352, 서열 353, 서열 358, 서열 359 및 서열 360, 및 이들의 변이체로부터 선택된 1개 이상의 CDR 서열을 갖는 결합제, 예를 들어 항체를 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 스클레로스틴을 중화시킨다.
또한, 본 발명은 인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하고, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 78, 서열 79, 서열 80, 서열 81, 서열 99, 서열 100, 서열 101, 서열 102, 서열 103, 서열 104, 서열 105, 서열 106, 서열 107, 서열 108, 서열 109, 서열 110, 서열 111, 서열 112, 서열 113, 서열 114, 서열 115, 서열 116, 서열 237, 서열 238, 서열 239, 서열 240, 서열 241, 서열 242, 서열 243, 서열 244, 서열 245, 서열 246, 서열 247, 서열 248, 서열 249, 서열 250, 서열 251, 서열 252, 서열 253, 서열 254, 서열 255, 서열 256, 서열 257, 서열 258, 서열 259, 서열 260, 서열 261, 서열 262, 서열 263, 서열 264, 서열 265, 서열 266, 서열 267, 서열 268, 서열 269, 서열 270, 서열 271, 서열 272, 서열 273, 서열 274, 서열 275, 서열 276, 서열 277, 서열 278, 서열 279, 서열 280, 서열 281, 서열 282, 서열 283, 서열 284, 서열 285, 서열 286, 서열 287, 서열 288, 서열 289, 서열 290, 서열 291, 서열 292, 서열 293, 서열 294, 서열 295, 서열 296, 서열 297, 서열 298, 서열 351, 서열 352, 서열 353, 서열 358, 서열 359 및 서열 360, 및 이들의 변이체로부터 선택된 1개 이상의 CDR 서열을 갖는 결합제, 예를 들어 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 스클레로스틴에서 상기 단백질의 생체내 활성에 중요한 영역을 제공한다.
본 발명의 이러한 측면 및 다른 측면은 하기하는 발명의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조로 할 때 명백해질 것이다. 본원에 개시된 모든 참조문헌은, 이들 각각이 개별적으로 포함된 것과 같이 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 스클레로스틴 단백질의 에피토프 및 스클레로스틴 결합제, 예를 들면 스클레로스틴과 결합할 수 있는 항체와 관련된 조성물 및 방법을 제공한다.
도 1은 항-인간 스클레로스틴 및 항-마우스 스클레로스틴 항체 Ab-A에 대한 경쇄 (도 1A) (서열 23) 및 중쇄 (도 1B) (서열 27)의 성숙 형태의 아미노산 서열 (신호 펩티드는 절단됨)을 도시한다.
도 2는 항-인간 스클레로스틴 및 항-마우스 스클레로스틴 항체 Ab-B에 대한 경쇄 (도 2A) (서열 31) 및 중쇄 (도 2B) (서열 35)의 성숙 형태의 아미노산 서열 (신호 펩티드는 절단됨)을 도시한다.
도 3은 항-인간 스클레로스틴 및 항-마우스 스클레로스틴 항체 Ab-C에 대한 경쇄 (도 3A) (서열 15) 및 중쇄 (도 3B) (서열 19)의 성숙 형태의 아미노산 서열 (신호 펩티드는 절단됨)을 도시한다.
도 4는 항-인간 스클레로스틴 및 항-마우스 스클레로스틴 항체 Ab-D에 대한 경쇄 (도 4A) (서열 7) 및 중쇄 (도 4B) (서열 11)의 성숙 형태의 아미노산 서열 (신호 펩티드는 절단됨)을 도시한다.
도 5는 마우스에서 비히클, PTH (1-34), Ab-A 또는 Ab-B 처치 3주 후에 2개의 골격 부위 (요추 및 경골의 골간단(骨幹端))에서 측정한 골 무기질 밀도를 도시한다.
도 6은 마우스에서 비히클, PTH (1-34) 또는 Ab-C 처치 2주 후에 2개의 골격 부위 (요추 및 경골의 골간단)에서 측정한 골 무기질 밀도를 도시한다.
도 7은 마우스에서 비히클 또는 Ab-D 처치 3주 후에 2개의 골격 부위 (요추 및 경골의 골간단)에서 측정한 골 무기질 밀도를 도시한다.
도 8은 인간 스클레로스틴의 성숙 형태의 아미노산 서열 (신호 펩티드는 절단됨) (서열 1)을 도시한다. 또한, 인간 스클레로스틴의 성숙 형태를 코딩하는 인간 스클레로스틴 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열도 도시한다. 8개의 시스테인에는 C1 내지 C8의 번호가 매겨져 있다. 시스틴-노트는 3개의 디술피드 결합 (C1-C5, C3-C7, C4-C8)에 의해 형성된다. C2와 C6도 디술피드 결합을 형성하지만, 이 디술피드는 시스틴-노트의 일부가 아니다.
도 9는 인간 스클레로스틴의 기본 구조에 대한 모식도를 도시한다. N-말단 아암(arm) (첫번째 Q부터 C1까지) 및 C-말단 아암 (C8부터 말단 Y까지)이 있다. 이들 아암 사이에는 시스틴-노트 구조 (3개의 디술피드에 의해 형성됨: C1-C5, C3-C7, C4-C8) 및 루프 1, 루프 2 및 루프 3으로 기재한 3개의 루프가 있다. 루프 1 및 루프 3의 원위 영역은 C2-C6 디술피드에 의해 연결되어 있다. 잠재적인 트립신 절단 부위가 표시되어 있다 (아르기닌 = R 및 리신 = K). 잠재적인 AspN 절단 부위 중 일부가 표시되어 있다 (아스파르트산 (D) 잔기만을 나타냄).
도 10은 트립신 또는 AspN 소화 후 인간 스클레로스틴의 HPLC 펩티드 맵을 도시한다. 트립신 소화에 의해 생성된 인간 스클레로스틴 펩티드 (T19.2, T20, T20.6 및 T21-22) 및 AspN 소화에 의해 생성된 인간 스클레로스틴 펩티드 (AspN14.6, AspN18.6 및 AspN22.7-23.5)가 표시되어 있다.
도 11은 트립신 소화에 의해 생성된, 단리된 인간 스클레로스틴 디술피드 연결된 펩티드에 관한 서열 및 질량 정보를 도시한다. Seq. pos. = 서열 위치. Obs. = 관찰치. 관찰된 질량은 ESI-LC-MS 분석으로 결정하였다.
도 12는 AspN 소화에 의해 생성된, 단리된 인간 스클레로스틴 펩티드에 관한 서열 및 질량 정보를 도시한다. AspN22.7-23.5 펩티드는 4개의 디술피드 결합을 함유한다. Seq. pos. = 서열 위치. Obs. = 관찰치. 관찰된 질량은 ESI-LC-MS 분석으로 결정하였다.
도 13은 트립신 소화에 의해 생성된 4종의 인간 스클레로스틴 펩티드 (T19.2, T20, T20.6 및 T21-22)의 선형 모식도를 보여준다.
도 14는 AspN 소화에 의해 생성된 5종의 인간 스클레로스틴 펩티드 (AspN14.6, AspN18.6 및 AspN22.7-23.5)의 선형 모식도를 보여준다. AspN14.6 HPLC 피크는 어떠한 디술피드 결합으로도 연결되지 않은 3개의 펩티드로 구성된다.
도 15는 비아코어(Biacore)-기재의 "인간 스클레로스틴 펩티드 에피토프 경쟁 결합 검정"으로부터의 공명 단위 (Ru, Resonance Unit) 신호를 보여준다. 각종 인간 스클레로스틴-펩티드 (용액 중)에 대한 상대적 Mab 결합 대(vs.) 무손상 성숙 형태 인간 스클레로스틴 (비아코어 칩상에 고정화됨)에 대한 Mab 결합을 평가하였다. 나타낸 데이타는 Ab-A에 대한 것이다. 사용된 인간 스클레로스틴 펩티드는 T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 및 AspN22.7-23.5였다.
도 16은 비아코어-기재의 "인간 스클레로스틴 펩티드 에피토프 경쟁 결합 검정"으로부터의 공명 단위 (Ru) 신호를 보여준다. 각종 인간 스클레로스틴-펩티드 (용액 중)에 대한 상대적 Mab 결합 대 무손상 성숙 형태 인간 스클레로스틴 (비아코어 칩상에 고정화됨)에 대한 Mab 결합을 평가하였다. 나타낸 데이타는 Ab-B에 대한 것이다. 사용된 인간 스클레로스틴 펩티드는 T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 및 AspN22.7-23.5였다.
도 17은 비아코어-기재의 "인간 스클레로스틴 펩티드 에피토프 경쟁 결합 검정"으로부터의 공명 단위 (Ru) 신호를 보여준다. 각종 인간 스클레로스틴-펩티드 (용액 중)에 대한 상대적 Mab 결합 대 무손상 성숙 형태 인간 스클레로스틴 (비아코어 칩상에 고정화됨)에 대한 Mab 결합을 평가하였다. 나타낸 데이타는 Ab-C에 대한 것이다. 사용된 인간 스클레로스틴 펩티드는 T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 및 AspN22.7-23.5였다.
도 18은 비아코어-기재의 "인간 스클레로스틴 펩티드 에피토프 경쟁 결합 검정"으로부터의 공명 단위 (Ru) 신호를 보여준다. 각종 인간 스클레로스틴-펩티드 (용액 중)에 대한 상대적 Mab 결합 대 무손상 성숙 형태 인간 스클레로스틴 (비아코어 칩상에 고정화됨)에 대한 Mab 결합을 평가하였다. 나타낸 데이타는 Ab-D에 대한 것이다. 사용된 인간 스클레로스틴 펩티드는 T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 및 AspN22.7-23.5였다.
도 19는 인간 스클레로스틴의 2개의 Mab 결합 에피토프를 보여준다. 도 19A는 인간 스클레로스틴에 대한 Ab-A 및 Ab-B의 결합에 관여하는 루프 2 에피토프의 서열을 보여준다 (서열 6). 도 19B는 인간 스클레로스틴에 대한 Ab-C 및 Ab-D 결합에 관여하는 T20.6 에피토프의 서열, 디술피드 결합 및 이의 모식도를 보여준다 (서열 2 내지 서열 5).
도 20은 트립신 소화 후 인간 스클레로스틴의 HPLC 펩티드 맵을 도시한다. 도 20A는 인간 스클레로스틴 Ab-D 복합체의 소화를 보여준다. 도 20B는 인간 스클레로스틴 단독의 소화를 보여준다. T19.2, T20, T20.6 및 T21-22 펩티드 피크가 표시되어 있다.
도 21은 인간 스클레로스틴에 대한 Ab-D 결합에 관여하는 "T20.6 유도체 1 (시스틴-노트 + 4개의 아암)" 에피토프의 서열, 디술피드 결합 및 이의 모식도를 보여준다 (서열 70 내지 서열 73).
도 22는 항-스클레로스틴 중화 Mab 동정에 이용된 MC3T3-E1-BF 골모세포 세포주 무기질침착 검정의 결과를 보여준다. 마우스 스클레로스틴 (Scl)은 1 ㎍/mL로 사용되었다. 모노클로날 항체는 10 및 5 ㎍/mL로 사용되었다. 무기질침착 (여러 유형의 불용성 인산칼슘)의 정도는 칼슘 측정으로 정량화하였다.
도 23은 항-스클레로스틴 중화 Mab 동정에 이용된 MC3T3-E1-BF 골모세포 세포주 무기질침착 검정의 결과를 보여준다. 인간 스클레로스틴 (Scl)은 1 ㎍/mL로 사용되었다. 모노클로날 항체는 8 및 4 ㎍/mL로 사용되었다. 무기질침착 (여러 유형의 불용성 인산칼슘)의 정도는 칼슘 측정으로 정량화하였다.
도 24는 항-스클레로스틴 중화 Mab 동정에 이용된 MC3T3-E1-BF 골모세포 세포주 무기질침착 검정의 결과를 보여준다. 인간 스클레로스틴 (Scl)은 1 ㎍/mL로 사용되었다. 모노클로날 항체는 10 ㎍/mL로 사용되었다. 무기질침착 (여러 유형의 불용성 인산칼슘)의 정도는 칼슘 측정으로 정량화하였다.
도 25는 염증-유도된 골 소실 SCID 마우스 모델의 결과를 도시한다. Ab-A 처치는 전체 골 무기질 밀도 (도 25A), 척추골 밀도 (도 25B) 및 대퇴골 밀도 (도 25C)로 측정시에 대장염과 관련이 있는 염증-관련 골 소실로부터 마우스를 보호하였다.
본 발명은 전장 스클레로스틴에도 결합하는 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 인간 스클레로스틴 단백질 영역, 및 이들 에피토프의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 스클레로스틴 또는 스클레로스틴의 일부에 특이적으로 결합하는 결합제 (예를 들어 항체), 및 이러한 결합제를 이용한 방법을 제공한다. 상기 결합제는 1종 이상의 리간드에 대한 인간 스클레로스틴의 결합을 차단하거나 방해하는데 유용하다.
재조합 인간 스클레로스틴/SOST는 알앤드디 시스템즈(R＆D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재, 2006 카탈로그 번호 1406-ST-025)로부터 구입할 수 있다. 추가로, 재조합 마우스 스클레로스틴/SOST는 알앤드디 시스템즈 (미국 미네소타주 미네아폴리스 소재, 2006 카탈로그 번호 1589-ST-025)로부터 구입할 수 있다. 연구 등급의 스클레로스틴 결합 모노클로날 항체는 알앤드디 시스템즈 (미국 미네소타주 미네아폴리스 소재, 마우스 모노클로날: 2006 카탈로그 번호 MAB1406, 래트 모노클로날: 2006 카탈로그 번호 MAB1589)로부터 구입할 수 있다. 미국 특허 제6,395,511호 및 동 제6,803,453호 및 미국 특허 공개 제20040009535호 및 동 제20050106683호는 일반적으로 항-스클레로스틴 항체에 관해 언급한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 인간 스클레로스틴이라는 용어는 서열 1의 단백질 및 그의 대립유전자 변이체를 포함한다. 스클레로스틴은, 스클레로스틴을 코딩하는 유전자로 형질감염시킨 293T 숙주 세포에서 숙주 세포 배양액의 여과된 상등액을 염 구배의 헤파린 HP 컬럼으로 용출시켜 정제할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 제조 및 추가의 정제는 실시예 1 및 실시예 2에 기재되어 있다.
본 발명이 결합제는 본원에서 정의한 바와 같은 항체인 것이 바람직하다. 용어 "항체"는 무손상 항체 또는 그의 결합 단편을 지칭한다. 항체는 완전 항체 분자 (예를 들어 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 갖는 인간 버전 항체)를 포함하거나 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 항체 단편으로는 F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc 및 Fd 단편 등이 있고, 이것들은 단일 도메인 항체, 단일-쇄 항체, 맥스바디(maxibody), 미니바디(minibody), 인트라바디(intrabody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), v-NAR 및 비스-scFv에 혼입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136] 참조). 피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디(monobody)를 비롯한 항체 폴리펩티드는 미국 특허 제6,703,199호에도 개시되어 있다. 다른 항체 폴리펩티드는 미국 특허 공개 제2005/0238646호에 개시되어 있으며, 이것은 단일-쇄 폴리펩티드이다.
항체로부터 유래된 항원 결합 단편은 통상의 방법에 따라 예를 들어 항체의 단백질성 가수분해, 예를 들어 온전한 항체의 펩신 또는 파파인 소화로 수득할 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 펩신을 이용하여 항체를 효소 절단시켜, F(ab')2라 불리는 5 S 단편을 만들어 생성될 수 있다. 상기 단편은 티올 환원제를 사용하여 추가로 절단하여, 3.5 S Fab' 1가 단편을 만들 수 있다. 임의로, 절단 반응은 디술피드 연결부의 절단으로 인하여 생성되는 술피드릴기에 대한 차단기를 사용하여 수행될 수 있다. 별법으로, 파파인을 사용한 효소 절단은 2개의 1가 Fab 단편 및 Fc 단편을 직접 생성한다. 이들 방법은 예를 들어 골덴버그(Goldenberg)의 미국 특허 제4,331,647호, 문헌 ([Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960], [Porter, Biochem. J. 73:119, 1959], [Edelman et al., in Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967)] 및 [Andrews, S.M. and Titus, J.A. in Current Protocols in Immunology (Coligan J.E., et al., eds), John Wiley ＆ Sons, New York (2003). pages 2.8.1-2.8.10 및 2.10A.1-2.10A.5])에 기재되어 있다. 항체를 절단하는 다른 방법, 예를 들어 중쇄를 분리시켜 1가 경쇄-중쇄 단편 (Fd)을 형성하는 방법, 단편의 추가 절단 방법, 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전자조작 기술도, 이들 단편이 무손상 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 단편이라면 이용될 수 있다.
항체 단편은 임의의 합성 단백질 또는 유전자조작된 단백질일 수도 있다. 예를 들어, 항체 단편은 경쇄 가변 영역으로 구성된 단리된 단편, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커로 연결된 재조합 단일 쇄 폴리펩티드 분자 (scFv 단백질) 등을 포함한다.
또다른 형태의 항체 단편은 항체의 1개 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 펩티드이다. CDR ("최소 인식 단위" 또는 "초가변 영역"이라고도 불림)은 관심 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 구축하여 수득될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 항체-생성 세포의 mRNA를 주형으로 사용하여 가변 영역을 합성하는 폴리머라제 연쇄 반응으로 제조된다 (예를 들어, 문헌 ([Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995)] 및 [Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)]) 참조).
따라서, 한 실시양태에서, 상기 결합제는 본원에 기재한 바와 같은 CDR을 1개 이상 포함한다. 상기 결합제는 본원에 기재한 바와 같은 CDR을 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상 포함할 수 있다. 상기 결합제는 본원에 기재한 항체의 가변 영역 도메인을 1개 이상 포함할 수 있다. 가변 영역 도메인은 임의의 크기 또는 임의의 아미노산 조성일 수 있고, 일반적으로 인간 스클레로스틴과의 결합을 담당하고 1개 이상의 프레임워크(framework) 서열에 인접하거나 그의 프레임에 맞게(in frame) 존재하는 1개 이상의 CDR 서열, 예를 들어 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 및/또는 본원에서 구체적으로 기재한 경쇄 CDR을 포함한다. 일반적인 측면에서, 가변 (V) 영역 도메인은 이뮤노글로불린 중쇄 (VH) 및/또는 경쇄 (VL) 가변 도메인의 임의의 적합한 배열일 수 있다. 따라서, 예를 들어 V 영역 도메인은 단량체일 수 있고 VH 도메인 또는 VL 도메인일 수 있으며, 이것은 하기하는 바와 같이 인간 스클레로스틴에 적어도 1×10-7 M 이하의 친화도로 독립적으로 결합할 수 있다. 별법으로, V 영역 도메인은 이량체일 수 있고 VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. V 영역 이량체는 비-공유결합으로 연결될 수 있는 1개 이상의 VH쇄 및 1개 이상의 VL쇄를 포함한다 (이하, Fv라고 지칭함). 원한다면, 상기 쇄는 예를 들어 2개의 가변 도메인 사이의 디술피드 결합을 통해 직접 공유결합 커플링되거나 또는 링커, 예를 들어 펩티드 링커를 통해 공유결합 커플링되어, 단일 쇄 Fv (scFv)를 형성할 수 있다.
가변 영역 도메인은 임의의 천연 발생 가변 도메인 또는 그의 조작된 버전일 수 있다. 조작된 버전이라는 것은, 가변 영역 도메인이 재조합 DNA 조작 기술로 생성되었음을 의미한다. 이렇게 조작된 버전은 예를 들어 특이적 항체 가변 영역에서 특이적 항체의 아미노산 서열 내 또는 그에 대한 삽입, 결실 또는 변화가 일어난 것을 포함한다. 특별한 예로는, 제1 항체로부터의 1개 이상의 CDR 및 임의로는 1개 이상의 프레임워크 아미노산을 함유하고, 나머지 가변 영역 도메인은 제2 항체로부터 유래된 것인 조작된 가변 영역 도메인 등이 있다.
가변 영역 도메인은 1개 이상의 다른 항체 도메인 또는 그의 단편에 C-말단 아미노산에서 공유결합으로 부착될 수 있다. 따라서, 예를 들어 가변 영역 도메인에 존재하는 VH 도메인은 이뮤노글로불린 CH1 도메인 또는 그의 단편에 연결될 수 있다. 유사하게, VL 도메인은 CK 도메인 또는 그의 단편에 연결될 수 있다. 이러한 방식에서, 예를 들어 상기 항체는 항원 결합 도메인이, 결합된 VH 도메인 및 VL 도메인이 이들의 C-말단에서 CH1 및 CK 도메인 각각에 공유결합으로 연결되어 있는 것을 함유하는 Fab 단편일 수 있다. CH1 도메인은 추가의 아미노산으로 연장되어, 예를 들어 Fab' 단편에서 발견되는 것과 같은 힌지(hinge) 영역 또는 힌지 영역 도메인의 일부를 제공하거나, 또는 추가의 도메인, 예를 들어 항체 CH2 및 CH3 도메인을 제공할 수 있다.
본원에 기재한 바와 같이, 결합제는 이들 CDR 중 1개 이상을 포함한다. 예를 들어, 1개 이상의 CDR이 공지된 항체 프레임워크 영역 (IgG1, IgG2 등)에 혼입될 수도 있고, 또는 적합한 비히클에 접합되어 그의 반감기를 증대시킬 수도 있다. 적합한 비히클로는 Fc, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 알부민, 트랜스페린 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 비히클 및 다른 적합한 비히클은 당업계에 공지되어 있다. 이와 같이 접합된 CDR 펩티드는 단량체 형태, 이량체 형태, 사량체 형태 또는 다른 형태로 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 1개 이상의 수용성 중합체가 결합제 중 1개 이상의 특정 위치, 예를 들어 아미노 말단에서 결합된다.
특정 바람직한 실시양태에서, 결합제는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 1개 이상의 수용성 중합체 부착부를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 및 동 제4,179,337호를 참조한다. 특정 실시양태에서, 유도체 결합제는 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로스 또는 다른 탄수화물 기재의 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알콜, 및 또한 이러한 중합체들의 혼합물 중 1종 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 수용성 중합체는 1개 이상의 측쇄에 무작위로 부착된다. 특정 실시양태에서, PEG는 결합제, 예를 들어 항체의 치료능이 개선되도록 작용할 수 있다. 이러한 특정 방법은 예를 들어 미국 특허 제6,133,426호 등에서 논의되어 있으며, 상기 문헌은 어떠한 목적으로든 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 결합제가 1개 이상의 아미노산 치환을 가질 수 있으나, 상기 결합제는 결합 특이성을 보유한다는 것이 인지될 것이다. 따라서, 결합제 구조에 있어서의 변형은 본 발명의 범위에 속한다. 이는, 결합제의 스클레로스틴 결합능을 손상시키지 않으며 보존적 또는 비보존적일 수 있는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 비-천연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 이것은 생물학적 시스템에서의 합성이 아니라 전형적으로 화학적 펩티드 합성에 의해 혼입된다. 이들로는 펩티드모방체(peptidomimetics) 및 기타 역전되거나 반전된 형태의 아미노산 부분 등이 있다. 보존적 아미노산 치환은 또한 천연 아미노산 잔기를, 해당 위치 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 영향이 거의 없거나 전혀 없도록 하는 표준 잔기로 치환하는 것을 포함할 수도 있다.
비-보존적 치환은 한 클래스의 아미노산 또는 아미노산 모방체 중의 구성원을 상이한 물리적 성질 (예를 들어 크기, 극성, 소수성, 전하)을 갖는 또다른 클래스의 구성원과 교환하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 치환된 잔기는 인간 항체 중에서 비-인간 항체와 상동성인 영역 또는 상기 분자의 비-상동성 영역에 도입될 수 있다.
또한, 당업자는 원하는 각 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 함유하는 시험 변이체를 생성할 수 있다. 이후, 상기 변이체를 당업자에게 공지된 활성 검정으로 스크리닝할 수 있다. 이러한 변이체는 적합한 변이체에 관한 정보를 모으는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기의 변화가 활성의 파괴, 바람직하지 못한 활성 감소, 또는 부적합한 활성을 초래하는 것이 발견되었다면, 이러한 변화를 갖는 변이체는 배제될 수 있다. 즉, 이러한 통상의 실험으로부터 모은 정보를 기초로 하여, 당업자는 추가의 치환이 단독으로 또는 다른 돌연변이와 함께 배제되어야 하는 아미노산을 쉽게 결정할 수 있다.
당업자는 공지의 기술을 이용하여 본원에 기재한 폴리펩티드의 적합한 변이체를 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 당업자는 상기 분자 중에서 활성에 중요하다고 여겨지지 않는 영역을 표적으로 함으로써 활성 파괴 없이 변화될 수 있는 적합한 영역을 동정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 당업자는 상기 분자 중에서 유사한 폴리펩티드 중에 보존된 잔기 및 부분을 동정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 영역이라 하더라도, 생물학적 활성을 파괴하지 않거나 폴리펩티드 구조에 부정적인 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환을 실시할 수 있다.
추가로, 당업자는 유사한 폴리펩티드에서 활성 또는 구조에 중요한 잔기를 확인하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있다. 이러한 비교로부터, 당업자는 단백질 중에서 유사한 폴리펩티드에서의 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 당업자는 이러한 예측된 중요 아미노산 잔기에 대하여 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.
당업자는 또한 유사한 폴리펩티드에서의 구조와 관련하여 3차원 구조 및 아미노산 서열을 분석할 수도 있다. 이러한 정보로부터, 당업자는 항체의 아미노산 잔기 정렬을 그의 3차원 구조와 관련하여 예측할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질의 표면상에 존재할 것으로 예측되는 아미노산 잔기는 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관여할 수 있기 때문에, 당업자는 이러한 잔기에는 근본적인 변화가 가해지지 않도록 선택할 수 있다.
수많은 과학 학술 간행물이 2차 구조 예측에 집중되어 왔다. 문헌 ([Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996)], [Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974)], [Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974)], [Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978)], [Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276] 및 [Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979)])을 참조한다. 또한, 컴퓨터 프로그램도 2차 구조 예측을 보조하는데 현재 이용가능하다. 2차 구조 예측 방법 중 하나는 상동성 모델링을 기초로 한다. 예를 들어, 서열 동일성이 30％ 초과이거나 또는 유사성이 40％ 초과인 2종의 폴리펩티드 또는 단백질은 흔히 유사한 구조적 형태를 갖는다. 단백질 구조 데이타베이스 (PDB)의 최근 진보는 폴리펩티드의 구조 또는 단백질의 구조 내 폴딩(folding)의 잠재적 수 등을 비롯하여 2차 구조의 증대된 예측능을 제공해 왔다. 문헌 [Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999)]을 참조한다. 주어진 폴리펩티드 또는 단백질에는 폴딩의 수가 제한되어 있고, 일단 결정적인 수의 구조가 밝혀졌으면, 구조적 예측이 현저하게 매우 정확해질 것임이 제안된 바 있다 [Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)].
2차 구조를 예측하는 추가의 방법은 "트레딩(threading)" ([Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997)], [Sippl et al., Structure, 4(1):15-19 (1996)]), "프로파일 분석" ([Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991)], [Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990)], [Gribskov et al, Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)]) 및 "진화적 연결부" (문헌 [Holm, 상기 문헌 (1999)] 및 [Brenner, 상기 문헌 (1997)] 참조) 등을 포함한다.
특정 실시양태에서, 결합제의 변이체는, 모(parent) 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교할 때 글리코실화 부위의 수 및/또는 유형이 변경되어 있는 글리코실화 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체는 천연 단백질보다 더 많거나 더 적은 수의 N-연결 글리코실화 부위를 포함한다. N-연결 글리코실화 부위는 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr (여기서, X로 표시한 아미노산 잔기는 프롤린 이외의 임의의 아미노산 잔기일 수 있음)의 서열을 특징으로 한다. 상기 서열이 생성되도록 아미노산 잔기를 치환하는 것은, N-연결 탄수화물 쇄가 부가될 수 있는 새로운 잠재적 부위를 제공한다. 별법으로, 상기 서열을 없애는 치환은 기존의 N-연결 탄수화물 쇄를 제거할 것이다. 또한, 1개 이상의 N-연결 글리코실화 부위 (전형적으로는 천연 발생의 것)가 제거되고 1개 이상의 새로운 N-연결 부위가 생성되는 N-연결 탄수화물 쇄의 재배열도 제공된다. 추가의 바람직한 항체 변이체는, 모 아미노산 서열과 비교할 때 1개 이상의 시스테인 잔기가 결실되거나 또다른 아미노산 (예를 들어, 세린) 대신 치환된 시스테인 변이체를 포함한다. 시스테인 변이체는 항체가 예를 들어 불용성 봉입체(inclusion body)의 단리 후 생물학적 활성 형태로 리폴딩되어야 하는 경우에 유용할 수 있다. 시스테인 변이체는 일반적으로 천연 단백질보다 시스테인 잔기의 수가 적고, 전형적으로는 쌍을 이루지 않은 시스테인으로 인한 상호작용이 최소화되도록 짝수이다.
원하는 아미노산 치환 (보존적 치환 또는 비-보존적 치환)은 당업자가 이러한 치환을 원하는 시기에 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 스클레로스틴에 대한 항체의 중요 잔기를 동정하거나, 본원에 기재한 스클레로스틴 항체의 친화도를 증가시키거나 감소시키는데 이용될 수 있다.
특정 실시양태에 따라서, 바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질분해에 대한 감수성을 감소시키는 치환, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키는 치환, (3) 단백질 복합체를 형성하는 결합 친화도를 변경시키는 치환, (4) 결합 친화도를 변경시키는 치환, 및/또는 (4) 이러한 폴리펩티드에 다른 물리화학적 성질 또는 기능적 성질을 부여하거나 그러한 성질을 변형시키는 치환이다. 특정 실시양태에 따라, 단일 또는 다중 아미노산 치환 (특정 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환)은 천연 발생 서열 (특정 실시양태에서는 분자간 접촉부를 형성하는 도메인(들) 바깥쪽의 폴리펩티드 부분 중의 천연 발생 서열)에서 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않는 것일 수 있다 (예를 들어, 대체 아미노산이 모 서열 중의 나선을 파괴하거나 모 서열에 특징적인 다른 유형의 2차 구조를 파괴하는 경향이 있어서는 안됨). 당업계에서 인식되는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌 ([Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))], [Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991))] 및 [Thornton et al. Nature 354:105 (1991)])에 기재되어 있으며, 상기 문헌 각각은 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 결합제는 중합체, 지질 또는 다른 부분과 화학적으로 결합될 수 있다.
상기 결합제는 생체적합성 프레임워크 구조에 혼입된, 본원에 기재한 CDR 중 1개 이상을 포함할 수 있다. 한 예에서, 생체적합성 프레임워크 구조는 국소화된 표면 영역에서 항원에 결합하는 1종 이상의 아미노산 서열 (예를 들어, CDR, 가변 영역 등)을 디스플레이할 수 있는, 형태적으로 안정한 구조적 지지체 또는 프레임워크 또는 스캐폴드(scaffold)를 형성하기에 충분한 폴리펩티드 또는 그의 일부를 포함한다. 이러한 구조는 천연 발생 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 "폴드(fold)" (구조적 모티프)일 수도 있고, 또는 천연 발생 폴리펩티드 또는 폴드에 대하여 1개 이상의 변형, 예를 들어 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 가질 수도 있다. 이들 스캐폴드는 임의의 종 (또는 1종 초과의 종), 예를 들어 인간, 다른 포유동물, 다른 척추동물, 무척추동물, 식물, 박테리아 또는 바이러스의 폴리펩티드에서 유래된 것일 수 있다.
전형적으로, 생체적합성 프레임워크 구조는 이뮤노글로불린 도메인 이외의 단백질 스캐폴드 또는 골격을 기초로 한다. 예를 들어, 피브로넥틴, 안키린, 리포칼린, 네오카르지노스타인, 사이토크롬 b, CP1 아연 핑거(zinc finger), PST1, 코일링된 코일(coiled coil), LACI-D1, Z 도메인 및 텐드라미사트 도메인을 기초로 하는 것이 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Nygren and Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469] 참조).
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합제가 본원에 기재한 인간화 항체를 포함한다는 것이 인지될 것이다. 예를 들어 본원에 기재한 것과 같은 인간화 항체는 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다 ([Zhang, W., et al., Molecular Immunology. 42(12):1445-1451, 2005], [Hwang W. et al., Methods. 36(1):35-42, 2005], [Dall'Acqua WF, et al., Methods 36(1):43-60, 2005] 및 [Clark, M., Immunology Today. 21(8):397-402, 2000]).
추가로, 당업자는 적합한 결합제가 이들 항체의 일부, 예를 들어 본원에서 구체적으로 개시한 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 1개 이상을 포함한다는 것을 인식할 것이다. CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 1개 이상의 영역은 1개 이상의 아미노산 치환을 가질 수 있지만, 상기 결합제는 비-치환된 CDR의 결합 특이성을 보유한다. 상기 결합제의 비-CDR 부분은 비-단백질 분자일 수 있고, 이때의 결합제는 본원에 개시된 항체가 스클레로스틴에 결합하는 것을 교차-차단하고/하거나 스클레로스틴을 중화시킨다. 상기 결합제의 비-CDR 부분은 비-단백질 분자일 수 있고, 이때의 결합제는 "인간 스클레로스틴 펩티드 에피토프 경쟁 결합 검정"에서 인간 스클레로스틴 펩티드에 대하여 발휘하는 결합 패턴이 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 및 Ab-24 중 1종 이상이 발휘하는 결합 패턴과 유사하고/하거나 스클레로스틴을 중화시킨다. 상기 결합제의 비-CDR 부분은 아미노산으로 이루어질 수 있고, 이때의 결합제는 재조합 결합 단백질 또는 합성 펩티드이며, 상기 재조합 결합 단백질은 본원에 개시된 항체가 스클레로스틴에 결합하는 것을 교차-차단하고/하거나 스클레로스틴을 중화시킨다. 상기 결합제의 비-CDR 부분은 아미노산으로 이루어질 수 있고, 이때의 결합제는 재조합 결합 단백질이며, 상기 재조합 결합 단백질은 인간 스클레로스틴 펩티드 에피토프 경쟁 결합 검정 (하기함)에서 인간 스클레로스틴 펩티드에 대하여 발휘하는 결합 패턴이 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 및 Ab-24 중 1종 이상이 발휘하는 결합 패턴과 유사하고/하거나 스클레로스틴을 중화시킨다.
항체가 상기한 바와 같이 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 1개 이상을 포함하는 경우, 이것은 이들 서열을 코딩하는 DNA를 함유하는 숙주 세포로부터의 발현에 의해 수득될 수 있다. 각 CDR 서열을 코딩하는 DNA는 CDR의 아미노산 서열을 기초로 결정될 수 있고, 적절한 경우에는 올리고뉴클레오티드 합성 기술, 부위-지정 돌연변이유발 및 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술을 이용하여 임의의 원하는 항체 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 DNA 서열과 함께 합성될 수 있다. 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역을 코딩하는 DNA는 유전자 서열 데이타베이스, 예를 들어 진뱅크(GenBank)®로부터 당업자에게 널리 이용가능하다. 상기 언급한 CDR 각각은 전형적으로 가변 영역 프레임워크에서 캐버트(Kabat) 넘버링 시스템 [Kabat et al., 1987 in 서열 of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, USA]에 따라 중쇄의 위치 31 내지 35 (CDR-H1), 50 내지 65 (CDR-H2) 및 95 내지 102 (CDR-H3) 및 경쇄의 위치 24 내지 34 (CDR-L1), 50 내지 56 (CDR-L2) 및 89 내지 97 (CDR-L3)에 위치할 것이다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA가 일단 합성되면, 이것은 임의의 수의 공지의 발현 벡터를 이용하여 핵산 절단, 라이게이션, 형질전환 및 형질감염과 관련한 임의의 각종 공지의 절차에 따라 복제되어 발현될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 항체 단편의 발현은 원핵 숙주, 예를 들어 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli)에서 선호될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178:497-515] 참조). 특정 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편의 발현은 효모 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)), 동물 세포 (예를 들어 포유동물 세포) 또는 식물 세포 등을 비롯한 진핵 숙주 세포에서 선호될 수 있다. 적합한 동물 세포의 예로는 골수종 (예를 들어 마우스 NSO 세포주), COS, CHO 또는 하이브리도마 세포 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 식물 세포의 예로는 담배 세포, 옥수수 세포, 대두 세포 및 벼 세포 등이 있다.
항체 가변 영역 및/또는 불변 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 1개 이상의 복제가능한 발현 벡터를 제조하고, 이것을 이용하여 항체가 생성될 적절한 세포주, 예를 들어 비-생성 골수종 세포주, 예를 들어 마우스 NSO 세포주 또는 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli)를 형질감염시킬 수 있다. 효율적인 전사 및 번역 달성을 위해서는, 각 벡터 중의 DNA 서열이 가변 도메인 서열에 작동가능하게 연결된 적절한 조절 서열, 특히 프로모터 및 리더 서열을 포함해야 한다. 이러한 방법으로 항체를 생성하는 특별한 방법은 일반적으로 공지되어 있으며 통상적으로 사용되고 있다. 예를 들어, 기본적인 분자 생물학 절차는 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989] 또한 문헌 [Maniatis et al., 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001)]에 기재되어 있다. DNA 서열결정은 문헌 ([Sanger et al., PNAS 74:5463, (1977)] 및 [Amersham International plc sequencing handbook])에 기재된 바와 같이 수행할 수 있고, 부위-지정 돌연변이유발은 당업계에 공지된 방법 ([Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441, (1984)], [Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985)], [Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987), the Anglian Biotechnology Ltd handbook])에 따라 수행할 수 있다. 추가로, 수많은 간행물이 DNA 조작, 발현 벡터의 제작, 및 적절한 세포의 형질전환 및 배양에 의한 항체 제조에 적합한 기술을 기재한다 ([Mountain A and Adair, J R in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Chapter 1, 1992, Intercept 및over, UK)], ["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, New York]).
상기 언급한 CDR 중 1개 이상을 함유하는 본 발명에 따른 항체의 친화도를 개선시키고자 하는 경우, 이는 CDR 유지 [Yang et al., J. Mol. Biol, 254, 392-403, 1995], 쇄 셔플링(shuffling) [Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992], 이. 콜라이 돌연변이 균주의 사용 [Low et al., J. Mol. Biol, 250, 350-368, 1996], DNA 셔플링 [Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997], 파지 디스플레이 [Thompson et al., J. MoI Biol, 256, 7-88, 1996] 및 성적(sexual) PCR [Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998] 등을 비롯한 수많은 친화도 성숙 프로토콜로 달성할 수 있다. 이들 친화도 성숙 방법 모두가 문헌 [Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998]에 논의되어 있다.
본 발명에 따른 다른 항체는 본원에 기재하고 당업계에 공지된 바와 같은 통상의 면역화 및 세포 융합 절차로 수득될 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체는 각종 공지 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 일반적으로, 특이적 항원에 결합하는 모노클로날 항체는 당업자에게 공지된 방법으로 수득될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495, 1975], [Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.12.6.7 (John Wiley ＆ Sons 1991)], 미국 특허 제RE 32,011호, 동 제4,902,614호, 동 제4,543,439호 및 동 제4,411,993호, [Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn 및 Bechtol (eds.) (1980)] 및 [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)], [Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995)]). 항체 단편은 임의의 적합한 표준 기술, 예를 들어 단백질분해 소화 또는 임의로는 단백질분해 소화 (예를 들어, 파파인 또는 펩신 사용) 후의 디술피드 결합의 온화한 환원 및 알킬화 등을 이용하여 유도될 수 있다. 별법으로, 이러한 단편은 본원에 기재한 바와 같은 재조합 유전자 조작 기술로 생성될 수도 있다.
당업계에 공지되고 본원에 기재된 방법에 따라, 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 바와 같이 동물, 예를 들어 래트, 햄스터, 토끼, 또는 바람직하게는 마우스, 예를 들어 트랜스제닉 또는 넉-아웃(knock-out)에게 서열 1의 인간 스클레로스틴 또는 그의 단편을 포함하는 면역원을 주입하여 수득될 수 있다. 특이적 항체 생성의 여부는 초기 주입후 및/또는 부스터 주입후에 당업계에 공지되고 본원에 기재된 여러가지 면역검출 방법 중 임의의 것을 이용하여 혈청 샘플을 수득하고 인간 스클레로스틴 또는 펩티드에 결합하는 항체의 존재를 검출하여 모니터링할 수 있다. 원하는 항체를 생성하는 동물로부터, 림프양 세포, 가장 통상적으로는 비장 또는 림프절의 세포를 꺼내어 B-림프구를 수득한다. 이어서, 상기 B 림프구를 약물-감작화된 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화된 동물과 동계(syngeneic)이고 임의로는 바람직한 기타 성질 (예를 들어, 내인성 Ig 유전자 생성물, 예컨대 P3X63-Ag 8.653 (ATCC 번호: CRL 1580), NSO, SP20의 발현 불능)을 보유하는 것과 융합시켜, 불멸 진핵 세포주인 하이브리도마를 생성한다. 림프양 (예를 들어 비장) 세포 및 골수종 세포를 수분 동안 막 융합-촉진제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 비-이온성 세정제와 배합한 후에 하이브리도마 세포의 성장은 지지하지만 미융합 골수종 세포의 성장은 지지하지 않는 선별 배지에 낮은 밀도로 플레이팅할 수 있다. 바람직한 선별 배지는 HAT (하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘)이다. 충분한 시간 후, 통상적으로는 약 1주 내지 2주 후, 세포 콜로니가 관찰된다. 단일 콜로니를 단리하고, 세포에 의해 생성된 항체를 당업계에 공지되고 본원에 기재된 각종 면역검정법 중 임의의 것을 이용하여 인간 스클레로스틴에 대한 결합 활성에 대하여 시험할 수 있다. 하이브리도마를 클로닝하고 (예를 들어 제한 희석 클로닝 또는 연질 아가 플라크 단리법을 이용함), 스클레로스틴에 특이적인 항체를 생성하는 양성 클론을 선별하여 배양한다. 하이브리도마 배양액으로부터의 모노클로날 항체를 하이브리도마 배양액의 상등액에서 단리할 수 있다. 뮤린(murine) 모노클로날 항체를 생성하는 별법의 방법은 하이브리도마 세포를 동계 마우스, 예를 들어 모노클로날 항체를 함유하는 복수액의 형성이 촉진되도록 처리된 마우스 (예를 들어, 프리스탄-프라이밍(priming)된 마우스)의 복강 내로 주입하는 것이다. 모노클로날 항체는 각종 수립된 기술로 단리 및 정제될 수 있다. 이러한 단리 기술로는 프로테인-A 세파로스(Protein-A Sepharose)를 이용한 친화도 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 및 이온-교환 크로마토그래피 (예를 들어, 콜리간(Coligan) 문헌의 제2.7.1면 내지 제2.7.12면 및 제2.9.1면 내지 제2.9.3면, 문헌 [Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)] 참조) 등이 있다. 모노클로날 항체는 항체의 특정 성질 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 이소형, 결합 특이성 등)을 기초로 하여 선택된 적절한 리간드를 이용한 친화도 크로마토그래피로 정제될 수 있다. 고체 지지체상에 고정된 적합한 리간드의 예로는, 프로테인 A, 프로테인 G, 항-불변 영역 (경쇄 또는 중쇄) 항체, 항-이디오타입(idiotype) 항체, 및 TGF-베타 결합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체 등이 있다.
본 발명의 항체는 또한 인간 모노클로날 항체일 수도 있다. 인간 모노클로날 항체는 당업자에게 친숙한 임의의 수의 기술로 생성될 수 있다. 이러한 방법으로는, 인간 말초혈 세포 (예를 들어, B 림프구 함유)의 엡스테인 바르 바이러스 (EBV) 형질전환, 인간 B 세포의 시험관내 면역화, 삽입된 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터의 비장 세포의 융합, 인간 이뮤노글로불린 V 영역 파지 라이브러리로부터의 단리, 또는 당업계에 공지되고 본원에서의 개시내용을 기초로 하는 기타 절차 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체는 항원성 시험감염(challenge)에 대한 반응으로 특이적 인간 항체를 생성하도록 조작된 트랜스제닉 마우스에서 수득될 수 있다. 트랜스제닉 마우스로부터 인간 항체를 수득하는 방법은 예를 들어 문헌 ([Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994], [Lonberg et al., Nature 368:856, 1994], [Taylor et al., Int. Immun. 6:579, 1994], 미국 특허 제5,877,397호, [Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58], [Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:525-35])에 기재되어 있다. 상기 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소가, 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 파괴를 함유하는 배아 줄기 세포주에서 유래한 마우스 균주에 도입된다 (또한, 문헌 [Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)] 참조). 예를 들어, 인간 이뮤노글로불린 트랜스진(transgene)은 미니-유전자 구조물이거나 또는 마우스 림프양 조직에서 B 세포-특이적 DNA 재배열 및 과다돌연변이가 일어난 효모 인공 염색체상의 트랜스유전자좌(transloci)일 수 있다. 인간 모노클로날 항체는 트랜스제닉 마우스를 면역화하여 수득될 수 있으며, 이것은 이후에 스클레로스틴에 특이적인 인간 항체를 생성할 수 있다. 면역화된 트랜스제닉 마우스의 림프양 세포는 본원에 기재된 방법에 따라 인간 항체-분비 하이브리도마를 제조하는데 이용될 수 있다. 인간 항체를 함유하는 폴리클로날 혈청 또한 면역화된 동물의 혈액으로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 인간 항체를 생성하는 또다른 방법은 EBV 형질전환에 의해 인간 말초혈 세포를 불멸화하는 것을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,464,456호를 참조한다. 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는 이러한 불멸화 B 세포주 (또는 림프아구양 세포주)는 본원에서 제공하는 바와 같은 면역검출 방법, 예를 들어 ELISA로 동정된 후에 표준 클로닝 기술로 단리될 수 있다. 항-스클레로스틴 항체를 생성하는 림프아구양 세포주의 안정성은 당업계에 공지된 방법에 따라 형질전환된 세포주를 뮤린 골수종과 융합하여 마우스-인간 하이브리드 세포주를 생성함으로써 개선될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989)] 참조). 인간 모노클로날 항체를 생성하는 또다른 방법은 시험관내 면역화이며, 이것은 인간 비장 B 세포를 인간 스클레로스틴으로 프라이밍한 후에 프라이밍된 B 세포를 헤테로하이브리드 융합 파트너와 융합시키는 것을 포함한다. 예를 들어 문헌 [Boerner et al., 1991 J. Immunol. 147:86-95]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 당업계에 공지되고 (제WO 92/02551호, 미국 특허 제5,627,052호, 문헌 [Babcook et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)]) 본원에 기재된 분자 생물학 기술에 따라 항-인간 스클레로스틴 항체를 생성하는 B 세포가 선별되고 상기 B 세포로부터 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 클로닝된다. 면역화된 동물로부터의 B 세포는 비장, 림프절 또는 말초혈 샘플에서 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하고 있는 세포를 선별하여 단리될 수 있다. B 세포는 인간, 예를 들어 말초혈 샘플에서 단리될 수도 있다. 원하는 특이성을 갖는 항체를 생성하는 단일 B 세포의 검출 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 플라크 형성, 형광-활성화 세포 분류, 시험관내 자극 및 이후 특이적 항체의 검출 등이 있다. 특이적 항체-생성 B 세포의 선별 방법으로는, 예를 들어 인간 스클레로스틴을 함유하는 연질 아가 중 B 세포의 단일 세포 현탁액 제조 등이 있다. B 세포에 의해 생성된 특이적 항체가 항원에 결합하면 복합체가 형성되고, 이것은 면역침전물로 관찰될 수 있다. 원하는 항체를 생성하는 B 세포를 선별한 후, 당업계에 공지되고 본원에 기재된 방법에 따라 DNA 또는 mRNA를 단리 및 증폭시켜 특이적 항체 유전자를 클로닝할 수 있다.
본 발명의 항체를 수득하기 위한 추가의 방법은 파지 디스플레이에 의한 것이다. 예를 들어, 문헌 ([Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55], [Burton et al, 1994 Adv. Immunol. 57:191-280])을 참조한다. 인간 또는 뮤린 이뮤노글로불린 가변 영역 유전자 조합 라이브러리는, TGF-베타 결합 단백질 또는 그의 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 Ig 단편 (Fab, Fv, sFv 또는 이들의 다량체)의 선별을 위해 스크리닝될 수 있는 파지 벡터에서 생성될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,223,409호, 문헌 ([Huse et al., 1989 Science 246:1275-81], [Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989)], [Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990)], [Kang et al., 1991 Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:4363-66], [Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227:381-388], [Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16:47-52]) 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌을 참조한다. 예를 들어, Ig 가변 영역 단편을 코딩하는 복수개의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 라이브러리는 섬유상 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 그의 변이체의 게놈에 파지 외피 단백질을 코딩하는 서열과 프레임에 맞게 삽입될 수 있다. 융합 단백질은 경쇄 가변 영역 도메인 및/또는 중쇄 가변 영역 도메인과의 외피 단백질 융합일 수 있다.
특정 실시양태에 따라, 이뮤노글로불린 Fab 단편은 또한 파지 입자 상에 나타날 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,698,426호 참조).
중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 cDNA 발현 라이브러리는 또한, 예를 들어 λ이뮤노자프(ImmunoZap)(상표명)(H) 및 λ이뮤노자프(상표명)(L) 벡터 (캘리포니아주 라 졸라 소재 스트라젠(Sratagene))를 사용하여 λ 파지 내에서 제조될 수 있다. 요약하면, mRNA를 B 세포 개체군으로부터 단리하고, 이를 사용하여 λ이뮤노자프(H) 및 λ이뮤노자프(L) 벡터 내에 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 cDNA 발현 라이브러리를 제조한다. 이들 벡터는 개별적으로 스크리닝되거나 공-발현되어 Fab 단편 또는 항체 (상기 휴스(Huse) 등의 문헌 및 상기 사스트리(Sastry) 등의 문헌 참조)를 형성할 수 있다. 이어서 포지티브 플라크를 비-용해성 플라스미드로 전환하여 이. 콜라이로부터 모노클로날 항체 단편이 높은 수준으로 발현되도록 할 수 있다.
한 실시양태에서, 하이브리도마 내의 목적하는 모노클로날 항체를 발현하는 유전자의 가변 영역은 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭된다. 이들 프라이머는 당업자에 의해 합성되거나, 시판되는 공급원 (예를 들어, 마우스 및 인간 가변 영역에 대한 프라이머, 및 다른 것들 중에서 VHa, VHb, VHc, VHd, CH1, VL 및 CL 영역에 대한 프라이머를 판매하는 스트라젠 (캘리포니아주 라 졸라 소재))으로부터 구입할 수 있다. 이들 프라이머를 사용하여 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 증폭시킬 수 있으며, 그 후 이들을 벡터, 예컨대 각각 이뮤노자프(상표명)H 또는 이뮤노자프(상표명)L (스트라젠) 내로 삽입할 수 있다. 이들 벡터는 발현을 위해 이. 콜라이, 효모 또는 포유동물 기재 시스템 내로 도입될 수 있다. 이들 방법을 사용하여 VH 및 VL 도메인의 융합을 함유하는 다량의 단쇄 단백질을 제조할 수 있다 (문헌 [Bird et al., Science 242:423-426, 1988] 참조).
임의의 상기 기술한 면역화 및 다른 기술을 이용하여 본 발명에 따른 항체를 제조하는 세포를 수득하고, 이로부터 본원에 기술된 표준 절차에 따라 DNA 또는 mRNA를 단리하고 증폭시킴으로써 특정 항체 유전자를 클로닝할 수 있다. 이로부터 제조된 항체를 서열화하고, 확인된 CDR 및 CDR에 대해 코딩한 DNA를 이전에 기술한 바와 같이 조작하여 본 발명에 따른 다른 항체를 발생시킬 수 있다.
바람직하게는, 상기 결합제는 구체적으로 스클레로스틴에 결합한다. 모든 결합제 및 결합 검정으로부터, 당업자는 결합제가 치료적으로 유효하고 적합해지기 위해 검출가능하게 결합하지 않아야 하는 다양한 잔기가 고갈되었고 사용하기에 비현실적임을 인지하고 있다. 그러므로, 본원에 개시된 결합제에 대해, 용어 "구체적으로 결합한다"는 결합제가 관련되지 않은 제어 단백질에 결합하는 것보다 높은 친화도로 스클레로스틴, 바람직하게는 인간 스클레로스틴에 결합하는 결합제의 능력을 지칭한다. 바람직하게는, 제어 단백질은 계란 흰자 리소자임이다. 바람직하게는, 상기 결합제는 제어 단백질에 대한 친화도 보다 50, 100, 250, 500, 1000 또는 10,000배 이상의 친화도로 스클레로스틴에 결합한다. 결합제는 인간 스클레로스틴에 대해 1 x 10-7M 이하, 1 x 10-8M 이하, 1 x 10-9M 이하, 1 x 10-10M 이하, 1 x 10-11M 이하 또는 1 x 10-12M 이하의 결합 친화도를 가질 수 있다.
친화도는 친화도 ELISA 검정으로 측정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 친화도는 비아코어 검정으로 측정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 친화도는 동력법으로 측정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 친화도는 평형/용액법으로 측정할 수 있다. 상기 방법은 본원에 보다 자세히 기술되어 있거나, 또는 당업계에 공지되어 있다.
바람직하게는, 본 발명의 스클레로스틴 결합제는 본원에 기술된 세포-기재 검정 및/또는 본원에 기술된 생체내 검정에서 스클레로스틴 기능을 조절하고/거나 본원에 기술된 하나 이상의 에피토프에 결합하고/거나, 본 명세서에 기술된 항체 중 하나에 결합하는 것을 교차-차단하고/거나 본 명세서에 기술된 항체 중 하나에 의해 스클레로스틴과의 결합으로부터 교차-차단된다. 따라서, 상기 결합제는 본원에 기술된 검정을 사용하여 확인할 수 있다.
특정 실시양태에서, 결합제는 먼저 본원에 제공된 하나 이상의 에피토프에 결합하고/거나 본원에 기술된 세포-기재 검정 및/또는 생체내 검정으로 중화되고/거나 본 명세서에 기술된 항체를 교차-차단하고/거나 본 명세서에 기술된 하나 이상의 항체에 의해 스크레로스틴과의 결합으로부터 교차-차단됨으로써 발생된다. 이어서, 이들 항체의 CDR 영역을 사용하여 적절한 생체적합한 골격에 삽입하여 스클레로스틴 결합제를 발생시킨다. 상기 결합제의 비-CDR 부분은 아미노산으로 구성될 수 있거나, 또는 비-단백질 분자일 수 있다. 본원에 기술된 검정으로 결합제를 특성화할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 결합제는 본원에 정의된 바와 같은 항체이다.
당업자는 일부 단백질, 예컨대 항체가 다양한 번역후 개질을 겪을 수 있음을 이해할 것이다. 이들 개질의 유형 및 정도는 종종 단백질을 발현시키는데 사용되는 숙주 세포주 및 배양 조건에 따라 달라진다. 상기 개질은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화에서의 변형을 포함할 수 있다. 자주 일어나는 개질은 카르복시펩티다제의 작용으로 인한 카르복시-말단 염기성 잔기 (예컨대, 리신 또는 아르기닌)의 손실이다 (문헌 [Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995]에 기술된 바와 같음).
Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D 및 Ab-1로서 지칭되는 항체를 하기에 나타내었다. "HC"는 중쇄를 지칭하고, "LC"는 경쇄를 지칭한다. 하기 일부 항체에 대하여, CDR은 어두운 네모로 표시하고, 불변 (C) 영역은 두꺼운 이탤릭체로 표시하였다.
Ab -D
항체 D (본원에서 Ab-D 및 Mab-D로도 지칭됨)는 스클레로스틴에 높은 친화도로 결합하는 마우스 항체이다. Ab-D의 비아코어 결합 패턴을 도 18에 나타내었다.
Ab-D 경쇄의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00001
Ab-D LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00002
이다.
신호 펩티드를 포함하는 Ab-D LC의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00003
이다.
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-D LC의 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00004
이다.
Ab-D HC 중쇄의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00005
이다.
Ab-D HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00006
이다.
신호 펩티드를 포함하는 Ab-D HC의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00007
이다.
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-D HC의 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00008
이다.
Ab-D의 중쇄 가변 영역 내 CDR (상보성 결정 영역) 서열은
Figure 112015094068939-pat00009
이다.
Ab-D의 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00010
이다.
Ab -C
항체 C (본원에서 Ab-C 및 Mab-C로도 지칭됨)는 스클레로스틴에 높은 친화도로 결합하는 마우스 항체이다. Ab-C의 비아코어 결합 패턴을 도 17에 나타내었다. Ab-C 경쇄의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00011
이다.
Ab-C LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00012
이다.
신호 펩티드를 포함하는 Ab-C LC의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00013
이다.
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-C LC의 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00014
이다.
Ab -C 중쇄
Ab-C HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00015
이다.
Ab-C HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00016
이다.
신호 펩티드를 포함하는 Ab-C HC의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00017
이다.
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-C HC의 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00018
이다.
Ab-C의 중쇄 가변 영역 내 CDR (상보성 결정 영역) 서열은
Figure 112015094068939-pat00019
이다.
Ab-C의 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00020
이다.
Ab -A
항체 A (본원에서 Ab-A 및 Mab-A로도 지칭됨)는 스클레로스틴에 높은 친화도로 결합하는 토끼-마우스 키메라 항체이다. Ab-A의 비아코어 결합 패턴을 도 15에 나타내었다.
Ab -A 경쇄
Ab-A LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00021
Ab-A LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00022
신호 펩티드를 포함하는 Ab-A LC의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00023
이다.
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-A LC의 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00024
이다.
Ab-A HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00025
이다.
Ab-A HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00026
이다.
신호 펩티드를 포함하는 Ab-A HC의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00027
이다.
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-A HC의 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00028
이다.
Ab-A의 중쇄 가변 영역 내 CDR (상보성 결정 영역) 서열은
Figure 112015094068939-pat00029
이다.
Ab-A의 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00030
이다.
Ab-A는 인간화된 것이고, 하기 서열을 갖는 항체 1 (본원에서 Ab-1로도 지칭됨)로 지칭된다.
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-1 LC 가변 영역의 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00031
이다.
신호 펩티드를 포함하는 Ab-1 LC 가변 영역의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00032
이다.
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-1 HC 가변 영역의 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00033
이다.
신호 펩티드를 포함하는 Ab-1 HC 가변 영역의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00034
이다.
Ab-1의 중쇄 가변 영역 내 CDR (상보성 결정 영역) 서열은
Figure 112015094068939-pat00035
이다.
Ab-1의 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00036
이다.
Ab -B
항체 B (본원에서 Ab-B 및 Mab-B로도 지칭됨)는 스클레로스틴에 높은 친화도로 결합하는 마우스 항체이다. Ab-B의 비아코어 결합 패턴을 도 16에 나타내었다.
Ab -B 경쇄
Ab-B LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00037
이다.
Ab-B LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00038
이다.
신호 펩티드를 포함하는 Ab-B LC의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00039
이다.
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-B LC의 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00040
이다.
Ab -B 중쇄
Ab-B HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00041
이다.
Ab-B HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00042
이다.
신호 펩티드를 포함하는 Ab-B HC의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00043
이다.
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-B HC의 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00044
이다.
Ab-B의 중쇄 가변 영역 내 CDR (상보성 결정 영역) 서열은
Figure 112015094068939-pat00045
이다.
Ab-B의 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00046
이다.
본원에 개시된 항체는 단백질의 생체내 활성에 중요한 인간 스클레로스틴의 영역에 결합한다. 항체와 스클레로스틴의 결합은, 예컨대 실시예 5 및 9 (마우스) 및 실시예 12 (원숭이)에서 기술된 생체내 항체의 사용에 의해 달성되는 골 무기질 밀도 증가와 관련될 수 있다. 골 형성, 골 무기질 함량, 골 질량, 골 질 및 골 강도 중 적어도 하나의 증가는 또한, 예컨대 실시예 5 및 9 (마우스) 및 실시예 12 (원숭이)에서 기술된 바와 같은 생체내 항체의 사용에 의해 달성될 수 있다. 항체와 스클레로스틴의 결합은 주로 이의 CDR 서열에 의해 결정되므로, 본 발명을 실행하기 위한 항체는 적절한 골격 내에서 개시된 전체 또는 일부 CDR 서열로 발생될 수 있으며, 여기서 상기 항체는 스클레로스틴에 구체적으로 결합하는 능력을 보유하며, 예를 들어 골 무기질 밀도에서의 증가를 달성할 것으로 기대될 수 있다. 상기 항체는 낮은 골 형성, 낮은 골 무기질 밀도, 낮은 골 무기질 함량, 낮은 골 질량, 낮은 골 질 및 낮은 골강도 중 적어도 하나에 의해 야기되거나, 이와 관련되거나 또는 이를 발생시키는 인간 또는 동물 상태의 치료에 유용하다. 본 발명의 CDR을 포함하는 항체 및 이의 단편의 구축 및 발현 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
그러므로, 본 발명은 한 실시양태에서 Ab-A를 비롯한 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 이는 구체적으로 스클레로스틴에 결합하고, 상기 중쇄의 가변 도메인은 CDR-H1에 대해 서열 51, CDR-H2에 대해 서열 52, CDR-H3에 대해 서열 53에 제시된 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDR이 CDR-H1에 대해 서열 51, CDR-H2에 대해 서열 52, CDR-H3에 대해 서열 53 중 적어도 하나의 펩티드로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 내에 경쇄가 존재할 경우, 상기 경쇄는 임의의 적합한 상보적 사슬일 수 있고, 특히 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 54, CDR-L2에 대해 서열 55 및 CDR-L3에 대해 서열 56에 제시된 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄로부터 선택될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDR이 CDR-L1에 대해 서열 54, CDR-L2에 대해 서열 55, CDR-L3에 대해 서열 56 중 적어도 하나의 펩티드로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 Ab-B를 비롯한 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 이는 구체적으로 스클레로스틴에 결합하고, 상기 중쇄의 가변 도메인은 CDR-H1에 대해 서열 57, CDR-H2에 대해 서열 58, CDR-H3에 대해 서열 59에 제시된 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDR이 CDR-H1에 대해 서열 57, CDR-H2에 대해 서열 58, CDR-H3에 대해 서열 59 중 적어도 하나의 펩티드로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 내에 경쇄가 존재할 경우, 상기 경쇄는 임의의 적합한 상보적 사슬일 수 있고, 특히 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 60, CDR-L2에 대해 서열 61 및 CDR-L3에 대해 서열 62에 제시된 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄로부터 선택될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDR이 CDR-L1에 대해 서열 60, CDR-L2에 대해 서열 61, CDR-L3에 대해 서열 62 중 적어도 하나의 펩티드로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 Ab-C를 비롯한 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 이는 구체적으로 스클레로스틴에 결합하고, 상기 중쇄의 가변 도메인은 CDR-H1에 대해 서열 45, CDR-H2에 대해 서열 46, CDR-H3에 대해 서열 47에 제시된 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDR이 CDR-H1에 대해 서열 45, CDR-H2에 대해 서열 46, CDR-H3에 대해 서열 47 중 적어도 하나의 펩티드로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 내에 경쇄가 존재할 경우, 상기 경쇄는 임의의 적합한 상보적 사슬일 수 있고, 특히 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 48, CDR-L2에 대해 서열 49 및 CDR-L3에 대해 서열 50에 제시된 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄로부터 선택될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDR이 CDR-L1에 대해 서열 48, CDR-L2에 대해 서열 49, CDR-L3에 대해 서열 50 중 적어도 하나의 펩티드로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 Ab-D를 비롯한 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 이는 구체적으로 스클레로스틴에 결합하고, 상기 중쇄의 가변 도메인은 CDR-H1에 대해 서열 39, CDR-H2에 대해 서열 40, CDR-H3에 대해 서열 41에 제시된 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDR이 CDR-H1에 대해 서열 39, CDR-H2에 대해 서열 40, CDR-H3에 대해 서열 41 중 적어도 하나의 펩티드로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 내에 경쇄가 존재할 경우, 상기 경쇄는 임의의 적합한 상보적 사슬일 수 있고, 특히 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 42, CDR-L2에 대해 서열 43 및 CDR-L3에 대해 서열 44에 제시된 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄로부터 선택될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDR이 CDR-L1에 대해 서열 42, CDR-L2에 대해 서열 43, CDR-L3에 대해 서열 44 중 적어도 하나의 펩티드로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
추가의 항-스클레로스틴 항체를 하기에 기술하였다. 일부 아미노산 서열에 대하여, 상보성-결정 영역 (CDR)은 어두운 네모로 표시하고, 불변 영역은 두꺼운 이탤릭체로 표시하였다.
Ab -2
항체 2 (Ab-2로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab -2 경쇄 :
Ab-2 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00047
이다.
Ab-2 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00048
이다.
신호 펩티드를 포함하는 Ab-2 LC의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00049
이다.
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-2 LC의 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00050
이다.
Ab -2 중쇄
Ab-2 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00051
이다.
Ab-2 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00052
이다.
신호 펩티드를 포함하는 Ab-2 HC의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00053
이다.
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-2 HC의 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00054
이다.
Ab -3
항체 3 (본원에서 Ab-3으로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab -3 경쇄
Ab-3 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00055
이다.
Ab-3 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00056
이다.
신호 펩티드를 포함하는 Ab-3 LC의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00057
이다.
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-3 LC의 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00058
이다.
Ab -3 중쇄
Ab-3 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00059
이다.
Ab-3 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00060
이다.
신호 펩티드를 포함하는 Ab-3 HC의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00061
이다.
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-3 HC의 핵산 서열은
Figure 112015094068939-pat00062
이다.
Ab -4
항체 4 (본원에서 Ab-4로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab -4 경쇄 :
Ab-4 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00063
Ab-4 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00064
신호 펩티드를 포함하는 Ab-4 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00065
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-4 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00066
Ab -4 중쇄 :
Ab-4 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00067
Ab-4 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00068
신호 펩티드를 포함하는 Ab-4 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00069
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-4 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00070
Ab-4를 인간화하여 Ab-5를 발생시켰다.
Ab -5
항체 5 (본원에서 Ab-5로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab-5 경쇄:
Ab-5 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00071
Ab-5 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00072
신호 펩티드를 포함하는 Ab-5 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00073
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-5 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00074
Ab -5 중쇄 :
Ab-5 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00075
카르복시-말단 리신이 없는 Ab-5 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00076
Ab-5 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00077
신호 펩티드를 포함하는 Ab-5 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00078
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-5 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00079
Ab -5 가변 도메인:
Ab-5 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00080
Ab-5 경쇄 가변 도메인의 DNA 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00081
Ab-5 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00082
Ab-5 중쇄 가변 도메인의 DNA 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00083
Ab-5의 중쇄 가변 영역 내 CDR (상보성 결정 영역) 서열은
Figure 112015094068939-pat00084
이다.
Ab-5의 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00085
이다.
Ab -6
항체 6 (본원에서 Ab-6로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab -6 경쇄 :
Ab-6 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열은
Figure 112015094068939-pat00086
이다.
Ab-6 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00087
신호 펩티드를 포함하는 Ab-6 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00088
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-6 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00089
Ab -6 중쇄 :
Ab-6 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00090
Ab-6 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00091
신호 펩티드를 포함하는 Ab-6 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00092
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-6 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00093
Ab -7
항체 7 (본원에서 Ab-7로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab -7 경쇄 :
Ab-7 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00094
Ab-7 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00095
신호 펩티드를 포함하는 Ab-7 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00096
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-7 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00097
Ab -7 중쇄 :
Ab-7 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00098
Ab-7 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00099
신호 펩티드를 포함하는 Ab-7 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00100
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-7 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00101
Ab -8
항체 8 (본원에서 Ab-8로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab -8 경쇄 :
Ab-8 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00102
Ab-8 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00103
신호 펩티드를 포함하는 Ab-8 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00104
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-8 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00105
Ab -8 중쇄 :
Ab-8 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00106
Ab-8 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00107
신호 펩티드를 포함하는 Ab-8 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00108
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-8 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00109
Ab -9
항체 9 (본원에서 Ab-9로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab -9 경쇄 :
Ab-9 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00110
Ab-9 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00111
신호 펩티드를 포함하는 Ab-9 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00112
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-9 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00113
Ab -9 중쇄 :
Ab-9 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00114
Ab-9 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00115
신호 펩티드를 포함하는 Ab-9 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00116
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-9 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00117
Ab -10
항체 10 (본원에서 Ab-10로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab -10 경쇄:
Ab-10 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00118
Ab-10 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00119
신호 펩티드를 포함하는 Ab-10 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00120
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-10 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00121
Ab -10 중쇄 :
Ab-10 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00122
Ab-10 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00123
신호 펩티드를 포함하는 Ab-10 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00124
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-10 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00125
Ab -11
항체 11 (본원에서 Ab-11로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab -11 경쇄 :
Ab-11 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00126
Ab-11 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00127
신호 펩티드를 포함하는 Ab-11 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00128
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-11 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00129
Ab-11 중쇄:
Ab-11 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00130
Ab-11 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00131
신호 펩티드를 포함하는 Ab-11 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00132
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-11 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00133
Ab-12
항체 12 (본원에서 Ab-12로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab-12 경쇄:
Ab-12 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00134
Ab-12 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00135
신호 펩티드를 포함하는 Ab-12 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00136
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-12 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00137
Ab -12 중쇄 :
Ab-12 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00138
Ab-12 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00139
신호 펩티드를 포함하는 Ab-12 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00140
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-12 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00141
Ab-13
항체 13 (본원에서 Ab-13으로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab-13 경쇄:
Ab-13 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00142
Ab-13 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00143
신호 펩티드를 포함하는 Ab-13 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00144
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-13 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00145
Ab -13 중쇄 :
Ab-13 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00146
Ab-13 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00147
신호 펩티드를 포함하는 Ab-13 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00148
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-13 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00149
Ab-13을 인간화하여 Ab-14를 발생시켰다. 항체 14 (본원에서 Ab-14로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab-14 경쇄
Ab-14 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00150
Ab-14 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00151
신호 펩티드를 포함하는 Ab-14 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00152
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-14 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00153
Ab -14 중쇄 :
Ab-14 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00154
카르복시-말단 리신이 없는 Ab-14 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00155
Ab-14 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00156
신호 펩티드를 포함하는 Ab-14 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00157
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-14 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00158
Ab-14의 중쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00159
이다.
Ab-14의 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00160
이다.
Ab -14 가변 도메인:
Ab-14 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00161
Ab-14 경쇄 가변 도메인의 DNA 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00162
Ab-14 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00163
Ab-14 중쇄 가변 도메인의 DNA 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00164
Ab-3을 인간화하여 Ab-15를 발생시켰다.
Ab-15
항체 15 (본원에서 Ab-15로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab-15 경쇄:
Ab-15 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00165
Ab-15 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00166
신호 펩티드를 포함하는 Ab-15 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00167
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-15 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00168
Ab -15 중쇄
Ab-15 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00169
카르복시-말단 리신이 없는 Ab-15 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00170
Ab-15 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00171
신호 펩티드를 포함하는 Ab-15 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00172
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-15 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00173
Ab-15의 중쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00174
이다.
Ab-15의 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00175
이다.
Ab -15 가변 도메인:
Ab-15 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00176
Ab-15 경쇄 가변 도메인의 DNA 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00177
Ab-15 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00178
Ab-15 중쇄 가변 도메인의 DNA 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00179
Ab-11을 인간화하여 Ab-16을 발생시켰다.
Ab-16
항체 16 (본원에서 Ab-16로도 지칭됨) LC 및 HC의 서열은 다음과 같다.
Ab-16 경쇄:
Ab-16 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00180
Ab-16 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00181
신호 펩티드를 포함하는 Ab-16 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00182
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-16 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00183
Ab -16 중쇄 :
Ab-16 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00184
카르복시-말단 리신이 없는 Ab-16 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00185
Ab-16 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00186
신호 펩티드를 포함하는 Ab-16 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00187
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-16 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00188
Ab-16의 중쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00189
이다.
Ab-16의 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00190
이다.
Ab -16 가변 도메인:
Ab-16 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00191
Ab-16 경쇄 가변 도메인의 DNA 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00192
Ab-16 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00193
Ab-16 중쇄 가변 도메인의 DNA 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00194
추가 항체는 본원에서 항체 17-22 (본원에서 Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21 및 Ab-22로도 지칭됨)로 지칭된다. Ab-17, Ab-19 및 Ab-21의 모든 VK 영역에 대한 κ 불변 영역은 다음과 같다.
Figure 112015094068939-pat00195
항체 17, 19 및 21의 VH 영역에 대한 중쇄 불변 영역은 다음과 같다.
Figure 112015094068939-pat00196
다음의 항체 아미노산 서열에서, 어두운-네모로 표시한 아미노산은 상보성-결정 영역 (CDR)을 나타내고, 밑줄친 아미노산은 신호 펩티드를 나타낸다.
Ab-17
신호 펩티드를 포함하는 Ab-17 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00197
신호 펩티드를 포함하는 Ab-17 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00198
신호 펩티드를 포함하는 Ab-17 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00199
신호 펩티드를 포함하는 Ab-17 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00200
Ab-17을 인간화하여 Ab-18을 발생시켰다.
Ab-18
신호 펩티드를 포함하는 Ab-18 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00201
신호 펩티드를 포함하는 Ab-18 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00202
신호 펩티드를 포함하는 Ab-18 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00203
신호 펩티드를 포함하는 Ab-18 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00204
Ab-18 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00205
Ab-18 경쇄 가변 도메인의 DNA 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00206
Ab-18 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00207
Ab-18 중쇄 가변 도메인의 DNA 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00208
Ab-19
신호 펩티드를 포함하는 Ab-19 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00209
신호 펩티드를 포함하는 Ab-19 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00210
신호 펩티드를 포함하는 Ab-19 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00211
신호 펩티드를 포함하는 Ab-19 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00212
Ab-19을 인간화하여 항체 20 (본원에서 Ab-20로도 지칭됨) 및 항체 23 (본원에서 Ab-23으로도 지칭됨)을 발생시켰다.
Ab-20
IgG4 버젼
신호 펩티드를 포함하는 Ab-20 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00213
신호 펩티드를 포함하는 Ab-20 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00214
신호 펩티드를 포함하는 Ab-20 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00215
신호 펩티드를 포함하는 Ab-20 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00216
Ab -23
IgG2 버젼
경쇄 :
Ab-23 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00217
Ab-23 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00218
신호 펩티드를 포함하는 Ab-23 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00219
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-23 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00220
중쇄 :
Ab-23 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00221
카르복시-말단 리신이 없는 Ab-23 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00222
Ab-23 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00223
신호 펩티드를 포함하는 Ab-23 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00224
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-23 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00225
Ab-23의 중쇄 가변 영역 내 CDR (상보성 결정 영역) 서열은
Figure 112015094068939-pat00226
이다.
Ab-23의 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00227
이다.
Ab-23 가변 도메인:
Ab-23 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00228
Ab-23 경쇄 가변 도메인의 DNA 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00229
Ab-23 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00230
Ab-23 중쇄 가변 도메인의 DNA 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00231
Ab-21
신호 펩티드를 포함하는 Ab-21 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00232
신호 펩티드를 포함하는 Ab-21 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00233
신호 펩티드를 포함하는 Ab-21 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00234
신호 펩티드를 포함하는 Ab-21 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00235
Ab-21을 인간화하여 Ab-22를 수득하였다.
Ab -22
신호 펩티드를 포함하는 Ab-22 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00236
신호 펩티드를 포함하는 Ab-22 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00237
신호 펩티드를 포함하는 Ab-22 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00238
신호 펩티드를 포함하는 Ab-22 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00239
Ab-22 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00240
Ab-22 경쇄 가변 도메인의 DNA 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00241
Ab-22 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00242
Ab-22 중쇄 가변 도메인의 DNA 서열 (신호 서열 부재):
Figure 112015094068939-pat00243
Ab-18, Ab-20 및 Ab-22에 대하여, 경쇄 인간 κ 불변 영역은 다음과 같다.
Figure 112015094068939-pat00244
중쇄 인간 λ-4 불변 영역은 다음과 같다.
Figure 112015094068939-pat00245
힌지 (hinge) 영역은 Ser-241-Pro 돌연변이를 함유하여 힌지 안정성을 증진시킨다 (문헌 [Angal S et al, (1993), Mol Immunol, 30(1), 105-108])
Ab-24
항체 24 (본원에서 Ab-24로도 지칭됨) LC 및 HC의 영역은 다음과 같다.
경쇄:
Ab-24 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00246
Ab-24 LC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00247
신호 펩티드를 포함하는 Ab-24 LC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00248
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-24 LC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00249
Ab -24 중쇄 :
Ab-24 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)의 아미노산 서열 :
Figure 112015094068939-pat00250
Ab-24 HC의 성숙한 형태 (신호 펩티드 제거)를 코딩하는 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00251
신호 펩티드를 포함하는 Ab-24 HC의 아미노산 서열:
Figure 112015094068939-pat00252
신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 Ab-24 HC의 핵산 서열:
Figure 112015094068939-pat00253
Ab-24의 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00254
이다.
Ab-24의 중쇄 가변 영역 내 CDR 서열은
Figure 112015094068939-pat00255
이다.
하기 표 1은 Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-1l, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 및 Ab-24의 CDR 서열 및 아미노산 서열을 제공한다. 카바트 (Kabat) 번호화 시스템 (문헌 [Kabat et al, 1987 in 서열 of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, USA])에 따라, L1, L2 및 L3은 경쇄 CDR의 1, 2 및 3을 나타내고, H1, H2 및 H3은 중쇄 CDR의 1, 2 및 3을 나타낸다.
<표 1A>
Figure 112015094068939-pat00256
<표 1B>
Figure 112015094068939-pat00257
<표 1C>
Figure 112015094068939-pat00258
올리고펩티드 또는 폴리펩티드가 상기 표 1 중 1개 이상의 CDR 및/또는 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 및 Ab-24 중 하나 이상이 스클레로스틴과 결합하는 것을 교차-차단하는 스클레로스틴 결합제의 CDR과 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상 동일한 아미노산 서열을 갖고/거나, 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 및 Ab-24 중 하나 이상이 스클레로스틴과 결합하는 것; 및/또는 세포 기재 미네랄화 검정 (즉, 스클레로스틴 중화 결합제)에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단할 수 있는 스클레로스틴 결합제의 CDR에 결합하는 것; 및/또는 루프 2 에피토프에 결합하는 스클레로스틴 결합제의 CDR에 결합하는 것; 및/또는 T20.6 에피토프에 결합하는 스클레로스틴 결합제의 CDR에 결합하는 것; 및/또는 "T20.6 유도체 (시스틴-노트 +4 아암)" 에피토프에 결합하는 스클레로스틴 결합제의 CDR에 결합하는 것을 교차-차단할 경우, 상기 올리고펩티드 또는 폴리펩티드는 본 발명의 범주 내에 있다.
스클레로스틴 결합제 폴리펩티드 및 항체가 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 및 Ab-24 중 하나 이상의 가변 영역과 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상 동일한 아미노산 서열을 갖고, 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 및 Ab-24 중 하나 이상이 스클레로스틴과 결합하는 것을 교차-차단하고/거나, 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 및 Ab-24 중 하나 이상이 스클레로스틴에 결합하는 것이 교차-차단되고/거나; 세포 기재 미네랄화 검정 (즉, 스클레로스틴 중화 결합제)에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단할 수 있고/거나; 루프 2 에피토프에 결합하고/거나; T20.6 에피토프에 결합하고/거나; "T20.6 유도체 (시스틴-노트 +4 아암)" 에피토프에 결합할 경우, 상기 스클레로스틴 결합제 폴리펩티드 및 항체는 본 발명의 범주 내에 있다.
스클레로스틴 결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 및 Ab-24 중 하나 이상의 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상 동일한 아미노산 서열을 갖고, 여기서 코딩된 스클레로스틴 결합제가 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 및 Ab-24 중 하나 이상이 스클레로스틴과 결합하는 것을 교차-차단하고/거나, 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 및 Ab-24 중 하나 이상이 스클레로스틴에 결합하는 것이 교차-차단되고/거나; 세포 기재 미네랄화 검정 (즉, 스클레로스틴 중화 결합제)에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단할 수 있고/거나; 루프 2 에피토프에 결합하고/거나; T20.6 에피토프에 결합하고/거나; "T20.6 유도체 (시스틴-노트 +4 아암)" 에피토프에 결합할 경우, 상기 스클레로스틴 결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 범주 내에 있다.
본 발명에 따른 항체는 인간 스클레로스틴에 대해 1 x 10-7M 이하, 1 x 10-8M 이하, 1 x 10-9M 이하, 1 x 10-10M 이하, 1 x 10-11M 이하 또는 1 x 10-12M 이하의 결합 친화도를 가질 수 있다.
결합제, 예컨대 항체 또는 결합 파트너의 친화도, 및 결합제 (예컨대, 항체)가 결합을 억제하는 정도는 당업자가 통상의 기술, 예를 들어 문헌 [Scatchard et al., Ann. KY. Acad. Sci. 51:660-672 (1949)]에 기술된 것 또는 표면 플라스몬 공명을 이용하여 결정할 수 있다. 표면 플라스몬 공명에 있어서, 표적 분자는 고체상에 고정되고 유동 세포를 따라 흐르는 이동상에서 리간드에 노출된다. 고정된 표적에 결합한 리간드가 발생할 경우, 국소적 반사 인덱스가 변화되어 SPR 각의 변화를 초래하고, 이는 반사된 빛의 강도 변화를 검출함으로써 실시간으로 모니터링될 수 있다. SPR 신호의 변화율을 분석하여 결합 반응의 연합상 및 해리상에 대한 명확한 속도 상수를 얻을 수 있다. 이들 값의 비율은 명확한 평형 상수 (친화도)이다 (예를 들어, 문헌 [Wolff et al, Cancer Res. 53:2560-65 (1993)] 참조).
본 발명에 따른 항체는 임의의 이뮤노글로불린 부류, 예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD 또는 IgA에 속할 수 있다. 이는 동물, 예를 들어, 조류 (예를 들어, 닭) 및 포유동물 (마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 다른 설치류, 소, 말, 양, 염소, 카멜, 인간 또는 다른 영장류가 포함되나, 이에 제한되지 않음)로부터 수득하거나 유래될 수 있다. 상기 항체는 내면화된 항체일 수 있다. 항체의 제조는 일반적으로 미국 특허 공개번호 제2004/0146888 A1호에 개시되어 있다.
특성화 검정
특정 Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D 및 항체 1-24 (Ab-1 내지 Ab-24) CDR을 신규 골격 및/또는 불변 영역 내로 조작하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 항체를 발생시키기 위한 상기 기술한 방법에서, 목적하는 항체 또는 결합제를 선택하기 위한 적절한 검정 (즉, 스클레로스틴에 대한 결합 친화도를 측정하기 위한 검정; 교차-차단 검정; 비아코어-기재 "인간 스클레로스틴 펩티드 에피토프 경쟁적 결합 검정"; MC3T3-E1 세포 기재 검정; 생체내 검정)을 이용할 수 있다.
에피토프 결합 검정
성숙한 형태의 인간 스클레로스틴은 시스틴-노트 구조를 갖는 190개의 아미노산 당단백질이다 (도 8 및 9). 시스틴-노트 구조에 추가로, 상기 단백질은 3개의 루프 (루프 1, 루프 2 및 루프 3으로 고안됨)를 갖는 것을 특징으로 한다. 인간 스클레로스틴을 단백질 분해에 적용시켜 단편을 제조한다. 요약하면, 트립신, aspN 및 lysC를 비롯한 상이한 프로테아제를 사용하여, 다양한 절단 부위 및 크기를 갖는 단편을 발생시킨다. 다양한 인간 스클레로스틴 펩티드의 서열 및 중량을 측정한다. 항체 보호 정도를 측정하여 클리핑 부위 차폐 및 펩티드 이동을 비롯한, 단백질분해에 대한 접근성의 효과를 결정한다. 마지막으로, 비아코어-기재 "인간 스클레로스틴 펩티드 에피토프 경쟁 검정"을 수행한다.
스클레로스틴을 트립신 절단에 노출시켜 도 13에 요약된 바와 같은 펩티드 단편 패턴을 생성시킨다. 상기 단편을 T19.2, T20, T20.6 및 T21-22로 지칭한다. 도 19B에 도식화한 바와 같이, T20.6 에피토프는 시스틴-노트 영역의 3개의 디술피드 결합에 의해 결합된 4개의 분리 펩티드 서열의 복합체이다. 상기 펩티드 중 2개는 2개의 디술피드 결합에 의해 결합된다. 다른 두개의 펩티드는 도식적으로 처음 두 개의 폴리펩티드를 양분하는 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 연결된다.
트립신 소화에 의해 발생된 T20.6 에피토프는 천연 폴리펩티드의 시스틴-노트 구조를 보유하고, 항체 Ab-C 및 Ab-D에 의해 인지된다. 에피토프 T20.6의 유도체는 서열 1로 지칭된 서열 위치에서 시스틴-노트 영역 및 아미노산 58-64, 73-81, 112-117 및 138-141로 이루어져 있다. 이러한 유도체 에피토프를 도 21에 나타내었다. 시스틴-노트 영역을 포함하는 에피토프는 T20.6 에피토프 (도 19B) 내에 존재하나 T20.6 유도체 에피토프 (도 21)에는 존재하지 않는 하나 이상의 아미노산을 가질 수 있다.
다른 에피토프-함유 영역은 인간 스클레로스틴의 루프 2 영역 (도 19A) 내에서 확인되고, 항체 Ab-A 및 Ab-B에 의해 인지된다. 루프 2 에피토프는 서열 1의 아미노산 86-111 (C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5, 서열 6)을 포함한다. 입체적으로 서열 1의 전장 스클레로스틴에 대하여, 루프 2-함유 구조는 한쪽 말단에서 위치 86 (C4)의 시스테인과 위치 144 (C8)의 시스테인 사이의 디술피드 결합, 및 다른 쪽 말단에서 위치 111 (C5)의 시스테인과 위치 57 (C1)의 시스테인 사이의 디술피드 결합으로 정의된다.
인간 스클레로스틴의 aspN 절단에 의해 발생된 펩티드를 도 12에 나타내었다. 상기 도면에서, 이들 펩티드를 AspN14.6, AspN18.6 및 AspN22.7-23.5로 지정하고, 본원에서는 각각 N14.6, N18.6 및 N22.7-23.5로도 지칭한다.
일군의 항체는 비아코어-기재 "인간 스클레로스틴 펩티드 에피토프 경쟁적 결합 검정"으로 입증되는, 특정 에피토프에 결합하는 구체적인 패턴을 보인다. 요약하면, 항체 상의 에피토프-결합 부위를 포화시킬 농도에서, 상기 항체를 시험할 에피토프와 함께 예비인큐베이션한다. 이어서, 상기 항체를 칩 표면에 결합된 스클레로스틴에 노출시킨다. 적절한 인큐베이션 및 세척 절차 후에, 경쟁적 결합 패턴이 성립된다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 스클레로스틴 분자에 결합된 예시적 항체 Ab-D를 칩의 표면에 부착시켰다. 항체 Ab-D를 스클레로스틴과 함께 예비인큐베이션하자, 칩 상의 스클레로스틴에 결합한 항체는 감소하여 0에 가까워졌다. 에피토프 T19.2로 이루어진 펩티드와 함께 예비인큐베이션하자, T19.2는 항체 결합에 대해 스클레로스틴과 경쟁하지 않았다. 그러나, T20, T20.6, T21-22 또는 N22.7-23.5로 지정한 에피토프 중 어느 하나와 함께 예비인큐베이션하자, 상기 칩 상의 스클레로스틴과 항체와의 결합 중 많은 부분이 파괴되었다. 반대로, 상기 항체를 T19.2, N14.6 또는 N18.6으로 지정된 에피토프 중 어느 하나와 함께 예비인큐베이션하자 스클레로스틴에 결합하는 항체의 능력이 파괴되지 않았다. 이러한 결합 프로파일 (도 17)을 갖는 두 번째 예시적 항체는 Ab-C이다.
그러므로, 항체 Ab-D는 예시이고, 에피토프 T20, T20.6, T21-22 및 N22.7-23.5에 결합하는 대표적인 일군의 항체이며, 스클레로스틴에 결합하는 항체를 차단하는 능력으로 측정시 에피토프 T19.2, N14.6 및 N18.6에 최소한으로 검출가능하게 결합한다. 이러한 결합 패턴 특성을 갖는 항체는 항체 분자 중 하나 이상의 영역에서 아미노산 서열을 공유할 수 있거나, 또는 그렇지 않다. 항체 유사도는 기능적으로, 예컨대 상기 기술한 각각의 에피토프와 함께 예비인큐베이션한 후에 스클레로스틴에 결합하는 능력으로 측정한다. 항체 Ab-D의 결합 패턴과 유사하거나 동일한 패턴을 보이는 항체가 본 발명에 포함된다. "~와 유사한"은, 예를 들어 항체가 각각의 폴리펩티드 T20, T20.6, T21-22 및 N22.7-23.5에 결합함으로써, 이러한 결합이 구체적으로, 달리 스클레로스틴 또는 스클레로스틴 펩티드와 함께 예비인큐베이션하지 않고 발생하는, 스클레로스틴에 결합하는 항체의 50％ 이상과 경쟁하는 것을 의미한다. 상기 항체는 또한 폴리펩티드 T19.2, N14.6 및 N18.6에 거의 결합하지 않거나 또는 검출가능한 정도로 결합해서, 스클레로스틴 또는 스클레로스틴 펩티드와 함께 예비인큐베이션하지 않고 발생하는 결합이 30％ 이하로 감소하도록 한다.
예를 들어, 특정 기전에 얽매이지 않고, 도 18의 항체 결합 패턴은 항체 Ab-D, 및 Ab-D 결합의 에피토프 결합 패턴을 갖는 다른 항체가 결합하는 에피토프 공간이 스클레로스틴의 시스틴-노트 영역을 포함하는 폴리펩티드로 이루어졌음을 시사한다.
따라서, 본원에 개시되고 도 19B에 언급한 바와 같이, 예시적인 T20.6 에피토프는 이들 분리 디술피드 결합을 통해 부착된 4개의 펩티드 사슬을 포함한다. 펩티드 사슬인 SAKPVTELVC3SGQC4GPAR (서열 3)은 디술피드 결합에 의해 C3에서 C7로 및 C4에서 C8로 펩티드 사슬 LVASC7KC8KRLTR (서열 5)에 부착된다. 펩티드 사슬인 DVSEYSC1RELHFTR (서열 2)은 디술피드 결합에 의해 C1에서 C5로 펩티드 사슬 WWRPSGPDFRC5IPDRYR (서열 4)에 부착된다. 서열 3 및 5의 폴리펩티드는 입체적 구축을 통해 서열 2 및 4의 폴리펩티드와 연결된 채로 남아있고, 이로써 도 19B에 도시한 바와 같이 C1-C5 결합은 C4-C8 및 C3-C7 결합 판을 교차하고, 이들 사이에 위치한다.
본원에 개시된 바와 같이, 예시적인 T20.6 유도체 에피토프는 3개의 개별적인 디술피드 결합을 통해 부착된 4개의 펩티드 쇄를 포함한다 (도 21 참조). 펩티드 쇄 SAKPVTELVC3SGQC4 (서열 70)는 디술피드 결합 (C3-C7 결합 및 C4-C8 결합)에 의해 펩티드 쇄 LVASC7KC8 (서열 71)에 부착된다. 펩티드 쇄 C1RELHFTR (서열 72)은 디술피드 결합 (C1-C5 결합)에 의해 펩티드 쇄 C5IPDRYR (서열 73)에 부착된다. 서열 70 및 71의 폴리펩티드들은 입체 구조물 (도 21에 예시된 바와 같이, C1-C5 결합은 C4-C8 결합 및 C3-C7 결합으로 이루어진 면을 가로질러 그 사이에 위치함)을 통해 서열 72 및 73의 폴리펩티드들과의 결합을 유지한다.
항체 Ab-A는 예시적인 항체이며, 항체 Ab-C 및 Ab-D의 경우에서 얻어진 것과 구별되는, 인간 스클레로스틴 펩티드로의 특징적인 결합 패턴을 갖는 또다른 항체 군을 대표하는 항체이다. Ab-A 및 Ab-A가 대표하는 항체 군은 N22.7-23.5 에피토프에 결합하고, 에피토프 T19.2, T20, T20.6, T21-22, N14.6 또는 N18.6과는, 스클레로스틴으로의 항체 결합을 차단하는 능력의 측정시에 최소한으로 검출가능한 결합을 형성한다 (도 15). 이러한 결합 프로파일을 갖는 또다른 예시적인 항체는 Ab-B이다 (도 16). 이러한 특징적인 결합 패턴을 갖는 항체들은 항체 분자의 하나 이상의 영역에서 아미노산 서열을 공유할 수 있다. 항체 유사성은 상기 기재된 각 에피토프와의 사전 인큐베이션 후에 스클레로스틴 결합 능력에 따라 기능적으로 결정된다. 본 발명은, 항체 Ab-A의 결합 패턴과 유사하거나 동일한 결합 패턴을 나타내는 항체들을 포함한다. "유사"란, 예를 들어 항체가 N22.7-23.5 폴리펩티드에 결합하고, 이때 이 결합이, 스클레로스틴 또는 스클레로스틴 펩티드와의 사전 인큐베이션이 없이 달리 생성되는 항체와 스클레로스틴의 결합에 비해 50％ 이상 특이적으로 우세한 경우를 의미한다. 또한, 상기 항체는 폴리펩티드 T19.2, T20, T20.6, T21-22, N14.6 및 N18.6으로의 검출가능한 결합을 거의 또는 전혀 나타내지 않고, 이에 따라 스클레로스틴 또는 스클레로스틴 펩티드와의 사전 인큐베이션이 없이 달리 생성되는 결합에 비해 30％ 이하 감소된 수준을 나타낸다.
예를 들어, 특정 메카니즘에 속박됨이 없이, 도 15의 항체 결합 패턴은, 항체 Ab-A 및 Ab-A의 에피토프 결합 패턴을 갖는 여타 항체가 결합하는 에피토프 공간이 스클레로스틴의 루프 2 영역을 포함하는 폴리펩티드로 구성되어 있음을 시사한다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같이, 루프 2 영역은 선형 펩티드로 기술될 수 있으나, 천연 디술피드 결합 구조가 유지된 스클레로스틴의 시스테인-매듭-함유 부분 또는 천연 스클레로스틴 내에 존재하는 경우에는 3차 구조를 획득한다 (도 19A 참조). 하기 실시예에서 논의된 바와 같이, 루프 2 에피토프의 선형 또는 3차 구조는 항체로의 결합에 영향을 미칠 수 있다. 루프 2 영역은 아미노산 서열 C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5 (서열 6)를 포함할 수 있다. "C4"는 서열 1을 기준으로 86-위치에 위치한 시스테인 잔기를 의미한다. "C5"는 서열 1을 기준으로 111-위치에 위치한 시스테인 잔기를 의미한다. 천연 스클레로스틴 단백질에서, C4는 디술피드 결합에 의해 144-위치의 시스테인 (C8)으로 연결되고, C5는 디술피드 결합에 의해 57-위치의 시스테인 (C1)으로 연결된다. 루프 2 영역으로부터 유래된 에피토프에는 CGPARLLPNAIGRGKWWRPS (서열 63); GPARLLPNAIGRGKWWRPSG (서열 64); PARLLPNAIGRGKWWRPSGP (서열 65); ARLLPNAIGRGKWWRPSGPD (서열 66); RLLPNAIGRGKWWRPSGPDF (서열 67); LLPNAIGRGKWWRPSGPDFR (서열 68); 및 LPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (서열 69)가 포함된다.
교차-차단 검정
본원에서 사용된 "교차-차단"이란 용어는, 소정의 항체 또는 다른 결합제가 그밖의 항체 또는 결합제와 스클레로스틴의 결합을 방해할 수 있음을 의미한다.
경쟁 결합 검정법을 이용하여, 소정의 항체 또는 다른 결합제가 또다른 항체 또는 결합제와 스클레로스틴의 결합을 방해하는 정도, 나아가 본 발명에 따른 교차-차단을 하는 것으로 판단될 수 있는지 여부를 측정할 수 있다. 특히 적합한 한 정량적 검정법에서는, 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 비아코어 기기가 이용된다. 적합한 또다른 정량적 교차-차단 검정법에서는, 항체 또는 다른 결합제가 스클레로스틴에 결합할 때 이들간의 경쟁 수준을 측정하는 ELISA-기반 방법이 이용된다.
비아코어 교차-차단 검정
항체 또는 다른 결합제가 본 발명에 따른 교차-차단을 하는지 또는 교차-차단을 할 수 있는지 여부를 결정하는 데 적합한 비아코어 검정이 개괄적으로 하기 기재되어 있다. 편의상, 2종의 항체가 언급되나, 본원에 기재된 모든 스클레로스틴 결합제에 대한 검정이 수행될 있음을 알 것이다. 비아코어 기기 (예를 들어, 비아코어 3000)는 제조사의 추천에 따라 작동시킨다.
따라서, 한 교차-차단 검정에서는, 표준 아민 커플링 화학을 이용하여 스클레로스틴을 CM5 비아코어 칩에 커플링시킴으로써 스클레로스틴-코팅 표면을 생성한다. 통상적으로, 200 내지 800개의 스클레로스틴 공명 단위가 칩에 결합될 것이다 (쉽게 측정가능한 수준의 결합이 얻어지지만, 사용되는 시험 시약의 농도에 따라 쉽게 포화될 수 있는 양임).
서로 교차-차단하는 능력을 평가할 2종의 항체 (A* 및 B*로 지칭됨)를 적합한 완충액 중에서 1:1의 결합 부위 몰비로 혼합하여 시험 혼합물을 생성한다. 결합 부위를 기준으로 한 농도 계산시, 항체의 분자량은 항체의 총 분자량을 항체 상의 스클레로스틴 결합 부위의 개수로 나눈 값으로 가정한다.
시험 혼합물 중 각 항체의 농도는 비아코어 칩에 포획된 스클레로스틴 분자 상에 존재하는 항체 결합 부위들을 쉽게 포화시키기에 매우 충분해야 한다. 혼합물 중 항체들의 몰 농도 (결합 부위 기준)는 서로 동일하며, 그 농도는 통상적으로 1.00 내지 1.5 μM (결합 부위 기준)이다.
또한, 항체 A* 및 항체 B*를 각각 단독으로 함유하는 개별 용액을 제조한다. 상기 항체 A* 용액 및 항체 B* 용액은 완충액 및 농도가 시험 혼합물과 동일해야 한다.
시험 혼합물을 스클레로스틴-코팅 비아코어 칩 위로 통과시키고, 총 결합 수준을 기록한다. 이후, 칩에 결합된 스클레로스틴을 손상시키지 않으면서 결합된 항체가 분리되도록 칩을 처리한다. 통상적으로, 상기 처리는 칩을 60초간 30 mM HCl로 처리함으로써 수행된다.
이후, 항체 A* 단독의 용액을 스클레로스틴-코팅 표면 위로 통과시키고, 결합 수준을 기록한다. 또다시, 칩에 결합된 스클레로스틴을 손상시키지 않으면서 결합된 모든 항체가 분리되도록 칩을 처리한다.
이후, 항체 B* 단독의 용액을 스클레로스틴-코팅 표면 위로 통과시키고, 결합 수준을 기록한다.
그 다음, 항체 A*과 항체 B*의 혼합물의 최대 이론적 결합 수준을 계산하되, 이 수준은 각 항체를 스클레로스틴 표면 위로 단독으로 통과시켰을 때 각각의 결합 수준들의 합이다. 실제 기록된 혼합물의 결합 수준이 상기 이론적 최대 수준보다 낮은 경우, 두 항체는 서로 교차-차단을 한 것이다.
따라서, 일반적으로, 상기 비아코어 교차-차단 검정법에 있어서, 본 발명에 따른 교차-차단성 항체 또는 다른 결합제는 검정 동안, 그리고 본 발명의 제2 항체 또는 다른 결합제의 존재 하에 기록된 결합 수준이 두 항체 또는 결합제들의 조합의 최대 이론적 결합 수준 (상기 정의된 바와 같음)의 80％ 내지 0.1％ (예를 들어, 80％ 내지 4％), 구체적으로는 75％ 내지 0.1％ (예를 들어, 75％ 내지 4％), 보다 구체적으로는 70％ 내지 0.1％ (예를 들어, 70％ 내지 4％)가 되도록 스클레로스틴에 결합한다.
상기 기재된 비아코어 검정법은 항체들 또는 다른 결합제들이 서로 본 발명에 따른 교차-차단을 하는지 여부를 결정하기 위해 이용되는 주요 검정법이다. 드문 경우지만, 특정 항체 또는 다른 결합제는 아민 화학을 통해 CM5 비아코어 칩에 커플링된 스클레로스틴에 결합하지 않을 수도 있다 (일반적으로, 이러한 경우는 스클레로스틴 상의 해당 결합 부위가 칩으로의 커플링에 의해 차폐되거나 파괴된 경우에 발생함). 이러한 경우, 태그가 부착된 형태의 스클레로스틴, 예를 들어 His-태그가 부착된 N-말단 스클레로스틴 (미국 미네소타주 미니애폴리스에 소재한 알앤디 시스템즈 (R＆D Systems); 2005 cat＃ 1406-ST-025)을 이용하여 교차-차단을 측정할 수 있다. 이러한 특정 방식에서는, 항-His 항체가 비아코어 칩에 커플링된 후에 His-태그가 부착된 스클레로스틴이 칩의 표면 위로 통과하여 항-His 항체에 의해 포획된다. 각 칩의 재생 사이클 후에 새로운 His-태그가 부착된 스클레로스틴이 항-His 항체-코팅 표면 상에 다시 로딩되는 것을 제외하고는, 상기 교차-차단 검정은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된다. His-태그가 부착된 N-말단 스클레로스틴을 사용하는 주어진 예 이외에도, His-태그가 부착된 C-말단 스클레로스틴이 대체적으로 사용될 수 있다. 또한, 이러한 교차-차단 검정에서는 당업계에 알려져 있는 여타 각종 태그 및 태그 결합 단백질 조합이 이용될 수 있다 (예를 들어, 항-HA 항체를 갖는 HA 태그; 항-FLAG 항체를 갖는 FLAG 태그; 스트렙타비딘을 갖는 비오틴 태그).
ELISA -기반 교차-차단 검정
항-스클레로스틴 항체 또는 다른 스클레로스틴 결합제가 본 발명에 따른 교차-차단을 하는지 또는 교차-차단을 할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 ELISA 검정법이 개괄적으로 하기 기재된다. 편의상, 2종의 항체 (Ab-X 및 Ab-Y)가 언급되나, 본원에 기재된 모든 스클레로스틴 결합제에 대한 검정이 수행될 있음을 알 것이다.
상기 검정의 일반 원리는 ELISA 플레이트의 웰 상에 코팅된 항-스클레로스틴 항체에 있다. 과잉량의 잠재적 교차-차단성 제2 항-스클레로스틴 항체를 용액 상태로 첨가한다 (즉, ELISA 플레이트에 결합되지 않음). 이후, 제한된 양의 스클레로스틴을 웰에 첨가한다. 코팅된 항체 및 용액 중의 항체는 제한된 수의 스클레로스틴 분자로의 결합을 위해 경쟁한다. 코팅된 항체에 결합하지 않은 스클레로스틴을 제거하면서 액상의 제2 항체, 및 액상의 제2 항체와 스클레로스틴 사이에서 형성된 모든 복합체를 제거하기 위해 플레이트를 세척한다. 이후, 적절한 스클레로스틴 검출 시약을 사용하여 결합된 스클레로스틴의 양을 측정한다. 코팅된 항체를 교차-차단할 수 있는 액상의 항체가 사용되는 경우, 코팅된 항체가 결합할 수 있는 스클레로스틴 분자의 수는 코팅된 항체가 액상의 제2 항체의 부재 하에 결합할 수 있는 스클레로스틴 분자의 수에 비해 감소될 수 있다.
상기 검정은 Ab-X 및 Ab-Y와 관련하여 아래에서 보다 상세하게 기술된다. Ab-X로서 고정화 항체가 선택된 경우, Ab-X를 ELISA 플레이트의 웰 상에 코팅한 후, 후속적으로 첨가되는 시약의 비-특이적 결합을 최소화하기 위해 플레이트를 적합한 차단 용액으로 차단한다. 이후, 웰 당 Ab-Y 스클레로스틴 결합 부위의 몰수가, 웰 당 ELISA 플레이트의 코팅 동안 사용된 Ab-X 스클레로스틴 결합 부위의 몰수보다 10배 이상 높도록 과잉량의 Ab-Y를 ELISA 플레이트에 첨가한다. 이후, 웰 당 첨가된 스클레로스틴의 몰수가, 각 웰의 코팅을 위해 사용된 Ab-X 스클레로스틴 결합 부위의 몰수보다 25배 이상 낮도록 스클레로스틴을 첨가한다. 적합한 기간의 인큐베이션 후, ELISA 플레이트를 세척하고, 스클레로스틴 검출 시약을 첨가하여, 코팅된 항-스클레로스틴 항체 (이 경우에는 Ab-X임)가 특이적으로 결합된 스클레로스틴의 양을 측정한다. 검정을 위한 배경 신호는 코팅된 항체 (이 경우에는 Ab-X임), 액상의 제2 항체 (이 경우에는 Ab-Y임), 스클레로스틴 완충액 단독 (즉, 스클레로스틴이 없음) 및 스클레로스틴 검출 시약을 함유하는 웰에서 얻어진 신호로서 정의된다. 검정을 위한 양성 대조 신호는 코팅된 항체 (이 경우에는 Ab-X임), 액상의 제2 항체 완충액 단독 (즉, 액상의 제2 항체가 없음), 스클레로스틴 및 스클레로스틴 검출 시약을 함유하는 웰에서 얻어진 신호로서 정의된다. ELISA 검정은 양성 대조 신호가 배경 신호의 6배 이상인 방식으로 수행될 필요가 있다.
어떤 항체를 코팅 항체로서 사용하는지, 그리고 어떤 항체를 제2의 (경쟁자) 항체로서 사용하는지 선택하는 것으로부터 발생하는 임의의 아티팩트 (예를 들어, 스클레로스틴에 대한 Ab-X의 친화도와 Ab-Y의 친화도가 유의하게 상이함)를 방지하기 위해, 교차-차단 검정은 다음과 같은 2가지 방식으로 수행될 필요가 있다:
1) 방식 1: Ab-X가, ELISA 플레이트 상에 코팅된 항체이고, Ab-Y가 액상의 경쟁자 항체인 경우; 및
2) 방식 2: Ab-Y가, ELISA 플레이트 상에 코팅된 항체이고, Ab-X가 액상의 경쟁자 항체인 경우.
방식 1 또는 2에 있어서, 액상의 항-스클레로스틴 항체의 사용으로 인해, 스클레로스틴 검출 신호 (즉, 코팅된 항체가 결합한 스클레로스틴의 양)가, 액상의 항-스클레로스틴 항체의 부재 하에 얻어진 스클레로스틴 검출 신호 (즉, 양성 대조 웰)에 비해 60％ 내지 100％, 구체적으로는 70％ 내지 100％, 보다 구체적으로는 80％ 내지 100％ 감소될 수 있는 경우에 Ab-X 및 Ab-Y가 교차-차단을 하는 것으로 정의된다.
이와 같은 ELISA-기반 교차-차단 검정의 예는 실시예 7 ("ELISA-기반 교차-차단 검정")에서 찾아볼 수 있다.
세포-기반 중화 검정
시험관내 골 형성 모델로서, 배양액 중 골모세포계 세포 (1차 세포 또는 세포주)에 의한 무기질화가 이용된다. 무기질화는 1종 이상의 분화제에 의해 골모세포계 세포의 분화가 유도되는 것으로부터 출발하여 약 1 내지 6주가 소요된다. 전체적인 일련의 이벤트에는 세포 증식, 분화, 세포외 매트릭스 생성, 매트릭스 성숙 및 최종적으로 무기질 침착 (칼슘 포스페이트의 결정화 및/또는 침착을 의미함)이 포함된다. 본원에서는, 세포 증식 및 분화로부터 출발하여 무기질의 침착으로 종료되는 일련의 이벤트가 무기질화로 지칭된다. 칼슘 (무기질)의 측정값이 검정 결과이다.
MC3T3-E1 세포 (문헌 [Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J. Cell Biol. 96:191-198]) 및 고유 세포주의 서브클론은 분화제의 존재 하에 성장시, 배양액 중에서 무기질을 형성할 수 있다. 이러한 서브클론으로는 MC3T3-E1-BF (문헌 [Smith E, Redman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J. Biol. Chem. 275:19992-20001])가 포함된다. 고유 MC3T3-E1 세포 및 MC3T3-E1-BF 서브클론의 경우, 스클레로스틴은 무기질 침착까지를 비롯한 일련의 이벤트 중 하나 이상을 억제할 수 있다 (즉, 스클레로스틴은 무기질화를 억제함). 스클레로스틴의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항-스클레로스틴 항체는 스클레로스틴의 존재 하에서 배양액 중의 무기질 침착을 가능하게 하며, 이때 칼슘 포스페이트 (칼슘으로서 측정됨)가 침착된 양은 스클레로스틴 단독 (즉, 항체가 없음)의 처리 군에서 측정된 칼슘의 양에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 많다. 도 22, 23 및 24에 제시된 세포-기반 무기질 침착 검정 실험에서 사용되는 항체는 약 145 Kd의 분자량을 갖고, 항체 분자 당 2개의 스클레로스틴 결합 부위를 갖는다.
특정 항-스클레로스틴 항체 또는 항-스클레로스틴 결합제가 스클레로스틴을 중화시킬 수 있는지 여부 (즉, 스클레로스틴 중화 항체 또는 그의 유도체, 또는 스클레로스틴 중화 결합제인지 여부)를 결정하기 위한 목적으로 상기 검정을 수행하는 경우, 검정에서 사용된 스클레로스틴의 양은, 스클레로스틴 단독의 처리 군에서 측정된 칼슘 포스페이트 (칼슘으로서 측정됨)의 침착 수준이 스클레로스틴 비-처리 군에 비해 70％ 이상 (통계적으로 유의한 수준) 높은 최소량일 필요가 있다. 항-스클레로스틴 중화 항체 또는 항-스클레로스틴 중화 결합제는, 칼슘 포스페이트 (칼슘으로서 측정됨)의 침착 수준이 스클레로스틴 단독 (즉, 항체 및 결합제가 없음)의 처리 군에 비해 통계적으로 유의하게 높은 항-스클레로스틴 중화 항체 또는 항-스클레로스틴 중화 결합제로서 정의된다. 항-스클레로스틴 항체 또는 항-스클레로스틴 결합제가 중화 항체인지 여부를 결정하기 위해서는, 검정에서 사용된 항-스클레로스틴 항체 또는 항-스클레로스틴 결합제의 양이, 웰 당 스클레로스틴 결합 부위의 몰수가 웰 당 스클레로스틴의 몰수에 비해 과잉으로 존재하는 양일 필요가 있다. 요구될 수 있는 과잉 수준은 항체의 효력에 따라 24, 18, 12, 6, 3 또는 1.5배일 수 있고, 당업자는 둘 이상의 결합제 농도를 시험하는 정형적인 (routine) 실시에 대해 친숙하다. 예를 들어, 효력이 높은 항-스클레로스틴 중화 항체 또는 항-스클레로스틴 중화 결합제는, 웰 당 스클레로스틴 결합 부위의 몰수가 웰 당 스클레로스틴의 몰수에 비해 심지어 6배 미만의 과잉 수준으로 존재하는 경우에도 스클레로스틴을 중화시킬 수 있을 것이다. 효력이 낮은 항-스클레로스틴 중화 항체 또는 항-스클레로스틴 중화 결합제는 12, 18 또는 24배의 과잉 수준에서만 클레로스틴을 중화시킬 수 있을 것이다. 최대 범위의 효력을 갖는 스클레로스틴 결합제가 중화 스클레로스틴 결합제로서 적합하다. 예시적인 세포-기반 무기질 침착 검정은 실시예 8에 상세하게 기재되어 있다.
인간 스클레로스틴을 중화시킬 수 있는 항-스클레로스틴 항체 및 그의 유도체, 및 인간 스클레로스틴을 중화시킬 수 있는 스클레로스틴 결합제는, 골 형성의 저하, 골 무기질 밀도의 저하, 골 무기질 함량의 저하, 골 질량의 저하, 골 질의 저하 및 골 강도의 저하 중 하나 이상으로 인한 인간 증상/장애, 또는 골 형성의 저하, 골 무기질 밀도의 저하, 골 무기질 함량의 저하, 골 질량의 저하, 골 질의 저하 및 골 강도의 저하 중 하나 이상과 관련된 인간 증상/장애, 또는 골 형성의 저하, 골 무기질 밀도의 저하, 골 무기질 함량의 저하, 골 질량의 저하, 골 질의 저하 및 골 강도의 저하 중 하나 이상을 유발하는 인간 증상/장애의 치료에 있어서 유용할 수 있다.
생체내 중화 검정
새로운 골 형성의 자극과 관련된 각종 파라미터의 증가, 또는 새로운 골 형성으로 인한 각종 파라미터의 증가는, 스클레로스틴을 중화시킬 수 있고 이에 따라 새로운 골 형성의 자극을 일으킬 수 있는 결합제를 식별하기 위한 생체내 스클레로스틴 결합제 시험의 결과로서 측정될 수 있다. 이러한 파라미터로는 각종 혈청 동화작용 마커 [예를 들어, 오스테오칼신, P1NP (1형 프로콜라겐의 n-말단 프로펩티드)], 골 형성의 골 조직형태계측 마커 (예를 들어, 골모세포 표면/골 표면; 골 형성 속도/골 표면; 골주 두께), 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량, 골 질량, 골 질 및 골 강도가 포함된다. 스클레로스틴 중화 결합제는, 새로운 골 형성의 자극과 관련된 임의의 파라미터, 또는 새로운 골 형성으로 인한 임의의 파라미터가 비히클-처리 동물의 경우에 비해 통계적으로 유의하게 증가되는 결합제로서 정의된다. 이러한 생체내 시험은 임의의 적합한 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 원숭이)에서 수행될 수 있다. 상기 생체내 시험의 예는 실시예 5 ("항-스클레로스틴 모노클로날 항체의 생체내 시험")에서 찾아볼 수 있다.
스클레로스틴의 아미노산 서열이 포유동물 종을 통틀어 100％ 동일하지는 않으나 (예를 들어, 마우스 스클레로스틴은 인간 스클레로스틴과 100％ 동일하지는 않음), 당업자는 생체내에서 특정 종 (예를 들어, 마우스)의 스클레로스틴을 중화시킬 수 있으면서 시험관내에서 인간 스클레로스틴에 결합할 수 있는 스클레로스틴 결합제가 생체내에서 인간 스클레로스틴을 중화시킬 수 있는 가능성이 높다는 점을 알 것이다. 따라서, 이러한 인간 스클레로스틴 결합제 (예를 들어, 항-인간 스클레로스틴 항체)는 골 형성의 저하, 골 무기질 밀도의 저하, 골 무기질 함량의 저하, 골 질량의 저하, 골 질의 저하 및 골 강도의 저하 중 하나 이상으로 인한 인간 증상/장애, 또는 골 형성의 저하, 골 무기질 밀도의 저하, 골 무기질 함량의 저하, 골 질량의 저하, 골 질의 저하 및 골 강도의 저하 중 하나 이상과 관련된 인간 증상/장애, 또는 골 형성의 저하, 골 무기질 밀도의 저하, 골 무기질 함량의 저하, 골 질량의 저하, 골 질의 저하 및 골 강도의 저하 중 하나 이상을 유발하는 인간 증상/장애의 치료에 있어서 유용할 수 있다. 마우스 스클레로스틴 유전자를 삭제하고 그 위치에 인간 스클레로스틴 유전자를 삽입하기 위해 동종 재조합이 이용된 마우스 (즉, 인간 스클레로스틴 유전자 녹-인 마우스 또는 인간 SOST 녹-인 마우스)는 또다른 생체내 시스템의 일례이다.
본 발명은, 예를 들어 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D 및 Ab-1 내지 Ab-24와 인간 스클레로스틴의 결합을 교차-차단하는 상기 기재된 결합제들 중 하나를 제약상 허용되거나 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물 및 치료 방법은 동시 계류중인 미국 출원 일련 번호 제10/868,497호 (2004년 6월 16일자로 출원되었으며, 미국 출원 일련 번호 제60/478,977호를 우선권으로 주장함)에 개시되어 있고, 상기 두 출원은 본원에 참고문헌으로 포함된다.
각종 치료 요법 (예를 들어, 피하, 경구, 비경구, 정맥내, 비내 및 근육내 투여 및 제제화 포함) 중에서, 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하기 위해 개발된 적합한 투여 및 치료 요법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이들의 일부는 일반적인 예시의 목적으로 아래에서 간략하게 논의된다.
특정 용도에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 경구 투여를 통해 동물에게 전달될 수 있다. 이와 같이, 상기 조성물은 불활성 희석제 또는 동화성 (assimilable) 식용 담체와 함께 제제화될 수 있거나, 또는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐 중에 봉입될 수 있거나, 또는 정제로 압축될 수 있거나, 또는 식품과 함께 직접 복용될 수 있다.
특정 상황에서는, 본원에 개시된 제약 조성물을 피하, 비경구, 정맥내, 근육내 또는 심지어 복강내로 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이들의 일부가 예를 들어, US 5,543,158; US 5,641,515 및 US 5,399,363에 보다 상세하게 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 유리 염기 또는 약리학상 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은, 계면활성제, 예를 들어 히드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물 중에서 제조될 수 있다. 또한, 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물, 및 오일 중에서 분산액을 제조할 수 있다. 통상적인 저장 및 사용 조건의 경우, 이들 제제는 일반적으로 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유할 것이다.
주사용으로 적합한 예시적인 제약 형태로는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말 (예를 들어, US 5,466,468 참조)이 포함된다. 모든 경우에서, 상기 제약 형태는 멸균 상태여야 하며, 주사가 용이한 정도의 유체 상태이어야 한다. 상기 제약 형태는 제조 및 저장 조건에서 안정해야 하고, 미생물 (예를 들어, 박테리아 및 진균류)의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 담체는 용매 또는 분산 매질 (예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일 함유)일 수 있다. 예를 들어, 코팅 (예를 들어, 레시틴)의 사용, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및/또는 계면활성제의 사용을 통해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 각종 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 촉진될 수 있다. 많은 경우에서, 제약 형태가 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 흡수 지연은 조성물 중에서 흡수 지연 물질 (예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)을 사용함으로써 달성될 수 있다.
한 실시양태에서, 수용액의 비경구 투여의 경우, 상기 용액은 필요한 경우, 적합하게 완충되어야 하고, 우선 액체 희석제가 충분한 염수 또는 글루코스에 의해 등장성이 되어야 한다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 당업자는 본 발명에 비추어 사용될 수 있는 멸균 수성 매질을 알 것이다. 예를 들어, 1회의 투여량은 1 mL의 등장성 NaCl 용액에 용해되어, 1000 mL의 피하주사액 (hypodermoclysis fluid)에 첨가되거나 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., pp. 1035-1038, 1570-1580] 참조). 물론, 치료할 대상체의 상태에 따라 투여량이 어느 정도 달라질 것이다. 또한, 인간 투여의 경우, 미국 FDA 생물제제 표준 연구소가 요구하는 멸균성, 발열원성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족시키는 것이 물론 바람직할 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제조될 수 있다. 제약상 허용되는 염의 예로는 산 부가염 (단백질의 유리 아미노 기에 의해 형성됨)이 포함되며, 이들은 무기 산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 유기 산, 예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등에 의해 형성된다. 또한, 유리 카르복실 기와의 염은 무기 염기, 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철, 및 유기 염기, 예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도될 수 있다. 중성 또는 염 형태로 제조된 용액은 그 투여용 제제의 경우와 부합하는 방식으로 치료상 유효한 양으로 투여될 것이다.
담체는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 추가로 포함할 수 있다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제를 사용하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 치료용 조성물에서 사용되는 것이 고려된다 (활성 성분과 비상용성인 경우는 제외). 또한, 보충 활성 성분이 조성물에 혼입될 수 있다. "제약상 허용되는"이란 구절은, 분자 물질 또는 조성물이 인간에게 투여되었을 때 알레르기성 반응 또는 유사한 부적절 반응이 나타나지 않는 경우를 의미한다.
특정 실시양태에서는, 본 발명의 조성물을 적합한 숙주 세포/유기체에 투여하기 위해 리포좀, 나노캡슐, 마이크로입자, 지질 입자, 소낭 등이 사용된다. 특히, 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포좀, 소낭, 나노구체 또는 나노입자 등 중에 둘러싸여 전달되도록 제제화될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 조성물은 담체 비히클의 표면에 공유 결합되거나 공유 결합이 아닌 방식으로 결합될 수 있다.
일반적으로, 잠재적인 약물 담체로서의 리포좀 및 리포좀-유사 제제의 형성 및 사용은 당업자에게 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Lasic, Trends Biotechnol. 16(7):307-21, 1998]; [Takakura, Nippon Rinsho 56(3):691-95, 1998]; [Chandran et al., Indian J. Exp. Biol. 55(8): 801-09, 1997]; [Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 12(2-3):233-61, 1995]; US 5,567,434; US 5,552,157; US 5,565,213; US 5,738,868 및 US 5,795,587 참조 (이들 문헌은 각각 그 전문이 본원에 구체적으로 포함됨)). 리포좀을 사용하는 경우는 전신적 전달 후에 자가면역성 반응 또는 허용될 수 없는 독성과 관련이 있는 것으로 보이지 않는다. 특정 실시양태에서, 수성 매질에 분산되어 자발적으로 다중막 동심성 겹층 소낭 (multilamellar concentric bilayer vesicle) (다중막 소낭 (MLV)으로도 지칭됨)을 형성하는 인지질로부터 리포좀이 형성된다.
또한, 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 조성물의 제약상 허용되는 나노캡슐 제제를 제공한다. 일반적으로, 나노캡슐은 안정하고 재현가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12):1113-28, 1998] 참조). 세포내 중합체의 과부하로 인한 부작용을 방지하기 위해, 생체내에서 소화될 수 있는 중합체를 이용하여 약 0.1 ㎛ 크기의 초미세 입자를 설계할 수 있다. 이러한 입자는 예를 들어, 문헌 [Couvreur et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1):1-20, 1988]; [zur Muhlen et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2):149-55, 1998]; [Zambaux et al., J. Controlled Release 50(1-3):31-40, 1998]; 및 US 5,145,684에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 제약 조성물은, 제약 조성물의 사용에 관한 설명을 제공하는 패키징 재료와 함께 용기 내에 포함될 수 있다. 일반적으로, 이러한 설명에는 시약 농도 뿐만 아니라 특정 실시양태에서 제약 조성물의 재구성에 필요할 수 있는 부형제 성분 또는 희석제 (예를 들어, 물, 염수 또는 PBS)의 상대적인 양을 기술하는 명확한 표현이 포함될 것이다.
투여되는 양은 체중 1 kg 당 0.01 내지 100 mg의 범위일 수 있다. 물론, 투여량 및 투여 빈도는 치료할 증상의 특성 및 중증도, 목적하는 반응, 환자의 상태 등에 따라 달라질 것이며, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 통상적으로, 상기 조성물은 상기 명시된 바와 같이 다양한 기술에 의해 투여될 수 있다.
골 무기질 함량 및/또는 골 무기질 밀도의 증가 수준은, X선의 사용 (예를 들어, 이중 에너지 X선 흡수측정법 (Dual Energy X-ray Absorptometry; "DEXA")을 통해, 또는 1) 골 형성 및/또는 골모세포 활성의 마커, 예를 들어 골모세포 특이적 알칼리성 포스파타제, 오스테오칼신, 1형 프로콜라겐 C' 프로펩티드 (PICP), 전 알칼리성 포스파타제 (문헌 [Comier, Curr. Opin. in Rheu. 7:243(1995)] 참조) 및 혈청 프로콜라겐 1 N-말단 프로펩티드 (P1NP) (이에 제한되지는 않음) 및/또는 2) 골 재흡수 및/또는 골모세포 활성의 마커, 예를 들어 피리디놀린, 데옥시피리디놀린, N-텔로펩티드, 요 (urinary) 히드록시프롤린, 혈장 타르트레이트-내성 산 포스파타제, 및 갈락토실 히드록시라이신; (상기 코미어 (Comier)의 문헌 참조), 혈청 TRAP 5b (타르트네이트-내성 산 포스파타제 동형체 (isoform) 5b) 및 혈청 가교된 C-텔로펩티드 (sCTXI) (이에 제한되지는 않음)의 측정을 통한 추정에 의해 직접적으로 측정될 수 있다. 또한, 골 질량은 체중으로부터 계산되거나 여타 방법에 의해 계산될 수 있다 (문헌 [Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res. 5:177-181, 1984] 참조). 예를 들어, 골다공증 및 골감소증과 같은 인간 질환의 증상과 유사한 골 손실, 골 재흡수, 골 형성, 골 강도 또는 골 무기질 침착의 파라미터들에 대한 본 발명의 조성물 및 방법의 효과를 시험하기 위해 동물 및 특정 동물 모델이 이용된다. 이러한 모델의 예로는 난소-절제된 래트 모델 (문헌 [Kalu, D.N., The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss. Bone and Mineral 15:175-192 (1991)]; [Frost, H.M. and Jee, W.S.S. On the rat model of human osteopenias and osteoporosis. Bone and Mineral 18:227-236 (1992)]; 및 [Jee, W.S.S. and Yao, W., Overview: animal models of osteopnia and osteoporosis. J. Musculoskel. Neuron. Interact. 1:193-207 (2001)])이 포함된다.
본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있는 구체적인 증상으로는, 골의 성장 또는 발생이 비정상적인 이형성증 (dysplasia), 및 골감소증, 골다공증 및 골 손실의 각종 원인이 포함된다. 이러한 증상의 대표적인 예로는 연골무형성증, 쇄골 두개골 이골증, 연골종증, 섬유상 이형성증, 고쉐(Gaucher) 질환, 저포스페이트혈성 구루병, 마르판(Marfan) 증후군, 다발성 유전성 외골증, 신경섬유종증, 불완전골생성증, 골화석증, 골반문증, 경화성 병변, 가관절증, 및 화농성 골수염, 치주 질환, 항간질성 약물-유발 골 손실, 원발성 및 속발성 부갑상선 기능항진, 가족성 부갑상선 기능항진 증후군, 체중 감소-유발 골 손실, 남성 골다공증, 폐경후 골 손실, 골관절염, 신성 골이영양증, 침윤성 골 장애, 경구 골 손실, 턱의 골괴사, 연소성 파제트(Paget) 질환, 유선상 과골증, 대사성 골 질환, 비만세포증, 겸상적혈구 빈혈/질환, 장기 이식-관련 골 손실, 신장 이식-관련 골 손실, 전신성 홍반성 루푸스, 강직성 척추염, 간질, 연소성 관절염, 지중해빈혈, 점액다당류증, 파브리(Fabry) 질환, 터너(Turner) 증후군, 다운(Down) 증후군, 클라인펠터(Klinefelter) 증후군, 나병, 페르테스(Perthes) 질환, 청년기 특발성 척주측만증, 영아 발병성 다기관 염증성 질환, 윈체스터(Winchester) 증후군, 멘케스(Menkes) 질환, 윌슨(Wilson) 질환, 허혈성 골 질환 (예, 레그-칼베-페르테스(Legg-Calve-Perthes) 질환, 국부 이동성 골다공증), 빈혈 상태, 스테로이드에 의해 유발된 증상, 글루코코르티코이드-유발 골 손실, 헤파린-유발 골 손실, 골수 장애, 괴혈병, 영양실조, 칼슘 결핍, 특발성 골감소증 또는 골다공증, 선천성 골감소증 또는 골다공증, 알콜 중독, 만성 간 질환, 폐경후 상태, 만성 염증성 증상, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 염증성 대장염, 크론(Crohn) 질환, 희발월경, 무월경, 임신, 당뇨병, 갑상선 기능항진, 갑상선 장애, 부갑상선 장애, 쿠싱(Cushing) 질환, 말단비대증, 성선기능저하증, 부동화 또는 무위(disuse), 반사 교감신경 이상 증후군, 국부 골다공증, 골연화증, 인공 관절과 관련된 골 손실, HIV-관련 골 손실, 성장 호르몬의 손실과 관련된 골 손실, 낭성 섬유증과 관련된 골 손실, 섬유상 이형성증, 화학요법-관련 골 손실, 종양-유발 골 손실, 암-관련 골 손실, 호르몬 절제 골 손실, 다발성 골수종, 약물-유발 골 손실, 신경성 거식증, 질환-관련 안면골 손실, 질환-관련 머리뼈(cranial bone) 손실, 질환-관련 악골 손실, 질환-관련 두개골(skull bone) 손실, 우주 여행과 관련된 골 손실이 포함된다. 추가적인 증상으로는 노화와 관련된 골 손실, 예를 들어 노화와 관련된 안면골 손실, 노화와 관련된 머리뼈 손실, 노화와 관련된 악골 손실, 및 노화와 관련된 두개골 손실이 포함된다.
또한, 본 발명의 조성물은 정형외과 시술, 치과 시술, 이식 수술, 관절 대체, 골 이식, 골 미용 수술 및 골 복구, 예를 들어 골절 치유, 불유합 치유, 지연 유합 치유 및 안면 재건술의 결과를 개선하는 데 유용할 수 있다. 시술, 대체, 이식, 수술 또는 복구 동안에, 또는 그 전후에 1종 이상의 조성물이 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 1종 이상의 본 발명에 따른 항-스클레로스틴 결합제를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 결합제는 항체일 수 있다. 또한, 상기 키트는 다음 중 하나 이상을 임의로 포함할 수 있다:
(1) 스크리닝, 진단, 예후, 치료 모니터링 또는 이들 용도의 임의 조합을 위해 1종 이상의 결합제(들)의 사용 설명서;
(2) 항-스클레로스틴 결합제(들)에 대한 표지된 결합 파트너;
(3) 항-스클레로스틴 결합제(들)가 고정화된 고체상 (예를 들어, 시약 스트립); 및
(4) 스크리닝, 진단, 예후, 치료 모니터링 또는 이들 용도의 임의 조합에 대한 규정 승인을 명시하는 라벨 또는 삽입물.
결합제(들)에 대한 표지된 결합 파트너가 없는 경우, 결합제(들) 자체가 1종 이상의 검출가능한 마커(들), 예를 들어 화학발광 잔기, 효소 잔기, 형광 잔기 또는 방사성 잔기로 표지될 수 있다.
하기 실시예는 제한이 아닌 예시를 목적으로 한다.
[실시예]
실시예 1
스클레로스틴의 재조합 발현
재조합 인간 스클레로스틴/SOST는 알앤디 시스템즈 (미국 미네소타주 미니애폴리스; 2006 cat＃ 1406-ST-025)로부터 구입할 수 있다. 재조합 마우스 스클레로스틴/SOST도 알앤디 시스템즈 (미국 미네소타주 미니애폴리스; 2006 cat＃ 1589-ST-025)로부터 구입할 수 있다.
별법으로, 상이한 종의 스클레로스틴이 무혈청 현탁액에 적합화된 293T 또는 293EBNA 세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. 형질감염은 500 mL 또는 1 L 배양액에서 수행될 수 있다. 다음 시약 및 재료는 기브코 (Gibco) BRL (현재 미국 캘리포니아주 칼스배드에 소재한 인비트로젠 (Invitrogen)임)로부터 구입할 수 있다. 카탈로그 번호는 괄호 안에 나열되어 있다: 무혈청 DMEM (21068-028); DMEM/F12 (3:1) (21068/11765); 1X 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물 (51500-056); 1X Pen Strep Glut (10378-016); 2 mM L-글루타민 (25030-081); 20 mM HEPES (15630-080); 0.01％ 플루로닉 (Pluronic) F68 (24040-032). 요약하면, 세포 접종물 (5.0-10.0×105 세포/mL × 배양액 부피)을 10분간 4 ℃에서 2,500 RPM으로 원심분리하여 조건화 배지를 분리하였다.
세포를 무혈청 DMEM에 재현탁시키고, 10분간 4 ℃에서 2,500 RPM으로 다시 원심분리하였다. 세척 용액을 흡인 제거한 후, 세포를 성장 배지 [DMEM/F12 (3:1) + 1X 인슐린-트랜스퍼린-셀레늄 보충물 + 1X Pen Strep Glut + 2 mM L-글루타민 + 20 mM HEPES + 0.01％ 플루로닉 F68]에 재현탁시켰다 (1 L 또는 3 L 스피너 플라스크 배양). 가습 인큐베이터 (37 ℃ 및 5％ CO2 유지) 내에 있는 자석 교반 플레이트 (125 RPM) 상에서 스피너 플라스크 배양을 유지시켰다. 50 mL 원뿔형 튜브 중에서, 포유동물 발현 플라스미드 DNA (예를 들어, pcDNA3.1, pCEP4, 미국 캘리포니아주 칼스배드에 소재한 인비트로젠 라이프 테크놀로지스 (Invitrogen Life Technologies) [스클레로스틴의 완전한 코딩 영역 (및 정지 코돈)과 함께 코작 (Kozak) 공통 서열 (예를 들어, CCACC) (출발 부위 ATG의 5' 방향) 함유] 및 형질감염 시약의 복합체를 형성하였다.
DNA-형질감염 시약 복합체는 무혈청 DMEM 또는 OPTI-MEM 중에서 최종 배양액 부피의 5 내지 10％로 제조될 수 있다. 이러한 목적으로 사용될 수 있는 형질감염 시약으로는 엑스-트림젠 (X-tremeGene) RO-1539 (미국 인디애나주 인디애나폴리스에 소재한 로쉐 어플라이드 사이언스 (Roche Applied Science)), 푸젠6 (FuGene6) (미국 인디애나주 인디애나폴리스에 소재한 로쉐 어플라이드 사이언스), 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 (미국 캘리포니아주 칼스배드에 소재한 인비트로젠) 및 293펙틴 (293fectin) (미국 캘리포니아주 칼스배드에 소재한 인비트로젠)이 포함된다. 우선, 1 내지 5 ㎍의 플라스미드 DNA (배양액 1 mL 당)를 무혈청 DMEM에 첨가한 후, 1 내지 5 ㎕의 형질감염 시약 (배양액 1 mL 당)을 첨가하였다. 복합체는 약 10 내지 30분간 실온에서 인큐베이션된 후에 스피너 플라스크의 세포에 첨가될 수 있었다. 형질감염/발현은 4 내지 7일간 수행될 수 있었고, 이후에 조건화 배지 (CM)를 60분간 4 ℃에서 원심분리 (4,000 RPM)에 의해 수거하였다.
실시예 2
재조합 스클레로스틴의 정제
포유동물 숙주 세포로부터 재조합 스클레로스틴을 다음과 같이 정제하였다. 모든 정제 공정은 실온에서 수행하였다. 뮤린 (murine) 및 인간 스클레로스틴을 비롯한 각종 스클레로스틴을 정제하기 위한 정제 계획을 수행하였다. 상기 정제 계획에서는 친화도 크로마토그래피에 이어 양이온 교환 크로마토그래피가 이용되었다.
헤파린 크로마토그래피
포유동물 숙주 세포 조건화 배지 (CM)를 베크만 (Beckman) J6-M1 원심분리기에 의해 원심분리하여 (1시간, 4 ℃, 4000 rpm) 세포 파편을 분리하였다. 이후, CM 상층액을 멸균 0.2 ㎛ 여과기를 통해 여과하였다. (이때, 멸균 여과된 CM은 정제 단계전까지 임의로 냉동 저장될 수 있다.) CM이 냉동된 경우, 이를 다음과 같은 온도 또는 이들을 조합한 온도에서 해동시켰다: 4 ℃, 실온 또는 온수. 해동 후, CM을 멸균 0.2 ㎛ 여과기를 통해 여과하고, 임의로 분자량 10 kD의 컷-오프 막을 이용한 접촉 유동 한외여과 (tangential flow ultrafiltration; TFF)에 의해 농축하였다. CM 농축물을 멸균 0.2 ㎛ 여과기를 통해 여과하고, PBS 중에서 평형화된 헤파린 고성능 (헤파린 HP) 컬럼 [지이 헬스케어 (GE Healthcare; 이전 회사명: 아머샴 바이오사이언시스 (Amersham Biosciences))] 상에 로딩하였다. 별법으로, 여과된 CM 상층액을, PBS 중에서 평형화된 헤파린 HP 컬럼 상에 직접 로딩할 수 있다.
로딩 후, 흘러나온 배출액의 280 nm에서의 흡광도가 기준값 (즉, CM 상층액 로딩 전에 측정한 흡광도)으로 복귀될 때까지 헤파린 HP 컬럼을 PBS로 세척하였다. 이후, 선형 구배 (150 mM → 2 M 염화나트륨 (PBS 중))를 이용하여 컬럼으로부터 스클레로스틴을 용출시켰다. 용출액의 280 nm에서의 흡광도를 모니터링하고, 단백질-함유 분획을 수집하였다. 이후, 분획을 코마시 (Coomassie)-염색 SDS-PAGE에 의해 분석하여, 글리코실화 스클레로스틴의 크기로 이동하는 폴리펩티드를 함유하는 분획을 식별하였다. 컬럼으로부터의 적절한 분획들을 합하여 헤파린 HP 풀을 생성하였다.
양이온 교환 크로마토그래피
헤파린 HP 컬럼으로부터 용출된 스클레로스틴을 SP 고성능 (SPHP) 크로마토그래피 매질을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피 (지이 헬스케어; 이전 회사명: 아머샴 바이오사이언시스)에 의해 추가로 정제하였다. 10,000 MWCO 막 (피어스 (Pierce)의 슬라이드-어-라이저 (Slide-A-Lyzer))을 이용한 투석에 의해 헤파린 HP 풀을 PBS로 완충 교환하였다. 이후, 투석된 헤파린 HP 풀을, PBS 중에서 평형화된 SPHP 컬럼 상에 로딩하였다. 로딩 후, 흘러나온 배출액의 280 nm에서의 흡광도가 기준값으로 복귀될 때까지 헤파린 HP 컬럼을 PBS로 세척하였다. 이후, 선형 구배 (150 mM → 1 M 염화나트륨 (PBS 중))를 이용하여 SPHP 컬럼으로부터 스클레로스틴을 용출시켰다. 용출액의 280 nm에서의 흡광도를 모니터링하고, 용출된 스클레로스틴을 분획으로 수집하였다. 이후, 분획을 코마시-염색 SDS-PAGE에 의해 분석하여, 글리코실화 스클레로스틴의 크기로 이동하는 폴리펩티드를 함유하는 분획을 식별하였다. 컬럼으로부터의 적절한 분획들을 합하여 SPHP 풀을 생성하였다.
제제화
정제 후, 10,000 MWCO 막 (피어스의 슬라이드-어-라이저)을 이용한 투석에 의해 헤파린 HP 풀을 PBS 중에서 제제화시켰다. 스클레로스틴의 농축이 필요한 경우, 원심분리 장치 (아미콘 센트리콘 (Centricon) 또는 센트리프렙 (Centriprep)) 및 10,000 MWCO 막을 이용하였다. 제제화 후, 스클레로스틴을 멸균 0.2 ㎛ 여과기를 통해 여과하고, 40 ℃에서 저장하거나 냉동시켰다.
실시예 3
펩티드 결합 ELISA
래트 스클레로스틴의 공지된 아미노산 서열 (서열 98)을 기초로 하여 일련의 중첩 펩티드 (각 펩티드의 길이: 약 20-25개의 아미노산)를 합성하였다. 모든 펩티드는 감소된 시스테인 잔기를 함유하도록 설계되었고, 추가의 시스테인이 각 펩티드의 C-말단에 포함되었다 (아직까지는 서열 중에 시스테인이 함유되지 않음). 이로써, 펩티드가 공유 커플링에 의해 분석용 플레이트에 결합할 수 있었다 (시판중인 술프히드릴 결합 플레이트 (코스타 (Costar)) 사용, 농도: 1 ㎍/mL, 포스페이트 완충 염수 (PBS: pH 6.5, 1 mM EDTA 함유) 중). 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, PBS (0.5％ 트윈 (Tween) 20 함유)로 3회 세척하였다. 플레이트를 30분간 실온에서 PBS 용액 (0.5％ 피쉬 스킨 젤라틴 (시그마 (Sigma)) 함유)과 함께 인큐베이션함으로써 차단시킨 후, 0.5％ 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다.
시험할 항체를 PBS (0.5％ 피쉬 스킨 젤라틴 함유) 중에 1 ㎍/mL로 희석시키고, 1시간 동안 실온에서 펩티드-코팅 플레이트와 함께 인큐베이션하였다. 과잉의 항체를 PBS (0.5％ 트윈 20 함유)로 3회 세척하여 제거하였다. 이후, 호스래디쉬 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase) (0.5％ 트윈 20을 함유하는 PBS 중에 적절하게 희석됨)에 컨쥬게이션되고 해당 항체에 결합할 수 있는 적절한 제2 항체와 함께 플레이트를 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 3회 세척하였다 (1회: 0.5％ 트윈 20을 함유하는 PBS, 2회: PBS). 최종적으로, 플레이트를 5분간 실온에서 호스래디쉬 퍼옥시다제 발색성 기질 (TMB-Stable Stop, RDI)과 함께 인큐베이션하였고, 산으로 발색을 중지시키고, 플레이트의 광학 밀도를 450 nm에서 측정하였다.
재료
코스타의 술프히드릴 결합 플레이트 (VWR＃ 29442-278)
코팅 완충액: 1X PBS pH 6.5 + 1 mM EDTA
차단 완충액: 1X PBS + 0.5％ 피쉬 스킨 젤라틴 (CS의 PBS; 시그마＃ G7765의 FSG)
세척 완충액: 1X PBS + 0.5％ 트윈 20
래트 스클레로스틴 펩티드
항체 샘플: 일시적 Ab, 정제된 재조합 Ab, 토끼 혈청 등
적절한 제2 Ab: 염소-항-토끼/마우스-HRP (잭슨 이뮤노 리서치 (Jackson Immuno Research), 115-036-072)
TMB-Stable Stop (RDI＃ RDI-TMBSX-IL)
방법:
1. 플레이트를 1OO ㎕/웰의 래트 스클레로스틴 펩티드 (1X PBS pH 6.5 + 1 mM EDTA 중에 1 ㎍/mL로 희석됨)로 코팅하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. (플레이트는 개봉 후 30분 내에 사용되어야 한다.)
2. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하였다.
3. 플레이트를 200 ㎕/웰 차단 완충액으로 차단하였다. 플레이트를 30분간 실온에서 인큐베이션하였다.
4. (2)에 기재된 바와 같은 세척을 반복하였다.
5. 플레이트를 차단 완충액 중에 1 ㎍/mL로 희석된 샘플 50 ㎕/웰과 함께 인큐베이션하였다 [혈청 역가는 1:100에서 출발함; 일시적 재조합 Ab를 그대로 사용함; 정제된 재조합 Ab를 사용함] (모든 샘플을 2회 반복 수행함). 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
6. (2)에 기재된 바와 같이 플레이트를 세척하였다.
7. 플레이트를 차단 완충액 중에 1:1600으로 희석된 적절한 제2 항체 (HRP 표지됨) (50 ㎕/웰)와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
8. 플레이트를 1X 세척 완충액 및 2X PBS로 세척하였다.
9. 플레이트를 5분간 실온에서 TMB 50 ㎕/웰과 함께 인큐베이션하였다.
10. 50 ㎕/웰의 0.5 M HCl로 반응을 중지시켰다.
11. 450 nm 파장에서 플레이트를 판독하였다.
다음 펩티드 서열을 상기 기재된 바와 같이 스크리닝하였다:
QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP (서열 82)
TEIIPGLREYPEPPQELENN (서열 83)
PEPPQELENNQTMNRAENGG (서열 84)
ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (서열 85)
CRELHYTRFVTDGP (서열 86)
CRELHYTRFVTDGPSRSAKPVTELV (서열 87)
CRSAKPVTELVSSGQSGPRARLL (서열 88)
CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFR (서열 89)
RAQRVQLLCPGGAAPRSRKV (서열 90)
PGGAAPRSRKVRLVAS (서열 91)
KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ (서열 92)
IPDRYAQRVQLLSPGG (서열 93)
SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR (서열 94)
KGRKPRPRARGAKANQAELENAY (서열 95)
PNAIGRVKWWRPNGPDFR (서열 96)
KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (서열 97).
친화도가 높은 중화 항체 (Ab-19)가 2개의 중첩 펩티드 서열, 즉 PNAIGRVKWWRPNGPDFR (서열 96) 및 KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (서열 97)에 결합하였다.
상기 절차를 통해, 외견상의 선형 에피토프와 반응하는 항체에 대한 에피토프를 인식할 수 있다. 항체 결합 부위의 일부 또는 전부를 함유하는 펩티드는 항체에 결합할 것이며, 따라서 검출될 것이다.
실시예 4
인간 스클레로스틴 에피토프의 식별
스클레로스틴 구조
성숙 형태 (신호 펩티드는 제거됨)의 인간 스클레로스틴은 190개 아미노산의 단백질이다 (도 8). 도 9는 N-말단 암 (arm) (N-말단 Q → 시스테인1) 및 C-말단 암 (시스테인8 → 말단 Y)을 갖는 스클레로스틴의 일반 구조를 나타내는 모식도이다. 두 암 사이에는 시스테인-매듭 구조 및 3개의 루프 (루프 1, 루프 2 및 루프 3으로 지칭됨)가 샌드위치되어 있다. 스클레로스틴에서, 4개의 디술피드 결합은 서열 57-위치의 Cys1과 서열 111-위치의 Cys5의 결합 (C1-C5로 지칭됨), 서열 71-위치의 Cys2와 서열 125-위치의 Cys6의 결합 (C2-C6으로 지칭됨), 서열 82-위치의 Cys3과 서열 142-위치의 Cys7의 결합 (C3-C7로 지칭됨), 및 서열 86-위치의 Cys4와 서열 144-위치의 Cys8의 결합 (C4-C8로 지칭됨)이다. 8원 고리 구조는 C3-C7 및 C4-C8 디술피드 결합을 통해 형성된다. 이러한 고리 구조는 고리를 관통하는 C1-C5 디술피드 결합과 함께 통상적인 시스테인-매듭을 형성한다. 시스테인-매듭의 일부가 아닌 C2-C6은 2개의 거대 루프 구조, 서로 근접해 있는 루프 1 (잔기 57 → 잔기 82) 및 루프 3 (잔기 111 → 잔기 142)을 형성한다. 루프 2는 C4 (잔기 86) → C5 (잔기 111)이다.
실험
항-스클레로스틴 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프의 특징 분석을 위한 일반적인 방법에는, 인간 스클레로스틴을 여러 프로테아제로 단편화시키는 단계, 각종 인간 스클레로스틴 펩티드의 서열을 결정하는 단계, 이들 펩티드를 단리하는 단계, 및 비아코어-기반 "인간 스클레로스틴 펩티드 에피토프 경쟁 결합 검정법"을 이용하여, 각 펩티드가 특정 모노클로날 항체에 결합하는 능력에 대해 시험하는 단계가 포함되었다. 생성된 데이타로부터 결합 에피토프의 위치를 결정할 수 있었다.
펩티드 소화물에 대하여 HPLC 펩티드 맵핑을 수행하였다 (개별 피크를 수집하고, 펩티드를 식별하고, 매트릭스-보조 레이저 이탈 질량 분광법 (MALDI-MS) 및 전자분무 이온화 LC-MS (ESI-LC-MS) 분석법 및/또는 N-말단 시퀀싱에 의해 맵핑함). 상기 연구에서의 모든 HPLC 분석은 역상 C8 컬럼 (2.1 mm i.d. × 15 cm 길이)을 이용하여 수행하였다. HPLC 펩티드 맵핑은 0.05％ 트리플루오로아세트산 (이동상 A) → 0.05％ 트리플루오로아세트산 중 90％ 아세토니트릴의 선형 구배를 이용하여 수행하였다. 컬럼은 50분에 걸쳐 0.2 mL/분의 유속으로 전개되었다.
트립신 및 AspN 엔도프로테이나제 소화
성숙 형태의 인간 스클레로스틴을 트립신 (아르기닌 및 라이신 처리 후에 소화됨) 또는 AspN으로 소화하였다. 약 200 ㎍의 스클레로스틴 (0.5 내지 1.0 mg/mL)을 20 시간 동안 37 ℃에서 8 ㎍의 트립신 또는 AspN과 함께 PBS (pH 7.2) 중에서 인큐베이션하였다.
트립신 소화
트립신 소화물을 HPLC 크로마토그래피에 의해 처리한 결과, 여러개의 주요 피크가 나타났다 (도 10A). 트립신 소화 후에 HPLC로부터 회수된 펩티드 피크에 대한 서열 분석을 수행하였다. 또한, 펩티드 소화물의 온라인 (on-line) ESI LC-MS 검정을 수행하여 HPLC에 의해 분리된 펩티드의 정확한 질량을 측정하였다. 이에 따라, 펩티드 피크에 존재하는 펩티드들을 식별하였다 (도 11). 도 13은 스클레로스틴 서열을 따라 정렬된 각종 펩티드 서열 (T19.2, T20, T20.6, T21-22)을 나타낸다. 각 T 뒤에 있는 숫자 (예를 들어, T19.2)는 체류 시간을 반영한다. T19.2는 C2-C6 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 펩티드 (루프 1로부터의 1개 펩티드 및 루프 3으로부터의 1개 펩티드)를 함유한다. T20은 시스테인-매듭 구조에 의해 서로 고정된 2개의 펩티드를 함유한다 (루프 1 및 3이 그대로 C2-C6 디술피드에 의해 서로 고정되고, 루프 2의 대부분은 포함되지 않음). T20.6은 시스테인-매듭 구조에 의해 서로 고정된 4개의 서열을 함유하나, 루프 1 및 3의 일부 (T19.2 부분)는 포함하지 않고, 루프 2의 대부분을 포함하지 않는다. T21-22는 T20과 거의 동일하나, 루프 2 영역에서 3개의 아미노산을 추가로 갖는다.
AspN 소화
AspN 소화물의 HPLC 크로마토그래피는 수개의 주 피크를 생성시켰다 (도 10B). 서열 분석은 HPLC에 의해 회수되는 펩티드 피크에 대해 수행되었다. 펩티드 소화물의 온-라인 ESI LC-MS 분석은 또한 HPLC에 의해 분리된 펩티드의 정확한 질량을 측정하여 수행하였다. 이와 같이, AspN 소화에 의한 펩티드 피크 내에 존재하는 펩티드를 규명하였다 (도 12). 도 14는 스클레로스틴 서열에 따른 다양한 펩티드 서열 (AspN14.6, AspN18.6, AspN22.7-23.5)의 정렬을 나타낸다. 각 AspN (예, AspN1 8.6)에 따른 숫자는 체류 시간을 반영한다. AspN14.6은 스클레로스틴의 N- 및 C-말단 아암 둘다로부터의 3개의 짧은 펩티드를 함유하는 한편, AspN18.6은 스클레로스틴의 N-말단 아암으로부터의 보다 큰 펩티드이다. AspN22.7-23.5은 104개 아미노산의 단일 펩티드 단편을 함유하며, 8개의 시스테인 (4개의 디술피드 결합) 모두, 시스틴-매듭, 및 루프 1, 2 및 3 모두를 포함한다.
에피토프를 특징규명하기 위한 전략은 각종 트립신, 및 AspN 생성 인간 스클레로스틴 펩티드를 사용하여, 펩티드가 각종 항체 (Ab-A, Ab-B, Ab-C 및 Ab-D)에 여전히 결합될 수 있는지의 여부를 결정하는 것이다. 구체적으로 이는 비아코어(Biacore)-기재 "인간 스클레로스틴 펩티드 에피토프 경쟁 결합 검정"으로 시험하였으며, 여기서 특정 모노클로날 항체의 비아코어 칩 상에 고정화된 인간 스클레로스틴으로의 결합은 각각의 각종 단리된 트립신 및 AspN HPLC 펩티드 분획물 유무로 결정하였다. 임의의 경쟁 펩티드 부재하에, 특정 모노클로날 항체는 칩 상에서 인간 스클레로스틴을 결합시키며, 공명 유닛 (RU) 반응을 생성시킬 수 있다. 특정 모노클로날 항체를 무손상 인간 스클레로스틴과 함께 용액 중에서 미리 인큐베이션한 다음 칩과의 결합을 시험하여 용액 중에서 Mab의 인간 스클레로스틴과의 결합이 Mab가 칩 상의 인간 스클레로스틴과 결합하는 것을 방지하므로 이러한 경쟁 검정의 일반적인 원리가 확인됨을 입증하였다.
이러한 일반적인 절차를 각 펩티드에 대해 개별적으로 반복하였다. 왕성한 RU 반응은 시험한 특정 펩티드가 용액 중에서 Mab를 결합시킬 수 없다는 것을 나타내는 것으로 받아들여졌다 (따라서, Mab는 칩 상에 고정화된 인간 스클레로스틴을 결합시키는데 자유로움). 결론적으로, 왕성한 RU 반응의 부재는 Mab가 용액 중에서 스클레로스틴 펩티드를 결합시킬 수 있다는 것을 나타냈다. 이러한 결합 패턴, 즉 다양한 스클레로스틴 펩티드의 공지된 동일물과의 커플링은 항-스클레로스틴 항체 Ab-A, Ab-B, Ab-C 및 Ab-D에 의해 결합된 스클레로스틴의 에피토프를 결정하는데 사용하였다.
비아 코어 -기재 인간 스클레로스틴 펩티드 에피토프 경쟁 결합 검정
인간 스클레로스틴 표면의 제조:
성숙 형태 인간 스클레로스틴의 비아코어 센서 칩 (CM5) 표면으로의 고정화는 제작자의 지시서에 따라 수행하였다. 요약하자면, 0.2 M N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)와 0.05 M N-히드록시숙신이미드 (NHS)을 함유한 혼합물 60 μL를 주사함으로써 센서 칩 표면 상의 카르복실기를 활성화시켰다. 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.0)을 사용하여 인간 스클레로스틴을 20 μg/mL의 농도로 희석한 다음 활성화된 CM5 표면 상에 주사하였다. 1 M 에탄올아민 60 μL를 주사함으로써 표면 상의 잉여량의 반응기를 불활성화시켰다. 최종 고정화 수준은 인간 스클레로스틴 표면에 대해 약 5000 공명 유닛 (RU)이었다. 바탕의 모방-커플링 참조 표면을 센서 칩 상에 또한 제조하였다.
결합 특이성 분석:
염화칼슘 또는 염화마그네슘 무함유 1X 인산염 완충 식염수를 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 기브코/인비트로겐(Gibco/Invitrogen)사로부터 입수하였다. IgG-무함유 소 혈청 알부민, 분획물 V를 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)사로부터 입수하였다. 각 Mab (2 nM)를 샘플 완충액 (1X PBS + 0.005% P-20 + 0.1 mg/mL BSA) 중에서 20 nM 인간 스클레로스틴 또는 특정 인간 스클레로스틴 펩티드 (주: AspN14.6 내에는 3개의 연결되지 않은 펩티드가 존재함)와 함께 개별적으로 인큐베이션한 다음, 고정화된 인간 스클레로스틴 표면 상에 주사하였다. 샘플 주사 유속은 5 μL/분이며, 이어서 8 mM 글리신 (pH 2.0) 중 1 M NaCl을 30초 동안 30 μL/분으로 사용하여 표면을 재생하였다. 비아평가 3.2를 이용하여 데이타를 분석하고, 도 15 (Ab-A), 도 16 (Ab-B), 도 17 (Ab-C) 및 도 18 (Ab-D)에 나타냈다.
루프 2 및 T20 .6 에피토프:
2종의 대표 항체 (Ab-A 및 Ab-B)에 대한 스클레로스틴 펩티드 결합 패턴은 사실상 동일하며 (도 15 및 도 16), 이들 항체 둘다가 오로지 AspN22.7-23.5 펩티드를 결합시킬 수 있음을 나타냈다. AspN22.7-23.5와 다른 모든 스클레로스틴 펩티드 간의 유일한 차이는 AspN22.7-23.5가 무손상 루프 2를 함유한다는 것이다. 이는 Ab-A 및 Ab-B가 스클레로스틴의 루프 2 영역에 결합함으로써 루프 2 에피토프를 정의함을 나타냈다 (도 19A). Ab-C 및 Ab-D에 대한 스클레로스틴 펩티드 결합 패턴은 서로 간에 사실상 동일하나 (도 17 및 도 18), Ab-A 및 Ab-B에 대해 발견한 것과는 완전히 별개였다. 이들 예에서 시험된 펩티드 중에서, Ab-C 및 Ab-D가 결합할 수 있는 가장 작은 펩티드는 T20.6 펩티드였다. 이러한 결과는 T20.6 에피토프를 정의한다 (도 19B).
프로테아제 보호 검정:
본 검정의 일반적인 원리는 Mab가 스클레로스틴에 결합하는 것이 특정 특이적 프로테아제 절단 부위를 보호할 수 있으며, Mab가 결합하는 스클레로스틴의 영역을 결정하는데 상기 정보를 이용할 수 있다는 것이다.
"T20 .6 유도체 1 (시스틴-매듭 + 4 아암 )" 에피토프:
도 20은 인간 스클레로스틴 Ab-D 복합체 (도 2OA: 상기 기재된 바와 같은 트립신으로 소화하기 전에 인간 스클레로스틴을 Ab-D와 함께 1:1 몰 비율로 미리 인큐베이션함), 및 인간 스클레로스틴 단독 (도 2OB: 인간 스클레로스틴을 상기 기재된 바와 같은 트립신으로 소화시킴)에 대한 HPLC 펩티드 맵을 나타냈다. 도 20A의 T19.2 및 T20.6의 펩티드 피크는 각 피크 높이가 도 20B와 비교하여 명백하게 감소되었음을 나타났다. 피크 높이의 이러한 감소는 펩티드 T20 및 T21-22에 대한 피크 높이의 증가를 수반하였다. 이러한 데이타는, Ab-D의 부재하에 트립신에 의해 절단되어 펩티드 T19.2 및 T20.6을 생성시키는, 루프 1 및 루프 3 내의 염기성 아미노산은 Ab-D가 스클레로스틴에 미리 결합되는 경우에 트립신에 의한 절단에 대해 저항하였다. T20, T20.6 및 T21-22의 존재는 Ab-D가 스클레로스틴에 미리 결합되는 경우에 루프 2가 여전히 효율적으로 절단됨을 나타낸다. 이러한 데이타는 Ab-D가 T20.6 에피토프의 루프 1 및 루프 3 상에 결합됨으로써 도 21에 나타난 바와 같은 보다 작은 "T20.6 유도체 1 (시스틴-매듭 + 4 아암)" 에피토프를 정의한다는 것을 나타낸다.
실시예 5
마우스에서 항- 스클레로스틴 모노클로날 항체의 생체내 시험
4주령의 BDF1 수컷 마우스를 칼즈 리버 래보라토리즈(미국 노쓰 캐롤라이나주 롤리 소재)로부터 입수하여 각 케이지에 5마리의 동물을 깨끗한 케이지 내에 수용시켰다. 실온을 68 내지 72 ℉로 유지하고, 상대 습도를 34 내지 73%로 유지하였다. 상기 케이스를 수용하는 실험실은 12시간 명암 주기를 가졌으며, 모든 AAALAC 사항을 충족하였다. 연구에 대한 모든 마우스의 임상적 관찰은 1일 1회 수행하였다.
정제된 항-스클레로스틴 모노클로날 항체 (Ab-A 도 1; Ab-B 도 2; Ab-C 도 3; Ab-D 도 4)를 멸균 둘베코 인산염 완충 식염수로 희석하였다. 마우스에게 체중 1 g 당 21 μl의 항-스클레로스틴 항체 또는 PBS 비히클을 매주 2회씩 (월요일 및 목요일) 25 mg/kg으로 피하 주사하였다. 인간 PTH (1-34)를 PTH 완충액 (0.001 N HCl, 0.15 M NaCl, 2% BSA)로 희석하여 양성 대조군으로서 체중 1 g 당 21 μl를 매주 5회씩 (월요일, 화요일, 수요일, 목요일, 금요일) 100 μg/kg으로 피하 투여하였다 (도 5 및 6). 집단 당 마우스의 수는 도 5 및 6에서는 N=5이고, 도 7에서는 N=6였다.
PIXImus 생체내 골 밀도계
골 무기질 밀도 (BMD)는 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 지이/루나 메디칼 시스템즈(GE/Lunar)사의 PIXImus2 시스템을 장착한 말초 이중 에너지 X선 흡수 계측법(peripheral Dual Energy X-ray Absorptometry; pDEXA)에 의해 근위 경골 골간단 및 요추골에서 매주 측정하였다. 25 mm2의 관심 영역 (ROI)은 근위 관절 표면, 골단, 및 경골의 골간단 상의 근위 말단을 포함하여 위치하였다. 관심 영역 (ROI)은 요추골 (L1-L5)을 포함하여 위치하였다. 근위 경골 및 요부 영역을 분석하여 총 골 무기질 밀도를 결정하였다. 집단 평균은 ± 표준 편차로 기록되었으며, 통계 분석을 위해 비히클 처리군과 비교하였다.
통계 분석
통계 분석은 던넷(Dunnett) 및 터키-크라머(Tukey-Kramer) (BMD 데이타를 위해 MS 엑셀 및 JMP 버전 5.0.을 이용함)를 이용하여 수행하였다. 각 데이타 세트에 대한 집단 평균은 P 값이 0.05 (P < 0.05) 미만인 경우에 유의적으로 상이한 것으로 간주하였다.
항체의 스클레로스틴 중화 활성
Ab-A (도 5), Ab-B (도 5), Ab-C (도 6) 및 Ab-D의 각각에 대해 나타낸 비히클 (도 7)에 비해 BMD의 통계적으로 유의한 증가는 이들 4종의 항체가 스클레로스틴 중화 항체임을 입증한다. 더욱이, 이러한 데이타는, 마우스 스클레로스틴과 결합하는 항-스클레로스틴 항체의 경우에 상기한 바와 같이 마우스의 처리 및 분석을 이용하여 스클레로스틴 중화 항체를 확인할 수 있다는 것을 나타냈다.
실시예 6
항체가 인간 스클레로스틴에 결합하는 것을 차단하는 항체에 대한 스크리닝 검정
표준 아민 커플링 화학을 이용하여 CM5 비아코어 칩에 인간 스클레로스틴을 커플링시켜 스클레로스틴 코팅된 표면을 생성시켰다. 300 공명 유닛의 스클레로스틴을 상기 표면 상에 커플링시켰다.
시험할 항체를 HBS-EP 완충액 (10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% (v/v) 계면활성제 P20임) 중에 200 μg/ml의 농도로 희석하고, 이어서 1 대 1 몰 비율 (결합 부위를 기준)로 혼합하여 시험 혼합물을 생성시켰다. 이와 같이, 시험 혼합물은 각 항체를 100 μg/ml의 농도 (결합 부위를 기준으로 1.3 μM)로 함유하였다. 시험 믹스 중에 각 항체를 함유한 분리 용액 단독을 또한 제조하였다. 상기 용액은 개별 항체를 HBS-EP 완충액 중에 100 μg/ml (결합 부위를 기준으로 1.3 μM)으로 함유하였다.
시험 혼합물 200 μL를 유속 10 μL/분으로 스클레로스틴-코팅된 칩을 통과시키고, 결합 양을 기록하였다. 이어서, 30 mM HCl의 2회 60초 펄스를 이용하여 상기 칩을 처리하여, 결합된 항체를 모두 제거하였다. 이어서, 시험 혼합물의 항체 중 1종만을 함유한 용액 (결합 부위를 기준으로, 시험 혼합물로서 동일한 완충액 중의 1.3 μM)은 시험 혼합물로서 동일한 방식으로 상기 칩에 통과시키고, 결합 양을 기록하였다. 상기 칩을 다시 처리하여 결합된 항체를 모두 제거하였으며, 최종적으로 시험 혼합물 단독으로부터 다른 항체를 함유한 용액 (결합 부위를 기준으로, 시험 혼합물로서 동일한 완충액 중의 1.3 μM)을 상기 칩에 통과시키고, 결합 양을 기록하였다.
하기 표는 상이한 항체의 범위에 대해 교차-차단 검정에 의한 결과를 나타냈다. 표의 각 셀 내의 값은, 표의 상단 열에 나타낸 항체 (결합 부위를 기준으로 1.3 μM) 또는 완충액을 표의 제1 컬럼에 나타낸 항체 (결합 부위를 기준으로 1.3 μM) 또는 완충액과 혼합하는 경우에 나타난 결합 양 (RU)을 나타냈다.
Figure 112015094068939-pat00259
상기 표의 항체의 각 조합에 대한 평균 결합값 (RU) (각 조합은 2회씩 수행하였기 때문)을 이용하여, 항체의 각 조합에 의해 나타난 이론적 결합 비율을 계산하는 것이 가능하다. 단독으로 검정한 경우에 (즉, 항체 및 완충액), 각 시험 혼합물의 성분에 대한 평균값의 총합으로 계산되는 이론적인 결합.
Figure 112015094068939-pat00260
상기 데이타로부터 Ab-4, Ab-A 및 Ab-19는 서로 교차-차단하는 것이 명백하였다. 유사하게, Ab-13 및 Ab-3는 서로 교차-차단하였다.
실시예 7
엘리자( ELISA )-기반 교차-차단 검정
본 실시예에서 사용한 액체 용량은 96-웰 플레이트 엘리자에 전형적으로 사용되는 용량 (예, 50-200 μl/웰)일 수 있다. 본 실시예에서 Ab-X 및 Ab-Y는, 약 145 Kd의 분자량을 가지고 항체 분자 당 2 스클레로스틴 결합 부위를 갖는 것으로 추정하였다. 항-스클레로스틴 항체 (Ab-X)를 1시간 이상 동안 96-웰 엘리자 플레이트 [예, 코닝(Corning) 96 웰 EIA/RIA 평저 마이크로플레이트 (제품번호 3590), 미국 매사추세츠주 액톤 소재의 코닝 인크.(Corning Inc.)] 상에 코팅하였다 (예, 1 μg/ml의 50 μ). 상기 코팅 단계 후에, 항체 용액을 제거하고, 상기 플레이트를 세척 용액 (예, PBS 및 0.05% 트윈 20)으로 1회 또는 2회 세척하고, 이어서 적절한 차단 용액 (예, PBS, 1% BSA, 1% 염소 혈청 및 0.5% 트윈 20)을 사용하고 당업계에 공지된 절차를 이용하여 차단하였다. 이어서, 차단 용액을 엘리자 플레이트로부터 제거하고, 코팅된 항체를 교차-차단할 수 있는 시험할 제2의 항-스클레로스틴 항체 (Ab-Y)를 차단 용액 중 과량으로(예, 10 μg/ml의 50 μl) 엘리자 플레이트의 적절한 웰에 첨가하였다. 상기를 수행한 후에 이어서 차단 용량 중 스클레로스틴의 한정량 (예, 10 ng/ml의 50 μl)을 적절한 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 교반하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 플레이트를 세척 용액으로 2회 내지 4회 세척하였다. 차단 용액 중 적정량의 스클레로스틴 검출 시약 [예, 적정량의 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 접합체와 미리-결합된 비오틴화 항-스클레로스틴 폴리클로날 항체]을 엘리자 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 이상 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 플레이트를 4회 이상 세척 용액으로 세척하고, 적절한 시약 [예, HRP 기질, 예컨대 TMB (비색성) 또는 다양한 HRP 발광 기질]으로 발색시켰다. 검정에 대한 배경 신호는 코팅된 항체 (이 경우 Ab-X), 제2 용액 상 항체 (이 경우 Ab-Y), 오로지 스클레로스틴 완충액 (즉, 스클레로스틴 무함유) 및 스클레로스틴 검출 시약을 사용하여 웰 중에서 수득한 신호로 정의한다. 검정에 대한 양성 대조군 신호는 코팅된 항체 (이 경우 Ab-X), 오로지 제2 용액 상 항체 완충액 (즉, 제2 용액 상 항체 무함유), 스클레로스틴 및 스클레로스틴 검출 시약을 사용하여 웰 중에서 수득한 신호로 정의한다. 엘리자 검정은 6회 이상의 배경 신호를 양성 대조군 신호가 되게 하는 방식으로 실행할 필요가 있다.
코팅된 항체로서 사용하기 위한 항체 및 제2 (경쟁) 항체로서 사용하기 위한 항체의 선택으로부터 야기되는 임의의 인공물 (스클레로스틴에 대한 Ab-X와 Ab-Y 간의 유효적으로 상이한 친화도)을 피하기 위해, 교차-차단 검정은 하기의 2가지 형식으로 실행할 필요가 있다:
1) 형식 1은 Ab-X가 엘리자 플레이트 상에 코팅된 항체이고, Ab-Y가 용액 중에 존재하는 경쟁 항체인 것이고,
2) 형식 2는 Ab-Y가 엘리자 플레이트 상에 코팅된 항체이고, Ab-X가 용액 중에 존재하는 경쟁 항체인 것이다.
Ab-X 및 Ab-Y는, 형식 1 또는 형식 2의 경우에, 용액 상 항-스클레로스틴 항체가 용액 상 항-스클레로스틴 항체의 부재하에 수득된 스클레로스틴 검출 신호 (즉, 양성 대조군 웰)와 비교하여 스클레로스틴 검출 신호 (즉, 코팅된 항체에 의해 결합된 스클레로스틴의 양)가 60% 내지 100%, 특히 70% 내지 100%, 보다 특히 80% 내지 100% 감소될 수 있는지에 따라 교차-차단으로 정의한다.
스클레로스틴의 태깅(tagging) 버전, 예컨대 N-말단 His-태깅된 스클레로스틴 (미국 매사추세츠주 미니애폴리스 소재의 알 앤드 디 시스템즈(R&D Systems); 2005 카탈로그 번호 1406-ST-025)을 엘리자에 사용하는 경우에, 적절한 유형의 스클레로스틴 검출 시약은 HRP-표지된 항-His 항체를 포함할 수 있다. N-말단 His-태깅된 스클레로스틴 사용에 더하여, 또한 C-말단 His-태깅된 스클레로스틴을 사용할 수 있다. 더욱이, 당업계에 공지된 각종 다른 태그 및 태그 결합 단백질 조합물 (예, 항-HA 항체와의 HA 태그; 항-FLAG 항체와의 FLAG 태그; 스트렙타비딘과의 비오틴 태그)을 상기 엘리자-기반 교차-차단 검정에 사용할 수 있다.
실시예 8
스클레로스틴 활성을 길항할 수 있는 확인용 작용제에 대한 세포 기반 무기질침착 검정
도입부
배양 중 조골세포계 세포, 즉 1차 세포 또는 세포주에 의한 무기질침착은 골 형성의 시험관내 모델로서 사용한다. 무기질침착은 1종 이상의 분화 작용제에 의한 조골세포계 세포 분화의 유도를 개시시키는데 약 1주 내지 6주가 걸린다. 전반적인 연속 사건은 세포 증식, 분화, 세포외 매트릭스 생성, 매트릭스 성숙, 및 최종적으로 무기질 침착 (이는 인산칼슘의 결정화 및/또는 침착을 의미함)을 포함한다. 세포 증식 및 분화로 시작하여 무기질 침착으로 끝나는 이러한 연속 사건은 본원에서 무기질침착으로 나타낸다. 칼슘 (무기질)의 측정은 검정의 결과이다.
무기질의 침착은 강력한 생물리학적 특징을 가지며, 즉 무기질 "시드"가 형성되기 시작하면 전체 배양 중 침착될 것인 무기질의 총량이 이후에 수 일 내에 매우 급속히 침착될 수 있다. 배양 중 무기질 침착의 시기 및 정도는 부분적으로 사용할 특정 조골세포계 세포/세포주, 성장 조건, 분화 작용제의 선택, 및 세포 배양 배지에 사용되는 혈청의 특정 제품 번호에 의해 영향을 받는다. 조골세포계 세포/세포주 무기질침착 배양에 대해, 하나 이상의 공급사로부터의 적어도 8개 내지 15개의 혈청 제품은 무기질침착이 발생하는 특정 혈청 제품을 확인하기 위해 시험되어야 한다.
MC3T3-E1 세포 (문헌 [Sudo H et al, In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J. Cell Biol. 96:191-198]) 및 원 세포주의 서브클론은 분화 작용제의 존재하에 성장시 배양 중에 무기질을 형성할 수 있다. 상기 서브클론은 MC3T3-E1-BF (문헌 [Smith E, Redman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J Biol Chem 275:19992-20001])를 포함한다.
스클레로스틴 중화 항체의 확인
MC3T3-E1-BF 세포를 무기질침착 검정에 사용하였다. 아스코르브산 및 B-글리세로포스페이트를 사용하여 무기질 침착을 발생시키는 MC3T3-E1-BF 세포 분화를 유도하였다. 특정 스크리닝 프로토콜은, 96-웰 형식으로 수요일에 세포를 플레이팅한 다음, 대부분의 무기질 침착이 발생하는 마지막 대략 8시간 (예를 들어, 일요일 밤부터 월요일까지)을 포함한 12일 기간에 걸쳐 배지를 7회 교체하였다 (하기에 추가로 기재된 바와 같음). 임의의 주어진 처리에 대해, 3개의 웰을 사용하였다 (N=3). 무기질 침착의 특정 시기 및 정도는 부분적으로 사용할 특정 혈청 제품 번호에 따라 다를 수 있다. 대조군 시험은, 일반적으로 세포 배양 시험에 대해 당업계에 익히 공지된 바와 같이, 상기 변수에 의해 설명될 것이다.
상기 검정 시스템에서, 스클레로스틴은, 무기질 침착을 발생시켜 이를 포함하는 하나 이상의 연속 사건을 억제하였다 (즉, 스클레로스틴은 무기질침착을 억제함). 스클레로스틴의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항-스클레로스틴 항체는 스클레로스틴의 존재하에 배양의 무기질침착을 허용함으로써, 오로지 스클레로스틴 처리군 (즉, 항체 무함유)에서 측정된 칼슘의 양에 비해 인산칼슘의 침착 (칼슘에 대해 측정)은 통계상 유의적으로 증가하였다. 통계 분석 (MS 엑셀 및 JMP 이용)에 대해, 일원식-아노바(ANOVA)에 이어 던넷 비교를 이용하여 집단간의 차이를 결정하였다. 각 데이타 세트에 대한 집단 평균은 P 값이 0.05 미만인 경우에 (P < 0.05) 유의적으로 상이한 것으로 간주하였다. 상기 검정을 실행에 의한 대표적인 결과는 도 22에 나타냈다. 재조합 마우스 스클레로스틴의 부재하에, 무기질 침착을 발생시켜 이를 포함하는 연속 사건을 통상적으로 진행하였다. 각 처리군에서 칼슘 수준은 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 나타냈다. 상기 예시 실험에서, 칼슘 검정에 의한 칼슘 수준은 약 31 μg/ml였다. 그러나, 재조합 마우스 스클레로스틴을 첨가하자 무기질침착이 억제되었으며, 칼슘은 약 85%까지 감소되었다. 항-스클레로스틴 모노클로날 항체 Ab-19 또는 Ab-4를 재조합 스클레로스틴과 함께 첨가하자, 스클레로스틴의 억제 활성이 하나의 항체에 의해 중화되기 때문에 오로지 스클레로스틴-처리군에 비해 무기질 침착이 통계상 유의적으로 증가하였다. 상기 실험에 의한 결과는 Ab-19 및 Ab-4가 스클레로스틴 중화 모노클로날 항체 (Mab)임을 나타냈다.
도 23은 재조합 인간 스클레로스틴 및 2종의 인간화 항-스클레로스틴 Mab를 이용하여 매우 유사한 결과를 나타냈다. 도 24는 나타낸 바와 같은 재조합 인간 스클레로스틴 및 마우스 및 인간화 항-스클레로스틴 Mab를 이용하여 매우 유사한 결과는 나타냈다.
도 22, 23 및 24에 나타난 실험에 사용된 항체는 분자량이 약 145 Kd이고, 항체 분자 당 2곳의 스클레로스틴 결합 부위를 가졌다.
자세한 MC3T3-E1-BF 세포 배양 프로토콜은 하기에 기재하였다.
시약 및 배지
시약 회사 카탈로그 번호
알파-MEM 기브코-인비트로겐 12571-048
아스코르브산 시그마 A4544
베타-글리세로포스페이트 시그마 G6376
1OOX 펜스트렙글루타민
(PenStrepGlutamine)		 기브코-인비트로겐 10378-016
디메틸술폭시드 (DMSO) 시그마 D5879 또는 D2650
소 태아 혈청 (FBS) 칸세라(Cansera) CS-C08-500
(제품 번호 SF50310)
또는 소 태아 혈청 (FBS) 테라셀 인터내셜날
(TerraCell Int.)		 CS-C08-1000A
(제품 번호 SF-20308)
알파-MEM은 통상적으로 1년 만기일을 갖도록 제조되었다. 제조일 이후 6개월 이상 경과 되지 않은 알파-MEM을 세포 배양에 사용하였다.
증식 배지 (알파-MEM/10%FBS/펜스트렙글루)를 하기와 같이 제조하였다:
500 ml 병의 FBS를 해동시키고, 0.22 마이크로미터 필터를 통과시켜 필터 멸균시켰다. 상기 FBS 100 ml를 알파-MEM 1 ℓ에 첨가한 다음 10Ox 펜스트렙글루타민 100 ml를 첨가하였다. 사용하지 않은 FBS를 분취하여 후에 사용하도록 냉동시켰다.
분화 배지 (알파-MEM/10%FBS/펜스트렙글루, + 50 μg/ml 아스코르브산, + 10 mM 베타-글리세로포스페이트)를 하기와 같이 제조하였다:
하기와 같이 아스코르브산 및 베타-글리세로포스페이트를 함유한 증식 배지 100 ml를 보충함으로써 분화 배지 100 ml를 제조하였다:
원액 농도
(하기 참조)		 용량 최종 농도
아스코르브산 10 mg/ml 0.5 ml 100 μg/ml
(50 μg/ml + 50 μg/ml)
β-글리세로포스페이트 1 M 1.0 ml 1O mM
분화 배지를 세포 배양에 사용하는 날에 단지 증식 배지를 보충함으로써 분화 배지를 제조하였다. 알파-MEM이 이미 50 μg/ml 아스코르브산을 함유했기 때문에 분화 배지 내 아스코르브산의 최종 농도는 100 μg/ml였다. 아스코르브산 원액 (10 mg/ml)을 제조하고, -8O ℃에서 냉동시키기 위해 분취하였다. 각 분취액을 한번에 사용하였다 (즉, 재냉동시키지 않음). 베타-글리세로포스페이트 원액 (1 M)을 제조하고, -2O ℃에서 냉동시키기 위해 분취하였다. 각 분취액을 냉동시키고, 최대 5회까지 해동시킨 다음 버렸다.
MC3T3 - E1 - BF 세포의 증식을 위한 세포 배양
세포를 37 ℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 스클레로스틴 중화 항체에 대해 스크리닝 목적을 위해 세포 은행을 발생시켰다. 세포 은행을 하기와 같이 생성시켰다:
냉동 MC3T3-E1-BF 세포 1 바이알을 37 ℃ 수조 중에서 교반하여 해동시켰다. 해동 세포를 50 ml의 튜브 내 증식 배지 (알파-MEM/10%FBS/펜스트렙글루) 10 ml에 넣고, 5분 동안 완만하게 스핀 다운시켰다. 이어서, 세포를 알파-MEM/10%FBS/펜스트렙글루 4 ml 중에 재현탁시켰다. 트립판 블루 및 혈구계를 이용하여 세포 수를 측정한 후에, 알파-MEM/10%FBS/펜스트렙글루 배지 50 ml 중 1 x 106개 세포를 하나의 T175 플라스크 내에 플레이팅하였다.
이들 계대가 전면성장한 경우에 (대략 제7일째), 세포를 트립신/EDTA (0.05% 트립신; 0.53 mM EDTA)으로 트립신처리하고, 5분 동안 완만하게 스핀 다운시키고, 이어서 알파-MEM/10%FBS/펜스트렙글루 5 ml 중에 재현탁시켰다. 트립판 블루 및 혈구계를 이용하여 세포 수를 측정한 후에, 1개의 T175 플라스크 당 알파-MEM/10%FBS/펜스트렙글루 배지 50 ml 중 1 x 106개 세포를 플레이팅하였다. 상기 시점에서 플레이팅에 사용된 T175 플라스크의 수는 이용가능한 전체 세포수 및 다음 계대에서 취하게 되는 플라스크의 원하는 수에 따라 다르다. 잉여량의 세포를 90%FBS/10%DMSO 1 ml 당 1 내지 2 x 106개 살아있는 세포로 냉동시켰다.
본 계대가 전면성장한 경우에 (약 3 내지 4일), 세포를 트립신/EDTA (0.05% 트립신; 0.53 mM EDTA)로 트립신처리하고, 5분 동안 완만하게 스핀 다운시키고, 이어서 알파-MEM/10%FBS/펜스트렙글루 5 ml 중에 재현탁시켰다. 트립판 블루 및 혈구계를 이용하여 세포 수를 측정한 후에, 1개의 T175 플라스크 당 알파-MEM/10%FBS/펜스트렙글루 배지 50 ml 중 1 x 106개 세포를 플레이팅하였다. 상기 시점에서 플레이팅에 사용된 T175 플라스크의 수는 이용가능한 전체 세포수 및 다음 계대에서 취하게 되는 플라스크의 원하는 수에 따라 다르다. 잉여량의 세포를 90%FBS/10%DMSO 1 ml 당 1 내지 2 x 106개 살아있는 세포로 냉동시켰다.
본 계대가 전면성장한 경우에 (약 3 내지 4일), 세포를 트립신/EDTA (0.05% 트립신; 0.53 mM EDTA)로 트립신처리하고, 5분 동안 완만하게 스핀 다운시키고, 이어서 알파-MEM/10%FBS/펜스트렙글루 5 ml 중에 재현탁시켰다. 트립판 블루 및 혈구계를 이용하여 세포 수를 측정한 후에, 1개의 T175 플라스크 당 알파-MEM/10%FBS/펜스트렙글루 배지 50 ml 중 1 x 106개 세포를 플레이팅하였다. 상기 시점에서 플레이팅에 사용된 T175 플라스크의 수는 이용가능한 전체 세포수 및 다음 계대에서 취하게 되는 플라스크의 원하는 수에 따라 다르다. 잉여량의 세포를 90%FBS/10%DMSO 1 ml 당 1 내지 2 x 106개 살아있는 세포로 냉동시켰다.
본 계대가 전면성장한 경우에 (약 3 내지 4일), 세포를 트립신/EDTA (0.05% 트립신; 0.53 mM EDTA)로 트립신처리하고, 5분 동안 완만하게 스핀 다운시키고, 이어서 알파-MEM/10%FBS/펜스트렙글루 5 ml 중에 재현탁시켰다. 트립판 블루 및 혈구계를 이용하여 세포 수를 측정한 후에, 세포를 90%FBS/10%DMSO 1 ml 당 1 내지 2 x 106개 살아있는 세포로 냉동시켰다. 냉동 세포의 이러한 "최종 계대"는 스크리닝 검정에 사용하는 계대였다.
MC3T3 - E1 - BF 세포를 무기질침착시키기 위한 세포 배양
세포를 37 ℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 무기질침착 세포 배양 절차 동안 온도 및 % CO2 변동을 최소하는 것이 바람직하다. 이는 영양공급 동안 플레이트를 인큐베이터 밖에 두는 시간을 최소화함으로써 및 또한 무기질침착 세포 배양 절차 동안 인큐베이터 문의 개폐 횟수를 최소화함으로써 달성할 수 있다. 이와 관련하여, 무기질침착 세포 배양만 하도록 조직 배양 인큐베이터를 갖추는 것 (및 따라서 필요한 경우에만 개폐함)이 유용할 수 있다 .
상기한 바와 같이 제조된 "최종 계대" 바이알의 적절한 수를 37 ℃ 수조 내에서 교반하여 해동시켰다. 해동 세포를 50 ml의 튜브 내 증식 배지 (알파-MEM/10%FBS/펜스트렙글루) 10 ml에 넣고, 5분 동안 완만하게 스핀 다운시켰다. 이어서, 세포를 알파-MEM/10%FBS/펜스트렙글루 4 ml 중에 재현탁시켰다. 트립판 블루 및 혈구계를 이용하여 세포 수를 측정한 후에, 콜라겐 I 코팅된 96-웰 플레이트 (벡톤 디킨슨 랩웨어(Becton Dickinson Labware), 카탈로그 번호 354407) 상에 웰 당 증식 배지 200 μl 중 2500개 세포를 플레이팅하였다.
무기질침착 플레이트-가장자리 효과를 피하기 위해, 플레이트 주위의 모든 곳의 가장 바깥쪽 열/컬럼에는 세포를 플레이팅하지 않았다. 대신에 PBS 200 μl를 상기 웰에 첨가하였다.
예시적인 세포 배양 절차
하기 절차에서, 세포 플레이팅 출발일은 수요일로 지정하였다. 그 주의 다른 날을 세포 플레이팅 출발일로 지정하는 경우에, 하기에 나타낸 바와 같이 전체 과정 동안 배지 제거 및 첨가에 대한 1일 스케줄을 생성해야할 것이다. 예를 들어, 세포를 화요일에 플레이팅한 경우에, 배지는 제1 금요일 및 토요일 또는 제2 금요일 및 토요일 둘다에서 제거하고 추가하지 않아야 한다. 화요일에 개시된 경우에, 플레이트는 최종 일요일에 칼슘 검정을 위해 제조될 수 있다.
세포를 수요일에 증식 배지 200 μl 중 2500개 세포로 플레이팅하였다.
목요일에, 증식 배지 전부를 제거하고, 분화 배지 200 μl를 첨가하였다.
금요일에, 배지 100 μl를 제거하고, 새로운 분화 배지 100 μl를 첨가하였다.
월요일에, 배지 100 μl를 제거하고, 새로운 분화 배지 100 μl를 첨가하였다.
화요일에, 배지 100 μl를 제거하고, 새로운 분화 배지 100 μl를 첨가하였다.
수요일에, 배지 100 μl를 제거하고, 새로운 분화 배지 100 μl를 첨가하였다.
목요일에, 배지 100 μl를 제거하고, 새로운 분화 배지 100 μl를 첨가하였다.
금요일에, 배지 100 μl를 제거하고, 새로운 분화 배지 100 μl를 첨가하였다.
그 다음 월요일에, 칼슘 검정을 위해 하기와 같이 플레이트를 제조하였다:
플레이트를 10 mM 트리스, HCl (pH 7-8)로 1회 세척하였다. 흄 후드 하에서 작업한 후에, 웰 당 0.5 N HCl 200 μl를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 -8O ℃에서 냉동시켰다.
칼슘을 측정하기 바로 직전에, 플레이트를 2회 냉동-해동시키고, 이어서 분쇄하고, 다중채널 피펫을 사용하여 플레이트 함유물을 분배시켰다. 이어서, 플레이트 함유물을 4 ℃에서 30분 동안 정치시키고, 그 시점에서 상업적으로 이용가능한 칼슘 키트를 이용하여 칼슘을 측정하기 위해 적정량의 상등액을 분리하였다. 예시적 비제한적인 키트는 칼슘 (CPC) 리퀴컬러(Liquicolor) [미국 텍사스주 보에른 소재의 스탄비오 래보라토리즈(Stanbio Laboratory)의 카탈로그 번호 0150-250]였다.
상기 세포 기반 검정에서, 스클레로스틴은, 무기질 침작을 발생시키고 이를 포함하는 하나 이상의 연속 사건을 억제하였다 (즉, 스클레로스틴은 무기질침착을 억제함). 따라서, 특정 세포 배양 실험에 스클레로스틴을 포함하는 실험에서, 제1 목요일에 시작하여 이후 매일 공급일에 재조합 스클레로스틴을 배지에 첨가하였다. 스클레로스틴을 중화시키는 능력에 대해 항-스클레로스틴 모노클로날 항체 (Mab)를 시험하는 경우, 즉 무기질침착을 억제하는 스클레로스틴의 능력을 중화시킴으로써 무기질침착을 허용하는 경우에, 제1 목요일에 시작하여 이후 매일 공급일에 Mab를 배지에 첨가하였다. 프로토콜에 따라, 이를 하기와 같이 달성하였다: Mab를 분화 배지 중에서 재조합 스클레로스틴과 함께 37 ℃에서 45 내지 60분 동안 미리 인큐베이션하고, 이어서 세포에 영양공급을 위해 상기 배지를 사용하였다.
MC3T3-E1-BF 세포에 대한 제12일 무기질침착 프로토콜은 상기와 같이 기재되었다. 동일한 시약 및 영양공급 프로토콜을 이용하여, 본 발명자들이 RIKEN 세포 은행 (일본 305-0074 이바라끼 쯔꾸바시 RIKEN 바이오리소스 센터 3-1-1 꼬야다이 알씨비 1126)으로부터 입수한 원 MC3T3-E1 세포 (문헌 [Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J Cell Biol 96:191-198])를 무기질침착시키는데 MC3T3-E1-BF 세포보다 더 오래 (무기질침착에 대해 총 20일) 걸렸다. 원 MC3T3-E1 세포의 무기질침착은 재조합 스클레로스틴에 의해 억제되었으며, 이러한 억제는 스클레로스틴 중화 항체를 사용하여 차단하였다.
실시예 9
SCID 마우스에서 결장염의 CD4 CD45RB HI 전달 모델에서 염증-유도된 골 손실로부터의 항- 스클레로스틴 항체 보호
모델 개관
CD4+ T 세포의 CD45RB높음 아집단을 C.B-17 scid 마우스로 주사하면 인간 염증성 장 질환 (IBD)의 특징과 유사한 특징을 갖는 만성 장 염증을 일으킨다. 상피 세포 과다형성 및 육아종 형성을 수반한 결장으로 중증 백혈구 침윤을 갖는 세포를 전달한 후에 설사 및 소모병을 3 내지 5주 동안 주목하였다. CD4+ 세포의 상호 아집단을 투여한 C-B-17 scid 마우스, 즉 CD45RB낮음을 발현하는 마우스는 결장염을 나타내지 않으며, 주사되지 않은 scid 마우스와 구별되지 않게 체중이 증가하였다. 결장염 증상에 더하여, 결장염의 CD4+ CD45RB높음 T 세포 전달 모델은, 식이 흡수장애 이외의 염증 메카니즘을 주로 통할 것으로 고려되는 (문헌 [Byrne, F. R. et al., Gut 54:78-86, 2005]) 골 무기질 밀도 (BMD)의 감소를 수반하였다.
결장염 유도 및 염증-유도된 골 손실
비장을 암컷 balb/c 마우스로부터 취하고, 70 μm 세포 여과기를 통해 분쇄하였다. 이어서, B220, MAC-1, CD8 및 I-Ad에 대한 항체를 이용하는 디나비드(Dynabead)로 음성 선별에 의해 CD4+ 집단을 풍부하게 하였다. 이어서, 풍부 집단은 FITC 접합된 항-CD4 및 PE 접합된 항-CD45RB로 염색되었으며, 모플로(Moflo; 다코시토메이션(Dakocytomation)) 상에서 2색 분류함으로써 CD4+CD45RB높음 및 CD4+CD45RB낮음 집단으로 분별하였다. CD45RB높음 및 CD45RB낮음 집단은 CD4+ 세포의 각각 가장 밝은 염색 40% 및 가장 흐릿한 염색 20%로 정의하였다. 이어서, 5 x 105개 세포를 제0일에 C.B-17 scid 마우스로 복막내 주사하고, 묽은 변 또는 설사 및 체중 감소를 통해 결장염의 진행을 모니터링하였다. 골 무기질 밀도 측정은 연구 종료시 (제88일)에 수행하였다.
결장염 증상 및 BMD 에 대한 항- 스클레로스틴 처리의 효과
CD4+CD45RB높음 세포 전달 전날부터 Ab-A IgG를 10 mg/kg으로 피하 투여하고, 또한 음성 대조군 항체 101.4를 10 mg/kg으로 피하 투여한 마우스와 비교하였다. 이후에 상기 항체를 매주 투여하였다. 비-병원성 CD4+CD45RB낮음 세포를 투여하고 10 mg/kg 101.4를 투여한 마우스 집단은 대조군으로서 연구하였다. 연구 종료시 (제88일), 골 무기질 밀도를 측정하고, 세포 침윤의 분석 및 조직 손상의 평가를 위해 결장 절편을 취하였다.
a) 결장염 증상의 효과 없음
전형적인 결장염 증상, 체중 감소 및 염증 세포의 결장으로의 침윤은 Ab-A로처리한 경우에 어떠한 영향도 받지 않았다. 유사하게, Ab-A 처리 이후 결장에 대한 조직 손상이 개선되지 않았다.
b) 골 무기질 밀도의 염증-유도된 손실 억제
세포를 C.B-17 scid 마우스로 전달한 후 제88일에, 골 무기질 밀도를 측정하였다 (총 BMD, 척추골 BMD 및 대퇴골 BMD). CD4+CD45RB낮음 비-병원성 세포를 투여한 대조군 마우스와 비교하여, CD4+ CD45RB높음 T 세포 및 음성 대조군 항체 101.4를 투여한 마우스는 도 25에서 나타낸 바와 같이 골 무기질 밀도가 감소되었다. 반대로, Ab-A 처리 이후에 BMD의 감소는 나타나지 않았다. 전체, 척추골 및 대퇴골의 BMD 측정값은 CD4+ CD45RB높음 T 세포를 투여하고 Ab-A로 처리한 마우스에서 CD4+ CD45RB높음 T 세포를 투여하고 101.4로 처리한 마우스보다 유의적으로 높았다 (본페로니(Bonferroni) 다중 비교 검정에 의해 P<0.001).
실시예 10
인간 스클레로스틴에 대한 항- 스클레로스틴 항체 친화도 ( K D )의 킨엑사 ( KinExA )-기반 측정
킨엑사(KinExA®) 3000 (미국 아이다호주 보이시 소재의 사피다인 인스트러먼츠 인크.(Sapidyne Instruments Inc.))을 이용하여 인간 스클레로스틴에 대한 몇가지 항-스클레로스틴 항체의 친화도를 용액 평형 결합 분석에 의해 평가하였다. 이러한 측정을 위해, 리액티(Reacti)-겔 6x 비드 (미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스(Pierce))를 50 mM Na2CO3(pH 9.6) 중 40 μg/ml 인간 스클레로스틴으로 4 ℃에서 밤새 예비 코팅하였다. 이어서, 비드를 1 M 트리스-HCl (pH 7.5) 중 1 mg/ml BSA로 4 ℃에서 2시간 동안 차단하였다. 10 pM, 30 pM 또는 100 pM의 항체를 0.1 pM 내지 1 nM의 농도에 이르는 다양한 농도의 인간 스클레로스틴과 혼합하고, 0.1 mg/ml BSA 및 0.005% P20을 함유한 PBS 중 실온에서 8시간 초과 동안 평형을 이루게 하였다. 이어서, 혼합물을 인간 스클레로스틴 코팅된 비드에 통과시켰다. 마우스 또는 인간 항체 샘플 각각에 대해 형광 Cy5-표지된 염소 항-마우스-IgG 또는 형광 Cy5-표지된 염소 항-인간-IgG 항체 (미국 펜실바니아주 웨스트 그로브 소재의 잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research))을 사용하여 비드-결합된 항-스클레로스틴 항체의 양을 정량하였다. 측정된 형광 신호의 양은 평형을 이룬 각 반응 혼합물에서 유리 항-스클레로스틴 항체의 농도에 비례하였다. 킨엑사 프로(KinExA Pro) 소프트웨어에서 제공되는 n-곡선 한 자리 균일 결합 모델(n-curve one-site homogeneous binding model)을 이용하여 경쟁 곡선의 비선형 회귀로부터 해리 평형 상수 (KD)를 얻었다. 선택된 항체에 대한 킨엑사 검정의 결과를 하기 표에 요약하였다.
항체 항원 KD ( pM ) 95% 신뢰 구간
Ab-13 인간 스클레로스틴 0.6 0.4 - 0.8 pM
Ab-4 인간 스클레로스틴 3 1.8 - 4 pM
Ab-19 인간 스클레로스틴 3 1.7 - 4 pM
Ab-14 인간 스클레로스틴 1 0.5 - 2 pM
Ab-5 인간 스클레로스틴 6 4.3 - 8 pM
Ab-23 인간 스클레로스틴 4 2.1 - 8 pM
실시예 11
인간 스클레로스틴에 대한 인간화 항- 스클레로스틴 항체의 친화도를 측정하는 비아 코어 방법
비아코어 기술은 표지하지 않고 생분자간 결합을 실시간으로 모니터링한다. 리간드라 불리는 상호반응물 중 하나를 고정화된 표면 상에 직접 고정화하거나 포획하는 한편, 분석물이라 하는 다른 하나는 포획된 표면을 통해 용액으로 유동시켰다. 센서는 분석물이 리간드와 결합하여 표면 상에서 복합체를 형성할 때 센서 표면 상에서의 질량 변화를 검출한다. 이는 해리 과정에 상응한다, 해리 과정은 분석물이 완충액으로 대체되는 경우에 모니터링하였다. 친화도 비아코어 검정에서, 리간드는 항-스클레로스틴 항체이고, 분석물은 스클레로스틴이었다.
기구
비아코어 ® 3000, 비아코어 AB, 스웨덴 업살라 소재
센서 칩
CM5 (연구 등급) 카탈로그 번호: BR-1001-14, 비아코어 AB, 스웨덴 업살라 소재. 칩은 4 ℃에 저장함.
비아 중화 용액
70% (w/w) 글리세롤. 비아유지 키트 카탈로그 번호의 일부: BR-1002-51, 비아코어 AB, 스웨덴 업살라 소재. 비아유지 키트는 4 ℃에 저장함.
아민 커플링 키트
카탈로그 번호: BR-1000-5Q, 비아코어 AB, 스웨덴 업살라 소재.
에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC). 증류수 중에 75 mg/mL이 되게 하여 200 μL의 분취액으로 -70 ℃에 저장함.
N-히드록시숙신이미드 (NHS). 증류수 중에 11.5 mg/mL이 되게 하여 200 μL의 분취액으로 -70 ℃에 저장함.
1 M 에탄올아민 히드로클로라이드-NaOH (pH 8.5). 200 μL의 분취액으로 -70 ℃에 저장함.
완충액
포획 항체를 고정화시키기 위한 작업 완충액: HBS-EP (0.01 M HEPES (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20임). 카탈로그 번호: BR-1001-88, 비아코어 AB, 스웨덴 업살라 소재. 완충액은 4 ℃에 저장함.
고정화 완충액: 아세테이트 5.0 (10 mM 아세트산나트륨 (pH 5.0)임). 카탈로그 번호: BR-1003-51, 비아코어 AB, 스웨덴 업살라 소재. 완충액은 4 ℃에 저장함.
결합 검정을 위한 작업 완충액: CM-덱스트란 (카탈로그 번호 27560, 스위스 부흐스 소재의 플루카 바이오케미카(Fluka BioChemika))을 1 mg/mL로 첨가한 HBS-EP (0.01 M HEPES (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % 계면활성제 P20, 카탈로그 번호: BR-1001-88, 비아코어 AB, 스웨덴 업살라 소재임). 완충액은 4 ℃에 저장함.
리간드 포획
어피니퓨어(Affinipure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc 단편 특이성. 잭슨 이뮤노리서치 인크. (미국 펜실바니아주 소재) 카탈로그 번호: 109-006-098. 완충액은 4 ℃에 저장함.
리간드
인간화 항-인간 스클레로스틴 항체 Ab5, Ab14 및 Ab20.
분석물
재조합 인간 스클레로스틴. 분취액은 -7O ℃에 저장하고, 각 검정을 위해 1회 해동함.
재생 용액
11.6 M 원액 (영국 풀레 소재의 BDH, 카탈로그 번호: 101254H)으로부터 증류수로 희석하여 제조된 40 mM HCl.
50 mM 원액으로부터 증류수로 희석하여 제조된 5 mM NaOH. 카탈로그 번호: BR-1003-58, 비아코어 AB, 스웨덴 업살라 소재.
검정 방법
검정 형식은 고정화된 항-인간 IgG-Fc에 의한 항-스클레로스틴 항체의 포획에 이어서 포획된 표면에 대한 스클레로스틴의 적정임.
절차의 예시는 하기에 나타냈다:
BIA (비아분자 상호작용 분석)는 비아코어 3000 (비아코어 AB)을 이용하여 수행하였다. 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc 단편 특이성 (잭슨 이뮤노리서치)은 아민 커플링 화학을 통해 CM5 센서 칩 상에 포획 수준 약 4000 반응 유닛 (RU)으로 고정화되었다. 1 mg/mL CM-덱스트란을 함유한 HBS-EP 완충액 (10 mM HEPES (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EPTA, 0.005 % 계면활성제 P20, 비아코어 AB)을 작업 완충액으로서 유속 10 μl/분으로 사용하였다. 약 5 μg/mL의 항-스클레로스틴 항체 10 μl를 주사하여 고정화된 항-인간 IgG-Fc에 의한 포획에 사용하였다. 항체 포획 수준은 전형적으로 100-200 RU였다. 스클레로스틴을 포획된 항-스클레로스틴 항체에 대해 30 μL/분의 유속으로 다양한 농도로 적정하였다. 유속 10 μL/분으로 40 mM HCl를 2회 10 μL 주사하고 이어서 5 mM NaOH를 5 μL를 주사함으로써 상기 표면을 재생하였다.
배경 공제 결합 곡선은 표준 절차에 따라 비아평가 소프트웨어 (버전 3.2)를 이용하여 분석하였다. 역학 파라미터는 교정 알고리즘으로부터 결정하였다.
역학 데이타 및 계산한 해리 상수는 표 2에 나타냈다.
<표 2>
Figure 112015094068939-pat00261
실시예 12
시노몰구스 ( CYNOMOLGUS ) 원숭이에서 항- 스클레로스틴 모노클로날 항체의 생체내 검정
33마리의 약 3 내지 5년령의 암컷 시노몰구스 원숭이 (막트카 파시쿨라리스(Macctca fascicularis))를 상기 2개월간 연구에 사용하였다. 본 연구는 11 집단을 포함한다:
집단 1 : 비히클 (N=4)
집단 2: Ab-23 (N=2, 투여량 3 mg/kg)
집단 3: Ab-23 (N=3, 투여량 10 mg/kg)
집단 4: Ab-23 (N=3, 투여량 30 mg/kg)
집단 5: Ab-5 (N=3, 투여량 3 mg/kg)
집단 6: Ab-5 (N=3, 투여량 10 mg/kg)
집단 7: Ab-5 (N=3, 투여량 30 mg/kg)
집단 8: Ab-14 (N=3, 투여량 3 mg/kg)
집단 9: Ab-14 (N=3, 투여량 10 mg/kg)
집단 10: Ab-14 (N=3, 투여량 30 mg/kg)
집단 11: 부갑상선 호르몬 (1-34) [PTH (1-34)] (N=3, 투여량 10 μg/kg)
모든 투여는 피하 투여였다. PTH (1-34)를 매일 투여하고, 모노클로날 항체 (Mab)를 2회 투여하였다 (연구 개시 시점에 제1 투여 및 1개월 시점에 제2 투여). 골 파라미터 (예, 골 무기질 밀도) pQCT (말초 정량적 전산화 단층 촬영) 및 DXA (이중 에너지 X-선 흡수계측)의 평가를 위해, 연구 개시 전에 (기저값을 얻기 위해) 및 1개월 후에 (Mab의 제2 투여 전에), 및 최종적으로 추가 분석 (예, 조직형태계측 분석)을 위해 마우스를 검시하는 시점인 연구의 말미 (2개월 시점)에 스캔을 수행하였다. 동력학 조직형태계측을 위해 동물을 플루오로크롬 표지시켰다 (제14일, 제24일, 제47일 및 제57일). 혈청을 본 연구 동안 다양한 시점에 수집하였다 [제1일 예비-투여 (제1 Mab 투여일), 제1일 투여 후 12시간, 제2일, 제3일, 제5일, 제7일, 제14일, 제21일, 제28일, 제29일 투여 후 12시간 (제29일은 제2 및 최종 Mab 투여일임), 제30일, 제31일, 제33일, 제35일, 제42일, 제49일 및 제56일].
상업적으로 입수가능한 키트를 이용하여 3종의 골-관련 혈청 생체마커를 측정하였다:
오스테오칼신 ( OC ) (DSL 오스테오칼신 방사선면역검정 키트; 미국 텍사스주 웹스터 소재의 다이아그노스틱 시스템즈 래보라토리즈, 인크.(Diagnostic Systems Laboratories, Inc.))
제I형 프로콜라겐의 N-말단 프로펩티드 ( P1NP ) (P1NP 방사선면역검정 키트; 필란드 에스푸 소재의 오리온 다이아그노스틱카(Orion Diagnostica))
콜라겐 제I형 알 사슬의 C- 텔로펩티드 단편 ( sCTXI ) (세럼 크로스랩스(Serum CrossLaps®) ELISA; 덴마크 헬레브 소재의 노르딕 바이오사이언스 다이아그노스틱스 AJS(Nordic Bioscience Diagnostics AJS))
pQCT 및 DXA 스캔은 다수의 골격 부위 (경골 골간단 및 골간, 방사상 골간단 및 골간, 대퇴골 경부, 요추골 포함)를 횡단하여 다양한 골 파라미터 (골 무기질 밀도 (BMD) 및 골 무기질 함량 포함)에 대한 데이타를 수득하였다. 골 데이타 (각 동물에 대한 기저선으로부터의 변화율) 및 동화 (OC, P1NP) 혈청 생체마커 데이타 (각 동물에 대한 기저선으로부터의 변화율)의 분석은, 비히클 집단에 비해, 각 Mab에 대한 특정 시점 및 투여량의 특정 파라미터에서 통계학상 유의적인 증가를 나타냈다. 이러한 골 파라미터 데이타, 혈청 생체마커 데이타, 뿐만 아니라 조직형태계측 데이타는 각 3 Mab (Ab-23, Ab-5 및 Ab-14)가 시노몰구스 원숭이에서 스클레로스틴을 중화시킬 수 있음을 나타냈다. 이러한 활성은 Ab-23 및 Ab-5에 대해, 특히 가장 높은 투여량 (30 mg/kg)에서, 골 형성 (동화 효과)에서의 명백한 증가 뿐만 아니라 골에서 알짜 이익 (예, BMD)을 가지면서 가장 왕성하였다. 골 파라미터 및 동화 조직형태계측 파라미터에서 통계학상 유의적인 증가를 양성 대조군 집단 (PTH (1-34))에 대해 또한 발견하였다.
혈청 골 형성 마커 (P1NP, 오스테오칼신)는 다양한 시점 및 투여량에서, 특히 Ab-23 및 Ab-5에 대해 30 mg/kg 집단에서 증가하였다 (p<0.05 대 비히클 (VEH)). 조직형태계측 분석은, Ab-23 및 Ab-5의 가장 높은 투여량에서, 요부 척추골 및 근위 경골 (5-배 이하 증가) 및 대퇴골 골간의 내피질 표면 (10-배 이하 증가)의 해면골에서 골 형성 비율에 있어서 현저한 증가 (p<0.05 대 VEH)를 나타냈다. 잔기둥 두께는 요추골에서 높은 투여량의 Ab-23 및 Ab-5를 사용하여 증가되었다 (>60%, p<0.05 대 VEH). 연구 말미 (2개월)에, 기저선으로부터의 변화율로서 면적 BMD는 대퇴골 경부, 원위요골 (Ab-23, 30 mg/kg) 및 요추골 (Ab-5, 30 mg/kg)에서 증가하였다 (p<0.05 대 VEH). 요추골에서 면적 BMD의 증가는 척추골 강도 (Ab-23에 대해 척추골 최대 하중에 있어서 97% 증가, 30 mg/kg; p<0.05 대 VEH)의 증가를 수반하였으며; Mab 투여전 요부 면적 BMD에 대한 기저값은 모든 집단에 대해 통계학적으로 유사하였다. 요약하자면, 시노골구스 원숭이에서 스클레로스틴-중화 Mab의 단기간 투여는 부분적으로 골 형성, BMD 및 척추골 골 강도를 증가시켰다.
상기로부터, 본 발명의 특정 실시양태는 예시 목적을 위해 본원에 기재되었지만, 다양한 변형이 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않는 한 행해질 수 있다. 따라서, 본 발명은 첨부되는 청구의 범위를 제외하고는 제한되지 않는다. 본원에 개시된 모든 출원, 공개 특허 출원, 및 특허 문헌은 참고로 본원에 포함된다.
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gggcttcagt gaagatatct 120 tgtaaggctt ctggatacac attcactgac cactacatga gctgggtgaa gcagagtcat 180 ggaaaaagcc ttgagtggat tggagatatt aatccctatt ctggtgaaac tacctacaac 240 cagaagttca agggcacggc cacattgact gtagacaagt cttccagtat agcctacatg 300 gagatccgcg gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag agatgattac 360 gacgcctctc cgtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgcagccaaa 420 acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg 480 gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 540 tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 600 actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc 660 aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 720 ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 780 aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 840 atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 900 acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc 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ttgccaacag ggtgatacgc ttccgtacac gttcgggggg 360 gggaccaagc tggaaataag acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705 <210> 153 <211> 447 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 153 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Asn Gln Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Val Tyr Asp Gly Ser Tyr Glu Asp Trp 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tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gacagttgag 660 cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa cagcacgttc 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccat gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa a 1341 <210> 235 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 235 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu 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gagctgagca gcctgcgctc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgcg ttcgatttat 360 tactacgatg ccccgtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctctagtgcc 420 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 720 tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga 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ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 540 actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc 600 aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 660 ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 720 aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 780 atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 840 acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 900 cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 960 gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1020 ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1080 acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1140 cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc 1200 atctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1260 tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1320 ggtaaatga 1329 <210> 362 <211> 461 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 362 Met Gly Trp Ser Ser Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe 35 40 45 Thr Thr Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Met Ile His Pro Ser Ala Ser Glu Ile Arg Leu Asp 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Gly Pro Thr Ser Val Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Glu Trp Gly Ser Met Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 130 135 140 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val 145 150 155 160 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro 195 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ttattgccag cagtggacca ccacctatac ctttggccag 300 ggcaccaaac tggaaattaa acgt 324 <210> 374 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 374 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Asp Asn Gly Glu Ser Thr Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Asp Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Val Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 375 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 375 gaagtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cgagcggctt taacattaaa gattattata ttcattgggt gcgccaggcg 120 ccgggccagg gcctggaatg gatgggccgc attgatccgg ataacggcga aagcacctat 180 gtgccgaaat ttcagggccg 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tgcattgggt aagacaagcg 120 ccaggacaag gattggaatg gatgggcgaa attaacccta atagtggagg agcaggctac 180 aatcaaaaat tcaaagggag agttacaatg acaacagaca caagcacttc aacagcatat 240 atggaactgc gatcacttag aagcgacgat acagctgtat actattgcgc acgacttggg 300 tatgatgata tatatgatga ctggtatttc gatgtttggg gccagggaac aacagttacc 360 gtctctagt 369 <210> 380 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 380 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Phe Phe Pro 85 90 95 Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 381 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 381 gacatccagc tgacccagag ccccagcttc ctttccgcat ccgttggtga ccgagtaaca 60 atcacatgcc gcgcctcatc ttcagttaca tcttcttatc ttaattggta tcaacaaaaa 120 ccaggaaaag cacctaaact tcttatatac tctacatcta atctcgcatc aggagttccc 180 tctcgatttt caggatctgg atcaggcaca gaatttacac ttactatatc atcactccaa 240 ccagaagact tcgccactta ttactgccaa caatacgatt tttttccaag cacattcgga 300 ggaggtacaa aagtagaaat caag 324 <210> 382 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 382 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Thr Tyr Asn His Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Ala Val Ile Thr Thr Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 383 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 383 gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtcaagaaac ctggagcaag cgtaaaggtt 60 agttgcaaag catctggata cacatttacc gactactaca tgaattgggt acgacaagcc 120 cctggacaaa gacttgaatg gatgggagac attaaccctt ataacgacga cactacatac 180 aatcataaat ttaaaggaag agttacaatt acaagagata catccgcatc aaccgcctat 240 atggaacttt cctcattgag atctgaagac actgctgttt attactgtgc aagagaaact 300 gccgttatta ctactaacgc tatggattac tggggtcaag gaaccactgt taccgtctct 360 agt 363 <210> 384 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 384 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Thr Ile Ser Ser Asn 20 25 30 His Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 385 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 385 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctctcagcat ccgtaggcga tagagttaca 60 ataacatgca gcgtatcatc aactatatca tcaaatcatc ttcattggtt ccaacagaaa 120 cccggcaaag cacctaaatc acttatatac ggcacatcaa atctcgcatc aggcgttcct 180 tcaagatttt caggctctgg ctcaggcacc gactttactc ttacaatatc ctccctccaa 240 cccgaagact tcgcaaccta ttactgtcaa caatggtcct catatccact cacatttggc 300 ggcggcacaa aagtagaaat taaa 324 <210> 386 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 386 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Phe Asn Ile Lys Asp Phe 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Leu Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Phe His Asp Gly Thr Ser Tyr Trp Tyr Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 387 <211> 375 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 387 gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctgactt caacattaaa gacttctatc tacactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gattggaagg attgatcctg agaatggtga tactttatat 180 gacccgaagt tccaggacaa ggtcaccatg accacagaca cgtccaccag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaggcg 300 gattatttcc acgatggtac ctcctactgg tacttcgatg tctggggccg tggcaccctg 360 gtcaccgtct ctagt 375 <210> 388 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 388 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asp Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 389 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 389 gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gggccagctc aagtataagt tacatacact ggtatcagca aaaaccaggg 120 aaagccccta agctcctgat ctatgccaca tccaacctgg cttctggggt cccatcaagg 180 ttcagcggca gtggatctgg gacagaattc actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa 240 gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtgacc cactcacgtt cggcggaggg 300 accaaggtgg agatcaaa 318 <210> 390 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 390 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Val Asp Pro Asp Asn Gly Glu Thr Glu Phe Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Pro Gly Lys Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Thr Tyr Thr Trp Phe Pro Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 391 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 391 gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggatt cgacattaag gactactata tacactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatcggaagg gttgatcctg acaatggtga gactgaattt 180 gccccgaagt tcccgggcaa ggtcaccatg accacagaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaagac 300 tacgatggta cctacacctg gtttccttat tggggccaag ggactctggt caccgtctct 360 agt 363 <210> 392 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 392 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ala Gly Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Tyr Asp Asp Ile Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val 195 200 205 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys 210 215 220 Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 393 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 393 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Thr Tyr Asn His Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Ala Val Ile Thr Thr Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 210 215 220 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 394 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 394 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Phe Asn Ile Lys Asp Phe 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Leu Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Phe His Asp Gly Thr Ser Tyr Trp Tyr Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 130 135 140 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys 195 200 205 Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu 210 215 220 Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly 450 <210> 395 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 395 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Val Asp Pro Asp Asn Gly Glu Thr Glu Phe Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Pro Gly Lys Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Thr Tyr Thr Trp Phe Pro Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 210 215 220 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 396 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 396 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ile Tyr Tyr Tyr Asp Ala Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 210 215 220 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445

Claims (43)

  1. 서열 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 서열 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 서열 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 서열 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함하고, 동물에게 투여시에 서열 1의 스클레로스틴에 특이적이고 서열 1의 스클레로스틴에 1 x 10-7M 이하의 결합 친화도(Kd)로 결합하는 항체를 유발하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 서열 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 서열 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 서열 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 갖는 조성물이며, 여기서 서열 2 및 서열 4는 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 57 및 111에서의 디술피드 결합에 의해 연결되어 있고, 서열 3 및 서열 5는 (a) 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 82 및 142에서의 디술피드 결합, 및 (b) 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 86 및 144에서의 디술피드 결합 중 1개 이상에 의해 연결되어 있으며, 상기 펩티드들이 서열 1의 인간 스클레로스틴의 트립신 소화에 의해 수득되고 인간 스클레로스틴의 상응하는 영역의 3차 구조를 보유하는 것인 조성물.
  3. 서열 70의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 서열 71의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 서열 72의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 서열 73의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 갖는 조성물이며, 여기서 서열 72 및 서열 73은 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 57 및 111에서의 디술피드 결합에 의해 연결되어 있고, 서열 70 및 서열 71은 (a) 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 82 및 142에서의 디술피드 결합, 및 (b) 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 86 및 144에서의 디술피드 결합 중 1개 이상에 의해 연결되어 있는 것인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 비인간 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법.
  5. (i) 서열 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 서열 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 서열 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 서열 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드로 이루어지고, 여기서 서열 2 및 서열 4는 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 57 및 111에서의 디술피드 결합에 의해 연결되어 있고, 서열 3 및 서열 5는 (a) 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 82 및 142에서의 디술피드 결합, 및 (b) 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 86 및 144에서의 디술피드 결합 중 1개 이상에 의해 연결되어 있는 것인 펩티드, 또는
    (ii) 서열 70의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 서열 71의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 서열 72의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 서열 73의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드로 이루어지고, 여기서 서열 72 및 서열 73은 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 57 및 111에서의 디술피드 결합에 의해 연결되어 있고, 서열 70 및 서열 71은 (a) 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 82 및 142에서의 디술피드 결합, 및 (b) 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 86 및 144에서의 디술피드 결합 중 1개 이상에 의해 연결되어 있는 것인 펩티드
    에 결합하는 항체이며, 상기 (i) 또는 (ii)의 펩티드에 1 x 10-7M 이하의 결합 친화도(Kd)로 결합하는 항체.
  6. 제5항에 있어서, 서열 6의 에피토프에도 결합하는 항체.
  7. 제5항에 있어서, 항체 Ab-C, Ab-D, Ab-2, Ab-3, Ab-11, Ab-13, Ab-14, Ab-15 또는 Ab-16과 서열 1의 스클레로스틴의 결합을 교차-차단(cross-block)하고/하거나 항체 Ab-C, Ab-D, Ab-2, Ab-3, Ab-11, Ab-13, Ab-14, Ab-15 또는 Ab-16에 의해 서열 1의 스클레로스틴과의 결합이 교차-차단되는 항체이며,
    여기서 항체 Ab-C가 서열 15에 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 19에 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것이고,
    항체 Ab-D가 서열 7에 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 19에 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것이고,
    항체 Ab-2가 서열 117에 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 121에 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것이고,
    항체 Ab-3이 서열 125에 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 129에 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것이고,
    항체 Ab-11이 서열 189에 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 193에 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것이고,
    항체 Ab-13이 서열 205에 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 209에 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것이고,
    항체 Ab-14가 서열 213에 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 217에 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것이고,
    항체 Ab-15가 서열 221에 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 225에 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것이고,
    항체 Ab-16이 서열 229에 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 233에 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인
    항체.
  8. 스클레로스틴 폴리펩티드에 1 x 10-7M 이하의 결합 친화도(Kd)로 결합하는 항체이며, 상기 폴리펩티드가 서열 2의 아미노산 서열, 서열 3의 아미노산 서열, 서열 4의 아미노산 서열 및 서열 5의 아미노산 서열로 이루어지며, 여기서 서열 2 및 서열 4는 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 57 및 111에서의 디술피드 결합에 의해 연결되어 있고, 서열 3 및 서열 5는 (a) 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 82 및 142에서의 디술피드 결합, 및 (b) 서열 1을 참조하면 아미노산 위치 86 및 144에서의 디술피드 결합 중 1개 이상에 의해 연결되어 있으며, 상기 폴리펩티드가 인간 스클레로스틴의 상응하는 영역의 3차 구조를 보유하는 것인, 항체.
  9. a) 서열 48, 49 및 50의 CDR 서열 및 서열 45, 46 및 47의 CDR 서열;
    b) 서열 42, 43 및 44의 CDR 서열 및 서열 39, 40 및 41의 CDR 서열;
    c) 서열 278, 279 및 280의 CDR 서열 및 서열 290, 291 및 292의 CDR 서열;
    d) 서열 284, 285 및 286의 CDR 서열 및 서열 296, 297 및 298의 CDR 서열;
    e) 서열 275, 276 및 277의 CDR 서열 및 서열 287, 288 및 289의 CDR 서열; 또는
    f) 서열 281, 282 및 283의 CDR 서열 및 서열 293, 294 및 295의 CDR 서열
    을 포함하는 항체.
  10. 제9항에 있어서, (a) 서열 129에 제공된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 및 서열 125에 제공된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 경쇄;
    (b) 서열 225 또는 394에 제공된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 및 서열 221에 제공된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 경쇄;
    (c) 서열 209에 제공된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 및 서열 205에 제공된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 경쇄;
    (d) 서열 217 또는 393에 제공된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 및 서열 213에 제공된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 경쇄;
    (e) 서열 19에 제공된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 및 서열 15에 제공된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 경쇄; 또는
    (f) 서열 11에 제공된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 및 서열 7에 제공된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 경쇄
    를 포함하는 항체.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물에서 골 형성, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량, 골 질량, 골 질 및 골 강도 중 하나 이상을 증가시킬 수 있고/있거나 세포 기재의 무기질침착 검정에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단할 수 있는 항체.
  12. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체인 항체.
  13. 제12항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 이뮤노글로불린인 항체.
  14. 제12항에 있어서, IgG 항체인 항체.
  15. 제12항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  16. 제12항에 있어서, 키메라 항체 또는 인간 항체인 항체.
  17. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편인 항체.
  18. 제17항에 있어서, 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc 또는 Fd 단편을 포함하는 항체.
  19. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항체.
  20. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합된 항체.
  21. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 스클레로스틴에 1 x 10-7M 이하의 결합 친화도(Kd)로 결합하는 항체.
  22. 제8항에 있어서, 인간화된 항체.
  23. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 이펙터(effector) 또는 리포터 분자가 부착된 항체.
  24. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  25. 제24항의 폴리뉴클레오티드를 하나 이상 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  26. 제25항에 있어서, 서열 126, 128, 130, 132, 222, 224, 226, 228, 385, 387, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 381 및 383으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  27. 제25항에 따른 클로닝 또는 발현 벡터를 하나 이상 포함하는 숙주 세포.
  28. 제27항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법.
  29. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체를 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 포함하는, 포유동물에서 낮은 골 무기질 밀도 또는 골 손실을 치료하기 위한 조성물.
  30. 제8항 또는 제10항의 항체를 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 포함하는, 골다공증 또는 골감소증을 치료하기 위한 조성물.
  31. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 진단 키트.
  32. 제9항에 있어서, IgG 항체인 항체.
  33. 제32항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  34. 제32항에 있어서, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 항체.
  35. 제9항에 있어서, 항체 단편인 항체.
  36. 제35항에 있어서, 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc 또는 Fd 단편을 포함하는 항체.
  37. 제9항에 있어서, 단리된 항체.
  38. 제9항에 있어서, 재조합된 항체.
  39. 제9항의 항체를 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 포함하는, 포유동물에서 낮은 골 무기질 밀도 또는 골 손실을 치료하기 위한 조성물.
  40. 제9항의 항체를 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 포함하는, 골다공증 또는 골감소증을 치료하기 위한 조성물.
  41. 제39항에 있어서, 포유동물이 폐경후 여성인 조성물.
  42. 제29항에 있어서, 포유동물이 폐경후 여성인 조성물.
  43. 제21항에 있어서, 인간 스클레로스틴에 1 x 10-8 M 이하의 결합 친화도(Kd)로 결합하는 항체.
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