KR101483470B1 - 연속 발효에 의한 유산의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모의 배양액을 평균 세공 지름이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만인 다공성막으로 여과 처리하고, 여액으로부터 생산물을 회수하는 동시에 미여과액을 상기 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한 발효 원료를 상기 배양액에 추가하는 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법에 의해 장기간 안정하고 또한 저비용으로 발효에 의한 유산의 생산 효율을 현저하게 향상시키는 것이 가능해진다.
Description
본 발명은 유산 생산 능력이 있는 효모를 고차 배수체로 함으로써 효모의 배양 및 발효를 안정화시켜 장기간 효율적인 유산의 생산을 가능하게 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법에 관한 것이다.
발효법은 크게 배치 발효법(Batch 발효법) 및 유가 발효법(Fed-Batch 발효법)과 연속 발효법으로 분류할 수 있다. 배치 발효법 및 유가 발효법은 설비적으로는 간소해서 단시간에 배양이 종료되기 때문에 잡균 오염에 의한 피해가 적은 이점이 있다. 그렇지만, 시간의 경과와 함께 배양액 중의 생산물 농도가 높아지면 침투압 또는 생산물 저해 등의 영향에 의해 생산성 및 수율이 저하되는 문제점이 있다. 그 때문에 장시간에 걸쳐 안정하고 고수율인 동시에 고생산성을 유지하는 것이 곤란하다. 연속 발효법은 발효조 안에서 목적 물질이 고농도로 축적되는 것을 회피함으로써 장기간에 걸쳐 고수율인 동시에 고생산성을 유지할 수 있는 이점이 있지만, 연속 발효법에 의한 배양을 장기간 안정하게 계속시키는 것은 매우 곤란하여 연구가 거듭되고 있다.
연속 발효법에 있어서의 제안으로, 미생물이나 배양 세포를 분리막으로 여과하고, 여액으로부터 생산물을 회수함과 동시에 여과한 미생물이나 배양 세포를 배양액에 유지 또는 환류시킴으로써 배양액 중의 미생물이나 세포 농도를 높게 유지하는 방법이 있다.
예컨대, 세라믹스 막을 사용한 연속 발효 장치에 있어서, 연속 발효하는 기술이 개시되어 있다(특허문헌 1~3). 그러나, 개시된 기술은 세라믹스 막의 눈막힘에 의한 여과 유량이나 여과 효율의 저하에 문제가 있고, 눈막힘 방지를 위해 반대 세정 등을 행하고 있다.
또한, 숙신산의 연속 발효에 의한 제조방법(특허문헌 5)이 개시되어 있다. 이 기술에서는 막 분리에 있어서, 높은 여과압(약 200kPa)이 채용되어 있다. 높은 여과압은 비용적으로도 불리할 뿐만 아니라 여과 처리에 있어서 미생물이나 세포가 압력에 의해 물리적인 데미지를 받기 때문에 미생물이나 세포를 연속적으로 배양액으로 되돌리는 연속 발효법에 있어서는 적절하지 않다. 또한, 특허문헌 5에서는 연속 발효를 장기간 계속시키기 위한 제안으로서 분리막이나 여과압 등의 기술이 개시되어 있지만, 연속 발효 시간은 300시간 정도이며, 더욱 장기간 연속 배양을 계속시키는 방법의 제안이 소망되고 있다.
한편, 유기산의 제조에 사용되는 미생물의 검토로는 산에 대한 내성이 강한 효모를 이용한 검토가 열심히 행해져 있다(비특허문헌 1 및 2). 효모에는 염색체가 1세트밖에 존재하지 않는 1배체 효모 이외에 염색체를 복수 세트 갖는 고차 배수체가 존재한다. 고차 배수체 효모는 주로 빵 효모나 양조용 효모로서 사용되고 있다(특허문헌 6~8). 이들은 식료나 음료의 생산에 사용되어 풍미의 향상이나 제조 과정의 개량의 목적을 위하여 사용되고 연속 배양에 이용된 기술은 없다.
또한, 고차 배수체를 사용한 유산의 제조방법이 개시되어 있다(특허문헌 9~12). 이들은 유산 합성 유전자의 수를 증가시키기 위해서 고차 배수체를 이용하고 있지만, 모두 Fed-Batch 발효법에서의 배양이며, 또한 배양 시간도 100시간 이내로 단시간이며, 막을 이용한 연속 발효의 기재는 없다.
그 밖에 영양 요구성을 갖지 않는 영양 비요구성 효모를 사용한 유산 생산에 대해서도 보고되어 있지만(특허문헌 13), 이것도 배양 시간은 100시간 미만이며, 발효법도 Fed-Batch 발효법만이 개시되어 있다.
이와 같이, 생산성을 높이는 연속 발효법과, 발효에 이용하는 미생물은 따로따로 검토가 진척되어 왔다. 발효법으로서 유리한 연속 발효법으로 미생물을 배양했을 때에는 배양과 함께 여과압이 높아져 장기간 계속하는 것이 불가능해지거나 배양의 장기화와 함께 유산의 생산성이 저하하는 등 양자의 이점을 충분히 발휘하는 것은 어려운 현상이 있었다. 그래서, 이들 문제를 해결하고 장기간 안정하게 유산을 생산 가능한 연속 발효 기술의 개발이 소망되어 있었다.
Biotechnology Progress, 11, 294-298(1995)
Journal of fermentation and bioengineering, 86, 284-289(1988)
본 발명의 목적은 장시간에 걸쳐 안정하게 유산의 고생산성을 유지할 수 있는 연속 발효법에 의한 유산의 제조방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 예의 연구한 결과, 연속 발효에 있어서 유산 생산 효모가 장기간 안정하게 증식을 반복하면서 유산의 고생산성을 유지하기 위해서는 유산 생산 능력을 갖는 효모를 고차 배수체로 함으로써 장기간 유산의 고생산성을 유지시킬 수 있는 것을 찾아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 다시 말해, 본 발명은 이하와 같은 구성을 갖는다.
(1) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모의 배양액을 평균 세공(細孔) 지름이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만의 다공성막으로 여과 처리하고, 여액으로부터 생산물을 회수하는 동시에 미여과액을 상기 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한 발효 원료를 상기 배양액에 추가하는 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법.
(2) (1)에 있어서, 다공성막의 막간 차압을 0.1kPa 이상 20kPa 미만의 범위로 하여 여과 처리하는 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법.
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 고차 배수체 효모는 2배체인 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법.
(4) (1)~(3) 중 어느 하나에 있어서, 고차 배수체 효모는 영양 비요구성인 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법.
(5) (1)~(4) 중 어느 하나에 있어서, 연속 발효의 유산 대(對) 당(糖) 수율은 70% 이상인 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법.
(6) (1)~(5) 중 어느 하나에 있어서, 연속 발효의 배양액 중의 유산 축적 농도는 40g/L 이상인 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법.
(7) (1)~(6) 중 어느 하나에 있어서, 연속 발효의 유산 생산 속도는 7.5g/L/h 이상인 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법.
(8) (5)~(7) 중 어느 하나에 있어서, 연속 발효를 400시간 이상 계속시키는 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법.
(9) (1)~(8) 중 어느 하나에 있어서, 고차 배수체 효모는 사카로미세스(saccharomyces) 속에 속하는 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법.
(10) (1)~(9) 중 어느 하나에 있어서, 고차 배수체 효모는 사카로미세스 세레비시에(saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법.
(발명의 효과)
본 발명에 따르면, 고차 배수체 효모를 사용함으로써 장시간에 걸쳐 안정하게 소망의 발효 생산물인 유산의 고생산성을 유지하는 연속 발효가 가능해지고, 유산을 저비용으로 안정하게 생산하는 것도 가능해진다.
도 1은 본 발명에 사용되는 막분리형 연속 발효 장치의 하나의 실시형태를 설명하기 위한 개요 측면도이다.
도 2는 본 발명에 사용되는 다른 막분리형 연속 발효 장치의 하나의 실시형태를 설명하기 위한 개요 측면도이다.
도 3은 본 발명에 사용되는 분리막 엘리먼트의 하나의 실시형태를 설명하기 위한 개요 사시도이다.
도 4는 본 발명에 사용되는 다른 분리막 엘리먼트의 예를 설명하기 위한 개요 사시도이다.
도 5는 유산 탈수소 효소 유전자 발현용 벡터이다.
도 6은 실시예 13과 실시예 14 및 비교예 16과 비교예 17의 유산 축적 농도의 변화이다.
도 7은 실시예 13과 실시예 14 및 비교예 16과 비교예 17의 유산 대 당 수율의 변화이다.
도 8은 실시예 13과 실시예 14 및 비교예 16과 비교예 17의 유산 생산 속도의 변화이다.
도 9는 실시예 15와 실시예 16 및 비교예 18과 비교예 19의 유산 축적 농도의 변화이다.
도 10은 실시예 15와 실시예 16 및 비교예 18과 비교예 19의 유산 대 당 수율의 변화이다.
도 11은 실시예 15와 실시예 16 및 비교예 18과 비교예 19의 유산 생산 속도의 변화이다.
도 2는 본 발명에 사용되는 다른 막분리형 연속 발효 장치의 하나의 실시형태를 설명하기 위한 개요 측면도이다.
도 3은 본 발명에 사용되는 분리막 엘리먼트의 하나의 실시형태를 설명하기 위한 개요 사시도이다.
도 4는 본 발명에 사용되는 다른 분리막 엘리먼트의 예를 설명하기 위한 개요 사시도이다.
도 5는 유산 탈수소 효소 유전자 발현용 벡터이다.
도 6은 실시예 13과 실시예 14 및 비교예 16과 비교예 17의 유산 축적 농도의 변화이다.
도 7은 실시예 13과 실시예 14 및 비교예 16과 비교예 17의 유산 대 당 수율의 변화이다.
도 8은 실시예 13과 실시예 14 및 비교예 16과 비교예 17의 유산 생산 속도의 변화이다.
도 9는 실시예 15와 실시예 16 및 비교예 18과 비교예 19의 유산 축적 농도의 변화이다.
도 10은 실시예 15와 실시예 16 및 비교예 18과 비교예 19의 유산 대 당 수율의 변화이다.
도 11은 실시예 15와 실시예 16 및 비교예 18과 비교예 19의 유산 생산 속도의 변화이다.
본 발명은 유산을 생산하는 능력을 갖는 효모를 배양하는 발효에 있어서, 고차 배수체 효모를 사용함으로써 유산의 고생산성을 장기간 유지하면서 연속 발효법에 의해 유산을 제조하는 방법으로, 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모의 배양액을 분리막으로 여과하고, 여액으로부터 생산물을 회수하고, 또한 미여과액을 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한 발효 원료를 배양액에 추가하는 연속 발효에 있어서 분리막으로서 평균 세공 지름이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만인 다공성막을 사용하여 여과 처리하는 유산의 제조방법이다.
우선, 본 발명에 있어서 분리막으로서 사용되는 다공성막에 대해서 설명한다. 본 발명에 있어서의 다공성막은 바람직하게는 피처리수의 수질이나 용도에 따른 분리 성능과 투수 성능을 갖는 것이다. 다공성막은 저지 성능 및 투수 성능이나 분리 성능, 예컨대 내오염성의 점에서 다공질 수지층을 포함하는 다공성막인 것이 바람직하다.
다공질 수지층을 포함하는 다공성막은 바람직하게는 다공질 기재의 표면에 분리 기능층으로서 작용하는 다공질 수지층을 가지고 있다. 여기서 다공질 기재 재료는 유기재료 및/또는 무기재료 등으로 이루어지고, 바람직하게는 유기재료, 보다 바람직하게는 유기 섬유가 사용된다. 그 중에서도 바람직한 다공질 기재는 셀룰로오스 섬유, 셀룰로오스 트리아세테이트 섬유, 폴리에스테르 섬유, 폴리프로필렌 섬유 및 폴리에틸렌 섬유 등의 유기 섬유를 사용하여 이루어진 직포 또는 부직포이며, 보다 바람직하게는 밀도의 제어가 비교적 용이해서 제조도 용이하고 저렴한 부직포가 사용된다. 상기 다공질 기재의 두께는 50㎛ 이상 3000㎛ 이하인 것이 다공질 수지층을 지지해서 분리막에 강도를 주는데 바람직하다. 또한, 다공질 기재에 다공질 수지층이 침투하고 있어도, 다공질 기재에 다공질 수지층이 침투하지 않고 있어도 어느 것이어도 좋고, 용도에 따라서 선택된다.
다공질 수지층은 유기 고분자막을 적합하게 사용할 수 있다. 유기 고분자막의 재질로서는, 예컨대 폴리에틸렌계 수지, 폴리프로필렌계 수지, 폴리염화비닐계 수지, 폴리불화비닐리덴계 수지, 폴리술폰계 수지, 폴리에테르술폰계 수지, 폴리아크릴로니트릴계 수지, 폴리올레핀계 수지, 셀룰로오스계 수지, 셀룰로오스트리아세테이트계 수지 등을 들 수 있고, 이들 수지를 주성분으로 하는 수지의 혼합물이어도 좋다. 여기서 주성분이란 그 성분이 50중량% 이상, 바람직하게는 60중량% 이상 함유하는 것을 말한다. 특히 유기 고분자막의 재질로서는 용액에 의한 제막이 용이해서 물리적 내구성이나 내약품성에도 우수한 폴리염화비닐계 수지, 폴리불화비닐리덴계 수지, 폴리술폰계 수지, 폴리에테르술폰계 수지, 폴리아크릴로니트릴계 수지, 폴리올레핀계 수지 또는 이들 수지를 주성분으로 하는 수지의 혼합물이 바람직하고, 폴리불화비닐리덴계 수지 또는 그것을 주성분으로 하는 수지의 혼합물이 보다 바람직하게 사용된다.
여기서, 폴리불화비닐리덴계 수지로서는 불화비닐리덴의 단독 중합체 또는 불화비닐리덴과 공중합 가능한 비닐계 단량체의 공중합체가 바람직하게 사용된다. 불화비닐리덴과 공중합 가능한 비닐계 단량체로서는 테트라플루오로에틸렌, 헥사플루오로프로필렌 및 염화 3불화에틸렌 등이 예시된다.
또한, 폴리 올레핀계 수지로서는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 염소화 폴리에틸렌 또는 염소화 폴리프로필렌을 들 수 있지만, 염소화 폴리에틸렌이 바람직하게 사용된다.
본 발명에 사용되는 다공성막은 표면의 평균 세공 지름이 0.01㎛ 이상인 것이 중요하다. 다공성막의 표면의 평균 세공 지름이 0.01㎛ 이상이면 발효에 사용되는 균체에 의한 눈막힘이 일어나기 어렵고, 또한 여과 성능이 장기간 안정하게 계속되는 성능을 갖는다. 또한, 다공성막의 평균 세공 지름이 0.01㎛ 이상이면 고차 배수체 효모가 리크될 일이 없는 높은 배제율과, 높은 투수성을 양립시킬 수 있고, 투수성을 장시간 유지하는 것이 보다 높은 정밀도와 재현성을 갖고 실시할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서의 다공성막의 표면의 평균 세공 지름이 0.01㎛ 미만일 경우, 다공성막의 투수 성능이 저하되고, 막이 오염되지 않고 있어도 효율적인 운전을 할 수 없어질 경우가 있어 다공성막의 평균 세공 지름이 0.01㎛ 이상, 바람직하게는 0.02㎛ 이상, 보다 바람직하게는 0.04㎛ 이상일 경우에는 효율적인 운전이 가능하다.
본 발명에 있어서의 다공성막의 평균 세공 지름은 고차 배수체 효모의 누출, 즉 배제율이 저하되는 문제의 발생을 방지하기 위해서, 또 고차 배수체 효모가 직접 구멍을 막아버리는 것을 막기 위해서 1㎛ 미만인 것이 중요하고, 0.4㎛ 이하가 바람직하고, 0.2㎛ 이하이면 보다 적합하게 실시할 수 있다. 또한, 고차 배수체 효모가 목적으로 하는 유산 이외의 물질, 예컨대 단백질, 다당류 등 응집하기 쉬운 물질을 생산할 경우가 있고, 또한 배양액 중의 고차 배수체 효모 중 일부가 사멸함으로써 세포의 파쇄물이 생성할 경우가 있어 이들 물질에 의해 다공성막이 폐쇄되는 것을 회피하기 위해서 평균 세공 지름이 0.1㎛ 이하인 것이 더욱 적합하다. 따라서, 본 발명에 사용되는 다공성막의 표면의 평균 세공 지름은 0.4㎛ 이하가 바람직하고, 0.2㎛ 이하가 보다 바람직하고, 0.1㎛ 이하가 특히 바람직하다.
여기서, 본 발명에 있어서의 표면의 평균 세공 지름은 배율 10,000배의 주사형 전자현미경 다공질막 표면의 관찰에 있어서의 9.2㎛×10.4㎛의 범위내에서 관찰할 수 있는 세공 모두의 지름을 측정하고, 평균함으로써 구할 수 있다. 또는, 평균 세공 지름은 막 표면을 주사형 전자현미경을 사용하여 배율 10,000배로 사진 촬영하고, 10개 이상, 바람직하게는 20개 이상의 세공을 무작위로 선택하고, 그들 세공의 지름을 측정하고, 수 평균하여 구할 수도 있다. 세공이 원상이 아닐 경우, 화상 처리 장치 등에 의해 세공이 갖는 면적과 동일한 면적을 갖는 원(등가원)을 구하고, 등가원 지름을 세공의 지름으로 하는 방법에 의해 구한다.
본 발명에 사용되는 다공성막의 표면의 평균 세공 지름은 세공 지름의 표준편차가 작은, 즉 세공 지름의 크기가 일치하고 있는 것이 균일한 투과액을 얻을 수 있고, 표준편차 σ는 0.1㎛ 이하인 것이 바람직하다. 또한, 발효 운전 관리가 용이해지므로 평균 세공 지름의 표준편차는 작으면 작을수록 바람직하다. 평균 세공 지름의 표준편차 σ는 상술된 배율 10,000배의 주사형 전자현미경 다공막 표면의 관찰에 있어서의 9.2㎛×10.4㎛의 범위내에서 관찰할 수 있는 세공수를 N으로 하고, 측정한 각각의 지름을 Xk로 하고, 세공 직경의 평균을 X(ave)로 한 하기 (식 1)에 의해 산출된다.
본 발명에 사용되는 다공성막에 있어서는 배양액의 투과성이 중요한 성능 중 하나이다. 다공성막의 투과성의 지표로서 사용전 다공성막의 순수 투과 계수를 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 다공성막의 순수 투과 계수는 음료 용수를 투석막(Toray Industries, Inc. 제품의 필트라이저 B2-1.5H)으로 여과한 것을 원수로 하여 25℃, 헤드 높이 1m로 투수량을 측정해 산출했을 때, 2×10-9㎥/㎡/s/pa 이상인 것이 바람직하고, 순수 투과 계수가 2×10-9㎥/㎡/s/pa 이상 6×10-7㎥/㎡/s/pa 이하이면 실용적으로 충분한 투과 수량이 얻어진다. 보다 바람직하게는 2×10-9㎥/㎡/s/pa 이상 1×10-7㎥/㎡/s/pa 이하이다.
본 발명에 사용되는 다공성막에 있어서의 막표면 조도란 표면에 대하여 수직 방향의 높이의 평균치이다. 막 표면 조도는 분리막 표면에 부착된 고차 배수체 효모가 교반이나 순환 펌프에 의해 액류에 의한 막면 세정 효과로 박리하기 쉽게 하기 위한 인자의 하나이다. 다공성막의 표면 조도는 0.1㎛ 이하인 것이 바람직하다. 막표면 조도가 0.1㎛ 이하이면 막에 부착된 고차 배수체 효모가 박리되기 쉽고, 고차 배수체 효모의 여과에 있어서 막표면에서 발생하는 전단력을 저하시킬 수 있고, 효모의 파괴가 억제되어 다공성막의 눈막힘도 억제됨으로써 장기간 안정한 여과가 가능하며, 또한 보다 낮은 막간 차압으로 연속 발효가 실시 가능하기 때문에 막이 눈막힘된 경우라도 높은 막간 차압으로 운전했을 경우에 비해 세정 회복성이 양호하다. 한편, 눈막힘을 억제함으로써 안정한 연속 발효가 가능해지므로 다공성막의 표면 조도는 작으면 작을수록 바람직하다.
여기서, 막표면 조도는 하기 원자간력 현미경 장치(AFM)를 사용하여 하기 조건으로 측정된다.
장치: 원자간력 현미경 장치(Digital Instruments 제품의 Nanoscope IIIa)
조건
탐침: SiN 캔틸레버(Digital Instruments 제품)
주사 모드 컨택트 모드(기중 측정)
수중 탭핑 모드(수중 측정)
주사 범위: 10㎛, 25㎛사방(기중 측정)
5㎛, 10㎛사방(수중 측정)
주사 해상도: 512×512
시료 조제: 측정시에 막 샘플은 상온에서 에탄올에 15분 침지한 후 RO수중에 24시간 침지하고 세정한 후 풍건한다.
막 표면 조도(drough)는 상기 원자간력 현미경 장치(AFM)에 의해 각 포인트의 Z축 방향의 높이로부터 하기 (식2)에 의해 산출한다.
본 발명에 사용되는 다공성막의 형상은 평막이어도 중공사(中孔絲)막이어도 좋다. 다공성막의 형상이 평막인 경우, 그 평균 두께는 용도에 따라서 선택되지만, 바람직하게는 20㎛ 이상 5000㎛ 이하이며, 보다 바람직하게는 50㎛ 이상 2000㎛ 이하이다. 다공성막이 중공사막인 경우, 중공사의 내경은 바람직하게는 200㎛ 이상 5000㎛ 이하이며, 막 두께는 바람직하게는 20㎛ 이상 2000㎛ 이하이다. 또한, 유기 섬유 또는 무기 섬유를 통상으로 한 직물이나 편물을 중공사의 내부에 포함하고 있어도 좋다.
본 발명에 사용되는 다공성막의 작성법에 대해서 예시하여 설명한다.
우선, 다공성막의 바람직한 실시형태의 하나인 평막의 작성법에 대해서 설명한다. 다공질 기재의 표면에 수지와 용매를 포함하는 원액의 피막을 형성하는 동시에 그 원액을 다공질 기재에 함침시킨다. 그 후, 피막을 갖는 다공질 기재의 피막측 표면만을 비용매를 포함하는 응고욕과 접촉시켜서 수지를 응고시킴과 아울러 다공질 기재의 표면에 다공질 수지층을 형성한다.
원액은 수지를 용매에 용해시켜서 조제한다. 원액의 온도는 제막성의 관점에서 통상 5~120℃의 범위내에서 선정하는 것이 바람직하다. 용매는 수지를 용해하는 것이며, 수지에 작용해서 그들이 다공질 수지층을 형성하는 것을 촉진시키는 것이다. 용매로서는 N-메틸피롤리디논(NMP), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸술폭시드(DMSO), N-메틸-2-피롤리돈, 테트라히드로푸란, 테트라메틸요소, 인산 트리메틸, 시클로헥사논, 이소포론, γ-부티로락톤, 메틸이소아밀케톤, 프탈산 디메틸, 프로필렌글리콜메틸에테르, 프로필렌카보네이트, 디아세톤알콜, 글리세롤트리아세테이트, 아세톤 및 메틸에틸케톤 등을 사용할 수 있다. 그 중에서도 수지의 용해성이 높은 N-메틸피롤리디논(NMP), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸술폭시드(DMSO)를 바람직하게 사용할 수 있다. 이들을 단독으로 사용해도 좋고, 2종류 이상을 혼합하여 사용해도 좋다.
또한, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 글리세린 등의 용매 이외의 성분을 용매에 첨가해도 좋다. 용매에 비용매를 첨가할 수도 있다. 비용매는 수지를 용해하지 않는 액체이다. 비용매는 수지의 응고 속도를 제어해서 세공의 크기를 제어하도록 작용한다. 비용매로서는 물이나 메탄올 및 에탄올 등의 알콜류를 사용할 수 있다. 그 중에서도 비용매로서 비용의 점에서 물이나 메탄올이 바람직하다. 용매 이외의 성분 및 비용매는 혼합물이어도 좋다.
원액에는 개공제를 첨가할 수도 있다. 개공제는 응고욕에 침지되었을 때에 추출되어 수지층을 다공질로 하는 작용을 갖는 것이다. 개공제를 첨가함으로써 평균 세공 지름의 크기를 제어할 수 있다. 개공제는 응고욕에의 용해성이 높은 것이 바람직하다. 개공제로서는, 예컨대 염화칼슘이나 탄산칼슘 등의 무기염을 사용할 수 있다. 또한, 개공제로서 폴리에틸렌글리콜이나 폴리프로필렌글리콜 등의 폴리옥시알킬렌류나, 폴리비닐알콜, 폴리비닐부티랄 및 폴리아크릴산 등의 수용성 고분자 화합물이나, 글리세린을 사용할 수 있다.
이어서, 다공성막의 바람직한 실시형태의 하나인 중공사막의 작성법에 대해서 설명한다. 중공사막은 수지와 용매로 이루어진 원액을 2중관식 구금(口金)의 외측관으로부터 토출하는 동시에 중공부 형성용 유체를 2중관식 구금의 내측관으로부터 토출시켜 냉각욕 중에서 냉각 고화해서 제작할 수 있다.
원액은 상술된 평막의 작성법에서 설명한 수지를 20중량% 이상 60중량% 이하의 농도로 상술된 평막의 생성법에서 설명한 용매에 용해시킴으로써 조제할 수 있다. 또한, 중공부 형성용 유체에는 보통 기체 또는 액체를 사용할 수 있다. 또한, 얻어진 중공사막의 외표면에 새로운 다공성 수지층을 코팅(적층)할 수도 있다. 적층은 중공사막의 성질, 예컨대 친수·소수성, 세공 지름 등을 소망하는 성질로 변화시키기 위해서 행할 수 있다. 적층되는 새로운 다공성 수지층은 수지를 용매에 용해시킨 원액을 비용매를 포함하는 응고욕과 접촉시켜서 수지를 응고시킴으로써 제작할 수 있다. 그 수지의 재질은, 예컨대 상술된 유기 고분자막의 재질과 같은 것이 바람직하게 사용될 수 있다. 또한, 적층 방법은 특별히 한정되지 않고, 원액에 중공사막을 침지해도 좋고, 중공사막의 표면에 원액을 도포해도 좋고, 적층 후 부착된 원액의 일부를 긁어내거나, 에어 나이프를 이용해서 날려버림으로써 적층량을 조제할 수도 있다.
본 발명에 사용되는 다공성막은 수지 등의 부재를 이용해서 중공사막의 중공부를 접착·밀봉하고, 지지체에 설치함으로써 분리막 엘리먼트로 할 수 있다.
본 발명에 사용되는 다공성막은 지지체와 조합시킴으로써 분리막 엘리먼트로 할 수 있다. 지지체로서 지지판을 이용하고, 상기 지지판 중 적어도 한 면에 본 발명에 사용되는 다공성막을 배치한 분리막 엘리먼트는 본 발명에 사용되는 다공성막을 갖는 분리막 엘리먼트의 적합한 실시형태 중 하나이다. 투수량을 크게 하기 위해서 지지판의 양면에 다공성막을 배치하는 것도 분리막 엘리먼트의 바람직한 실시형태이다.
본 발명의 유산의 제조방법에서는 다공성막의 막간 차압을 0.1kPa 이상 20kPa 미만의 범위에서 여과 처리하는 것이 바람직하다. 발효 배양액을 여과하기 위해서 20kPa 이상의 막간 차압으로 여과 처리하면, 압력을 가하기 위한 동력이 필요해서 유산을 제조할 때의 경제효과가 저하된다. 또한, 20kPa 이상의 보다 높은 막간 차압을 가함으로써 연속 발효 배양에 사용되는 고차 배수체 효모가 파쇄될 경우가 있어 유산을 생산하는 능력이 저하된다. 0.1kPa 미만의 막간 차압으로는 여과에 요하는 시간이 걸리고 생산 속도가 저하되어버린다. 여과 압력인 막간 차압이 0.1이상 20kPa 미만의 범위이면 수두차(水頭差)에 의해 막간 차압을 얻을 수 있으므로 특별히 발효조 안을 가압 상태로 유지할 필요가 없고, 유산을 생산하는 능력이 저하되지 않는다. 또한, 특별히 발효조 안을 가압 상태로 유지할 필요가 없으므로 다공성막을 발효조 내부에 설치하는 실시형태도 가능해지고, 발효 장치가 컴팩트화될 수 있는 이점도 얻어진다.
여기서 말하는 막간 차압이란 다공성막에 있어서의 피처리수측과 투과수측의 압력차를 나타낸다. 다공질막의 단위면적당 처리 유량을 일정하게 하는 운전을 실시했을 때에 피처리수를 다공성막에 의해 장기간 계속해서 막 여과하면, 피처리수에 존재하는 오탁 물질이 다공성막의 세공에 흡착되는 것 및 표면에 퇴적되는 것에 기인하여 막이 오염되어진다. 그러나, 막 막힘이 일어나서 막간 차압이 향상하고, 현저하게 처리 유량이 저하하고, 안정한 운전의 계속이 곤란해지기 때문에 막간 차압을 측정하면서 여과하는 것이 바람직하다. 막간 차압의 측정 방법은 다공성막에 있어서의 피처리수측 및 투과수측에 압력계를 설치하여 압력을 측정하고, 그 압력 차를 구함으로써 측정할 수 있다.
이어서, 본 발명에 사용되는 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모에 대해서 설명한다. 본 발명의 유산의 제조방법에서는 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모를 사용함으로써 간편한 조작 조건으로 장시간에 걸쳐 안정하게 소망하는 발효 생산물인 유산의 고생산성을 유지하는 연속 발효가 가능해지고, 유산을 저비용으로 안정하게 생산하는 것이 가능해진다.
고차 배수체 효모란 세포내에 2세트 이상의 염색체를 가지는 효모이다. 고차 배수체 효모는 일반적으로 유전학적 해석에 사용되는 1배체 효모와 비교하면 크고, 그것에 의해 보다 다공질막의 폐쇄가 일어나기 어려워 장기간 배양에 적합하다. 고차 배수체 효모를 사용함으로써 막표면에 발생하는 전단력을 저하시킬 수 있고, 효모의 파괴가 억제되어 다공성막의 눈막힘도 억제되므로 장기간 안정한 여과가 가능하게 되는 동시에 막의 재이용이 가능해지고, 저비용화할 수 있는 이점을 들 수 있다. 또한, 막이 눈막힘된 경우라도 1배체 효모에 비해 세정 회복성이 양호하다. 고차 배수체 효모의 염색체의 세트수에 관해서는 특별히 제한은 없지만, 2세트의 염색체를 가진 2배체 효모가 바람직하다.
고차 배수체 효모는, 예컨대 발효 공업에 있어서 자주 사용되는 빵 효모, 청주 효모, 와인 효모나 맥주 효모 등의 효모 등을 들 수 있다. 사용되는 고차 배수체 효모는 자연 환경으로부터 단리된 것이라도 좋고, 또한 돌연변이나 유전자 조환에 의해 일부 성질이 개변된 것이어도 좋다.
유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모란 유산 탈수소 효소 유전자(이하, LDH라고 함)가 도입된 고차 배수체 효모이다. 유산 탈수소 효소가 도입된 고차 배수체 효모의 작출 방법에 대해서는 특별히 한정은 없지만, 유산 탈수소 효소 유전자가 염색체 상에 도입된 1배체 효모를 고차 배수체화함으로써 염색체당 유전자형을 변화시키지 않고, 유산 탈수소 효소 유전자의 카피수를 간단히 늘리는 것이 가능해지고, 나아가서는 유산 생산 능력을 증강시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서는, 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모가 영양 비요구성이면, 종래보다 영양소가 적은 배지, 즉 저비용의 배지가 사용 가능해지는 동시에 간편한 조작 조건으로 장시간에 걸쳐 안정하게 유산의 고생산성을 유지하는 연속 발효가 가능해지고, 유산을 저비용으로 안정하게 생산하는 것도 가능해지기 때문에 본 발명에 있어서 바람직하게 사용된다.
효모가 갖는 영양 요구성이란 야생형 효모가 갖는 영양 합성 유전자에 어떠한 원인으로 변이가 생기고, 결과로서 상기 영양의 합성 능력을 결손하고 있는 것을 의미한다. 또한, 영양 요구성의 복귀란 상기 영양 요구성의 변이가 다시 야생형 또는 거기에 매우 가까운 상태로 복귀하는 것을 의미한다. 영양 요구성은 주로 유전자 조작 등일 때에 마커로서 사용되기 때문에 영양 요구성 효모는 유전자 조작시에 바람직하게 사용된다.
효모가 영양 요구성을 갖는 경우, 필요로 하는 영양소의 구체예로는 메티오닌, 티로신, 이소류신, 페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 아스파라긴산, 발린, 세린, 아르기닌, 우라실, 아데닌, 리신, 트립토판, 류신, 히스티딘 등이 알려져 있다. 영양 요구성을 나타내는 효모가 갖는 유전자형으로서는 이하의 것을 들 수 있다.
·메티오닌 요구성: met1, met2, met3, met4, met5, met6, met7, met8, met10, met13, met14, met20
·티로신 요구성: tyr1
·이소류신, 발린 요구성: ilv1, ilv2, ilv3, ilv5
·페닐알라닌 요구성: pha2
·글루탐산 요구성: GLU3
·트레오닌 요구성: thr1, thr4
·아스파라긴산 요구성: asp1, asp5
·세린 요구성: ser1, ser2
·아르기닌 요구성: arg1, arg3, arg4, arg5, arg8, arg9, arg80, arg81, arg82, arg84
·우라실 요구성: ura1, ura2, ura3, ura4, ura6
·아데닌 요구성: ade1, ade2, ade3, ade4, ade5, ade6, ade8, ade9, ade12, ADE15
·리신 요구성: lys1, lys2, lys4, lys5, lys7, lys9, lys11, lys13, lys14
·트립토판 요구성: trp1, trp2, trp3, trp4, trp5
·류신 요구성: leu1, leu2, leu3, leu4, leu5
·히스티딘 요구성: his1, his2, his3, his4, his5, his6, his7, his8.
본 발명에 바람직하게 사용되는 영양 비요구성 효모는 상기 영양 요구성을 나타내는 유전자형을 갖지 않거나, 또는 상보되는 효모이다. 또한, 영양 비요구성 효모인 것인가 아닌가의 판정 방법으로는 효모의 최소 배지인 SD 배지(표 1)에 있어서, 생육 가능한지를 가지고 판단 기준으로 할 수 있다.
영양 요구성 효모의 영양 요구성을 복귀시켜서 영양 비요구성 효모를 작출하는 방법으로는 유전자 재조합 방법에 의해 영양 합성 유전자를 도입하고, 영양 요구성을 복귀시키는 방법이나, 또한 다른 영양 요구성을 갖는 효모끼리를 접합, 자낭 형성시켜 목적으로 하는 영양 요구성을 복귀시키는 과정을 반복하고, 최종적으로 영양 요구성을 모두 복귀시켜 영양 비요구성 효모로 하는 방법 등을 들 수 있다.
유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모에 도입되어 있는 LDH로서는 환원형 니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드(NADH)와 피루브산을, 산화형 니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)와 유산으로 변환하는 활성을 가지는 단백질을 코딩하고 있으면 한정되지 않고, 예컨대 유산 대 당 수율이 높은 유산균 유래의 LDH, 포유류 유래의 LDH 또는 양서류 유래의 LDH를 사용할 수 있다. 이 중 호모사피엔스(Homo sapiens) 유래, 및 개구리 유래의 LDH가 바람직하게 사용된다. 또한, 개구리 중에서도 발톱 개구리과(Pipidae)에 속하는 개구리 유래의 LDH를 사용하는 것이 바람직하고, 발톱 개구리과에 속하는 개구리 중에서도 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis) 유래의 LDH를 바람직하게 사용할 수 있다.
상기 LDH에는 유전적 다형성이나, 변이 유발 등에 의한 변이형의 유전자도 포함된다. 여기서 유전적 다형성이란 유전자 상의 자연 돌연변이에 의해 유전자의 염기 배열이 일부 변화하고 있는 것이며, 변이 유발이란 인공적으로 유전자에 변이를 도입하는 것을 말한다. 변이 유발은, 예컨대 부위 특이적 변이 도입용 키트(Mutan-K(TAKARA BIO Inc. 제품))를 사용하는 방법이나, 랜덤 변이 도입용 키트(BD Diversify PCR Random Mutagenesis(CLONTECH 제품))를 사용하는 방법 등이 있다. 또한, 본 발명에 사용되는 LDH는 NADH와 피루브산을 NAD+와 유산으로 변환하는 활성을 가지는 단백질을 코딩하고 있으면 염기 배열의 일부에 결실 또는 삽입이 존재하고 있어도 상관없다.
유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모는 상기 LDH를 효모 염색체 외부에서 유지되는 플라스미드나 YAC 등에 있어서 유지해도 좋지만, 상술한 바와 같이 효모 염색체에 도입하여 유지하는 것이 바람직하다. 효모 염색체에 LDH를 도입하는 방법으로는 특별히 제한은 없지만, 예컨대 일본 특허공개 2008-29329호 공보에 개시되는 방법에 의해 도입할 수 있다. 또한, 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모에 있어서, LDH는 적어도 1개, 바람직하게는 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개 이상, 더욱 바람직하게는 4개 이상 유지하고 있다.
본 발명에 사용되는 발효 원료는 배양되는 효모의 생육을 촉진하고, 목적으로 하는 발효 생산물인 유산을 양호하게 생산시킬 수 있는 것이면 좋고, 예컨대 탄소원, 질소원, 무기염류, 및 필요에 따라 아미노산이나 비타민 등의 유기 미량 영양소를 적당히 함유하는 액체 배지 등이 바람직하게 사용된다. 상기 탄소원으로서는, 예컨대 글루코오스, 수크로오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 락토오스 및 말토오스 등의 당류, 이들 당류를 함유하는 전분 당화액, 감자당밀, 사탕무우당밀, 하이테스트당밀, 사탕수수 주스, 사탕수수 주스 추출물 또는 농축액, 사탕수수 주스로부터 정제 또는 결정화된 원료당, 사탕수수 주스로부터 정제 또는 결정화된 정제당, 또한 아세트산, 푸마르산 등의 유기산, 에탄올 등의 알콜류, 및 글리세린 등이 바람직하게 사용된다. 여기서 당류란 다가 알콜의 최초의 산화 생성물이며, 알데히드기 또는 케톤기를 하나 갖고, 알데히드기를 갖는 당을 알도오스, 케톤기를 갖는 당을 케토오스와 분류되는 탄수화물을 가리키고, 바람직하게는 글루코오스, 수크로오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 락토오스 또는 말토오스이다. 상기 탄소원은 배양 개시시에 일괄하여 첨가해도 좋고, 배양중 분할해서 또는 연속적으로 첨가할 수도 있다.
또한, 상기 질소원으로서는, 예컨대 암모니아 가스, 암모니아수, 암모늄 염류, 요소, 질산염류, 기타 보조적으로 사용되는 유기 질소원, 예컨대 유박류, 대두 가수분해액, 카제인 분해물, 그 외의 아미노산, 비타민류, 옥수수 침지액, 효모 또는 효모 엑기스, 육(肉) 엑기스, 펩톤 등의 펩티드류, 각종 발효 균체 및 그 가수분해물 등이 사용된다.
또한, 상기 무기 염류로서는, 예컨대 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염 및 망간염 등을 적당히 첨가 사용할 수 있다.
또한, 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모가 영양 요구성일 경우에는 그 영양물을 표품(標品) 또는 그것을 함유하는 천연물로서 첨가할 수 있다. 또한, 소포제(消泡劑) 도 필요에 따라 첨가 사용할 수 있다.
유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모의 발효 배양 조건에 대해서는 배양할 수 있는 한에 있어서는 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 pH가 4~8이고 온도가 20~40℃의 범위에서 행해진다. 발효 배양액의 pH는 무기산 또는 유기산, 알칼리성 물질, 또한 요소, 탄산칼슘 및 암모니아 가스 등에 의해 상기 범위내의 미리 정해진 값으로 조절된다.
유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모의 발효 배양에 있어서, 산소의 공급 속도를 올릴 필요가 있으면 공기에 산소를 첨가해서 산소 농도를 21% 이상으로 유지하고, 배양액을 가압하고, 교반 속도를 올리거나, 또는 통기량을 올리는 등의 수단을 이용할 수 있다. 반대로, 산소의 공급 속도를 내릴 필요가 있으면 탄산 가스, 질소 및 아르곤 등 산소를 포함하지 않는 가스를 공기에 혼합해서 공급하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서는, 배양 초기에 Batch 배양 또는 Fed-Batch 배양을 행해서 균체 농도를 높게 한 후에 연속 배양(빼내기)을 개시해도 좋고, 고농도의 균체를 시딩하고, 배양 개시와 함께 연속 배양을 행해도 좋다. 적당한 시기부터 발효 원료액의 공급 및 배양물의 빼내기를 행하는 것이 가능하다. 발효 원료액 공급과 배양물의 빼내기의 개시 시기는 반드시 같을 필요는 없다. 또한, 발효 원료액의 공급과 배양물의 빼내기는 연속적이어도 좋고, 간헐적이어도 좋다. 발효 원료액에는 상기에 나타낸 것과 같은 균체 증식에 필요한 영양소를 첨가하고, 균체 증식이 연속적으로 행하여지도록 하면 좋다.
발효 배양액 중의 균체의 농도는 발효 배양액의 환경이 균체의 증식에 있어서 부적절하게 되어서 사멸하는 비율이 높아지지 않는 범위에서 높은 상태로 유지하는 것이 효율적인 생산성을 얻는 점에서 바람직하고, 일례로서 건조 중량으로서 5g/L 이상으로 유지함으로써 양호한 생산 효율이 얻어진다. 또한, 연속 발효 장치의 운전상 문제나 생산 효율의 저하를 초래하지 않으면, 균체의 농도의 상한치는 특별히 한정되지 않는다.
발효 생산 능력이 있는 신선한 균체를 증식하면서 행하는 연속 배양 조작은 배양 관리상, 통상 단일의 발효 반응조에서 행하는 것이 바람직하다. 그렇지만, 균체를 증식하면서 생산물을 생성하는 연속 배양법이면 발효 반응조의 수는 상관없다. 발효 반응조의 용량이 작은 등의 이유로 복수의 발효 반응조를 사용할 수도 있다. 이 경우, 복수의 발효 반응조를 배관으로 병렬 또는 직렬로 접속해서 연속 배양을 행해도 발효 생산물의 고생산성은 얻어진다.
본 발명에 있어서, 연속 발효가 계속됨이란 발효 원료액의 공급과 배양물의 빼내기가 연속적 또는 간헐적으로 행해져 있는 상태를 나타냈다. 본 발명에 있어서는 연속 발효가 계속되고 있는 기간은 유산이 효율적으로 생산되어 있는 것이 바람직하다. 유산이 효율적으로 생산되어 있다란 유산 축적 농도, 유산 생산 속도, 유산 대 당 수율에 의해 평가하여 그들 중 어느 1개, 바람직하게는 2개, 보다 바람직하게는 모두가 높은 상태인 것이다.
유산 축적 농도란 배양액에 포함되는 유산의 농도이며, 유산 축적 농도가 높은 상태란 유산 축적 농도가 40g/L 이상, 바람직하게는 42g/L, 보다 바람직하게는 44g/L이다.
유산 생산 속도란 단위시간당 생산되는 유산량이며, 유산 생산 속도가 높은 상태란 식 3으로 나타내어지는 유산 생산 속도가 7.5g/L/h 이상, 바람직하게는 8 이상, 보다 바람직하게는 9g/L/h 이상이다.
유산 대 당 수율이란 단위시간당 소비된 탄소원으로 생산된 유산의 양의 비율이며, 유산 대 당 수율이 높은 상태란 식 4에 표시되는 유산 대 당 수율이 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상이다.
본 발명에 의해 제조된 여과·분리 발효액에 포함되는 유산의 분리·정제는 종래 알려져 있는 농축, 증류 및 정석 등의 방법을 조합하여 행할 수 있고, 예컨대 여과·분리 발효액의 pH를 1이하로 하고 나서 디에틸에테르나 아세트산 에틸 등으로 추출하는 방법, 이온 교환 수지에 흡착 세정한 후에 용출하는 방법, 산촉매의 존재 하에서 알콜로 반응시켜서 에스테르로 하여 증류하는 방법, 및 칼슘염이나 리튬염으로서 정석하는 방법, WO2009/004922에 개시되는 나노 여과막과 증류를 조합시킨 분리·정제 방법 등을 들 수 있다.
이어서, 본 발명의 유산의 제조방법에 사용되는 연속 발효 장치의 바람직한 실시형태에 대해서 도를 이용해서 설명한다.
도 1은 본 발명의 연속 발효에 의한 유산의 제조방법에 사용되는 막분리형 연속 발효 장치의 바람직한 예를 설명하기 위한 개요 측면도이다. 도 1은 분리막 엘리먼트가 발효 반응조의 외부에 설치된 대표적인 예이다.
도 1에 있어서, 막분리형 연속 발효 장치는 발효 반응조(1)와 막분리조(12)과 차압 제어 장치(3)로 기본적으로 구성되어 있다. 여기서, 분리막 엘리먼트(2)에는 다공성 분리막이 갖추어져 있다. 이 다공성 분리막으로서는, 예컨대 국제공개 제2002/064240호 팸플렛에 개시되어 있는 분리막, 및 분리막 엘리먼트를 사용하는 것이 적합하다. 또한, 막분리조(12)는 발효 배양액 순환 펌프(11)를 통해서 발효 반응조(1)에 접속되어 있다.
도 1에 있어서, 배지 공급 펌프(7)에 의해 배지를 발효 반응조(1)에 투입하고, 필요에 따라 교반기(5)로 발효 반응조(1) 안의 발효 배양액을 교반하고, 또한 필요에 따라 기체 공급 장치(4)에 의해 필요로 하는 기체를 공급할 수 있다. 이 때, 공급한 기체를 회수 리사이클하여 다시 기체 공급 장치(4)로 공급할 수 있다. 또한, 필요에 따라 pH 센서·제어 장치(9) 및 pH 조정 용액 공급 펌프(8)에 의해 발효액의 pH를 조정하고, 또한 필요에 따라 온도 조절기(10)에 의해 발효 배양액의 온도를 조절함으로써 생산성이 높은 발효 생산을 행할 수 있다. 또한, 장치내의 발효액은 발효액 순환 펌프(11)에 의해 발효 반응조(1)와 막분리조(12) 사이를 순환한다. 발효 생산물을 포함하는 발효 배양액은 분리막 엘리먼트(2)에 의해 미생물과 발효 생산물에 여과·분리되어 장치계로부터 인출할 수 있다.
또한, 여과·분리된 미생물은 장치계내에 머무름으로써 장치계내의 미생물 농도를 높게 유지할 수 있고, 생산성이 높은 발효 생산을 가능하게 하고 있다. 여기서, 분리막 엘리먼트(2)에 의한 여과·분리에는 막분리조(12)의 수면과의 수두차압에 의해 특별한 동력을 사용하지 않고 실시 가능하지만, 필요에 따라 레벨 센서(6) 및 차압 제어 장치(3)에 의해 분리막 엘리먼트(2)의 여과·분리 속도 및 장치계 내의 발효 배양액량을 적당히 조절할 수 있다. 필요에 따라 기체 공급 장치(4)에 의해 필요로 하는 기체를 막분리조(12) 안에 공급할 수 있다. 이 때, 공급한 기체를 회수 리사이클해서 다시 기체 공급 장치(4)로 공급할 수 있다. 분리막 엘리먼트(2)에 의한 여과·분리는 필요에 따라 펌프 등에 의한 흡인 여과 또는 장치계 내를 가압함으로써 여과·분리할 수도 있다. 또한, 배양조에서 연속 발효로 고차 배수체 효모를 배양하고, 필요에 따라 발효조 안에 공급할 수 있다. 배양조에서 고차 배수체 효모를 배양하고, 필요에 따라 발효조 안에 공급함으로써 항상 신선하게 유산의 생산 능력이 높은 고차 배수체 효모에 의한 연속 발효가 가능해지고, 높은 생산 성능을 장기간 유지한 연속 발효가 가능해진다.
이어서, 도 2는 본 발명에 사용되는 것 이외의 막분리형 연속 발효 장치의 예를 설명하기 위한 개요 측면도이다. 본 발명의 유산의 제조방법에 사용되는 연속 발효 장치 중 분리막 엘리먼트가 발효 반응조의 내부에 설치된 대표적인 일례를 도 2의 개요도에 나타낸다.
도 2에 있어서, 막분리형 연속 발효 장치는 발효 반응조(1)와 차압 제어 장치(3)로 기본적으로 구성되어 있다. 발효 반응조(1) 안의 분리막 엘리먼트(2)에는 다공성막이 갖추어져 있다. 이 다공성 분리막으로서는, 예컨대 국제공개 제2002/064240호 팸플렛에 개시되어 있는 분리막, 및 분리막 엘리먼트를 사용할 수 있다. 분리막 엘리먼트에 관해서는 추후에 상세하게 설명한다.
이어서, 도 2의 막분리형 연속 발효 장치에 의한 연속 발효의 형태에 대해서 설명한다. 배지 공급 펌프(7)에 의해 배지를 발효 반응조(1)에 연속적 또는 단속적으로 투입한다. 배지는 투입전에 필요에 따라 가열 살균, 가열 멸균 또는 필터를 사용한 멸균 처리를 행할 수 있다. 발효 생산시에는 필요에 따라 발효 반응조(1) 안의 교반기(5)로 발효 반응조(1) 안의 발효 배양액을 교반한다. 발효 생산시에는 필요에 따라 기체 공급 장치(4)에 의해 필요로 하는 기체를 발효 반응조(1) 안에 공급할 수 있다. 발효 생산시는 필요에 따라 pH 센서·제어 장치(9) 및 pH 조정 용액 공급 펌프(8)에 의해 발효 반응조(1) 안의 발효 배양액의 pH를 조정하고, 필요에 따라 온도 조절기(10)에 의해 발효 반응조(1) 안의 발효 배양액의 온도를 조절함으로써 생산성이 높은 발효 생산을 행할 수 있다. 여기서는 계장·제어 장치에 의한 발효 배양액의 물리화학적 조건의 조절로 pH 및 온도를 예시했지만, 필요에 따라 용존 산소나 ORP의 제어, 온라인 케미컬 센서 등의 분석 장치에 의해 발효 배양액 중의 유산의 농도를 측정하고, 발효 배양액 중의 유산 농도를 지표로 한 물리화학적 조건의 제어를 행할 수 있다. 또한, 배지의 연속적 또는 단속적 투입은 바람직하게는 상기 계장장치에 의한 발효액의 물리화학적 환경의 측정값을 지표로 해서 배지 투입량 및 속도를 적당히 조절한다.
도 2에 있어서, 발효 배양액은 발효 반응조(1) 안에 설치된 분리막 엘리먼트(2)에 의해 균체와 발효 생산물이 여과·분리되어 발효 생산물이 장치계로부터 인출된다. 또한, 여과·분리된 균체가 장치계내에 저류됨으로써 장치계내의 균체 농도를 높게 유지할 수 있고, 생산성이 높은 발효 생산을 가능하게 하고 있다. 여기서, 분리막 엘리먼트(2)에 의한 여과·분리는 발효 반응조(1)의 수면과의 수두차압에 의해 행해지고, 특별한 동력을 사용하지 않고 실시 가능하지만, 필요에 따라 레벨 센서(6) 및 차압 제어 장치(3)에 의해 분리막 엘리먼트(2)의 여과·분리 속도 및 발효 반응조(1) 안의 발효 배양액량을 적당히 조절할 수 있다. 상기 분리막 엘리먼트에 의한 여과·분리에는 필요에 따라 펌프 등에 의한 흡인 여과 또는 장치계내를 가압함으로써 여과·분리할 수도 있다. 또한, 따로 준비한 배양조에서 균체를 배양하고, 필요에 따라 발효조 안에 공급할 수 있다. 배양조에서 균체를 배양하고, 필요에 따라 발효조 안에 공급함으로써 항상 신선한 균체에 의한 연속 발효가 가능해지고, 높은 유산 생산 성능을 장기간 유지한 연속 발효가 가능해진다.
본 발명의 유산의 제조방법에 사용되는 연속 발효 장치로 바람직하게 사용되는 분리막 엘리먼트에 대해서 도면에 근거해서 설명한다. 본 발명의 유산의 제조방법에 사용되는 연속 발효 장치로는 바람직하게는 국제공개 제2002/064240호 팸플렛에 개시되어 있는 분리막 및 분리막 엘리먼트를 사용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 분리막 엘리먼트의 형태는 적합한 형태의 예인 국제공개 제2002/064240호 팸플렛에 개시되어 있는 분리막 및 분리막 엘리먼트를 이하의 도면을 사용하여 그 개략을 설명한다. 도 3은 본 발명에 사용되는 분리막 엘리먼트의 하나의 실시형태를 설명하기 위한 개략 사시도이다.
분리막 엘리먼트는 도 3에 나타낸 바와 같이 강성을 갖는 지지판(13)의 양면에 유로재(14)와 상기 분리막(15)을 이 순서로 배치해서 구성되어 있다. 지지판(13)은 양면에 오목부(16)를 갖고 있다. 분리막(15)은 발효 배양액을 여과한다. 유로재(14)는 분리막(15)으로 여과한 투과수를 효율적으로 지지판(13)에 흘리기 위한 것이다. 지지판(13)에 흐른 투과수는 지지판(13)의 오목부(16)를 통과해 배출 수단인 집수 파이프(17)를 통해서 연속 발효 장치 외부로 인출된다.
이어서, 도 4에 나타내는 다른 실시형태의 분리막 엘리먼트에 대해서 설명한다. 도 4는 본 발명에 사용되는 다른 분리막 엘리먼트의 예를 설명하기 위한 단면 설명도이다.
분리막 엘리먼트는 도 4에 나타낸 바와 같이, 중공사막으로 구성된 분리막속(束)(18)은 상부 수지 밀봉층(19) 및 하부 수지 밀봉층(20)인 다발상으로 접착·고정화되어 있다. 하부 수지 밀봉층(20)에 의한 접착·고정화는 중공사막의 중공부를 밀봉하고 있어 발효 배양액의 누출을 방지하는 구조로 되어 있다. 한편, 상부 수지 밀봉층(19)은 중공사막의 내공을 밀봉하고 있지 않고, 집수 파이프(22)에 투과수가 흐르는 구조로 되어 있다. 이 분리막 엘리먼트는 지지 프레임(21)을 통해서 연속 발효 장치내에 설치하는 것이 가능하다. 분리막속(18)에 의해 여과된 투과수는 중공사막의 중공부를 통과하고, 집수 파이프(22)를 통해서 발효 배양조의 외부에 인출된다. 투과수를 인출하기 위한 동력으로서 수두차압, 펌프, 액체나 기체 등에 의한 흡인 여과 또는 장치계내를 가압하는 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 연속 발효에 의한 유산의 제조방법에 사용되는 연속 발효 장치의 분리막 엘리먼트를 구성하는 부재는 고압 증기 멸균 조작에 내성의 부재인 것이 바람직하다. 발효 장치내가 멸균 가능하면, 연속 발효시에 바람직하지 못한 균체에 의한 오염의 위험을 회피할 수 있어 보다 안정한 연속 발효가 가능해진다. 분리막 엘리먼트를 구성하는 부재는 고압 증기 멸균 조작의 조건인 121℃의 온도로 15분간의 처리에 내성인 것이 바람직하다. 분리막 엘리먼트 부재로서는, 예컨대, 스텐레스, 알루미늄 등의 금속, 폴리아미드계 수지, 불소계 수지, 폴리카보네이트계 수지, 폴리아세탈계 수지, 폴리부틸렌 테레프탈레이트계 수지, PVDF, 변성 폴리페닐렌에테르계 수지 및 폴리술폰계 수지 등의 수지를 바람직하게 선정할 수 있다.
본 발명의 연속 발효에 의한 유산의 제조방법에 사용되는 연속 발효 장치로는 분리막 엘리먼트를 발효조 밖에 설치해도 좋고, 발효 반응조 안에 설치해도 좋다. 분리막 엘리먼트를 발효 반응조 밖에 설치할 경우에는 따로 막분리조를 마련해서 그 내부에 분리막 엘리먼트를 설치할 수 있고, 발효 반응조와 막분리조 사이를 발효 배양액을 순환시키면서 분리막 엘리먼트에 의해 발효 배양액을 연속적으로 여과할 수 있다.
본 발명의 연속 발효에 의한 유산의 제조방법에 사용되는 연속 발효 장치에서 막분리조는 고압 증기 멸균이 가능한 것이 바람직하다. 막분리조가 고압 증기 멸균 가능함으로써 잡균에 의한 오염 회피가 용이해진다.
실시예
이하, 실시예를 이용해서 본 발명을 설명한다.
(참고예 1) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모의 작성
사카로미세스 세레비시에 NBRC10505주에 아프리카 발톱 개구리 유래의 L-유산 탈수소 효소 유전자(이하, XLDH라고도 함)를 도입해서 얻어진 유산을 생산하는 능력을 갖는 효모를 고차 배수체화함으로써 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모를 작성했다. 또한, 이하에 자세히 설명하는 바와 같이, 영양 요구성의 복귀나 온도 감수성 변이의 성질을 부여했다. 고차 배수체 효모를 작성하기 위해서 사용된 효모와, 이하에 설명되는 방법으로 작성한 효모를 표 2에 나타냈다. 이하에, LDH의 삽입, 온도 감수성 변이의 부여, 영양 요구성의 복귀 방법에 대해서 상세한 순서를 설명한다.
(그 1) 아프리카 발톱 개구리 유래의 L-LDH(XLDH) 발현 벡터의 구축
XLDH(배열번호 1)의 클로닝은 PCR법에 의해 행했다. PCR에는 아프리카 발톱 개구리의 신장 유래의 cDNA 라이브러리(STRATAGENE 제품)로부터 부속의 프로토콜에 따라 조제한 파지미드 DNA를 주형으로 했다.
PCR 증폭 반응에는 KOD-Plus polymerase(TOYOBO CO., LTD. 제품)를 사용하고, 반응 버퍼, dNTPmix 등은 부속물을 사용했다. 상기한 바와 같이 부속의 프로토콜에 따라 조제한 파지미드 DNA를 50ng/샘플, 프라이머를 50pmol/샘플, 및 KOD-Plus polymerase를 1유닛/샘플이 되도록 50㎕의 반응계로 조제했다. 반응 용액을 PCR 증폭 장치 iCycler(BIO-RAD 제품)에 의해 94℃의 온도로 5분 열변성시킨 후 94℃(열변성): 30초, 55℃(프라이머 아닐링): 30초, 68℃(상보쇄의 신장): 1분을 1사이클로 해서 30사이클 행하고, 그 후 4℃의 온도로 냉각했다. 또한, 유전자 증폭용 프라이머(배열번호 2,3)에는 5말단측에는 SalI 인식 배열, 3말단측에는 NotI 인식 배열이 각각 부가되도록 하여 제작했다.
PCR 증폭 단편을 정제하고, 말단을 T4 polynucleotide Kinase(TAKARA BIO Inc. 제품)에 의해 인산화 후 pUC118 벡터(제한 효소 HincII로 절단하고, 절단면을 탈인산화 처리한 것)에 라이게이션했다. 라이게이션은 DNA Ligation Kit Ver.2( TAKARA BIO Inc. 제품)를 이용해 행했다. 라이게이션 용액을 대장균 DH5α의 컨피턴트 세포(TAKARA BIO Inc. 제품)로 형질 전환하고, 항생 물질 안피시린을 50μg/㎖를 포함하는 LB 플레이트에 뿌려서 밤새 배양했다. 생육한 콜로니에 대해서, 미니 프렙으로 플라스미드 DNA를 회수하고, 제한 효소 SalI 및 NotI로 절단하고, 아프리카 발톱 개구리 유래의 LDH 유전자가 삽입되어 있는 플라스미드를 선발했다. 이들 일련의 조작은 모두 부속의 프로토콜에 따라 행했다.
XLDH가 삽입된 pUC118 벡터를 제한 효소 SalI 및 NotI로 절단하고, DNA 단편을 1% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분리, 정법에 따라 XLDH를 포함하는 단편을 정제했다. 얻어진 단편을 도 5에 나타낸 발현 벡터 pTRS11의 XhoI/NotI 절단 부위에 라이게이션하고, 상기와 같은 방법으로 플라스미드 DNA를 회수하고, 제한 효소 XhoI 및 NotI로 절단함으로써 XLDH가 삽입된 발현 벡터인 pTRS102를 선발했다.
상기한 바와 같이 하여 얻어진 pTRS102를 XLDH의 주형으로 하여 PDC1 ·SED1·TDH3 유전자좌에 LDH를 삽입하는 방법을 이하에 설명한다.
(그 2) 효모 염색체 PDC1 유전자좌에의 LDH의 삽입
pTRS102를 증폭 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 4,5)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 XLDH 및 TDH3 터미네이터 배열을 포함하는 1.3kb의 PCR 단편을 증폭했다. 여기서 배열번호 4는 PDC1 유전자의 개시 코돈으로부터 상류 60bp에 상당하는 배열이 부가되도록 디자인했다.
이어서, 플라스미드 pTRS424를 증폭 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 6,7)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 효모 선택 마커인 TRP1 유전자를 포함하는 1.2kb의 PCR 단편을 증폭했다. 여기서, 배열번호 7은 PDC1 유전자의 종지 코돈으로부터 하류 60bp에 상당하는 배열이 부가되도록 디자인했다.
각각의 DNA 단편을 1% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분리, 상법에 따라 정제했다. 여기서 얻어진 각 1.3kb 단편, 1.2kb 단편을 혼합한 것을 증폭 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 4,7)를 프라이머 세트로 한 PCR법에 의해 5말단·3말단에 각각 PDC1 유전자의 상류·하류 60bp에 상당하는 배열이 부가되었고, XLDH, TDH3 터미네이터 및 TRP1 유전자가 연결된 약 2.5kb의 PCR 단편을 증폭했다.
상기 PCR 단편을 1% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분리, 상법에 따라 정제후, 형질 전환 조작을 행하고, 트립토판 비첨가 배지에서 배양함으로써 XLDH가 염색체상의 PDC1 유전자 프로모터의 하류에 도입되어 있는 형질 전환주를 선택했다.
상기한 바와 같이 하여 얻어진 형질 전환주가 아프리카 발톱 개구리 유래의 L-LDH가 염색체상의 PDC1 유전자 프로모터의 하류에 도입되어 있는 효모인 것의 확인은 하기와 같이 행했다. 우선, 형질 전환주의 게놈 DNA를 게놈 DNA 추출 키트 Gen 토루쿤(TAKARA BIO Inc. 제품)에 의해 조제하고, 이것을 증폭 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 7,8)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 약 2.8kb의 증폭 DNA 단편이 얻어진 것으로 확인했다. 또한, 비형질 전환주에서는 상기 PCR에 의해 약 2.1kb의 증폭 DNA 단편이 얻어졌다.
(그 3) 효모 염색체 SED1 유전자좌에의 LDH의 삽입
SED1 유전자좌에의 도입은 참고예 1에서 제작한 pTRS102를 증폭 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 5,9)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 아프리카 발톱 개구리 유래의 LDH 유전자 및 TDH3 터미네이터 배열을 포함하는 1.3kb의 PCR 단편을 증폭했다. 여기서 배열번호 9는 SED1 유전자의 개시 코돈으로부터 상류 60bp에 상당하는 배열이 부가되도록 디자인했다.
이어서, 플라스미드 pRS423을 증폭 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 6,10)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 효모 선택 마커인 HIS3 유전자를 포함하는 약 1.3kb의 PCR 단편을 증폭했다. 여기서, 배열번호 10은 SED1 유전자의 종지 코돈으로부터 하류 60bp에 상당하는 배열이 부가되도록 디자인했다.
각각의 DNA 단편을 1% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분리, 상법에 따라 정제했다. 여기서 얻어진 2종류의 약 1.3kb 단편을 혼합한 것을 증폭 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 9,10)를 프라이머 세트로 한 PCR법에 의해 5말단·3말단에 각각 SED1 유전자의 상류·하류 60bp에 상당하는 배열이 부가되었고, 아프리카 발톱 개구리 유래의 LDH 유전자, TDH3 터미네이터 및 HIS3 유전자가 연결된 약 2.6kb의 PCR 단편을 증폭했다.
상기 PCR 단편을 1% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분리, 상법에 따라 정제후, 형질 전환 조작을 행하고, 히스티딘 비첨가 배지에서 배양함으로써 XLDH가 염색체상의 SED1 유전자 프로모터의 하류에 도입되어 있는 형질 전환주를 선택했다.
상기한 바와 같이 하여 얻어진 형질 전환주가 XLDH가 염색체상의 SED1 유전자 프로모터의 하류에 도입되어 있는 효모인 것의 확인은 하기와 같이 행했다. 우선, 형질 전환주의 게놈 DNA를 게놈 DNA추출 키트 Gen 토루쿤(TAKARA BIO Inc. 제품)에 의해 조제하고, 이것을 증폭 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 11,12)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 약 2.9kb의 증폭 DNA 단편이 얻어지는 것으로 확인했다. 또한, 비형질 전환주에서는 상기 PCR에 의해 약 1.4kb의 증폭 DNA 단편이 얻어진다.
(그 4) 효모 염색체 TDH3 유전자좌에의 LDH의 도입
TDH3 유전자좌에의 도입은 pTRS102의 TDH3 터미네이터를 ADH1 터미네이터로 변경한 플라스미드를 제작했다.
우선, NBRC10505주로부터 게놈 DNA추출 키트 "Gen 토루쿤"(TAKARA BIO Inc. 제품)에 의해 게놈 DNA를 추출하고, 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 올리고뉴클레오티드(배열번호 13,14)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 ADH1 프로모터를 포함하는 PCR 단편을 증폭했다. 여기서, 배열번호 13에는 5말단측에는 NotI 인식 배열, 배열번호 14에는 3말단측에는 HindIII 인식 배열이 각각 부가되도록 해서 제작했다.
PCR 증폭 단편을 정제하고, 말단을 T4 polynucleotide Kinase(TAKARA BIO Inc. 제품)에 의해 인산화 후 pUC118 벡터(제한 효소 HincII로 절단하고, 절단면을 탈인산화 처리한 것)에 라이게이션했다. 라이게이션 용액을 대장균 DH5α의 컨피턴트 세포(TAKARA BIO Inc. 제품)로 형질 전환하고, 항생 물질 안피시린 50μg/㎖를 포함하는 LB 플레이트에 뿌려서 밤새 배양했다. 생육한 콜로니에 대해서, 미니 프렙으로 플라스미드 DNA를 회수하고, 제한 효소 NotI 및 HindIII로 절단하고, ADH1 터미네이터가 삽입되어 있는 플라스미드를 선발했다. 제작한 플라스미드를 pUC118-ADH1t로 한다.
이어서, pUC118-ADH1t를 제한 효소 NotI 및 HindIII로 절단하고, DNA 단편을 1% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분리, 상정법에 따라 ADH1 터미네이터를 포함하는 단편을 정제했다. 얻어진 ADH1 터미네이터를 포함하는 단편을 pTRS102의 NotI/HindIII 절단 부위에 라이게이션하고, 상기와 같은 방법으로 플라스미드 DNA를 회수하고, 제한 효소 NotI 및 HindIII로 절단함으로써 TDH3 터미네이터가 ADH1 터미네이터로 변경된 플라스미드를 선발했다. 이후, 이렇게 하여 제작한 플라스미드를 pTRS150으로 한다.
이 pTRS150을 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 15,16)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 개구리 유래의 L-LDH 유전자 및 ADH1 터미네이터 배열을 포함하는 1.3kb의 PCR 단편을 증폭했다. 여기서, 배열번호 16의 프라이머는 TDH3 유전자의 개시 코돈으로부터 상류 60bp에 상당하는 배열이 부가되도록 디자인했다.
이어서, 플라스미드 pRS426을 증폭 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 17,18)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 효모 선택 마커인 URA3 유전자를 포함하는 1.2kb의 PCR 단편을 증폭했다. 여기서, 배열번호 18의 프라이머는 TDH3 유전자의 종지 코돈으로부터 하류 60bp에 상당하는 배열이 부가되도록 디자인했다.
각각의 PCR 단편을 1% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분리, 상법에 따라 정제했다. 여기서 얻어진 각 1.3kb단편, 1.2kb 단편을 혼합한 것을 증폭 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 16,18)를 프라이머 세트로 한 PCR법에 의해 XLDH, ADH1 터미네이터 및 URA3 유전자가 연결된 약 2.5kb의 PCR 단편을 증폭했다.
상기 PCR 단편을 1% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분리, 상법에 따라 정제후, 형질 전환 조작을 행하고, 우라실 비첨가 배지에서 배양함으로써 XLDH가 염색체상의 TDH3 유전자 프로모터의 하류에 도입되어 있는 형질 전환주를 선택했다.
상기한 바와 같이 하여 얻어진 형질 전환주가 XLDH가 염색체상의 TDH3 유전자 프로모터의 하류에 도입되어 있는 효모인 것의 확인은 하기와 같이 행했다. 우선, 형질 전환주의 게놈 DNA를 게놈 DNA 추출 키트 "Gen 토루쿤"(TAKARA BIO Inc. 제품)에 의해 조제하고, 이것을 증폭 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 19, 20)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 약 2.8kb의 증폭 DNA 단편이 얻어짐으로써 확인했다. 또한, 비형질 전환주에서는 상기 PCR에 의해 약 2.1kb의 증폭 DNA 단편이 얻어진다.
(그 5) PDC5 유전자가 온도 감수성 변이를 갖는 효모의 취득
온도 감수성 변이의 부여는 일본 특허공개 2008-048726호 공보에 기재되어 있는 pdc5 유전자에 온도 감수성 변이를 갖는 효모 SW015주와 온도 감수성 변이를 부여하고 싶은 효모를 접합시키는 것에 의해 얻었다. 상기 2배체 효모를 자낭 형성 배지에서 자낭 형성시켜 마이크로 매니퓰레이터로 자낭을 해부하고, 각각의 1배체 세포를 취득하고, 각각 1배체 세포에 관한 영양 요구성을 조사함으로써 취득한 1배체 세포 중에서 PDC1 유전자, SED1 유전자, TDH1 유전자좌 중 어느 하나에 XLDH가 삽입되고, 또한 pdc5 유전자에 온도 감수성 변이를 갖는(34℃에서 생육 불능) 주를 선택했다.
이어서, 영양 요구성의 복귀 방법을 설명한다.
(그 6) 리신 영양 요구성 복귀주의 작성
리신 요구성을 복귀시킬 경우에는 이하의 방법을 사용했다. Funakoshi Corporation 제품의 BY4741의 게놈 DNA를 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 21,22)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 LYS2 유전자의 전반 약 2kb의 PCR 단편을 증폭시켰다. 상기 PCR 단편을 1% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분리, 상법에 따라 정제 후, 형질 전환 조작을 행하고, LYS2 유전자의 앰버 변이를 해제했다. 리신 비첨가 배지에서 배양함으로써 리신 합성 능력이 복귀한 형질 전환주를 선택했다.
상기한 바와 같이 하여 얻어진 형질 전환주가 LYS2 유전자의 앰버 변이를 해제한 효모인 것의 확인은 하기와 같이 행했다. 우선, 얻어진 형질 전환체와 야생형 LYS2 유전자를 갖는 20GY77주를 접합시켜 2배체 세포를 얻었다. 상기 2배체 세포를 자낭 형성 배지에서 자낭 형성시켰다. 마이크로 매니퓰레이터로 자낭을 해부하고, 각각의 1배체 세포를 취득하고, 각각 1배체 세포의 영양 요구성을 조사했다. 취득한 1배체 세포 모두가 리신 합성 능력을 가지고 있는 것을 확인했다. 또한, LYS2 유전자의 변이가 해제되지 않고 리신 합성 능력이 복귀했을 경우에는 상기에서 얻어진 1배체 세포 중 리신 합성 능력을 가지지 않는 세포가 얻어진다.
(그 7) 류신 영양 요구성 복귀주의 취득
류신 요구성을 복귀시킬 경우에는 이하의 방법을 사용했다. 플라스미드 PRS425를 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 23,24)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 LEU2 유전자의 PCR 단편 약 2kb를 증폭시켰다. 상기 PCR 단편을 1% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분리, 상법에 따라 정제 후 형질 전환 조작을 행하고, LEU2 유전자의 변이를 해제했다. 류신 비첨가 배지에서 배양함으로써 류신 합성 능력이 복귀한 형질 전환주를 선택했다.
상기한 바와 같이 하여 얻어진 형질 전환주가 LEU2 유전자의 변이를 해제한 효모인 것의 확인은 하기와 같이 행했다. 우선, 얻어진 형질 전환체와 야생형의 LEU2 유전자를 갖는 사카로미세스 세레비시에 20GY7주를 접합시켜 2배체 세포를 얻었다. 상기 2배체 세포를 자낭 형성 배지에서 자낭 형성시켰다. 마이크로 매니퓰레이터로 자낭을 해부하고, 각각의 1배체 세포를 취득하고, 각각 1배체 세포의 영양 요구성을 조사했다. 취득한 1배체 세포 모두가 류신 합성 능력을 가지고 있는 것을 확인했다. 한편, LEU2 유전자의 변이가 해제되지 않고 류신 합성 능력이 복귀했을 경우에는 상기에서 얻어진 1배체 세포 중 류신 합성 능력을 가지지 않는 세포가 얻어진다.
(그 8) 아데닌 영양 요구성 복귀주의 취득
아데닌 요구성을 복귀시킬 경우에는 이하의 방법을 사용했다. 플라스미드 PRS422를 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 25,26)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 ADE2 유전자의 PCR 단편 약 2kb를 증폭시켰다. 상기 PCR 단편을 1% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분리, 상법에 따라 정제 후 형질 전환 조작을 행하고, ADE2 유전자의 변이를 해제했다. 아데닌 비첨가 배지에서 배양함으로써 아데닌 합성 능력이 복귀한 형질 전환주를 선택했다.
상기한 바와 같이 하여 얻어진 형질 전환주가 AED2 유전자의 변이를 해제한 효모인 것의 확인은 하기와 같이 행했다. 우선, 얻어진 형질 전환체와 야생형 ADE2 유전자를 갖는 사카로미세스 세레비시에 20GY7주를 접합시켜 2배체 세포를 얻었다. 상기 2배체 세포를 자낭 형성 배지에서 자낭 형성시켰다. 마이크로 매니퓰레이터로 자낭을 해부하고, 각각의 1배체 세포를 취득하고, 각각 1배체 세포의 영양 요구성을 조사했다. 취득한 1배체 세포 모두가 아데닌 합성 능력을 가지고 있는 것을 확인했다. 또한, ADE2 유전자의 변이가 해제되지 않고 아데닌 합성 능력이 복귀했을 경우에는 상기에서 얻어진 1배체 세포 중 아데닌 합성 능력을 가지지 않는 세포가 얻어진다.
(그 9) 우라실 영양 요구성 복귀주의 취득
우라실 요구성을 복귀시킬 경우에는 이하의 방법을 사용했다. 플라스미드 pRS426을 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(배열번호 27,28)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 URA3 유전자의 PCR 단편 약 2kb를 증폭시켰다. 상기 PCR 단편을 1% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분리, 상법에 따라 정제 후 형질 전환 조작을 행하고, URA3 유전자의 변이를 해제했다. 우라실 비첨가 배지에서 배양함으로써 우라실 합성 능력이 복귀한 형질 전환주를 선택했다.
상기한 바와 같이 하여 얻어진 형질 전환주가 URA3 유전자의 변이를 해제한 효모인 것의 확인은 하기와 같이 행했다. 우선, 얻어진 형질 전환체와 야생형의 URA3 유전자를 갖는 사카로미세스 세레비시에 20GY7주를 접합시켜 2배체 세포를 얻었다. 상기 2배체 세포를 자낭 형성 배지에서 자낭 형성시켰다. 마이크로 매니퓰레이터로 자낭을 해부하고, 각각의 1배체 세포를 취득하고, 각각 1배체 세포의 영양 요구성을 조사했다. 취득한 1배체 세포 모두가 우라실 합성 능력을 가지고 있는 것을 확인했다. 또한, URA3 유전자의 변이가 해제되지 않고 우라실 합성 능력이 복귀했을 경우에는 상기에서 얻어진 1배체 세포 중 우라실 합성 능력을 가지지 않는 세포가 얻어진다.
(그 10) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체주의 취득
그 1~9의 방법을 조합하여 얻어진 형질 전환체를 접합시켜 영양 요구성이 없는 2배체 원영양주를 얻었다. 또한, 2배체 원영양주를 자낭 형성 배지에서 자낭 형성시켜 마이크로 매니퓰레이터로 자낭을 해부하고, 각각의 1배체 세포를 취득했다. 취득한 1배체 세포의 영양 요구성을 조사하고, SD 배지(표 1)에서 생육한 주에 대해서 영양 요구성이 복귀했다고 판단하고, 1배체 원영양주로 했다.
(참고예 2) 유산의 정량방법
유산은 배양액의 원심 상청에 대해서 이하의 조건으로 HPLC법에 의해 유산량을 측정함으로써 확인했다.
컬럼: Shim-Pack SPR-H(Shimadzu Corporation 제품)
이동상: 5mMp-톨루엔술폰산(유속 0.8㎖/min)
반응액: 5mMp-톨루엔술폰산, 20mM 비스트리스, 0.1mM EDTA·2Na(유속 0.8㎖/min)
검출 방법: 전기전도도
온도: 45℃.
또한, L-유산의 광학순도 측정은 이하의 조건으로 HPLC법에 의해 측정했다.
컬럼: TSK-gel Enantio L1(Tosoh Corporation 제품)
이동상: 1mM 황산동 수용액
유속: 1.0㎖/min
검출 방법: UV 254nm
온도: 30℃.
또한, L-유산의 광학순도는 다음식으로 계산했다.
광학순도(%)=100×(L-D)/(L+D)
여기서, L은 L-유산의 농도, D는 D-유산의 농도를 나타낸다.
(참고예 3) 다공성막의 제작(그 1)
수지로서 폴리 불화비닐리덴(PVDF) 수지를, 또한 용매로서 N,N-디메틸아세트아미드(DMAc)를 각각 사용하고, 이들을 90℃의 온도하에서 충분히 교반하여 하기 조성을 갖는 원액을 얻었다.
[원액]
·PVDF: 13.0중량%
·DMAc: 87.0중량%.
이어서, 상기 원액을 25℃의 온도로 냉각한 후, 미리 유리판 상에 접착하여 둔 밀도가 0.48g/㎤이고, 두께가 220㎛인 폴리에스테르 섬유제 부직포(다공질 기재)에 도포하고, 즉시 하기 조성을 갖는 25℃ 온도의 응고욕 중에 5분간 침지하여 다공질 기재에 다공질 수지층이 형성된 평막을 얻었다.
[응고액]
·물: 30.0중량%
·DMAc: 70.0중량%.
이 다공성막을 유리판으로부터 박리한 후, 80℃ 온도의 열수에 3회 침지해서 DMAc를 씻어내어 분리막을 얻었다. 다공질 수지층 표면의 9.2㎛×10.4㎛의 범위내를 배율 10,000배로 주사형 전자 현미경 관찰을 행한 바, 관찰할 수 있는 세공 모두의 지름의 평균은 0.1㎛이었다. 이어서, 상기 분리막에 대해서 순수 투과 계수를 평가한 바, 50×10-9㎥/㎡/s/Pa이었다. 또한, 평균 세공 지름의 표준편차는 0.035㎛이고, 막표면 조도는 0.06㎛이었다.
(참고예 4) 다공성막의 제작(그 2)
중량 평균 분자량 41.7만의 불화비닐리덴 호모폴리머와 γ-부티로락톤을 각각 38중량%과 62중량%의 비율로 170℃의 온도에서 용해시켜 원액을 제작했다. 이 원액을 γ-부티로락톤을 중공부 형성 액체로서 교반하면서 구금으로부터 토출하고, 온도 20℃의 γ-부티로락톤 80중량% 수용액으로 이루어진 냉각욕 중에서 고화해서 중공사막을 제작했다.
이어서, 중량 평균 분자량 28.4만의 불화비닐리덴 호모폴리머를 14중량%, 셀룰로오스 아세테이트 프로피오네이트(Eastman Chemical Company, CAP482-0.5)를 1중량%, N-메틸-2-피롤리돈을 77중량%, 폴리옥시에틸렌 야자유 지방산 소르비탄(Sanyo Chemical Industries, Ltd. 제품, 상품명 "IONET T-20C"(등록상표))을 5중량% 및 물을 3중량%의 비율로 95℃의 온도에서 혼합 용해시켜 원액을 조제했다. 이 원액을 상기에서 얻어진 중공사막의 표면에 균일하게 도포하고, 바로 수욕중에서 응고시킨 본 발명에 사용되는 중공사막(다공성막)을 제작했다. 얻어진 중공사막(분리막)의 피처리수측 표면의 평균 세공 지름은 0.05㎛이었다. 이어서, 상기 분리막인 중공사막에 대해서 순수 투과 계수를 평가한 바, 5.5×10-9㎥/㎡·s·Pa이었다. 또한, 평균 세공 지름의 표준편차는 0.006㎛이었다.
(실시예 1) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체(영양 비요구성) 효모를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 1)
참고예 1에서 제작한 효모 HI003주를 사용하고, 도 1의 연속 발효 장치와 표 3에 나타내는 조성의 SC4 배지에 의해 유산의 제조를 행했다. 배지는 121℃의 온도로 15분간 고압 증기 멸균해서 행했다. 분리막 엘리먼트 부재에는 스텐레스 및 폴리술폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막에는 상기 참고예 3에서 제작한 다공성막을 사용했다.
실시예 1에 있어서의 운전 조건은 다음과 같다.
·발효 반응조 용량: 2(L)
·막분리조 용량: 0.5(L)
·사용 분리막: 폴리 불화비닐리덴 여과막(참고예 3)
·막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 60㎠c
·온도 조정: 32(℃)
·발효 반응조 통기량: 0.05(L/min)
·막분리조 통기량: 0.3(L/min)
·발효 반응조 교반 속도: 100(rpm)
·pH 조정: 8N Ca(OH)2에 의해 pH5로 조정
·유산 발효 배지 공급 속도: 50~300㎖/hr.의 범위에서 가변 제어
·발효액 순환 장치에 의한 순환액량: 0.1(L/min)
·막투과 수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(막간 차압: 0.1kPa~20kPa 미만으로 제어)
·분리막 엘리먼트를 포함하는 배양조는 121℃, 20min의 오토 클레이브에 의해 고압 증기 멸균.
생산물인 유산의 농도의 평가에는 상기 참고예 2에 나타낸 HPLC를 사용하고, 글루코오스 농도의 측정에는 "글루코오스 테스트 와코-C"(등록상표)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품)를 사용했다.
우선, HI003주를 시험관에 5㎖의 SC4 배지에서 밤새 진탕 배양해 배양액을 얻었다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 SC4 배지 100㎖에 식균하고, 500㎖ 용량의 사카구치 플라스크(Sakaguchi flask)에서 24시간, 30℃의 온도에서 진탕하여 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 1에 나타낸 연속 발효 장치의 1.5L의 SC4 배지에 식균하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 교반하고, 발효 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도의 조정, pH의 조정을 행하고, 발효 배양액 순환 펌프(11)를 가동시키지 않고, 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료후 즉시 발효 배양액 순환 펌프(11)를 가동시켜 전 배양시 운전 조건에 더해 막분리조(12)를 통기하고, SC4 배지의 연속 공급을 행하고, 막분리형 연속 발효 장치의 발효 배양액량을 2L가 되도록 막투과 수량의 제어를 행하면서 연속 배양하고, 연속 발효에 의한 유산의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과 수량의 제어는 차압 제어 장치(3)에 의해 막간 차압이 0.1kPa 이상 20kPa 미만이 되도록 적당히 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효 배양액 중의 생산된 유산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다.
800시간의 연속 발효 시험을 행한 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(실시예 2) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체(영양 비요구성) 효모를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 2)
참고예 1에서 제작한 효모 HI003주를 사용하고, 도 2에 나타낸 연속 발효 장치와 표 3에 나타낸 조성의 SC4 배지를 사용하여 유산의 제조를 행했다. 배지는 121℃의 온도로 15분간 고압 증기 멸균해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재에는 스텐레스 및 폴리술폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막에는 상기 참고예 3에서 제작한 다공성 분리막을 사용했다.
실시예 2에 있어서의 운전 조건은 다음과 같다.
·발효 반응조 용량: 2(L)
·사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막(참고예 3)
·막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
·온도 조정: 32(℃)
·발효 반응조 통기량: 0.05(L/min)
·유산 발효 배지 공급 속도: 50~300㎖/hr.의 범위에서 가변제어
·발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
·pH 조정: 8N Ca(OH)2에 의해 pH5로 조정
·막투과 수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(막간 차압: 0.1kPa~20kPa 미만으로 제어)
·분리막 엘리먼트를 포함하는 배양조는 121℃, 20min의 오토 클레이브에 의해 고압 증기 멸균.
생산물인 유산의 농도의 평가에는 상기 참고예 2에 나타낸 HPLC를 사용하고, 글루코오스 농도의 측정에는 "글루코오스 테스트 와코-C"(등록상표)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품)를 사용했다.
우선, HI003주를 시험관에 5㎖의 SC4 배지에서 밤새 진탕 배양해 배양액을 얻었다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 SC4 배지 100㎖에 식균하고, 500㎖ 용량의 사카구치 플라스크에서 24시간, 30℃의 온도로 진탕하여 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 2에 나타낸 막분리형 연속 발효 장치의 1.5L의 SC4 배지에 식균하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 400rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도의 조정, pH의 조정을 행하고, 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시 SC4 배지의 연속 공급을 행하고, 막분리형 연속 발효 장치의 발효액량이 1.5L가 되도록 막투과 수량의 제어를 행하면서 연속 배양하고, 연속 발효에 의한 유산의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과 수량의 제어는 차압 제어 장치(3)에 의해 막간 차압이 0.1kPa 이상 20kPa 미만이 되도록 적당히 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효 배양액 중의 생산된 유산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 유산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 투입 글루코오스로부터 산출된 유산 대 당 수율, 유산 생산 속도를 측정했다.
800시간의 발효 시험을 행한 결과를 표 6에 나타냈다. 도 2에 나타낸 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 유산의 제조방법에 의해 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(실시예 3) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체(영양 비요구성) 효모를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 3)
분리막에 상기 참고예 4에서 작성한 다공성막을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동 조건으로 실시, 평가했다. 750시간의 연속 발효 시험을 행한 결과를 표 6에 나타냈다. 본 발명의 유산의 제조방법에 의해 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(실시예 4) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체(영양 비요구성) 효모를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 4)
분리막에 상기 참고예 4에서 작성한 다공성 분리막을 사용한 것 이외에는 실시예 2와 동 조건으로 실시 평가했다. 770시간의 발효 시험을 행한 결과를 표 6에 나타냈다. 발명의 유산의 제조방법에 의해 안정하고, 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(비교예 1) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체(영양 비요구성) 효모를 사용한 회분 발효에 의한 유산의 제조
균체를 사용한 발효 형태로서 가장 전형적인 회분 발효를 행하고, 그 L-유산 생산성을 평가했다. 표 3에 나타낸 SC4 배지를 사용하고, 도 1의 막분리형 연속 발효 장치의 발효 반응조(1)만을 사용한 회분 발효 시험으로 행했다. 배지는 121℃의 온도로 15분간 고압 증기 멸균해서 사용했다. 이 비교예 1에서도 균체로서 상기 참고예 1에서 작성한 효모 HI003주를 이용하고, 생산물인 유산의 농도 및 배양액 중 당류의 정량에는 상기 참고예 2에 나타낸 HPLC를 사용했다.
비교예 1의 운전 조건을 이하에 나타낸다.
·발효 반응조 용량: 2(L)
·온도 조정: 30(℃)
·발효 반응조 통기량: 0.05(L/min)
·발효 반응조 교반 속도: 100(rpm)
·pH 조정: 8N Ca(OH)2에 의해 pH5로 조정
·배양조는 121℃, 20min의 오토 클레이브에 의해 고압 증기 멸균.
우선, HI003주를 시험관에 의해 5㎖의 유산 발효 배지에서 밤새 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 신선한 유산 발효 배지 100㎖에 식균해 500㎖ 용량의 사카구치 플라스크에서 24시간 진탕하여 배양했다(전 배양). 전 배양액을 막분리형 연속 발효 장치의 1L의 유산 발효 배지에 식균하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 100rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)를 통기했다. 온도의 조정과 pH의 조정을 행하고, 발효 배양액 순환 펌프(11)를 가동시키지 않고, 회분 발효 배양을 행했다. 이 때의 균체 증식량은 600nm에서의 흡광도로 14였다. 회분 발효의 결과를 표 6에 나타냈다. 발효 시간이 짧고, 유산 대 당 수율, 유산 생산 속도가 본 발명의 실시예보다 열화되어 있었다.
(비교예 2) 1배체 효모(영양 비요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 1)
참고예 1에서 제작한 효모 HI003-1B주를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동 조건에 의해 평가했다. 그 결과, 600시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 표 6에 나타냈다. 이 결과, 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(비교예 3) 1배체 효모(영양 비요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 2)
참고예 1에서 제작한 효모 HI003-1B주를 사용한 것 이외에는 실시예 2와 동 조건으로 실시 평가했다. 그 결과, 600시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 표 6에 나타냈다. 그 결과, 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(비교예 4) 1배체 효모(영양 비요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 3)
참고예 1에서 제작한 효모 HI003-1B주를 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동 조건으로 실시 평가했다. 그 결과, 500시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 표 6에 나타냈다. 이 결과, 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(비교예 5) 1배체 효모(영양 비요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 4)
참고예 1에서 제작한 효모 HI003-1B주를 사용한 것 이외에는 실시예 4와 동 조건으로 실시 평가했다. 그 결과, 500시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 표 6에 나타냈다. 이 결과, 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(비교예 6) 1배체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 1)
참고예 1에서 제작한 효모 SU014-3B주를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동 조건으로 실시, 평가했다. 그 결과, 300시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 표 6에 나타냈다. 이 결과, 영양 비요구성 효모 또는 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(비교예 7) 1배체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 2)
참고예 1에서 제작한 효모 SU014-3B주를 사용한 것 이외에는 실시예 2와 동 조건으로 실시, 평가했다. 그 결과, 280시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 표 6에 나타냈다. 이 결과, 영양 비요구성 효모 또는 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(비교예 8) 1배체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 3)
참고예 1에서 제작한 효모 SU014-3B주를 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동 조건으로 실시, 평가했다. 그 결과, 350시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 표 6에 나타냈다. 이 결과, 영양 비요구성 효모 또는 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(비교예 9) 1배체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 4)
참고예 1에서 제작한 효모 SU014-3B주를 사용한 것 이외에는 실시예 4와 동 조건으로 실시, 평가했다. 그 결과, 270시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 표 6에 나타냈다. 이 결과, 영양 비요구성 효모 또는 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(실시예 5) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체(영양 비요구성) 효모를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 5)
표 4에 기재된 유산 발효 배지를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동 조건으로 실시 평가했다. 800시간의 발효 시험을 행한 결과를 표 7에 나타냈다. SC4 배지보다 영양원이 적은 유산 발효 배지도 본 발명의 유산의 제조방법에 의해 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(실시예 6) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체(영양 비요구성) 효모를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 6)
표 4에 기재된 유산 발효 배지를 사용한 것 이외에는 실시예 2와 동 조건으로 실시 평가했다. 800시간의 발효 시험을 행한 결과를 표 7에 나타냈다. SC4 배지보다 영양원이 적은 유산 발효 배지도 본 발명의 유산의 제조방법에 의해 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(실시예 7) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체(영양 비요구성) 효모를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 7)
표 4에 기재된 유산 발효 배지를 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동 조건으로 실시 평가했다. 800시간의 발효 시험을 행한 결과를 표 7에 나타냈다. SC4 배지보다 영양원이 적은 유산 발효 배지도 본 발명의 유산의 제조방법에 의해 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(실시예 8) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체(영양 비요구성) 효모를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 8)
표 4에 기재된 유산 발효 배지를 사용한 것 이외에는 실시예 4와 동 조건으로 실시 평가했다. 800시간의 발효 시험을 행한 결과를 표 7에 나타냈다. SC4 배지보다 영양원이 적은 유산 발효 배지도 본 발명의 유산의 제조방법에 의해 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(실시예 9) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 1)
참고예 1에서 제작한 효모 SU014주를 사용한 것 이외에는 실시예 5와 동 조건으로 실시, 평가했다. 700시간의 연속 발효 시험을 행한 결과를 표 7에 나타냈다. 영양 비요구성의 고차 배수체 효모보다 유산 대 당 수율 및 유산 생산 속도에 있어서 다소 열화되지만, 장기간 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(실시예 10) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 2)
참고예 1에서 제작한 효모 SU014주를 사용한 것 이외에는 실시예 6과 동 조건으로 실시, 평가했다. 700시간의 발효 시험을 행한 결과를 표 7에 나타냈다. 영양 비요구성의 고차 배수체 효모보다 유산 대 당 수율 및 유산 생산 속도에 있어서 다소 열화되지만, 장기간 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(실시예 11) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 L-유산의 제조(그 3)
참고예 1에서 제작한 효모 SU014주를 사용한 것 이외에는 실시예 7과 동 조건으로 실시, 평가했다. 650시간의 연속 발효 시험을 행한 결과를 표 7에 나타냈다. 영양 비요구성의 고차 배수체 효모보다 유산 대 당 수율 및 유산 생산 속도에 있어서 다소 열화되지만, 장기간 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(실시예 12) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 4)
참고예 1에서 제작한 효모 SU014주를 사용한 것 이외에는 실시예 8과 동 조건으로 실시, 평가했다. 670시간의 발효 시험을 행한 결과를 표 7에 나타냈다. 영양 비요구성의 고차 배수체 효모보다 유산 대 당 수율 및 유산 생산 속도에 있어서 다소 열화되지만, 장기간 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(비교예 10) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체(영양 비요구성) 효모를 사용한 회분 발효에 의한 유산의 제조
표 4에 나타낸 유산 발효 배지를 사용한 것 이외에는 비교예 1과 동 조건으로 실시, 평가했다. 회분 발효의 결과를 표 7에 나타냈다. 발효 시간이 짧고, 유산 대 당 수율, 유산 생산 속도가 본 발명의 실시예보다 열화되어 있었다.
(비교예 11) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모(영양 요구성)를 사용한 회분 발효에 의한 유산의 제조
참고예 1에서 작성한 SU014주를 사용한 것 이외에는 비교예 2와 동 조건으로 실시, 평가했다. 회분 발효의 결과를 표 7에 나타냈다. 발효 시간이 짧고, 유산 대 당 수율, 유산 생산 속도가 본 발명의 실시예보다 열화되어 있었다.
(비교예 12) 유산을 생산하는 능력을 갖는 1배체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 1)
참고예 1에서 제작한 효모 SU014-3B주를 사용한 것 이외에는 실시예 5와 동 조건으로 실시, 평가했다. 그 결과, 300시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 표 7에 나타냈다. 이 결과, 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(비교예 13) 유산을 생산하는 능력을 갖는 1배체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 2)
참고예 1에서 제작한 효모 SU014-3B주를 사용한 것 이외에는 실시예 6과 같이 실시, 평가했다. 그 결과, 280시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 표 7에 나타냈다. 이 결과, 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(비교예 14) 유산을 생산하는 능력을 갖는 1배체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 3)
참고예 1에서 제작한 효모 SU014-3B주를 사용한 것 이외에는 실시예 7과 같이 실시, 평가했다. 그 결과, 1배체 효모의 경우, 350시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 표 7에 나타냈다. 이 결과, 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(비교예 15) 유산을 생산하는 능력을 갖는 1배체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 4)
참고예 1에서 제작한 효모 SU014-3B주를 사용한 것 이외에는 실시예 8과 같이 실시, 평가했다. 그 결과, 270시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 표 7에 나타냈다. 이 결과, 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(실시예 13) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체(영양 비요구성) 효모를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 9)
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적을 240㎠로 확대하고, 표 5에 기재된 유산 발효 배지 2를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동 조건으로 실시, 평가했다. 1400시간의 발효 시험을 행한 결과를 도 6~8에 나타냈다. 본 발명의 유산의 제조방법에 의해 장기간 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(실시예 14) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체(영양 비요구성) 효모를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 10)
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적을 240㎠로 확대하고, 표 5에 기재된 유산 발효 배지(2)를 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동 조건으로 실시, 평가했다. 1350시간의 발효 시험을 행한 결과를 도 6~8에 나타냈다. 본 발명의 유산 제조방법에 의해 장기간 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(실시예 15) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체(영양 비요구성) 효모를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 11)
참고예 1에서 제작한 효모 SE001주를 사용한 것 이외에는 실시예 13과 동 조건으로 실시, 평가했다. 1350시간의 발효 시험을 행한 결과를 도 9~11에 나타냈다. 본 발명의 유산의 제조방법에 의해 장기간 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(실시예 16) 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체(영양 비요구성) 효모를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 12)
참고예 1에서 제작한 효모 SE001주를 사용한 것 이외에는 실시예 14와 동 조건으로 실시, 평가했다. 1350시간의 발효 시험을 행한 결과를 도 9~11에 나타냈다. 본 발명의 유산의 제조방법에 의해 장기간 안정한 유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다.
(비교예 16) 유산을 생산하는 능력을 갖는 1배체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 5)
참고예 1에서 제작한 효모 SU014-3B주를 사용한 것 이외에는 실시예 13과 동 조건으로 실시, 평가했다. 그 결과, 300시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 도 9~11에 나타냈다. 이 결과, 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(비교예 17) 유산을 생산하는 능력을 갖는 1배체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 6)
참고예 1에서 제작한 효모 SU014-3B주를 사용한 것 이외에는 실시예 14와 동 조건으로 실시, 평가했다. 그 결과, 280시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 도 9~11에 나타냈다. 이 결과, 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(비교예 18) 유산을 생산하는 능력을 갖는 1배체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 7)
참고예 1에서 제작한 효모 SE001-1A주를 사용한 것 이외에는 실시예 15와 동 조건으로 실시, 평가했다. 그 결과, 300시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 도 9~11에 나타냈다. 이 결과, 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(비교예 19) 유산을 생산하는 능력을 갖는 1배체 효모(영양 요구성)를 사용한 연속 발효에 의한 유산의 제조(그 8)
참고예 1에서 제작한 효모 SE001-1A주를 사용한 것 이외에는 실시예 16과 동 조건으로 실시, 평가했다. 그 결과, 270시간에 막간 차압이 20kPa 이상으로 되어 배양을 종료했다. 그 연속 발효 시험 결과를 도 9~11에 나타냈다. 이 결과, 고차 배수체 효모를 사용한 것이 장기간 안정하게 유산을 제조할 수 있는 것이 밝혀졌다.
또한, 실시예 1~16 및 비교예 1~19의 배양 조건을 표 8에 나타냈다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명의 고차 배수체 효모를 공시균으로 한 연속 발효법에 의한 유산의 제조방법에 따르면, 간편한 조작 조건으로 장시간에 걸쳐 안정하게 소망의 발효 생산물인 유산의 고생산성을 유지하는 연속 발효가 가능해지고, 널리 발효 공업에 있어서 발효 생산물인 유산을 저비용으로 안정하게 생산하는 것이 가능해진다.
1: 발효 반응조 2: 분리막 엘리먼트
3: 수두차 제어 장치 4: 기체 공급 장치
5: 교반기 6: 레벨 센서
7: 배지 공급 펌프 8: pH 조정 용액 공급 펌프
9: pH 센서·제어 장치 10: 온도 조절기
11: 발효액 순환 펌프 12: 막분리조
13: 지지판 14: 유로재
15: 분리막 16: 오목부
17: 집수 파이프 18: 분리막속
19: 상부 수지 밀봉층 20: 하부 수지 밀봉층
21: 지지 프레임 22: 집수 파이프
3: 수두차 제어 장치 4: 기체 공급 장치
5: 교반기 6: 레벨 센서
7: 배지 공급 펌프 8: pH 조정 용액 공급 펌프
9: pH 센서·제어 장치 10: 온도 조절기
11: 발효액 순환 펌프 12: 막분리조
13: 지지판 14: 유로재
15: 분리막 16: 오목부
17: 집수 파이프 18: 분리막속
19: 상부 수지 밀봉층 20: 하부 수지 밀봉층
21: 지지 프레임 22: 집수 파이프
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<110> Toray Industries, Inc.
<120> Method for producing lactic acid by continuous fermentation
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<170> PatentIn version 3.1
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<213> Xenopus laevis
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aacaaggtca ccattgtggg tgtgggggcc gtgggcatgg cctgtgccat cagtgtcctg 120
cagaaggatt tggcagatga gcttgcactt gttgatgtga tagaagacaa actgaagggg 180
gaaatgatgg atctccagca tggcagtctg ttccttcgta cccccaagat tgtctcaggg 240
aaagattaca gcgtcactgc aaactccaag ctggtagttg tgacggccgg ggcccgtcag 300
caggagggag agagtcgcct gaatctggtt cagcgcaatg tcaacatctt caaattcatc 360
attcccaaca ttgtcaagta cagccccaac tgcaccctgc tcatcgtctc caacccagtg 420
gacattctga catatgtggc ctggaagatc agtggattcc ccaaaaaccg tgtcattggc 480
agcggctgca atttggactc tgcccgtttc cgttacctca tggggcagaa gtttgggatc 540
cacacccaga gctgccacgg ttgggtcatt ggggaacacg gagactcgag tgtgccagtg 600
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gacgcagaca aggagaactg gaaggaggtg cacaagcagg ttgtggacag cgcctatgaa 720
gtgatcaagc tgaagggcta cacctcctgg gctattggcc tgtccgtagc tgacctgtct 780
gagagtatcc tgaagaacct ccgccgagtc catcccattt ccacaatggt caagggcatg 840
tacggcgtga ataatgatgt tttcctcagt gtcccctgtg tgttgggcaa cttgggcatc 900
acagacgtgg ttaacatgac gctgaaggca gatgaagagg atcgcttacg caagagcgca 960
gacaccctgt gggccatcca gaaggagctg cagttctag 999
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Claims (10)
- 유산을 생산하는 능력을 갖는 고차 배수체 효모의 배양액을 평균 세공 지름이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만인 다공성막으로 여과 처리하고, 여액으로부터 생산물을 회수하는 동시에 미여과액을 상기 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한 발효 원료를 상기 배양액에 추가하는 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 다공성막의 막간 차압을 0.1kPa 이상 20kPa 미만의 범위로 하여 여과 처리하는 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 고차 배수체 효모는 2배체인 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 고차 배수체 효모는 영양 비요구성인 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 연속 발효의 유산 대 당 수율은 70% 이상인 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 연속 발효의 배양액 중의 유산 축적 농도는 40g/L 이상인 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 연속 발효의 유산 생산 속도는 7.5g/L 이상인 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법. - 제 5 항에 있어서,
상기 연속 발효를 400시간 이상 계속시키는 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 고차 배수체 효모는 사카로미세스 속에 속하는 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 고차 배수체 효모는 사카로미세스 세레비시에인 것을 특징으로 하는 연속 발효에 의한 유산의 제조방법.
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