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BRPI0610197A2 - agentes de ligação de esclerostina - Google Patents

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BRPI0610197A2
BRPI0610197A2 BRPI0610197-6A BRPI0610197A BRPI0610197A2 BR PI0610197 A2 BRPI0610197 A2 BR PI0610197A2 BR PI0610197 A BRPI0610197 A BR PI0610197A BR PI0610197 A2 BRPI0610197 A2 BR PI0610197A2
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BR
Brazil
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seq
cdr
bone
disease
binding agent
Prior art date
Application number
BRPI0610197-6A
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English (en)
Inventor
Christopher Paszty
Martyn Kim Robinson
Kevin Graham
Alistair James
Kelly Sue Hoffmann
John Latham
Alastair Lawson
Hsieng Sen Lu
Andy Popplewell
Wenyan Shen
David Winkler
Aaron George Winters
Original Assignee
Ucb Pharma Sa
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Application filed by Ucb Pharma Sa, Amgen Inc filed Critical Ucb Pharma Sa
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Publication of BRPI0610197A2 publication Critical patent/BRPI0610197A2/pt
Publication of BRPI0610197B1 publication Critical patent/BRPI0610197B1/pt
Publication of BRPI0610197B8 publication Critical patent/BRPI0610197B8/pt

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Abstract

São descritas composições e métodos relacionados, aos epítopos da proteína esclerostina, e agentes de ligação de esclerostina, tais como anticorpos capazes de se ligarem à esclerostina.

Description

"AGENTES DE LIGAÇÃO DE ESCLEROSTINA"
Campo Técnico
A presente invenção se refere geralmente a epito-pos de proteína esclerostina, incluindo proteína esclerosti-na humana, e agentes de ligação (como anticorpos) capazes deligação à esclerostina ou fragmentos.
Antecedentes da Invenção
Duas ou três fases distintas de alterações em mas-sa óssea ocorrem ao longo da vida de um indivíduo (vejaRiggs, West J, Med. 154:63-77 (1991)). A primeira fase ocor-re tanto em homens como em mulheres e procede à realizaçãode um pico de massa óssea. Esta primeira fase é obtida pormeio do crescimento linear das placas de crescimento endo-condral e crescimento radial, devido - a uma taxa de aposiçãodo periósseo. A segunda fase começa em torno de 30 anos deidade para a ossos trabeculares (ossos planos como as vérte-bras e pelve) e cerca de 40 anos de idade para ossos corti-cais (por exemplo, ossos longos encontrados nos membros) econtinua durante a velhice. Esta fase caracteriza-se porlenta perda óssea e ocorre tanto nos homens como nas mulhe-res. Nas mulheres, uma terceira fase de perda óssea tambémocorre, muito provavelmente devido a deficiência de estrogê-nio pós-menopausa. Durante esta fase apenas, como mulherespodem perder uma massa óssea adicional de osso cortical e docompartimento trabecular (veja Riggs, supra).
A perda do conteúdo mineral ósseo pode ser causadapor uma grande variedade de condições e pode resultar emproblemas médicos significativos. Por exemplo, a osteoporoseé uma doença debilitante em seres humanos e é caracterizadapor diminuição da massa óssea no esqueleto e densidade mine-ral, a deterioração estrutural do osso, incluindo a degrada-ção da microarquitetura óssea e o correspondente aumento nafragilidade óssea (ou seja, diminui a força óssea), e sus-ceptibilidade à fratura em indivíduos afetados. A osteoporo-se em seres humanos é geralmente precedida pelo osteopeniaclinica (densidade mineral óssea, que é superior a um desviopadrão, mas menos de 2,5 desvios padrão abaixo do valor mé-dio para osso adulto jovem) , uma condição encontrada em a-proximadamente 25 milhões de pessoas nos Estados Unidos. Ou-tros 7-8 milhões de pacientes nos Estados Unidos foram diag-nosticados com osteoporose clinica (definida como conteúdomineral ósseo superior a 2,5 desvios padrão abaixo do queosso adulto jovem maduro). A freqüência de ocorrência de os-teoporose na população humana aumenta com a idade. Entrecaucasianos, a osteoporose é predominante em mulheres que,nos Estados Unidos, compreende a 80% do grupo de pacientescom osteoporose. A maior fragilidade e suscetibilidade àfratura do osso esquelético no envelhecida é agravada pelomaior risco de quedas acidentais nesta população. Quadris,punhos, e vértebras fraturadas estão entre como as lesõesmais comuns associadas com osteoporose. As fraturas de qua-dril em particular são extremamente desconfortáveis e caraspara o doente, e para como mulheres, se relacionam com altastaxas de mortalidade e morbilidade.
Embora a osteoporose tenha sido considerada comoum aumento do risco de fraturas devido à diminuição da massaóssea, alguns dos tratamentos atualmente disponíveis paraperturbações esqueléticas podem aumentar a densidade ósseade adultos, bem como a maioria dos tratamentos disponíveisatualmente trabalham principalmente através da inibição dareabsorção óssea mais, Em vez de estimular a nova formaçãoóssea. 0 estrogênio está agora sendo prescrito para retardara perda óssea. No entanto, existe alguma controvérsia sobrese os doentes ganham qualquer benefício a longo prazo e se oestrogênio tem qualquer efeito sobre doentes com mais de 75anos de idade. Além disso, acredita-se que o uso de estrogê-nio aumente o risco de câncer da mama e endométrio. A calci-tonina, osteocalcina com vitamina K, ou altas doses de cál-cio dietário, com ou sem vitamina D, também foram sugeridospara mulheres pós-menopáusicas. Altas doses de cálcio, noentanto, têm freqüentemente efeitos gastrintestinais secun-dários indesejáveis, e os níveis de cálcio sérico e urináriodevem ser continuamente controlados (por exemplo, Khosla eRiggs, Mayo Clin. Proc. 70:978982, 1995). Outras abordagensterapêuticas atuais para a osteoporose incluem bifosfonatos(por exemplo, Fosamax ™, Actonel ™, Bonviva ™, Zometa ™, ol-padronato, neridronato, skelid, bonefos), hormônio parati-roidiano, calcilíticos, calcimiméticos (por exemplo, Cina-calcet), estatinas, esteróides anabolizantes, sais de lantâ-nio e estrôncio, e fluoreto de sódio. Esses tratamentos, noentanto, são muitas vezes associados a efeitos secundáriosindesejáveis (veja Khosla e Riggs, supra). A esclerostina, oproduto do gene SOST, está ausente em esclerosteose, uma do-ença esquelética caracterizada por super-crescimento do ossoe ossos fortemente densos (Brunkow et al., Am. J. Hum. Ge-; net, 68:577-589, 2001; Balemans et al. , Hum. Mol. Genet,10:537-543, 2001). A seqüência de aminoácidos da esclerostina humana é relatada por Brunkow et al. ibid e é divulgadaaqui como SEQ ID n° . : 1.
Breve Resumo da Invenção
São divulgadas aqui composições e métodos que po-dem ser utilizados para aumentar pelo menos um entre forma-ção óssea, densidade mineral óssea, conteúdo mineral ósseo,massa óssea, qualidade óssea e força óssea, e que, portanto,podem ser utilizados para tratar uma ampla variedade de con-dições de que um aumento de pelo menos um entre formação ós-sea, densidade mineral óssea, conteúdo mineral ósseo, massaóssea, qualidade óssea e força óssea é desejável. A presenteinvenção também oferece outras vantagens relacionadas des-critas aqui.
A invenção se refere às regiões (epitopos) da es-clerostina humana reconhecidas pelos agentes de ligação di-vulgados aqui, métodos para a utilização desses epitopos, emétodos de produção desses epitopos.
A invenção também se relaciona a epitopos especí-ficos para a região de esclerostina identificados como volta2, e agentes de ligação, que se ligam especificamente paraaquela região.
A invenção também se relaciona a epitopos especí-ficos para a região de nó de cistina de esclerostina, e a-gentes de ligação tais como anticorpos que se ligam especi-ficamente com aquela região.A invenção se relaciona a agentes de ligação, taiscomo anticorpos, que se ligam especificamente à esclerosti-na. Os agentes de ligação podem ser caracterizados pela suacapacidade de bloquear de modo cruzado a ligação de pelo me-nos um anticorpo divulgado aqui para esclerostina e/ou a serbloqueado de modo cruzado a partir da ligação à esclerostinapor pelo menos um anticorpo divulgado aqui. Os anticorpos eoutros agentes de ligação também podem ser caracterizadospelo seu caráter de ligação padrão para peptideos de escle-rostina humana em um "ensaio de ligação de concorrência doepitopo de peptideo de esclerostina humana", como divulgadosaqui.
A invenção se relaciona a agentes de ligação, taiscomo anticorpos, que podem contribuir para aumentar pelo me-nos um de formação óssea, densidade mineral óssea, conteúdomineral ósseo, massa óssea, qualidade óssea e força óssea emum mamífero.
A invenção se relaciona a agentes de ligação, taiscomo anticorpos, que podem bloquear o efeito inibitório daesclerostina em um ensaio de mineralização com base na célu-la.
A invenção ainda se refere a construção de um po-lipeptideo composto por dois, três ou quatro fragmentos po-lipeptidicos ligados por pelo menos uma ligação dissulfeto,o que representa uma região central de nó de cistina de es-clerostina, e anticorpos capazes de se ligar especificamenteaos mesmos.
A invenção se refere a métodos de obtenção de epi-topos adequados para o uso como imunogênios para gerar, emmamíferos, agentes de ligação, tais como anticorpos capazesde se ligar especificamente à esclerostina; em certas moda-lidades os agentes de ligação gerados são capazes de neutra-lizar a atividade da esclerostina in vivo.
A invenção se refere a uma composição para obterum anticorpo especifico para esclerostina quando a composi-ção é administrada a um animal, o que inclui uma composiçãopolipeptideo tendo seqüência de aminoácidos da SEQ ID n° . :6, SEQ ID n°.: 63, SEQ ID n° . : 64, SEQ ID n°.: 65, SEQ IDn°.: 66, SEQ ID n°.: 67, SEQ ID n°.: 68, ou SEQ ID n°.: 69.
A invenção também se refere a uma composição paraobter um anticorpo especifico para esclerostina quando acomposição é administrada a um animal, a composição compre-endendo pelo menos um polipeptideo constituído essencialmen-te da seqüência de aminoácidos SEQ ID n°.: 2, SEQ ID n°.: 3,SEQ ID n° . : 4 ou SEQ ID n° . : 5, a composição pode incluirpelo menos dois ou pelo menos três das seqüências de aminoá-cidos SEQ ID n°.: 2, SEQ ID n°.: 3, SEQ ID n°.: 4 e SEQ IDn° . : 5, a composição pode incluir todos os quatro das se-qüências de aminoácidos SEQ ID n°.: 2, SEQ ID n°.: 3, SEQ IDn° . : 4 e SEQ ID n°. : 5.
A invenção se refere ainda a uma composição paraobter um anticorpo especifico para esclerostina quando acomposição é administrada a um animal, a composição incluaum polipeptideo com as seqüências de aminoácidos de SEQ IDn°.: 2, SEQ ID n° . : 3, SEQ ID n° . : 4 e SEQ ID n° . : 5, ondeSEQ ID n° . : 2 e 4 estão ligados por uma ligação dissulfetonas posições de aminoácidos 57 e 111 com referência à SEQ IDn°.: 1, e SEQ ID n°.: 3 e 5 são ligados por pelo menos um de(a) uma ligação dissulfeto nas posições de aminoácidos 82 e142 com referência à SEQ ID n° . : 1, e (b) uma ligação dis-sulfeto nas posições de aminoácidos 86 e 144 com referênciaà SEQ ID n° . : 1; o polipeptideo Podem manter a estrutura doterciário correspondente polipeptideo região de esclerostinahumana de SEQ ID n°.: 1.
A invenção também se refere ao polipeptideo T20.6constituído essencialmente de um multiplicar truncado prote-ína esclerostina humana de SEQ ID n° . : 1, onde aminoácidos1-50, 65-72, 91-100, 118-137 e 150-190 da SEQ ID n° . : 1 es-tão ausentes da polipeptideo; este polipeptideo pode ser ob-tido por digestão triptica de esclerostina humana, e comoproteínas podem ser isolados por fracionamento HPLC.
A invenção ainda se refere a porção imunogênicaT20.6 de esclerostina humana compreendendo aminoácidos 51-64, 73-90, 101-117 e 138-149 da SEQ ID n°.: 1, onde a porçãoimunogênica compreende pelo menos um dos seguintes:
(a) uma ligação dissulfeto entre os aminoácidos 57e 111;
(b) uma ligação dissulfeto entre os aminoácidos 82e 142; e
(c) uma ligação dissulfeto entre os aminoácidos 86e 144;
a porção imunogênica pode ter pelo menos duas des-tas ligações dissulfeto; e a porção imunogênica pode ter astrês ligações dissulfeto.A invenção ainda se refere a uma porção imunogêni-ca T20.6 derivada de esclerostina humana compreendendo ami-noacidos 57-64, 73-86, 111-117 e 138-144 da SEQ ID n° . : 1,onde a porção imunogênica compreende pelo menos um dos :
(a) uma ligação dissulfeto entre os aminoacidos 57 e 111;
(b) uma ligação dissulfeto entre os aminoacidos 82 e 142; e
(c) uma ligação dissulfeto entre os aminoacidos 86 e 144;
a porção imunogênica pode ter pelo menos duas des-tas ligações dissulfeto; e a porção imunogênica pode ter to-dos as três ligações dissulfeto.
A invenção ainda se refere a um polipeptideo cons-tituido essencialmente de uma proteina esclerostina humanade SEQ ID n° . : 1 truncada nas extremidades do terminal C eterminal N, onde os aminoacidos 1-85 e 112-190 da SEQ IDn° . : 1 estão ausentes do polipeptideo.
A invenção também se relaciona a uma porção de es-clerostina humana imunogênica, compreendendo aminoacidos 86-111 de SEQ ID n°.: 1; a porção imunogênica pode ser consti-tuída essencialmente por aminoacidos contíguos CGPARLLPNAI-GRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID n°.: 6).
A invenção ainda se refere a uma porção imunogêni-ca de esclerostina de ratos, compreendendo aminoacidos 92-109 de SEQ ID n°.: 98; a porção imunogênica pode ser consti-tuída essencialmente por aminoacidos contíguos PNAIGRVKW-WRPNGPDFR (SEQ ID n°.: 96).A invenção ainda se refere a uma porção imunogêni-ca de esclerostina de ratos, compreendendo aminoácidos 99-120 de SEQ ID n°.: 98; a porção imunogênica pode ser consti-tuída essencialmente por. aminoácidos contíguos KWWRPNGPDFR- CIPDRYRAQRV (SEQ ID n°.: 97).
A invenção se refere a um método de produzir umaporção de esclerostina humana imunogênica, compreendendo asetapas de:
(a) tratamento da esclerostina humana para conse-guir completar a digestão triptica;
(b) coleta da amostra da digestão triptica com pe-so molecular médio de 7122,0 Daltons (massa teórica 7121,5Daltons) ou tempo de retenção de cerca de 20,6 minutos, con-forme determinado por eluição de uma HPLC de coluna de fasereversa com gradiente linear de ácido trifluoracético 0,05%para acetonitrila 90% em TFA 0,05% com uma taxa de fluxo de0,2 mL/min; e
(C) purificar a porção imunogênica.
A invenção se refere a um método de produção de umanticorpo capaz de ligar especificamente com esclerostina,incluindo:
(a) imunizar um animal com uma composição que in-clui um polipeptideo de SEQ ID n° . : 6, SEQ ID n° . : 63, SEQID n°.: 64, SEQ ID n°.: 65, SEQ ID n°.: 66, SEQ ID n°. : 67,SEQ ID n°.: 68, SEQ ID n°.: 69, SEQ ID n°.: 96, ou SEQ IDn°.: 97;
(b) coletar o soro do animal; e
(c) isolar um anticorpo sérico capaz de ligar es-pecificamente com esclerostina.
A invenção também se refere a um método de produ-ção de um anticorpo capaz de ligar especificamente com es-clerostina, o método inclui:
(a) imunizar um animal com uma composição que in-clui polipeptideo T20.6 ou um derivado da T20.6;
(b) coletar o soro do animal; e
(c) isolar um anticorpo sérico capaz de ligar es-pecificamente com esclerostina.
A invenção ainda se refere a um método de detecçãode um anticorpo anti-esclerostina em uma amostra biológica,compreendendo as etapas de
(a) contatar a amostra biológica com um polipepti-deo constituído essencialmente por SEQ ID n° . : 6, SEQ IDn°.: 63, SEQ ID n°.: 64, SEQ ID n°.: 65, SEQ ID n°.: 66, SEQID n°.: 67, SEQ ID n°.: 68, SEQ ID n°.: 69, SEQ ID n°.: 96,ou SEQ ID n°.: 97, em condições que permitam um complexo demodo a formar entre os anticorpos e o polipeptideo; e
(b) detectar a presença ou ausência do complexo,onde a presença do complexo indica que a amostra biológicacontém um anticorpo anti-esclerostina.
A invenção também se refere a um método de detec-ção de um anticorpo anti-esclerostina em uma amostra bioló-gica, compreendendo as etapas de
(a) contatar a amostra biológica com polipeptideoT20.6 ou um derivado da T20.6 em condições que permitam umcomplexo de modo a formar entre os anticorpos e o polipepti-deo; e(b) detectar a presença ou ausência do complexo,onde a presença do complexo indica que a amostra biológicacontém um anticorpo anti-esclerostina.
A invenção ainda se refere a um agente de ligaçãoà esclerostina, como um anticorpo, que bloqueia de modo cru-zado a ligação de pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B,Ab-C, ou Ab-D para uma proteina esclerostina. o agente deligação à esclerostina pode também ser bloqueado de modocruzado desde a ligação à esclerostina em pelo menos um dosanticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, ou Ab-D. O anticorpo isolado,ou um fragmento ligado ao antigeno, pode ser um anticorpopoliclonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humaniza-do, um anticorpo humano, um anticorpo quimérico ou similar.
A invenção ainda se refere a um agente de ligaçãoà esclerostina, como um anticorpo, que é impedido de ligarde modo cruzado à esclerostina em pelo menos um dos anticor-pos Ab-A, Ab-B, Ab-C, ou Ab-D. O anticorpo isolado, ou umfragmento ligado ao antigeno, pode ser um anticorpo policlo-nal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, umanticorpo humano, um anticorpo quimérico ou similar.
A invenção ainda se refere a um agente de ligaçãoà esclerostina, como um anticorpo isolado, que bloqueia demodo cruzado a ligação de pelo menos um dos anticorpos 1.24(Ab-1 a Ab-24) a uma proteina esclerostina. O agente de li-gação à esclerostina pode também ser bloqueado de modo cru-zado da ligação à esclerostina em pelo menos um dos anticor-pos 1.24 (Ab-1 a Ab-24). O anticorpo isolado, ou um fragmen-to ligado ao antigeno, pode ser um anticorpo policlonal, umanticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpohumano, ou um anticorpo quimérico.
A invenção ainda se refere a um agente de ligaçãoà esclerostina, como um anticorpo isolado, que é impedido deligar de modo cruzado à esclerostina em pelo menos um dosanticorpos 1.24 (Ab-1 a Ab-24), o anticorpo isolado, ou umaligação ao fragmento de antigeno da mesma, pode ser um anti-corpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo hu-manizado, um anticorpo humano, ou um anticorpo quimérico.
A invenção ainda se refere a um agente de ligação,como um isolado anticorpo que exibe um padrão semelhante aligação à peptideos de esclerostina humana em um "escleros-tina humana peptideo epitopo ensaio de competição de liga-Ab-B, C ou Ab-Ab-D; o anticorpo isolado, ou um fragmento li-gado ao antigeno, pode ser um anticorpo policlonal, um anti-corpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo hu-mano, ou um anticorpo quimérico.
A invenção ainda se refere a um método para trata-mento de uma doença óssea associada com pelo menos um debaixa formação óssea, baixa densidade mineral óssea, baixoconteúdo mineral ósseo, baixa massa óssea, baixa qualidadeóssea e baixa força óssea em um mamífero indivíduo, que com-preende Proporcionando a um indivíduo que necessitem de taltratamento em um quantidade de um processo anti-agente deligação à esclerostina suficiente para pelo menos um aumentode formação óssea, densidade mineral óssea, conteúdo mineralósseo, massa óssea, qualidade óssea e força óssea onde o an-ti-agente de ligação à esclerostina compreende um anticorpo,ou fragmento de ligação à esclerostina.
A invenção também se refere a um isolado escleros-tina polipeptideo ou fragmentos, onde o polipeptideo contém6 resíduos conservados de cisteina e os fragmentos dessecompreendem de 7 a 14 aminoácidos de SEQ ID n° . : 2, 8 a 17aminoácidos de SEQ ID n°. : 3 ; 8 a 18 resíduos de SEQ IDn° . : 4; e 6 a 12 resíduos de SEQ ID n°.: 5, e do polipepti-deo ou fragmentos dele estão estabilizados por ligações dis-sulfeto entre SEQ ID n°.: 2 e 4, e entre SEQ ID n°.: 3 e 5;o polipeptideo ou fragmentos podem incluir 10-14 aminoácidosda SEQ ID n°.: 2, 14 a 17 aminoácidos de SEQ ID n°.: 3, 13 a18 aminoácidos de SEQ ID n° . : 4;, e de 8 a 12 resíduos deSEQ ID n°.: 5; e do polipeptideo ou fragmentos podem incluirSEQ ID n°.: 2, SEQ ID n° . : 3, SEQ ID n° . : 4, e SEQ ID n° . :5.
São fornecidos aqui anticorpos que se ligam espe-cificamente aos esclerostina humana. Os anticorpos são ca-racterizados pela sua capacidade de bloquear de modo cruzadoa ligação de pelo menos um anticorpo divulgado aqui à escle-rostina humana e/ou a ser bloqueado de modo cruzado desdeligação esclerostina humana por pelo menos um anticorpo di-vulgado aqui .
É fornecido também um anticorpo isolado, ou umfragmento de ligação ao antigeno, que pode aumentar pelo me-nos um de formação óssea, densidade mineral óssea, conteúdomineral ósseo, massa óssea, qualidade óssea e força óssea emum mamífero.É fornecido também um anticorpo isolado, ou umfragmento de ligação ao antigeno, que podem bloquear o efei-to inibitório de esclerostina em um ensaio de mineralizaçãocom base na célula.
É fornecido também um agente de ligação, tal comoanticorpos, que se liga especificamente à esclerostina huma-na e tem pelo menos uma seqüência CDR selecionada a partirde SEQ ID n°.s: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79,80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108,109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240,241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252,253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264,265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276,277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288,289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352,353, 358, 359, e 360, e variantes, onde o anticorpo ou frag-mento de ligação ao antigeno do mesmo neutraliza esclerosti-na .
É fornecido também um agente de ligação, tal comoanticorpos, que se liga especificamente à esclerostina huma-na e tem pelo menos uma seqüência CDR selecionada a partirSEQ ID n°.s: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80,81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241,242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253,254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265,266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277,278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289,290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353,358, 359, e 360, e variantes.
Também são fornecidas regiões de esclerostina hu-mana que são importantes para a atividade in vivo da proteí-na .
Estes e outros aspectos da presente invenção tor-nar-se-ão aparentes mediante referência à seguinte descriçãodetalhada e desenhos anexos. Todas as referências divulgadasaqui são incorporadas por referência em suas integridadescomo se cada uma fosse incorporada individualmente.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1 mostra as seqüências de aminoácidos deforma madura (peptideos sinal clivados) da cadeia leve (Fi-gura IA) (SEQ ID n°.: 23) e cadeia pesada (Figura 1B) (SEQID n°.: 27) para os anti-Esclerostina humana e anticorpo an-ti-esclerostina de rato Ab-A.
Figura 2 ilustra as seqüências de aminoácidos deforma madura (peptideos sinal clivados) da cadeia leve (Fi-gura 2A) (SEQ ID n° . : 31) e cadeia pesada (Figura 2B) (SEQID n°.: 35) para o anticorpo Ab-B anti-Esclerostina humana eanti-esclerostina de rato.
Figura 3 descreve as seqüências de aminoácidos deforma madura (peptideos sinal clivados) da cadeia leve (Fi-gura 3A) (SEQ ID n° . : 15) e cadeia pesada (Figura 3B) (SEQID n°.: 19) para o anticorpo Ab-C anti-Esclerostina humana eanti-esclerostina de rato.Figura 4 ilustra as seqüências de aminoácidos deforma madura (peptideos sinal clivados) da cadeia leve (Fi-gura 4A) (SEQ ID n°.: 7) e cadeia pesada (Figura 4B) (SEQ IDn° . : 11) para o anticorpo Ab-D anti-esclerostina humana eanti-esclerostina de rato.
Figura 5 descreve a densidade mineral óssea em ra-tos medidos em dois sitios esqueléticos (vértebras lombarese matáfise tibial) após 3 semanas de tratamento com o veicu-lo, PTH (1-34), Ab-A ou Ab-B.
Figura 6 mostra a densidade mineral óssea em ratosmedidos em dois sitios esqueléticos (vértebras lombares ematáfise tibial) após 2 semanas de tratamento com o veiculo,PTH (1-34) ou Ab-C.
Figura 7 descreve a densidade mineral óssea em ra-tos medidos em dois sitios esqueléticos (Vértebras lombarese matáfise tibial) após 3 semanas de tratamento com o veicu-lo ou Ab-D.
Figura 8 descreve a seqüência de aminoácidos deforma madura (peptideo sinal clivado) de esclerostina humana(SEQ ID n° . : 1) . Também é descrita a seqüência nucleotidicade esclerostina humana codificação região que codifica aforma madura de esclerostina humana. As oito cisteinas sãonumerados Cl a C8. O nó de cistina é formado por três liga-ções dissulfeto (C1-C5; C3-C7; C4-C8). C2 e C6 também formamuma ligação dissulfeto, porém este dissulfeto não faz partede nó de cistina.
Figura 9 ilustra um esquema da estrutura de baseda esclerostina humana. Há um braço terminal N (a partir doprimeiro Q para Cl) e um braço terminal C (a partir de C8 aoterminal Y). Entre esses braços há a estrutura de nó de cis-tina (formada por três dissulfetos: C1-C5; C3-C7; C4-C8) etrês voltas, que são designadas Volta 1, volta 2 e volta 3.
As regiões distais da volta 1 e volta 3 estão ligadas peladissulfeto C2-C6. Sitios potenciais de clivagem com tripsinasão indicados (arginina e lisina = R = K). Alguns dos sitiospotenciais de clivagem de AspN são indicados (apenas ácidoaspártico (D) os residuos são mostrados).
Figura 10 ilustra os mapas de HPLC de peptideo hu-mano esclerostina após digestão tanto com tripsina comoAspN. Os peptideos de esclerostina humana gerados por diges-tão por tripsina são indicados (T19.2, T20, T20.6 e T21-22),como são os peptideos de esclerostina humana gerados por di-gestão com AspN (AspN14.6, AspN18.6 e AspN22.7-23.5) .
Figura 11 ilustra seqüência e informação de massapara o isolamento de peptideos de esclerostina humana liga-dos com dissulfeto gerados por digestão por tripsina. Seq.POS. = Posição de seqüência. OBS. = Observadas. A massa Ob-servada foi determinada pela análise ESI-LC-MS.
Figura 12 ilustra seqüência e informação de massapara o isolamento de peptideo de esclerostina humana geradopor AspN digestão. O peptideo AspN22.7-23,5 contém como 4ligações dissulfeto. Seq. POS. = Posição de seqüência. OBS. = Observadas. A massa Observada foi determinada por análiseESI-LC-MS.
Figura 13 mostra um processo linear esquemático dequatro peptideos de esclerostina humana (T 19,2, T20, T20.6e T21-22) gerados por digestão por tripsina.
Figura 14 mostra um processo linear esquemático decinco peptideos de esclerostina humana (AspN 14,6, AspNl8.6e AspN22.7-23,5) gerados por AspN digestão. 0 AspN14.6 HPLCpico é composto de três peptideos não ligados por quaisquerligações dissulfeto.
Figura 15 mostra o sinal de unidade de ressonância(Ru) do "ensaio de ligação de competição ao epitopo de pep-tideo de esclerostina humana" baseado em Biacore. A ligaçãoMab relativa para vários peptideos de esclerostina humana(em solução), versus ligação Mab para esclerostina humana deforma madura intacta (imobilizadas sobre Chip Biacore) foiavaliada. Os dados mostrados são de Ab-A. Os peptideos deesclerostina humana utilizados foram T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspNl4.6, AspN18.6 e AspN22.7-23, 5.
Figura 16 mostra o sinal de unidade de ressonância(Ru) do "ensaio de ligação de competição ao epitopo de pep-tideo de esclerostina humana" baseado em Biacore. A ligaçãoMab relativa para vários peptideos de esclerostina humana(em solução), versus ligação Mab para esclerostina humana deforma madura intacta (imobilizadas sobre Chip Biacore) foiavaliada. Os dados mostrados são de Ab-B. Os peptideos deesclerostina humana utilizados foram T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 e AspN22.7-23, 5.
Figura 17 mostra a ressonância unidade (Ru) sinaldo "ensaio de ligação de competição ao epitopo de peptideode esclerostina humana" baseado em Biacore. A ligação Mabrelativa para vários peptideos de esclerostina humana (emsolução), versus ligação Mab para esclerostina humana deforma madura intacta (imobilizadas sobre Chip Biacore) foiavaliada. Os dados mostrados são de Ab-C. Peptideos de es-clerostina humana utilizados foram T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspNl4.6, AspN18.6 e AspN22.7-23,5.
Figura 18 mostra a ressonância unidade (Ru) sinalde "ensaio de ligação de competição ao epitopo de peptideode esclerostina humana" baseado em Biacore. A ligação Mabrelativa para vários peptideos de esclerostina humana (emsolução), versus ligação Mab para esclerostina humana deforma madura intacta (imobilizadas sobre Chip Biacore) foiavaliada. Os dados mostrados são de Ab-D. Peptideos de es-clerostina humana utilizados foram T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 e AspN22.7-23,5.
Figura 19 mostra dois Mab ligação epitopos de es-clerostina humana. Figura 19A mostra seqüência do epitopo devolta 2 para ligação do Ab-A, Ab-B para esclerostina humana(SEQ ID n° . : 6.) . Figura 19B mostra seqüência, ligação dis-sulfeto e esquemática do T20.6 epitopo para ligação de Ab eAb-C-D para esclerostina humana (SEQ ID n°.:2-5).
Figura 20 ilustra os mapas de HPLC peptideo humanoesclerostina após digestão com tripsina. Figura 20A mostradigestão dos esclerostina humana Ab-D complexas. Figura 20Bmostra de digestão de esclerostina humana sozinha. Os picosdos peptideos T19.2, T20, T20.6 e T21-22 são indicados.
Figura 21 mostra a seqüência, ligação dissulfeto eesquemática do epitopo "derivado 1 T20.6 (nó de cistina + 4braços)" para ligação do Ab-D para esclerostina humana. (SEQID n°.:70-73).
Figura 22 mostra os resultados do ensaio de mine-ralização de linhagem celular de osteoblastos MC3T3-E1-BFutilizado para identificar as medidas de Mabs anti-esclerostina neutralizadoras. A esclerostina de camundon-gos(Scl) foi utilizada em 1 ug/mL. Os anticorpos monoclonaisforam utilizados em 10 e 5 ug/mL. A extensão da mineraliza-ção (vários tipos de fosfato de cálcio insolúvel) foi quan-tificada medindo cálcio.
Figura 23 ilustra os resultados do ensaio de mine-ralização de linhagem celular de osteoblastos MC3T3-E1-BFutilizado para identificar as medidas de Mabs anti-esclerostina neutralizadoras. Esclerostina Humana (Scl) foiutilizada em 1 ug/mL. Os anticorpos monoclonais foram utili-zados em 8 e 4 ug/mL. Extensão da mineralização (vários ti-pos de fosfato de cálcio insolúvel) foi quantificada medindocálcio.
Figura 24 mostra os resultados do ensaio de mine-ralização de linhagem celular de osteoblastos MC3T3-E1-BFutilizado para identificar as medidas de Mabs anti-esclerostina neutralizadoras. Esclerostina Humana (Scl) foiutilizada em 1 ug/mL. Os anticorpos monoclonais foram utili-zados em 10 ug/mL. Extensão da mineralização (vários tiposde fosfato de cálcio insolúvel) foi quantificado medindocálcio.
Figura 25 mostra os resultados de uma perda ósseainduzida por inflamação em modelo de rato SCID. 0 tratamentoAb-A protegeu os camundongos de perda óssea relacionada àinflamação associada a colite quando medida como o total dadensidade mineral óssea (Figura 25A), densidade vertebralóssea (Figura 25B), e densidade óssea femoral (Figura 25C).
Descrição Detalhada
A presente invenção se refere às regiões do Homemproteina esclerostina que contêm epitopos reconhecidos poranticorpos que se ligam também a esclerostina de comprimentopleno, bem como os métodos de produzir e utilizar esses epi-topos. A invenção fornece também agentes de ligação (comoanticorpos), que se ligam especificamente a esclerostina ouporções de esclerostina, bem como os métodos para a utiliza-ção deste tipo de agentes de ligação. Os agentes de ligaçãosão úteis para impedir ou prejudicar a ligação de escleros-tina humana a um ou mais ligante.
A esclerostina recombinante humana/SOST está dis-ponivel comercialmente a partir de R & D Systems (Minneapo-lis, MN, E.U.A.; 2006 n° cat. 1406-ST-025). Além disso, es-clerostina recombinante de rato/SOST está disponível comer-cialmente a partir de R & D Systems (Minneapolis, MN,E.U.A.; 2006 n° cat. 1589-ST-025). Os anticorpos monoclonaisde ligação a esclerostina de grau de investigação estão co-mercialmente disponíveis a partir de R & D Systems (Minnea-polis, MN, E.U.A.; os monoclonais de rato: 2006 n° cat.MAB1406; os monoclonais de rato: 2006 n° cat. MAB1589). Pa-tente US n°s 6395511 e 6803453, e Publicações de Patente US20040009535 e 20050106683 referem-se geralmente ao anticorpoanti-esclerostina.
Conforme utilizado neste documento, o termo escle-rostina humana destina-se a incluir a proteina de SEQ IDn° . : 1 e variantes alélicos. A esclerostina pode ser purifi-cada a partir células hospedeiras 293T que foram transfecta-das por um gene que codifica esclerostina por eluição do so-brenadante filtrado do liquido de cultura de célula hospe-deira utilizando uma coluna Heparina HP, usando um gradientede sal. A preparação e posterior purificação utilizando cro-matografia de troca catiônica são descritas em Exemplos 1 e2.
Agentes de ligação da invenção são preferencial-mente anticorpos, como definido aqui. O termo "anticorpo" serefere a um anticorpo intacto, ou um fragmento de ligação domesmo. Um anticorpo pode incluir uma molécula de anticorpocompleta (incluindo as versões policlonais, monoclonais,quimérica, humanizada, ou humana tendo cadeias pesadas e/oucadeias leves), ou compreende um fragmento de ligação ao an-tigeno. Os fragmentos de Anticorpo incluem fragmentosF(aB')2, Fab, Fab', Fv, Fc, e Fd, e podem ser incorporados aanticorpos de dominio único, anticorpos de cadeia única, ma-xicorpos, minicorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos,tetracorpos, v-NAR e di-scFv (Veja, por exemplo, Hollinger eHudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136) . Poli-peptideos de Anticorpo também são divulgados em Patente USn° 6703199, incluindo monocorpos de polipeptideo de fibro-nectina. Outros polipeptideos de anticorpos são divulgadosem Publicação de Patente US 2005/0238646, que são polipepti-deos de cadeia única.
Os fragmentos de ligação derivados de um antigenode um anticorpo podem ser obtidos, por exemplo, por hidróli-se proteolitica do anticorpo, por exemplo, ou digestão compepsina papaina de qualquer anticorpo, de acordo com métodosconvencionais. A titulo de exemplo, fragmentos de anticorpospodem ser produzidos por clivagem enzimática de anticorposcom pepsina para fornecer um fragmento 5S denominadoF(aB')2. Este fragmento pode ainda ser clivado usando um ti-ol como agente redutor para produzir fragmentos 3.5S Fab'monovalentes. Opcionalmente, a reação de clivagem pode serrealizada através de um grupo de bloqueio para grupos sulfi-drila que resultam de clivagem das ligações dissulfeto. Comouma alternativa, uma clivagem enzimática utilizando papainapara produzir dois fragmentos monovalentes Fab e um fragmen-to Fc diretamente. Estes métodos estão descritos, por exem-pio, por Goldenberg, Patente US n° 4331647, Nisonoff et al.,Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J.73:119, 1959; Edelman et al em Methods in Enzymology 1:422(Academic Press 1967), e por Andrews, SM E Titus, JA em Cur-rent Protocols in Immunology (Coligan JE, et al., Orgs.),John Wiley & Sons, Nova York (2003). Páginas 2.8.1-2.8.10 e2.10A.1-2.10A.5. Outros métodos de adesão de anticorpos, co-mo separação de fragmentos de cadeias pesadas para formarfragmentos monovalentes de cadeia leve e pesada (Fd), cliva-gem adicional de fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas,quimicas ou genéticas também podem ser utilizados, desde queos fragmentos se liguem ao antigeno que é reconhecido peloanticorpo intacto.
Um fragmento de anticorpo também pode ser qualquerproteína sintética ou geneticamente modificada. Por exemplo,fragmentos de anticorpos incluem fragmentos isolados consis-tindo da região variável de cadeia leve, fragmentos "Fv"consistindo na região variável de cadeia leve e pesada, mo-léculas polipeptidicas recombinantes de cadeia única em queas regiões variáveis leve e pesada são conectadas por umpeptideo ligante (ScFv proteínas).
Outra forma de um fragmento de anticorpo é um pep-tideo composto por uma ou mais regiões de determinação decomplementaridade (CDRs), de um anticorpo. CDRs (também de-signada "unidades mínimas de reconhecimento", ou "região hi-pervariável") podem ser obtidas pela construção de polinu-cleotideos que codificam o CDR de interesse. Tais polinucle-otideos estão dispostos, por exemplo, por meio da cadeia depolimerase para sintetizar a região variável de RNAm utili-zando células produtoras de anticorpos, como um modelo (ve-ja, por exemplo, Larrick et al, Methods: A Companion to Me~thods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "GeneticManipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Anti-bodies: Production, Engineering and Clinicai Application,Ritter et al. (eds.), pág 166 (Cambridge University Press1995); e Ward et al, "Genetic Manipulation and Expression ofAntibodies in Monoclonal Antibodies: Principies and Applica-tions", Birch et al, (eds.), pág 137 (Wiley-Liss, Inc.1995)) .
Assim, em uma modalidade, o agente de ligação com-preende pelo menos uma CDR, conforme descrito aqui. 0 agentede ligação pode incluir pelo menos duas, três, quatro, cincoou seis CDR's como descrito aqui. 0 agente de ligação aindapode incluir pelo menos uma região de domínio variável de umanticorpo aqui descrita. A região de dominio variável podeser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e, emgeral compreenderá pelo menos uma seqüência CDR responsávelpela ligação à esclerostina humana, por exemplo CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 e/ou CDRs de cadeia leve especificamente descri-tas neste documento e que é adjacente a ou n estrutura deuma ou mais seqüências estruturais. Em termos gerais, a va-riável (V) pode ser qualquer arranjo de região de dominioadequado de imunoglobulina de domínios variáveis de cadeiapesada (VH) e/ou leve (VL) . Assim, por exemplo, a região dedominio V pode ser monomérica e ser um dominio VH ou VL, queé capaz de autonomamente ligar à esclerostina humana com umaafinidade pelo menos igual a 1 x 10~7 M ou menos como des-crito abaixo. Alternativamente, a região de dominio V podeser dimérica e conter dimeros VH-VH, VH-VL, ou VL-VL. 0 di-mero da região V compreende pelo menos uma cadeia VH e pelomenos uma cadeia VL que pode ser não covalentemente associa-da (a seguir designada FV) . Se desejado, as cadeias podemser acopladas covalentemente tanto diretamente, por exemploatravés de uma ligação dissulfeto entre os dois domínios va-riáveis, ou através de uma ligação, por exemplo, um peptideoligante, para formar uma única cadeia Fv (scFV).
A região de dominio variável pode ser de ocorrên-cia natural, ou uma versão geneticamente modificada da mes-ma. Versão geneticamente modificada significa uma região dedominio variável que foi criada utilizando técnicas de enge-nharia de DNA recombinante. Essas versões modificadas inclu-em aquelas criadas, por exemplo, a partir de um anticorpoespecifico de região variável por inserções, eliminações, oumudanças em ou para as seqüências de aminoácidos do anticor-po especifico. Exemplos particulares incluem região de domí-nio variável modificada que contenha pelo menos uma CDR eopcionalmente uma ou mais estruturas de aminoácidos de umprimeiro anticorpo e o restante da região de domínio variá-vel de um segundo anticorpo.
A região de dominio variável pode ser covalente-mente ligada a um aminoácido de terminal C a pelo menos umoutro dominio de anticorpo ou um fragmento do mesmo. Assim,por exemplo, um dominio VH que está presente na região dodominio variável pode ser associado a um dominio de imuno-globulina CHI, ou um fragmento do mesmo. Do mesmo modo umdominio VL pode estar associado a um dominio CK ou um frag-mento do mesmo. Desta forma, por exemplo, o anticorpo podeser um fragmento Fab onde a ligação antigeno dominio contémdomínios VH e VL associados covalentemente ligados ao seuterminal C de um dominio CHI e CK, respectivamente. 0 domi-nio CHI pode ser ampliado com mais aminoácidos, por exemplo,para fornecer uma região de articulação ou uma parte de umdominio de região de articulação como encontrado em um frag-mento Fab' , ou fornecer mais domínios, tais como domínios deanticorpos CH2 e CH3.
Conforme descrito aqui, agentes de ligação incluirpelo menos um desses CDRs. Por exemplo, um ou mais CDR podemser incorporadas conhecido anticorpo quadro regiões (IgGl,IgG2, etc), ou conjugada com um veiculo adequado para refor-çar a sua meia-vida. Veículos adequados incluem, mas não es-tão limitados a Fc, polietilenoglicol (PEG), albumina,transferrina, e similares. Estes e outros veículos adequadossão conhecidos na técnica. Tais peptideos conjugados CDR po-de ser em forma monomérica, dimérica, tetramérica, ou outra.Em uma modalidade, um ou mais polímeros solúveis em água sãoligados em uma ou mais condições especificas, por exemplo,no terminal amino, de um agente de ligação.
Em certas modalidades preferidas, um agente de li-gação compreende um ou mais polímeros solúveis em água, in-cluindo, mas não limitado a, polietileno glicol, polioxieti-leno glicol, ou polipropileno glicol. Veja, por exemplo, Pa-tentes US N °s 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192,4179337. Em certas modalidades, um agente de ligação deriva-do compreende um ou mais de monometoxi-polietilenoglicol,dextrano, celulose, ou outros polímeros baseados em carboi-dratos, poli-(N-vinilpirrolidona)-polietilenoglicol, propi-leno glicol homopolimeros, um co-polimero oxido de polipro-pileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exem-plo, glicerol) e policloreto álcool, bem como as misturasdesses polímeros. Em certas modalidades, um ou mais polímerosolúvel em água é aleatoriamente anexado a uma ou mais ca-deias laterais. Em certas modalidades, PEG pode atuar paramelhorar a capacidade de um agente terapêutico de ligação,como um anticorpo. Tais métodos são discutidos, por exemplo,em Patente US No. 6133426, que é incorporada por referênciapara qualquer finalidade.Será apreciado que um agente de ligação da presen-te invenção pode ter pelo menos uma substituição de aminoá-cido, desde que o agente de ligação mantenha a especificida-de da ligação. Portanto, as modificações das estruturas doagente de ligação são abrangidas pelo âmbito da aplicação dainvenção. Estas podem incluir substituições de aminoácidos,que podem ser conservadora ou não-conservadora, que não des-truam a capacidade de ligação esclerostina de um agente deligação. As substituições conservadoras de aminoácidos podemenglobar resíduos de aminoácido de ocorrência não natural,que são tipicamente incorporados pela sintese quimica dopeptideo, em vez de por sintese em sistemas biológicos. Es-tes incluem peptidomiméticos e outras formas revertidas ouinvertidas de frações de aminoácidos. Uma substituição con-servadora de um aminoácido pode também envolver a substitui-ção de um residuo nativo de aminoácido com um resíduos nor-mativo de tal forma que haja pouco ou nenhum efeito sobre apolaridade ou carga do residuo de aminoácido na posição.
As substituições não conservadoras podem envolvera troca de um membro de uma classe de aminoácidos ou aminoá-cidos miméticos por um membro de uma outra classe com dife-rentes propriedades fisicas (por exemplo: tamanho, polarida-de, hidrofobicidade, carga). Esses resíduos podem ser subs-tituídos introduzidos em regiões dos anticorpos humanos quesão homólogas com os anticorpos não-humanos, ou para as re-giões não-homólogas da molécula.
Além disso, alguém versado na técnica podem gerartestes variantes contendo uma único substituição de aminoá-cido, em cada resíduo de aminoácido desejado. As variantespodem então ser analisados utilizando ensaios de atividadeconhecidos por versados na técnica. Tais variantes poderiamser utilizadas para recolher informações sobre variantes a-dequadas. Por exemplo, se alguém descobriu que a mudança pa-ra um determinado aminoácido resultou na destruição de resí-duos, indesejavelmente reduzida, ou atividade imprópria, comvariantes tal mudança pode ser evitada. Em outras palavras,com base em informações recolhidas a partir de tais rotinasde experiências, alguém versado na técnica pode facilmentedeterminar os aminoácidos onde mais substituições devem serevitadas por si mesmas ou em combinação com outras mutações.
Um técnico qualificado será capaz de determinarvariantes adequadas do polipeptideo como aqui definido usan-do técnicas bem conhecidas. Em certas modalidades, alguémversado na técnica podem identificar áreas apropriadas damolécula que pode ser alterado sem destruir atividade seg-mentação por regiões que não acreditava ser importante paraa atividade. Em certas modalidades, pode-se identificar re-siduos e porções das moléculas que são conservadas entre se-melhantes polipeptideos. Em certas modalidades, mais áreasque podem ser importantes para a atividade biológica ou es-trutural podem estar sujeitas a substituições conservadorasde aminoácido sem destruir a atividade biológica ou sem le-sar a estrutura do polipeptideo.
Além disso, alguém versado na técnica pode rever afunção estrutural para identificar resíduos de polipeptideosem estudos semelhantes, que são importantes para a atividadeou estrutura. Em virtude de tal comparação, pode-se prever aimportância dos resíduos de aminoácido em uma proteína quecorrespondem aos resíduos de aminoácidos, que são importan-tes para a atividade ou estrutura semelhante em proteínas.
Alguém versado na técnica podem optar pela substituição qui-micamente semelhante de aminoácido para tais referidos resí-duos importantes de aminoácido.
Alguém versado na técnica também pode analisar aestrutura tridimensional e seqüência de aminoácidos, em re-lação a essa estrutura semelhante em polipeptideos. Em vir-tude de tais informações, alguém versado na técnica permitamprever o alinhamento dos aminoácidos resíduos de um anticor-po com respeito à sua estrutura tridimensional. Em certasmodalidades, alguém versado na técnica pode optar por nãofazer mudanças radicais de aminoácidos resíduos prevista pa-ra ser na superfície da proteína, uma vez que esses resíduospodem estar envolvidos em importantes interações com outrasmoléculas.
Um número de publicações cientificas foi dedicadoà previsão de estrutura secundária. Veja Moult J., Curr. Op.in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al, Biochemistry,13(2):222-245 (1974); Chou et al, Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al, Adv. Enzymol. Relat. Áreas Mol..Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al, Ann. Rev. Biochem. ,47:251-276 e Chou et al, Biophys. J. , 26:367-384 (1979). A-lém disso, os programas de computador são atualmente dispo-níveis para ajudar com previsão da estrutura secundária. Ummétodo de predição da estrutura secundário é baseado na ho-mologia de modelagem. Por exemplo, dois polipeptideos ouproteínas, que tenham uma seqüência de identidade superior a30%, ou'semelhança superior a 40% têm freqüentemente topolo-gias estruturais semelhantes. O crescimento recente das pro-teínas estruturais de base (APO) foi reforçado já que a pre-visibilidade da estrutura secundária, incluindo o número po-tencial de vezes em um polipeptídeo ou da estrutura da pro-teína. Veja Holm et al. , Nucl. Acid. Res., 27 (1 de) :244-247 (1999). Foi sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct.Biol., 7 (3): 369-376 (1997)) que há um número limitado devezes, em um dado polipeptídeo ou proteínas e que, uma vezpor críticos Número de estruturas foram resolvidos, estrutu-ral previsão tornar-se-á dramaticamente mais precisos.
Métodos adicionais de predição da estrutura secun-daria incluem "alinhamento" (Jones, D., Curr. Opin. Struct.Biol, 1 (3) :377-87 (1997); Sippl et al., Estrutura, 4 (1):15-19 (1996)), "análise de perfil" (Bowie et al. Science,253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth.. Enzym. , 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sei, 84 (13):4355-4358 (1987)), e "ligação evolutiva" (Veja Holm, supra-citado (1999), e Brenner, supracitado (1997)).
Em certas modalidades, variantes de agentes de li-gação incluem variantes de glicosilação onde o número e/outipo de glicosilação site tenha sido alterado, em comparaçãocom as seqüências de aminoácidos de um pai polipeptídeo. Emcertas modalidades, variantes incluem um maior ou um menornúmero de sítios de N-glicosilação ligado do que o nativoproteínas. Um sítios de N-glicosilação ligado é caracteriza-da pela seqüência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, onde o residuo deaminoácido designado como X pode ser qualquer resíduo excetoaminoácido prolina. A substituição do resíduo de aminoácidospara criar essa seqüência fornece um novo site potencial pa-ra a adição de uma cadeia de carboidratos N-ligados. Alter-nativamente, substituições que eliminar essa seqüência iráremover uma existente cadeia de carboidratos N-ligada. Tam-bém é fornecido um rearranjo da N-ligados carboidratos ca-deias onde um ou mais sítios de N-glicosilação ligada (tipi-camente aqueles que estão naturalmente presentes) são elimi-nados e um ou mais novo N-ligados sítios são criados. Vari-antes de anticorpo adicional preferidas incluem variantes decisteína em que um ou mais resíduos de cisteína são retira-dos ou substituídos por um outro aminoácido (por exemplo,serina), em comparação com o progenitor seqüência aminoací-dica. As variantes de cistina podem ser úteis quando anti-corpos deve ser rearticulaçãodo em uma conformação biologi-camente ativa, como após o isolamento da inclusão de órgãosinsolúveis. As variantes de cistina geralmente têm menos re-síduos de cisteína do que a proteína nativa, e normalmentetêm um mesmo número para minimizar interações resultantes decisteínas não pareadas.
As substituições desejadas de aminoácidos (sejaconservadora ou não-conservadora) podem ser determinadas poraquele versado na técnica no momento em que tais substitui-ções são desejados. Em certas modalidades, substituições a-minoácidos podem ser usadas para identificar importante re-síduos de anticorpos para esclerostina, ou para aumentar oudiminuir a afinidade dos anticorpos para esclerostina aquidescritas.
De acordo com certas modalidades, as substituiçõesde aminoácidos preferidas são aquelas que: (1) reduzem asusceptibilidade a proteólise, (2) reduzem a susceptibilida-de à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para pro-teínas formando complexos, (4) alteram de afinidade de liga-ções, e/ou (4) conferem ou modificam outras propriedades fi-sioquimicas ou funcionais sobre tais polipeptideos. De acor-do com certas modalidades, as substituições de aminoácidosúnicas ou múltiplas (em certas modalidades, substituiçõesconservadoras de aminoácidos) podem ser feitas na seqüênciaque ocorre naturalmente (em certas modalidades, na porção dopolipeptideo fora do domínio formando contatos intermolecu-lares). Em certas modalidades, uma substituição de aminoáci-do conservadora normalmente não pode alterar substancialmen-te como características estruturais da seqüência mãe (porexemplo, um aminoácido substituto não deve tender a quebraruma hélice que ocorra na seqüência mãe, ou perturbar outrostipos de estrutura secundária que caracteriza a seqüênciamãe). Exemplos de estruturas reconhecidas na técnica de po-lipeptideo secundário e terciário são descritas em Proteins,Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H.Freeman and Company, Nova York (1984)); Introduction to Pro-tein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publi-shing, Nova York, N. Y. (1991)); e Thornton et al. Nature354:105 (1991), que são, cada uma, incorporadas neste docu-mento por referência.Em certas modalidades, os agentes de ligação dainvenção podem ser ligações quimicas com polímeros, lipi-dios, ou outras frações.
Os agentes de ligação podem incluir pelo menos umadas CDRs aqui descritas incorporadas em um quadro de estru-tura biocompativel. Em um exemplo, o quadro biocompativeisestrutura composta por um polipeptideo ou parte dele que ésuficiente para formar um confomacionalmente estável apoioestrutural, ou quadro, ou estrutura, que é capaz de exibiruma ou mais seqüências de aminoácidos que se ligam ao anti-geno (por exemplo,.:, CDRs, uma região variável, etc) em umaregião localizada na superfície. Tais estruturas podem serde ocorrência natural polipeptideo ou "articulação" de poli-peptideo (um motivo estrutural), ou pode ter uma ou mais mo-dificações, como aditamentos, supressões ou substituições deaminoácidos, em relação a uma ocorrência natural polipepti-deo ou articulação. Estes estruturas pode ser derivada de umpolipeptideo de qualquer espécie (ou de mais de uma espé-cie) , como um homem, outros mamíferos, outros vertebrados,invertebrados, vegetais, bactérias ou virus.
Tipicamente, o quadro de estruturas biocompativeissão baseadas em proteínas estruturas ou outros esqueletos dedomínios de imunoglobulina. Por exemplo, os que se baseiamnos fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarzinostaina,citocromo b, ponta de zinco CPI, PST1, mola, LACI-D1, Z do-mínio e domínios tendramisat podem ser utilizados (Veja, porexemplo, Nygren e Uhlen, 1997, Current Opinion in StructuralBiology, 7, 463-469).Em modalidades preferidas, ele será apreciado queos agentes de ligação da invenção incluem a humanizado anti-corpos aqui descritas. Anticorpos humanizados, como os des-critos neste documento pode ser produzido utilizando técni-cas conhecidas para aqueles hábeis na técnica (Zhang, W., etal Molecular Immunology. 42 (12) : 1445-1451, 2005; Hwang W.et al. Methods. 36 (1 de) :35-42, 2005; Dall'Acqua WF, etal. Methods 36 (J) :43-60, 2005; e Clark, M., Immunology To-day. 21 (8) -. 397-402, 2000).
Além disso, alguém versado na técnica irá reconhe-cer que agentes de ligação adequados incluem frações destesanticorpos, como um ou mais dos CDR-Hl, CDR-H2, CDR-H3, CDR-Ll, CDR-L2 e CDR-L3 como concretamente divulgado aqui. Pelomenos uma das regiões da CDR-Hl, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1,CDR-L2 e CDR-L3 pode ter pelo menos uma substituição aminoá-cido, desde que o agente de ligação mantém o caracter liga-ção da especificidade da CDR não substituído. A parte não-CDR do agente de ligação pode ser uma molécula não-protéica,onde o agente de ligação bloqueia de modo cruzado a ligaçãode um anticorpo divulgada aqui para esclerostina e/ou neu-tralize esclerostina. A parte não-CDR do agente de ligaçãopode ser um não-proteico molécula em que o agente de ligaçãoexibe um padrão semelhante a ligação à peptideos de escle-rostina humana em um "ensaio de competição de ligação de e-pitopo de peptideo de esclerostina humana", como que exibidoem pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10,Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24, e/ou neutraliza aesclerostina. a parte não-CDR do agente de ligação pode sercomposto de aminoácidos, onde o agente de ligação é uma pro-teína recombinante ligação ou um peptideo sintético, e asproteínas recombinantes bloqueiam de modo cruzado a ligaçãode um anticorpo divulgado aqui para esclerostina e/ou neu-tralizam a esclerostina. a parte não-CDR do agente de liga-ção pode ser composto de aminoácidos, onde o agente de liga-ção é uma proteína recombinante ligação, e como ligação aproteínas recombinantes exibe um padrão semelhante a ligaçãoa peptídeos de esclerostina humana no ensaio de competiçãode ligação ao epítopo de peptideo de esclerostina humana(descrito abaixo) enquanto que exibido em pelo menos um dosanticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4,Ab-5, Ab -6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13,Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24, e/ou neutralize a esclerostina.
Sempre que um anticorpo compreende um ou mais deCDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 como descri-to acima, ele pode ser obtido pela expressão de um grandenúmero de células que contêm codificação de DNA para estasseqüências. A codificação de DNA para cada seqüência de CDRpode ser determinada com base na seqüência de aminoácidos doCDR e sintetizadas em conjunto com qualquer anticorpo dese-jado de região variável na estrutura da região constante eseqüências de DNA utilizando técnicas de síntese de oligonu-cleótido, mutagênese dirigida ao sítio e cadeia de polimera-se (PCR) como técnicas adequadas. O DNA que codifica as es-truturas de região variável e regiões constante são ampla-mente disponíveis para aqueles hábeis na técnica de dados deseqüências genéticas tais como GenBank (R). Cada uma das re-feridas As CDRs estarão geralmente localizadas em uma estru-tura de região variável nas posições 31-35 (CDR-H1), 50-65(CDR-H2) e 95-102 (CDR-H3) da cadeia pesada e posições 24-34(CDR-L1), 50-56 (CDR-L2) e 89-97 (CDR-L3) da cadeia leve, deacordo com o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al,1987 em Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S. Department of Health and Human Services, NIH, USA).
Uma vez sintetizado, o DNA que codifica um anti-corpo da invenção ou fragmento dele pode ser propagado e ex-presso, de acordo com qualquer um de uma série de procedi-mentos bem conhecidos de excisão de ácido nucléico, ligação,transformação e transfecção utilizando qualquer número devetores de expressão conhecidos. Assim, em determinados mo-dalidades a expressão de um fragmento de anticorpo pode serpreferida em um hospedeiro procariotico, tais como Escheri-chia coli (veja, por exemplo, Pluckthun et al., 1989 MethodsEnzymol. 178:497-515). Em algumas outras modalidades, a ex-pressão do anticorpo ou um fragmento dele pode ser preferidaem uma célula hospedeira eucariótica, incluindo levedura(por exemplo, S.accharomyces cerevisiae, Schizosaccharomycespombe, e Pichia pastoris), células animais (incluindo célu-las mamíferas) ou células vegetais. Exemplos de células ani-mais adequadas incluem, mas não são limitados a, mieloma(como uma linhagem de camundongo NSO) , COS, CHO, ou célulasde hibridoma. Exemplos de células vegetais incluem célulasde tabaco, milho, soja, e arroz.
Um ou mais vetores de expressão replicáveis con-tendo o DNA que codifica um anticorpo na região variávele/ou constante podem ser preparados e usados para transfor-mar uma linhagem celular adequada, por exemplo, a não-produção de linhagem de células de mieloma, como uma linha-gem NSO de rato ou uma bactéria, tal como E. Coli, em que aprodução de anticorpos irá ocorrer. A fim de obter eficientetranscrição e tradução, a seqüência de DNA de cada vetor de-ve incluir seqüências regulamentares adequadas, ou seja, umaseqüência promotora e lider operacionalmente ligadas a se-qüência de dominio variável. Métodos particulares para pro-duzir anticorpos desta forma são geralmente bem conhecidos eutilizados rotineiramente. Por exemplo, os procedimentos combase na biologia molecular são descritos por Maniatis e Al{Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 a ed., Cold S-pring Harbor Laboratory, Nova York, 1989; veja também Mania-tis et al. 3 a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, NovaYork, (2001)) . A seqüenciação do DNA pode ser efetuada comodescrito em Sanger et al. (PNAS 74:5463, (1977)), bem como oseqüenciamento manual Amersham International plc, e em si-tios de mutagênese dirigidos podem ser efetuados de acordocom métodos conhecidos na técnica (Kramer et al, Nucleic A-cids Res. 12:9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sei. USA82:488-92 (1985); Kunkel et al, Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987); the Anglian Biotechnology Ltd handbook). Alémdisso, diversas publicações descrevem técnicas adequadas pa-ra a preparação de anticorpos por manipulação de DNA, cria-ção de vetores de expressão, e transformação da cultura decélulas adequada (Mountain A and Adair, J R em Biotechnologyand Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, cap. 1,1992, Intercept, Andover, UK); "Current Protocols in Molecu-lar Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience,Nova York).
Onde é desejado melhorar a afinidade de anticor-pos, de acordo com a invenção que contenham uma ou mais dasreferidas CDRs pode ser obtida através de um número de pro-tocolos de maturação de afinidade incluindo a manutenção dasCDRs (Yang et al. J. Mol. Biol, 25 A, 392-403, 1995), emba-ralhamento da cadeia (Marks et al. Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), a utilização de mutação de cepas de E. coli (Lowet al. J. Mol. Biol, 250, 350-368, 1996), embaralhamento deDNA (Patten et al. Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733,1997), exibição de fago (Thompson et al. J. Mol Biol, 256,7-88, 1996) e PCR sexual (Crameri, et al. Nature, 391, 288-291, 1998). Todos esses métodos de maturação de afinidadesão discutidas por Vaughan e Al (Nature Biotechnology, 16,535-539, 1998) .
Outros anticorpos, de acordo com a invenção podemser obtidos por imunização convencional e fusão celular comoprocedimentos aqui descritos e conhecidos na técnica. Os an-ticorpos monoclonais da invenção podem ser gerados usandouma variedade de técnicas conhecidas. Em geral, os anticor-pos monoclonais que se ligam aos antigenos específicos podemser obtidos por métodos conhecidos para aqueles versados natécnica (veja, por exemplo, Kohler et al, Nature 256:495,1975; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunol-ogy, 1:2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); Patente U.S.Nos. RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439, e 4.411.993; Mono-clonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in BiologicalAnalyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.)(1980); e Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksleyet al, "Production of monoclonal antibodies against proteinsexpressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems,2a edição, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford UniversityPress 1995)) . Os fragmento de anticorpos podem ser derivadosutilizando qualquer norma técnica adequada, como a digestãoproteolitica, ou opcionalmente, por digestão proteolitica(por exemplo, utilizando papaina ou pepsina), seguindo-se deligeira redução das ligações dissulfeto e alquilação. Alter-nativamente, esses fragmentos podem também ser gerados portécnicas de recombinação genética como descrito aqui.
Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos atra-vés da injeção em um animal, por exemplo, um rato, hamster,um coelho, ou de preferência um rato, incluindo por exemploum transgênico ou knock-out, como sabido na técnica, com umimunogênio compreendendo esclerostina humana de SEQ ID n°.:1, ou um fragmento dela, de acordo com métodos conhecidos natécnica e aqui descritas. A presença de anticorpos especifi-cos produção pode ser monitorizados após a primeira injeçãoe/ou após uma injeção de reforço mediante a obtenção de umsoro amostra e detectar a presença de um anticorpo que seliga à esclerostina humana ou peptideo usando qualquer umdos vários immunodetection métodos conhecidos na técnica eaqui descritas. De animais produzindo o desejado anticorpos,células linfóides, mais comumente células do baço ou dosgânglios linfáticos, que são removidos para obter B-linfócitos. Os linfócitos B são então fundidos com uma fár-maco-sensibilizadas mieloma Fusão celular parceiro, de pre-ferência um que seja singeneico com a imunização dos animaise que eventualmente . tenha outras propriedades desejáveis(por exemplo, incapacidade de expressar produtos Ig de genesendógenos, por exemplo, P3X63-Ag 8.653 (No. ATCC CRL 1580);NSO, SP20) para produzir hibridomas, que são linhagens celu-lares eucarióticas imortais. As células linfóides (por exem-plo, o baço) e células de mieloma podem ser combinadas poralguns minutos com um agente promotor de fusão de membrana,como o polietileno-glicol ou um detergente não iônico e, emseguida, plaqueadas em baixa densidade em um meio selectivoque suporta o crescimento de células hibridomas, mas não cé-lulas de mieloma não fundidas. 0 meio de seleção preferido éHAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Depois de um tem-po suficiente, geralmente cerca de uma ou duas semanas, co-lônias de células são observados. 0 hibridomas são clonados(por exemplo, por diluição limitada de clonagem ou por sua-ves isolamento de placa ágar) e os clones positivos que pro-duzem um anticorpo especifico para a esclerostina são sele-cionados e cultivados. Os anticorpos monoclonais de culturasde hibridomas podem ser isolados dos sobrenadantes de cultu-ras de hibridomas. Um método alternativo para a produção deum anticorpo monoclonal murino é injetar as células de hi-bridomas na cavidade peritoneal de um rato singeneico, porexemplo, um rato que tenha sido tratado (por exemplo, sensi-bilizado com pristano) para promover a formação de fluido deascite contendo os anticorpos monoclonais. Os anticorpos mo-noclonais podem ser isoladas e purificados por uma variedadede técnicas bem estabelecidas. Tais técnicas de isolamentoincluem cromatografia de afinidade com Proteina-A sefarose,cromatografia de exclusão tamanho, e cromatografia de trocaiônica (veja, por exemplo, Coligan nas páginas 2.7.1-2.7.12e páginas 2.9.1-2.9.3; Baines e Al, "Purification of Immuno-globulin G (IgG)," em Methods in Molecular Biology, Vol. 10,páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Os anticorposmonoclonais podem ser purificados por cromatografia de afi-nidade usando uma adequada ligante selecionados com base empropriedades particulares dos anticorpos (por exemplo, pesa-do ou leve cadeia isotipo, ligação especificidade, etc.) E-xemplos de um ligante adequado, imobilizadas em um suportesólido, incluem Proteina A, proteína G, uma região constante(de cadeia leve ou cadeia pesada) anticorpo, um anticorpoanti-idiotipico, e uma proteina de ligação beta versão TGF,ou fragmento da mesma ou variante.
Um anticorpo da presente invenção pode também serum anticorpo monoclonal humano. Human anticorpos monoclonaispodem ser gerados por qualquer número de técnicas com asquais aqueles que tenham habilidade ordinária na técnica se-rão familiarizados. Tais métodos incluem, mas não estão li-mitados a, transformação de células do sangue periférico hu-mano pelo virus Epstein Barr (EBV) (por exemplo, contendolinfócitos B) , imunização, in vitro de células humanas B, afusão de células transgênicas de baço imunizado de camundon-gos transportando genes inseridos de imunoglobulina humana,isolamento de bibliotecas de fagos de região da imunoglobu-lina humana V, ou outros procedimentos como são conhecidosna técnica e baseiados nesta divulgação. Por exemplo, os an-ticorpos monoclonais humanos podem ser obtidos a partir decamundongos transgênicos que foram manipulados para produziranticorpos humanos específicos em resposta ao desafio anti-gênico. Os métodos para a obtenção de anticorpos humanos ca-mundongos transgênicos são descritos, por exemplo, Green etal. Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al. Nature 368:856,1994; Taylor et al.Jnt. Immun. 6:579, 1994; Patente US n°5877397; Bruggemann et al. 1997 Curr. Opin. Biotechnol.8:455-58; Jakobovits et al. 1995 Ann. NY Acad. Sei. 764:525-35. Nesta técnica, elementos da cadeia humana pesados e le-ves legitimidade são introduzidas em linhagens de ratos de-rivadas de células estaminais embrionárias a partir de li-nhagens que contêm perturbações endógenas direcionadas aoslocais de cadeia pesada e cadeia leve (veja também Brugge-mann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)). Porexemplo, transgenes de imunoglobulina humana podem ser mini-genes construídos, ou transsituados sobre cromossomos arti-ficiais de levedura, que sofrem rearranjos específicos nascélulas B-DNA e hitrocação no tecido linfóide do rato. Osanticorpos humanos monoclonais podem ser obtidos pela imuni-zação dos camundongos transgênicos, que poderá então produ-zir anticorpos humanos específicos para esclerostina. As cé-lulas linfóides dos camundongos transgênicos imunizados po-dem ser usadas para produzir hibridomas secretores de anti-corpos humanos de acordo com os métodos aqui descritos. Sorocontendo anticorpos policlonais humanos também pode ser ob-tido a partir do sangue do animal imunizado.
Outro método da invenção para gerar anticorpos hu-manos inclui immortalizar as células do sangue periféricohumano por transformação EBV. Veja, por exemplo, Patente USn° 4464456. Tal linhagem celular imortalizada B (ou linhagemcelular de linfoblastóides) produz um anticorpo monoclonalque se liga especificamente à esclerostina podem ser identi-ficada por métodos de imunodetecção como nela se prevê, porexemplo, um ELISA e, em seguida, isolada por técnicas padrãode clonagem. A estabilidade da linhagem das células linfo-blastóides produzindo um anticorpo anti-esclerostina podeser melhorada através da fusão das células transformadas li-nha com um mieloma murino para produzir um rato-humano hí-brido linhagem celular, de acordo com métodos conhecidos natécnica (veja, por exemplo, Glasky et al., Hybridoma 8 :377-89 (1989)). Ainda um outro método para gerar anticorpos mo-noclonais humanos é a imunização in vivo, que inclui sensi-bilização de células B esplênicas humanas com esclerostinahumana, seguida pela fusão de células B sensibilizadas comum parceiro de fusão heteroibrido. Veja, por exemplo, Boer-ner et al. 1991 J. Immunol 147:86-95. Em certas modalidades,célula B que produz um anticorpo anti-esclerostina humano éselecionada e as regiões variáveis de cadeia leve e cadeiapesada são clonadas a partir das células B, de acordo comtécnicas de biologia molecular conhecidas na técnica (WO92/02551; E.U. patente 5627052 ; Babcook et al. Proc. NatlAcad. Sei. E.U.A. 93:7843-48 (1996)) e aqui descritas. Célu-las B de um animal imunizado podem ser isoladas do baço, dosgânglios linfáticos, ou amostra de sangue periférico, sele-cionando uma célula que está produzindo um anticorpo que seliga especificamente à esclerostina. As células B podem tam-bém ser isoladas de seres humanos, por exemplo, a partir deuma amostra de sangue periférico. Métodos de detecção únicaB células que estão a produzir um anticorpo com o desejadoespecificidade são bem conhecidas na técnica, por exemplo,formação de placas, riagem de célula ativada por fluorescên-cia, a estimulação, in vitro seguida pela detecção de anti-corpos específicos, e similares. Métodos para seleção de an-ticorpos específicos produtoras de células B incluem, porexemplo, preparar uma única célula suspensão de células B emmeio ágar contém esclerostina humana. Ligação do anticorpoespecifico produzido pelas células B para o antigênio resul-ta na formação de um complexo, que pode ser visível como umimunoprecipitado. Após a produção como células B desejadasos anticorpos são selecionados, os Genes específicos do an-ticorpo podem ser clonados para isolar e amplificar DNA ouRNAm, de acordo com métodos conhecidos na técnica e aquidescritos .
Um outro método para a obtenção de anticorpos dainvenção é por visor de fago. Veja, por exemplo, Winter etal. 1994 Annu. Rev. Immunol 12:433-55; Burton et al, 1994Adv. Immunol 57:191-280. Bibliotecas combinatórias de genesda região variável da Imunoglobulina humana ou murina podemser criadas em vetores fago que podem ser selecionados paraselecionar fragmentos de Ig (Fab, Fv, sFv, ou multimeros dosmesmos), que se ligam especificamente a proteínas de ligaçãoTGF-versão beta ou variantes ou fragmentos delas. Veja, porexemplo, Patente U.S. No. 5,223,409; Huse et al, 1989 Scien-ce 246:1275-81; Sastry et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA86:5728-32 (1989); Alting-Mees et al, Strategies in Molecu-lar Biology 3:1-9 (1990); Kang et al, 1991 Proc. Natl Acad.Sei. USA 88:4363-66; Hoogenboom et al, 1992 J. Molec. Biol227:381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16:47-52 ereferências ai citadas. Por exemplo, uma biblioteca que con-tém uma pluralidade de seqüências polinucleotidicas de codi-ficação de fragmentos de região variável Ig podem ser inse-ridas no genoma de um bacteriofago filamentoso, tal como M13ou uma variante, na armação com a seqüência codifica umaproteína de revestimento de fago. A fusão da proteína podeser uma fusão da camada proteína com a cadeia leve região dedominio variável e/ou com a cadeia pesada região de dominiovariável. De acordo com certas modalidades, imunoglobulinaFab fragmentos também podem ser exibidos em partículas defago (veja, por exemplo, Patente US n° 5.698.426).
As bibliotecas de expressão de DNAc de imunoglobu-lina de cadeias pesadas e leves de também podem ser prepara-dos em função de fago lambda, por exemplo, usando vetoresImmunoZap ™ (H) e ImmunoZap ™ (L) (Stratagene, La Jolla, Ca-lifórnia) . Resumidamente, RNAm é isolado a partir de célulasB população, e usado para criar bibliotecas de expressão deimunoglobulina DNAc de cadeia pesada e leve em vetores Immu-noZap ™ (H) e ImmunoZap ™ (L). Estes vetores podem ser sele-cionados individualmente ou co-expressa a forma Fab fragmen-tos ou anticorpos (veja Huse et al., Supracitado; veja tam-bém Sastry et al., Supra). Placas Positivas poderão ser pos-teriormente convertidas para um plasmideo não-litico quepermite elevado nivel de expressão anticorpo monoclonalfragmentos de E. Coli.
Em uma modalidade, em um hibridomas a variável re-giões de um gene expressando um anticorpo monoclonal de in-teresse são amplificados utilizando nucleótidos Primários.Estes primários podem ser sintetizados por alguém com habi-lidade na técnica, ou podem ser adquiridos a partir de fon-tes comercialmente disponíveis. (Veja, por exemplo, Strata-gene (La Jolla, Califórnia), que vende iniciadores de regi-ões variáveis de rato e humanos, incluindo, entre outros,primários para VHa, Vm, VHC, VHd, CHI, VL CL e regiões.)Primários Estes podem ser usados Para amplificar regiões va-riáveis de cadeia leve ou pesada, o que pode então ser inse-rido em vetores, tais como ImmunoZAP ™ H ou ImmunoZAP ™ L(Stratagene), respectivamente. Estes vetores podem, então,ser introduzida em E. Coli, levedura, ou mamíferos para sis-temas baseados expressão. Grandes quantidades de uma únicacadeia de proteínas contendo uma fusão dos domínios VH e VLpode ser produzido utilizando esses métodos (veja Bird etal., Science 242:423-426, 1988).
Uma vez que as células que produzem anticorpos, deacordo com a invenção foram obtidas utilizando alguma dassituações acima descritas de técnicas de imunização e ou-tras, os Genes dos anticorpos especificos podem ser clonadospor isolar e amplificar DNA ou RNAm dai, de acordo com pro-cedimentos normalizados conforme descrito aqui. Os anticor-pos produzidos dai podem ser ordenados e os CDRs identifica-dos e como DNA que codifica as CDRs pode ser manipulado comodescrito anteriormente para gerar outros anticorpos, de a-cordo com a invenção.
Preferencialmente os agentes de ligação se ligamespecificamente à esclerostina. Como acontece com todos osagentes de ligação e ligação ensaios, alguém versado na téc-nica nesta técnica reconhece que como várias frações o qualum agente de ligação não deve se ligar de modo dectável, demodo a ser terapeuticamente eficaz e adequada seria imprati-cável e exaustiva a lista. Portanto, por um agente de liga-ção divulgada neste documento, o termo "especificamente li-ga" se refere à capacidade de um agente de ligação para li-gar para esclerostina, preferencialmente humano esclerosti-na, com maior afinidade do que se liga a uma proteína alheioao controle. De preferência a proteína controle é lisozimados ovos brancos de galinha. Preferencialmente os agentes deligação deve ligar a esclerostina com uma afinidade que sejapelo menos 50, 100, 250, 500, 1000, ou 10000 vezes maior doque a afinidade de uma proteina controle. Um agente de liga-ção pode ter um caracter de afinidade de ligação para escle-rostina humana igual ou inferior a 1 x IO"7 M, inferior ouigual a 1 x IO"8 M, inferior ou igual a 1 x IO"9 M, inferiorou igual a 1 x 10~10 M, inferior ou igual a 1 x 10"11 M, ouigual ou inferior a 1 x 10 M. A afinidade pode ser deter-minada por um teste de afinidade ELISA. Em certas modalida-des, afinidade pode ser determinada por um ensaio BIAcore.Em certas modalidades, afinidade pode ser determinado por ummétodo cinético. Em certas modalidades, afinidade pode serdeterminado por um método equilibrio/solução. Esses métodosestão descritos em detalhes aqui ou conhecidos na técnica.Agentes de ligação à esclerostina da presente invenção depreferência modulam a função do ensaio de esclerostina combase na célula aqui descritos e/ou no ensaio in vivo aquidescritos e/ou ligam a um ou mais dos epitopos aqui descri-tos e/ou bloquear de modo cruzado a ligação de um dos anti-corpos descritos no presente pedido e/ou são bloqueado demodo cruzado desde ligação esclerostina por um dos anticor-pos descritos no presente pedido. Por conseguinte, tais a-gentes de ligação podem ser identificados usando a ensaiosaqui descritos.
Em certas modalidades, os agentes de ligação sãogerados pelo primeiro identificar anticorpos que se ligam amais um dos epitopos aqui fornecidas e/ou neutralizar na cé-lula de base e/ou in vivo aqui descritas e/ou bloquear acruzar-anticorpos descritos neste Aplicação e/ou são bloque-ado de modo cruzado desde ligação esclerostina por um dosanticorpos descritos no presente pedido. O CDR regiões des-tes anticorpos são então utilizados para inserir em quadrosbiocompativeis adequados para gerar agentes de ligação à es-clerostina. a parte não-CDR do agente de ligação pode sercomposto de aminoácidos, ou pode ser um não-proteico molécu-la. Os ensaios aqui descritos permitem a caracterização deagentes de ligação. Preferencialmente os agentes de ligaçãoda presente invenção são anticorpos como definido aqui. Seráentendido por alguém versado na técnica que algumas protei-nas, tais como anticorpos, podem sofrer uma variedade de mo-dificações postranslacionais. O tipo e a extensão destas mo-dificações depende muitas vezes da célula hospedeira linhautilizada para expressar como proteínas, bem como a culturacondições. Essas modificações podem incluir variações naglicosilação, oxidação com metionina, formação de dicetopi-perizina, Isomerização de aspartato e desamidação de aspara-gina. A modificação freqüente é a perda de um terminal car-boxila básicos de residuos (como lisina ou arginina) devidoà ação de carboxipeptidases (conforme descrito em Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995). Anticorposreferidos como Ab-A, Ab-B, Ab-C, D-Ab e Ab-1 são descritas aseguir. "HC" se refere à cadeia pesada e "LC" se refere àcadeia leve. Para alguns anticorpos abaixo, o CDRs são caixasombreada e as regiões constantes (C) estão em negrito itá-lico.
Ab-D
Anticorpo D (também aqui referidos como Ab-D eMab-D) é um anticorpo de rato que apresenta alta afinidade àligação à esclerostina. O padrão de ligação BIAcore de Ab-D é mostrado na Figura 18.
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removida) do Ab-D cadeia leve:
1 DVQMIQSPSS LSASLGDIVT MTCQASQGTS INLNWFQQKP GKAPKLLIYG51 SSNLEDGVPS RFSGSRYGTD FTLTISSLED EDLATYFCLQ HSYLPYTFGG101 GTKLEIKJRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SWCFLNNFYPKDINVKWKI151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKT201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 7)
Seqüência de ácidos nucléicos codificação a formamadura (peptideo sinal removido) Ab-D da LC é a seguinte:1 GATGTCCAGA TGATTCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTTTGGGAGA51 CATAGTCACC ATGACTTGCC AGGCAAGTCA GGGCACTAGC ATTAATTTAA101 ACTGGTTTCA GCAAAAACCA GGGAAGGCTC CTAAGCTCCT GATCTATGGT151 TCAAGCAACT TGGAAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTÁGATA201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGGAGGAT GAAGATCTGG251 CAACTTATTT CTGTCTACAA CATAGTTATC TCCCGTACAC GTTCGGAGGG301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQID n°.: 8)
A seqüência de aminoácidos de Ab-D LC incluindopeptideo sinal é como segue:
1 MNTRAPAEFL GFLLLWFLGA RCDVQMIQSP SSLSASLGDI VTMTCQASQG51 TSINLNWFQQ KPGKAPKLLI YGSSNLEDGV PSRFSGSRYG TDFTLTISSL101 EDEDLATYFC LQHSYLPYTF GGGTKLEIKR ADAAPTVSIF PPSSEQLTSG151 GASVVCFLNN FYPKDINVKW KIDGSERQNG VLNSWTDQDS KDSTYSMSST201 LTLTKDEYER HNSYTCEATH KTSTSPIVKS FNRNEC (SEQ ID n°.:9)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-D LC incluindoa seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGAACACGA GGGCCCCTGC TGAGTTCCTT GGGTTCCTGT TGCTCTGGTT
51 TTTAGGTGCC AGATGTGATG TCCAGATGAT TCAGTCTCCA TCCTCCCTGT
101 CTGCATCTTT GGGAGACATA GTCACCATGA CTTGCCAGGC AAGTCAGGGC
151 ACTAGCATTA ATTTAAACTG GTTTCAGCAA AAACCAGGGA AGGCTCCTAA
201 GCTCCTGATC TATGGTTCAA GCAACTTGGA AGATGGGGTC CCATCAAGGT
251 TCAGTGGCAG TAGATATGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG
301 GAGGATGAAG ATCTGGCAAC TTATTTCTGT CTACAACATA GTTATCTCCC
351 GTACACGTTC GGAGGGGGGA CCAAGCTGGA AATAAAACGG GCTGATGCTG
401 CACCAACTGT ATCCATCTTC CCACCATCCA GTGAGCAGTT AACATCTGGA
451 GGTGCCTCAG TCGTGTGCTT CTTGAACAAC TTCTACCCCA AAGACATCAA
501 TGTCAAGTGG AAGATTGATG GCAGTGAACG ACAAAATGGC GTCCTGAACA
551 GTTGGACTGA TCAGGACAGC AAAGACAGCA CCTACAGCAT GAGCAGCACC
601 CTCACGTTGA CCAAGGACGA GTATGAACGA CATAACAGCT ATACCTGTGA
651 GGCCACTCAC AAGACATCAA CTTCACCCAT TGTCAAGAGC TTCAACAGGA
701 ATGAGTGTTA G (SEQ ID n°.: 10)
A seqüência de aminoácidos de forma madura (pepti-deo sinal removido) de Ab-D HC cadeia pesada é como segue:1 EVQLQQSGPE LVTPGASVKI SCKASGYTFT DHYMSWVKQS HGKSLEWIGb
20 51 INPYSGEFTY NQKFKGTATL TVDKSSSIAY MEIRGLTSED SAVYYCARDD
101 YDASPFAYWG QGTLVTVSAA KTTPPSVYPL APGSAAQTNS MVTLGCLVKG
151 YFPEPVTVTW NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL YTLSSSVTVP SSTWPSETVT
201 CNVAHPASST KVDKKIVPRD CGCKPCICTV PEVSSVFIFP PKPKDVLTIT
251 LTPKVTCVVV DISKDDPEVQ FSWFVDDVEV HTAQTQPREE QFNSTFRSVS
25 301 ELPIMHQDWL NGKEFKCRVN SPAFPAPIEK TISKTKGRPK APQVYTIPPP
351 KEQMAKDKVS LTCMITDFFP EDITVEWQWN GQPAENYKNT QPIMDTDGSY401 FIYSKLNVQK SNWEAGNTFT CSVLHEGLHN HHTEKSLSHS PGK (SEQ IDn°.: 11 )A seqüência de ácidos nucléicos codificando a for-ma madura (peptideo sinal removido) de Ab-D HC é:
1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTGGTGACGC CTGGGGCTTC51 AGTGAAGATA TCTTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACCACTACA101 TGAGCTGGGT GAAGCAGAGT CATGGAAAAA GCCTTGAGTG GATTGGAGAT151 ATTAATCCCT ATTCTGGTGA AACTACCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAC201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCTTCCAG TATAGCCTAC ATGGAGATCC251 GCGGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGAGATGAT301 TACGACGCCT CTCCGTTTGC TTACTGGGGC CAAGGGACTC TGGTCACTGT351 CTCTGCAGCC AAAACGACAC CCCCATCTGT CTATCCACTG GCCCCTGGAT401 CTGCTGCCCA AACTAACTCC ATGGTGACCC TGGGATGCCT GGTCAAGGGC451 TATTTCCCTG AGCCAGTGAC AGTGACCTGG AACTCTGGAT CCCTGTCCAG501 CGGTGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTGCA GTCTGACCTC TACACTCTGA551 GCAGCTCAGT GACTGTCCCC TCCAGCACCT GGCCCAGCGA GACCGTCACC601 TGCAACGTTG CCCACCCGGC CAGCAGCACC AAGGTGGACA AGAAAATTGT651 GCCCAGGGAT TGTGGTTGTA AGCCTTGCAT ATGTACAGTC CCAGAAGTAT701 CATCTGTCTT CATCTTCCCC CCAAAGCCCA AGGATGTGCT CACCATTACT751 CTGACTCCTA AGGTCACGTG TGTTGTGGTA GACATCAGCA AGGATGATCC801 CGAGGTCCAG TTCAGCTGGT TTGTAGATGA TGTGGAGGTG CACACAGCTC851 AGACGCAACC CCGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACTTTCCG CTCAGTCAGT901 GAACTTCCCA TCATGCACCA GGACTGGCTC AATGGCAAGG AGTTCAAATG951 CAGGGTCAAC AGTCCAGCTT TCCCTGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA1001 AAACCAAAGG CAGACCGAAG GCTCCACAGG TGTACACCAT TCCACCTCCC1051 AAGGAGCAGA TGGCCAAGGA TAAAGTCAGT CTGACCTGCA TGATAACAGA151 ACTAGCATTA ATTTAAACTG GTTTCAGCAA AAACCAGGGA AGGCTCCTAA201 GCTCCTGATC TATGGTTCAA GCAACTTGGA AGATGGGGTC CCATCAAGGT251 TCAGTGGCAG TAGATATGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG301 GAGGATGAAG ATCTGGCAAC TTATTTCTGT CTACAACATA GTTATCTCCC351 GTACACGTTC GGAGGGGGGA CCAAGCTGGA AATAAAACGG GCTGATGCTG4 01 CACCAACTGT ATCCATCTTC CCACCATCCA GTGAGCAGTT AACATCTGGA4 51 GGTGCCTCAG TCGTGTGCTT CTTGAACAAC TTCTACCCCA AAGACATCAA501 TGTCAAGTGG AAGATTGATG GCAGTGAACG ACAAAATGGC GTCCTGAACA551 GTTGGACTGA TCAGGACAGC AAAGACAGCA CCTACAGCAT GAGCAGCACC601 CTCACGTTGA CCAAGGACGA GTATGAACGA CATAACAGCT ATACCTGTGA651 GGCCACTCAC AAGACATCAA CTTCACCCAT TGTCAAGAGC TTCAACAGGA701 ATGAGTGTTA G (SEQ ID n°.: 10)
A seqüência de aminoácidos de forma madura (peptí-deo sinal removido) de Ab-D HC cadeia pesada é como segue:1 EVQLQQSGPE LVTPGASVKI SCKASGYTFT DHYMSWVKQS HGKSLEWIGB51 INPYSGEFT YNQKFKGTATL TVDKSSSIAY MEIRGLTSED SAVYYCARDD101 YDASPFAYWG QGTLVTVSAA KTTPPSVYPL APGSAAQTNS MVTLGCLVKG151 YFPEPVTVTW NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL YTLSSSVTVP SSTWPSETVT201 CNVAHPASST KVDKKTVPRD CGCKPCICTV PEVSSVFIFP PKPKDVLTIT251 LTPKVTCVVVD ISKDDPEVQ FSWFVDDVEV HTAQTQPREE QFNSTFRSVS301 ELPIMHQDWL NGKEFKCRVN SPAFPAPIEK TISKTKGRPK APQVYTIPPP351 KEQMAKDKVS LTCMITDFFP EDITVEWQWN GQPAENYKNT QPIMDTDGSY401 FIYSKLNVQK SNWEAGNTFT CSVLHEGLHNHHTEKSLSHS PGK (SEQ IDn°.: 11 )
A seqüência de ácidos nucléicos codificando a for-ma madura (peptideo sinal removido) de Ab-D HC é:
1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTGGTGACGC CTGGGGCTTC51 AGTGAAGATA TCTTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACCACTACA101 TGAGCTGGGT GAAGCAGAGT CATGGAAAAA GCCTTGAGTG GATTGGAGAT151 ATTAATCCCT ATTCTGGTGA AACTACCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAC201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCTTCCAG TATAGCCTAC ATGGAGATCC251 GCGGCCTGAC 'ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGAGATGAT301 TACGACGCCT CTCCGTTTGC TTACTGGGGC CAAGGGACTC TGGTCACTGT351 CTCTGCAGCC AAAACGACAC CCCCATCTGT CTATCCACTG GCCCCTGGAT4 01 CTGCTGCCCA AACTAACTCC ATGGTGACCC TGGGATGCCT GGTCAAGGGC451 TATTTCCCTG AGCCAGTGAC AGTGACCTGG AACTCTGGAT CCCTGTCCAG501 CGGTGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTGCA GTCTGACCTC TACACTCTGA551 GCAGCTCAGT GACTGTCCCC TCCAGCACCT GGCCCAGCGA GACCGTCACC601 TGCAACGTTG CCCACCCGGC CAGCAGCACC AAGGTGGACA AGAAAATTGT651 GCCCAGGGAT TGTGGTTGTA AGCCTTGCAT ATGTACAGTC CCAGAAGTAT
7 01 CATCTGTCTT CATCTTCCCC CCAAAGCCCA AGGATGTGCT CACCATTACT7 51 CTGACTCCTA AGGTCACGTG TGTTGTGGTA GACATCAGCA AGGATGATCC
8 01 CGAGGTCCAG TTCAGCTGGT TTGTAGATGA TGTGGAGGTG CACACAGCTC851 AGACGCAACC CCGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACTTTCCG CTCAGTCAGT901 GAACTTCCCA TCATGCACCA GGACTGGCTC AATGGCAAGG AGTTCAAATG951 CAGGGTCAAC AGTCCAGCTT TCCCTGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA1001 AAACCAAAGG CAGACCGAAG GCTCCACAGG TGTACACCAT TCCACCTCCC1051 AAGGAGCAGA TGGCCAAGGA TAAAGTCAGT CTGACCTGCA TGATAACAGA
As seqüências CDR (região determinante de comple-mentaridade) na região variável da cadeia pesada de Ab-D sãocomo segue:
CDR-H1 : DHYMS (SEQ ID n°.:39)CDR-H2: DINPYSGETTYNQKFKG (SEQ ID n°.:40)CDR-H3: DDYDASPFAY (SEQ ID n°.:41)
As seqüências de regiões variáveis de cadeia leveCDR de Ab-D são:
CDR-L1 : QASQGTSINLN (SEQ ID n°.:42)CDR-L2: GSSNLED (SEQ ID n°.:43)CDR-L3 : LQHSYLPYT (SEQ ID n°.:44)Ab-CAnticorpo C (também referido aqui como Ab-C e Mab-C) é um anticorpo de camundongo que exibe alta afinidade deligação à esclerostina. 0 padrão de ligação BIAcore de Ab-Cé mostrado na Figura 17. A seqüência de aminoácidos de formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-C de cadeia leve écomo segue:
1 DIVLTQSPAS LTVSLGLRAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL51 LIYAASNLES GIPARFSGNG SGTDFTLNIH PVEEEDAVTY YCQQSNEDPW101 TFGGGTKLEI KRADAAPTVS IFPPSSEQLT SGGASVVCFL NNFYPKDINV151 KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS STLTLTKDEY ERHNSYTCEA201 THKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ ID n°.: 15)
A seqüência de ácidos nucléicos codificando a for-ma madura (peptideo sinal removido) de Ab-C LC é:
1 GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGACTGTGT CTCTAGGCCT 51 GAGGGCCACC ATCTCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT TATGATGGTG101 ATAGTTATAT GAACTGGTAC CAGCAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC151 CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GGGATCCCAG CCAGGTTTAG2 01 TGGCAATGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT CCTGTGGAGG251 AGGAGGATGC TGTAACCTAT TACTGTCAAC AAAGTAATGA GGATCCGTGG301 ACGTTCGGTG GAGGCACCAA GCTGGAAATC AAACGGGCTG ATGCTGCACC351 AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA TCTGGAGGTG4 01 CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA CATCAATGTC451 AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC TGAACAGTTG501 GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC AGCACCCTCA 551 CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC CTGTGAGGCC601 ACTCACAAGACATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA ACAGGAATGA651 GTGTTAG (SEQ ID n°.:16)
A seqüência de aminoácidos de Ab-C LC incluindopeptideo sinal é:
1 METDTILLWV LLLWVPGSTG DIVLTQSPAS LTVSLGLRAT ISCKASQSVD51 YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNLES GIPARFSGNG SGTDFTLNIH101 PVEEEDAVTY YCQQSNEDPW TFGGGTKLEI KRADAAPTVS IFPPSSEQLT151 SGGASVVCFL NNFYPKDINV KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS201 STLTLTKDEY ERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ ID n°.:17)
A seqüência de ácidos nucléicos de Ab-C LC inclu-indo a seqüência de codificação de peptideo sinal é:
ATGGAGACAG ACACAATCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG
51 CTCCACTGGT GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGACTGTGT
101 CTCTAGGCCT GAGGGCCACC ATCTCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT
151 TATGATGGTG ATAGTTATAT GAACTGGTAC CAGCAGAAAC CAGGACAGCC
201 ACCCAAACTC CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GGGATCCCAG
251 CCAGGTTTAG TGGCAATGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT
301 CCTGTGGAGG AGGAGGATGC TGTAACCTAT TACTGTCAAC AAAGTAATGA
351 GGATCCGTGG ACGTTCGGTG GAGGCACCAA GCTGGAAATC AAACGGGCTG
401 ATGCTGCACC AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA
451 TCTGGAGGTG CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA
501 CATCAATGTC AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC
551 TGAACAGTTG GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC
601 AGCACCCTCA CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC
651 CTGTGAGGCC ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA
701 ACAGGAATGA GTGTTAG (SEQ ID n°.: 1 .8)
Ab-C Cadeia pesada
A seqüência de aminoácidos de forma madura (pepti-
deo sinal removido) de Ab-C HC é:
1 EVQLQQSGPE LVKPGTSVKM SCKASGYTFT DCYMNWVKQS HGKSLEWIGD51 INPFNGGTTY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MQLNSLTSDD SAVYYCARSH101 YYFDGRVPWD AMDYWGQGTS VTVSSAKTTP PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPA VLQSDLYTLS SSVTVPSSTW201 PSETVTCNVA HPASSTKVDK KIVPRDCGCK PCICTVPEVS SVFIFPPKPK251 DVLTITLTPK VTCVVVDISK DDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS301 TFRSVSELPI MHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV351 YTIPPPKEQM AKDKVSLTCM ITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM401 DTDGSYFIYS KLNVQKSNWE AGNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK(SEQ ID n°.: 19)
A seqüência de ácidos nucléicos codificando a for-ma madura (peptideo sinal removido) de Ab-C HC é como segue:
1 GAGGTCCAGC TGCAACAATC TGGACCTGAG CTGGTGAAGC CTGGGACTTC
51 AGTGAAGATG TCCTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTGCTACA
101 TGAACTGGGT GAAGCAGAGC CATGGGAAGA GCCTTGAATG GATTGGAGAT
151 ATTAATCCTT TCAACGGTGG TACTACCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA
201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAC ATGCAGCTCA
251 ACAGCCTGAC ATCTGACGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATCCCAT
301 TATTACTTCG ATGGTAGAGT CCCTTGGGAT GCTATGGACT ACTGGGGTCA
351 AGGAACCTCA GTCACCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT
401 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA CTAACTCCAT GGTGACCCTG
451 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG CCAGTGACAG TGACCTGGAA
501 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTGCAGT
551 CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CTGTCCCCTC CAGCACCTGG
601 CCCAGCGAGA CCGTCACCTG CAACGTTGCC CACCCGGCCA GCAGCACCAA
651 GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG TGGTTGTAAG CCTTGCATAT
701 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA TCTTCCCCCC AAAGCCCAAG
751 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG GTCACGTGTG TTGTGGTAGA
801 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT CAGCTGGTTT GTAGATGATG851 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC
901 ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ATGCACCAGG ACTGGCTCAA
951 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG TGCAGCTTTC CCTGCCCCCA
1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA GACCGAAGGC TCCACAGGTG
1051 TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG GCCAAGGATA AAGTCAGTCT
1101 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA AGACATTACT GTGGAGTGGC
1151 AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGAACTACA AGAACACTCA GCCCATCATG
1201 GACACAGATG GCTCTTACTT CATCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG
1251 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC
1301 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATG (SEQ ID n°.-20)
A seqüência de aminoácidos de Ab-C HC incluindopeptideo sinal é:
1 MGWNWIFLFL LSGTAGVYSE VQLQQSGPEL VKPGTSVKMS CKASGYTFTD
51 CYMNWVKQSH GKSLEWIGDI NPFNGGTTYN QKFKGKATLT VDKSSSTAYM
101 QLNSLTSDDs AVYYCARSHY YFDGRVPWDA MDYWGQGTSV TVSSAKTTPP
151 SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV
201 LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKK IVPRDCGCKP
251 CICTVPEVSS VFIFPPKPKD VLTITLTPKV TCVVVDISKD DPEVQFSWFV
301 DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM HQDWLNGKEF KCRVNSAAFP
351 APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA KDKVSLTCMI TDFFPEDITV
401 EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFIYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH
451 EGLHNHHTEK SLSHSPGK (SEQ ID n°.:21)
A seqüência de ácidos nucléicos de Ab-C HC inclu-indo a seqüência de codificação de peptideo sinal é:
1 ATGGGATGGA ACTGGATCTT TCTCTTCCTC TTGTCAGGAA CTGCAGGTGT51 CTACTCTGAG GTCCAGCTGC AACAATCTGG ACCTGAGCTG GTGAAGCCTG101 GGACTTCAGT GAAGATGTCC TGTAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC151 TGCTACATGA ACTGGGTGAA GCAGAGCCAT GGGAAGAGCC TTGAATGGAT201 TGGAGATATT AATCCTTTCA ACGGTGGTAC TACCTACAAC CAGAAGTTCA251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTACATG301 CAGCTCAACA GCCTGACATC TGACGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG351 ATCCCATTAT TACTTCGATG GTAGAGTCCC TTGGGATGCT ATGGACTACT401 GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ACCGTCTCCT CAGCCAAAAC GACACCCCCA451 TCTGTCTATC CACTGGCCCC TGGATCTGCT GCCCAAACTA ACTCCATGGT501 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA AGGGCTATTT CCCTGAGCCA GTGACAGTGA551 CCTGGAACTC TGGATCCCTG TCCAGCGGTG TGCACACCTT CCCAGCTGTC601 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC TCTGAGCAGC TCAGTGACTG TCCCCTCCAG651 CACCTGGCCC AGCGAGACCG TCACCTGCAA CGTTGCCCAC CCGGCCAGCA701 GCACCAAGGT GGACAAGAAA ATTGTGCCCA GGGATTGTGG TTGTAAGCCT
751 TGCATATGTA CAGTCCCAGA AGTATCATCT GTCTTCATCT TCCCCCCAAA
801 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA TTACTCTGAC TCCTAAGGTC ACGTGTGTTG851 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA
901 GATGATGTGG AGGTGCACAC AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT951 CAACAGCACT TTCCGCTCAG TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCAGGACT1001 GGCTCAATGG CAAGGAGTTC AAATGCAGGG TCAACAGTGC AGCTTTCCCT1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC1101 ACAGGTGTAC ACCATTCCAC CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG1151 TCAGTCTGAC CTGCATGATA ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG12 01 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC12 51 CATCATGGAC ACAGATGGCT CTTACTTCAT CTACAGCAAG CTCAATGTGC1301 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT1351 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG1401 TAAATGA (SEQ ID n°.:22)
As seqüências CDR (região determinante de comple-mentaridade) na região variável da cadeia pesada de Ab-C sãocomo segue:
CDR-H1 : DCYMN (SEQ ID n°.:45)CDR-H2: DINPFNGGTTYNQKFKG (SEQ ID n°.:46)CDR-H3 : SHYYFDGRVPWDAMDY (SEQ ID n°.:47)
As seqüências de região variável CDR de cadeia le-ve de Ab-C são:
CDR-L1 : KASQ SVDYDGD SYMN (SEQ ID n°.:48)CDR-L2: AASNLES (SEQ ID n°.:49)CDR-L3 : QQSNEDPWT (SEQ ID n°.:50).
Ab-A Anticorpo A (também referido aqui como Ab-A eMab-A) é a anticorpo quimérico coelho-camundongo que exibealta afinidade de ligação à esclerostina. O padrão de liga-ção BIAcore de Ab-A é mostrado em Figura 15.Ab-A Cadeia leve
A seqüência de aminoácidos de forma madura (pepti-deo sinal removido) de Ab-A LC:
1 AQVLTQTPAS VSAAVGGTVT INCQSSQSVY DNNWLAWFQQ KPGQPPKLLI51 YDASDLASGV PSRFSGSGSG TQFTLTISGV QCADAATYYC QGAYNDVIYA101 FGGGTEVVVK RTDAAPTVSI FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK151 WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT201 HKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.:23)
A seqüência de ácidos nucléicos codificando a for-ma madura (peptideo sinal removido) de Ab-A LC:
1 GCGCAAGTGC TGACCCAGAC TCCAGCCTCC GTGTCTGCAG CTGTGGGAGG51 CACAGTCACC ATCAATTGCC AGTCCAGTCA GAGTGTTTAT GATAACAACT101 GGTTAGCCTG GTTTCAGCAG AAACCAGGGC AGCCTCCCAA GCTCCTGATT151 TATGATGCAT CCGATCTGGC ATCTGGGGTC CCATCGCGGT TCAGTGGCAG201 TGGATCTGGG ACACAGTTCA CTCTCACCAT CAGCGGCGTG CAGTGTGCCG251 ATGCTGCCAC TTACTACTGT CAAGGCGCTT ATAATGATGT TATTTATGCT
301 TTCGGCGGAG GGACCGAGGT GGTGGTCAAA CGTACGGATG CTGCACCAAC
351 TGTATCCATC TTCCCACCAT CCAGTGAGCA GTTAACATCT GGAGGTGCCT
401 CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC AACTTCTACC CCAAAGACAT CAATGTCAAG
451 TGGAAGATTG ATGGCAGTGA ACGACAAAAT GGCGTCCTGA ACAGTTGGAC
501 TGATCAGGAC AGCAAAGACA GCACCTACAG CATGAGCAGC ACCCTCACGT
551 TGACCAAGGA CGAGTATGAA CGACATAACA GCTATACCTG TGAGGCCACT
601 CACAAGACAT CAACTTCACC CATTGTCAAG AGCTTCAACA GGAATGAGTG
651 TTAG (SEQ : ID n°.:24)
A seqüência de aminoácidos de Ab-A LC incluini
peptideo sinal é :
1 MDTRAPTQLL GLLLLWLPGA TFAQVLTQTP ASVSAAVGGT VTINCQSSQS
51 VYDNNWLAWF QQKPGQPPKL LIYDASDLAS GVPSRFSGSG SGTQFTLTIS
101 GVQCADAATY YCQGAYNDVI YAFGGGTEVV VKRTDAAPTV SIFPPSSEQL
151 TSGGASVVCF LNNFYPKDIN VKWKIDGSER QNGVLNSWTD QDSKDSTYSM
201 SSTLTLTKDE YERHNSYTCE ATHKTSTSPI VKSFNRNEC (SEQ ID
n° . :25)
A seqüência de ácidos nucléicos de Ab-A LC inclu-indo a seqüência de codificação de peptideo sinal é:
2 0 1 ATGGACACGA GGGCCCCCAC TCAGCTGCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGGCT
51 CCCAGGTGCC ACATTTGCGC AAGTGCTGAC CCAGACTCCA GCCTCCGTGT101 CTGCAGCTGT GGGAGGCACA GTCACCATCA ATTGCCAGTC CAGTCAGAGT151 GTTTATGATA ACAACTGGTT AGCCTGGTTT CAGCAGAAAC CAGGGCAGCC201 TCCCAAGCTC CTGATTTATG ATGCATCCGA TCTGGCATCT GGGGTCCCAT
2 5 251 CGCGGTTCAG TGGCAGTGGA TCTGGGACAC AGTTCACTCT CACCATCAGC301 GGCGTGCAGT GTGCCGATGC TGCCACTTAC TACTGTCAAG GCGCTTATAA351 TGATGTTATT TATGCTTTCG GCGGAGGGAC CGAGGTGGTG GTCAAACGTA4 01 CGGATGCTGC ACCAACTGTA TCCATCTTCC CACCATCCAG TGAGCAGTTA451 ACATCTGGAG GTGCCTCAGT CGTGTGCTTC TTGAACAACT TCTACCCCAA501 AGACATCAAT GTCAAGTGGA AGATTGATGG CAGTGAACGA CAAAATGGCG551 TCCTGAACAG TTGGACTGAT CAGGACAGCA AAGACAGCAC CTACAGCATG601 AGCAGCACCC TCACGTTGAC CAAGGACGAG TATGAACGAC ATAACAGCTA651 TACCTGTGAG GCCACTCACA AGACATCAAC TTCACCCATT GTCAAGAGCT701 TCAACAGGAA TGAGTGTTAG (SEQ ID n°.:26)
A seqüência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-A HC é:
1 QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGFSLSS YWMNWVRQAP GEGLEWIGTI51 DSGGRTDYAS WAKGRFTISR TSTTMDLKMT SLTTGDTARY FCARNWNLWG101 QGTLVTVSSA STKGPSVYPL APGSAAQTNS MVTLGCLVKG YFPEPVTVTW151 NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL YTLSSSVTVP SSTWPSETVT CNVAHPASST201 KVDKKLVPRD CGCKPCICTV PEVSSVFIFP PKPKDVLTIT LTPKVTCVVV251 DISKDDPEVQ FSWFVDDVEV HTAQTQPREE QFNSTFRSVSE LPIMHQDWL301 NGKEFKCRVN SAAFPAPIEK TISKTKGRPK APQVYTIPPP KEQMAKDKVS351 LTCMITDFFP EDITVEWQWN GQPAENYKNT QPIMNTNGSY FVYSKLNVQK401 SNWEAGNTFT CSVLHEGLHN HHTEKSLSHS PGK (SEQ ID n°.:27)
A seqüência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptideo sinal removido) de Ab-A HC:1 CAGTCGCTGG AGGAGTCCGG GGGTCGCCTG GTCACGCCTG GGACACCCCT51 GACACTCACC TGCACAGCCT CTGGATTCTC CCTCAGTAGT TATTGGATGA101 ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGGAGGGGC TGGAATGGAT CGGAACCATT151 GATTCTGGTG GTAGGACGGA CTACGCGAGC TGGGCAAAAG GCCGATTCAC2 01 CATCTCCAGA ACCTCGACTA CGATGGATCT GAAAATGACC AGTCTGACGA251 CCGGGGACAC GGCCCGTTAT TTCTGTGCCA GAAATTGGAA CTTGTGGGGC301 CAAGGCACCC TCGTCACCGT CTCGAGCGCT TCTACAAAGG GCCCATCTGT351 CTATCCACTG GCCCCTGGAT CTGCTGCCCA AACTAACTCC ATGGTGACCC401 TGGGATGCCT GGTCAAGGGC TATTTCCCTG AGCCAGTGAC AGTGACCTGG4 51 AACTCTGGAT CCCTGTCCAG CGGTGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTGCA501 GTCTGACCTC TACACTCTGA GCAGCTCAGT GACTGTCCCC TCCAGCACCT551 GGCCCAGCGA GACCGTCACC TGCAACGTTG CCCACCCGGC CAGCAGCACC601 AAGGTGGACA AGAAAATTGT GCCCAGGGAT TGTGGTTGTA AGCCTTGCAT651 ATGTACAGTC CCAGAAGTAT CATCTGTCTT CATCTTCCCC CCAAAGCCCA7 01 AGGATGTGCT CACCATTACT CTGACTCCTA AGGTCACGTG TGTTGTGGTA7 51 GACATCAGCA AGGATGATCC CGAGGTCCAG TTCAGCTGGT TTGTAGATGA801 TGTGGAGGTG CACACAGCTC AGACGCAACC CCGGGAGGAG CAGTTCAACA851 GCACTTTCCG CTCAGTCAGT GAACTTCCCA TCATGCACCA GGACTGGCTC901 AATGGCAAGG AGTTCAAATG CAGGGTCAAC AGTGCAGCTT TCCCTGCCCC951 CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAACCAAAGG CAGACCGAAG GCTCCACAGG1001 TGTACACCAT TCCACCTCGC AAGGAGCAGA TGGCCAAGGA TAAAGTCAGT1051 CTGACCTGCA TGATAACAGA CTTCTTCCCT GAAGACATTA CTGTGGAGTG1101 GCAGTGGAAT GGGCAGCCAG CGGAGAACTA CAAGAACACT CAGCCCATCA1151 TGGACACAGA TGGCTCTTAC TTCGTCTACA GCAAGCTCAA TGTGCAGAAG12 01 AGCAACTGGG AGGCAGGAAA TACTTTCACC TGCTCTGTGT TACATGAGGG1251 CCTGCACAAC CACCATACTG AGAAGAGCCT CTCCCACTCT CCTGGTAAAT1301 GA (SEQ ID n°.:28)
A seqüência de aminoácidos de Ab-A HC incluindopeptideo sinal é:
1 METGLRWLLL VAVLKGVHCQ SLEESGGRLV TPGTPLTLTC TASGFSLSSY51 WMNWVRQAPG EGLEWIGTID SGGRTDYASW AKGRFTISRT STTMDLKMTS101 LTTGDTARYF CARNWNLWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVYPLA PGSAAQTNSM151 VTLGCLVKGY FPEPVTVTWN SGSLSSGVHT FPAVLQSDLY TLSSSVTVPS201 STWPSETVTC NVAHPASSTK VDKKIVPRDC GCKPCICTVP EVSSVFIFPP251 KPKDVLTITL TPKVTCVVVD ISKDDPEVQF SWFVDDVEVH TAQTQPREEQ301 FNSTFRSVSE LPIMHQDWLN GKEFKCRVNS AAFPAPIEKT ISKTKGRPKA351 PQVYTIPPPK EQMAKDKVSL TCMITDFFPE DITVEWQWNG QPAENYKNTQ4 01 PIMNTNGSYF VYSKLNVQKS NWEAGNTFTC SVLHEGLHNH HTEKSLSHSP451 GK (SEQ ID n°.: 29)
A seqüência de ácidos nucléicos de Ab-A HC inclu-indo a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGAGACTG GGCTGCGCTG GCTTCTCCTG GTCGCTGTGC TCAAAGGTGT51 CCACTGTCAG TCGCTGGAGG AGTCCGGGGG TCGCCTGGTC ACGCCTGGGA101 CACCCCTGAC ACTCACCTGC ACAGCCTCTG GATTCTCCCT CAGTAGTTAT151 TGGATGAACT GGGTCCGCCA GGCTCCAGGG GAGGGGCTGG AATGGATCGG201 AACCATTGAT TCTGGTGGTA GGACGGACTA CGCGAGCTGG GCAAAAGGCC251 GATTCACCAT CTCCAGAACC TCGACTACGA TGGATCTGAA AATGACCAGT301 CTGACGACCG GGGACACGGC CCGTTATTTC TGTGCCAGAA ATTGGAACTT351 GTGGGGCCAA GGCACCCTCG TCACCGTCTC GAGCGCTTCT ACAAAGGGCC4 01 CATCTGTCTA TCCACTGGCC CCTGGATCTG CTGCCCAAAC TAACTCCATG4 51 GTGACCCTGG GATGCCTGGT CAAGGGCTAT TTCCCTGAGC CAGTGACAGT501 GACCTGGAAC TCTGGATCCC TGTCCAGCGG TGTGCACACC TTCCCAGCTG551 TCCTGCAGTC TGACCTCTAC ACTCTGAGCA GCTCAGTGAC TGTCCCCTCC601 AGCACCTGGC CCAGCGAGAC CGTCACCTGC AACGTTGCCC ACCCGGCCAG651 CAGCACCAAG GTGGACAAGA AAATTGTGCC CAGGGATTGT GGTTGTAAGC
7 01 CTTGCATATG TACAGTCCCA GAAGTATCAT CTGTCTTCAT CTTCCCCCCA7 51 AAGCCCAAGG ATGTGCTCAC CATTACTCTG ACTCCTAAGG TCACGTGTGT801 TGTGGTAGAC ATCAGCAAGG ATGATCCCGA GGTCCAGTTC AGCTGGTTTG8 51 TAGATGATGT GGAGGTGCAC ACAGCTCAGA CGCAACCCCG GGAGGAGCAG901 TTCAACAGCA CTTTCCGCTC AGTCAGTGAA CTTCCCAT.CA TGCACCAGGA951 CTGGCTCAAT GGCAAGGAGT TCAAATGCAG GGTCAACAGT GCAGCTTTCC
1001 CTGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAA CCAAAGGCAG ACCGAAGGCT1051 CCACAGGTGT ACACCATTCC ACCTCCCAAG GAGCAGATGG CCAAGGATAA1101 AGTCAGTCTG ACCTGCATGA TAACAGACTT CTTCCCTGAA GACATTACTG1151 TGGAGTGGCA GTGGAATGGG CAGCCAGCGG AGAACTACAA GAACACTCAG12 01 CCCATCATGG ACACAGATGG CTCTTACTTC GTCTACAGCA AGCTCAATGT1251 GCAGAAGAGC AACTGGGAGG CAGGAAATAC TTTCACCTGC TCTGTGTTAC1301 ATGAGGGCCT GCACAACCAC CATACTGAGA AGAGCCTCTC CCACTCTCCT1351 GGTAAATGA (SEQ ID n°.:30)
As seqüências CDR (região determinante de comple-mentaridade) na região variável da cadeia pesada de Ab-A sãocomo segue:
CDR-H1: SYWMN (SEQ ID n°.:51)
CDR-H2: TIDSGGRTDYASWAKG (SEQ ID n°.:52)
CDR-H3: NWNL (SEQ ID n°.:53)
As seqüências de região variável CDR de cadeia le-ve de Ab-A são:
CDR-L1 : QSSQSVYDNNWLA (SEQ ID n°.:54)
CDR-L2: DASDLAS (SEQ ID n°.: 55)
CDR-L3 : QGAYNDVTYA (SEQ ID n°.:56)
Ab-A foi humanizado, e é referido como Anticorpo 1(também referido aqui como Ab-1), tendo as seguintes seqüências:
A seqüência de ácidos nucléicos de Ab-1 LC regiãovariável incluindo a seqüência de codificação de peptideosinal é
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCACATTTGCTCAAGTTCTGACCCAGAGTCCAAGCAGTCTCTCCGCCAGCGTAGGCGATCGTGTGACTATTACCTGTCAATCTAGTCAGAGCGTGTATGATAACAATTGGCTGGCGTGGTACCAGCAAAAACCGGGCAAAGCCCCGAAGCTGCTCATCTATGACGCGTCCGATCTGGCTAGCGGTGTGCCAAGCCGTTTCAGTGGCAGTGGCAGCGGTACTGACTTTACCCTCACAATTTCGTCTCTCCAGCCGGAAGATTTCGCCACTTACTATTGTCAAGGTGCTTACAACGATGTGATTTATGCCTTCGGTCAGGGCACTAAAGTAGAAATCAAACGT (SEQ ID n°.:74)
A seqüência de aminoácidos de região variável Ab -1 LC incluindo peptideo sinal é:
MDTRAPTOLLGLLLLWLPGATFAOVLTOSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVYDNNWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGAYNDVIYAFGQGTKVEIKR (SEQ ID n°.:75)
A seqüência de ácidos nucléicos de Ab-1 HC regiãovariável incluindo a seqüência de codificação de peptideosinal é:
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCACTGTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGAGGCGGGCTTGTCCAGCCTGGAGGGAGCCTGCGTCTCTCTTGTGCAGCAAGCGGCTTCAGCTTATCCTCTTACTGGATGAATTGGGTGCGGCAGGCACCTGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTGGGCACCATTGATTCCGGAGGCCGTACAGACTACGCGTCTTGGGCAAAGGGCCGTTTCACCATTTCCCGCGACAACTCCAAA
AATACCATGTACCTCCAGATGAACTCTCTCCGCGCAGAGGACACAGCACGTTATTACTGTGCACGCAACTGGAATCTGTGGGGTCAAGGTACTCTTGTAACAGTCTCGAGC (SEQID n ° . : 7 6 )
Seqüência de aminoácidos de Ab-1 HC região variá-vel incluindo peptideo sinal
METGLRWLLLVAVLKGVHCEVQLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFSLSSYWMNWVRQAPGKGLEWVGTIDSGGRTDYASWAKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDtARYYCARNWNLWGQGTLVTVSS (SEQ ID n°.: 77 )
As regiões CDR (região.determinante de complemen-taridade) seqüências na região variável da cadeia pesada deAb-1 são como segue:
CDR-H1: SYWMN (SEQ ID n°.:51)
CDR-H2: TIDSGGRTDYASWAKG (SEQ ID n°.:52)
CDR-H3 : NWNL (SEQ ID n°.:53)As seqüências de região variável CDR de cadeia le-ve de Ab-1 são:
CDR-L1 : QSSQSVYDNNWLA (SEQ ID n°.:54)
CDR-L2: DASDLAS (SEQ ID n°.:55)
CDR-L3: QGAYNDVTYA (SEQ ID n°.:56)
Ab-B Anticorpo B (também referido aqui como Ab-B e
Mab-B) é o anticorpo de camundongo que exibe alta afinidadede ligação à esclerostina. 0 padrão de ligação BIAcore de
Ab-B é mostrado em Figura 16.
Ab-B Cadeia leve
A seqüência de aminoácidos de forma madura (pepti-deo sinal removido) de Ab-B LC é:
1 QIVLTQSPTI VSASPGEKVT LICSASSSVS FVDWFQQKPG TSPKRWIYRT51 SNLGFGVPAR FSGGGSGTSH SLTISRMEAE DAATYYCQQR STYPPTFGAG101 TKLELKRADA APTVSIFPPS SEQLTSGGAS VVCFLNNFYP KDINVKWKID151 GSERQNGVLN SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS201 TSPIVKSFNR NEC(SEQ ID n°.:31)
A seqüência de ácidos nucléicos codificando a for-ma madura (peptideo sinal removido) de Ab-B LC é:
1 CAAATTGTTC TCACCCAGTC TCCAACAATC GTGTCTGCAT CTCCAGGGGA51 GAAGGTCACc CTAATCTGCA GTGCCAGTTC AAGTGTAAGT TTCGTGGACT101 GGTTCCAGCA GAAGCCAGGC ACTTCTCCCA AACGCTGGAT TTACAGAACA151 TCCAACCTGG GTTTTGGAGT CCCTGCTCGC TTCAGTGGCG GTGGATCTGG201 GACCTCTCAC TCTCTCACAA TCAGCCGAAT GGAGGCTGAA GATGCTGCCA251 CTTATTACTG CCAGCAAAGG AGTACTTACC CACCCACGTT CGGTGCTGGG301 ACCAAGCTGG AACTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT351 CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT401 TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGACATCA ATGTCAAGTG GAAGATTGAT4 51 GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG501 CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAGGACG551 AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA601 ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG (SEQ IDn°.:32)
A seqüência de aminoácidos de Ab-B LC incluindopeptideo sinal é:
1 MHFQVQIFSF LLISASVIVS RGQIVLTQSP TIVSASPGEK VTLICSASSS51 VSFVDWFQQK PGTSPKRWIY RTSNLGFGVP ARFSGGGSGT SHSLTISRME101 AEDAATYYCQ QRSTYPPTFG AGTKLELKRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG151 ASVVCFLNNF YPKDINVKWK IDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL201 TLTKDEYERH NSYTCEATHK TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID n°.:33)
A seqüência de ácidos nucléicos de Ab-B LC inclu-indo a seqüência de codificação de peptideo sinal é:
1 ATGCATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCCTCAGT
51 CATAGTGTCC AGAGGGCAAA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCA ACAATCGTGT
101 CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACCCTAA TCTGCAGTGC CAGTTCAAGT
151 GTAAGTTTCG TGGACTGGTT CCAGCAGAAG CCAGGCACTT CTCCCAAACG
201 CTGGATTTAC AGAACATCCA ACCTGGGTTT TGGAGTCCCT GCTCGCTTCA
251 GTGGCGGTGG ATCTGGGACC TCTCACTCTC TCACAATCAG CCGAATGGAG
301 GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAAAGGAGTA CTTACCCACC
351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAACT GAAACGGGCT GATGCTGCAC
401 CAACTGTATC CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT
451 GCCTCAGTCG TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT
501 CAAGTGGAAG ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT
551 GGACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC
601 ACGTTGACCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC
651 CACTCACAAG ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG701 AGTGTTAG (SEQ ID n°.:34) Ab-B Cadeia pesada
A seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideo sinal removido) de Ab-B HC:
1 QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLS TSGMGVGWIR HPSGKNLEWL51 AHIWWDDVKR YNPVLKSRLT ISKDTSNSQV FLKIANVDTA DTATYYCARI101 EDFDYDEEYY AMDYWGQGTS VIVSSAKTTP PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPA VLQSDLYTLS SSVTVPSSTW201 PSETVTCNVA HPASSTKVDK KIVPRDCGCK PCICTVPEVS SVFIFPPKPK251 DVLTITLTPK VTCVVVDISK DDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPBEEQFNS301 TFRSVSELPI MHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV351 YTIPPPKEQM AKDKVSLTCM ITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM4 01 DTDGSYFVYS KLNVQKSNWE AGNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK(SEQ ID n°.:35)
A seqüência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptideo sinal removido) de Ab-B HC:
1 CAGGTTACTC TGAAAGAGTC TGGCCCTGGG ATATTGCAGC CCTCCCAGAC51 CCTCAGTCTG ACTTGTTCTT TCTCTGGGTT TTCACTGAGC ACTTCTGGTA101 TGGGTGTAGG CTGGATTCGT CACCCATCAG GGAAGAATCT GGAGTGGCTG151 GCACACATTT GGTGGGATGA TGTCAAGCGC TATAACCCAG TCCTGAAGAG2 01 CCGACTGACT ATCTCCAAGG ATACCTCCAA CAGCCAGGTA TTCCTCAAGA251 TCGCCAATGT GGACACTGCA GATACTGCCA CATACTACTG TGCTCGAATA301 GAGGACTTTG ATTACGACGA GGAGTATTAT GCTATGGACT ACTGGGGTCA351 AGGAACCTCA GTCATCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT4 01 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA CTAACTCCAT GGTGACCCTG451 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG CCAGTGACAG TGACCTGGAA501 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTGCAGT551 CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CTGTCCCCTC CAGCACCTGG601 CCCAGCGAGA CCGTCACCTG CAACGTTGCC CACCCGGCCA GCAGCACCAA651 GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG TGGTTGTAAG CCTTGCATAT701 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA TCTTCCCCCC AAAGCCCAAG51 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG GTCACGTGTG TTGTGGTAGA801 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT CAGCTGGTTT GTAGATGATG851 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC901 ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ATGCACCAGG ACTGGCTCAA951 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG TGCAGCTTTC CCTGCCCCCA1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA GACCGAAGGC TCCACAGGTG1051 TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG GCCAAGGATA AAGTCAGTCT1101 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA AGACATTACT GTGGAGTGGC1151 AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGAACTACA AGAACACTCA GCCCATCATG1201 GACACAGATG GCTCTTACTT CGTCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG1251 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC1301 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATGA(SEQ ID n°.:36)
A seqüência de aminoácidos de Ab-B HC incluindopeptideo sinal:
1 MGRLTSSFLL LIVPAYVLSQ VTLKESGPGI LQPSQTLSLT CSFSGFSLST51 SGMGVGWIRH PSGKNLEWLA HIWWDDVKRY NPVLKSRLTI SKDTSNSQVF101 LKIANVDTAD TATYYCARIE DFDYDEEYYA MDYWGQGTSV IVSSAKTTPP151 SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV201 LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKK IVPRDCGCKP251 CICTVPEVSS VFIFPPKPKD VLTITLTPKV TCVVVDISKD DPEVQFSWFV301 DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM HQDWLNGKEF KCRVNSAAFP351 APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA KDKVSLTCMI TDFFPEDITV401 EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFVYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH451 EGLHNHHTEK SLSHSPGK (SEQ ID n°.:37)
A seqüência de ácidos nucléicos de Ab-B HC inclu-indo a seqüência de codifi'1 ATGGGCAGGC TTACTTCTTC51 ccTGTCccAG GTTACTCTGA101 CCCAGACCCT CAGTCTGACT 151 TCTGGTATGG GTGTAGGCTG201 GTGGCTGGCA CACATTTGGT251 TGAAGAGCCG ACTGACTATC301 CTCAAGATCG CCAATGTGGA351 TCGAATAGAG GACTTTGATT4 01 GGGGTCAAGG AACCTCAGTC4 51 TCTGTCTATC CACTGGCCCC501 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA551 CCTGGAACTC TGGATCCCTG601 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC651 CACCTGGCCC AGCGAGACCG
7 01 GCACCAAGGT GGACAAGAAA751 TGCATATGTA CAGTCCCAGA
8 01 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA851 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT
901 GATGATGTGG AGGTGCACAC951 CAACAGCACT TTCCGCTCAG1001 GGCTCAATGG CAAGGAGTTC1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT1101 ACAGGTGTAC ACCATTCCAC1151 TCAGTCTGAC CTGCATGATA12 01 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA1251 CATCATGGAC ACAGATGGCT1301 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA
:ação de peptideo sinal:
ATTCCTGCTA CTGATTGTCC CTGCATATGT
AAGAGTCTGG CCCTGGGATA TTGCAGCCCT
TGTTCTTTCT CTGGGTTTTC ACTGAGCACT
GATTCGTCAC CCATCAGGGA AGAATCTGGA
GGGATGATGT CAAGCGCTAT AACCCAGTCC
TCCAAGGATA CCTCCAACAG CCAGGTATTC
CACTGCAGAT ACTGCCACAT ACTACTGTGC
ACGACGAGGA GTATTATGCT ATGGACTACT
ATCGTCTCCT CAGCCAAAAC GACACCCCCA
TGGATCTGCT GCCCAAACTA ACTCCATGGT
AGGGCTATTT CCCTGAGCCA GTGACAGTGA
TCCAGCGGTG TGCACACCTT CCCAGCTGTC
TCTGAGCAGC TCAGTGACTG TCCCCTCCAG
TCACCTGCAA CGTTGCCCAC CCGGCCAGCA
ATTGTGCCCA GGGATTGTGG TTGTAAGCCT
AGTATCATCT GTCTTCATCT TCCCCCCAAA
TTACTCTGAC TCCTAAGGTC ACGTGTGTTG
GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA
AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT
TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCAGGACT
AAATGCAGGG TCAACAGTGC AGCTTTCCCT
CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC
CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG
ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG
GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC
CTTACTTCGT CTACAGCAAG CTCAATGTGC
GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT1351 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG1401 TAAATGA (SEQ ID n°.:38)
As seqüências CDR (região determinante de comple-mentaridade) na região variável da cadeia pesada de Ab-B sãocomo segue:
CDR-H1 : TSGMGVG (SEQ ID n°.:57)CDR-H2: ff1WWDDVKRYNPVLKS (SEQ ID n°.:58)CDR-H3 : EDFDYDEEYYAMDY (SEQ ID n°.:59)
As seqüências de região CDR cadeia leve variávelde Ab-B são:
CDR-L1: SASSSVSFVD (SEQ ID n°.: 60)CDR-L2: RTSNLGF (SEQ ID n°.: 61)CDR-L3: QQRSTYPPT (SEQ ID n°.: 62)
Os anticorpos divulgados aqui se ligam a regiõesde esclerostina humana que são importantes para in vivo naatividade da proteína. A ligação de um anticorpo para escle-rostina podem ser correlacionados com aumentos de, por exem-plo, a densidade mineral óssea alcançada pelo uso do anti-corpo in vivo, como descrito em Exemplos 5 e 9 (ratos) e E-xemplo 12 (macaco) . Aumenta em pelo menos um dos formaçãoóssea, conteúdo mineral ósseo, massa óssea, qualidade ósseae força óssea também pode ser obtida por utilização do anti-corpo in vivo, como descrito em Exemplos 5 e 9 (ratos) e E-xemplo 12 (macaco). Desde a ligação de um anticorpo para es-clerostina é principalmente determinada pelos seus CDR se-qüências, um anticorpo para praticar a invenção pode ser ge-rada com todas ou algumas das seqüências CDR divulgada em umenquadramento adequado, onde o anticorpo retém a capacidadede se ligam especificamente a esclerostina, E pode-se espe-rar para conseguir aumentos de, por exemplo, a densidade mi-neral óssea. Esses anticorpos são úteis no tratamento de se-res humanos ou animais são causadas por condições que, asso-ciado com, ou resultar em pelo menos uma de baixa formaçãoóssea, baixa densidade mineral óssea, baixo conteúdo mineralósseo, baixa massa óssea, baixa qualidade óssea e baixa for-ça óssea. Os métodos de construção e expressão de anticorpose fragmentos dos mesmos compreendendo CDR's da presente in-venção são bem conhecidos pelos técnicos versados na técnica.
A presente invenção se refere, portanto, em umamodalidade de um anticorpo isolados, inclusive Ab-A, ou umfragmento antigeno ligação, que se liga especificamente àesclerostina e onde a variável dominio da cadeia pesada com-preende pelo menos uma CDR com como seqüências dadas em SEQID n°.: 51 de CDR-H1, SEQ ID n°.: 52 de CDR-H2 e SEQ ID n°.:53 de CDR-H3. O anticorpo ou antigênio ligação fragmento de-la podem incluir uma cadeia pesada variável dominio no qualos CDRs constituídas, em pelo menos um dos peptideos de SEQID n°.: 51 de CDR-H1, SEQ ID n°.: 52 de CDR-H2 e SEQ ID n° .:53 de CDR-H3.
Quando nos anticorpos da invenção uma cadeia leveestá presente a cadeia leve pode ser qualquer cadeia comple-mentares adequados e podem, em particular, ser selecionadosa partir de uma cadeia leve onde a variável dominio incluipelo menos uma CDR com como seqüências dadas em SEQ ID n°.:
54 de CDR-L1, SEQ ID n° . : 55 de CDR-L2 e SEQ ID n° . : 56 deCDR-L3. O anticorpo ou antigênio ligação desse fragmento po-de incluir um dominio variável de cadeia leve no qual os C-DRs constituídas, em pelo menos um dos peptideos de SEQ IDn°.: 54 de CDR-L1, SEQ ID n°.: 55 de CDR-L2 e SEQ ID n°.: 56de CDR-L3.
A presente invenção ainda se refere a um anticorpoisolados, inclusive
Ab-B, ou um fragmento antigeno ligação ora, que seliga especificamente à esclerostina e onde a variável domi-nio da cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR com comoseqüências dadas em SEQ ID n°.: 57 de CDR-Hl, SEQ ID n°.: 58Para CDR-H2 e SEQ ID n°.: 59 de CDR-H3. O anticorpo ou anti-gênio ligação fragmento dela podem incluir uma cadeia pesadavariável dominio no qual os CDRs constituídas, em pelo menosum dos peptideos de SEQ ID n°.: 57 de CDR-Hl, SEQ ID n°.: 58de CDR-H2 e SEQ ID n°.: 59 de CDR-H3.
Quando nos anticorpos da invenção uma cadeia leveestá presente a cadeia leve pode ser qualquer cadeia comple-mentares adequados e podem, em particular, ser selecionadosa partir de uma cadeia leve onde a variável dominio incluipelo menos uma CDR com como seqüências dadas em SEQ ID n°. :60 de CDR-L1, SEQ ID n° . : 61 de CDR-L2 e SEQ ID n° . : 62 deCDR-L3. O anticorpo ou antigênio de ligação desse fragmentopode incluir um dominio variável de cadeia leve no qual asCDRs constituídas, em pelo menos um dos peptideos de SEQ IDn°.: 60 de CDR-L1, SEQ ID n°.: 61 de CDR-L2 e SEQ ID n° . : 62de CDR-L3. A presente invenção ainda se refere a um anticor-po isolados, inclusive Ab-C, ou um fragmento antigeno liga-ção ora, que se liga especificamente à esclerostina e onde avariável dominio da cadeia pesada compreende pelo menos umaCDR com como seqüências dadas em SEQ ID n° . : 45 de CDR-H1,SEQ ID n°.: 46 de CDR-H2 e SEQ ID n°.: 47 de CDR-H3. O anti-corpo ou antigênio ligação fragmento dela podem incluir umacadeia pesada variável dominio no qual os CDRs constituídas,em pelo menos um dos peptideos de SEQ ID n°.: 45 de CDR-H1,SEQ ID n°.: 46 de CDR-H2 e SEQ ID n°.: 47 de CDR-H3.
Quando nos anticorpos da invenção uma cadeia leveestá presente a cadeia leve pode ser qualquer cadeia comple-mentares adequados e podem, em particular, ser selecionadosa partir de uma cadeia leve onde a variável dominio incluipelo menos uma CDR com como seqüências dadas em SEQ ID n°.:48 de CDR-L1, SEQ ID n° . : 49 de CDR-L2 e SEQ ID n° . : 50 deCDR-L3. O anticorpo ou antigênio ligação desse fragmento po-de incluir um dominio variável de cadeia leve no qual os C-DRs constituídas, em pelo menos um dos peptideos de SEQ IDn°.: 48 de CDR-L1, SEQ ID n°.: 49 de CDR-L2 e SEQ ID n°.: 50de CDR-L3. A presente invenção também se refere a um únicoanticorpo, incluindo Ab-D, ou um fragmento antigeno ligaçãoora, que se liga especificamente à esclerostina e onde a va-riável dominio da cadeia pesada compreende pelo menos umaCDR com como seqüências dadas em SEQ ID n°.: 39 para CDR-H1,SEQ ID n°.: 40 de CDR-H2 e SEQ ID n°.: 41 de CDR-H3. O anti-corpo ou antigênio ligação fragmento dela podem incluir umacadeia pesada variável dominio no qual os CDRs constituídas,em pelo menos um dos peptideos de SEQ ID n°.: 39 de CDR-H1,SEQ ID n°.: 40 de CDR-H2 e SEQ ID n°.: 41 de CDR-H3.Quando nos anticorpos da invenção uma cadeia leveestá presente a cadeia leve pode ser qualquer cadeia comple-mentares adequados e podem, em particular, ser selecionadosa partir de uma cadeia leve onde a variável dominio incluipelo menos uma CDR com como seqüências dadas em SEQ ID n°.:42 de CDR-L1, SEQ ID n° . : 43 de CDR-L2 e SEQ ID n° . : 44 deCDR-L3. 0 anticorpo ou antigênio de ligação desse fragmentopode incluir um dominio variável de cadeia leve no qual osCDRs constituídas, em pelo menos um dos peptideos de SEQ IDn°.: 42 de CDR-L1, SEQ ID n°.: 43 de CDR-L2 e SEQ ID n° . : 44de CDR-L3.
Anticorpos anti-esclerostina adicionais são des-critas a seguir. Para alguns dos aminoácidos seqüências acomplementaridade-determinação regiões (CDRs) são embalados-sombreadas e o constante regiões estão em negrito, itálico.
Ab-2
As seqüências do Anticorpo 2 (também designada porAb-2) LC e HC são como seguintes:Ab-2 Cadeia leve:
Aminoácido seqüência de forma madura (peptideo si-nal removida) do Ab-2 LC:
1 QIVLSQSPAI LSTSPGEKVT MTCRASSSVY YMHWYQQKPG SSPKPWIYAT51 SNLASGVPVR FSGSGSGTSY SLTITRVEAE DAATYYCQQW SSDPLTFGAG101 TKLELKRADA APTVSIFPPS SEQLTSGGAS VVCFLNNFYP KDINVKWKID151 GSERQNGVLN SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS201 TSPIVKSFNR NEC (ID NO seguintes: 117)
Seqüência de codificação de ácidos nucléicos deforma madura (peptideo sinal removida) do Ab-2 LC:1 CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTACAT CTCCAGGGGA
51 GAAGGTCACA ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTATAT TACATGCACT
101 GGTACCAGCA GAAGCCAGGA TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA
151 TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGTTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG
201 GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCACCAGAGT GGAGGCTGAA GATGCTGCCA
251 CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGTGCTGGG
301 ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT
351 CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT
401 TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGACATCA ATGTCAAGTG GAAGATTGAT
451 GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG
501 CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAGGACG
551 AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA
601 ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG (SEQ n° . 118)
Seqüência de. aminoácidos de Ab-2 LC incluindo pep-tideo sinal:
1 MDFQVQIFSF LLISASVIMS RGQIVLSQSP AILSTSPGEK VTMTCRASSS51 VYYMHWYQQK PGSSPKPWIY ATSNLASGVP VRFSGSGSGT SYSLTITRVE101 AEDAATYYCQ QWSSDPLTFG AGTKLELKRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG151 ASVVCFLNNF YPKDINVKWK IDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL
201 TLTKDEYERH NSYTCEATHK TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID n°.: 119)Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-2 LC incluindoa seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT 51 CATTATGTCC AGGGGACAAA TTGTTCTCTC CCAGTCTCCA GCAATCCTGT101 CTACATCTCC AGGGGAGAAG GTCACAATGA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT151 GTATATTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGATCCT CCCCCAAACC201 CTGGATTTAT GCCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT GTTCGCTTCA251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAC CAGAGTGGAG301 GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAAACGGGCT GATGCTGCAC4 01 CAACTGTATC CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT451 GCCTCAGTCG TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT501 CAAGTGGAAG ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT551 GGACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC601 ACGTTGACCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC651 CACTCACAAGACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG701 AGTGTTAG (SEQ ID n°.: 120) Ab-2 Cadeia pesada
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-2 HC:
1 EVQVQQSGPE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DYFIHWVKQR PEQGLEWIGR51 LDPEDGESDY APKFQDKAIM TADTSSNTAY LQLRSLTSED TAIYYCERED101 YDGTYTFFPY WGQGTLVTVS AAKTTPPSVY PLAPGSAAQT NSMVTLGCLV151 KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VHTFPAVLQS DLYTLSSSVT VPSSTWPSET2 01 VTCNVAHPAS STKVDKKIVP RDCGCKPCIC TVPEVSSVFI FPPKPKDVLT251 ITLTPKVTCV VVDISKDDPE VQFSWFVDDV EVHTAQTQPR EEQFNSTFRS301 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPI EKTISKTKGR PKAPQVYTIP351 PPKEQMAKDK VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMDTDG4 01 SYFIYSKLNV QKSNWEAGNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK(SEQ ID n°.:121)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-2 HC:
1 GAGGTTCAGG TGCAGCAGTC TGGGCCAGAA CTTGTGAAGC CAGGGGCCTC51 AGTCAAGTTG TCCTGCACAG CTTCTGGCTT CAACATTAAA GACTACTTTA101 TACACTGGGT GAAGCAGAGG CCTGAACAGG GCCTGGAGTG GATTGGAAGG151 CTTGATCCTG AGGATGGTGA AAGTGATTAT GCCCCGAAGT TCCAGGACAA201 GGCCATTATG ACAGCAGACA CATCATCCAA CACAGCCTAT CTTCAGCTCA251 GAAGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCATCT ATTATTGTGA GAGAGAGGAC301 TACGATGGTA CCTACACCTT TTTTCCTTAC TGGGGCCAAG GGACTCTGGT351 CACTGTCTCT GCAGCCAAAA CGACACCCCC ATCTGTCTAT CCACTGGCCC401 CTGGATCTGC TGCCCAAACT AACTCCATGG TGACCCTGGG ATGCCTGGTC451 AAGGGCTATT TCCCTGAGCC AGTGACAGTG ACCTGGAACT CTGGATCCCT501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTGCAGTCT GACCTCTACA551 CTCTGAGCAG CTCAGTGACT GTCCCCTCCA GCACCTGGCC CAGCGAGACC601 GTCACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC AGCACCAAGG TGGACAAGAA651 AATTGTGCCC AGGGATTGTG GTTGTAAGCC TTGCATATGT ACAGTCCCAG701 AAGTATCATC TGTCTTCATC TTCCCCCCAA AGCCCAAGGA TGTGCTCACC751 ATTACTCTGA CTCCTAAGGT CACGTGTGTT GTGGTAGACA TCAGCAAGGA801 TGATCCCGAG GTCCAGTTCA GCTGGTTTGT AGATGATGTG GAGGTGCACA851 CAGCTCAGAC GCAACCCCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC TTTCCGCTCA901 GTCAGTGAAC TTCCCATCAT GCACCAGGAC TGGCTCAATG GCAAGGAGTT951 CAAATGCAGG GTCAACAGTG CAGCTTTCCC TGCCCCCATC GAGAAAACCA1001 TCTCCAAAAC CAAAGGCAGA CCGAAGGCTC CACAGGTGTA CACCATTCCA1051 CCTCCCAAGG AGCAGATGGC CAAGGATAAA GTCAGTCTGA CCTGCATGAT1101 AACAGACTTC TTCCCTGAAG ACATTACTGT GGAGTGGCAG TGGAATGGGC1151 AGCCAGCGGA GAACTACAAG AACACTCAGC CCATCATGGA CACAGATGGC1201 TCTTACTTCA TCTACAGCAA GCTCAATGTG CAGAAGAGCA ACTGGGAGGC1251 AGGAAATACT TTCACCTGCT CTGTGTTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC1301 ATACTGAGAA GAGCCTCTCC CACTCTCCTG GTAAATGA (SEQ ID n° .122)
Seqüência de aminoácidos de Ab-2 HC incluindo peptideo sinal:
1 MKCSWVIFFL MAVVTGVNSE VQVQQSGPEL VKPGASVKLS CTASGFNIKD51 YFIHWVKQRP EQGLEWIGRL DPEDGESDYA PKFQDKAIMT ADTSSNTAYL101 QLRSLTSEDT AIYYCEREDY DGTYTFFPYW GQGTLVTVSA AKTTPPSVYP
151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD
201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT
251 VPEVSSVFIF PPKPKDVLTI TLTPKVTCVV VDISKDDPEV QFSWFVDDVE
301 VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE
351 KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW
401 NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH
451 NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID n°.: 123)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-2 HC incluindo a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT
51 CAATTCAGAG GTTCAGGTGC AGCAGTCTGG GCCAGAACTT GTGAAGCCAG
101 GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC TGCACAGCTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC
151 TACTTTATAC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT GAACAGGGCC TGGAGTGGAT
201 TGGAAGGCTT GATCCTGAGG ATGGTGAAAG TGATTATGCC CCGAAGTTCC
51 AGGACAAGGC CATTATGACA GCAGACACAT CATCCAACAC AGCCTATCTT 301 CAGCTCAGAA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCATCTATT ATTGTGAGAG
351 AGAGGACTAC GATGGTACCT ACACCTTTTT TCCTTACTGG GGCCAAGGGA
401 CTCTGGTCAC TGTCTCTGCA GCCAAAACGA CACCCCCATC TGTCTATCCA
451 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC TCCATGGTGA CCCTGGGATG
501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT GACAGTGACC TGGAACTCTG
551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT GCAGTCTGAC
601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCCTCCAGCA CCTGGCCCAG
651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC GGCCAGCAGC ACCAAGGTGG
701 ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT GTAAGCCTTG CATATGTACA
751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CTTCATCTTC CCCCCAAAGC CCAAGGATGT
801 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTGTGTTGTG GTAGACATCA
851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT GGTTTGTAGA TGATGTGGAG901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACTTT951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CCAGGACTGG CTCAATGGCA1001 AGGAGTTCAA ATGCAGGGTC AACAGTGCAG CTTTCCCTGC CCCCATCGAG1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGCAGACCG AAGGCTCCAC AGGTGTACAC1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG1201 AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC1251 AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC1351 AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AATGA (SEQID n°.: 124)
Ab-3
As seqüências da Anticorpo 3 (também referido aquicomo Ab-3) LC e HC são como segue:
Ab-3 Cadeia leve Seqüência de aminoácidos de formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-3 LC:
1 EIVLTQSPAL MAASPGEKVT ITCSVSSTIS SNHLHWFQQK SDTSPKPWIY51 GTSNLASGVP VRFSGSGSGT SYSLTISSME AEDAATYYCQ QWSSYPLTFG101 AGTKLELRRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG ASVVCFLNNF YPKDINVKWK151 IDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL TLTKDEYERH NSYTCEATHK201 TSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 125)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-3 LC:
1 GAAATTGTGC TCACCCAGTC TCCAGCACTC ATGGCTGCAT CTCCGGGGGA51 GAAGGTCACC ATCACCTGCA GTGTCAGTTC AACTATAAGT TCCAACCACT101 TGCACTGGTT CCAGCAGAAG TCAGACACCT CCCCCAAACC CTGGATTTAT151 GGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT GTTCGCTTCA GTGGCAGTGG201 ATCTGGGACC TCTTATTCTC TCACAATCAG CAGCATGGAG GCTGAGGATG251 CTGCCACTTA TTACTGTCAA CAGTGGAGTA GTTACCCACT CACGTTCGGC
301 GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAGACGGGCT GATGCTGCAC CAACTGTATC
351 CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT GCCTCAGTCG
401 TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT CAAGTGGAAG
451 ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT GGACTGATCA
501 GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC ACGTTGACCA
551 AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC CACTCACAAG
601 ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG AGTGTTAG
(SEQ ID n°.: 126)
Seqüência de aminoácidos de Ab-3 LC incluindo pep-tideo sinal:
1 MDFHVGIFSF MLISVTVILS SGEIVLTQSP ALMAASPGEK VTITCSVSST51 ISSNHLHWFQ QKSDTSPKPW IYGTSNLASG VPVRFSGSGS GTSYSLTISS101 MEAEDAATYY CQQWSSYPLT FGAGTKLELR RADAAPTVSI FPPSSEQLTS151 GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS
201 TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC (SEQ ID n°.:127)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-3 LC incluindoa seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGATTTTC ATGTGCAGAT TTTCAGCTTC ATGCTAATCA GTGTCACAGT51 CATTTTGTCC AGTGGAGAAA TTGTGCTCAC CCAGTCTCCA GCACTCATGG101 CTGCATCTCC GGGGGAGAAG GTCACCATCA CCTGCAGTGT CAGTTCAACT151 ATAAGTTCGA ACCACTTGCA CTGGTTCCAG CAGAAGTCAG ACACCTCCCC201 CAAACCCTGG ATTTATGGCA CATCCAACCT GGCTTCTGGA GTCCCTGTTC
251 GCTTCAGTGG CAGTGGATCT GGGACCTCTT ATTCTGTCAC AATCAGCAGC301 ATGGAGGCTG AGGATGCTGC CACTTATTAC TGTCAACAGT GGAGTAGTTA351 CCCACTCACG TTCGGCGCTG GGACCAAGCT GGAGCTGAGA CGGGCTGATG4 01 CTGCACCAAC TGTATCCATC TTCCCACCAT CCAGTGAGCA GTTAACATCT451 GGAGGTGCCT CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC AACTTCTACC CCAAAGACAT501 CAATGTCAAG TGGAAGATTG ATGGCAGTGA ACGACAAAAT GGCGTCCTGA551 ACAGTTGGAC TGATCAGGAC AGCAAAGACA GCACCTACAG CATGAGCAGC601 ACCCTCACGT TGACCAAGGA CGAGTATGAA CGACATAACA GCTATACCTG651 TGAGGCCACT CACAAGACAT CAACTTCACC CATTGTCAAG AGCTTCAACA701 GGAATGAGTG TTAG (SEQ ID n°.: 128)
Ab-3 Cadeia pesada Seqüência de aminoácidos deforma madura (peptideo sinal removido) de Ab-3 HC:
1 EVQLQQSGAE LVRPGALVKL SCTASDFNIK DFYLHWMRQR PEQGLDWIGR51 IDPENGDTLY DPKFQDKATL TTDTSSNTAY LQLSGLTSET TAVYYCSREA101 DYFHDGTSYW YFDVWGAGTT ITVSSAKTTP PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPA VLQSDLYTLS SSVTVPSSTW201 PSETVTCNVA HPASSTKVDK KIVPRDCGCK PCICTVPEVS SVFIFPPKPK251 DVLTITLTPK VTCVWDISKD DPEVQFSVVF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS301 TFRSVSELPI MHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV351 YTIPPPKEQM AKDKVSLTCM ITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM401 DTDGSYFIYS KLNVQKSNWE AGNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK(SEQ ID NO: 129)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-3 HC:
1 GAGGTTCAGC TGCAGCAGTC TGGGGCTGAA CTTGTGAGGC CAGGGGCCTT51 AGTCAAGTTG TCCTGCACAG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC101 TACACTGGAT GAGGCAGCGG CCTGAACAGG GCCTGGACTG GATTGGAAGG151 ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTTTATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA201 GGCCACTCTT ACAACAGACA CATCCTCCAA CACAGCCTAC CTGCAGCTCA251 GCGGCCTGAC ATCTGAGACC ACTGCCGTCT ATTACTGTTC TAGAGAGGCG301 GATTATTTCC ACGATGGTAC CTCCTACTGG TACTTCGATG TCTGGGGCGC351 AGGGACCACA ATCACCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT401 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA CTAACTCCAT GGTGACCCTG
451 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG CCAGTGACAG TGACCTGGAA
501 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTGCAGT
551 CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CTGTCCCCTC CAGCACCTGG
601 CCCAGCGAGA CCGTCACCTG CAACGTTGCC CACCCGGCCA GCAGCACCAA
GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG TGGTTGTAAG CCTTGCATAT
701 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA TCTTCCCCCC AAAGCCCAAG
751 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG GTCACGTGTG TTGTGGTAGA
801 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT CAGCTGGTTT GTAGATGATG
851 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC
901 ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ATGCACCAGG ACTGGCTCAA
951 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG TGCAGCTTTC CCTGCCCCCA
1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA GACCGAAGGC TCCACAGGTG
1051 TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG GCCAAGGATA AAGTCAGTCT
1101 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA AGACATTACT GTGGAGTGGC
1151 AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGAACTACA AGAACACTCA GCCCATCATG
1201 GACACAGATG GCTCTTACTT CATCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG
1251 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC
1301 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATG
(SEQ ID n°.: 130)
Seqüência de aminoácidos de Ab-3 HC incluindo pep-tideo sinal:
1 MKCSWVIFFL MAVVTGVNSE VQLQQSGAEL VRPGALVKLS CTASDFNIKD
51 FYLHWMRQRP EQGLDWIGRI DPENGDTLYD PKFQDKATLT TDTSSNTAYL101 QLSGLTSETT AVYYCSREAD YFHDGTSYWY FDVWGAGTTI TVSSAKTTPP
151 SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV
201 LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKK IVPRDCGCKP
251 CICTVPEVSS VFIFPPKPKD VLTITLTPKV TCVVVDISKD DPEVQFSWFV301 DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM HQDWLNGKEF KCRVNSAAFP351 APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA KDKVSLTCMI TDFFPEDITV401 EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFIYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH451 EGLHNHHTEK SLSHSPGK (SEQ ID n°.: 131)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-3 HC incluindoa seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT51 CAATTCAGAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCTGAACTT GTGAGGCCAG101 GGGCCTTAGT CAAGTTGTCC TGCACAGCTT CTGACTTCAA CATTAAAGAC151 TTCTATCTAC ACTGGATGAG GCAGCGGCCT GAACAGGGCC TGGACTGGAT2 01 TGGAAGGATT GATCCTGAGA ATGGTGATAC TTTATATGAC CCGAAGTTCC251 AGGACAAGGC CACTCTTACA ACAGACACAT CCTCCAACAC AGCCTACCTG301 CAGCTCAGCG GCCTGACATC TGAGACCACT GCCGTCTATT ACTGTTCTAG351 AGAGGCGGAT TATTTCCACG ATGGTACCTC CTACTGGTAC TTCGATGTCT 4 01 GGGGCGCAGG GACCACAATC ACCGTCTCCT CAGCCAAAAC GACACCCCCA451 TCTGTCTATC CACTGGCCCC TGGATCTGCT GCCCAAACTA ACTCCATGGT501 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA AGGGCTATTT CCCTGAGCCA GTGACAGTGA551 CCTGGAACTC TGGATCCCTG TCCAGCGGTG TGCACACCTT CCCAGCTGTC601 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC TCTGAGCAGC TCAGTGACTG TCCCCTCCAG651 CACCTGGCCC AGCGAGACCG TCACCTGCAA CGTTGCCCAC CCGGCCAGCA
7 01 GCACCAAGGT GGACAAGAAA ATTGTGCCCA GGGATTGTGG TTGTAAGCCT751 TGCATATGTA CAGTCCCAGA AGTATCATCT GTCTTCATCT TCCCCCCAAA801 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA TTACTCTGAC TCCTAAGGTC ACGTGTGTTG
8 51 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA 901 GATGATGTGG AGGTGCACAC AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT
951 CAACAGCACT TTCCGCTCAG TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCAGGACT1001 GGCTCAATGG TAAGGAGTTC AAATGCAGGG TCAACAGTGC AGCTTTCCCT1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC1101 ACAGGTGTAC ACCATTCCAC CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG1151 TCAGTCTGAC CTGCATGATA ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG1201 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC1251 CATCATGGAC ACAGATGGCT CTTACTTCAT CTACAGCAAG CTCAATGTGC1301 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT1351 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG1401 TAAATGA (SEQ ID n°.: 132)
Ab-4
As seqüências da Anticorpo 4 (também referido aquicomo Ab-4) LC e HC são como segue:
Ab-4 Cadeia leve:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-4 LC:
1 DIQMTQITSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG101 GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 133)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-4 LC:
1 GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC151 ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQID n°.: 134)
Seqüência de aminoácidos de Ab-4 LC incluindo pep-tideo sinal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQITSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS
51 NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ
101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA
151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT
201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID n°.: 135
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-4 LC incluin
a seqüência decodificação de peptideo sinal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG
51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT
101 CTCTGGGIGA CIGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC
151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT
201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG
251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA
301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC
351 TTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA
401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC
451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA
501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA
551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG
601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT701 GTTAG (SEQ ID n°.: 136)
Ab-4 Cadeia pesada:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-4 HC:
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQN QGKTLEWIGE51 INPNSGGAGY NQKFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG101 YDDIYDDWYF DVWGAGTTVT YSSAKTTPPS VYPLAfGSAA QTNSMVTLGC151 LVKGIFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKKI VPRDCGCKPC ICTVPEVSSV FIFPPKPKDV251 LTITLTPKVT CVVVDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT351 IPPPKEQMAK DKVSLTCMIT DFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT4 01 DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK(SEQ ID n°.: 137)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-4 HC:
1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA101 TGCACTGGGT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA CCCTAGAGTG GATAGGAGAA151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC4 01 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC4 51 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG701 TCCCAGAAGTATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQID n°.: 138)
Seqüência de aminoácidos de Ab-4 HC incluindo pep-tideo sinal:
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD51 YNMHWVKQNQ GKTLEWIGEI NPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVYW401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQSeqüência de ácia seqüência de codificação1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC
101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC151 TACAACATGC ACTGGGTGAA201 AGGAGAAATT AATCCTAACA251 AGGGCAAGGC CACATTGACT301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC351 ATTGGGCTAC GATGATATCT401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC451 TATCCACTGG CCCCTGGATC501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC801 GGATGTGCTC ACCATTACTC851 ACATCAGCAA GGATGATCCC901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA1101 GTACACCATT CCACCTCCCA1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC
ID n°.: 139)
ios nucléicos de Ab-4 HC incluindode peptideo sinal:
TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGTAACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTGTGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGACGCAGAACCAA GGAAAGACCC TAGAGTGGATGTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCAGTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATGTGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAGACGACGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCGTCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTCTGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCTATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGAGGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAGCAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTGGCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCACCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATAATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAATGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAGGAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGATGACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAGAACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCAAGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCCAACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGTAGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTCTTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGGGGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG1401 A (SEQ ID n°.:140)
Ab-4 foi humanizado para gerar Ab-5. Ab-5 As se-qüências da Anticorpo 5 (também referido aqui como Ab-5) LCe HC são como segue:
Ab-5 Cadeia leve:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-5 LC:
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GDTLPYTFGG101 GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG201 LSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID n°.: 141)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-5 LC:
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCCGCAT CCGTAGGCGA
51 CCGCGTAACC ATAACATGTA GAGCATCTCA AGATATTTCC AACTATTTGA
101 ATTGGTACCA ACAAAAACCC GGCAAAGCAC CTAAACTCCT CATTTACTAT
151 ACATCAAGAC TCCTCTCCGG CGTTCCATCA CGATTCTCAG GCTCCGGCTC
201 CGGCACAGAT TTCACACTCA CTATTTCCTC CCTCCAACCA GAAGATTTTG
251 CAACCTATTA CTGTCAACAA GGCGATACAC TCCCATACAC ATTCGGCGGC
301 GGCACAAAAG TTGAAATTAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT CTGTCTTCAT
351 CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC TCTGTTGTGT
401 GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA GTGGAAGGTG
451 GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA CAGAGCAGGA
501 CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG CTGAGCAAAG551 CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC CCATCAGGGC601 CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT GT (SEQ IDn°.: 142)
Seqüência de aminoácidos de Ab-5 LC incluindo peptideo sinal:
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQD51 ISNYLNWYQQ KPGKAPKLLI YYTSRLLSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL101 QPEDFATYYC QQGDTLPYTF GGGTKVEIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG151 TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST201 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC (SEQ ID n° . :143)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-5 LC incluindo
a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT
51 CCGAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTCT
101 CCGCATCCGT AGGCGACCGC GTAACCATAA CATGTAGAGC ATCTCAAGAT
151 ATTTCCAACT ATTTGAATTG GTACCAACAA AAACCCGGCA AAGCACCTAA
201 ACTCCTCATT TACTATACAT CAAGACTCCT CTCCGGCGTT CCATCACGAT
251 TCTCAGGCTC CGGCTCCGGC ACAGATTTCA CACTCACTAT TTCCTCCCTC
301 CAACCAGAAG ATTTTGCAAC CTATTACTGT CAACAAGGCG ATACACTCCC
351 ATACACATTC GGCGGCGGCA CAAAAGTTGA AATTAAACGT ACGGTGGCTG
401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA
451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA
501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA
551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC
601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA
651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG
701 GAGAGTGT (SEQ ID n°.:144)Ab-5 Cadeia pesada:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-5 HC:
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMHWVRQA PGQGLEWMGE51 INPNSGGAGY NQKPKGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARLG101 YDDIYDDWYF DVWGQGTTVT YSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC151 LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG201 TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS301 TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PAPIEKTISK TKGQPREPQV351 YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPML401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK(SEQ ID n°.: 145)
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-5 HC sem terminal carbóxi-lisina:
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMHWVRQA PGQGLEWMGE51 INPNSGGAGY NQKFKGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARLG101 YDDIYDDWYF DVWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC151 LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG201 TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS301 TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PAPIEKTISK TKGQPREPQV351 YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPML401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG(SEQ ID n°.:392)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-5 HC:
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTAAAAAAAC CAGGAGCAAG51 CGTTAAAGTT TCTTGTAAAG CAAGCGGATA TACATTTACA GATTACAACA101 TGCATTGGGT AAGACAAGCG CCAGGACAAG GATTGGAATG GATGGGCGAA151 ATTAACCCTA ATAGTGGAGG AGCAGGCTAC AATCAAAAAT TCAAAGGGAG2 01 AGTTACAATG ACAACAGACA CAAGCACTTC AACAGCATAT ATGGAACTGC251 GATCACTTAG AAGCGACGAT ACAGCTGTAT ACTATTGCGC ACGACTTGGG301 TATGATGATA TATATGATGA CTGGTATTTC GATGTTTGGG GCCAGGGAAC351 AACAGTTACC GTCTCTAGTG CCTCCACCAA GGGCCCATCG GTCTTCCCCC4 01 TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC CCTGGGCTGC4 51 CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT GGAACTCAGG501 CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA CAGTCCTCAG551 GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG CAACTTCGGC601 ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA ACACCAAGGT651 GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA CCGTGCCCAG
7 01 CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAG751 GACACCCT CATGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG TGGTGGTGGA
8 01 CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC GTGGACGGCG851 TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC901 ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG ACTGGCTGAA951 CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC CCAGCCCCCA
1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTG1051 TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC AGGTCAGCCT1101 GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC GTGGAGTGGG1151 AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC TCCCATGCTG12 01 GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG
1251 CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC1301 TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAA(SEQ ID n°.: 146)
Seqüência de aminoácidos de Ab-5 HC incluindo pep-tídeo sinal:
1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD51 YNMHWVRQAP GQGLEWMGEI NPNSGGAGYN QKFKGRVTMT TDTSTSTAYM101 ELRSLRSDDT AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ201 ssGLYSLssv VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVYCPP251 CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFNWYV301 DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP351 APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV401 EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH451 EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID n°.: 147)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-5 HC incluindoa seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGAGCGG CGCCGAGGTA AAAAAACCAG101 GAGCAAGCGT TAAAGTTTCT TGTAAAGCAA GCGGATATAC ATTTACAGAT151 TACAACATGC ATTGGGTAAG ACAAGCGCCA GGACAAGGAT TGGAATGGAT201 GGGCGAAATT AACCCTAATA GTGGAGGAGC AGGCTACAAT CAAAAATTCA251 AAGGGAGAGT TACAATGACA ACAGACACAA GCACTTCAAC AGCATATATG301 GAACTGCGAT CACTTAGAAG CGACGATACA GCTGTATACT ATTGCGCACG351 ACTTGGGTAT GATGATATAT ATGATGACTG GTATTTCGAT GTTTGGGGCC401 AGGGAACAAC AGTTACCGTC TCTAGTGCCT CCACCAAGGG CCCATCGGTC451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC CAGGAGCACC TCCGAGAGCA CAGCGGCCCT501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA551 ACTCAGGCGC TCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTACAG601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAA651 CTTCGGCACC CAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA701 CCAAGGTGGA CAAGACAGTT GAGCGCAAAT GTTGTGTCGA GTGCCCACCG751 TGCCCAGCAC CACCTGTGGC AGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA
801 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG
851 TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG
901 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCACGGG AGGAGCAGTT
951 CAACAGCACG TTCCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTTGTG CACCAGGACT
1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCA
1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC
1101 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG
1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG
1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACACCTCC
1251 CATGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG
1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT
1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG
1401 TAAA (SEQ ID n°.: 148)
Ab-5 Domínio variável:
Seqüência de aminoácidos de Ab-5 de cadeia leve dedomínio variável (sem seqüência sinal):
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQICP GKAPKLLIYY51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GDTLPYTFGG101 GTKVEIK (SEQ ID n°.:376)
seqüência de DNA de Ab-5 de cadeia leve de domíniovariável(sem seqüência sinal):
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCCGCAT CCGTAGGCGA51 CCGCGTAACC ATAACATGTA GAGCATCTCA AGATATTTCC AACTATTTGA101 ATTGGTACCA ACAAAAACCC GGCAAAGCAC CTAAACTCCT CATTTACTAT151 ACATCAAGAC TCCTCTCCGG CGTTCCATCA CGATTCTCAG GCTCCGGCTC2 01 CGGCACAGAT TTCACACTCA CTATTTCCTC CCTCCAACCA GAAGATTTTG251 CAACCTATTA CTGTCAACAA GGCGATACAC TCCCATACAC ATTCGGCGGC301 GGCACAAAAG TTGAAATTAA A (SEQ ID n°.:377)
Seqüência de aminoácidos de Ab-5 de cadeia pesadade dominio variável (sem seqüência sinal):
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMHWVRQA PGQGLEWMGE51 INPNSGGAGY NQKFKGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARLG101.YDDIYDDWYF DVWGQGTTVT VSS (SEQ ID n°.:378)
Seqüência de DNA de Ab-5 de cadeia pesada de domi-nio variável(sem seqüência sinal):
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTAAAAAAAC CAGGAGCAAG51 CGTTAAAGTT TCTTGTAAAG CAAGCGGATA TACATTTACA GATTACAACA101 TGCATTGGGT AAGACAAGCG CCAGGACAAG GATTGGAATG GATGGGCGAA151 ATTAACCCTA ATAGTGGAGG AGCAGGCTAC AATCAAAAAT TCAAAGGGAG2 01 AGTTACAATG ACAACAGACA CAAGCACTTC AACAGCATAT ATGGAACTGC251 GATCACTTAG AAGCGACGAT ACAGCTGTAT ACTATTGCGC ACGACTTGGG301 TATGATGATA TATATGATGA CTGGTATTTC GATGTTTGGG GCCAGGGAAC351 AACAGTTACC GTCTCTAGT (SEQ ID n°.:37 9)
As seqüências de região CDR (região determinantede complementaridade) na região variável da cadeia pesada deAb-5 são como segue:
CDR-H1: DYNMH (SEQ ID n°.:245)CDR-H2: EINPNSGGAGYNQKFKG (SEQ ID n°.:246)CDR-H3 : LGYDDIYDD WYFDV (SEQ ID n°.:247)
As seqüências de região variável CDR de cadeia le-ve de Ab-5 são:
CDR-L1 : RASQDISNYLN (SEQ ID n°.:78)
CDR-L2: YTSRLLS (SEQ ID n°.:79)CDR-L3 : QQGDTLPYT (SEQ ID n°.:80)Ab-6As seqüências de Anticorpo 6 (também referido aquicomo Ab-6) LC e HC são como segue:
Ab-6 Cadeia leve:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptídeosinal removido) de Ab-6 LC:
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWFQQKP DGTLKLLIFY51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG101 GTKLEIRRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 149)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-6 LC:
1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA
51 CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC AATTATTTAA
101 ACTGGTTTCA GCAGAAACCA GATGGAACTC TTAAACTCCT GATCTTCTAC
151 ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTTCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC
201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAGCAA GAAGATATTG
251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC GTTCGGGGGG
301 GGGACCAAGC TGGAAATAAG ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT
351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT
401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT
451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA
501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG
551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA
601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQID n°.: 150)
Seqüência de aminoácidos de Ab-6 LC incluindo pep-tideo sinal:1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS51 NYLNWFQQKP DGTLKLLIFY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ101 EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIRRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID n°.: 151)
Seqüência de ácidos nucléicos Ab-6 LC incluindo aseqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG
51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT
101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC
151 AATTATTTAA ACTGGTTTCA GCAGAAACCA GATGGAACTC TTAAACTCCT
201 GATCTTCTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTTCCATCA AGGTTCAGTG
251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAGCAA
301 GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC
351 GTTCGGGGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAG ACGGGCTGAT GCTGCACCAA
401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC
451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA
501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA
551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG
601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC
651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT
701 GTTAG (SEQ ID n°.: 152)
Ab-6 Cadeia pesada:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-6 HC:
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQN QGKSLEWIGE51 INPNSGGSGY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARLV101 YDGSYEDWYF DVWGAGTTVT YSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC151 LVKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKKI VPRDCGCKPC ICTVPEVSSV FIFPPKPKDV251 LTITLTPKVT CVWDISKDD PEVQFSWFVD D VEVHTAQTQ PREEQFNSTF301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT351 IPPPKEQMAK DKVSLTCMIT DFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT401 DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK(SEQ ID n°.: 153)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptídeo sinal removido) de Ab-6 HC:
1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC
51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACAACA
101 TGCACTGGGT GAAACAGAAC CAAGGAAAGA GCCTAGAGTG GATAGGAGAA
151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TAGTGGCTAC AACCAAAAGT TCAAAGGCAA
201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCTTCCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTCC
251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGTC
301 TACGATGGCA GCTACGAGGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC
351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC
401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC
451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG
501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC
551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC
601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA
651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG
701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG
751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG
801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG
851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC
901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA12 01 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG12 51 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQID n°.: 154)
Seqüência de aminoácidos de Ab-6 HC incluindo pep-tideo sinal:
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD51 YNMHWVKQNQ GKSLEWIGEI NPNSGGSGYN QKFKGKATLT VDKSSSTAYM101 ELRSLTSEDS AVYYCARLVY DGSYEDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID n°.:155)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-6 HC incluindoa seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT51 CCTCTCTGAG GTCCAGCTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC151 TACAACATGC ACTGGGTGAA ACAGAACCAA GGAAAGAGCC TAGAGTGGAT201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTAG TGGCTACAAC CAAAAGTTCA251 AAGGCAAGGC CACATTGACT301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC351 ATTGGTCTAC GATGGCAGCT401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC451 TATCCACTGG CCCCTGGATC501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC801 GGATGTGCTC ACCATTACTC851 ACATCAGCAA GGATGATCCC901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA1101 GTACACCATT CCACCTCCCA1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT1351 CTGCACAACC ACCATACTGA1401 A (SEQ ID n°.: 156)
Ab-7
As seqüências decomo Ab-7) LC e HC são comoAb-7 Cadeia leve:
GTAGACAAGT CTTCCAGCAC AGCCTACATG
TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG
ACGAGGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG
TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTCTGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCTATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA
GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG
CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG
GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCACCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA
ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA
TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG
GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT
GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG
AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA
AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC
AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT
AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC
TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG
GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT
TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA
ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC
GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG
Anticorpo 7 (também referido aquisegue:Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptídeosinal removido) de Ab-7 LC:
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ICCRASQVIT NYLYWYQQKP DGTFKLLIYY51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG101 GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 157)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-7 LC:
1 GTATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA51 CAGAGTCACC ATCTGTTGCA GGGCAAGTCA GGTCATTACC AATTATTTAT101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT GATCTACTAC151 ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAG GAAGATATTG251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC GTTCGGAGGG301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT4 01 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GT (SEQ IDn°.: 158)
Seqüência de aminoácidos de Ab-7 LC incluindo pep-tideo sinal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ICCRASQVIT51 NYLYWYQQKP DGTFKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ101 EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID n°.: 159)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-7 LC incluindoa seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG
51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT
101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCTGTTGCA GGGCAAGTCA GGTCATTACC
151 AATTATTTAT ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT
201 GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG
251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAG
301 GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC
351 GTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA
401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC
451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA
501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA
551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG
601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC
651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT
701 GT (SEQ ID n°.: 160)
Ab-7 Cadeia pesada:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptid
sinal removido) de Ab-7 HC:
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWMKQN QGKSLEWIGE
51 INPNSGGAGY NQQFKGKATL TVDKSSRTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG
101 YVGNYEDWYF DVWGAGTTVT YSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC
151 LVKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS
201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKKI VPRDCGCKPC ICTVPEVSSV FIFPPKPKDV
251 LTITLTPKVT CVVVDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT351 IPPPKEQMAK DKVSLTCMIT DFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT401 DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQID n°.: 161)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-7 HC:
1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACAACA101 TGCACTGGAT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA GCCTAGAATG GATAGGAGAA151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGCAGT TCAAAGGCAA201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAG GACAGCCTAC ATGGAGCTCC251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC301 TACGTTGGTA ATTACGAGGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC 4 01 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC4 51 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG8 01 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC 901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA1301 ACCACCATACTGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA A (SEQ IDn°.: 162)
Seqüência de aminoácidos de Ab-7 HC incluindo pep-tideo sinal:
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD51 YNMHWMKQNQ GKSLEWIGEI NPNSGGAGYN QQFKGKATLT VDKSSRTAYM101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY VGNYEDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID n°.: 163)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-7 HC incluindoa seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT51 CCTCTCTGAG GTCCAGCTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC151 TACAACATGC ACTGGATGAA GCAGAACCAA GGAAAGAGCC TAGAATGGAT201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGCAGTTCA251 AAGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCAGGAC AGCCTACATG301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG351 ATTGGGCTAC GTTGGTAATT ACGAGGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAA(SEQ ID n°.: 164)
Ab-8
As seqüências da Anticorpo 8 (também referido aquicomo Ab-8) LC e HC são como segue:
Ab-8 Cadeia leve:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-8 LC:
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG101 GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 165)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-8 LC:
1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA
51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA
101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC
151 ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC
201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG
251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG
301 GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT
351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT
401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT
451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA
501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG
551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA
601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID n°.: 166)
Seqüência de aminoácidos de Ab-8 LC incluindo pep-tideo sinal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS51 NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID n°.: 167)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-8 LC incluindoa seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG
51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT
101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC
151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT
201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG
251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA
301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC
351 TTTCGGAGGG GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA
401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC
451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA
501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA
551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG
601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC
651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT
701 GTTAG (SEQ ID n° . : 166 3) Ab-8 Cadeia pesada<">: Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-8 HC:
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQN QGKTLDWIGE51 INPNSGGAGY NQKFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG101 YDDIYDDWYF DVWGAGTTVT YSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC151 LVKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKKI VPRDCGCKPC ICTVPEVSSV FIFPPKPKDV251 LTITLTPKVT CVVVDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT351 IPPPKEQMAK DKVSLTCMIT DFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT401 DGSYFIYSKL NVQKSNWEA GNTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQID n°.: 169)Seqüência de ácimadura (peptideo sinal reme1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG101 TGCACTGGGT GAAGCAGAAC151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG201 GGCCACATTG ACTGTAGACA251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC301 TACGATGATA TCTACGACGA351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG4 01 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC751 CTCACCATTA CTCTGACTCC801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC851 TGCACACAGC TCAGACGCAA901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA1101 CATGATAACA GACTTCTTCC1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA12 51 GGAGGCAGGA AATACTTTCA
dos nucléicos codificando a forma•vido) de Ab-8 HC:
TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTCCTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACACAAGGAAAGA CCCTAGACTG GATAGGAGAATGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAAAGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCCTCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGCCTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGACCCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCACCAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGCTGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGGACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACCGTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGCTGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGAATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAGTTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTGTAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAGAGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGGCCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTCCATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAAACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGAGGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACCGATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTGCTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGATACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACACAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTGCCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQID n°.: 170)
Seqüência de aminoácidos de Ab-8 HC incluindo pep-tideo sinal:
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD51 YNMHWVKQNQ GKTLDWIGEI NPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ201 SDLYTLSSSV IVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID n°.: 171)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-8 HC incluindoa seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGAACCAA GGAAAGACCC TAGACTGGAT201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA2 51 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG 4 01 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC4 51 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG
651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA
701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA
751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA
801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG
851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT
901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG
951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA
1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC
1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT
1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC
1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG
1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT
1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA
1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC
1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG
1401 A (SEQ ID n°.: 172)
Ab-9
As seqüências da Anticorpo 9 (também referido aquicomo Ab-9) LC e HC são como segue:Ab-9 Cadeia leve:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-9 LC:
1 DIQMTQITSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY51 TSRLFSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG101 GTKVEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 173)Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-9 LC:
1 GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC151 ACATCAAGAT TATTTTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG301 GGGACCAAGG TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT4 01 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT4 51 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GT (SEQ IDn°.: 174)
Seqüência de aminoácidos de Ab-9 LC incluindo pep-tideo sinal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQITSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS51 NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLFSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKVEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID n°.: 175)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-9 LC incluindo a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC151 AATTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT
201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TATTTTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG
251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA
301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC
351 TTTCGGAGGG GGGACCAAGG TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA
401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC
451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA
501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA
551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG
601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC
651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT
701 GT (SEQ ID n°.: 176)
Ab-9 Cadeia pesada:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-9 HC:
1 EVQLQQSGPE LMKPGTSVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQT QGKTLEWIGE51 INPNSGGAGY NQKFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCAKLG101 YDDIYDDWYF DVWGAGTTVT YSSAKTTAPS VYPLAPVCGD TTGSSVTLGC151 LVKGYFPEPV TLTWNSGSLS SDVHTFPALL QSGLYTLSSS VTVTTWPSQT201 ITCNVAHPAS STKVDKKIEP RGSPTHKPCP PCPAPNLLGG PSVFIFPPKI251 KDVLMISLSP MVTCVVVDVS EDDPDVHVSW FVNNVEVHTA QTQTHREDYN301 STIRVVSALP IQHQDWMSGK EFKCKVNNKA LPAPIERTIS KPKGPVRAPQ351 VYVLPPPEEE MTKKQVTLTC MITDFMPEDI YVEWTNNGQT ELNYKNTEPV401 LDSDGSYFMY SKLRVEKKNW VERNSYSCSV VHEGLHNHHT TKSFSRTPGK(SEQ ID n°.: 177)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-9 HC:
1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGACTTC51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG101 TGCACTGGGT GAAGCAGACC151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG201 GGCCACATTG ACTGTAGACA251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC301 TACGATGATA TCTACGACGA351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG4 01 TGGCCCCTGT GTGTGGAGAT451 CTGGTCAAGG GTTATTTCCC501 ATCCCTGTCC AGTGATGTGC551 TCTACACCCT CAGCAGCTCA601 ATCACCTGCA ATGTGGCCCA651 AATTGAGCCC AGAGGGTCCC
7 01 CTCCTAACCT CTTGGGTGGA 7 51 AAGGATGTAC TCATGATCTC
8 01 GGATGTGAGC GAGGATGACC8 51 ACGTGGAAGT ACACACAGCT901 AGTACTATCC GGGTGGTCAG951 GAGTGGCAAG GAGTTCAAAT
1001 CCATCGAGAG AACCATCTCA1051 GTATATGTCT TGCCTCCACC1101 TCTGACCTGC ATGATCACAG1151 GGACCAACAA CGGGCAAACA1201 CTGGACTCTG ATGGTTCTTA
12 51 GAAGAACTGG GTGGAAAGAA1301 GTCTGCACAA TCACCACACG(SEQ ID n°.: 178)
Seqüência de amir
CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACACAAGGAAAGA CCCTAGAGTG GATAGGAGAATGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAAAGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCCTCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAAATTGGGCCTGGTATTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGACCCAAAACAAC AGCCCCATCG GTCTATCCACACAACTGGCT CCTCGGTGAC TCTAGGATGCTGAGCCAGTG ACCTTGACCT GGAACTCTGGACACCTTCCC AGCTCTCCTG CAGTCTGGCCGTGACTGTAA CCACCTGGCC CAGCCAGACCCCCGGCAAGC AGCACCAAAG TGGACAAGAACAACACATAA ACCCTGTCCT CCATGCCCAGCCATCCGTCT TCATCTTCCC TCCAAAGATCCCTGAGCCCC ATGGTCACGT GTGTGGTGGTCAGATGTCCA TGTCAGCTGG TTCGTGAACACAGACACAAA CCCATAGAGA GGATTACAACTGCCCTCCCC ATCCAGCACC AGGACTGGATGCAAGGTCAA CAACAAAGCC CTCCCAGCGCAAACCCAAAG GGCCAGTAAG AGCTCCACAGAGAAGAAGAG ATGACTAAGA AACAGGTCACACTTCATGCC TGAAGACATT TACGTGGAGTGAGCTAAACT ACAAGAACAC TGAACCAGTCCTTCATGTAC AGCAAGCTGA GAGTGGAAAAATAGCTACTC CTGTTCAGTG GTCCACGAGGACTAAGAGCT TCTCCCGGAC TCCGGGTAAA
toácidos de Ab-9 HC incluindo pep-tídeo sinal:
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGTSVKMS CKASGYTFTD
51 YNMHWVKQTQ GKTLEWIGEI NPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM
101 ELRSLTSEDS AVYYCAKLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTAPSV
151 YPLAPVCGDT TGSSVTLGCL VKGYFPEPVT LTWNSGSLSS DVHTFPALLQ
201 SGLYTLSSSV TVTTWPSQTI TCNVAHPASS TKVDKKIEPR GSPTHKPCPP
251 CPAPNLLGGP SVFIFPPKIK DVLMISLSPM VTCVVVDVSE DDPDVHVSWF
301 VNNVEVHTAQ TQTHREDYNS TIRVVSALPI QHQDWMSGKE FKCKVNNKAL
351 PAPIERTISK PKGPVRAPQV YVLPPPEEEM TKKQVTLTCM ITDFMPEDIY
401 VEWTNNGQTE LNYKNTEPVL DSDGSYFMYS KLRVEKKNWV ERNSYSCSVV
451 HEGLHNHHTT KSFSRTPGK (SEQ ID n°.: 179)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-9 HC incluindoa seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT
51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG
101 GGACTTCAGt GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC
151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGACCCAA GGAAAGACCC TAGAGTGGAT
201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA
251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG
301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAA
351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTATTTCGAT GTCTGGGGCG
401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACAACAGC CCCATCGGTC
451 TATCCACTGG CCCCTGTGTG TGGAGATACA ACTGGCTCCT CGGTGACTCT
501 AGGATGCCTG GTCAAGGGTT ATTTCCCTGA GCCAGTGACC TTGACCTGGA
551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGT GATGTGCACA CCTTCCCAGC TCTCCTGCAG
601 TCTGGCCTCT ACACCCTCAG CAGCTCAGTG ACTGTAACCA CCTGGCCCAG
651 CCAGACCATC ACCTGCAATG TGGCCCACCC GGCAAGCAGC ACCAAAGTGG
701 ACAAGAAAAT TGAGCCCAGA GGGTCCCCAA CACATAAACC CTGTCCTCCA751 TGCCCAGCTC CTAACCTCTT GGGTGGACCA TCCGTCTTCA TCTTCCCTCC
801 AAAGATCAAG GATGTACTCA TGATCTCCCT GAGCCCCATG GTCACGTGTG
851 TGGTGGTGGA TGTGAGCGAG GATGACCCAG ATGTCCATGT CAGCTGGTTC
901 GTGAACAACG TGGAAGTACA CACAGCTCAG ACACAAACCC ATAGAGAGGA
951 TTACAACAGT ACTATCCGGG TGGTCAGTGC CCTCCCCATC CAGCACCAGG
1001 ACTGGATGAG TGGCAAGGAG TTCAAATGCA AGGTCAACAA CAAAGCCCTC
1051 CCAGCGCCCA TCGAGAGAAC CATCTCAAAA CCCAAAGGGC CAGTAAGAGC
1101 TCCACAGGTA TATGTCTTGC CTCCACCAGA AGAAGAGATG ACTAAGAAAC
1151 AGGTCACTCT GACCTGCATG ATCACAGACT TCATGCCTGA AGACATTTAC
1201 GTGGAGTGGA CCAACAACGG GCAAACAGAG CTAAACTACA AGAACACTGA
1251 ACCAGTCCTG GACTCTGATG GTTCTTACTT CATGTACAGC AAGCTGAGAG
1301 TGGAAAAGAA GAACTGGGTG GAAAGAAATA GCTACTCCTG TTCAGTGGTC
1351 CACGAGGGTC TGCACAATCA CCACACGACT AAGAGCTTCT CCCGGACTCC
1401 GGGTAAA (SEQ ID n°.:180)
Ab-IO As seqüências da Anticorpo 10 (também refe-rido aqui como Ab-10) LC e HC são como segue: Ab-10 Cadeialeve: Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideo si-nal removido) de Ab-10 LC:
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG101 GTKLEIKRAD AAPTVSIFPL SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERH NSYTCEATHKT201 STSPLVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 181)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-10 LC:
1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC151 ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG301 GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT351 CTTCCCACTA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT4 01 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT4 51 GATGGCAGTG XACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQID n°.: 182)
Seqüência de aminoácidos de Ab-10 LC incluindopeptideo sinal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS 51 NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPL SSEQLTSGGA151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID n° . : 183)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-10 LC incluin- do a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC351 TTTCGGAGGG GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA401 CTGTATCCAT CTTCCCACTA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT701 GTTAG (SEQ ID n°.:184)
Ab-10 Cadeia pesada:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-10 HC:
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGY.TFT DYNMHWVKQN QGKTLEWIGE51 INPNSGGAGY NQKFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG101 YDDIYDDWYF DVWGAGTTVT YSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC151 LVKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKKI VPRDCGCKPC ICTVPEVSSV FIFPPKPKDV251 LTITLTPKVT CVVVDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT351 IPPPKEQMAK DKVSLTCMIT DFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT401 DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK(SEQID n°.: 185)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-10 HC:
1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA101 TGCACTGGGT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA CCCTAGAATG GATAGGAGAA151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQID n°.: 186)
Seqüência de aminoácidos de Ab-10 HC incluindopeptideo sinal:
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD51 YNMHWVKQNQ GKTLEWIGEI NPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI
251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD
301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP
351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW
4 01 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID n°.: 187)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-10 HC incluin-
do a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT
51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG
101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC
151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGAACCAA GGAAAGACCC TAGAATGGAT
201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA
251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG
301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG
351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG
401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC
451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT
501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA
551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG
601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG
651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA
701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA
751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA
801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG
851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT
901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG
951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC
1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT
1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC
1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG
1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT
1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA
1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC
1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG
1401 A (SEQ ID n°.: 188)
Ab-11
As seqüências da Anticorpo 11 (também referido a
qui como Ab-11) LC e HC são como segue:Ab-11 Cadeia leve:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-11 LC:
1 QIVLSQSPAF LSVSPGDKVT MTCRASSSIS YIHWFQQKPG SSPRSWIYAT51 SNLASGVPGR FSGSGSGTSY SLTISRVEAE DAATYYCQQW SSDPLTFGAG101 TKLELKRADA APTVSIFPPS SEQLTSGGAS VVCFLNNFYP KDINVKWKID151 GSERQNGVLN SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS201 TSPIVKSFNR NEC (SEQ ID n°.: 189)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-11 LC:
1 CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCATTC CTGTCTGTAT CTCCAGGGGA51 TAAGGTCACA ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATACACT101 GGTTTCAGCA GAAGCCAGGA TCCTCCCCCA GATCCTGGAT TTATGCCACA151 TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGGTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG201 GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAG GATGCTGCCA251 CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGTGCTGGG301 ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT351 CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT4 01 TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGACATCA ATGTCAAGTG GAAGATTGAT451 GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG501 CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAGGACG551 AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA601 ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG (SEQ IDn°.: 190)
Seqüência de aminoácidos de Ab-11 LC incluindopeptideo sinal:
1 MDFQVQIFSF LLISASVIMS RGQIVLSQSP AFLSVSPGDK VTMTCRASSS51 ISYIHWFQQK PGSSPRSWIY ATSNLASGVP GRFSGSGSGT SYSLTISRVE101 AEDAATYYCQ QWSSDPLTFG AGTKLELKRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG151 ASVVCFLNNF YPKDINVKWK IDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL201 TLTKDEYERH NSYTCEATHK TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID n°.:191)Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-11 LC incluin-do a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT51 CATAATGTCC AGAGGACAAA TTGTTCTCTC CCAGTCTCCA GCATTCCTGT101 CTGTATCTCC AGGGGATAAG GTCACAATGA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT151 ATAAGTTACA TACACTGGTT TCAGCAGAAG CCAGGATCCT CCCCCAGATC201 CTGGATTTAT GCCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT GGTCGCTTCA251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGAGTGGAG301 GCTGAGGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAAACGGGCT GATGCTGCAC4 01 CAACTGTATC CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT4 51 GCCTCAGTCG TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT501 CAAGTGGAAG ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT551 GGACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC601 ACGTTGACCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC651 CACTCACAAG ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG701 AGTGTTAG (SEQ ID n°.: 192)
Ab-11 Cadeia pesada:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-11 HC:
1 EVQLQQSGAD LVQPGASVKV SCTASGFDIK DYYIHWMKQR PDQGLEWIGR51 VbPDNGETEF APKFPGKATF TTDTSSNTAY LQLRGLTSED TAIYYCGRED101 YDGTYTWFPY WGQGTLVTVS AAKTTPPSVY PLAPGSAAQT NSMVTLGCLV151 KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VHTFPAVLQS DLYTLSSSVT VPSSTWPSET201 VTCNVAHPAS STKVDKKIVP RDCGCKPCLC TVPEVSSVFI FPPKPKDVLT251 ITLTPKVTCV VVDISKDDPE VQFSWFVDDV EVHTAQTQPR EEQFNSTFRS301 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPI EKTISKTKGR PKAPQVYTIP351 PPKEQMAKDK VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMDTDG
4 01 SYFIYSKLNV QKSNWEAGNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK(SEQ IDn°.: 193)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-11 HC:
1 GAAGTTCAGC TGCAACAGTC TGGGGCAGAC CTTGTGCAGC CAGGGGCCTC51 AGTCAAGGTG TCCTGCACAG CTTCTGGCTT CGACATTAAG GACTACTATA101 TACACTGGAT GAAACAGAGG CCTGACCAGG GCCTGGAGTG GATTGGAAGG151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT GCCCCGAAGT TCCCGGGCAA201 GGCCACTTTT ACAACAGACA CATCCTCCAA CACAGCCTAC CTACAACTCA 251 GAGGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCATCT ATTACTGTGG GAGAGAAGAC301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT TGGGGCCAAG GGACTCTGGT351 CACTGTCTCT GCAGCCAAAA CGACACCCCC ATCTGTCTAT CCACTGGCCC4 01 CTGGATCTGC TGCCCAAACT AACTCCATGG TGACCCTGGG ATGCCTGGTC451 AAGGGCTATT TCCCTGAGCC AGTGACAGTG ACCTGGAACT CTGGATCCCT
501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTGCAGTCT GACCTCTACA
551 CTCTGAGCAG CTCAGTGACT GTCCCCTCCA GCACCTGGCC CAGCGAGACC
601 GTCACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC AGCACCAAGG TGGACAAGAA
651 AATTGTGCCC AGGGATTGTG GTTGTAAGCC TTGCATATGT ACAGTCCCAG
701 AAGTATCATC TGTCTTCATC TTCCCCCCAA AGCCCAAGGA TGTGCTCACC
751 ATTACTCTGA CTCCTAAGGT CACGTGTGTT GTGGTAGACA TCAGCAAGGA
801 TGATCCCGAG GTCCAGTTCA GCTGGTTTGT AGATGATGTG GAGGTGCACA
851 CAGCTCAGAC GCAACCCCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC TTTCCGCTCA
901 GTCAGTGAAC TTCCCATCAT GCACCAGGAC TGGCTCAATG GCAAGGAGTT
951 CAAATGCAGG GTCAACAGTG CAGCTTTCCC TGCCCCCATC GAGAAAACCA
1001 TCTCCAAAAC CAAAGGCAGA CCGAAGGCTC CACAGGTGTA CACCATTCCA
1051 CCTCCCAAGG AGCAGATGGC CAAGGATAAA GTCAGTCTGA CCTGCATGAT
1101 AACAGACTTC TTCCCTGAAG ACATTACTGT GGAGTGGCAG TGGAATGGGC
1151 AGCCAGCGGA GAACTACAAG AACACTCAGC CCATCATGGA CACAGATGGC
1201 TCTTACTTCA TCTACAGCAA GCTCAATGTG CAGAAGAGCA ACTGGGAGGC
1251 AGGAAATACT TTCACCTGCT CTGTGTTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC
1301 ATACTGAGAA GAGCCTCTCC CACTCTCCTG GTAAATGA (SEQ IDn°.:194)
Seqüência de aminoácidos de Ab-11 HC incluindopeptideo sinal:
1 MKCSWVIFFL MAVVTGVNSE VQLQQSGADL VQPGASVKVS CTASGFDIKD51 YYIHWMKQRP DQGLEWIGRV DPDNGETEFA PKFPGKATFT TDTSSNTAYL101 QLRGLTSEDT AIYYCGREDY DGTYTWFPYW GQGTLVTVSA AKTTPPSVYP151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT251 VPEVSSVFIF PPKPKDVLTI TLTPKVTCVV VDISKDDPEV QFSWFVDDVE301 VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE351 KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW401 NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH451 NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID n°.: 195)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-11 HC incluin-do a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT51 CAATTCAGAA GTTCAGCTGC AACAGTCTGG GGCAGACCTT GTGCAGCCAG101 GGGCCTCAGT CAAGGTGTCC TGCACAGCTT CTGGCTTCGA CATTAAGGAC151 TACTATATAC ACTGGATGAA ACAGAGGCCT GACCAGGGCC TGGAGTGGAT 2 01 TGGAAGGGTT GATCCTGACA ATGGTGAGAC TGAATTTGCC CCGAAGTTCC251 CGGGCAAGGC CACTTTTACA ACAGACACAT CCTCCAACAC AGCCTACCTA301 CAACTCAGAG GCCTGACATC TGAGGACACT GCCATCTATT ACTGTGGGAG351 AGAAGACTAC GATGGTACCT ACACCTGGTT TCCTTATTGG GGCCAAGGGA4 01 CTCTGGTCAC TGTCTCTGCA GCCAAAACGA CACCCCCATC TGTCTATCCA4 51 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC TCCATGGTGA CCCTGGGATG501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT GACAGTGACC TGGAACTCTG551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT GCAGTCTGAC601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCCTCCAGCA CCTGGCCCAG.651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC GGCCAGCAGC ACCAAGGTGG 7 01 ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT GTAAGCCTTG CATATGTACA751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CTTCATCTTC CCCCCAAAGC CCAAGGATGT8 01 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTGTGTTGTG GTAGACATCA851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT GGTTTGTAGA TGATGTGGAG901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACTTT 951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CCAGGACTGG CTCAATGGCA1001 AGGAGTTCAA ATGCAGGGTC AACAGTGCAG CTTTCCCTGC CCCCATCGAG1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGCAGACCG AAGGCTCCAC AGGTGTACAC1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG1201 AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC1251 AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC1351 AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AATGA (SEQID n°.: 196)
Ab-12
As seqüências de Anticorpo 12 (também referido a-qui como Ab-12) LC e HC são como segue:
Ab-12 Cadeia leve:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-12 LC:
1 DLQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIFY51 TSTLQSGVPS RFSGSGSGTN YSLTITNLEQ DDAATYFCQQ GDTLPYTFGG101 GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 197)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-12 LC:
1 GATCTCCAGA TGACACAGAC TACTTCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA51 CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC AATTATTTAA101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTG TTAAGCTCCT GATCTTCTAC151 ACATCAACAT TACAGTCAGG AGTCCCATCG AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC201 TGGAACAAAT TATTCTCTCA CCATTACCAA CCTGGAGCAA GATGATGCTG251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC GTTCGGAGGG301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT4 51 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQID NO: 198)
Seqüência de aminoácidos de Ab-12 LC incluindopeptideo sinal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGSRC DLQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS
51 NYLNWYQQKP DGTVKLLIFY TSTLQSGVPS RFSGSGSGTN YSLTITNLEQ
101 DDAATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA
151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT
201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ED n°.: 199
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab -12 LC incluindo a s qüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG
51 TTCCAGATGT GATCTCCAGA TGACACAGAC TACTTCCTCC CTGTCTGCCT
101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC
151 AATTATTTAA XCTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTG TTAAGCTCCT
201 GATCTTCTAC ACATCAACAT TACAGTCAGG AGTCCCATCG AGGTTCAGTG
251 GCAGTGGGTC TGGAACAAAT TATTCTCTCA CCATTACCAA CCTGGAGCAA
301 GATGATGCTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC
351 GTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA
401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC
451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA
501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA
551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG
601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC
651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT701 GTTAG (SEQ ID n°.:200)
Ab-12 Cadeia pesada:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-12 HC:
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWMKQN QGKSLEWIGE51 INPNSGGSGY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG101 YYGNYEPWYF DVWGAGTTVT VSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC151 LVKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKKI VPRDCGCKPC ICTVPEVSSV FIFPPKPKDV251 LTITLTPKVT CVVVDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT351 IPPPKEQMAK DKVSLTCMIT DFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT401 DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQID n°.:201)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-12 HC:
1 GAGGTCCAGT TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC
51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACAACA
101 TGCACTGGAT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA GCCTAGAGTG GATAGGAGAG
151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TTCTGGTTAC AACCAGAAGT TCAAAGGCAA
201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTCC
251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC
301 TACTATGGTA ACTACGAGGA CTGGTATTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC
351 CACGGTCACC GTCTCCTCTG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC
401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC
451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG
501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC
551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA
651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG
701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG
751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG
801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG
851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC
901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA
951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA
1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC
1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG
1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA
1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA
1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG
1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA
1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID n°.:202)
Seqüência de aminoácidos de Ab-12 HC incluindopeptideo sinal:
1 MGWSWTFLFL LSGTSGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD51 YNMHWMKQNQ GKSLEWIGEI NPNSGGSGYN QKFKGKATLT VDKSSSTAYM101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY YGNYEDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID n°.:203)Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-12 HC incluin-do a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTTCGGGTGT51 CCTCTCTGAG GTCCAGTTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC151 TACAACATGC ACTGGATGAA GCAGAACCAA GGAAAGAGCC TAGAGTGGAT2 01 AGGAGAGATT AATCCTAACA GTGGTGGTTC TGGTTACAAC CAGAAGTTCA251 AAGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCAGCAC AGCCTACATG301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG351 ATTGGGCTAC TATGGTAACT ACGAGGACTG GTATTTCGAT GTCTGGGGCG401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCTGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA
7 01 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA
8 01 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT
901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA. GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG12 01 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG1401 A (SEQ ID n°.:204) Ab-13
As seqüências da Anticorpo 13 (também referido a-qui como Ab-13) LC e HC são como segue: Ab-13 Cadeia leve:Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideo sinal re-movido) de Ab-13 LC:
1 QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCRASSSVT SSYLNWYQQK PGSSPKLWIY51 STSNLASGVP ARFSGSGSGT SYSLTISSVE AEDAATYYCQ QYDFFPSTFG101 GGTKLEIKRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG ASVVCFLNNF YPKDINVKWK151 IDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL TLTKDEYERH NSYTCEATHK201 TSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.:205)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-13 LC:
1 CAGATTGTTC TCACCCAGTC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT CTCCAGGGGA
51 GAAGGTCACC ATGACCTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAACT TCCAGTTACT
101 TGAACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGATCTT CCCCCAAACT CTGGATTTAT
151 AGCACATCCA ACCTGGCTTC AGGAGTCCCA GCTCGCTTCA GTGGCAGTGG
201 GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGTGTGGAG GCTGAGGATG
251 CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTATGATT TTTTCCCATC GACGTTCGGT
301 GGAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAGCGGGCT GATGCTGCAC CAACTGTATC
351 CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT GCCTCAGTCG
401 TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT CAAGTGGAAG
451 ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT GGACTGATCA
501 GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC ACGTTGACCA
551 AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC CACTCACAAG
601 ACATCAACTT CACCCATCGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG AGTGT (SEQID n°.:206)Seqüência de aminoácidos de Ab-13 LC incluindopeptideo sinal:
1 MDSQVQIFSF LLISALVKMS RGQIVLTQSP AIMSASPGEK VTMTCRASSS51 VTSSYLNWYQ QKPGSSPKLW IYSTSNLASG VPARFSGSGS GTSYSLTISS101 VEAEDAATYY CQQYDFFPST FGGGTKLEIK RADAAPTVSI FPPSSEQLTS151 GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS201 TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC (SEQ IDn°.:207)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-13 LC incluin-
do . a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGATTCTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTTCTAATCA GTGCCTTAGT
51 CAAAATGTCC AGAGGACAGA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCA GCAATCATGT
101 CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACCATGA CCTGCAGGGC CAGCTCAAGT
151 GTAACTTCCA GTTACTTGAA CTGGTACCAG CAGAAGCCAG GATCTTCCCC
201 CAAACTCTGG ATTTATAGCA CATCCAACCT GGCTTCAGGA GTCCCAGCTC
251 GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACCTCTT ACTCTCTCAC AATCAGCAGT
301 GTGGAGGCTG AGGATGCTGC CACTTATTAC TGCCAGCAGT ATGATTTTTT
351 CCCATCGACG TTCGGTGGAG GCACCAAGCT GGAAATCAAG CGGGCTGATG
401 CTGCACCAAC TGTATCCATC TTCCCACCAT CCAGTGAGCA GTTAACATCT
451 GGAGGTGCCT CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC AACTTCTACC CCAAAGACAT
501 CAATGTCAAG TGGAAGATTG ATGGCAGTGA ACGACAAAAT GGCGTCCTGA
551 ACAGTTGGAC TGATCAGGAC AGCAAAGACA GCACCTACAG CATGAGCAGC
601 ACCCTCACGT TGACCAAGGA CGAGTATGAA CGACATAACA GCTATACCTG
651 TGAGGCCACT CACAAGACAT CAACTTCACC CATCGTCAAG AGCTTCAACA
701 GGAATGAGTG T (SEQ ID n°.:208)
Ab-13 Cadeia pesada:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-13 HC:1 EVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGYTFT DYYMNWVKQS HGESLEWIGD51 INPYNDDTTY NHKFKGKATL TVDKSSNTAY MQLNSLTSED SAVYYCARET101 AVITTNAMDY WGQGTSVTVS SAKTTPPSVY PLAPGSAAQT NSMVTLGCLV151 KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VHTFPAVLQS DLYTLSSSVT VPSSTWPSET201 VTCNVAHPAS STKVDKKIVP RDCGCKPCLC TVPEVSSVFI FPPKPKDVLT251 ITLTPKVTCV VVDISKDDPE VQFSWFVDDV EVHTAQTQPR EEQFNSTFRS301 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPI EKTISKTKGR PKAPQVYTIP351 PPKEQMAKDK VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMDTDG401 SYFIYSKLNV QKSNWEAGNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK (SEQID n°.:209)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptídeo sinal removido) de Ab-13 HC:
1 GAGGTCCAGC TGCAACAATC TGGACCTGAG CTGGTGAAGC CTGGGGCTTC51 AGTGAAGATG TCCTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACTACA101 TGAACTGGGT GAAGCAGAGC CATGGAGAGA GCCTTGAGTG GATTGGAGAT151 ATTAATCCTT ACAACGATGA TACTACCTAC AACCACAAGT TCAAGGGCAA201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AATCCTCCAA CACAGCCTAC ATGCAGCTCA251 ACAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGAGAGACG301 GCCGTTATTA CTACGAATGC TATGGACTAC TGGGGTCAAG GAACCTCAGT351 CACCGTCTCC TCAGCCAAAA CGACACCCCC ATCTGTCTAT CCACTGGCCC401 CTGGATCTGC TGCCCAAACT AACTCCATGG TGACCCTGGG ATGCCTGGTC451 AAGGGCTATT TCCCTGAGCC AGTGACAGTG ACCTGGAACT CTGGATCCCT501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTGCAGTCT GACCTCTACA551 CTCTGAGCAG CTCAGTGACT GTCCCCTCCA GCACCTGGCC CAGCGAGACC601 GTCACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC AGCACCAAGG TGGACAAGAA651 AATTGTGCCC AGGGATTGTG GTTGTAAGCC TTGCATATGT ACAGTCCCAG701 AAGTATCATC TGTCTTCATC TTCCCCCCAA AGCCCAAGGA TGTGCTCACC751 ATTACTCTGA CTCCTAAGGT CACGTGTGTT GTGGTAGACA TCAGCAAGGA801 TGATCCCGAG GTCCAGTTCA GCTGGTTTGT AGATGATGTG GAGGTGCACA
851 CAGCTCAGAC GCAACCCCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC TTTCCGCTCA
901 GTCAGTGAAC TTCCCATCAT GCACCAGGAC TGGCTCAATG GCAAGGAGTT
951 CAAATGCAGG GTCAACAGTG CAGCTTTCCC TGCCCCCATC GAGAAAACCA
1001 TCTCCAAAAC CAAAGGCAGA CCGAAGGCTC CACAGGTGTA CACCATTCCA
1051 CCTCCCAAGG AGCAGATGGC CAAGGATAAA GTCAGTCTGA CCTGCATGAT
1101 AACAGACTTC TTCCCTGAAG ACATTACTGT GGAGTGGCAG TGGAATGGGC
1151 AGCCAGCGGA GAACTACAAG AACACTCAGC CCATCATGGA CACAGATGGC
1201 TCTTACTTCA TCTACAGCAA GCTCAATGTG CAGAAGAGCA ACTGGGAGGC
1251 AGGAAATACT TTCACCTGCT CTGTGTTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC
1301 ATACTGAGAA GAGCCTCTCC CACTCTCCTG GTAAA (SEQ ID n°.:210)
Seqüência de aminoácidos de Ab-13 HC incluindopeptídeo sinal:
1 MGWNWIFLFL LSGTAGVYSE VQLQQSGPEL VKPGASVKMS CKASGYTFTD51 YYMNWVKQSH GESLEWIGDI NPYNDDTTYN HKFKGKATLT VDKSSNTAYM101 QLNSLTSEDS AVYYCARETA VITTNAMDYW GQGTSVTVSS AKTTPPSVYP151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT251 VPEVSSVFIF PPKPKDVLTI TLTPKVTCVV VDISKDDPEV QFSWFVDDVE301 VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE351 KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW401 NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH451 NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID n°.:211)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-13 HC incluin-do a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGGATGGA ACTGGATCTT TCTCTTCCTC TTGTCAGGAA CTGCAGGTGT51 CTACTCTGAG GTCCAGCTGC AACAATCTGG ACCTGAGCTG GTGAAGCCTG101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGTAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC151 TACTACATGA ACTGGGTGAA GCAGAGCCAT GGAGAGAGCC TTGAGTGGAT
201 TGGAGATATT AATCCTTACA ACGATGATAC TACCTACAAC CACAAGTTCA
251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAAT CCTCCAACAC AGCCTACATG
301 CAGCTCAACA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG
351 AGAGACGGCC GTTATTACTA CGAATGCTAT GGACTACTGG GGTCAAGGAA
401 CCTCAGTCAC CGTCTCCTCA GCCAAAACGA CACCCCCATC TGTCTATCCA
451 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC TCCATGGTGA CCCTGGGATG
501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT GACAGTGACC TGGAACTCTG
551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT GCAGTCTGAC
601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCCTCCAGCA CCTGGCCCAG
651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC GGCCAGCAGC ACCAAGGTGG
701 ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT GTAAGCCTTG CATATGTACA
751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CTTCATCTTC CCCCCAAAGC CCAAGGATGT
801 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTGTGTTGTG GTAGACATCA
851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT GGTTTGTAGA TGATGTGGAG
901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACTTT
951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CCAGGACTGG CTCAATGGCA
1001 AGGAGTTCAA ATGCAGGGTC AACAGTGCAG CTTTCCCTGC CCCCATCGAG
1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGCAGACCG AAGGCTCCAC AGGTGTACAC
1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT
1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG
1201 AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC
1251 AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT
1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC
1351 AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AA (SEQ IDn° . :212)
Ab-13 foi humanizado para gerar Ab-14. As seqüên-cias da Anticorpo 14 (também referido aqui como Ab-14) LC eHC são como segue: Ab-14 Cadeia leve:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-14 LC:
1 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASSSVT SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY51 STSNLASGVP SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QYDFFPSTFG101 GGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASCCCLLNNF YPREAKVQWK151 VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ .201 GLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID n°.:213)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-14 LC:
1 GACATCCAGC TGACCCAGAG CCCCAGCTTC CTTTCCGCAT CCGTTGGTGA
51 CCGAGTAACA ATCACATGCC GCGCCTCATC TTCAGTTACA TCTTCTTATC
101 TTAATTGGTA TCAACAAAAA CCAGGAAAAG CACCTAAACT TCTTATATAC
151 TCTACATCTA ATCTCGCATC AGGAGTTCCC TCTCGATTTT CAGGATCTGG
201 ATCAGGCACA GAATTTACAC TTACTATATC ATCACTCCAA CCAGAAGACT
251 TCGCCACTTA TTACTGCCAA CAATACGATT TTTTTCCAAG CACATTCGGA
301 GGAGGTACAA AAGTAGAAAT CAAGCGTACG GTGGCTGCAC CATCTGTCTT
351 CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG
401 TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG
451 GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG TCACAGAGCA
501 GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG ACGCTGAGCA
551 AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG
601 GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT (SEQID n°.:214)
Seqüência de * aminoácidos de Ab-14 LC incluindopeptideo sinal:
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCDIQLTQSP SFLSASVGDR VTITCRASSS51 VTSSYLNWYQ QKPGKAPKLL IYSTSNLASG VPSRFSGSGS GTEFTLTISS101 LQPEDFATYY CQQYDFFPST FGGGTKVEIK RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS151 GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS201 TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC (SEQ ID
n°.:215)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-14 LC incluin-do a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT
51 CCCAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGCTGAC CCAGAGCCCC AGCTTCCTTT
101 CCGCATCCGT TGGTGACCGA GTAACAATCA CATGCCGCGC CTCATCTTCA
151 GTTACATCTT CTTATCTTAA TTGGTATCAA CAAAAACCAG GAAAAGCACC
201 TAAACTTCTT ATATACTCTA CATCTAATCT CGCATCAGGA GTTCCCTCTC
251 GATTTTCAGG ATCTGGATCA GGCACAGAAT TTACACTTAC TATATCATCA
301 CTCCAACCAG AAGACTTCGC CACTTATTAC TGCCAACAAT ACGATTTTTT
351 TCCAAGCACA TTCGGAGGAG GTACAAAAGT AGAAATCAAG CGTACGGTGG
401 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT
451 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC
501 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG
551 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC
601 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG
651 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA
701 GGGGAGAGTG T (SEQ ID n°.:216) Ab- -14 Cadeia pesada: Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-14 HC:
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMNWVRQA PGQRLEWMGD51 INPYNDDTTY NHKFKGRVTI TRDTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARET101 AVITTNAMDY WGQGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSNFGTQ201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT251 LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF301 RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT351 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS4 01 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQID n°.:217)
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-14 HC sem terminal carbóxi-lisina:1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMNWVRQA PGQRLEWMGD51 INPYNDDTTY NHKFKGRVTI TRDTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARET101 AVITTNAMDY WGQGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSNFGTQ201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT251 LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTKP REEQFNSTF301 RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT351 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS
4 01 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG (SEQID n°.:393)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-14 HC:
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTCAAGAAAC CTGGAGCAAG51 CGTAAAGGTT AGTTGCAAAG CATCTGGATA CACATTTACC GACTACTACA101 TGAATTGGGT ACGACAAGCC CCTGGACAAA GACTTGAATG GATGGGAGAC151 ATTAACCCTT ATAACGACGA CACTACATAC AATCATAAAT TTAAAGGAAG2 01 AGTTACAATT ACAAGAGATA CATCCGCATC AACCGCCTAT ATGGAACTTT2 51 CCTCATTGAG ATCTGAAGAC ACTGCTGTTT ATTACTGTGC AAGAGAAACT301 GCCGTTATTA CTACTAACGC TATGGATTAC TGGGGTCAAG GAACCACTGT351 TACCGTCTCT AGTGCCTCCA CCAAGGGCCC ATCGGTCTTC CCCCTGGCGC4 01 CCTGCTCCAG GAGCACCTCC GAGAGCACAG CGGCCCTGGG CTGCCTGGTC451 AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT CAGGCGCTCT
501 GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTACAGTCC TCAGGACTCT
551 ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAACTT CGGCACCCAG
601 ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA AGGTGGACAA
651 GACAGTTGAG CGCAAATGTT GTGTCGAGTG CCCACCGTGC CCAGCACCAC
701 CTGTGGCAGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC
751 CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG TGGACGTGAG
801 CCACGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG
851 TGCATAATGC CAAGACAAAG CCACGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACGTTC
901 CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTTGTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA
951 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCAGCC CCCATCGAGA
1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC
1051 CTGCCCCCAT CCCGGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG
1101 CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA
1151 ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CACCTCCCAT GCTGGACTCC
1201 GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG
1251 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA
1301 ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT ' CTCCGGGTAA A (SEQ I n° . :218)
Seqüência de aminoácidos de Ab-14 HC incluindopeptideo sinal:
1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD51 YYMNWVRQAP GQRLEWMGDI NPYNDDTTYN HKFKGRVTIT RDTSASTAYM101 ELSSLRSEDT AVYYCARETA VITTNAMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS201 GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP251 APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVQFNWYVDG301 VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP351 IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW401 ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA451 LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID n°.:219)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-14 HC incluin-do a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGAGCGG CGCCGAGGTC AAGAAACCTG101 GAGCAAGCGT AAAGGTTAGT TGCAAAGCAT CTGGATACAC ATTTACCGAC151 TACTACATGA ATTGGGTACG ACAAGCCCCT GGACAAAGAC TTGAATGGAT201 GGGAGACATT AACCCTTATA ACGACGACAC TACATACAAT CATAAATTTA251 AAGGAAGAGT TACAATTACA AGAGATACAT CCGCATCAAC CGCCTATATG301 GAACTTTCCT CATTGAGATC TGAAGACACT GCTGTTTATT ACTGTGCAAG351 AGAAACTGCC GTTATTACTA CTAACGCTAT GGATTACTGG GGTCAAGGAA401 CCACTGTTAC CGTCTCTAGT GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC451 CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCGG CCCTGGGCTG501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG551 GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT ACAGTCCTCA601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAACTTCGG651 CACCCAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG701 TGGACAAGAC AGTTGAGCGC AAATGTTGTG TCGAGTGCCC ACCGTGCCCA751 GCACCACCTG TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA801 GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACGTGC GTGGTGGTGG851 ACGTGAGCCA CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC901 GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCA CGGGAGGAGC AGTTCAACAG951 CACGTTCCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTGCACCAG GACTGGCTGA1001 ACGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT1101 GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC1151 TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG1201 GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACAC CTCCCATGCT12 51 GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA1301 GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT1351 CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA(SEQ ID n°.-220)
As seqüências CDR na região variável da cadeia pesada de Ab-14 são:
CDR-H1 : DYYMN (SEQ ID n°.:296)
CDR-H2: DINPYNDDTTYNHKFKG (SEQ ID n°.:297)
CDR-H3 : ETAVITTNAMD (SEQ ID n°.:298)
As seqüências de região variável CDR de cadeia le-ve de Ab-14 são:
CDR-L1 : RASSSVTSSYLN (SEQ ID n°.284)
CDR-L2: STSNLAS (SEQ ID n°.:285)
CDR-L3 : QQYDFFPST (SEQ ID n°.:286)
Ab-14 Domínio variável:
Seqüência de aminoácidos de Ab-14 de cadeia levede domínio variável (sem seqüência sinal):
1 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASSSVT SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY
51 STSNLASGVP SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QYDFFPSTFG101 GGTKVEIK (SEQ ID n°.:380)
Seqüência de DNA de Ab-14 de cadeia leve de domí-nio variável(sem seqüência sinal):
1 GACATCCAGC TGACCCAGAG CCCCAGCTTC CTTTCCGCAT CCGTTGGTGA51 CCGAGTAACA ATCACATGCC GCGCCTCATC TTCAGTTACA TCTTCTTATC101 TTAATTGGTA TCAACAAAAA CCAGGAAAAG CACCTAAACT TCTTATATAC151 TCTACATCTA ATCTCGCATC AGGAGTTCCC TCTCGATTTT CAGGATCTGG201 ATCAGGCACA GAATTTACAC TTACTATATC ATCACTCCAA CCAGAAGACT251 TCGCCACTTA TTACTGCCAA CAATACGATT TTTTTCCAAG CACATTCGGA301 GGAGGTACAA AAGTAGAAAT CAAG (SEQ ID n°.:381)
Seqüência de aminoácidos de Ab-14 de cadeia pesadade dominio variável (sem seqüência sinal):
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMNWVRQA PGQRLEWMGD51 INPYNDDTTY NHKFKGRVTI TRDTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARET101 AVITTNAMDY WGQGTTVTVS S (SEQ ID n°.382)
Seqüência de DNA de Ab-14 de cadeia pesada de do-minio variável(sem seqüência sinal):
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTCAAGAAAC CTGGAGCAAG51 CGTAAAGGTT AGTTGCAAAG CATCTGGATA CACATTTACC GACTACTACA101 TGAATTGGGT ACGACAAGCC CCTGGACAAA GACTTGAATG GATGGGAGAC151 ATTAACCCTT ATAACGACGA CACTACATAC AATCATAAAT TTAAAGGAAG201 AGTTACAATT ACAAGAGATA CATCCGCATC AACCGCCTAT ATGGAACTTT251 CCTCATTGAG ATCTGAAGAC ACTGCTGTTT ATTACTGTGC AAGAGAAACT301 GCCGTTATTA CTACTAACGC TATGGATTAC TGGGGTCAAG GAACCACTGT351 TACCGTCTCT AGT (SEQ ID n°.:383)
Ab-3 foi humanizado para gerar Ab-15.
Ab-15
As seqüências da Anticorpo 15 (também referido a-qui como Ab-15) LC e HC são como segue:Ab-15 Cadeia leve:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-15 LC:
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSVSSTIS SNHLHWFQQK PGKAPKSLIY51.GTSNLASGVP SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QWSSYPLTFG101 GGTKVEIKRJ VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK151 VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ201 GLSSPVTKSF NRGEC(SEQ ID n°.:221)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-15 LC:
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCAGCAT CCGTAGGCGA
51 TAGAGTTACA ATAACATGCA GCGTATCATC AACTATATCA TCAAATCATC
101 TTCATTGGTT CCAACAGAAA CCCGGCAAAG CACCTAAATC ACTTATATAC
151 GGCACATCAA ATCTCGCATC AGGCGTTCCT TCAAGATTTT CAGGCTCTGG
201 CTCAGGCACC GACTTTACTC TTACAATATC CTCCCTCCAA CCCGAAGACT
251 TCGCAACCTA TTACTGTCAA CAATGGTCCT CATATCCACT CACATTTGGC
301 GGCGGCACAA AAGTAGAAAT TAAACGTACG GTGGCTGCAC CATCTGTCTT
351 CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG
401 TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG
451 GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG TCACAGAGCA
501 GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG ACGCTGAGCA
551 AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG
601 GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT (SEQID n°.:222)
Seqüência de aminoácidos de Ab-15 LC incluindopeptideo sinal:
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCSVSST51 ISSNHLHWFQ QKPGKAPKSL IYGTSNLASG VPSRFSGSGS GTDFTLTISS101 LQPEDFATYY CQQWSSYPLT FGGGTKVEIK RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS151 GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS201 TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC (SEQ IDn°.:223)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-15 LC incluin-do a seqüência de codificação de peptideo sinal:1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT
51 CCGAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTCT
101 CAGCATCCGT AGGCGATAGA GTTACAATAA CATGCAGCGT ATCATCAACT
151 ATATCATCAA ATCATCTTCA TTGGTTCCAA CAGAAACCCG GCAAAGCACC
201 TAAATCACTT ATATACGGCA CATCAAATCT CGCATCAGGC GTTCCTTCAA
251 GATTTTCAGG CTCTGGCTCA GGCACCGACT TTACTCTTAC AATATCCTCC
301 CTCCAACCCG AAGACTTCGC AACCTATTAC TGTCAACAAT GGTCCTCATA
351 TCCACTCACA TTTGGCGGCG GCACAAAAGT AGAAATTAAA CGTACGGTGG
401 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT
451 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC
501 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG
551 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC
601 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG
651 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA
701 GGGGAGAGTG T (SEQ ID n°.-224)Ab-15 Cadeia pesada
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-15 HC.
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASDFNIK DFYLHWVRQA PGQGLEWIGR51 IDPENGDTLY DPKFQDKVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREA101 DYFHDGTSYW YFDVWGRGTL YTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL151 GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN201 FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK251 PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQF301 NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPAPIEKTI SKTKGQPREP351 QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP401 MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG451 JT(SEQ ID n°.:225)Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-15 HC sem terminal carbóxi-lisina:1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASDFNIK DFYLHWVRQA PGQGLEWIGR51 IDPENGDTLY DPKFQDKVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREA101 DYFHDGTSYW YFDVWGRGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL151 GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN201 FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK251 PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQF301 NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPAPIEKTI SKTKGQPREP351 QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP401 MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG451 (SEQ ID n°.:394)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-15 HC:
1 GAGGTGCAGG TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC
51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC
101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATTGGAAGG
151 ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTTTATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA
201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCACCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA
251 GGAGCCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAGGCG
301 GATTATTTCC ACGATGGTAC CTCCTACTGG TACTTCGATG TCTGGGGCCG
351 TGGCACCCTG GTCACCGTCT CTAGTGCCTC CACCAAGGGC CCATCGGTCT
401 TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCGGCCCTG
451 GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA
501 CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTACAGT
551 CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAAC
601 TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC CCAGCAACAC
651 CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG TGCCCACCGT701 GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA
751 CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CGTGCGTGGT
801 GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC TGGTACGTGG
851 ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA GGAGCAGTTC
901 AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC ACCAGGACTG
951 GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GGCCTCCCAG
1001 CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA
1051 CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA AGAACCAGGT
1101 CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC ATCGCCGTGG
1151 AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACACCTCCC
1201 ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA
1251 CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG
1301 AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT
1351 AAA (SEQ ID n°.:226)
Seqüência de aminoácidos de Ab-15 HC incluindopeptideo sinal:
1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASDFNIKD51 FYLHWVRQAP GQGLEWIGRI DPENGDTLYD PKFQDKVTMT TDTSTSTAYM101 ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFHDGTSYWY FDVWGRGTLV TVSSASTKGP151 SVFPLAPCSR STSESTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV201 LQSSGLYSLS SVVTVPSSNF GTQTYTCNVD HKPSNTKVDK TVERKCCVEC251 PPCPAPPVAG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVQFNW301 YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STFRVVSVLT VVHQDWLNGK EYKCKVSNKG351 LPAPIEKTIS KTKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI401 AVEWESNGQP ENNYKTTPPM LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV451 MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID n°.:227)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-15 HC incluin-do a seqüência de codificação de peptideo sinal:1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC151 TTCTATCTAC ACTGGGTGCG201 TGGAAGGATT GATCCTGAGA251 AGGACAAGGT CACCATGACC301 GAGCTGAGGA GCCTGAGATC351 AGAGGCGGAT TATTTCCACG401 GGGGCCGTGG CACCCTGGTC451 TCGGTCTTCC CCCTGGCGCC501 GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA551 CGTGGAACTC AGGCGCTCTG601 CTACAGTCCT CAGGACTCTA651 CAGCAACTTC GGCACCCAGA701 GCAACACCAA GGTGGACAAG751 CCACCGTGCC CAGCACCACC801 CCCAAAACCC AAGGACACCC851 GCGTGGTGGT GGACGTGAGC901 TACGTGGACG GCGTGGAGGT951 GCAGTTCAAC AGCACGTTCC1001 AGGACTGGCT GAACGGCAAG1051 CTCCCAGCCC CCATCGAGAA1101 AGAACCACAG GTGTACACCC1151 ACCAGGTCAG CCTGACCTGC1201 GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA1251 ACCTCCCATG CTGGACTCCG1301 CCGTGGACAA GAGCAGGTGG1351 ATGCATGAGG CTCTGCACAA
CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGCTGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTGTGCAAGGCTT CTGACTTCAA CATTAAAGACACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGATATGGTGATAC TTTATATGAC CCGAAGTTCCACAGACACGT CCACCAGCAC AGCCTACATGTGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAGATGGTACCTC CTACTGGTAC TTCGATGTCTACCGTCTCTA GTGCCTCCAC CAAGGGCCCACTGCTCCAGG AGCACCTCCG AGAGCACAGCAGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGTACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCAGCTGTCCTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTCCCTACACCTG CAACGTAGAT CACAAGCCCAACAGTTGAGC GCAAATGTTG TGTCGAGTGCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCCTCATGATCTC CCGGACCCCT GAGGTCACGTCACGAAGACC CCGAGGTCCA GTTCAACTGGGCATAATGCC AAGACAAAGC CACGGGAGGAGTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTTGTGCACCGAGTACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAAGGCAACCATCTCC AAAACCAAAG GGCAGCCCCGTGCCCCCATC CCGGGAGGAG ATGACCAAGACTGGTCAAAG GCTTCTACCC CAGCGACATCTGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAAGACCACACGGCTCCTT CTTCCTCTAC AGCAAGCTCACAGCAGGGGA ACGTCTTCTC ATGCTCCGTGCCACTACACG CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC1401 TCCGGGTAAA (SEQ ID n°.:228)
As seqüências CDR na região variável da cadeia pe-sada de Ab-15 são:
CDR-H1 : DFYLH (SEQ ID n°.:290)
CDR-H2: RIDPENGDTLYDPKFQD (SEQ ID n°.:291)
CDR-H3 : EADYFHDGTSYWYFDV (SEQ ID n°.:292)
As seqüências de região variável CDR de cadeia le-ve de Ab-15 são:
CDR-L1: SVSSTISSNHLH (SEQ ID n°.:278)
CDR-L2: GTSNLAS (SEQ ID n°.:279)
CDR-L3: QQWSSYPLT (SEQ ID n°.:280)
Ab-15 Domínio variável:
Seqüência de aminoácidos de Ab-15 de cadeia levede dominio variável (sem seqüência sinal):
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSVSSTIS SNHLHWFQQK PGKAPKSLIY
51 GTSNLASGVP SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QWSSYPLTFG
101 GGTKVEIK (SEQ ID n°.:384)
Seqüência de DNA de Ab-15 de cadeia leve de domi-nio variável(sem seqüência sinal):
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCAGCAT CCGTAGGCGA
51 TAGAGTTACA ATAACATGCA GCGTATCATC AACTATATCA TCAAATCATC101 TTCATTGGTT CCAACAGAAA CCCGGCAAAG CACCTAAATC ACTTATATAC151 GGCACATCAA ATCTCGCATC AGGCGTTCCT TCAAGATTTT CAGGCTCTGG201 CTCAGGCACC GACTTTACTC TTACAATATC CTCCCTCCAA CCCGAAGACT251 TCGCAACCTA TTACTGTCAA CAATGGTCCT CATATCCACT CACATTTGGC301 GGCGGCACAA AAGTAGAAAT TAAA (SEQ ID n°.:385)
Seqüência de aminoácidos de Ab-15 de cadeia pesadade dominio variável (sem seqüência sinal):1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASDFNIK DFYLHWVRQA PGQGLEWIGR51 IDPENGDTLY DPKFQDKVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREA101 DYFHDGTSYW YFDVWGRGTL VTVSS (SEQ ID n°.-386)
Seqüência de DNA de Ab-15 de cadeia pesada de do-minio variável(sem seqüência sinal):
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATTGGAAGG151 ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTTTATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCACCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA251 GGAGCCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAGGCG301 GATTATTTCC ACGATGGTAC CTCCTACTGG TACTTCGATG TCTGGGGCCG351 TGGCACCCTG GTCACCGTCT CTAGT (SEQ ID n°.:387)Ab-11 foi humanizado para gerar Ab-16.
Ab-16
As seqüências da Anticorpo 16 (também referido a-qui como Ab-16) LC e HC são como segue:Ab-16 Cadeia leve:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-16 LC:
1 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASSSTS YIHWYQQKPG KAPKLLIYAf51 SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSDPLTFGGG101 TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD151 NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL201 SSPVTKSFNR GEC (SEQ ID n°.:229)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-16 LC:
1 GACATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTTC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA51 CAGAGTCACC ATCACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATACACT
101 GGTATCAGCA AAAACCAGGG AAAGCCCCTA AGCTCCTGAT CTATGCCACA
151 TCCAACCTGG CTTCTGGGGT CCCATCAAGG TTCAGCGGCA GTGGATCTGG
201 GACAGAATTC ACTCTCACAA TCAGCAGCCT GCAGCCTGAA GATTTTGCAA
251 CTTATTACTG TCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGCGGAGGG
301 ACCAAGGTGG AGATCAAACG TACGGTGGCT GCACCATCTG TCTTCATCTT
351 CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT GTTGTGTGCC
401 TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGAT
451 AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG AGCAGGACAG
501 CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG AGCAAAGCAG
551 ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA TCAGGGCCTG
601 AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGT (SEQ IDn° . :230)
Seqüência de aminoácidos de Ab-16 LC incluindopeptideo sinal:
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCDIQLTQSP SFLSASVGDR VTITCRASSS51 ISYIHWYQQK PGKAPKLLIY ATSNLASGVP SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ101 PEDFATYYCQ QWSSDPLTFG GGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT151 ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL201 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID n°.:231 )Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-16 LC incluin-do a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGGCT51 CCCAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGTTGAC CCAGTCTCCA TCCTTCCTGT101 CTGCATCTGT AGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT151 ATAAGTTACA TACACTGGTA TCAGCAAAAA CCAGGGAAAG CCCCTAAGCT201 CCTGATCTAT GCCACATCCA ACCTGGCTTC TGGGGTCCCA TCAAGGTTCA251 GCGGCAGTGG ATCTGGGACA GAATTCACTC TCACAATCAG CAGCCTGCAG301 CCTGAAGATT TTGCAACTTA TTACTGTCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT
351 CACGTTCGGC GGAGGGACCA AGGTGGAGAT CAAACGTACG GTGGCTGCAC
401 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT
451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT
501 ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG
551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG
601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT
651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG
701 AGTGT (SEQ ID n°.:232)
Ab-16 Cadeia pesada:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-16 HC:
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFDIK BYYIHWVRQA PGQGLEWIGR51 VDPDNGETEF APKFPGKVTM TTDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARED101 YDGTYTWFPY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSNFGTQ201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT251 LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVQFNVVYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF301 RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT351 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS401 DGSFFLYSKL TVbKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK(SEQ IDNO:233) .
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-16 HC sem terminal carbóxi-lisina:
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFDIK DYYIHWVRQA PGQGLEWIGR51 VDPDNGETEF APKFPGKVTM TTDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARED101 YDGTYTWFPY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSNFGTQ
201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT
251 LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF
301 RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT
351 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS
401 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG (SEQID n°.:395)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-16 HC:
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGO CTGGGGCCTC
51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGATT CGACATTAAG GACTACTATA
101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATCGGAAGG
151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT GCCCCGAAGT TCCCGGGCAA
201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCATCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA
251 GCAGGCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAAGAC
301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT TGGGGCCAAG GGACTCTGGT
351 CACCGTCTCT AGTGCCTCCA CCAAGGGCCC ATCGGTCTTC CCCCTGGCGC
401 CCTGCTCCAG GAGCACCTCC GAGAGCACAG CGGCCCTGGG CTGCCTGGTC
451 AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT CAGGCGCTCT
501 GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTACAGTCC TCAGGACTCT
551 ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAACTT CGGCACCCAG
601 ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA AGGTGGACAA
651 GACAGTTGAG CGCAAATGTT GTGTCGAGTG CCCACCGTGC CCAGCACCAC
701 CTGTGGCAGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC
751 CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG TGGACGTGAG
801 CCACGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG
851 TGCATAATGC CAAGACAAAG CCACGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACGTTC
901 CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTTGTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA951 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCAGCC CCCATCGAGA1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC1051 CTGCCCCCAT CCCGGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG1101 CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA1151 ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CACCTCCCAT GCTGGACTCC1201 GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG1251 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA1301 ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A (SEQ IDn°.:234)
Seqüência de aminoácidos de Ab-16 HC incluindopeptideo sinal:
1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGFDIKD51 YYIHWVRQAP GQGLEWIGRV DPDNGETEFA PKFPGKVTMT TDTSISTAYM101 ELSRLRSDDT AVYYCAREDY DGTYTWFPYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS201 GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP251 APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG301 VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP351 IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW4 01 ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA451 LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID n°.:235)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-16 HC incluin-do a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC 51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGATTCGA CATTAAGGAC151 TACTATATAC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT201 CGGAAGGGTT GATCCTGACA ATGGTGAGAC TGAATTTGCC CCGAAGTTCC251 CGGGCAAGGT CACCATGACC ACAGACACGT CCATCAGCAC AGCCTACATG301 GAGCTGAGCA GGCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG351 AGAAGACTAC GATGGTACCT ACACCTGGTT TCCTTATTGG GGCCAAGGGA401 CTCTGGTCAC CGTCTCTAGT GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC451 CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCGG CCCTGGGCTG501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG551 GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT ACAGTCCTCA601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAACTTCGG651 CACCCAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG701 TGGACAAGAC AGTTGAGCGC AAATGTTGTG TCGAGTGCCC ACCGTGCCCA751 GCACCACCTG TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA801 GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACGTGC GTGGTGGTGG851 ACGTGAGCCA CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC901 GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCA CGGGAGGAGC AGTTCAACAG951 CACGTTCCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTGCACCAG GACTGGCTGA1001 ACGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT1101 GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC1151 TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG1201 GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACAC CTCCCATGCT1251 GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA1301 GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT1351 CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA(SEQ ID n°.:236)
As seqüências CDR na região variável da cadeia pe-sada de Ab-16 são:
CDR-H1 : DYYIH (SEQ ID n°.:293)
CDR-H2: RVDPDNGETEFAPKFPG (SEQ ID n°.:294)CDR-H3 : EDYDGTYTWFPY (SEQ ID n°.:295)As seqüências CDR na região variável de cadeia le-ve de Ab-16 são:
CDR-Ll : RASSSISYIH (SEQ ID n°.:281)CDR-L2: ATSNLAS (SEQ ID n°.:282)
CDR-L3 : QQWSSDPLT (SEQ ID n°.:283)Dominio variável Ab-16:
Seqüência de aminoácidos de Ab-16 de cadeia levede dominio variável (sem seqüência sinal):
1 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASSSIS YIHWYQQKPG KAPKLLIYAT51 SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSDPLTFGGG101 TKVEIK (SEQ ID n°.:388)
Seqüência de DNA de Ab-16 de cadeia leve de domi-nio variável(sem seqüência sinal):
1 GACATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTTC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA51 CAGAGTCACC ATCACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATACACT101 GGTATCAGCA AAAACCAGGG AAAGCCCCTA AGCTCCTGAT CTATGCCACA151 TCCAACCTGG CTTCTGGGGT CCCATCAAGG TTCAGCGGCA GTGGATCTGG2 01 GACAGAATTC ACTCTCACAA TCAGCAGCCT GCAGCCTGAA GATTTTGCAA251 CTTATTACTG TCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGCGGAGGG301 ACCAAGGTGG AGATCAAA (SEQ ID n°.:389)
Seqüência de aminoácidos de Ab-16 de cadeia pesadade dominio variável (sem seqüência sinal):
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFDIK DYYIHWVRQA PGQGLEWIGR 51 VDPDNGETEF APKFPGKVTM TTDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARED101 YDGTYTWFPY WGQGTLVTVS S (SEQ ID n°.-390)
Seqüência de DNA de Ab-16 de cadeia pesada de do-minio variável(sem seqüência sinal):1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGATT CGACATTAAG GACTACTATA101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATCGGAAGG151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT GCCCCGAAGT TCCCGGGCAA201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCATCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA251 GCAGGCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAAGAC301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT TGGGGCCAAG GGACTCTGGT351 CACCGTCTCT AGT (SEQ ID n°.:391)
Anticorpos adicionais são referidos aqui como an-ticorpos 17-22 (também referidos aqui como Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, e Ab-22) . A região de constante Kapa paratodas as regiões VK de Ab-17, Ab-19, e Ab-21 é como segue:TDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.-323)
A região constante pesada para todas as regiões VHde anticorpos 17, 19 e 21 é como segue:
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID n°.:324)
Nas seguintes seqüências de aminoácidos de anti-corpos, os aminoácidos assinalados representam regiões dedeterminação de complemento (CDRs) e os aminoácidos subli-nhados representam peptideo sinal.
Ab-17Seqüência de aminoácidos de Ab-17 LC incluindopeptideo sinal:
MDFQVOIFSFMLISVTVILSSGEIVLTQSPALMAASPGEKVTITCSVSSSISSSNLHWSQQKSGTSPKLWIYGTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWTTTYTFGSGTKLELKR (SEQ ID n°.:299)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-17 LC incluin-do peptideo sinal:
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCATGCTAATCAGTGTCACAGTCATATTGTCCAGTGGAGAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAGCACTCATGGCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATCACCTGCAGTGTCAGCTCGAGTATAAGTTCCAGCAACTTACACTGGTCCCAGCAGAAGTCAGGAACCTCCCCCAAACTCTGGATTTATGGCACATCCAACCTTGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGTCAACAGTGGACTACTACGTATACGTTCGGATCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGT (SEQ IDn°.:300)
Seqüência de aminoácidos de Ab-17 HC incluindopeptideo sinal:
MGWNWIIFFLMAVVTGWSEVQLRQSGADLVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPDNGESTYVPKFQGKATITADTSSNTAYLQLRSLTSEDTAIYYCGREGLDYGDYYAVDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID n°.:301)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-17 HC incluin-do peptideo sinal:
ATGGGATGGAACTGGATCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCAGAGGTGCAGTTGCGGCAGTCTGGGGCAGACCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGATAATGGTGAAAGTACATATGTCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCATCCAACACAGCCTACCTACAACTCAGAAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCATCTA GT-CAAGGAACCTCGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID n°.:302)
Ab-17 foi humanizado para gerar Ab-18.
Ab-18
Seqüência de aminoácidos de Ab-18 LC incluindopeptideo sinal:
MDMRVPAOLLGLLLLWLPGARCDIOLTOSPSFLSASVGDRVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKPGKAPKLLIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTTTYTFGQGTKLEIKR (SEQ ID n°.:303)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-18 LC incluindo peptideo sinal:
ATGGATATGCGCGTGCCGGCGCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGCCGGGCGCGCGCTGCGATATTCAGCTGACCCAGAGCCCGAGCTTTCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCAGCGTGAGCAGCAGCATTAGCAGCAGCAACCTGCATTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATGGCACCAGCAACCTGGCGAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGAATTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTGGACCACCACCTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAACGT (SEQ IDn°. :304)
Seqüência de aminoácidos de Ab-18 HC incluindopeptideo sinal:
MDWTWSILFLVAAPTGAHSEVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPDNGESTYVPKFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGLDYGDYYAVDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID n°.:305)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-18 HC incluin-do peptideo sinal:
ATGGATTGGACCTGGAGCATTCTGTTTCTGGTGGCGGCGCCGACCGGCGCGCATAG
CGAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTG
AAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATTATTATATTCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGCATTGATCCGGATAACGGCGAAAGCACCTATGTGCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGATACCAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAAGGCCTGGATTATGGCGATTATTATGCGGTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ ID n°.-306)
Seqüência de aminoácidos de Ab-18 de cadeia levede dominio variável (sem seqüência sinal) :
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKPGKAPKLLIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTTT[Upsilon]TFGQGTKLEIKR (SEQ ID n°.:368)
Seqüência de DNA de Ab-18 de cadeia leve de domi-nio variável(sem seqüência sinal):
GATATTCAGCTGACCCAGAGCCCGAGCTTTCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGA.CCATTACCTGCAGCGTGAGCAGCAGCATTAGCAGCAGCAACCTGCATTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATGGCACCAGCAACCTGGCGAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGAATTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTGGACCACCACCTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAACGT (SEQ ID n°.:369)Seqüência de aminoácidos de Ab-18 de cadeia pesadade dominio variável (sem seqüência sinal):
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPDNGESTYVPKFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGLDYGDYYAVDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID n°.:370)
Seqüência de DNA de Ab-18 de cadeia pesada de do-minio variável(sem seqüência sinal):
GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGA
AAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATTATTATATTCATTGGGTG
CGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGCATTGATCCGGATAACGGCGAAAGCACCTATGTGCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGATACCAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAAGGCCTGGATTATGGCGATTATTATGCGGTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ ID n°.:371)
Ab-19
Seqüência de aminoácidos de Ab-19 LC incluindopeptideo sinal:
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVNISCRASQDISSYLNWYQQKPDGTVKLLIYSTSRLNSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLAQEDIATYFCQQDIKHPTFGGGTKLELKR (SEQ ID n°.:307)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-19 LC incluin-do peptideo sinal:
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCAACATCAGCTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAGTTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTCCACATCAAGATTAAACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCACTATTAGCAACCTGGCACAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGATATTAAGCATCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGTTGGAGCTGAAACGT (SEQ ID n°.:308)
Seqüência de aminoácidos de Ab-19 HC incluindopeptideo sinal:
MEWIWIFLFLLSGTAGVHSEVOLOQSGPELVKPGASVKMSCKASGFTFTDYIMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDDTEYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMDLSSLTSEGSAVYYCARSIYYYDAPFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID n°.:30 9)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-19 HC incluindo peptideo sinal:
ATGGAATGGATCTGGATATTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCTGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGGTTCACATTCACTGACTACATTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGATACTGAATACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGATCTCAGCAGTCTGACCTCTGAGGGCTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGATTTATTACTACGATGCCCCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID n°.:310)
Ab-19 foi humanizado para gerar o anticorpo 20(também referido aqui como Ab-20) e Anticorpo 23 (também re-ferido aqui como Ab-23).
versão Ab-20 IgG4
Seqüência de aminoácidos de Ab-20 LC incluindopeptideo sinal:
MMSSAOFLGLLLLCFQGTRCDIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASODISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSTSRLNSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDIKHPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID n°.:311)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-20 LC incluin-do peptideo sinal:
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGTGACCGTGTCACCATCACTTGCCGCGCAAGTCAGGATATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTACTTCCCGTTTGAATAGTGGGGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGATATTAAACACCCTACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGT (SEQ ID n°.:312)
Seqüência de aminoácidos de Ab-20 HC incluindopeptideo sinal:
MEWIWIFLFLLSGTAGVHSEVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDDTEYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYYYDAPFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID n°.:313)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-20 HC incluin-do peptideo sinal:
ATGGAATGGATCTGGATATTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCTGAGGTGCAGCTGCTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTTTACCTTCACCGACTATATTATGCACTGGGTGCGTCAGGCCCCTGGTCAAGGGCTTGAGTGGATGGGCTATATCAACCCTTATAATGATGACACCGAATACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGTGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGTTCGATTTATTACTACGATGCCCCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID n°.:349)
Ab-23 versão IgG2
Cadeia leve: Seqüência de aminoácidos de forma ma-dura (peptideo sinal removido) de Ab-23 LC:1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQPJS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYS51 TSRLNSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ DIKHPTFGQG101 TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD151 NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL201 SSPVTKSFNR GEC (SEQ ID n°.:341)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-23 LC:
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGTGA51 CCGTGTCACC ATCACTTGCC GCGCAAGTCA GGATATTAGC AGCTATTTAA101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCT151 ACTTCCCGTT TGAATAGTGG GGTCCCATCA CGCTTCAGTG GCAGTGGCTC201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG251 CAACTTACTA CTGTCAACAG GATATTAAAC ACCCTACGTT CGGTCAAGGC301 ACCAAGGTGG AGATCAAACG TACGGTGGCT GCACCATCTG TCTTCATCTT351 CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT GTTGTGTGCC401 TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGAT451 AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG AGCAGGACAG501 CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG AGCAAAGCAG551 ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA TCAGGGCCTG
601 AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGT (SEQ IDn°. :342)
Seqüência de aminoácidos de Ab-23 LC incluindopeptideo sinal:
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQD51 ISSYLNWYQQ KPGKAPKLLI YSTSRLNSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL101 QPEDFATYYC QQDIKHPTFG QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT151 ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL201 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID n°.:343)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-23 LC incluin-do a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGACATGA GGGTGCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTGTGGCT51 GAGAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT101 CTGCATCTGT AGGTGACCGT GTCACCATCA CTTGCCGCGC AAGTCAGGAT151 ATTAGCAGCT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA201 GCTCCTGATC TATTCTACTT CCCGTTTGAA TAGTGGGGTC CCATCACGCT251 TCAGTGGCAG TGGCTCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGTCTG301 CAACCTGAAG ATTTTGCAAC TTACTACTGT.CAACAGGATA TTAAACACCC351 TACGTTCGGT CAAGGCACCA AGGTGGAGAT CAAACGTACG GTGGCTGCAC401 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT501 ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG701 AGTGT (SEQ ID n°.:344)Cadeia pesada:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-23 HC:
1 EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGFTFT DYIMHWVRQA PGQGLEWMGY51 JNPYNDDTEY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSI101 YYYDAPFAYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT201 YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF LFPPKPKDTL251 MLSRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTFR301 VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL351 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIA VEWESNGQPENNY KTTPPMLDSD401 GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQID n°.:345)
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-23 HC sem terminal carbóxi-lisina:1 EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGFTFT DYIMHWVRQA PGQGLEWMGY51 INPYNDDTEY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSI101 YYYDAPFAYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT201 YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF LFPPKPKDTL251 MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTFR301 VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL351 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD401 GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPG (SEQID n°.:396)Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-23 HC:
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGTCCTC51 GGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGTTT TACCTTCACC GACTATATTA101 TGCACTGGGT GCGTCAGGCC CCTGGTCAAG GGCTTGAGTG GATGGGCTAT151 ATCAACCCTT ATAATGATGA CACCGAATAC AACGAGAAGT TCAAGGGCCG201 TGTCACGATT ACCGCGGACA AATCCACGAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA251 GCAGCCTGCG CTCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GCGTTCGATT301 TATTACTACG ATGCCCCGTT TGCTTACTGG GGCCAAGGGA CTCTGGTCAC351 CGTCTCTAGT GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCGCCCT401 GCTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG451 GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCTCTGAC501 CAGCGGCGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT551 CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAACTTCGG CACCCAGACC601 TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAC651 AGTTGAGCGC AAATGTTGTG TCGAGTGCCC ACCGTGCCCA GCACCACCTG701 TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC751 ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACGTGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA801 CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC851 ATAATGCCAA GACAAAGCCA CGGGAGGAGC AGTTCAACAG CACGTTCCGT901 GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTGCACCAG GACTGGCTGA ACGGCAAGGA951 GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA1001 CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG1051 CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT1101 GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG1151 GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACAC CTCCCATGCT GGACTCCGAC1201 GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA1251 GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC1301 ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA (SEQ IDn°.:346)
Seqüência de aminoácidos de Ab-23 HC incluindopeptideo sinal:
1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGSSVKVS CKASGFTFTD51 YIMHWVRQAP GQGLEWMGYI NPYNDDTEYN EKFKGRVTIT ADKSTSTAYM101 ELSSLRSEDT AVYYCARSIY YYDAPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL151 APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG201 LYSLSSVVTV PSSNFGTQTY TCNVDHKPSN TKVDKTVERK CCVECPPCPA251 PPVAGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VQFNWYVDGV301 EVHNAKTKPR EEQFNSTFRV VSVLTVVHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPAPI351 EKTISKTKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE401 SNGQPENNYK TTPPMLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL451 HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID n°.:347)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-23 HC incluin-do a seqüência de codificação de peptideo sinal:
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG101 GGTCCTCGGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTTTAC CTTCACCGAC151 TATATTATGC ACTGGGTGCG TCAGGCCCCT GGTCAAGGGC TTGAGTGGAT201 GGGCTATATC AACCCTTATA ATGATGACAC CGAATACAAC GAGAAGTTCA251 AGGGCCGTGT CACGATTACC GCGGACAAAT CCACGAGCAC AGCCTACATG301 GAGCTGAGCA GCCTGCGCTC TGAGGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGCG351 TTCGATTTAT TACTACGATG CCCCGTTTGC TTACTGGGGC CAAGGGACTC401 TGGTCACCGT CTCTAGTGCC TCCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG451 GCGCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCCGAGAGC ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT501 GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG AACTCAGGCG551 CTCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA601 CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG CCCTCCAGCA ACTTCGGCAC651 CCÁGACCTAC ACCTGCAACG TAGATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG7 01 ACAAGACAGT TGAGCGCAAA TGTTGTGTCG AGTGCCCACC GTGCCCAGCA751 CCACCTGTGG CAGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAA AACCCAAGGA8 01 CACCCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACGTGCGTG GTGGTGGACG851 TGAGCCACGA AGACCCCGAG GTCCAGTTCA ACTGGTACGT GGACGGCGTG901 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCACGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC951 GTTCCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTTGT GCACCAGGAC TGGCTGAACG1001 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGGCCTCCC AGCCCCCATC1051 GAGAAAACCA TCTCCAAAAC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC CACAGGTGTA1101 CACCCTGCCC CCATCCCGGG AGGAGATGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA1151 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TACCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG12 01 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACACCTC CCATGCTGGA12 51 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAA GCTCACCGTG GACAAGAGCA1301 GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG1351 CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCGG GTAAA (SEQID n°.:348)
As seqüências de CDR (região determinante de com-plementaridade) na região variável da cadeia pesada de Ab-23são como segue:
CDR-H1 : DYIMH (SEQ ID n°.:269)
CDR-H2: YINPYNDDTEYNEKFKG (SEQ ID n°.:270)
CDR-H3: SIYYYDAPFAY (SEQ ID n°.:271)
As seqüências de região variável CDR de cadeia le-ve de Ab-23 são:
CDR-L1 : RASQDISSYLN (SEQ ID n°.:239)CDR-L2: STSRLNS (SEQ ID n°.:240)CDR-L3 : QQDIKHPT (SEQ ID n°.:241)Domínios variáveis Ab-23:
Seqüência de aminoácidos de Ab-23 de cadeia levede dominio variável (sem seqüência sinal):DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYSTSRLNSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ DIKHPTFGQGTKVEIK (SEQ ID n°.:364)
Seqüência de DNA de Ab-23 de cadeia leve de domi-nio variável(sem seqüência sinal):
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGTGACCGTGTCACC ATCACTTGCC GCGCAAGTCA GGATATTAGC AGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCTACTTCCCGTT TGAA-TAGTGG GGTCCCATCA CGCTTCAGTG GCAGTGGCTCTGGGACAGAT TTCACTCTCACCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTGCAACTTACTA CTGTCAACAG GATAT-TAAAC ACCCTACGTT CGGTCAAGGCACCAAGGTGG AGATCAAA (SEQ ID n°.:365)
Seqüência de aminoácidos de Ab-23 de cadeia pesadade dominio variável (sem seqüência sinal):EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGFTFT DYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDDTEY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSEDTAVYYCARSIYYYDAPFAYW GQGTLVTVSS (SEQ ID n°.:366)
Seqüência de DNA de Ab-23 de cadeia pesada de do-minio variável(sem seqüência sinal):
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGTTT TACCTTCACC GACTATATTATGCACTGGGTGCGTCAGGCC CCTGGTCAAG GGCTTGAGTG GATGGGCTATATCAACCCTTATAATGATGA CACCGAATAC AACGAGAAGT TCAAGGGCCGTGTCACGATTACCGCGGACA AATCCACGAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCTCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GCGTTCGATTTATTACTACGATGCCCCGTT TGCTTACTGG GGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTCTCTAGT (SEQ IDn°.:367)
Ab-21
Seqüência de aminoácidos de Ab-21 LC incluindopeptideo sinal:
MKSOTOVFVYMLLWLSGVEGDIVMTOSHKFMSTSVGDRVTITCKASODVFTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELKR (SEQ ID NO:315)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-21 LC incluin-do peptideo sinal:
ATGAAGTCACAGACCCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGAA
GGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACGTCAGTAGGAGACAG
GGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTCTTTACTGCTGTAGCCTGGTATCA
ACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACA
CTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCA
TTAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAACAATATAGCAGCT
ATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGTTGGAGCTGAAACGT (SEQ ID n°.:316)
Seqüência de aminoácidos de Ab-21 HC incluindopeptideo sinal:
MGWNWIIFFLMAVVTGVNSEVOLOOSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPENGDIIYDPKFQGKASITTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCAYDAGDPAWFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID n°.:317)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-21 HC incluin-do peptideo sinal:
ATGGGATGGAACTGGATCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGTCAAGTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAATATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGAATGGTGATATTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGTATAACAACAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACGTCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTTACGATGCTGGTGACCCCGCCTGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID n°.:318)
Ab-21 foi humanizado para render Ab-22.
Ab-22
Seqüência de aminoácidos de Ab-22 LC incluindopeptideo sinal:
MDMRVPAOLLGLLLLWLRGARCDI0MT0SPSSLSASVGDRVTITCKAS0DVFTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGGGTKVEIKR (SEQ ID n°.:319)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-22 LC incluin-do peptideo sinal:
ATGGATATGCGCGTGCCGGCGCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGCGCGGCGCGCGCTGCGATATCCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCAAAGCGAGCCAGGATGTGTTTACCGCGGTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATTGGGCGAGCACCCGCCATACCGGCGTGCCGAGTCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTATAGCAGCTATCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGT (SEQID n°.:320)
Seqüência de aminoácidos de Ab-22 HC incluindopeptideo sinal:
MDWTWSILFLVAAPTGAHSEVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPENGDIIYDPKFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAYDAGDPAWFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID n°.:321)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-22 HC incluin-do peptideo sinal:ATGGATTGGACCTGGAGCATTCTGTTTCTGGTGGCGGCGCCGACCGGCGCGCATAGCGAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATTATTATATGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATCGGCCGCATTGATCCGGAAAACGGCGATATTATTTATGATCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGATACCAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGTATGATGCGGGCGATCCGGCGTGGTTTACCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ ID n°.:322)
Seqüência de aminoácidos de cadeia leve de Ab-22de dominio variável (sem seqüência sinal):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVF TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW AST-RHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSSYPLTFGG GTKVEIKR(SEQ ID n°.:336)
Seqüência de DNA de cadeia leve de Ab-22 de domi-nio variável (sem seqüência sinal):
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCAAAGCGAGCCAGGATGTGTTTACCGCGGTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATTGGGCGAGCACCCGCCATACCGGCGTGCCGAGTCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTATAGCAGCT
ATCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGT (SEQ ID n°.:.337)Seqüência de aminoácidos de cadeia pesada Ab-22 dedominio variável (sem seqüência sinal):
EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFNIK DYYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPENGDIIY DPKFQGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDDTAVYYCAYDAGDPAWFTYWG QGTLVTVSS (SEQ ID n°.:338)
Seqüência de DNA de cadeia pesada de Ab-22 de do-minio variável (sem seqüência sinal):GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATTATTATATGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATCGGCCGCATTGATCCGGAAAACGGCGATATTATTTATGATCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGATACCAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGTATGATGCGGGCGATCCGGCGTGGTTTACCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ ID n°.:339).
Para Ab-18, Ab-20, e Ab-22, a constante de regiãode cadeia leve humana kapa é como segue:
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (SEQ ID n° . :325) e a constante gama-4 da região de cadeia pesada humanaé como segue:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK* (SEQ ID n°.326)
A região da articulação contem a mutação Ser-241-Pro para melhorar a estabilidade da articulação (Angal S etal, (1993), Mol Immunol, 30(1), 105-108).Ab-24
As seqüências de Anticorpo 24 (também referido a-qui como Ab-24) LC e HC são como segue:Cadeia leve:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-24 LC:1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT IACKASQSVD YDGTSYMNWY QQKPGQPPKL51 LIYAASNLES EIPARFSGTG SGTDFTLNIH PVEEEDITTY YCQQSNEDPF101 TFGGGTKLEI KRADAAPTVS IFPPSSEQLT SGGASVVCFL NNFYPKDINV151 KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS STLTLTKDEY ERHNSYTCEA201 THKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.:350)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-24 LC:
1 GACATTGTGT TGACCCAGTC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT CTCTAGGGCA
51 GAGGGCCACC ATCGCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT TATGATGGTA
101 CTAGTTATAT GAATTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC
151 CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GAGATCCCAG CCAGGTTTAG
201 TGGCACTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT CCTGTGGAGG
251 AGGAGGATAT CACAACCTAT TACTGTCAGC AAAGTAATGA GGATCCGTTC
301 ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GTTGGAAATA AAACGGGCTG ATGCTGCACC
351 AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA TCTGGAGGTG
401 CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA CATCAATGTC
451 AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC TGAACAGTTG
501 GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC AGCACCCTCA
551 CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC CTGTGAGGCC
601 ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA ACAGGAATGA
651 GTGTTAG (SEQ ID n°.:354)
Seqüência de aminoácidos de Ab-24 LC incluindopeptideo sinal:
1 METDTILLWV LLLWVPGSTG DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT IACKASQSVD51 YDGTSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNLES EIPARFSGTG SGTDFTLNIH101 PVEEEDITTY YCQQSNEDPF TFGGGTKLEI KRADAAPTVS IFPPSSEQLT151 SGGASVVCFL NNFYPKDINV KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS201 STLTLTKDEY ERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ IDn° . :355)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-24 LC incluin-
do a seqüência de codificação do peptideo sinal
1 ATGGAGACAG ACACAATCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG
51 CTCCACTGGT GACATTGTGT TGACCCAGTC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT
101 CTCTAGGGCA GAGGGCCACC ATCGCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT
151 TATGATGGTA CTAGTTATAT GAATTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAGCC
201 ACCCAAACTC CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GAGATCCCAG
251 CCAGGTTTAG TGGCACTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT
301 CCTGTGGAGG AGGAGGATAT CACAACCTAT TACTGTCAGC AAAGTAATGA
351 GGATCCGTTC ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GTTGGAAATA AAACGGGCTG
401 ATGCTGCACC AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA
451 TCTGGAGGTG CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA
501 CATCAATGTC AAGT GGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC
551 TGAACAGTTG GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC
601 AGCACCCTCA CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC
651 CTGTGAGGCC ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA
701 ACAGGAATGA GTGTTAG (SEQ ID n°.:356)
Cadeia pesada Ab-24:
Seqüência de aminoácidos de forma madura (peptideosinal removido) de Ab-24 HC:
1 QVQLQQPGTE LVRPGTSVKL SCKASGYIFT TYWMNWVKQR PGQGLEWIGM
51 IHPSASEERL DQKFKDKATL TLDKSSSTAY MHLSGPTSVD SAVYYCARSG
101 EWGSMDYWGQ GTSVTVSSAK TTPPSVYPLA PGSAAQTNSM VTLGCLVKGY
151 FPEPVTVTWN SGSLSSGVHT FPAVLQSDLY TLSSSVTVPS STWPSETVTC
201 NVAHPASSTK VDKKIVPRDC GCKPCICTVP EVSSVFIFPP KPKDVLTITL
251 TPKVTCVVVD ISKDDPEVQF SWFVDDVEVH TAQTQPREEQ FNSTFRSVSE
301 LPIMHQDWLN GKEFKCRVNS AAFPAPIEKT ISKTKGRPKA PQVYTIPPPK351 EQMAKDKVSL TCMITDFFPE DITVEWQWNG QPAENYKNTQ PIMDTDGSYF401 IYSKLNVQKS NWEAGNTFTC SVLHEGLHNH HTEKSLSHSP GK(SEQ IDn°.-357)
Seqüência de ácidos nucléicos codificando a formamadura (peptideo sinal removido) de Ab-24 HC:
1 CAGGTCCAAC TACAGCAGCC TGGGACTGAG CTGGTGAGGC CTGGAACTTC51 AGTGAAGTTG TCCTGTAAGG CTTCTGGCTA CATCTTCACC ACCTACTGGA101 TGAACTGGGT GAAACAGAGG CCTGGACAAG GCCTTGAGTG GATTGGCATG151 ATTCATCCTT CCGCAAGTGA AATTAGGTTG GATCAGAAAT TCAAGGACAA201 GGCCACATTG ACTCTTGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAT ATGCACCTCA251 GCGGCCCGAC ATCTGTGGAT TCTGCGGTCT ATTACTGTGC AAGATCAGGG301 GAATGGGGGT CTATGGACTA CTGGGGTCAA GGAACCTCAG TCACCGTCTC351 CTCAGCCAAA ACGACACCCC CATCTGTCTA TCCACTGGCC CCTGGATCTG401 CTGCCCAAAC TAACTCCATG GTGACCCTGG GATGCCTGGT CAAGGGCTAT451 TTCCCTGAGC CAGTGACAGT GACCTGGAAC TCTGGATCCC TGTCCAGCGG501 TGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTGCAGTC TGACCTCTAC ACTCTGAGCA551 GCTCAGTGAC TGTCCCCTCC AGCACCTGGC CCAGCGAGAC CGTCACCTGC601 AACGTTGCCC ACCCGGCCAG CAGCACCAAG GTGGACAAGA AAATTGTGCC651 CAGGGATTGT GGTTGTAAGC CTTGCATATG TACAGTCCCA GAAGTATCAT701 CTGTCTTCAT CTTCCCCCCA AAGCCCAAGG ATGTGCTCAC CATTACTCTG751 ACTCCTAAGG TCACGTGTGT TGTGGTAGAC ATCAGCAAGG ATGATCCCGA801 GGTCCAGTTC AGCTGGTTTG TAGATGATGT GGAGGTGCAC ACAGCTCAGA851 CGCAACCCCG GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CTTTCCGCTC. AGTCAGTGAA901 CTTCCCATCA TGCACCAGGA CTGGCTCAAT GGCAAGGAGT TCAAATGCAG951 GGTCAACAGT GCAGCTTTCC CTGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAA1001 CCAAAGGCAG ACCGAAGGCT CCACAGGTGT ACACCATTCC ACCTCCCAAG1051 GAGCAGATGG CCAAGGATAA AGTCAGTCTG ACCTGCATGA TAACAGACTT1101 CTTCCCTGAA GACATTACTG TGGAGTGGCA GTGGAATGGG CAGCCAGCGG1151 AGAACTACAA GAACACTCAG CCCATCATGG ACACAGATGG CTCTTACTTC1201 ATCTACAGCA AGCTCAATGT GCAGAAGAGC AACTGGGAGG CAGGAAATAC12 51 TTTCACCTGC TCTGTGTTAC ATGAGGGCCT GCACAACCAC CATACTGAGA1301 AGAGCCTCTC CCACTCTCCT GGTAAATGA (SEQ ID n°.:361)
Seqüência de aminoácidos de Ab-24 HC incluindopeptideo sinal:
1 MGWSSIILFL VATATGVHSQ VQLQQPGTEL VRPGTSVKLS CKASGYIFTT51 YWMNWVKQRP GQGLEWIGMI HPSASEIRLD QKFKDKATLT LDKSSSTAYM101 HLSGPTSVDS AVYYCARSGE WGSMDYWGQG TSVTVSSAKT TPPSVYPLAP151 GSAAQTNSMV TLGCLVKGYF PEPVTVTWNS GSLSSGVHTF PAVLQSDLYT201 LSSSVTVPSS TWPSETVTCN VAHPASSTKV DKKIVPRDCG CKPCICTVPE251 VSSVFIFPPK PKDVLTITLT PKVTCVVVDI SKDDPEVQFS WFVDDVEVHT301 AQTQPREEQF NSTFRSVSEL PIMHQDWLNG KEFKCRVNSA AFPAPIEKTI351 SKTKGRPKAP QVYTIPPPKE QMAKDKVSLT CMITDFFPED ITVEWQWNGQ401 PAENYKNTQP IMDTDGSYFI YSKLNVQKSN WEAGNTFTCS VLHEGLHNHH451 TEKSLSHSPG K (SEQ ID n°.:362)
Seqüência de ácidos nucléicos de Ab-24 HC incluin-do a seqüência de codificação de peptideo sinal:.
1 ATGGGATGGA GCTCTATCAT CCTCTTCTTG GTAGCAACAG CTACAGGTGT51 CCACTCCCAG GTCCAACTAC AGCAGCCTGG GACTGAGCTG GTGAGGCCTG101 GAACTTCAGT GAAGTTGTCC TGTAAGGCTT CTGGCTACAT CTTCACCACC151 TACTGGATGA ACTGGGTGAA ACAGAGGCCT GGACAAGGCC TTGAGTGGAT2 01 TGGCATGATT CATCCTTCCG CAAGTGAAAT TAGGTTGGAT CAGAAATTCA251 AGGACAAGGC CACATTGACT CTTGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTATATG301 CACCTCAGCG GCCCGACATC TGTGGATTCT GCGGTCTATT ACTGTGCAAG351 ATCAGGGGAA TGGGGGTCTA TGGACTACTG GGGTCAAGGA ACCTCAGTCA4 01 CCGTCTCCTC AGCCAAAACG ACACCCCCAT CTGTCTATCC ACTGGCCCCT451 GGATCTGCTG CCCAAACTAA CTCCATGGTG ACCCTGGGAT GCCTGGTCAA*
501 GGGCTATTTC CCTGAGCCAG TGACAGTGAC CTGGAACTCT GGATCCCTGT
551 CCAGCGGTGT GCACACCTTC CCAGCTGTCC TGCAGTCTGA CCTCTACACT
601 CTGAGCAGCT CAGTGACTGT CCCCTCCAGC ACCTGGCCCA GCGAGACCGT
651 CACCTGCAAC GTTGCCCACC CGGCCAGCAG CACCAAGGTG GACAAGAAAA
701 TTGTGCCCAG GGATTGTGGT TGTAAGCCTT GCATATGTAC AGTCCCAGAA
751 GTATCATCTG TCTTCATCTT CCCCCCAAAG CCCAAGGATG TGCTCACCAT
801 TACTCTGACT CCTAAGGTCA CGTGTGTTGT GGTAGACATC AGCAAGGATG
851 ATCCCGAGGT CCAGTTCAGC TGGTTTGTAG ATGATGTGGA GGTGCACACA
901 GCTCAGACGC AACCCCGGGA GGAGCAGTTC AACAGCACTT TCCGCTCAGT
951 CAGTGAACTT CCCATCATGC ACCAGGACTG GCTCAATGGC AAGGAGTTCA
1001 AATGCAGGGT CAACAGTGCA GCTTTCCCTG CCCCCATCGA GAAAACCATC
1051 TCCAAAACCA AAGGCAGACC GAAGGCTCCA CAGGTGTACA CCATTCCACC
1101 TCCCAAGGAG CAGATGGCCA AGGATAAAGT CAGTCTGACC TGCATGATAA
1151 CAGACTTCTT CCCTGAAGAC ATTACTGTGG AGTGGCAGTG GAATGGGCAG
1201 CCAGCGGAGA ACTACAAGAA CACTCAGCCC ATCATGGACA CAGATGGCTC
1251 TTACTTCATC TACAGCAAGC TCAATGTGCA GAAGAGCAAC TGGGAGGCAG
1301 GAAATACTTT CACCTGCTCT GTGTTACATG AGGGCCTGCA CAACCACCAT
1351 ACTGAGAAGA GCCTCTCCCA CTCTCCTGGT AAATGA (SEQ ID n°.:363)
As seqüências na região variável CDR da cadeia leve de Ab-24 são como segue:
CDR-L1
KASQSVDYDGTSYMN (SEQ ID n°.:351)
CDR-L2 AASNLES (SEQ ID n °.:352)
CDR-L3 QQSNEDPFT (SEQ ID n °.:353)
As seqüências de CDR na região variável da cadeiapesada de Ab-24 são como segue:
CDR-H1: TYWMN (SEQ ID n°.:358)
CDR-H2: MIHPSASEIRLDQKFKD (SEQ ID n°.:359)CDR-H3: SGEWGSMDY (SEQ ID NC-.360)
A tabela 1 abaixo fornece as SEQ ID n° . e seqüên-cias de aminoácidos das CDR's de Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10,Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24. LI, L2, e L3 se re-ferem às CDR's de cadeia leve 1, 2, e 3, e Hl, H2, e H3 sereferem às CDR's de cadeia pesada 1, 2, e 3 de acordo com osistema de numeração de Kabat (Kabat et al, 1987 em Sequen-ces of Proteins of Immunological Interest, U.S. Departmentof Health and Human Services, NIH, EUA).
Tabela 1 <table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 182</column></row><table><table>table see original document page 183</column></row><table>Um oligopeptideo ou polipeptideo está no âmbito deaplicação da invenção se ele tem uma seqüência de aminoáci-dos que é pelo menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%,83%, 84 %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao menos a um de CDR's databela 1 supra, e/ou a uma CDR de um agente de ligação à es-clerostina que bloqueia de modo cruzado a ligação de pelomenos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab -1, Ab-2,Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20,Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24 para esclerostina, e/ou sejabloqueado de modo cruzado de se ligar a esclerostina em pelomenos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2,Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab -18, Ab-19, Ab-20,Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24; e/ou de uma CDR de um agentede ligação à esclerostina onde o agente de ligação pode blo-quear o efeito inibitório da esclerostina Em um ensaio demineralização com base na célula (isto é, um agente de liga-ção que neutraliza a esclerostina) , e/ou a uma CDR de um a-gente de ligação à esclerostina que se liga a uma alça 2 e-pitopo; e/ou de uma CDR de um agente de ligação à escleros-tina que se liga a um epitopo T20.6; e/ou de uma CDR de umagente de ligação à esclerostina que se liga a uma "epitopoderivado T20.6 (nó de cistina + 4 braços)".
Os agentes de ligação à esclerostina polipeptideose anticorpos estão no âmbito da invenção se tiverem seqüên-cias de aminoácidos que são pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%,89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% i-dênticas a uma região variável de pelo menos um dos anticor-pos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5,Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab -13, Ab-14,Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24, e bloquearem de modo cruzado a ligação de pelomenos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2,Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20,Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24 para esclerostina, e/ou sãobloqueados de modo cruzado desde a ligação à esclerostina empelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1,Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-1litro, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, E Ab-24; e/ou podem bloquearo efeito inibitório de esclerostina em um ensaio de minera-lização com base na célula (isto é, um agente de ligação queneutraliza a esclerostina), e/ou ligar para um epitopo devolta 2; e/ou ligar para um epitopo T20.6; e/ou ligar paraum " epitopo T20.6 derivado (nó de cistina + 4 braços)".
A codificação de polinucleotideos de agentes deligação à esclerostina está no âmbito da invenção se tiveremseqüências polinucleotidicas que são pelo menos 85%, 86%,87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%ou 99% idêntica a uma codificação polinucleotidicas uma va-riável região de pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B,Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab -2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8,Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24, e on-de os agentes de ligação de esclerostina codificados blo-queiam de modo cruzado a ligação de pelo menos um dos anti-corpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14,Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24 para esclerostina, e/ou são bloqueados de modocruzado desde a ligação à esclerostina em pelo menos um dosanticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4,Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13,Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24; e/ou podem bloquear o efeito inibitórioda esclerostina em um ensaio de mineralização com base emcélula (ou seja, um agente de ligação que neutraliza a es-clerostina) , e/ou ligar a um epitopo de volta 2; e/ou ligarpara um epitopo T20.6; e/ou ligar para um " epitopo derivadoT20.6 (nó de cistina + 4 braços)".
Anticorpos, de acordo com a invenção pode ter umcaracter de afinidade de ligação para esclerostina humanaigual ou inferior a 1 x 10 ~7 M, inferior ou igual a 1 x 10
8 M, inferior ou igual a 1 x 10 ~9 M, inferior ou igual a 1 x10 "10 M, inferior ou igual a 1 x 10 "u M, ou inferiores ouiguais a Ix 10 ~12 M.
A afinidade de um agente de ligação, como um anti-corpo ou parceiro de ligação, bem como a medida em que umagente de ligação (como um anticorpo) inibe a ligação, podeser determinado por alguém versado na técnica utilizandotécnicas convencionais, por exemplo as mesmas descritas porScatchard et al. (Ann. KY. Acad. Sei. 51:660-672 (1949)) oupela ressonância de plásmons de superfície (SPR; BIAcore,Biosensor, Piscataway, NJ) . Para ressonância de plasmon desuperfície, moléculas alvo são imobilizadas em uma fase só-lida e expostas a ligantes em uma fase móvel correndo juntoa um fluxo de células. Se a ligação do ligante ao alvo imo-bilizado ocorre, o índice de refração local se altera, le-vando a uma mudança no ângulo SPR, que pode ser acompanhadaem tempo real pela deteção de variações na intensidade daluz refletida. As taxas de variação do sinal SPR podem seranalisadas para render as constantes de taxa aparente paraas fases de associação e dissociação da reação de ligação. Aproporção destes valores dá a constante de equilíbrio apa-rente (afinidade) (veja, por exemplo, Wolff et al., CâncerRes. 53:2560-65 (1993)).
Um anticorpo, de acordo com a presente invençãopode pertencer a qualquer classe de imunoglobina, por exem-plo IgG, IgE, IgM, IgD, ou IgA. Ele pode ser obtido a partirde ou proveniente de um animal, por exemplo, aves (por exem-pio, frango) e mamíferos, que inclui mas não se limita a umcamundongo, rato, hamster, coelho, ou de outros roedores,vaca, cavalo, ovelha, cabra, camelo, ser humano, ou de ou-tros primatas. O anticorpo pode ser um anticorpo de interna-lização. A produção de anticorpos é geralmente divulgada naPublicação de Patente US No. 2004/0146888 Al.
Ensaios de Caracterização
Nos métodos descritos acima para gerar anticorpos,de acordo com a invenção, incluindo a manipulação de CDRsespecificas Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, e Anticorpo 1.24 (Ab-1 aAb-24) em novos frameworks e/ou regiões constantes, estãodisponíveis ensaios adequados para selecionar os agentes deligação ou anticorpos desejados (isto é, ensaios para a de-terminação da afinidade de ligação para esclerostina; ensai-os de bloqueio cruzado; "ensaio de ligação de competiçãodede epitopo de peptideo de esclerostina humana" baseado emBiacore; ensaio MC3T3-E1 baseada.na célula; in vivo) .
Ensaio de Ligação ao Epitopo
A esclerostina humana de forma madura é uma glico-proteina de 190 aminoácidos com uma estrutura em nó de cis-tina (Figuras 8 e 9). Para além da estrutura em nó de cisti-na, a proteína é caracterizada como tendo três voltas desig-;, nado volta 1, volta 2 e volta 3. A esclerostina Humana foisubmetida a digestão proteolitica para produzir fragmentos.Resumidamente, utilizando diferentes proteases, incluindotripsina, aspN, e lysC, fragmentos com diversos tamanhos esitios de clivagem foram gerados. As seqüências e massa paravárias peptideos de esclerostina humana foram determinados.
A proteção do anticorpo foi avaliada para determinar o efei-to sobre a acessibilidade para proteólise, incluindo o mas-caramento do sitio retirado e troca de peptideo. Finalmente,um "ensaio de ligação de competiçãode de epitopo de peptideode esclerostina humana" baseado em Biacore foi realizada.
A exposição de esclerostina da clivagem da tripsi-na resultou em um padrão de fragmentos de peptideo como re-sumido na figura 13. Os fragmentos são referidos como T19.2,T20, T20.6, e T21-22. Como demonstrado esquematicamente nafigura 19B, o epitopo T20.6 é um complexo de quatro seqüên-cias de peptideos distintas que estão unidas por três liga-ções dissulfeto na região do nó de cistina. Dois dos pepti-deos são ligados por duas ligações dissulfeto. Os outrosdois peptideos estão ligados por uma ligação dissulfeto que,esquematicamente, divide os dois primeiros polipeptideos.
0 epitopo T20.6 que foi gerado por digestão portripsina mantém a estrutura de nó de cistina do polipeptideonativo e é reconhecido por anticorpos Ab e Ab-C-D. 0 epitopoT20.6 derivado consiste em região de nó de cistina e aminoá-cidos 58-64, 73-81, 112-117 e 138-141 em posição de seqüên-cia com referência à SEQ ID n°.: 1. Este epitopo derivado émostrado na Figura 21. Um epitopo compreendendo a região donó de cistina pode ter um ou mais aminoácidos, que estãopresentes no epitopo T20.6 (Figura 19B) , mas que não estãopresentes na Epitopo derivado T20.6 (Figura 21).
Outra região contendo epitopo foi identificada naregião de volta 2 de esclerostina humana (Figura 19A) e éreconhecida por anticorpos Ab-A, Ab-B. O epitopo de volta 2compreende os aminoácidos 86-111 da SEQ ID n°.: 1(C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5, SEQ ID n°.: 6). Etericamente,com referência à esclerostina de extensão completa da SEQ IDn° . : 1, a estrutura contendo volta 2 é definida em uma ex-tremidade por uma ligação dissulfeto entre a cisteina na po-sição 86 (C4) e a cisteina na posição 144 (C8), e no outroextremo por uma ligação dissulfeto entre cisteina na posição111 (C5) e a cisteina na posição 57 (Cl).
Os peptideos gerados pela clivagem aspN da escle-rostina humana são mostrados na Figura 12. Na figura, essespeptideos são designados como AspN14.6, AspN18.,6, eAspN22.7-23,5, e também são mencionados neste documento comoN14.6, N18.6, N22.7-23,5, respectivamente.
Um grupo de anticorpos específicos exibe um padrãode ligação a certos epitopos como evidenciado por um "ensaiode ligação de competiçãode de epitopo de peptideo de escle-rostina humana" baseado em Biacore. Resumidamente, o anti-corpo é preincubado com o epitopo a ser testado, em concen-trações que vão saturar os sitios de ligação ao epitopo so-bre o anticorpo. O anticorpo é então exposto à esclerostinaligada à superfície de um chip. Após os procedimentos ade-quados de incubação e lavagem, um padrão de competitividadede ligação é estabelecido. Como mostrado na Figura 18, anti-corpos Ab-D exemplares ligados a moléculas de esclerostinaligadas à superfície do chip. A preincubação de anticorpoAb-D com esclerostina diminuiu a ligação do anticorpo à es-clerostina sobre o chip para próximo de zero. A preincubaçãocom um peptideo constituído por epitopo T19.2 mostrou queT19.2 não compete com esclerostina para ligação com anticor-pos. No entanto, a preincubação com qualquer um dos epitoposdesignados T20, T20.6, T21-22, ou N22.7-23,5 aboliu umagrande proporção de ligação do anticorpo à esclerostina nochip. Em contraste, a preincubação do anticorpo com qualquerum dos epitopos designados T19.2, N14.6 ou N18.6 não aboliua capacidade de produção de anticorpos para ligar à escle-rostina. Um segundo anticorpo exemplar com este perfil deligação (Fig. 17) é Ab-C.O anticorpo Ab-D, portanto, é exemplar e represen-tante de um grupo de anticorpos que se ligam aos epitoposT20, T20.6, T21-22, e N22.7-23,5, e têm ligação detectávelminima para epitopos T19,2, N14.6 e N18,6, conforme medidopela capacidade de bloquear a ligação anticorpo à escleros-tina. Os anticorpos que têm esta ligação padrão caracterís-tica podem ou não compartilhar seqüências de aminoácidos deuma ou mais regiões da molécula de anticorpo. A similaridadedo anticorpo é determinada funcionalmente, como pela capaci-dade de se ligar à esclerostina em seguida à preincubaçãocom cada um dos epitopos descritos acima. Os anticorpos queapresentam uma ligação padrão ou idêntica àquela do anticor-po Ab-D estão incluídos na invenção. Por "similar a" se en-tende, por exemplo, que o anticorpo exibrá ligações para ca-da um dos polipeptideos T20, T20.6, T21-22 e N22.7-23, 5 noqual essa ligação competirá especificamente com pelo menos50% das ligações ao anticorpo para esclerostina que, de ou-tra forma, ocorreria na ausência de preincubação com escle-rostina ou um peptideo de esclerostina. O anticorpo tambémapresenta pouca ou nenhuma ligação detectável para polipep-tideos T19,2, N14.6 e N18,6, resultando em uma redução de30% ou menos do que seria ligação ocorrer na ausência de apreincubação com esclerostina ou um peptideo esclerostina.
Por exemplo, sem estar ligado por um mecanismo es-pecial, o padrão de ligação do anticorpo da Figura 18 sugereque o epitopo do espaço a que o anticorpo Ab-D e outros an-ticorpos com o padrão de ligação do epitopo de Ab-D ligarconsiste de um polipeptideo compreendendo a região do nó decistina de esclerostina.
Assim, e como divulgado aqui e com referência àfigura 19B, um epitopo T20.6 exemplar compreende quatro ca-deias peptidicas ligadas através de três ligações dissulfetodistintas. A cadeia peptidica SAKPVTELVC3SGQC4GPAR (SEQ IDn°.: 3) é anexada à cadeia peptidica LVASC7KC8KRLTR (SEQ IDn°.: 5) por ligações dissulfeto de C3 para Cl e, a partir C4a C8. A cadeia peptidica DVSEYSCIRELHFTR (SEQ ID n°.: 2) éanexada à cadeia peptidica WWRPSGPDFRC5IPDRYR (SEQ ID n°.:
4) por uma ligação dissulfeto de Cl a C5. Os polipeptideosde SEQ ID n°.s: 3 e 5 permanecem associados aos polipepti-deos de SEQ ID n°.s: 2 e 4 através de uma construção esféri-ca pelo qual a ligação C1-C5 cruza o plano das ligações C4-C8 e C3-C7 e está localizada entre as mesmas, conforme ilus-trado na Figura 19B.
Como divulgado aqui e com referência à Figura 21,um epitopo exemplar derivado de T20.6 compreende quatro ca-deias peptidicas ligadas através de três ligações dissulfetodistintas. A cadeia peptidica SAKPVTELVC3SGQC4 (SEQ ID n° . :
70) é anexada à cadeia peptidica LVASC7KC8 (SEQ ID n°. : 71)por ligações dissulfeto de C3 a C7 e, a partir C4 a C8. Acadeia peptidica C1RELHFTR (SEQ ID n°.: 72) é anexada à ca-deia peptidica C5IPDRYR (SEQ ID n°.: 73) por uma ligaçãodissulfeto de Cl para C5. Os polipeptideos de SEQ ID n° : 70e 71 permanecem associados aos polipeptideos de SEQ ID n°.s:72 e 73 através de uma construção esférica pelo qual a liga-ção C1-C5 cruza o plano das ligações C4-C8 e C3-C7 e estálocalizado entre as mesmoas, conforme ilustrado na Figura21.
O anticorpo Ab-A é exemplar e representante de umsegundo grupo de anticorpos que têm uma ligação padrão ca-racterística para peptideos de esclerostina humana que édistinta da que obteve para anticorpos Ab e Ab-C-D. Ab-A, eo grupo de anticorpos que representa se liga ao epitopoN22.7-23.5 e têm ligação minima detectavel para epitoposT19.2, T20, T20.6, T21-22, N14.6 ou N18,6, conforme medidopela capacidade de bloquear a ligação anticorpo à escleros-tina (Fig 15). Um segundo anticorpo exemplar com este perfilde ligação (Fig. 16) é Ab-B. Anticorpos ter esta caracterís-tica ligação padrão pode ou não partes seqüência aminoacidi-ca de uma ou mais regiões da molécula do anticorpo. A simi-laridade do anticorpo é determinada funcionalmente, como pe-la capacidade de se ligar à esclerostina em seguida à prein-cubação com cada um dos epitopos descritos acima. Os anti-corpos que apresentam um padrão de ligação similar ou idên-tico àquele do anticorpo Ab-A são incluídos na invenção. Por"similar a" se entende, por exemplo, que o anticorpo irá e-xibir a ligação ao polipeptideo N22.7-23.5 onde essa ligaçãocompetirá especificamente com pelo menos 50% do anticorpo daligação à esclerostina que, de outra forma, ocorre na ausên-cia da preincubação com esclerostina ou um peptideo escle-rostina. O anticorpo também apresenta pouca ou nenhuma liga-ção detectavel para polipeptideos T19.2, T20, T20.6, T21-22,N14.6 e N18.6, resultando em uma redução de 30% ou menos daligação que ocorreria na ausência de preincubação com escle-rostina ou um peptideo esclerostina.Por exemplo, sem estar ligado por um mecanismo es-pecial, a ligação padrão do anticorpo da Figura 15 sugereque o espaço do epitopo a que o anticorpo Ab-A e outros an-ticorpos com a ligação padrão ao epitopo da ligação Ab-Aconsiste de um polipeptideo compreendendo a região da volta2 de esclerostina. Assim, e como divulgado aqui e com refe-rência à figura 19A, a região de volta 2 pode ser descritacomo um peptideo linear, mas adquire uma estrutura terciáriaquando está presente em esclerostina nativa ou uma porção deesclerostina contendo nó de cistina em que a estrutura deligação dissulfeto nativa é mantida. A estrutura linear outerciária da epitopo de volta 2 pode afetar ligação do anti-corpo a mesma, como discutido nos Exemplos. A região de vol-ta 2 pode incluir a seguinte seqüência de aminoácidos:
C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5 (SEQ ID NO: 6). "C4" se referea um residuo cisteina localizado na posição 86 com referên-cia a SEQ ID n° . : 1. "C5" se refere a um residuo cisteinalocalizado na posição 111 com referência à SEQ ID n°.: 1. Emproteina escelrostina nativa, C4 está ligado a uma cisteinana posição 144 (C8) por uma ligação dissulfeto, e C5 estáligado a uma cisteina na posição 57 (Cl) por uma ligaçãodissulfeto. Epitopos derivados da região de volta 2 incluemCGPARLLPNAIGRGKWWRPS (SEQ ID n° . : 63); GPARLLPNAIGRGKWWRPSG
(SEQ ID n°.: 64); PARLLPNAIGRGKWWRPSGP (SEQ ID n° . : 65);ARLLPNAIGRGKWWRPSGPD (SEQ ID n° . : 66); RLLPNAIGRGKWWRPSGPDF
(SEQ ID n°.: 67); LLPNAIGRGKWWRPSGPDFR (SEQ ID n° . : 68); eLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID n°.: 69)
Ensaios de Bloqueio CruzadoOs termos "bloquear cruzado", "bloqueado de modocruzado" e "bloqueio de modo cruzado" são utilizados indife-rentemente aqui para significar a capacidade de um anticorpoou outro agente de ligação de interferir com a ligação deanticorpos ou outros agentes de ligação para esclerostina.
A extensão a qual um anticorpo ou outro agente deligação é capaz de interferir com a ligação de um outro paraesclerostina, e, portanto, pode-se dizer que o mesmo blo-queia de modo cruzado, de acordo com a invenção, pode serdeterminada utilizando a ensaios de competição de ligação.
Um ensaio quantitativo particularmente adequado utiliza ummáquina Biacore que permite medir o grau de interações comtecnologia de ressonância de plasmon de superfície. Outro:, teste quantitativo adequado de bloqueio cruzado utiliza umaabordagem baseada em ELISA para medir a concorrência entreos anticorpos ou outros agentes de ligação em termos da sualigação à esclerostina.
Ensaio de Bloqueio Cruzado Biacore
O seguinte geralmente descreve um ensaio Biacoreadequado para determinar se um anticorpo ou outro agente deligação bloqueia de modo cruzado ou é capaz de bloquear demodo cruzado, de acordo com a invenção. Por conveniência éfeita referência a dois anticorpos, mas será apreciado que oteste pode ser usado com qualquer dos agentes de ligação àesclerostina aqui descritos. A máquina Biacore (por exemplo,Biacore 3000) é operada em conformidade com as recomendaçõesdo fabricante.
Assim, em um ensaio de bloqueio cruzado, a escle-rostina é acoplada a um chip Biacore CM5 utilizando acopla-mento químico amina padrão para gerar uma esclerostina-revestidos superfície. Tipicamente 200-800 unidades de res-sonância de esclerostina seria acoplado à pastilha (um valorque dá facilmente mensuráveis niveis de caracter ligação,mas que é facilmente saturável pelas concentrações do rea-gente de ensaio sendo usado).
Os dois anticorpos (denominados A* e B*), a seremavaliados por sua capacidade de bloquear-se de modo cruzadomutuamente são misturados em uma razão molar um para um desitios de ligação em um tampão adequado para criar a misturateste. Ao calcular a concentração em base no sitio de liga-ção o peso molecular de um anticorpo é considerado como ototal de peso molecular do anticorpo dividido pelo número desitios de ligação à esclerostina naquele anticorpo.
A concentração de cada anticorpo na mistura testedeve ser alta o suficiente para saturar facilmente os sitiosde ligação para aquele anticorpo nas moléculas de escleros-tina capturadas no chip Biacore. Os anticorpos na misturasão na mesma concentração molar (em base na ligação), e quea concentração estaria tipicamente entre 1,00 e 1,5 micromo-lar (em base na ligação local).
Soluções separadas contendo o anticorpo A* sozinhoe o anticorpo B* sozinho também são preparados. O anticorpo A* e o anticorpo B* nestas soluções devem estar no mesmotampão e na mesma concentração como na mistura teste.
A mistura teste é passada ao longo do chip Biacorerevestido com esclerostina e a quantidade total de ligaçõesé registrada. O chip são depois tratados de forma adequadapara remover os anticorpos ligados sem danificar a escleros-tina ligado ao chip. Tipicamente, isto é feito pelo trata-mento do chip com HC1 30 mM por 60 segundos. A solução deanticorpos A* sozinhos é, então, passada ao longo da super-fície revestida com esclerostina e a quantidade de ligação éregistrada. O chip são novamente tratados para remover todosos anticorpos ligados sem danificar a esclerostina ligada aochip.
A solução de anticorpo B* sozinho é, então, passa-da ao longo da superfície revestida com esclerostina e aquantidade de ligações é registrada. A ligação máxima teóri-ca da mistura de anticorpo A* e anticorpo B* é então calcu-lada, e é a soma da ligação de cada anticorpo quando passadosozinho sobre a superfície com esclerostina. Se a ligaçãoreal registrada da mistura é inferior a esse máximo teórico,em seguida, os dois anticorpos são mutuamente bloqueados demodo cruzado.
Assim, em geral, um anticorpo ou outros agente deligação bloqueado de modo cruzado, de acordo com a invençãoé aquele que vai se ligar a esclerostina no referido ensaiode bloqueio cruzado biacore tal que, durante o ensaio e napresença de um segundo anticorpo ou outro agente de ligaçãoda invenção a ligação registrada é de 80% e 0,1% (por exem-pio, 80% para 4%) da ligação máxima teórica, especificamenteentre 75% e 0,1% (por exemplo, 75% para 4%) da ligação máxi-ma teórica, e muito mais especificamente entre 70% e 0,1%(por exemplo, 70% para 4%), da ligação teórica máxima (talcomo acima definido) dos dois anticorpos ou agentes de liga-ção em combinação.
0 ensaio Biacore descrito acima, é um ensaio pri-mário utilizado para determinar se anticorpos ou outros a-gentes de ligação se bloqueiam mutuamente de modo cruzado,de acordo com a invenção. Em raras ocasiões particulares an-ticorpos ou outros agentes de ligação não podem se ligar àesclerostina acoplada através de grupo amina a um chip CM5Biacore (isto geralmente ocorre quando o respectivo sitio deligação sobre esclerostina é mascarado ou destruído pelo a-coplamento ao chip). Nesses casos o bloqueio cruzado podeser determinado utilizando uma versão codificada de escle-rostina, por exemplo esclerostina de terminal N marcada comHis (R & D Systems, Minneapolis, MN, E.U.A.; n° cat 20051406-ST-025) . Neste formato especifico, um anticorpo anti-His seria acoplado ao chip Biacore e, em seguida, a escle-rostina marcada com His seria transmitida ao longo da super-fície do chip e capturado pelos anticorpos anti-His. A aná-lise do bloqueio cruzado seria efetuada essencialmente comodescrito acima, exceto pelo fato de que, após cada volta deregeneração do chip, nova esclerostina marcada com His seriacarregado de volta para a superfície revestida de anticorpoanti-His. Além do exemplo dado usando esclerostina de termi-nal N marcada com His, esclerostina de terminal C marcadacom His poderia ser utilizada como alternativa. Além disso,várias outras combinações de marcadores e proteínas de liga-ção que são conhecidas na técnica poderiam ser usadas parauma tal análise de bloqueio cruzado (por exemplo, marcadorHA com anticorpo anti-HA; marcador FLAG com anti- anticorpoFLAG; marcador biotina com estreptavidina).
Ensaio de Bloqueio Cruzado Baseado em ELISA0 seguinte geralmente descreve um teste ELISA paradeterminar se um anticorpo anti-esclerostina ou outra agentede ligação à esclerostina bloqueia de modo cruzado ou é ca-paz de bloquear de modo cruzado, de acordo com a invenção.Por conveniência, é feita referência a dois anticorpos (Ab-Xe Ab-Y) , mas será apreciado que o teste pode ser usado comqualquer dos agentes de ligação à esclerostina aqui descri-tos .
O principio geral do ensaio é ter um anticorpo an-ti-esclerostina revestido nos poços de uma placa ELISA. Umaquantidade excessiva de um segundo anticorpo anti-esclerostina que bloqueia de modo cruzado potencialmente éadicionada em solução (ou seja, que não esteja ligado à pla-ca ELISA). Uma quantidade limitada de esclerostina é entãoadicionada aos poços. O anticorpo revestido e o anticorpo emsolução competem nesta ligação ao número limitado de molécu-Ias de esclerostina. A placa é lavada para remover a escle-rostina que não tenha sido ligada ao anticorpo revestido etambém para retirar o segundo anticorpo em fase em solução,bem como quaisquer complexos formados entre o segundo anti-corpo em fase em solução e a esclerostina. A quantidade deesclerostina ligada depois é medido através de um reagentede deteção de esclerostina adequado. Um anticorpo em soluçãoque é capaz de bloquear de modo cruzado o anticorpo revesti-do será capaz de provocar uma diminuição do número de molé-cuias de esclerostina que o anticorpo revestido pode ligarem relação ao número de moléculas de esclerostina que o an-ticorpo revestido pode ligar na ausência do segundo anticor-po em fase em solução.
Este ensaio é descrito com mais detalhe mais adi-ante para Ab-X e Ab-Y. No exemplo, quando Ab-X é escolhidopara ser o anticorpo imobilizado, é revestido nos poços daplaca ELISA, depois do que as placas são bloqueadas com umasolução de bloqueio adequada para minimizar a ligação nãoespecifica de reagentes que são posteriormente acrescenta-dos. Uma quantidade excessiva de Ab-Y é então adicionada àplaca ELISA tal que os moles de sitios de ligação de Ab-Y aesclerostina por poço seja pelo menos 10 vezes superior aosmoles de sitios de ligação de Ab-X a esclerostina que foramusados, por poço, durante o revestimento da placa ELISA. Es-clerostina é em seguida adicionada de modo que os moles deesclerostina acrescentados assim sejam pelo menos 25 vezesinferiores aos moles de sitios de ligação de Ab-X a escle-rostina que foram utilizados para o revestimento de cada po-ço. Após um periodo de incubação adequado a placa ELISA élavada e um reagente de deteção de esclerostina é adicionadopara medir a quantidade de esclerostina ligada especifica-mente pelo revestimento anticorpo anti-esclerostina (nestecaso Ab-X). O sinal antecedente para o ensaio é definido co-mo o sinal obtido em poços revestidos com o anticorpo (nestecaso Ab-X), segundo anticorpo em fase em solução (neste casoAb-Y), apenas tampão esclerostina (ou seja, sem esclerosti-na) e reagente de deteção de esclerostina. 0 controle sinalpositivo para o ensaio é definido como o sinal obtido em po-ços revestidos com o anticorpo (neste caso Ab-X), apenastampão de segundo anticorpo em fase se solução (ou seja, ne-nhum segundo anticorpo em fase em solução), esclerostina ereagente de deteção de esclerostina. O teste ELISA deve serexecutado de tal maneira, de modo a ter o controle sinal po-sitivo de pelo menos 6 vezes o sinal antecedente.
Para evitar quaisquer artefatos (por exemplo, afi-nidades significativamente diferentes entre Ab-X e Ab-Y paraesclerostina) resultantes da escolha de qual anticorpos usarcomo o anticorpo de revestimento e qual usar como o segundoanticorpo (competidor), o ensaio de bloqueio cruzado precisaser executado em dois formatos:
1) formato 1 é onde Ab-X é o anticorpo que é re-vestido para a placa ELISA e Ab-Y é o anticorpo competidor,que está em solução e
2) formato 2 é onde Ab-Y é o anticorpo que é re-vestido para a placa ELISA e Ab-X é o anticorpo competidorque está em solução.
Ab-X e Ab-Y são definidos como bloqueadores em mo-do cruzado se, tanto em formato 1 ou em formato 2, o anti-corpo anti-esclerostina na fase em solução é capaz de provo-car uma redução entre 60% e 100 %, especificamente entre 70%e 100%, e mais especificamente entre 80% e 100%, os sinaisde deteção de esclerostina (ou seja, a quantidade de escle-rostina ligada pelos anticorpos revestidos), em comparaçãocom o sinal de deteção de esclerostina obtido na ausência doanticorpo na fase em solução anti-esclerostina (ou seja, ospoços controle positivo).
Um exemplo deste ensaio de bloqueio cruzado basea-do em ELISA pode ser encontrada em Exemplo 7 (" ensaio debloqueio cruzado baseado em ELISA ").
Ensaio de Neutralização com Base na Célula
A mineralização por células em cultura de linhagemde osteoblastos, tanto células primárias como linhagens ce-lulares, é usada como um modelo da formação in. vitro do os-so. A mineralização leva cerca de uma a seis semanas paraocorrer com a indução da diferenciação de células de linha-gem de osteoblastos através de um ou mais agentes de dife-renciação. A seqüência global de eventos envolve a prolife-ração celular, diferenciação, produção de matriz extracelu-lar, a maturação da matriz e finalmente deposição de mine-rais, que se refere à cristalização e/ou deposição de fosfa-to de cálcio. Esta seqüência de eventos que começa com aproliferação celular e diferenciação, e que termina com adeposição de minerais é aqui referida como mineralização. Amedição de cálcio (mineral), é o resultado do ensaio.
Células MC3T3-E1 (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y,Yamamoto S, Kasai S. 1983. In vitro differentiation and cal-ei fication in a new clonal osteogenic cell line derivedfi'om newborn mouse calvaria. J. Cell Biol. 96:191-198) Esubclones da linhagem celular original pode formar mineraisna cultura em crescimento na presença de agentes diferencia-dores. Tais subclones incluem MC3T3-E1-BF (Smith E, RedmanR, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocor-ticoids inhibit deveiopmental stage-specific osteoblast cellcycle. J. Biol. Chem. 275:19992-20001). Para ambos os sub-clones MC3T3-E1-BF, bem como as células originais MC3T3-E1,a esclerostina pode inibir uma ou mais das seqüências de a-contecimentos que levam à deposição de minerais, inclusive aprópria (ou seja, a esclerostina inibe mineralização) . Anti-corpos anti-esclerostina que são capazes de neutralizar aatividade inibitória esclerostina permitir a mineralizaçãoda cultura na presença de esclerostina tal, que não há umaumento estatisticamente significativo na deposição de fos-fato de cálcio (medido como cálcio) , em comparação com aquantidade de cálcio medido na grupo de tratamento de apenasesclerostina (ou seja, nenhum anticorpo). Os anticorpos uti-lizados nas experiências do ensaio de mineralização com basena célula mostradas nas Figuras 22, 23 e 24 têm um peso mo-lecular de cerca de 145 kD e têm 2 esclerostina sitios deligação por molécula de anticorpo.
Ao executar o teste, com o objetivo de determinarse um determinado anticorpo anti-esclerostina ou agente deligação anti-esclerostina pode neutralizar a esclerostina(ou seja, é um anticorpo ou derivado do mesmo que neutralizaa esclerostina, ou é um agente de ligação que neutraliza aesclerostina), a quantidade de esclerostina utilizada no en-saio deve. ser o valor minimo de esclerostina que provoca pe-lo menos um 70%, estatisticamente significativamente, a re-dução da deposição de fosfato de cálcio (medido como cálcio)no grupo de apenas esclerostina, em comparação com a quanti-dade de cálcio deve ser medido no grupo sem esclerostina. Umanticorpo neutralizador anti-esclerostina ou um agente deligação neutralizador anti-esclerostina é definido como a-quele que provoca um aumento estatisticamente significativona deposição de fosfato de cálcio (medido como cálcio), emcomparação com a quantidade de cálcio medido no grupo detratamento com apenas esclerostina (ou seja, sem anticorpo,sem agente de ligação). Para determinar se um anticorpo an-ti-esclerostina ou um anti-agente de ligação à esclerostinaé neutralizado ou não, a quantidade do direito anticorpo an-ti-esclerostina ou anti-agente de ligação à esclerostina u-tilizado no ensaio deve ser tal que exista um excesso de mo-les de sitios de ligação esclerostina por poço, em compara-ção com o número de moles de esclerostina por poço. Depen-dendo da potência do anticorpo, o excesso que pode ser exi-gido podem ser de 24, 18, 12, 6, 3 ou 1,5 vezes, e alguémversado na técnica está familiarizado com a rotina práticados testes mais de uma concentração de agente de ligação.Por exemplo, uma anticorpo anti-esclerostina muito potenteneutralizador ou agente de ligação neutralizador anti-esclerostina será capaz de neutralizar a esclerostina mesmoquando há um excesso de menos de 6 vezes aos moles de sitiosde ligação de esclerostina por poço, em comparação com o nú-mero de moles de esclerostina por poço. 0 anticorpo neutra-lizador anti-esclerostina ou agente de ligação neutralizadoranti-esclerostina menos potente será capaz de neutralizar aesclerostina apenas a um excesso de 12, 18 ou 24 vezes. Osagentes de ligação à esclerostina dentro desta extensa vari-edade de potência são apropriados como agentes de ligaçãoneutralizadores de esclerostina. Os ensaios de mineralizaçãocom base na célula exemplares são descritos em detalhes noExemplo 8.
Os anticorpos anti-esclerostina e seus derivadosque podem neutralizar a esclerostina humana, e agentes deligação à esclerostina que pode neutralizar a esclerostinahumana podem ser de uso no tratamento de condições huma-nas/patologias que são causadas por, associadas, ou resul-tantes de pelo menos uma de baixa formação óssea, baixa den-sidade mineral óssea, baixo conteúdo mineral ósseo, baixamassa óssea, baixa qualidade óssea e baixa força óssea.
Ensaio de Neutralização in vivo
Os aumentos em diversos parâmetros relacionadoscom, ou resultanetes de, a estimulação da nova formação ós-sea podem ser medidos como uma saida para o ensaio in vivode agentes de ligação à esclerostina, a fim de identificaros agentes de ligação que são capazes de neutralizar a es-clerostina e, portanto, capazes de causar estimulação da no-va formação óssea. Esses parâmetros incluem diversos marca-dores marcadores séricos anabólicos [por exemplo, osteocal-cina, P1NP (propeptideo de terminal N de procolágeno tipo1)], marcadores histomorfométricos da formação óssea (porexemplo, superfície de osteoblastos/superficie óssea; taxade formação óssea/superficie óssea; espessura da trabécula),a densidade mineral óssea, conteúdo mineral ósseo, massa ós-sea, qualidade óssea e força óssea. Um agente de ligaçãoneutralizador de esclerostina é definido como um agente ca-paz de causar um aumento estatisticamente significativo, emcomparação com animais tratados com veiculo, em qualquer pa-râmetro associado, ou que resulta de, a estimulação da novaformação óssea. Tal ensaio in vivo pode ser realizado emqualquer mamífero apropriado (por exemplo, camundongo, rato,macaco) . Um exemplo de tal ensaio in vivo pode ser encontra-do no Exemplo 5 ("Teste in vivo de anticorpos anti-esclerostina monoclonais").
Embora a seqüência de aminoácidos de esclerostinanão é 100% idêntica em todas as espécies de mamíferos (porexemplo, a esclerostina de rato não é 100% idêntica à escle-rostina humana), será apreciado por alguém versado na técni-ca que um agente de ligação à esclerostina que pode neutra-lizar, in vivo, sendo a esclerostina de uma determinada es-pécie (por exemplo, rato) e que também pode ligar escleros-tina humana, in vitro é muito provável que seja capaz deneutralizar a esclerostina humana in vivo. Assim, tal agentede ligação à esclerostina humana (por exemplo, anticorposanti-esclerostina humana) pode ser de grande utilidade notratamento de condições humanas/patologias que são causadospor, associados a, ou resultantes de, em pelo menos um debaixa formação óssea, baixa densidade óssea mineral, baixoconteúdo mineral ósseo, baixa massa óssea, baixa qualidadeóssea e baixa força óssea. Os camundongos nos quais a recom-binação homóloga tenha sido utilizada para apagar os genesde esclerostina de camundongo e inserir os genes de escle-rostina humana em seu lugar (ou seja, genes knock-in de ca-mundongos de esclerostina humana ou knock-in de camundongosde SOST humano) seria um exemplo de um adicional no sistemain vivo.As composições farmacêuticas são fornecidas, com-preendendo um dos agentes de ligação acima descritos como apelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, D-Ab e Ab-1 aAb-24 para esclerostina humana, juntamente com um veiculo,excipiente, ou solvente farmaceuticamente ou fisiologicamen-te aceitável. As composições farmacêuticas e os métodos detratamento são divulgadas no Pedido de Patente Compêndio N°de série 10/868.497, apresentado em 16 de junho de 2004, queafirma a prioridade N° de série 60/478977, que são incorpo-rados por referência neste documento.
O desenvolvimento adequado de regimes de adminis-tração e de tratamento utilizando as composições especiaisaqui descritos em uma grande variedade de regimes de trata-mento, incluindo por exemplo, por via subcutânea, por viaoral, parentérica, via intravenosa, via intranasal, e a ad-ministração intramuscular e formulação, é bem conhecido natécnica, algumas das quais são brevemente discutidas abaixopara fins gerais de ilustração.
Em certas aplicações, as composições farmacêuticasdivulgadas neste documento poderão ser entregues através daadministração oral de um animal. Como tal, estas composiçõespodem ser formuladas com um diluente inerte ou com um veicu-lo assimilável comestível, ou eles podem ser incluídos emcápsulas de gelatina duras ou macias, ou eles podem ser com-pactados em comprimidos, ou eles podem ser inseridos direta-mente com o alimento da dieta.
Em determinadas circunstâncias, será desejável quea distribuição das composições farmacêuticas divulgadas aquipor via subcutânea, parenteral, via endovenosa, intramuscu-lar, ou mesmo intraperitoneal. Essas abordagens são bem co-nhecidos pelo técnico versado, algumas das quais são aindadescritos, por exemplo, em Patente US n° 5543158; Patente USn° 5641515 e Patente US n° 5399363. Em certas modalidades,soluções de compostos ativos como bases livres ou sais far-macologicamente aceitáveis podem ser preparados em água de-vidamente misturados com um tensoativo, como hidroxipropil-celulose. Também podem ser preparadas dispersões em glice-rol, polietileno glicóis líquidos, e misturas, e em óleos.Sob condições normais de armazenagem e de utilização, estespreparativos irão geralmente conter conservantes para evitaro crescimento de microorganismos.
Formas farmacêuticas ilustrativas adequadas parauso injectável estéril incluem soluções aquosas ou disper-sões e pó estéril para a preparação de soluções ou disper-sões injetáveis extemporâneas estéreis (por exemplo, vejaPatente US n° 5.466.468). Em todos os casos, a forma deveser estéril e devem ser fluida, na medida em que exista fá-cil seringabilidade. Devem ser estáveis nas condições de fa-brico e de armazenamento e devem ser preservadas contra aação contaminadora de microorganismos, como bactérias e fun-gos. O veiculo pode ser um solvente ou dispersão média con-tendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, gli-cerol, propileno glicol, liquido e polietileno-glicol, e ou-tras), misturas adequadas, e/ou óleos vegetais. A fluidezprópria pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de umrevestimento, tal como a lecitina, pela manutenção do tama-nho das partículas exigida no caso de dispersão e/ou atravésda utilização de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos podem ser facilitadas por diversos agentes anti-bacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobu-tanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e similares. Em mui-tos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, porexemplo, açúcares ou de cloreto de sódio. A absorção prolon-gada das composições injetáveis podem ser provocadas pelautilização nas composições de agentes que retardam a absor-ção, por exemplo, o monostearato de alumínio e gelatina.
Em uma modalidade, para administração parentéricaem uma solução aquosa, a solução deve ser adequadamente tam-ponada se necessário e o líquido diluente primeiro prestadoscom suficiente isotónica salina ou glicose. Estas soluçõesaquosas em particular são especialmente indicadas para admi-nistração endovenosa, intramuscular, subcutânea e intraperi-tonial. Neste contexto, um meio aquoso estéril que pode serempregado será conhecido por aqueles versados na técnica, àluz da presente divulgação. Por exemplo, uma dose pode serdissolvida em 1 mL de solução isotônico de NaCl que seja a-dicionada a 1000 mL de fluido de hipodermoclise ou injetadano proposto sítio de infusão, (veja, por exemplo, Reming-ton's Pharmaceutical Sciences, 15a edição., Págs. 1035-1038e 1570-1580) . Algumas variações na dosagem ocorrerão neces-sariamente, dependendo da condição do indivíduo a ser trata-do. Além disso, para administração humana, a preparação seránaturalmente preferida por satisfazer esterilidade, piroge-nicidade, e como normas gerais de segurança e pureza comoexigido pelas normas do Escritório de Biologia da FDA.
Em outra modalidade da invenção, como composiçõesdivulgadas neste documento poderão ser formulados de formaneutra ou sal. Sais ilustrativos farmaceuticamente aceitá-veis incluem os sais de adição ácida (formados com gruposamino livres das proteínas) e que são formados com ácidosinorgânicos como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfóri-co, ou ácidos orgânicos, tais como acético, oxálico, tartá-rico, mandélico, e similares. Sais formados com grupos car- boxila livres também podem ser obtidos a partir de bases i-norgânicas como, por exemplo, de sódio, potássio, amônio,cálcio, ferro ou hidróxidos, e bases orgânicas tais como i-sopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e simila-res. Após a formulação, as soluções serão administradas deforma compatível com a dosagem na formulação e em tal quan-tidade é terapeuticamente eficaz.
Os veículos podem ainda incluir todos e quaisquersolventes, meio de dispersão, veículos, corantes, solventes,antibacterianos e agentes antifúngicos, isotônicos e agentesde retardo de absorção, tampões, soluções veículo, suspen-sões, colóides, e similares. A utilização de tais meios eagentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conheci-do na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio conven-cional ou agente é incompatível com o ingrediente ativo, asua utilização na terapêutica composições é contemplada. In-gredientes ativos suplementares também podem ser incorpora-dos nas composições. A expressão "farmaceuticamente aceitá-vel" se refere a entidades moleculares e composições que nãoproduzem uma reação alérgica ou similar nociva quando admi-nistradas a um humano.
Em certas modalidades, lipossomas, nanocápsulas,microparticulas, partículas lipidicas, vesiculas, e seme-lhantes, são utilizados para a introdução das composições dapresente invenção em células/organismos hospedeiros adequa-dos. Em particular, as composições da presente invenção po-dem ser formuladas para distribuição tanto encapsuladas emuma partícula lipidica, um lipossoma, uma vesicula, uma na-noesfera, ou um nanoparticula ou similar. Alternativamente,as composições da presente invenção podem ser ligadas, tantocovalentemente ou não-covalentemente, para a superfície detais veículos carreadores.
A formação e utilização de lipossomas e prepara-ções similares aos lipossomas como portadores potenciais defármacos é geralmente conhecida por aqueles versados na téc-nica (veja, por exemplo, Lasic, Trends Biotechnol. 16 (7):307-21, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56 (3): 69 1 de-95,1998; Chandran et al., Indian J. Exp, Biol. 35 (8): 801-09,1997; Margalit, Crit. Rev. There. Drug Carrier Syst. 12 (2-3) :233-61, 1995; Patente US n° 5567434; Patente US n°5552157; Patente US n° 5565213; Patente US n° 5738868 e Pa-tente US n° 5795587, cada especificamente incorporada nestedocumento por referência na sua totalidade). O uso de lipos-somas não parece estar associado a respostas autoimunes outoxicidade inaceitável após distribuição sistêmica. Em cer-tas modalidades, os lipossomas são formados a partir de fos-folipidos que se encontram dispersos em meio aquoso e formamespontaneamente vesículas de bicamadas multilamelares con-cêntricas (também denominadas vesículas multilamelares(MLVs)).
Alternativamente, em outras modalidades, a inven-ção prevê formulações em nanocápsulas farmaceuticamente a-ceitáveis das composições da presente invenção. As nanocáp-sulas podem geralmente aprisionar compostos de uma forma es-tável e reprodutível (veja, por exemplo, Quintanar-Guerreroet al., DrugDev. Ind. Pharm. 24 (12): 1113-28, 1998). Paraevitar efeitos colaterais devido à sobrecarga intracelularpolimérica, tais partículas ultrafinas (tamanho em torno de0,1 um), podem ser projetados usando polímeros capazes deser degradados in vivo. Tais partículas podem ser feitasconforme descrito, por exemplo, e Al Couvreur., Crit. Rev.There. Drug Carrier Syst. 5 (1): 1-20, 1988; zur Muhlen etal., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45 (2): 149 - 55, 1998; Zam-baux et al., J. Controlled Release 50 (1-3) :31-40, 1998; ePatente US n° 5145684.
Além disso, as composições farmacêuticas da pre-sente invenção podem ser colocadas dentro de contentores,juntamente com embalagens que fornecem instruções relativasà utilização de tais composições farmacêuticas. Geralmente,essas instruções incluem uma expressão tangível descrevendoa concentração do reagente, bem como em certas modalidades,quantidades relativas de ingredientes excipientes ou solven-tes (por exemplo, água, solução salina ou PBS), que podemser necessários para reconstituir a composição farmacêutica.
A dose administrada pode variar entre 0,01 mg/kg e100 mg/kg de peso corporal. Como será evidente para alguémversado na técnica na técnica, a quantidade e a freqüênciada administração dependerá, naturalmente, de fatores como anatureza e a gravidade da indicação a ser tratada, a respos-ta desejada, a condição do paciente e, dai por diante. Tipi-camente, as composições podem ser administradas por uma va-riedade de técnicas, conforme citado acima.
Os aumentos no conteúdo mineral ósseo e/ou na den-sidade mineral óssea podem ser determinado diretamente atra-vés do uso de raios-X (por exemplo, Absortometria de raios Xde energia dupla ou "DEXA"), ou por inferência através damedição de 1) marcadores da formação óssea e/ou atividade deosteoblastos, tais como, mas não limitado a, fosfatase alca-lina osteoblasto especifica, osteocalcina, propeptideo Cprocolágeno tipo 1 (PICP), fosfatase alcalina total (vejaCornier, Curr. Opin. in Rheu. 7:243(1995)) propeptideo determinal N de procolágeno 1 sérico (P1NP) e/ou 2) marcadoresda reabsorção óssea e/ou da atividade osteoclástica, inclu-indo, mas não limitado a, piridinolina, deoxipriridinolina,N-telopeptideo, hidroxiprolina urinaria, fosfatase ácida re-sistente a tartarato plasmática, e galactosil hidroxilisina;(veja Cornier, id) , TRAP 5b sérica (fosfatase ácida resis-tente a tartarato isoforma 5b) e C-telopeptideo reticuladosérico (sCTXI). A quantidade de massa óssea podem também sercalculada a partir do peso corporal ou através de outros mé-todos (veja Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res.5:177-181, 1984). Animais e modelos animais particulares sãoutilizados na técnica para testar o efeito das composições edos métodos da invenção, por exemplo, parâmetros de perdaóssea, reabsorção óssea, formação óssea, força óssea ou mi-neralização óssea que imitam condições de doenças humanas,como a osteoporose e osteopenias. Exemplos de tais modelosincluem o modelo rato esterectomizado (Kalu, D.N., The ova-riectomized rat model of postmenopausal bone loss. Bone andMineral 15:175-192 (1991); Frost, H.M. e Jee, W.S.S. On therat model of human osteopenias and osteoporosis. Bone andMineral 18:227-236 (1992); e Jee, W.S.S. e Yao, W., Over-view: animal models of osteopenia and osteoporosis. J. Mus-culoskel. Neuron. Interact. 1:193-207 (2001)).
As condições particulares que podem ser tratadospelas composições da presente invenção incluem displasias,onde o crescimento e desenvolvimento de ossos é anormal euma grande variedade de causas de osteopenia, osteoporose eperda óssea. Exemplos representativos de tais condições in-cluem acondroplasia, disostose cleidocranial, encondromato-se, displasia fibrosa, doença de Gaucher, hipofosfatêmicarickets, sindrome de Marfan, múltiplas hereditárias exoto-ses, neurofibromatose, osteogênese imperfeita, osteopetrose,osteopoiquilose, lesões escleróticas, pseudoartrose, e oste-omielite piogênica, doença periodonto, perda óssea induzidapor fármacos anti-epilépticos, hiperparatiroidismo secundá-rio e primário, sindromes de hiperparatiroidismo familiar,perda óssea induzida por peso, osteoporose em homens, perdaóssea pós-menopausa, osteoartrite, osteodistrofia renal,distúrbios infiltrativos do osso, perda óssea oral, osteone-crose das maxilas, doença de Paget juvenil A, melorreostose,doenças ósseas metabólicas, mastocitose, anemia/doença dacélula falciforme, perda óssea relacionada com transplantesde órgãos, perda óssea relacionada a transplante renal, lú-pus eritematoso sistêmico, espondilite anquilosante, epilep-sia, artritide juvenil, talassemia, mucopolissacaridoses,doença de Fabry, sindrome de Turner, sindrome de Down, sin-drome de Klinefelter, hanseniase, doença de Perthes, escoli-ose idiopática adolescente, doença inflamatória multi-sistêmica de inicio infantil, Sindrome de Winchester, doençade Menkes, doença de Wilson's, doença isqüêmica óssea (talcomo doença de Legg-Calve-Perthes, osteoporose regional mi-gratória) , estados anêmicos, condições causadas por esterói-des, perda óssea induzida por glicocorticóides, perda ósseainduzida por heparina, distúrbios da medula óssea, escorbu-to, desnutrição, deficiência de cálcio, osteopenia ou osteo-porose idiopática, osteopenia ou osteoporose congênitas, al-coolismo, doença hepática crônica, estado pós-menopausa,condições inflamatórias crônicas, artrite reumatóide, doençainflamatória intestinal, colite ulcerativa, colite inflama-tória, Doença de Crohn, oligomenoréia, amenorréia, gravidez,pacientes com diabetes mellitus, hipertireoidismo, distúr-bios da tiróide, distúrbios da paratiróide, sindrome de Cu-shing, acromegalia, hipogonadotrófico, imobilização ou desu-so, sindrome da distrofia simpática reflexa, osteoporose re-gional, osteomalácia, perda óssea associada com substituiçãoconjunta, perda óssea associada ao HIV, perda óssea associa-da com perda de hormônio de crescimento, perda óssea associ-ada com fibrose cistica, displasia fibrosa, perda óssea as-sociada a quimioterapia, perda óssea induzido por tumor,perda óssea relacionada com o câncer, perda óssea hormônioablativo, mieloma múltiplo, perda óssea induzida por fárma-co, Anorexia nervosa, perda óssea associada a doenças faci-ais, perda óssea associada a doença craniana, perda ósseaassociada a doença do maxilar, perda óssea associada a doen-ça do crânio, e perda óssea associada a viagens espaciais.Outras condições dizem respeito à perda óssea associada comenvelhecimento, incluindo perda óssea facial associada comenvelhecimento, perda óssea craniana associada ao envelheci-mento, perda óssea maxilar associada com envelhecimento, eperda óssea do crânio associada com envelhecimento.
As composições da presente invenção também podemser úteis para melhorar os resultados em procedimentos orto-pédicos, procedimentos dentários, cirurgia de implante,substituição de articulações, enxerto ósseo, cirurgia plás-tica óssea e reparação óssea, tais como cura de fraturas,cura não consolidada, cura de consolidação atrasada e re-construção facial. Uma ou mais composições podem ser admi-nistradas antes, durante e/ou após o processo de substitui-ção, enxerto, cirurgia ou reparação.
A invenção também fornece um kit de diagnósticoque inclui pelo menos um agente de ligação anti-esclerostina, de acordo com a presente invenção. Um agentede ligação pode ser um anticorpo. Além disso, esse um kitpode opcionalmente incluir um ou mais dos seguintes:
(1) instruções para o uso de um ou mais agentes deligação para rastreio, diagnóstico, prognóstico, acompanha-mento terapêutico ou qualquer combinação destas aplicações;
(2) parceiro de ligação marcado para o agente a-glutinante anti-esclerostina;
(3) uma fase sólida (como uma tira reagente) naqual os agente (s) de ligação anti-esclerostina é imobiliza-do; e
(4) um rótulo ou insersão indicando aprovação re-gulamentar para rastreio, diagnóstico, prognóstico ou usoterapêutico ou qualquer combinação dos mesmos.
Se não são fornecidos marcadores como parceiros deligação para o agente de ligação, o agente de ligação em sipode ser identificado com um ou mais de um marcador detectá-vel, por exemplo, uma fração quimioluminescente, enzimática,fluorescente, ou radioativa.
Os seguintes exemplos são oferecidos a titulo deilustração, e não por meio de limitação.
Exemplos
Exemplo 1
Expressão Recombinante de Esclerostina
A esclerostina humana recombinante/SOST está dis-ponível comercialmente a partir de R & D Systems (Minneapo-lis, MN, E.U.A.; 2006 n° cat. 14 06-ST-025) . Além disso, es-clerostina recombinante de rato /SOST está disponível comer-cialmente a partir de R & D Systems (Minneapolis, MN,E.U.A.; 2006 n° cat. 1589-ST-025).
Em alternativa, como espécies diferentes de escle-rostina podem ser expressaa transitoriamente em células emsuspensão adaptada 293T ou 293EBNA livres de soro. As trans-feções podem ser executadas como culturas de 500 mL ou 1L.Os seguintes reagentes e materiais estão disponíveis a par-tir Gibco BRL (agora Invitrogen, Carlsbad, CA) . Os númerosde catálogo são listados entre parênteses: DMEM livre de so-ro (21068-028); DMEM/F12 (3:1) (21068/11765); Complemento IXInsulino-Transferina-Selênio (51500-056) ; IX Pen Strep Glut(10378 -016); 1-Glutamina 2mM (25030-081), HEPES 20 mM(15630-080); Pluronic F68 0,01% (24040-032). Resumidamente,a célula inóculo (5,0-10,0 X IO"5 células/mL volumes X cul-tura) é centrifugadas a 2500 RPM por 10 minutos em 4 °C pararemover o meio concentrado.
As células são ressuspensas no DMEM livre de soroe centrifugadas novamente em 2500 RPM por 10 minutos em 4°C. Após aspirar solução de lavagem, as células são ressus-pensas em meio de crescimento [DMEM/F12 (3:1) + ComplementoIX Insulino-Transferina-Selênio + IX Pen Strep Glut + 2mM L-Glutamina + 20 mM HEPES + 0,01% Pluronic F68] em balão decultura de fundo redondo de 1L ou 3L. O balão de cultura defundo redondo é mantido em placa de agitação magnética a 125RPM, que é colocado em uma incubadora umidificada mantida a37 °C e CO2 5%. O plasmideo de expressão mamífero UJNA (porexemplo, pcDNA3.1, pCEP4, Invitrogen Life Technologies, Car-lsbad, CA), contendo a região de codificação completa (e có-don de finalização) de esclerostina com uma seqüência Kozakconsensual (por exemplo, CCACC) diretamente 5' do inicio dositio ATG, é complexado ao reagente transfeção em um tubocônico de 50 mL.
O complexo reagente de transfeção-DNA pode serpreparado em 5-10% do volume em cultura final DMEM livre desoro ou OPTI-MEM. Os reagentes de transfeção que possam serutilizados para esse fim incluem X-tremeGene RO-1539 (RocheApplied Science, Indianapolis, IN) , FuGene 6 (Roche AppliedScience, Indianapolis, IN), Lipofectamine 2000 (Invitrogen,Carlsbad, CA) e 293fectin (Invitrogen, Carlsbad, CA) . 1-5 ugde cultura plasmideo DNA/mL é primeiramente adicionada aoDMEM livre de soro, seguido por 1-5 uL de reagente de trans-feção/mL de cultura. Os complexos podem ser incubados emtemperatura ambiente durante cerca de 10-30 minutos e, emseguida, adicionados às células do balão de fundo redondo. Atransfeção/expressão pode ser executada por 4-7 dias, após oqual o meio condicionado (CM) é colhido por centrifugação a4000 RPM por 60 minutos a 4 °C
Exemplo 2
Purificação de Esclerostina Recombinanteesclerostina recombinante foi purificado de célu-las hospedeiras mamíferas do seguinte modo. Todos os proces-sos de purificação foram realizadas em temperatura ambiente.
Um esquema de purificação foi utilizado para purificar vá-rias espécies de esclerostina, incluindo esclerostina murinae humano. O esquema de purificação utilizou cromatografia deafinidade seguida por cromatografia de troca catiônica.
Cromatografia com Heparina
O meio condicionado de célula hospedeira mamífera(CM) , foi centrifugadas em uma centrifuga Beckman J6-M1 a4000 rpm durante 1 hora a 4 °C para remover detritos celula-res. O CM sobrenadante foi então filtrado através de um fil-tro estéril 0,2 um. (Neste ponto o CM filtrado estéril podeser opcionalmente armazenado congelado até a purificação.)Se o CM foi congelado, foi descongelado, nas seguintes tem-peraturas, ou na combinação destas: 4 °C, temperatura ambi-ente ou água morna. Após o descongelamento, o CM foi filtra-do através de um filtro estéril 0,2 um e opcionalmente con-centrado por ultrafiltração de fluxo tangencial (TFF), uti-lizando uma membrana de retirada de peso molecular 10 kD. OCM concentrado foi filtrado através de um filtro estéril 0,2um e, em seguida, carregado em uma coluna de Heparina de Al-to Desempenho (Heparin HP) (GE Healthcare, antiga AmershamBiosciences) equilibrada em PBS. Alternativamente, o filtra-do sobrenadante CM pode ser carregado diretamente na colunaHeparin HP equilibrada em PBS.
Após o carregamento, a coluna Heparina HP foi la-vada com PBS até a absorbância a 280 nm da linha de base re-tornada através do fluxo (ou seja, absorbância medida antesdo carregamento de sobrenadante CM). A esclerostina foi en-tão eluida da coluna usando um gradiente linear de 150 mM decloreto de sódio 2M em PBS. A absorbância a 280 nm do eluidofoi monitorada e frações contendo proteínas foram recolhi-das. As frações foram então medidas por SDS-PAGE marcado comCoomassie para identificar frações contendo um polipeptideoque migra no tamanho de esclerostina glicosilada. As fraçõesadequadas da coluna foram combinadas para fazer o conjuntoHeparina HP.
Cromatografia de Troca Catiônica
A esclerostina eluida da coluna Heparina HP foiainda purificada por cromatografia de troca catiônica utili-zando meio de cromatografia SP de Alto Desempenho (SPHP) (GEHealthcare, antiga Amersham Biosciences). O conjunto Hepari-na HP foi trocado em tampão PBS por diálise usando membranas10000 MWCO (Pierce Slide-A-Lyzer). O conjunto Heparina HPdializado foi então colocado em uma coluna SPHP equilibradaem PBS. Após o carregamento, a coluna foi lavada com PBS atéa absorbância a 280 nra da linha de base retornada através dofluxo. A esclerostina foi então eluida da coluna SPHP usandoum gradiente linear de 150 mM de cloreto de sódio a 1 M emPBS. A absorbância a 280 nm do eluido foi monitorada e a es-clerostina eluida foi recolhida em frações. As frações foramentão medidas por SDS-PAGE marcado com Coomassie para iden-tificar frações contendo um polipeptideo que migra no tama-nho de esclerostina glicosilada. As frações adequadas da co-luna foram combinadas para fazer o Conjunto SPHP.
Formulação
Após a purificação, o Conjunto SPHP foi formuladoem PBS por diálise usando membranas 10000 MWCO (Pierce Sli-de-A-Lyzer). Se a concentração de esclerostina foi necessá-ria, um dispositivo centrifuga (Amicon Centricon ou Centri-prep), com uma membrana 10000 MWCO foi utilizado. Após aformulação a esclerostina foi filtrada através de um filtroestéril 0,2 um e armazenada a 4 °C ou congelada.
Exemplo 3
ELISA de Ligação a Peptideo
Uma série de peptideos sobrepostos (cada um pepti-deo tendo aproximadamente 20-25 aminoácidos), foram sinteti-zados baseado na conhecida seqüência de aminoácidos de es-clerostina de rato (SEQ ID n°.: 98). Os peptideos foram pro-jetados de modo a que todos eles continham um resíduo ciste-ina reduzido; mais uma cisteina foi incluída no terminal Cde cada um peptideo que ainda não a continha um em sua se-qüência. Isto permitiu que os peptideos fossem ligados aoensaio as placas por covalentes acoplamento, utilizando pla-cas de ligação sulfidrila comercialmente disponíveis (Cos-tar), em uma concentração de 1 ug/mL, em solução salina tam-ponada com fosfato (PBS: pH 6,5) contendo EDTA 1 mM. Apósincubação durante 1 hora à temperatura ambiente, as placasforam lavadas três vezes com PBS contendo Tween 20 0,5%. Asplacas foram bloqueadas por incubação com uma solução de PBScontendo gelatina de pele de peixe 0,5% (Sigma) por 30 minu-tos à temperatura ambiente e em seguida lavada três vezes emPBS contendo Tween 20 0,5%.
Os anticorpos a serem testados foram diluídos a 1ug/mL em PBS contendo gelatina de pele de peixe a 0,5% e in-cubadas com o peptideo-revestidos placas durante 1 hora àtemperatura ambiente. Excess anticorpos foi removido portrês lavagens com PBS, Tween 20 a 0,5%. As placas foram en-tão incubadas com um anticorpo secundário conjugado adequa-das com peroxidase de rábano silvestre (diluido adequadamen-te em PBS contendo 0,5% de Tween 20) e capaz de ligar a pro-dução de anticorpos de interesse. As placas foram então la-vadas três vezes: uma vez com PBS contendo Tween 20 a 0,5%,e duas vezes com PBS. Finalmente as placas foram incubadascom um substrato cromogênico de peroxidase de rábano (TMB-Stable Stop, IDI) durante 5 minutos à temperatura ambiente,o desenvolvimento de cor foi interrompido com ácido, e adensidade ótica das placas medida a 450nm.
Materiais
Placas de Ligação de Sulfidrila Costar's (VWR n° .29442-278)
Tampão de Revestimento: IXPBS PH 6,5 + lmM EDTA
Tampão de Bloqueio: IX PBS + 0,5% Gelatina de pelede peixe (PBS de CS; FSG de Sigma G n°. 7765)
Tampão de lavagem: IX PBS + Tween 20 a 0,5% pepti-deos de Esclerostina de ratos
Amostras Anticorpo: Ab Transiente, Ab recombinantepurificado, soro de coelho, etc
Ab secundário adequado: ovelha-anti-coelho/camundongo-HRP (Jackson Immuno Research, 115-036-072)
TMB-Stable Stop (RDW IDI-TMBSX-1L) 0,5M HC1
Os métodos foram como segue:
1. Revestir placas com 100 uL/cavidade de peptideode esclerostina de rato diluído em IXPBS PH 6,5 + lmM EDTA a1 ug/mL. Incubar as placas por 1 hora à temperatura ambien-te, (as picas devem ser utilizadas 30 minutos após a abertu-ra) .
2. Lavar as placas 3X com tampão de lavagem.
3. Bloquear as placas com 200 uL/poço de tampão debloqueio. Incubar as placas 30 minutos a temperatura ambien-te .
4. Repetir a lavagem como descrito em (2).
5. Incubar as placas com 50 uL/poço de amostrasdiluído em tampão de bloqueio - os títulos de soro a partirde 1:100; usar Ab Recombinante Transiente neat; purificadarecombinante Ab utilização em 1 ug/mL (todas como amostrasexecutado em duplicatas) . Incubar as placas por lh a tempe-ratura ambiente.
6. Lavar as placas como descrito em (2).
7. Incubar as placas com 50 uL/poço apropriadosAnticorpo secundário (HRP marcados) diluído 1: 1600 no tam-pão de bloqueio. Incubar as placas por 1 hora à temperaturaambiente.
8. Lavar as placas IX com tampão de lavagem, 2x PBS
9. Incubar as placas com 50 uL/poço do TMB, 5 mi-nutos a temperatura ambiente.
10. Deixar em reação com 50 uL/poço HC1 0,5M.
11. Ler as placas a 450 nm onda.
Os seguintes peptídeos seqüências foram seleciona-das como descrito acima:
QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP (SEQ ID n°.: 82)
TEIIPGLREYPEPPQELENN (SEQ ID n°.: 83)
PEPPQELENNQTMNRAENGG (SEQ ID n°.: 84)ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (SEQ ID n°.: 85)CRELHYTRFVTDGP (SEQ ID n°.: 86)CRELHYTRFVTDGPSRSAKPVTELV (SEQ ID n°.: 87)
CRSAKPVTELVSSGQSGPRARLL (SEQ ID n°. : 88)
CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID n°.: 89)RAQRVQLLCPGGAAPRSRKV (SEQ ID n°.: 90)PGGAAPRSRKVRLVAS (SEQ ID n°.: 91)KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ (SEQ ID n°.: 92)IPDRYAQRVQLLSPGG (SEQ ID n°.: 93)SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR (SEQ ID n°.: 94)PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID n°.: 96)KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID n°.: 97).
O anticorpo neutralizador de alta afinidade (Ab-19) ligado a duas seqüências de peptideos sobrepostas: PNAI-GRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID n°.: 96) e KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV(SEQ ID n°. : 97) .
Este procedimento permite o reconhecimento de epi-topos de anticorpos que reagem com epitopos aparentes linea-res. Os peptideos que contenham a totalidade ou parte do si-tio de ligações com anticorpos vão se ligar aos anticorpose, assim, ser detectados.
Exemplo 4
Identificação de Epitopos de Esclerostina HumanaA esclerostina humana de forma madura (peptideosinal removido) é uma proteina de 190 aminoácidos (Figura8) . A Figura 9 mostra um diagrama da estrutura geral de es-clerostina com um braço terminal N (a partir do terminal N Qà cisteina 1) e um braço terminal C (a partir de Cistina8para o terminal Y) . Localizada entre estes dois braços, e-xiste a estrutura de nó de cistina e três voltas, que sãodesignadas Volta 1, Volta 2 e volta 3. As quatro ligaçõesdissulfeto na esclerostina são Cisl em posição de seqüência57 ligados a Cis5 em posição de seqüência 111 (designado porC1-C5), Cis2 em posição de seqüência 71 ligados a Cis6 emposição de seqüência 125 (referido como C2-C6) , Cis3 Na po-sição.de seqüência 82 ligados a Cis7 em posição de seqüência142 (designado por C3-C7), Cis4 em posição de seqüência 86ligados a Cis8 em posição de seqüência 144 (referido comoC4-C8). A estrutura anelar de 8 membros é formada por liga-ção dissulfeto C3-C7 e C4-C8. Esta estrutura anelar, em con-junto com a ligação dissulfeto C1-C5 que penetra através doanel, faz um tipico nó de cistina. C2-C6, que não é parte donó de cistina, traz duas grandes estruturas de volta, volta1 (residuos 57 a 82) e volta 3 (residuos 111 a 142) juntos.A volta 2 vai do C4 (residuo 86) a C5 (residuo 111) .
Experimento
A abordagem geral para caracterizar os epitoposligados por anticorpos anti-esclerostina monoclonais envol-veu a fragmentação de esclerostina humana em peptideos comdiferentes proteases, a determinação da seqüência dos diver-sos peptideos de esclerostina humana, isolando estes pepti-deos e testando cada uma deles para a sua capacidade de seligar a um determinado anticorpo monoclonal usando um "en-saio de ligação de competição ao epitopo de peptideo de es-clerostina humana" baseado em Biacore. Os dados resultantesdo estudo permitiu a localização da ligação ao epitopo a serdeterminado.
Os digeridos de peptideo foram submetidos a mapea-mento de peptideo com HPLC; os picos individuais foram cole-tados, e os peptideos identificados e mapeados pelas análi-ses de espectrometria de massa com dessorção a laser assis-tida por matriz (MALDI-MS) e de ionização eletrospray LC-MS(ESI-LC-MS) e/ou por sequenciação de terminal N. Todas asanálises HPLC para estes estudos foram realizadas utilizandouma coluna de fase reversa C8 (2,1 mm id x 15 cm de compri-mento) . 0 mapeamento de peptideo com HPLC foi realizado comum gradiente linear de ácido trifluoracetico 0,05% (fase mó-vel A) para acetonitrila 90% em ácido trifluoracetico 0,05%.
As colunas foram desenvolvidos mais de 50 minutos com umataxa de fluxo de 0,2 mL/minuto.
Digestão por Tripsina e AspN Endoproteinase
A esclerostina humana de forma madura foi digeridacom tripsina, que cliva após arginina e lisina, ou com AspN.
Aproximadamente 200 ug de esclerostina em 0,5-1,0 mg/mL fo-ram incubados em PBS (pH 7,2) por 20 horas a 37 °C com 8 ugde tanto com tripsina ou AspN.
Digestão por Tripsina
Cromatografia HPLC dos digeridos de tripsina ren-deram vários picos grandes (Fig. 10A). A análise da seqüên-cia foi realizada sobre os picos de peptideo recuperado deHPLC após digestão com tripsina. Uma análise On-Line ESI LC-MS do peptideo digerido também foi realizada para determinarcom precisão a massa de peptideos, que foram separados porHPLC. A identidade dos peptideos presentes nos picos de pep-tideo foi assim determinada (Fig. 11). A Figura 13 mostra oalinhamento das várias seqüências de peptideo (T19.2, T20,T20.6, T21-22) ao longo da seqüência de esclerositna. O nú-mero seguinte a cada T (por exemplo, T19.2) reflete o tempode retenção. T19.2 contém dois peptideos (um da volta 1 e umda volta 3) ligados pela ligação dissulfeto C2-C6. T20 con-tém dois peptideos, realizada em conjunto pela estrutura emnó de cistina, com voltas 1 e 3 intactas, realizada em con-junto pela ligação dissulfeto C2-C6 e com a maior parte dovolta 2 ausente. T20.6 contém quatro seqüências realizadasem conjunto pela estrutura em nó de cistina, mas está fal-tando parte do volta 1 e 3 (a parte T19.2) e está faltandomais da volta 2. T21-22 é praticamente idêntico ao T20 mastem 3 aminoácidos adicionais na região do laço 2.Digestão com AspN
Cromatografia HPLC dos digeridos com AspN renderamvários picos grandes (Fig. 10B) . A análise da seqüência foirealizada sobre os picos de peptideo recuperado de HPLC. Umaanálise On-Line ESI LC-MS do digerido de peptideo também foirealizada para determinar com precisão a massa de peptideos,que foram separados por HPLC. A identidade dos peptideospresentes nos picos de peptideo da digestão com AspN foi as-sim determinada (Fig. 12). A Figura 14 mostra o alinhamentodas várias seqüências de peptideos (AspN14.6, AspNl8.6,AspN22.7-23,5), na seqüência de esclerositna. O número apóscada AspN (por exemplo, AspN18-6) reflete a tempo de reten-ção. AspN14.6 contém três peptideos curtos, tanto do braçoterminal N como C de esclerostina, enquanto AspN18.6 é umdos maiores peptideos de braço terminal N de esclerostina.AspN22.7-23,5 contém um único fragmento de peptideo de 104aminoácidos a engloba todos as oito cisteinas (as quatro li-gações dissulfeto), o nó de cistina e de todos os circuitos 1, 2 e 3.
A estratégia para caracterizar os epitopos foi autilizar estes diferentes peptideos gerados com tripsina eAspN de esclerostina humana e determinar quais peptideos po-deriam ainda ser ligados pelos vários anticorpos (Ab-A, Ab-B, Ab e Ab-C-D). Especificamente isso foi testado em um "en-saio de ligação de competição ao epitopo de peptideo de es-clerostina humana" baseado em Biacore, onde a ligação de umanticorpo monoclonal especifico para esclerostina humana i-mobilizada no Chip Biacore era determinar, na presença ouausência de cada um das diferentes frações de peptideo HPLCisoladas de tripsina e AspN. Na ausência de qualquer compe-tidor peptideos, nomeadamente o anticorpo monoclonal foi ca-paz de ligar a esclerostina humana sobre o chip e produziruma unidade de ressonância, RU, resposta. A preincubação doanticorpo monoclonal particular com esclerostina humana in-tacta em solução, seguido de testes de ligação ao chip, de-monstraram que a ligação do Mab para esclerostina humana nasolução impediu "a ligação do Mab para a esclerostina humanasobre o chip, assim, a validação dos principio geral desseensaio de competição.
Este procedimento geral foi repetido individual-mente para cada um peptideo. Uma resposta RU robusta foi to-mada para indicar que o peptideo particular sendo testadosnão poderia ligar a Mab na solução (dai o Mab foi gratuitapara ligar a esclerostina humana que tinha sido imobilizadano chip). Inversamente, a ausência de uma resposta vigorosaRU indicou que o Mab foi capaz de ligar ao peptideo de es-clerostina em solução. Estes padrões de ligação, junto com aidentidade conhecida dos diversos peptideos de esclerostina,foram utilizados para determinar os epitopos de esclerostinaque estavam ligados por anticorpos anti-esclerostina Ab-A,Ab-B, C-Ab e Ab-D.
Ensaio de Ligação de Competição ao Epitopo de Pep-tideo de Esclerostina Humana Baseado em Biacore
Preparação de Superfície de Esclerostina Humana:
A imobilização de forma madura de esclerostina hu-mana à superfície de um chip sensor BIAcore (CM5) foi reali-zada de acordo com instruções do fabricante. Resumidamente,grupos carboxila sobre a superfície de um chip sensor foramativados por injeção de 60 uL de uma mistura contendo N-etil-N'-(dimetilaminopropil) carbodimida (CED) 0,2 M e N-hidroxiuccinimida (NHS) 0,05 M. A esclerostina humana foidiluída em acetato de sódio 10 mM, o pH 4,0 em uma concen-tração de 20 ug/mL seguido por injeção sobre a superfícieativada CM5. Os grupos reativos em excesso sobre a superfí-cie foram desativados por injeção de 60 uL de etanolamina 1M. Os níveis finais imobilizadas foram de ~ 5000 unidades deressonância (RU) para a superfície, de esclerostina humana.Uma superfície referência em branco, simuladamente acopladatambém foi preparada sobre o chip sensor.
Análise Especificidade de Ligação:
IX salina tamponada fosfato sem cloreto de cálcioou cloreto de magnésio foi de Gibco/Invitrogen, Carlsbad,CA. Albumina sérica bovina, fração V, livre de IgG foi deSigma-Aldrich, St. Louis, MO. Cada Mab (2 nM) foi separada-mente incubado com esclerostina humana 20 nM ou de uma de-terminada amostra em tampão (IX PBS + 0, 005% P-20 + 0,1 mgde/mL BSA)peptídeo de esclerostina humano (nota: há 3 peptí-deos não ligados em AspN14.6) antes da injeção sobre super-fície de esclerostina humana imobilizada. A taxa de fluxo daamostra de injeção foi 5 uL/minuto seguido por regeneraçãode superfície utilizando NaCl 1 M em Glicina 8 mM, o pH 2,0a 30 uL/min durante 30 segundos. Os dados foram analisadosusando BIAevaluation 3.2, e é apresentado na Figura 15 (Ab-A), Figura 16 (Ab-B), Figura 17 (Ab-C) e Figura 18 (Ab-D).Epitopos de volta 2 e T20.6:
O padrão de ligação de peptideo de esclerostinapara dois anticorpos representantes (Ab- A e Ab-B) foi pra-ticamente idêntico (Fig. 15 e Fig. 16) e mostrou que ambosos anticorpos só poderiam ligar ao peptideo AspN22.7-23, 5. Aúnica diferença entre AspN22.7-23,5 e todos os outros pepti-deos de esclerostina é que AspN22.7-23, 5 contém uma volta 2intacta. Isto mostra que Ab-A, Ab-B liga a região da volta 2da esclerostina, definindo assim o epitopo de volta 2 (Fig.19A) . O padrão de ligação de peptideo de esclerostina paraAb e Ab-C-D foi praticamente idêntico um ao outro (Fig. 17 eFig. 18), mas completamente distinto do que se verifica paraAb-A, Ab-B. Dos peptideos testados neste exemplo, o peptideomais diminutivo a que Ab-C e Ab -D poderia se ligar era opeptideo T20.6. Este resultado define o epitopo T20.6 (Fig.19B) .
Ensaio de Proteção de Protease:
O principio geral deste ensaio é que a ligação deum Mab para esclerostina pode resultar na proteção de deter-minados sitios da clivagem com protease e esta informaçãopode ser usada para determinar a região de esclerostina paraonde o Mab se liga.
Epitopo "derivado 1 T20.6 1 (nó de cistina + 4braços)":
A figura 20 mostra os mapas HPLC de um complexo depeptideo de esclerostina humana Ab-D (Fig. 20A: a escleros-tina humana foi preincubada em uma relação 1:1 molar com Ab-D antes da digestão com tripsina como descrito acima) e es-clerostina humana sozinha (Fig. 20B : Esclerostina Humanafoi digerida com tripsina como descrito acima). Os picos depeptideos T19.2 e T20.6 na Figura 20A revelam uma clara re-dução nos respectivos picos de altura, em comparação com aFigura 20B. Esta redução nas alturas do pico foi acompanhadapor um aumento na altura do pico dos peptideos T20 e T21-22.
Estes dados indicam que os resíduos básicos de aminoácido novolta 1 e volta 3, que na ausência de Ab-D foram clivadospor tripsina para gerar peptideos T19.2 e T20.6, eram resis-tentes à clivagem por tripsina quando Ab-D foi pré-ligado àesclerostina. A presença de T20, T20.6 e T21-22 indica que avolta 2 foi ainda clivada eficientemente quando Ab-D foipré-ligado à esclerostina. Estes dados indicam que Ab-D li-gado ao lado da volta 1 e volta 3 do epitopo T20.6 definin-do, assim, o menor epitopo "derivado 1 T20.6 (nó de cistina+ 4 braços)" mostrado na Figura 21.
Exemplo 5
Testes in vivo de Anticorpos Anti-esclerostina Mo-noclonais em Camundongos
Camundongos machos BDF1 com quatro semanas de ida-de foram obtidos a partir de Charles River Laboratories (Ra-leigh, NC) e alojados em gaiolas limpas, cinco animais porgaiola. A temperatura ambiente foi mantida entre 20 e 22,2 °F, e a umidade relativa foi mantida entre 34 e 73%. 0 labo-ratório abrigando as gaiolas tinha um ciclo claro/escuro de12 horas e reuniu todas as especificações AAALAC. As obser-vações clinicas de todos os camundongos em estudo ocorreramuma vez por dia.
Os anticorpos monoclonais anti-esclerostina puri-ficados (Ab-A Fig.l; Ab-B Fig.2; Ab-C Fig. 3; Ab-D Fig.4)foram diluidos em salina tamponada com fosfato estéril deDulbecco. Os camundongos foram sensibilizados com anticorposanti-esclerostina em veiculo PBS ou por via subcutânea em 21uL por grama de peso corporal, duas vezes por semana (segun-da e quinta-feira) a 25 mg/Kg. PTH humano (1-34) foi diluidoem tampão PTH (0,001 N HC1, 0,15 M NaCl, 2% BSA) , e adminis-trado por via subcutânea em 21 uL de por grama de peso cor-poral, cinco vezes por semana (segunda, terça, quarta-feira,quinta-feira, sexta-feira) a 100 ug/kg de como um controlepositivo (Figuras 5 e 6) . O número de camundongos por grupofoi N = 5 na Fig 5 e 6, e N = 6 na Figura 7.
Densiometria Óssea in vivo PIXImus
A densidade mineral óssea (DMO) foi determinadasemanalmente na metáfise tibial proximal e vértebras lomba-res por Absortometria de raiso X de dupla energia (pDEXA)periférica, com o sistema PIXImus2 da GE/Lunar Medicai Sys-tems, Madison, WI. Uma região de interesse (ROI) com 25 mm2,foi colocada para incluir a superfície articular proximal, aepifise, e a extremidade proximal sobre a metáfise da tibia.A região de interesse (ROI), foi colocada a fim de incluiras vértebras lombares (L1-L5). As regiões proximais tibial elombar foram analisados para determinar a densidade mineralóssea total. As médias dos grupos foram relatadas + DesvioPadrão e, em comparação com o grupo em tratamento com veicu-lo para análise estatística.
Análise Estatística
A análise estatística foi realizada com um Dun-netfs e Tukey-Kramer (usando o MS Excel e JMP v. 5.0. paraos Dados DMO) . As médias dos grupos para cada conjunto dedados foram consideradas significativamente diferentes quan-do o valor P era inferior a 0,05 (P <0,05).
Atividade Neutralizadora de Esclerostina dos Anti-corpos
Os aumentos estatisticamente significativos em DMOem comparação com o veiculo visto para cada um de Ab-A (Fi-gura 5), Ab-B (Figura 5), Ab-C (Figura 6) e Ab-D (Figura 7)demonstra que estes quatro anticorpos são anticorpos neutra-lizadores de esclerostina. Além disso, este dados mostramque, para anticorpos anti-esclerostina que se ligam à escle-rostina de rato, o tratamento e a análise de camundongos,tal como descrito acima podem ser usados para identificaranticorpos neutralizadores de esclerostina.
Exemplo 6
Ensaio de Rastreio para anticorpos que Bloqueiam a
Ligação de um Anticorpo à Esclerostina Humana
A esclerostina humana foi acoplada a um Chip Bia-core CM5 utilizando acoplamento quimico amina padrão paragerar uma superfície revestida com esclerostina. 300 unida-des de ressonância de esclerostina foram acopladas à super-fície .
Os anticorpos a serem testados foram diluídos auma concentração de 200 ug/mL em BH-EP-tampão (sendo HEPES10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005% (V/V) Tensoati-vo P20) e, em seguida, e então misturados a uma razão molarum para um (em base em um sitio de ligação) para gerar amistura teste. Esta mistura teste, assim, cada anticorpocontido em uma concentração de 100 ug/mL (1,3 um em uma basede sitio de ligação). As soluções separadas contendo cada umdos anticorpos na mistura teste sozinha também foram prepa-rados. Estas soluções individuais continham os anticorpos emBH-EP-tampão em uma concentração de 100 ug/mL (1,3 um em umabase de sitio de ligação).
20 uL da mistura teste foi passada sobre o chiprevestido com esclerostina com uma taxa de fluxo de 10uL/min e a quantidade de ligação registrada. 0 chip, em se-guida, foi tratado com dois pulsos de 60 segundos de HC1 30nM para a eliminação de todos os anticorpos ligados. Uma so-lução que contêm apenas um dos anticorpos da mistura teste(1,3 uM no mesmo tampão como a mistura teste em base no si-tio de ligação) Foi então passado sobre o chip da mesma ma-neira que a mistura teste e a quantidade de ligação regis-trada. 0 chip foi novamente tratado para remover todos osanticorpos ligados e finalmente uma solução contendo outrosanticorpos da mistura teste sozinha (1,3 uM no mesmo tampãocomo a mistura teste em base no sito de ligação), foi passa-da sobre o chip e a quantidade de ligações é registrada.
A tabela abaixo mostra os resultados de ensaios debloqueio cruzado em uma variedade de anticorpos diferentes.Os valores em cada quadro da tabela representam a quantidadede ligação (em RU) observada quando os anticorpos (1,3 uMsobre uma base de sitio de ligação) ou tampão indicado nalinha superior da tabela foram misturados com os anticorpos(1.3uM em uma base de sitio de ligação) ou tampão indicadana primeira coluna da tabela.
<table>table see original document page 236</column></row><table>
Usando o valor médio de ligação (em RU) para cadacombinação de anticorpos na tabela supra (uma vez que cadacombinação aparece duas vezes), é possivel calcular o per-centual do teórico ligação demonstrado por cada combinaçãode anticorpos. A ligação teórica sendo calculada como a somados valores médios para os componentes de cada mistura testequando medidos isoladamente (isto é, anticorpos e tampão).
<table>table see original document page 236</column></row><table><table>table see original document page 237</column></row><table>
Dos dados acima referidos, é evidente que Ab-4,Ab-A e Ab-19 se bloqueiam mutuamente de modo cruzado. Domesmo modo Ab-13 e Ab-3 se bloqueiam mutuamente de modo cru-zado .
Exemplo 7
Ensaio de Bloqueio Cruzado Baseado em ELISA
Os volumes liquidos utilizados neste exemplo seri-am aqueles tipicamente utilizados em placas ELISA de 96 po-ços (por exemplo, 50-200 uL/cavidade) . Ab-X e Ab -Y, nesteexemplo são assumidas por ter pesos moleculares de aproxima-damente 145 kD e para ter 2 esclerostina sitios de ligaçãopor anticorpos molécula. Um anticorpo anti-esclerostina (Ab-X) é revestido (por exemplo, 50 [mu] , de 1 ug/mL) em umaplaca ELISA de 96 poços [por exemplo: microplaca de 96 Poçosde fundo chato Corning EIA/RIA (Produto n°. 3590), CorningInc., Acton, MA] durante pelo menos uma hora. Após essa eta-pa a solução de revestimento de anticorpo é removida, a pla-ca é lavada lavagem uma ou duas vezes com solução (por exem-plo, PBS e Tween 20 a 0,05%) e, em seguida, é bloqueada u-sando uma solução de bloqueio apropriada (por exemplo, PBS,BSA 1%, Cabra soro 1% e Tween 20 a 0,5%) e procedimentos co-nhecidos na técnica. A solução de Bloqueio é então removidada placa ELISA e um segundo anticorpo anti-esclerostina (Ab-Y) , que está sendo testado por sua capacidade de bloquear demodo cruzado o anticorpo revestido, é adicionado em excesso(por exemplo, 50 uL de 10 ug/mL) de solução para o bloqueioapropriado das cavidades da placa ELISA. Após isto, umaquantidade limitada (por exemplo, 50 uL de 10 ng/mL) de es-clerostina na solução de bloqueio é então adicionada aos po-ços adequados e a placa é incubada durante pelo menos umahora à temperatura ambiente, enquanto agitada. A placa é en-tão lavada 2-4 vezes com solução de lavagem. Um quantidadeadequada de um reagente de deteção de esclerostina [por e-xemplo, anticorpo anti-esclerostina policlonal biotiniladoque tenha sido pré-complexado com um quantidade adequada deum estreptavidina peroxidase de rábano (HRP) conjugada] nasolução de bloqueio é adicionado à placa ELISA e incubadopor pelo menos uma hora à temperatura ambiente. A placa éentão lavada, pelo menos 4 vezes com solução de lavagem e érevelada com um reagente adequado [por exemplo, substratosHRP, como TMB (colorimétrico) ou vários substratos HRP lumi-nescentes]. 0 sinal de fundo para o ensaio é definido como osinal obtido em poços revestidos com o anticorpo (neste casoAb-X), segundo fase em solução anticorpo (neste caso Ab-Y),esclerostina tampão só (ou seja, não esclerostina) e reagen-te de deteção de esclerostina. 0 controle positivo sinal pa-ra o ensaio é definido como o sinal obtido em poços revesti-dos com o anticorpo (neste caso Ab-X), segundo anticorpo emfase de solução (neste caso Ab-Y), tampão apenas (ou seja,nenhum segundo anticorpo em fase de solução), esclerostina ereagente de deteção de esclerostina. 0 teste ELISA deve serexecutado de tal maneira, de modo que o controle sinal posi-tivo seja de pelo menos 6 vezes o sinal antecedente.
Para evitar quaisquer artefatos (por exemplo, afi-nidades significativamente diferentes entre Ab-X e Ab-Y paraesclerostina) resultantes da escolha de anticorpos que seusa como anticorpos de revestimento e que se usa como o se-gundo anticorpo (competidor) , o ensaio de bloqueio cruzado
Precisa ser executado em dois formatos:
1) formato 1 é onde Ab-X é o anticorpo que é re-vestido para a placa ELISA e Ab-Y é o anticorpo competidor,que está em solução e
2) formato 2 é onde Ab-Y é o anticorpo que é re-vestido para a placa ELISA e Ab-X é o anticorpo competidorque está em solução.
Ab-X e Ab-Y são definidos como bloqueadores em mo-do cruzado se, tanto em formato 1 ou em formato 2, o anti-corpo anti-esclerostina na fase em solução é capaz de provo-car uma redução entre 60% e 100 %, especificamente entre 70%e 100%, e mais especificamente entre 80% e 100%, os sinaisde deteção de esclerostina (ou seja, a quantidade de escle-rostina ligada pelos anticorpos revestidos), em comparaçãocom o sinal de deteção de esclerostina obtido na ausência doanticorpo na fase em solução anti-esclerostina (ou seja, ospoços controle positivo).
No caso de uma versão marcada de esclerostina serutilizada no ELISA, tal como uma Esclerostina terminal Nmarcada com His (R & D Systems, Minneapolis, MN, E.U.A.;2005 n° cat. 1406-ST-025) , em seguida, um tipo adequado dereagente de detecção de esclerostina incluiria uma HRP mar-cada como anticorpo anti-His. Além de usar Esclerostina ter-minal N marcada com His, pode-se também usar Esclerostinaterminal C marcada com His. Além disso, vários outros marca-dores e combinações de proteínas de ligação marcadas que sãoconhecidos na técnica podem ser utilizados neste ensaio blo-queio cruzado ELISA (por exemplo, marcador HA com anticorposanti-HA; marcador FLAG com anticorpos anti-FLAG; marcadorbiotina com Estreptavidina).
Exemplo 8
Ensaio de Mineralização com Base na Célula paraIdentificar Agentes Capazes de Antagonizar a Atividade deEsclerostina
Introdução
A mineralização por células em cultura de linhagemde osteoblastos, tanto células primárias como linhagens ce-lulares, é usada como um modelo da formação in vitro do os-so. A mineralização leva cerca de uma a seis semanas paraocorrer com a indução da diferenciação de células de linha-gem de osteoblastos através de um ou mais agentes de dife-renciação. A seqüência global de eventos envolve a prolife-ração celular, diferenciação, produção de matriz extracelu-lar, a maturação da matriz e finalmente deposição de mine-rais, que se refere à cristalização e/ou deposição de fosfa-to de cálcio. Esta seqüência de eventos que começa com aproliferação celular e diferenciação, e que termina com adeposição de minerais é aqui referida como mineralização. Amedição de cálcio (mineral), é o resultado do ensaio.
A deposição de minerais tem uma forte caracterís-tica biofísica, onde uma vez que "sementes" minerais começama se formar, a quantidade total de minerais que será deposi-tada em toda a cultura pode, por vezes, ser depositada muitorapidamente, como alguns dias depois. 0 tempo e a extensãode deposição de minerais em cultura são influenciados, emparte, pelas linhagem de células osteoblastos/linhagem decélulas especial a ser utilizada, as condições de crescimen-to, a escolha de agentes de diferenciação e o número de loteem especial de soro utilizados no meio de cultura celular.Para culturas de mineralização de linhagem de células osteo-blastos/linhagem de células, pelo menos oito a quinze lotesde soro de mais de um fornecedor devem ser testados, a fimde identificar um determinado lote de soro que permita que amineralização ocorra.
Células MC3T3-E1 (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y,Yamamoto S, Kasai S. 1983. In vitro differentiation and cal-ei fication in a new clonal osteogenic cell line derivedfi'om newborn mouse calvaria. J. Cell Biol. 96:191-198) Esubclones da linhagem celular original pode formar mineraisna cultura em crescimento na presença de agentes diferencia-dores. Tais subclones incluem MC3T3-E1-BF (Smith E, RedmanR, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocor-ticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cellcycle. J. Biol. Chem. 275:19992-20001).
Identificação de Anticorpos Neutralizadores EsclerostinaCélulas MC3T3-E1-BF foram usadas para o ensaio demineralização. Ácido ascórbico e B-glicerofosfato foram usa-dos para induzir a diferenciação celular em MC3T3-E1-BF le-vando a deposição minerais. O rastreio especifico protocolo,em formato de 96-poços, envolveu plaquear as células em umaQuarta-feira, seguido por sete mudanças de meio (conformedescrito mais adiante) ao longo de 12 dias com a maioria dadeposição mineral acontecendo ao fim de aproximadamente de-zoito horas (por exemplo, da noite de domingo até segunda-feira) . Para qualquer tratamento, 3 poços foram utilizados(N = 3) . O tempo especifico, e extensão, de deposição mine-ral pode variar dependendo, em parte, do número de lote dosoro em especial a ser utilizado. Experimentos controle per-mitirão que tais variáveis sejam contabilizadas, como é sa-bido na técnica da experimentação geral de cultura celular.
Nesse sistema de ensaio a esclerostina inibiu umaou mais das seqüência de acontecimentos que levaram à depo-sição mineral e inclusive (ou seja, a esclerostina inibiu amineralização). Os anticorpos anti-esclerostina que foramcapazes de neutralizar a atividade inibitória da esclerosti-na permitida para mineralização da cultura na presença deesclerostina tal que houve um aumento estatisticamente sig-nificativo na deposição de fosfato de cálcio (medido comocálcio), em comparação com a quantidade de cálcio medido nogrupo de tratamento com esclerostina apenas (ou seja, nenhumanticorpo) . Para a análise estatística (usando o MS Excel eJMP) uma comparação ANOVA em 1 sentido seguida por compara-ção de Dunnett foi utilizada para determinar as diferençasentre os grupos. As médias dos grupos para cada conjunto dedados foram consideradas significativamente diferentes quan-do o valor P era inferior a 0,05 (P <0,05). Um resultado re-presentante para a execução desse ensaio é mostrado na Figu-ra 22. Na ausência de esclerostina recombinante de camundon-go, a seqüência de eventos que levaram à deposição de mine-ral incluindo a mesma procedeu normalmente. Os niveis decálcio em cada grupo de tratamento são mostrados como meio +Média de Erro Padrão (SEM). Neste experimento exemplar, osniveis de cálcio do ensaio de cálcio foram -31 ug/mL. No en-tanto, a adição da esclerostina recombinte de camundongocausou inibição da mineralização, e o cálcio foi reduzido em~ 85%. A adição de anticorpo anti-esclerostina monoclonalAb-19 ou Ab-4, juntamente com a esclerostina recombinanteresultou em um aumento estatisticamente significativo de de-posição de minerais, em comparação com o grupo de apenas es-clerostina, porque a atividade inibitória da esclerostinafoi neutralizada por um ou por outro anticorpo. Os resulta-dos deste experimento indicam que Ab-19 e Ab-4 são anticor-pos neutralizadores de esclerostina monoclonais (Mabs).
A Figura 23 mostra um resultado muito semelhanteusando esclerostina recombinante humana e dois Mabs anti-esclerostina humanizados. A Figura 24 também mostra um re-sultado muito semelhante usando esclerostina recombinantehumana e Mabs anti-esclerostina de camundongo e humanizadoscomo indicado.
Os anticorpos utilizados para as experiências mos-tradas na Fig 22, 23 e 24 têm um peso molecular de cerca de145 kD e têm 2 sítios de ligação à esclerostina por moléculade anticorpo.
Um protocolo detalhado de cultura celular MC3T3-El-BF é descrito abaixo.
Reagentes e Meios <table>table see original document page 244</column></row><table>
Alfa-MEM é normalmente fabricado com um 1 ano devencimento. Foi utilizado Alfa-MEM que não era tivesse maisdo que 6 meses após a data de fabricação para a cultura celular .
O Meio de Expansão (Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu)foi preparado do seguinte modo:
Um frasco com 500 mL de FBS foi descongelado e es-terilizado por filtragem através de um filtro de 0,22 mi-crons. 100 mL desse FBS foram adicionados a 1 litro de Alfa-MEM seguido pela adição de 10 mL de 100 x PenStrepGlutamine.FBS inutilizado foi aliquotado e recongelado para uso poste-rior .
Meio de Diferenciação (Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu,5+50 ug/mL de ácido ascórbico, + 10 mM versão beta-glicerofosfato) foi preparado do seguinte modo:
100 mL de Meio de Diferenciação foi elaborado com-pletando 100 mL de Meio de Expansão com ácido ascórbico ebeta-glicerofosfato como segue:
<table>table see original document page 245</column></row><table>
O Meio de Diferenciação foi feito complementando oMeio de Expansão apenas no dia em que o Meio de Diferencia-ção seria utilizado para a cultura celular. A concentraçãofinal de ácido ascórbico em Meio de Diferenciação é 100ug/mL, porque Alfa-MEM já contém 50 ug/mL de ácido ascórbi-co. A solução-mãe de Ácido ascórbico (10 mg/mL) foi feita ealiquotada para congelamento em -80 °C. Cada aliquota foiutilizada apenas uma vez (isto é, não foi recongelada). Asolução-mãe de Beta-glicerofosfato (1 M) foi feita e aliquo-tada para congelamento a -20 °C. Cada alíquota foi congeladae descongelada um máximo de 5 vezes antes de ser descartada.
Cultura celular para expansão de células MC3T3-E1-BF.
A cultura celular foi realizada a 37 °C e C02 5%.
Um banco de células foi gerado para fins de rastreio paraanticorpos neutralizadores de esclerostina. O banco de célu-las foi criado como segue:
Um frasco de células congeladas MC3T3-E1-BF foidescongelado, por agitação em um banho de água a 37 °C. Ascélulas descongeladas foram postas em 10 mL de Meio de ex-pansão (Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu) em tubo de 50 mL e su-avemente centrifugadas durante 5 minutos. As células foramentão ressuspensas em 4 mL de Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu.
Depois de determinar o número de células com azul de tripanoe hemacitômetro, 1 x IO"6 células foram plaqueadas em 50 mLde meio Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu em um balão T175.
Quando essa passagem foi confluente (em aproxima-damente 7 dias) , as células foram tripsinizadas com tripsi-na/EDTA (Tripsina 0,05%; EDTA 0,53 mM), centrifugadas suave-mente durante 5 minutos e, em seguida, ressuspensas em 5 mLde Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu. Depois de determinar o nú-mero de células com azul de tripano e hematocitômetro, ascélulas foram plaqueadas de 1 x IO'6 células em 50 mL demeio Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu para um balão T175. O nú-mero de recipientes T175 utilizados para plaquear neste mo-mento dependeu do número de células totais disponíveis e onúmero desejado de recipientes a serem usados até a próximapassagem. Células extras foram congeladas em 1-2 x 10 cé-lulas vivas/mL em 90% FBS/10% DMSQ.
Quando esta passagem foi confluente (cerca de 3-4dias) , as células foram tripsinizadas com tripsina/EDTA(0,05% Tripsina; 0,53 mM EDTA), centrifugadas suavemente du-rante 5 minutos e, em seguida, ressuspensão em 5 incorreta-mente Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu. Depois de determinar onúmero de células com azul de tripano e hematocitometro, ascélulas foram plaqueadas de 1 x IO"6 células em 50 mL demeio Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu para um balão T175. 0 nú-mero de recipientes T175 utilizados para plaquear neste mo-mento dependeu do número de células totais disponíveis e onúmero desejado de recipientes a serem usados até a próximapassagem. Células extras foram congeladas em 1-2 x IO"6 cé-lulas vivas/mL em 90% FBS/10% DMSQ.
Quando esta passagem foi confluente (cerca de 3-4dias), as células foram tripsinizadas com tripsina/EDTA(0,05% Tripsina; 0,53 mM EDTA), centrifugadas suavemente du-rante 5 minutos e, em seguida, ressuspensas em 5 mL de meioAlfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu. Depois de determinar o númerode células com azul de tripano e hematocitometro, as célulasforam plaqueadas de 1 x IO"6 células em 50 mL de meio Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu para um balão T175. O número de re-cipientes T175 utilizados para plaquear neste momento depen-deu do número de células totais disponíveis e o número dese-jado de recipientes a serem usados até a próxima passagem.Células extras foram congeladas em 1-2 x IO"6 células vi-vas /mL em 90% FBS/10% DMSQ.Quando esta passagem foi confluente (cerca de 3-4dias), como células foram tripsinizadas com tripsina/EDTA(0,05% Tripsina; 0,53 mM EDTA), centrifugadas suavemente du-rante 5 minutos e, em seguida, ressuspensão em 5 mL de Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu. Depois de determinar o número decélulas com azul de tripano e hematocitômetro, as célulasforam congeladas em 1-2 x 10~6 células vivas/mL em 90%FBS/10% DMSO. Esta "passagem final" de células congeladasfoi a passagem que foi utilizada para o ensaio de rastreio.Cultura celular para mineralizar células MC3T3-E1-BF.
A cultura celular foi realizada a 37 °C e C02 5%.É desejável minimizar as flutuações de temperatura e do % deCO2 durante o procedimento de cultura celular para minerali-zação. Isso pode ser conseguido minimizando o tempo que asplacas ficam fora da incubadora durante a alimentação e tam-bém pela redução do número de vezes que a porta da incubado-ra é aberta e fechada durante o procedimento de cultura ce-lular para mineralização. Neste sentido ter um incubadora decultura de tecido que é dedicada exclusivamente para a cul-tura celular de mineralização (e, portanto, não é aberta efechada mais do que o necessário) pode ser útil.
Um número adequado de frascos de "passagens fi-nais" preparados como descrito acima foram descongelados,por agitação em um banho de água a 37 °C. As células descon-geladas foram postas em 10 mL de Meio de expansão (Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu) em tubo de 50 mL e suavemente cen-trifugadas durante 5 minutos. As células foram então ressus-pensas em 4 mL de Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu. Depois dedeterminar o número de células por azul de tripano e hemato-citômetro, 2500 células foram plaqueadas em 200 microlitrosde Meio de Expansão por poço em placas de 96 poços revesti-das com colágeno 1 (Becton Dickinson Labware, n° cat.354407).
Para evitar um efeito de mineralização da extremi-dade da placa, as células não foram plaqueadas na li-nha/coluna ultraperiférica em torno da placa. Ao invés dis-so, 200 microlitros de PBS foram acrescentados a estes poços .
Processo Exemplar de Cultura Celular
No procedimento seguinte, o dia de partida paraplaquear as células é indicado para ser uma quarta-feira. Seum outro dia da semana é usado como o dia de partida paraplaquear as células, esse dia irá acionar o cronograma diá-rio para remover e adicionar meio durante todo o processo,como indicado abaixo. Por exemplo, se as células são plaque-adas em uma terça-feira, os meios não devem ser removidos eadicionados na primeira sexta-feira e sábado, nem na segundasexta-feira e sábado. Com um inicio na terça-feira, as pla-cas serão preparadas para o ensaio de cálcio no último domingo.
As células foram plaqueadas em uma quarta-feira em2500 células em 200 uL de Meio de Expansão.
Na quinta-feira todo o Meio de Expansão foi remo-vido e 200 uL de Meio de Diferenciação foi adicionado.
Na sexta-feira 100 uL do meio foi removido e 100uL de Meio de Diferenciação fresco foi adicionado.
Na segunda-feira 100 uL do meio foi removido e 100uL de Meio de Diferenciação fresco foi adicionado.
Na terça-feira 100 uL do meio foi removido e 100uL de Meio de Diferenciação fresco foi adicionado.
Na quarta-feira, 100 uL do meio foi removido e 100uL de Meio de Diferenciação fresco foi adicionado.
Na quinta-feira 100 uL do meio foi removido e 100uL de Meio de Diferenciação fresco foi adicionado.
Na sexta-feira 100 uL do meio foi removido e 100
uL de Meio de Diferenciação fresco foi adicionado.
Na segunda-feira seguinte as placas foram prepara-das para o ensaio de cálcio do seguinte modo:
As placas foram lavadas uma vez com 10 mM Tris,HC1 pH 7-8. Trabalhando em uma capela, 200 uL de 0,5 N HC1foram acrescentados por poço. As placas foram então congela-das a -80 °C.
Pouco antes da medição de cálcio, as placas foramcongeladas e descongeladas duas vezes e, em seguida, foi u-tilizada trituração com uma pipeta multicanal para dispersaro conteúdo da placa. O conteúdo da placa foi então deixadosedimentar a 4 °C durante 30 minutos quando uma adequadaquantidade de sobrenadante foi removida para medir o cálcioutilizando um kit de cálcio comercialmente disponível. Umkit exemplar e não-limitante é Cálcio (CPC) Liquicolor, N°.Cat. 0150-250, Stanbio Laboratory, Boerne, TX.
Neste ensaio com base na célula, a esclerostinainibe uma ou mais das seqüências de acontecimentos que leva-ram à deposição de minerais, inclusive a mesma (ou seja, aesclerostina inibe a mineralização). Assim, em experimentosonde a esclerostina foi incluida, em especial experimento decultura celular, a esclerostina recombinante foi adicionadaao meio começando na primeira quinta-feira e alimentada acada dia seguinte. Nos casos em que um anticorpo anti-esclerostina monoclonal (Mab) estava sendo testado para acapacidade de neutralizar a esclerostina, ou seja, permitira mineralização por neutralizar a a capacidade da escleros-tina de inibir a mineralização, o Mab foi adicionado ao meiocomeçando na primeira quinta-feira e alimentada todos os di-as subseqüentes. De acordo com o protocolo, isso foi reali-zado da seguinte forma: o Mab foi preincubado com a escle-rostina recombinante em Meio de Diferenciação por 45-60 mi-nutos a 37 °C e, em seguida, esse material foi utilizado pa-ra alimento para as células.
É descrito acima um protocolo de 12 dias de mine-ralização para células MC3T3-E1-BF. Usando os mesmos reagen-tes e protocolo de alimentação, as células originais MC3T3-El (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983.In vitro differentiation and caleification in a new clonalosteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. JCell Biol 96:191-198), que é obtida a partir do RIKEN CellBank (RCB 1126, RIKEN BioResource Center 3-1-1 Koyadai, Tsu-kuba-shi, Ibaraki 305-0074 Japão) levou mais tempo para mi-neralizar (20 dias no total de mineralização) do que as cé-lulas MC3T3-E1-BF. A mineralização da células originaisMC3T3-E1 foi inibida por esclerostina recombinante e estainibição foi bloqueada usando anticorpos neutralizadores deesclerostina.
Exemplo 9
Anticorpos Anti-Esclerostina Protegem de Perda Ós-sea Induzida por Inflamação no Modelo de Transferência CD4CD4 5RB elevado de Colite em Camundongos SCID
Resumo do modelo
Injeção do subconjunto CD4 5RBelevad0 de células TCD4 + em camundongos scid CB-17 resulta em inflamações intes-tinais crônicas com características semelhantes às da doençainflamatória intestinal humana (IBD). Diarréia e emaciaçãosão notadas 3-5 semanas após a transferência das células comgraves infiltrações leucocitárias no cólon acompanhadas dehiperplasia das células epiteliais e formação de granulomas.
Camundongos scid. CB-17 que recebem o subconjunto reciprocode células CD4 +, aqueles que expressam CD45RBbaixo, não a-presentam colite e têm um peso indistinguivel dos camundon-gos scid não sensibilizados. Além de sintomas de colite, omodelo de transferência de células T CD4 5RBelevado CD4 + decolite é acompanhado por uma redução da densidade mineralóssea (DMO), o que se pensa ser principalmente através demecanismos inflamatórios, em vez de má absorção dietária (B-yrne, FR et al., Out 54:78-86, 2005).
Indução da Colite e Perda Óssea Induzida por In-flamação
Os baços de camundongos balb/c fêmeas foram reti-rados e rompidos através de um filtro de 70 um de células. Apopulação CD4 + foi então enriquecida pela seleção negativacom Dynabeads utilizando anticorpos contra B220, MAC-1, CD8e I-Ad. A população enriquecida foi então corada com conju-gado FITC anti-CD4 e conjugado PE anti-CD45RB e fracionadoem populações CD4 + CD4 5RB elevado e CD4 + CD4 5RBbaix0 por duasordenações em cores em um Moflo (Dakocytomation). As popula-ções CD45RB elevad0 e CD45RBbaixo foram definidas como a colora-ção mais brilhante 40% e a coloração mais opaca 20% de célu-las CD4 +, respectivamente. 5 x 10~5 células foram então in-jetadas IP em Camundongos scid CB-17 no dia 0 e o desenvol-vimento da colite foi monitorizado através do aparecimentode fezes amolecidas ou diarréia e perda de peso. As mediçõesde densidade mineral óssea foram tomadas no encerramento doestudo (dia 88).
Efeito de Tratamento Anti-Esclerostina em Sintomasde Colite e BMP
IgG Ab-A foi administradA em lOmg/kg sc, A partirdo dia antes de transferência de célula CD4 + CD45RB elevadoe, em comparação com ratos que receberam o anticorpo contro-le negativo 101,4, em administração de também lOmg/kg sc. Osanticorpos foram dosados nas semanas subsequentes. Um grupode camundongos que recebeu células não patogênicas CD4 +CD45RBbaixa e foram tratados com lOmg/kg 101,4 foi estudadocomo.um controle. Ao término do estudo (88° dia) a densidademineral óssea, foi medida e seções do cólon tomadas para a-nálise da infiltração de células e avaliação do dano histo-lógico.
a) Nenhum efeito sobre sintomas de colite
Os sintomas tipicos de colite como perda de peso einfiltração de células inflamatórias no cólon não foram afe-tados pelo tratamento com Ab-A. Da mesma forma não houve me-lhoria do dano histológico ao cólon após o tratamento comAb-A.
b) Inibição da perda da densidade mineral ósseainduzida por inflamação. No 88° dia, após transferência decélulas em Camundongos scid CB-17, a densidade mineral ósseafoi medida (DMO total, DM0 vertebral e DM0 femoral). Em com-paração com os camundongos controle que receberam célulasnão patogênicas CD4 + CD45RBbaixo, os camundongos que recebe-ram células T CD4 + CD45RB elevado e anticorpo 101,4 controlenegativo tinham redução da densidade mineral óssea, conformemostra a Figura 25. Em contrapartida, não se observou redu-ção da DMO após . o tratamento com Ab-A. As medições da DMOtotal, de vértebras e de fêmur foram significativamente mai-ores nos ratos que receberam células T CD4 + CD45RB elevado etratados com Ab-A que dos camundongos que receberam célulasT CD4 + CD45RB elevado e foram tratados com 101,4 (P <0,001por teste de comparação múltipla de Bonferroni) .
Exemplo 10
Determinação da Afinidade (KD) com Base em KINEXAde Anticorpos Anti-Esclerostina para Esclerostina Humana
A afinidade de vários anticorpo anti-esclerostinapara esclerostina humana foi avaliada por uma análise de li-gação de solução em equilíbrio utilizando KinExA ® 3000 (Sa-pidyne Instruments Inc., Boise, ID) . Para essas medições,grânulos Reacti-Gel 6x (Pierce, Rockford, IL) foram pré-revestidos com 40 ug/mL de esclerostina humana em 50 mMNa2C03, pH 9,6 a 4 °C durante a noite. Os grânulos forambloqueados, em seguida, com 1 mg/mL de BSA em 1 M Tris-HCl,
0 pH 7,5 a 4 °C durante duas horas. 10 pM, 30 pM, ou 100 pMdos anticorpos foram misturadas com diferentes concentraçõesde esclerostina humana, variando a concentração de 0,1 pM a
1 pM e equilibrada à temperatura ambiente por mais de 8 ho-ras em PBS com 0,1 mg/mL de BSA e 0,005 % P2 (As misturasforam então passadas sobre os grânulos revestidos com escle-rostina humana. A quantidade de anticorpos anti-esclerostinaligada aos grânulos foi quantificada usando anticorpos anti-IgG de rato de cabra fluorescentes marcados com Cis ou anti-IgG humana de cabra fluorescentes marcados com Cis (JacksonImmuno Research, West Grove,) para as amostras de anticorposde camundongos ou humanos, respectivamente. A quantidade desinal fluorescente medido foi proporcional à concentração deanticorpos anti-esclerostina livres em cada mistura de rea-ção em equilíbrio. A constante de equilíbrio de dissociação(Kp) foi obtida a partir da regressão não-linear das curvasde competição utilizando um modelo de ligação homogêneo deum sitio de curva n fornecido no software KinExA Pro. Os re-sultados dos ensaios KinExA para os anticorpos selecionadosestão resumidos na tabela abaixo.
<table>table see original document page 255</column></row><table><table>table see original document page 256</column></row><table>
Exemplo 11
Método BIACORE para Determinar a Afinidade de An-ticorpos Anti-Esclerostina Humanizados para Esclerostina Hu-mana .
A tecnologia BIAcore controla a ligação entre bio-moléculas em tempo real e sem a exigência de rotulagem. Umdos interactantes, denominado o ligante, tanto é imobilizadodiretamente ou capturados na superfície imobilizada, enquan-to o outro, chamado analisado, flui em solução sobre a su-perficie capturada. 0 sensor detecta a mudança de massa so-bre a superfície do sensor como o analisado se liga ao li-gante para formar um complexo na superfície. Isto correspon-de ao processo de associação. O processo de dissociação émonitorado quando o analisado é substituído por tampão. Noensaio de afinidade BIAcore, o ligante é o anticorpo anti-esclerostina e o analisado é esclerostina.
Instrumento
Biacore (R) 3000, Biacore AB, Uppsala, SuéciaChip sensor
CM5 (grau de investigação) número de catálogo: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Suécia. Os Chips foram armaze-nados a 4 °C.
Solução BIAnormalisante
70% (p/p) Glicerol. Parte do Kit BIAmanutenção nú-mero de catálogo: BR-1002-51, Biacore AB, Uppsala, Suécia. 0Kit BIAmaintenance foi armazenado a 4 °C.Kit de Acoplamento Amina
Número de catálogo: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala, Suécia.
Cloridrato de Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbo-diimida (EDC). Composto a 75 mg/mL de água destilada e arma-zenado em alíquotas de 200 uL em -70 °C.
N-Hidroxisuccinimida (NHS). Composto a 11,5 mg/mLde água destilada e armazenado em alíquotas de 200 uL em -70 °C.
Cloridrato de Etanolamina-NaOH 1M pH 8,5. Armaze-nado em alíquotas de 200 uL em -70 °C.
Tampões
Tampão de corrida para imobilização de anticorposcapturados: BH-EP (sendo HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M,EDTA 3 mM, Tensoativo P20 0, 005%). Número de catálogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suécia. Tampão armazenado a 4 °C.
Tampão de Imobilização: Acetato 5,0 (sendo acetatode sódio 10 mM pH 5.0). Número de catálogo: BR-1003-51, Bia-core AB, Uppsala, Suécia. Tampão armazenado a 4 °C.
Tampão de corrida para ensaio de ligação: BH-EP(sendo 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005%Tensoativo P20, Número de catálogo: BR-1001-88, Biacore AB,Uppsala, Suécia), com CM-dextrano adicionado a 1 mg de/mL(Número de catálogo 27560, Fluka BioChemika, Buchs, Suiça).
Tampão armazenado a 4 °C.Captura de Ligante
Fragmento de IgG anti-humana de cabra Affinipure F(aB1)2/ fragmento Fc especifico. Jackson ImmunoResearch Inc(Pennsylvania, E.U.A.) Número de catálogo: 109-006-098. Rea-gente conservado a 4 °C.
Ligante
Anticorpos humanizados anti-esclerostina humanaAb5, Ab 14 e Ab2 0.
Analisado
Esclerostina Recombinante humana. Alíquotas arma-zenada a -70 °C e descongeladas uma vez para cada ensaio.Solução de Regeneração
HC1 40 mM preparado por diluição com água deStila-da de uma solução-mãe 11,6 M (BDH, Poole, Inglaterra. Catá-logo: 101254H).
NaOH 5 mM preparado por diluição com água destila-da a partir de solução a 50 mM. Número de catálogo: BR-1003-58, Biacore AB, Uppsala, Suécia.
Método de Ensaio
O formato do ensaio foi a captura do anticorpo an-ti-esclerostina imobilizado pela IgG-Fc anti-humana e entãotitulação de esclerostina sobre a superfície capturada.
Um exemplo do procedimento é indicado a seguir:BIA (Biamolecular Interaction Analysis), foi rea-lizada utilizando uma BIAcore 3000 (BIAcore AB) . FragmentoIgG anti-humana de cabra Affinipure F(aB')2, e fragmento Fcespecifico (Jackson ImmunoResearch) foram imobilizados em umChip sensor CM5 através de acoplamento quimico amina para umnivel dw captação de «4000 unidades de resposta (RUs). tam-pão BH-EP- (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, EPTA 3 mM, Ten-soativo P20 0,005%, BIAcore AB) contendo 1 mg/mL CM-dextranofoi utilizado como tampão de corrida com uma taxa de fluxode 10 uL/min. Uma injeção de 10 uL do anticorpo anti-esclerostina a ~ 5 ug/mL foi utilizada para capturar as IgG-Fc anti-humana imobilizadas. Os niveis de captura de Anti-corpo eram tipicamente 100-200 RU. A esclerostina foi ajus-tada ao longo dos anticorpos anti-esclerostina capturados emvárias concentrações com uma taxa de fluxo de 30 uL/minuto.
A superfície foi regenerada por duas injeções de 10 uL deHC1 40 mM, seguidas por uma injeção de 5 uL de NaOH 5 mM comuma vazão de 10 uL/minuto.
As curvas de ligação de subtração antecedentes fo-ram analisados utilizando o software BIAevaluation (versão3.2) seguindo os procedimentos normalizados. Os parâmetroscinéticos foram determinados a partir do algoritmo de ajus-te .
Os dados cinéticos e contantes de dissociação cal-culados são apresentados na tabela 2.
Tabela 2: Afinidade de anticorpo anti-esclerostinapara a esclerostina
<table>table see original document page 259</column></row><table>Exemplo 12
Testes in Vivo de Anticorpos Monoclonais Anti-Esclerostina em Macacos Da espécie cynomolgus
Trinta e três macacos da espécie cynomolgus fêmeascom cerca de 3-5 anos, (Macaca fascicularis) foram utiliza-dos neste estudo de 2 meses. 0 estudo continha 11 grupos:
Grupo 1: veiculo (N = 4)Grupo 2: Ab-23 (N = 2, dose 3 mg/Kg)Grupo 3: Ab-23 (N = 3, dose 10 mg/Kg)Grupo 4: Ab-23 (N = 3, dose 30 mg/Kg)
Grupo 5: Ab-5 (N = 3, dose 3 mg/Kg)Grupo 6: Ab-5 (N = 3, dose 10 mg/Kg)Grupo 7: Ab-5 (N = 3, dose 30 mg/Kg)Grupo 8: Ab-14 (N = 3, a dose 3 mg/Kg)Grupo 9: Ab-14 (N = 3, dose 10 mg/Kg)
Grupo 10: Ab-14 (N = 3, dose 30 mg/Kg)Grupo 11: Hormônio Paratireóideo (1-34) [PTH (1-34)] (N = 3, dose 10 ug/kg)
Todas as doses foram subcutâneas. PTH (1-34) foiadministrado diariamente, anticorpos monoclonais (Mabs) fo-ram dosados em duas vezes (primeira dose no inicio do estudoe segunda dose no ponto de tempo de um mês) . Para avaliaçãodo parâmetros ósseos (por exemplo, a densidade mineral ós-sea) , as varreduras pQCT (tomografia computadorizada perifé-rica quantitativa) e DXA (absorciometria de raios-X de duplaenergia) foram realizadas antes do inicio do estudo (paraobter valores basais), e depois de um mês (antes da segundadose de Mab) e, finalmente, no final do estudo (ponto detempo de 2 meses), em cujo ponto os macacos foram submetidosa necrópsia para uma análise mais aprofundada (por exemplo,análise histomorfométrica). Os animais foram marcados comfluorcromo (dias 14, 24, 47 e 57) para a histomorf ometriadinâmica. Foi coletado soro em vários pontos durante o perí-odo de estudo [dia 1 pré-administração (o dia da primeiradose de Mab) , dia 1 doze horas após a dose, dia 2, dia 3,dia 5, dia 7, dia 14, dia 21, dia 28, dia 29 doze horas pós-administração (dia 29 foi o dia da segunda e última dose deMab), dia 30, dia 31, dia 33, dia 35, dia 42, dia 49 e dia56] . Três biomarcadores séricos relacionados ao osso forammedidos utilizando materiais disponíveis comercialmente:
Osteocalcina (OC) (Kit de radioimunoensaio DSL Os-teocalcina; Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster,TX, E.U.A.)
Procolágeno de Propeptideo de terminal N do Tipo I(P1NP) (Kit de radioimunoensaio P1NP; Orion Diagnostica, Es-poo, Finlândia)
Fragmentos C-telopéptideos de cadeias de colágenotipo I Al (sCTXI) (Serum CrossLaps ® ELISA; Nordic Bioscien-ce Diagnostics AJS, Herlev, Dinamarca).
As varreduras PQCT e DXA produziram dados sobrevários parâmetros ósseos (incluindo a densidade mineral ós-sea (DMO) e conteúdo mineral ósseo) através de diversos si-tios esqueléticos (incluindo metáfise e diáfise tibiais, me-táfise e diáfise radiais, pescoço femural, vértebras lomba-res) . A análise destes dados ósseos (alteração percentual dalinha de base para cada animal) e os dados de biomarcadorsérico (alteração percentual da linha de base para cada ani-mal) anabólicos (OC, P1NP) revelaram aumentos estatistica-mente significativos, versus o grupo veiculo, em alguns pa-râmetros a alguns pontos de tempo e doses para cada Mab. Es-tes dados de parâmetros ósseos, dados de biomarcador sérico,bem como os dados histomorfométricos, indicaram que cada umdos 3 Mabs (Ab-23, Ab-5 e Ab-14) foi capaz de neutralizar aesclerostina em macacos da espécie cynomolgus. Esta ativida-de foi maior para Ab-23 e Ab-5, em particular com a dosemais elevada (30 mg/Kg), com um claro aumento na formaçãoóssea (efeito anabólico), bem como os ganhos liquidos nosossos (por exemplo, DMO) . Aumentos estatisticamente signifi-cativos nos parâmetros ósseos e parâmetros histomorfométri-cos anabólicos também foram encontrados para o grupo contro-le positivo (PTH (1 -34)).
Marcadores séricos de formação óssea (P1NP, osteo-calcina) foram aumentados (p <0,05 versus veiculo (VEH)), emvários pontos de tempo e doses, mas sobretudo nos grupos 30mg/Kg de Ab-23 e Ab-5. A análise histomorfométrica revelouum aumento dramático (p <0,05 versus VEH) nas taxas de for-mação óssea em osso canceloso na vértebra lombar e tibiaproximal (aumento de até 5 vezes), bem como na superfícieendocortical do midshaft femoral (até 10 vezes de aumento)em doses mais elevadas de Ab-23 e Ab-5. A espessura trabecu-lar foi aumentada com doses elevadas de Ab-23 e Ab-5 em vér-tebras lombares (>60%, p <0,05 versus VEH). Pelo estudo fi-nal (2 meses), DMO areai, como alteração percentual da linhade base, foi aumentada (p <0,05 versus VEH), no pescoço dofêmur, rádio ultra-distal (Ab-23, 30 mg/Kg), e vértebraslombares ( Ab-5, 30 mg/Kg). Os aumentos na DMO areai na vér-tebras lombares foram acompanhadas de aumentos das forçavertebral (97% de aumento na carga máxima vertebral para Ab-23, 30 mg/Kg; p <0,05 versus VEH); os valores basais paraDMO areai lombar antes da dosagem de Mab foram estatistica-mente semelhantes em todos os grupos. Em resumo, a adminis-tração de Mabs que neutralizam a esclerostina a curto prazoem macacos da espécie cynomolgus resultou, em parte, em au-mento na formação óssea, DMO e força óssea vertebral.
A partir do exposto, embora as modalidades especi-ficas da invenção tenham sido descritas neste documento parafins de ilustração, diversas modificações podem ser feitassem se desviar do espirito e do âmbito da invenção. Conse-quentemente, a invenção não é limitada, exceto pelas reivin-dicações anexas. Todas as publicações, pedidos de patentepublicados, patentes e documentos divulgados são incorpora-dos aqui por referência.

Claims (72)

1. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que bloqueia transversalmente aligação de pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C,Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9,Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab- 22, Ab-23, e Ab-24 à esclerostina.
2. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o ditoagente de ligação de. esclerostina é bloqueado transversal-mente da ligação à esclerostina por pelo menos um dos.anti-corpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5,Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14,Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab- 22, Ab-23, e Ab-24.
3. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que é bloqueado transversalmenteda ligação à esclerostina por pelo menos um dos anticorposAb-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6,Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15,Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab- 22, Ab-23, eAb-24.
4. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 1 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que acapacidade do dito agente de ligação de esclerostina de blo-quear transversalmente ou ser bloqueado transversalmente édetectada em um ensaio Biacore.
5. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 1 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que acapacidade do agente de ligação de esclerostina de bloqueartransversalmente ou ser bloqueado transversalmente é detec-tada em um ensaio ELISA.
6. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 1 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que odito agente de ligação de esclerostina é um anticorpo.
7. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 1 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que odito agente de ligação de esclerostina pode aumentar pelomenos um de formação óssea, densidade mineral óssea, teormineral ósseo, massa óssea, qualidade óssea e resistênciaóssea em um mamífero.
8. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 1 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que odito agente de ligação de esclerostina pode bloquear o efei-to inibidor da esclerostina em uma ensaio de mineralizaçãocom base em célula.
9. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito agente de ligação deesclerostina pode bloquear o efeito inibidor da esclerostinaem um ensaio de mineralização com base em célula.
10. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que se liga a uma epitopo Loop 2.
11. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que se liga a uma epitopo T20.6.
12. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que se liga a um epitopo "deriva-do 1 T20.6. (cistina + nó + 4 braços)".'
13. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom qualquer uma das reivindicações 7 a 12, CARACTERIZADOpelo fato de que o agente de ligação de esclerostina é umanticorpo.
14. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos uma se-qüência de CDR tendo pelo menos 7 5% de identidade cóm umaCDR selecionada de SEQ ID NOs:-39, 40, 41, 42, 43, .44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,-51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80,-81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,-110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241,-242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253,-254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265,-266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277,-278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289,-290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353,-358, 359, e 360.
15. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende pelo menos duas das ditas CDRs.
16. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende pelo menos seis das ditas CDRs.
17. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que adita percentagem de identidade é de 85%.
18. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que adita percentagem de identidade é de 95%.
19. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende:<table>table see original document page 267</column></row><table><table>table see original document page 268</column></row><table>
20. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende:(a) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 54, 55, e 56,e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 51, 52, e 53;(b) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 60, 61, e 62e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 57, 58, e 59;c) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 48, 49, e 50 eseqüências de CDR de SEQ ID NOs: 45, 46, e 47;d) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 42, 43, e 44 eseqüências de CDR de SEQ ID NOs: 39, 40, e 41;e) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 275, 276, e 277 e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 287, 288, e 289;f) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 278, 279, e-280 e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 290, 291, e 292;g) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 78, 79, e 80 eseqüências de CDR de SEQ ID NOs: 245, 246, e 247;h) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 81, 99, e 100e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 248, 249, e 250; i) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 101, 102, 103: j) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 104, 105, e 106 e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 254, 255, e 256; k) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 107, 108, e 109 e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 257, 258, e 259; 1) seqüências de CDR de SEQ ID . NOs: 110, 111, e 112 e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 260, 261, e 262; m) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 281, 282, e 283 e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 293, 294, e 295; n) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 113, 114, e 115 e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 263, 264, e 2 65; o) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 284, 285, e 286 e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 296, 297, e 2 98; p) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 116, 237, e 238 e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 266, 267, e 2 68;q) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 239, 240, e-241 e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 269, 270 e 271;r) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 242, 243, e-244 e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 272, 273, e 274; ous) seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 351, 352, e-353 e seqüências de CDR de SEQ ID NOs: 358, 359, e 360.
21. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom qualquer uma das reivindicações 14 a 20, CARACTERIZADOpelo fato de que o agente de ligação de esclerostina é umanticorpo.
22. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelofato de que compreende um agente de ligação de esclerostinaconforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12e 14 a 20.
23. Composição farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito agentede ligação de esclerostina é um anticorpo.
24. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos uma se-qüência de CDR tendo pelo menos 75% de identidade com umaCDR selecionada de SEQ ID NOs: 245, 246, 247, 78, 79, 80,-269, 270, 271, 239, 240 e 241.
25. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos uma se-qüência de CDR tendo pelo menos 75% de identidade com umaCDR selecionada de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 eCDR-L3, em que CDR-H1 tem a seqüência dada em SEQ ID NO: 245ou SEQ ID NO: 269, CDR-H2 tem a seqüência dada em SEQ ID NO:-246 ou SEQ ID NO: 270, CDR-H3 tem a seqüência dada na SEQ IDNO: 247 ou SEQ ID NO: 271, CDR-Ll tem a seqüência dada emSEQ ID NO: 78 ou SEQ ID NO: 239, CDR-L2 tem a seqüência dadaem SEQ ID NO: 79 ou SEQ ID NO: 240 e CDR-L3 tem a seqüênciadada em SEQ ID NO: 80 ou SEQ ID NO: 241.
26. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende três CDRs, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que(a) CDR-H1 é SEQ ID NO: 245, CDR-H2 é SEQ ID NO:-246 e CDR-H3 é SEQ ID NO: 247 ou(b) CDR-H1 é SEQ ID NO: 269, CDR-H2 é SEQ ID NO:270 e CDR-H3 é SEQ ID NO: 271.
27. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende três CDRs, CDR-Ll, CDR-L2 e CDR-L3, em que(a) CDR-Ll é SEQ ID NO: 78, CDR-L2 é SEQ ID NO: 79e CDR-L3 é SEQ ID NO: 80; ou(b) CDRL1 é SEQ ID NO: 239, CDR-L2 é SEQ ID NO:-240 e CDR-L3 é SEQ ID NO: 241.
28. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende seis CDRs, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-Ll, CDR-L2 eCDR-L3, em que(a) CDR-H1 é SEQ ID NO: 245, CDR-H2 é SEQ ID NO:-246, CDR-H3 é SEQ ID NO: 247, CDR-Ll.é SEQ ID NO: 78, CDR-L2é SEQ ID NO: 79 e CDR-L3 é SEQ ID NO: 80; ou(b) CDR-H1 é SEQ ID NO: 269, CDR-H2 é SEQ ID NO:-270, CDR-H3 é SEQ ID NO: 271, CDR-Ll é SEQ ID NO: 239, CDR-L2 é SEQ ID NO: 240 e CDR-L3 é SEQ ID NO: 241.
29. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom qualquer uma das reivindicações 24 a 28, CARACTERIZADOpelo fato de que é um anticorpo.
30. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 2 9, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende uma cadeia pesada em que a dita cadeia pesada com-preende um polipeptideo tendo pelo menos 85% de identidadecom a seqüência dada em SEQ ID NO: 333; SEQ ID NO: 378; SEQID NO: 327; SEQ ID NO: 329; ou SEQ ID NO: 366.
31. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende uma cadeia leve em que a dita cadeia leve compreendeum polipeptideo tendo pelo menos 85% de identidade com a se-qüência dada em SEQ ID NO: 332; SEQ ID NO: 376; SEQ ID NO:-314; SEQ ID NO: 328; ou SEQ ID NO: 364.
32. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 2 9, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende tanto uma cadeia pesada como uma cadeia leve em que(a) a cadeia pesada compreende um polipeptideotendo pelo menos 85% de identidade com a seqüência dada emSEQ ID NO: 333 e a cadeia leve compreende um polipeptideotendo pelo menos 85% de identidade com a seqüência dada emSEQ ID NO: 332, ou(b) a cadeia pesada compreende um polipeptideotendo pelo menos 8 5% de identidade com a seqüência dada emSEQ ID NO: 378 e a cadeia leve compreende um polipeptideotendo pelo menos 8 5% de identidade com a seqüência dada emSEQ ID NO: 376; ou(c) a cadeia pesada compreende um polipeptideotendo pelo menos 85% de identidade com a seqüência dada emSEQ ID NO: 327 e a cadeia leve compreende um polipeptideotendo pelo menos 85% de identidade com a seqüência dada emSEQ ID NO: 314; ou(d) a cadeia pesada compreende um polipeptideotendo pelo menos 85% de identidade com a seqüência dada emSEQ ID NO: 329 e a cadeia leve compreende um polipeptideotendo pelo menos 85% de identidade com a seqüência dada emSEQ ID NO: 328; ou(c) a cadeia pesada compreende um polipeptideotendo pelo menos 85% de identidade com a seqüência dada emSEQ ID NO: 366 e a cadeia leve compreende um polipeptideotendo pelo menos 85% de identidade com a seqüência dada emSEQ ID NO: 364.
33. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom qualquer uma das reivindicações 24 a 32, CARACTERIZADOpelo fato de que compreende uma região constante de cadeialeve e/ou de cadeia pesada.
34. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende a região constante de IgG4 ou de IgG2.
35. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma cadeia pesada quecompreende as CDRs Hl, H2 e H3 e compreende um polipeptideotendo a seqüência proporcionada na SEQ ID NO: 137 ou uma va-riante desta na qual as ditas CDRs são pelo menos 75% idên-ticas às SEQ ID NO: 245, 246 e 247, respectivamente, e umacadeia leve compreendendo as CDRs Ll, L2, e L3 e compreen-dendo um polipeptideo que tem a seqüência proporcionada emSEQ ID NO: 133 ou uma variante desta, na qual as ditas CDRssão pelo menos 75% idênticas às SEQ ID NO: 78, 79 e 80, res-pectivamente.
36. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma cadeia pesada quecompreende as CDRs Hl, H2 e H3 e compreende um polipeptideotendo a seqüência proporcionada na SEQ ID NO: 145 ou 392 ouuma variante destas, na qual as CDRs são pelo menos 75%idênticas às SEQ ID NO: 245, 246 e 247, respectivamente, euma cadeia leve compreendendo as CDRs Ll, L2, e L3 e compre-endendo um polipeptideo que tem a seqüência proporcionada emSEQ ID NO: 141 ou uma variante desta, na qual as ditas CDRssão pelo menos 75% idênticas às SEQ ID NO: 78, 79 e 80, res-pectivamente.
37. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma cadeia pesada quecompreende as CDRs Hl, H2 e H3 e compreende um polipeptideotendo a seqüência proporcionada na SEQ ID NO: 335 ou uma va-riante desta na qual as CDRs são pelo menos 75% idênticas àsSEQ ID NO: 269, .270 e 271, respectivamente, e uma cadeialeve compreendendo as CDRs Ll, L2, e L3 e compreendendo umpolipeptideo que tem a seqüência proporcionada em SEQ ID NO:-334 ou uma variante desta, na qual as ditas CDRs são pelomenos 75% idênticas às SEQ ID NO: 239, 240 e 241, respecti-vamente.
38. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma cadeia pesada quecompreende as CDRs Hl, H2 e H3 e compreende um polipeptideotendo a seqüência proporcionada na SEQ ID NO: 331 ou uma va-riante desta na qual as ditas CDRs são pelo menos 75% idên-ticas às SEQ ID NO: 269, 270 e 271, respectivamente, e umacadeia leve compreendendo as CDRs LI, L2, e L3 e compreen-dendo um polipeptideo que tem a seqüência proporcionada emSEQ ID NO: 330 ou uma variante desta, na qual as ditas CDRssão pelo menos 75% idênticas à SEQ ID NO: 239, 240 e 241,respectivamente.
39. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma cadeia pesada quecompreende as CDRs Hl, H2 e H3 e compreende um polipeptideotendo a seqüência proporcionada na SEQ ID NO: 345 ou 396 ouuma variante destas na qual as ditas CDRs são pelo menos 75%idênticas às SEQ ID NO: 269, 270 e 271, respectivamente, euma cadeia leve compreendendo as CDRs LI, L2, e L3 e compre-endendo um polipeptideo que tem a seqüência proporcionada emSEQ ID NO: 341 ou uma variante desta, na qual as ditas CDRssão pelo menos 75% idênticas à SEQ ID NO: 239, 240 e 241,respectivamente.
40. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma cadeia pesada quecompreende um polipeptideo tendo a seqüência proporcionadaem SEQ ID NO: 137, e uma cadeia leve que compreende um poli-peptideo tendo a seqüência proporcionada em SEQ ID NO: 133.
41. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma cadeia pesada quecompreende um polipeptideo tendo a seqüência proporcionadaem SEQ ID NO: 145 ou 392, e uma cadeia leve que compreendeum polipeptideo tendo a seqüência proporcionada em SEQ IDNO: 141.
42. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma cadeia pesada quecompreende um polipeptideo tendo a seqüência proporcionadaem SEQ ID NO: 335, e uma cadeia leve que compreende um poli-peptideo tendo a seqüência proporcionada em SEQ ID NO: 334.
43. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma cadeia pesada quecompreende um polipeptideo tendo a seqüência proporcionadaem SEQ ID NO: 331, e uma cadeia leve que compreende um poli-peptideo tendo a seqüência proporcionada em SEQ ID NO: 330.
44. Agente de ligação de esclerostina,CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma cadeia pesada quecompreende um polipeptideo tendo a seqüência proporcionadaem SEQ ID NO: 345 ou 396, e uma cadeia leve que compreendeum polipeptideo tendo a seqüência proporcionada em SEQ IDNO: 341.
45. Agente de ligação de esclerostina, de acordocom qualquer uma das reivindicações 24 a 44, CARACTERIZADOpelo fato de que é anexado ao mesmo uma ou mais moléculasefetoras ou repórteres.
46. Seqüência de polinucleotideos isolada,CARACTERIZADA pelo fato de que codifica o agente de ligaçãode esclerostina conforme definido em qualquer uma das rei-vindicações 24 a 44.
47. Vetor de clonagem ou de expressão,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma ou mais se-qüências de polinucleotideos conforme definidas na reivindi-cação 46.
48. Vetor, de acordo com a reivindicação 47,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos uma se-qüência dada em SEQ ID NO: 134, 136, 138, 140, 142, 144,-146, 148, 308, 310, 312, 342, 344, 346, 348, 349, 365, 367,-373, 375, e 379.
49. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato deque compreende um ou mais vetores de clonagem ou de expres-são .conforme definidos na reivindicação 47 ou 48.
50. Processo para a produção do agente de ligaçãode esclerostina conforme definido em qualquer uma das rei-vindicações 24 a 44, CARACTERIZADO pelo fato de que compre-ende cultivar a célula hospedeira conforme definida na rei-vindicação 49 e isolar o agente de ligação de esclerostina.
51. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelofato de que compreende um agente de ligação de esclerostinaconforme definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 45em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ouveiculo farmaceuticamente aceitável.
52. Composição farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 51, CARACTERIZADA pelo fato de que compreendeadicionalmente outros ingredientes ativos.
53. Agente de ligação de esclerostina conforme de-finido em qualquer uma das reivindicações 24 a 45 ou umacomposição farmacêutica conforme definida na reivindicação-51 ou 52, CARACTERIZADO pelo fato de ser para uso no trata-mento ou profilaxia de um distúrbio patológico que é mediadopor esclerostina ou que está associado a um nivel aumentadode esclerostina.
54. Método para tratar um distúrbio relacionado aosso em um paciente mamífero, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende proporcionar a um paciente que necessite de taltratamento uma composição farmacêutica conforme definida nareivindicação 22.
55. Método para tratar um distúrbio relacionado aosso em um paciente mamifero, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende proporcionar a um paciente que necessite de taltratamento uma composição farmacêutica conforme definida nareivindicação 23.
56. Método para tratar um distúrbio relacionado aosso em um paciente mamifero, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende proporcionar a um paciente que necessite de taltratamento uma composição farmacêutica conforme definida nareivindicação 51.
57. Método, de acordo com a reivindicação 54,CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio relacionado aosso é pelo menos um de acondroplasia, disostose cleidocra-niana, encondromatose, displasia fibrosa, Doença de Gaucher,raquitismo hipofosfatêmico, sindrome de Marfan, exotoses he-reditárias múltiplas, neurofibromatose, osteogênese imper-feita, osteopetrose, osteopoiquilose, lesões escleróticas,pseudoartrose, osteomielite pirogênica, doença periodontal,perda óssea induzida por fármaco antiepiléptico, hiperpara-tiroidismo primário e secundário, sindromes de hiperparati-roidismo familiar, perda óssea induzida por imponderabilida-de, osteoporose em homens, perda óssea pós-menopausa, osteo-artrite, osteodistrofia renal, distúrbios infiltrantes ós-seos, perda óssea oral, osteonecrose do maxilar, doença dePaget juvenil, melorreostose, doenças ósseas metabólicas,mastocitose, anemia/doença das células falciformes, perdaóssea relacionada a transplante de órgão, perda óssea rela-cionada a transplante do rim, lúpus eritematoso sistêmico,espondilite anquilosante, epilepsia, artritide juvenil, ta-lassemia, mucopolissacaridose, Doença de Fabry, Sindrome deTurner, Sindrome de Down, Sindrome de Klinefelter, lepra,Doença de Perthes, escoliose idiopática adolescente, doençainflamatória multissistêmica de inicio infantil, Sindrome deWinchester, Doença de Menkes, Doença de Wilson, doença ósseaisquêmica (tal como doença de Legg-Calve-Perthes, osteoporo-se migratória regional), estados anêmicos, condições causa-das por esteróides, perda óssea induzida por glicocorticói-des, perda óssea induzida por heparina, distúrbios da medulaóssea, escorbuto, desnutrição, deficiência de cálcio, osteo-porose, osteopenia, alcoolismo, doença hepática crônica, es-tado pós-menopausa, condições inflamatórias crônicas, artri-te reumatóide, doença inflamatória do intestino, colite ul-cerativa, colite inflamatória, doença de Crohn, oligomenor-réia, amenorréia, gravidez, diabetes melito, hipertireoidis-mo, distúrbios da tireóide, distúrbios da paratireóide, do-ença de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, imobilização oudesuso, sindrome de distrofia simpática do reflexo, osteopo-rose regional, osteomalacia, perda óssea associada à reposi-ção de articulação, perda óssea associada ao HIV, perda ós-sea associada à perda de hormônio do crescimento, perda ós-sea associada à fibrose cistica, perda óssea associada àquimioterapia, perda óssea induzida por tumor, perda óssearelacionada a câncer, perda óssea por ablação hormonal, mie-loma múltiplo, perda óssea induzida por fármaco, anorexianervosa, perda óssea facial associada a doenças, perda ósseacraniana associada a doenças, perda óssea do maxilar associ-ada a doenças, perda óssea do crânio associada a doenças,perda óssea associada ao envelhecimento, perda óssea facialassociada ao envelhecimento, perda óssea craniana associadaao envelhecimento, perda óssea do maxilar associada ao enve-lhecimento, e perda óssea do crânio associada ao envelheci-mento e perda óssea associada à viagem espacial.
58. Método, de acordo com a reivindicação 55,CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio relacionado aosso é pelo menos um de acondroplasia, disostose cleidocra-niana, encondromatose, displasia fibrosa, Doença de Gaucher,raquitismo hipofosfatêmico, sindrome de Marfan, exotoses he-reditárias múltiplas, neurofibromatose, osteogênese imper-feita, osteopetrose, osteopoiquilose, lesões escleróticas,pseudoartrose, osteomielite pirogênica, doença periodontal,perda óssea induzida por fármaco antiepiléptico, hiperpara-tiroidismo primário e secundário, sindromes de hiperparati-roidismo familiar, perda óssea induzida por imponderabilida-de, osteoporose em homens, perda óssea pós-menopausa, ostéo-artrite, osteodistrofia renal, distúrbios infiltrantes ós-seos, perda óssea oral, osteonecrose do maxilar, doença dePaget juvenil, melorreostose, doenças ósseas metabólicas,mastocitose, anemia/doença das células falciformes, perdaóssea relacionada a transplante de órgão, perda óssea rela-cionada a transplante do rim, lúpus eritematoso sistêmico,espondilite anquilosante, epilepsia, artritide juvenil, ta-lassemia, mucopolissacaridose, Doença de Fabry, Sindrome deTurner, Sindrome de Down, Sindrome de Klinefelter, lepra,Doença de Perthes, escoliose idiopática adolescente, doençainflamatória multissistêmica de inicio infantil, Sindrome deWinchester, Doença de Menkes, Doença de Wilson, doença ósseaisquêmica (tal como doença de Legg-Calve-Perthes, osteoporo-se migratória regional), estados anêmicos, condições causa-das por esteróides, perda óssea induzida por glicocorticói-des, perda óssea induzida por heparina, distúrbios da medulaóssea, escorbuto, desnutrição, deficiência de cálcio, osteo-porose, osteopenia, alcoolismo, doença hepática crônica, es-tado pós-menopausa, condições inflamatórias crônicas, artri-te reumatóide, doença inflamatória do intestino, colite ul-cerativa, colite inflamatória, doença de Crohn, oligomenor-réia, amenorréia, gravidez, diabetes melito, hipertireoidis-mo, distúrbios da tireóide, distúrbios da paratireóide, do-ença de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, imobilização oudesuso, sindrome de distrofia simpática do reflexo, osteopo-rose regional, osteomalacia, perda óssea associada à reposi-ção de articulação, perda óssea associada ao HIV, perda ós-sea associada à perda de hormônio do crescimento, perda ós-sea associada à fibrose cistica, perda óssea associada àquimioterapia, perda óssea induzida por tumor, perda óssearelacionada a câncer, perda óssea por ablação hormonal, mie-loma múltiplo, perda óssea induzida por fármaco, anorexianervosa, perda óssea facial associada a doenças, perda ósseacraniana associada a doenças, perda óssea do maxilar associ-ada a doenças, perda óssea do crânio associada a doenças,perda óssea associada ao envelhecimento, perda óssea facialassociada ao envelhecimento, perda óssea craniana associadaao envelhecimento, perda óssea do maxilar associada ao enve-lhecimento, perda óssea do crânio associada ao envelhecimen-to e perda óssea associada à viagem espacial.
59. Método, de acordo com a reivindicação 56,CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio relacionado aosso é pelo menos um de acondroplasia, disostose cleidocra-niana, encondromatose, displasia fibrosa, Doença de Gaucher,raquitismo hipofosfatêmico, sindrome de Marfan, exotoses he-reditárias múltiplas, neurofibromatose, osteogênese imper-feita, osteopetrose, osteopoiquilose, lesões escleróticas,pseudoartrose, osteomielite pirogênica, doença periodontal,perda óssea induzida por fármaco antiepiléptico, hiperpara-tiroidismo primário e secundário, sindromes de hiperparati-roidismo familiar, perda óssea induzida por imponderabilida-de, osteoporose em homens, perda óssea pós-menopausa, osteo-artrite, osteodistrofia renal, distúrbios infiltrantes ós-seos, perda óssea oral, osteonecrose do maxilar, doença dePaget juvenil, melorreostose, doenças ósseas metabólicas,mastocitose, anemia/doença das células falciformes, perdaóssea relacionada a transplante de órgão, perda óssea rela-cionada a transplante do rim, lúpus eritematoso sistêmico,espondilite anquilosante, epilepsia, artritide juvenil, ta-lassemia, mucopolissacaridose, Doença de Fabry, Sindrome deTurner, Sindrome de Down, Sindrome de Klinefelter, lepra,Doença de Perthes, escoliose idiopática adolescente, doençainflamatória multissistêmica de inicio infantil, Sindrome deWinchester, Doença de Menkes, Doença de Wilson, doença ósseaisquêmica (tal como doença de Legg-Calve-Perthes, osteoporo-se migratória regional), estados anêmicos, condições causa-das por esteróides, perda óssea induzida por glicocorticói-des, perda óssea induzida por heparina, distúrbios da medulaóssea, escorbuto, desnutrição, deficiência de cálcio, osteo-porose, osteopenia, alcoolismo, doença hepática crônica, es-tado pós-menopausa, condições inflamatórias crônicas, artri-te reumatóide, doença inflamatória do intestino, colite ul-cerativa, colite inflamatória, doença de Crohn, oligomenor-réia, amenorréia, gravidez, diabetes melito, hipertireoidis-mo, distúrbios da tireóide, distúrbios da paratireóide, do-ença de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, imobilização oudesuso, sindrome de distrofia simpática do reflexo, osteopo-rose regional, osteomalacia, perda óssea associada à reposi-ção de articulação, perda óssea associada ao HIV, perda ós-sea associada à perda de hormônio do crescimento, perda ós-sea associada à fibrose cistica, perda óssea associada àquimioterapia, perda óssea induzida por tumor, perda óssearelacionada a câncer, perda óssea por ablação hormonal, mie-loma múltiplo, perda óssea induzida por fármaco, anorexianervosa, perda óssea facial associada a doenças, perda ósseacraniana associada a doenças, perda óssea do maxilar associ-ada a doenças, perda óssea do crânio associada a doenças,perda óssea associada ao envelhecimento, perda óssea facialassociada ao envelhecimento, perda óssea craniana associadaao envelhecimento, perda óssea do maxilar associada ao enve-lhecimento, perda óssea do crânio associada à envelhecimentoe perda óssea associada à viagem espacial.
60. Método para aumentar pelo menos um de formaçãoóssea, teor mineral ósseo, massa óssea, densidade mineralóssea, qualidade óssea, e resistência óssea em um mamifero,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao ma-mifero uma composição farmacêutica conforme definida da rei-vindicação 22.
61. Método para aumentar pelo menos um de formaçãoóssea, teor mineral ósseo, massa óssea, densidade mineralóssea, qualidade óssea, e resistência óssea em um mamifero,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao ma-mifero uma composição farmacêutica conforme definida da rei-vindicação 23.
62. Método para aumentar pelo menos um de formaçãoóssea, teor mineral ósseo, massa óssea, densidade mineralóssea, qualidade óssea, e resistência óssea em um mamifero,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao ma-mifero uma composição farmacêutica conforme definida da rei-vindicação 51.
63. Método para aperfeiçoar o resultado em um ma-mifero que está se submetendo a um ou mais de um procedimen-to ortopédico, procedimento dental, cirurgia de implante,reposição de articulação, enxerto ósseo, cirurgia cosméticaóssea e regeneração óssea tal como cicatrização de fraturaóssea, cicatrização de não união, cicatrização de união de-morada e reconstrução facial, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende administrar ao dito mamifero uma composição far-macêutica conforme definida na reivindicação 22, antes, du-rante e/ou depois do dito procedimento, reposição, enxerto,cirurgia ou regeneração.
64. Método para aperfeiçoar o resultado em um ma-mifero que está se submetendo a um ou mais de um procedimen-to ortopédico, procedimento dental, cirurgia de implante,reposição de articulação, enxerto ósseo, cirurgia cosméticaóssea e regeneração óssea tal como cicatrização de fraturaóssea, cicatrização de não união, cicatrização de união de-morada e reconstrução facial, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende administrar ao dito mamifero uma composição far-macêutica conforme definida na reivindicação 23, antes, du-rante e/ou depois do dito procedimento, reposição, enxerto,cirurgia ou regeneração.
65. Método para aperfeiçoar o resultado em um ma-mifero que está se submetendo a um ou mais de um procedimen-to ortopédico, procedimento dental, cirurgia de implante,reposição de articulação, enxerto ósseo, cirurgia cosméticaóssea e regeneração óssea tal como cicatrização de fraturaóssea, cicatrização de não união, cicatrização de união de-morada e reconstrução facial, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende administrar ao dito mamifero uma composição far-macêutica conforme definida na reivindicação 55, antes, du-rante e/ou depois do dito procedimento, reposição, enxerto,cirurgia ou regeneração.
66. Anticorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que odito anticorpo é Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-ID, Ab-1, Ab-2, Ab-3,Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-1 1, Ab-12,Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab--21, Ab-22, Ab-23, ou Ab-24.
67. Kit para diagnóstico, CARACTERIZADO pelo fatode que compreende um agente de ligação de esclerostina con-forme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 3, 9 a-12, e 14 a 20.
68. Kit para diagnóstico, CARACTERIZADO pelo fatode que compreende um anticorpo conforme definido na reivin-dicação 6.
69. Kit para diagnóstico, CARACTERIZADO pelo fatode que compreende um anticorpo conforme definido na reivin-dicação 21.
70. Kit para diagnóstico, CARACTERIZADO pelo fatode que compreende um anticorpo conforme definido na reivin-dicação 29.
71. Polipeptideo, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende pelo menos um de SEQ ID Nos: 39, 40, 41, 42, 43,-44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,-59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104,-105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116,-237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248,-249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260,-261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272,-273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284,-285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296,-297, 298, 351, 352, 353, 358, 359, e 360.
72. Polipeptideo, de acordo com a reivindicação-71, CARACTERIZADO pelo fato de estar conjugado a pelo menosum de Fc, PEG, albumina, e transferrina.
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