JP2003259878A

JP2003259878A - 乳酸脱水素酵素をコードするｄｎａおよびその利用

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Publication number: JP2003259878A
Application number: JP2002065879A
Authority: JP
Inventors: Nobuhiro Ishida; 亘広石田; Masakata Hirai; 正名平井; Takao Imaeda; 孝夫今枝; Tsutomu Miyazaki; 力宮崎; Tateo Tokuhiro; 健郎徳弘; Satoshi Saito; 聡志齋藤; Osamu Saotome; 理早乙女; Noriko Hoya; 典子保谷; Yasuo Matsuo; 康生松尾
Original assignee: Toyota Motor Corp; Toyota Central R&D Labs Inc
Current assignee: Toyota Motor Corp; Toyota Central R&D Labs Inc
Priority date: 2002-03-11
Filing date: 2002-03-11
Publication date: 2003-09-16
Also published as: AU2003213456A1; WO2003076616A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】高等真核生物の遺伝子を、サッカロマイセス・
セレビシエなどの酵母を始めとする異種の生物中で発現
させる際の不完全さを是正することにより、より効率的
な遺伝子発現系を提供する。【解決手段】以下の（ａ）および（ｂ）のいずれかの特
徴を有するＤＮＡ。（ａ）乳酸脱水素酵素活性を備える
タンパク質をコードする塩基配列を有する。（ｂ）該塩
基配列の全体若しくは一部の配列からなるＤＮＡあるい
はその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイ
ズし、乳酸脱水素酵素活性を備えるタンパク質をコード
する塩基配列を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、乳酸の効率的生
産技術に関し、詳しくは、酵母に乳酸を産生させるのに
適する乳酸脱水素酵素活性を備えるタンパク質をコード
する塩基配列を有するＤＮＡ、およびこのＤＮＡの利用
に関する。

【０００２】

【従来の技術】組換えＤＮＡ技術の進歩により、微生
物、カビ、動植物および昆虫などの宿主で外来遺伝子を
発現させ、その形質転換体を増殖させることによって、
目的遺伝子産物を取得する技術が発展してきた。例え
ば、酵母などの培養によれば、発酵生産により大量の目
的遺伝子産物を産生させることも可能である。

【０００３】これまで、酵母によってＬ−乳酸を生産さ
せようとする試みはいくつか存在している。ウシ由来の
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）遺伝子を酵母サッカロマイセ
ス・セレビシエに導入し、Ｌ−乳酸を生産させる試みが
ある(Eri Adahi et al., "Modification of metabolic
pasthway of Saccaromyces cerevisiae by the express
ion of lactate dehydrogenase and deletion of pyruv
ate genes fo the lactic acid fermentation at low p
H value", J. Ferment. Bioeng. Vol.86, No.3, 284-28
9, 1988、Danio Porro et al., "Development of metab
olically engineered Saccaromyces cerevisiae cells
for the production of lactic asid",Biotechnol.Pro
g. Vol.11, 294-298, 1995, 特表２００１−５１６５８
４号公報)。しかしながら、いずれの報告においても、
Ｌ−乳酸の高生産は認められていない。

【０００４】タンパク質をコードする遺伝子は、そのタ
ンパク質のアミノ酸配列を、１アミノ酸につき、ＤＮＡ
の３塩基からなるコドン（遺伝暗号）によってコードし
ているが、一つのアミノ酸に対応する遺伝暗号は必ずし
も一つではない。大量に発現している遺伝子では、生物
種によって使用されている遺伝暗号に偏りがあることが
知られている。したがって、ウシ由来のＬＤＨをコード
する遺伝子は、ほ乳類などの高等真核生物において多用
される遺伝暗号からなる遺伝子であり、必ずしも酵母、
特にサッカロマイセス・セレビシエにおける発現には好
適なものではないと考えられる。

【０００５】また、遺伝子を効率的に発現させるために
は、最適な発現制御系に接続する必要がある。開始コド
ンの上流に発現に好適な配列を付加したり、より好適な
プロモーター遺伝子の下流に接続することによって、目
的とする遺伝子をより効率的に発現させることが可能と
なる。一方、宿主における目的産物に関連する代謝系も
考慮する必要がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このように、形質転換
微生物の培養によって乳酸を効率的に生産するには、宿
主において効率よく発現するＤＮＡ配列であることが望
まれるとともに、効率的発現が可能な発現制御系による
制御を受けることが望まれる。本発明の目的は、高等真
核生物のＤＮＡ、例えば、ウシなどの哺乳類のＬＤＨ遺
伝子を、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母を始
めとする異種の生物中で発現させる際の不完全さを是正
することにより、より効率的な遺伝子発現系、具体的に
は、Ｌ−乳酸の生産を行うための発現系を提供すること
である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、各種のＬ
ＤＨ遺伝子について微生物での発現に対して各種の最適
化を試みた結果、Ｌ−乳酸の産生量を増大させるのに適
したＤＮＡ配列を見出した。そして、かかるＤＮＡ配列
を有するＤＮＡ構築物を利用することにより、上記した
課題を解決するに至った。すなわち、本発明によれば、
以下の手段を提供することができる。

【０００８】（１）以下の（ａ）および（ｂ）のいずれ
かの特徴を有するＤＮＡ。（ａ）乳酸脱水素酵素活性を備えるタンパク質をコード
し、配列番号１に記載の塩基配列を有する。（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列の全体若しくは一部
の配列からなるＤＮＡあるいはその相補鎖とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズし、乳酸脱水素酵素活性
を備えるタンパク質をコードする塩基配列を有する。（２）以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの特徴を有
するＤＮＡ。（ｃ）乳酸脱水素酵素活性を備えるタンパク質をコード
し、配列番号３に記載の塩基配列を有する。（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列の全体若しくは一部
の配列からなるＤＮＡあるいはその相補鎖とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズし、乳酸脱水素酵素活性
を備えるタンパク質をコードする塩基配列を有する。（３）開始コドンを挟んでコザック配列を有する、
（１）または（２）に記載のＤＮＡ。（４）乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡであって、以下の特徴（ｅ）〜（ｇ）：（ｅ）サッカロマイセス・セレビシエにおけるコドン用
法を用いて設計されている、（ｆ）開始コドンを挟んでコザック配列を有している、
および（ｇ）コード領域の開始コドンから１００塩基毎に区切
られる複数の領域のＧＣ含量が２０％以上４０％以下の
範囲である、のうち少なくとも２種類を備える、ＤＮ
Ａ。（５）前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質は、
ウシ由来の乳酸脱水素酵素、あるいはウシ由来の乳酸脱
水素酵素のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミ
ノ酸が、置換、欠失、挿入および／または付加されたア
ミノ酸配列からなタンパク質である、（４）記載のＤＮ
Ａ。（６）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および／また
は付加されたアミノ酸配列からなり、乳酸脱水素酵素活
性を有するタンパク質をコードし、配列番号１または３
に記載の塩基配列の全部若しくはその一部からなるＤＮ
Ａあるいはその相補鎖とストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズする、ＤＮＡ。（７）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および／また
は付加されたアミノ酸配列からなり、乳酸脱水素酵素活
性を有するタンパク質をコードし、配列番号１あるいは
配列番号３のコード領域の塩基配列において、前記アミ
ノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加による改変
がなされた塩基配列を有する、ＤＮＡ。（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡからな
るＤＮＡセグメントと、このＤＮＡセグメントを発現可
能に連結されるプロモーターセグメント、とを備える、
ＤＮＡ構築物。（９）前記プロモーターセグメントは、サッカロマイセ
ス・セレビシエ由来のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プ
ロモーター活性を有する、（８）記載のＤＮＡ構築物。（１０）宿主染色体との相同組換えのためのＤＮＡセグ
メントを備える、（８）または（９）に記載のＤＮＡ構
築物。（１１）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡから
なるＤＮＡセグメントと、宿主染色体との相同組換えの
ためのＤＮＡセグメントと、とを備える、ＤＮＡ構築
物。（１２）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡから
なるＤＮＡセグメントが宿主染色体のプロモーターによ
って制御可能となるように相同組換え用ＤＮＡセグメン
トを備える、（１１）記載のＤＮＡ構築物。（１３）前記宿主染色体プロモーターは、サッカロマイ
セス・セレビシエ由来のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子
プロモーターである、（１１）または（１２）に記載の
ＤＮＡ構築物。（１４）前記ＤＮＡ構築物は、さらに、プラスミド、バ
クテリオファージ、レトロトランスポゾンおよび人工染
色体からなる群から選択されるいずれかのベクターの構
成セグメントを備える、（８）〜（１３）のいずれかに
記載のＤＮＡ構築物。（１５）（８）〜（１３）のいずれかに記載のＤＮＡ構
築物を用いて宿主細胞を形質転換させて得られる形質転
換体。（１６）前記宿主細胞は、細菌、酵母、動物細胞、昆虫
細胞および植物細胞のいずれかである、（１５）記載の
形質転換体。（１７）前記宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシ
エである、（１５）記載の形質転換体。（１８）宿主染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子
プロモーターあるいは当該プロモーターと置換された当
該プロモーターのホモログの下流に当該プロモーターに
よって制御可能に連結された、請求項１〜７のいずれか
に記載のＤＮＡであるＤＮＡセグメントを備える、形質
転換サッカロマイセス属酵母。（１９）（１５）〜（１８）のいずれかに記載の形質転
換体に由来する細胞を培養する工程と、前記工程でえら
れる培養物から乳酸を分離する工程、とを備える、乳酸
の製造方法。

【０００９】本発明によれば、微生物、特に酵母におけ
る発現が最適化されたＬＤＨ活性を備えるタンパク質を
コードする塩基配列を有するＤＮＡが提供される。この
ＤＮＡを利用することにより、Ｌ−乳酸を高生産可能な
形質転換体を容易に得ることができ、ひいては、Ｌ−乳
酸を効率よく生産することができる。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。（ＤＮＡ）本発明のＤＮＡは、Ｌ−乳酸脱水素酵素（Ｌ
ＤＨ）活性を備えるタンパク質をコードする塩基配列を
有する、あるいは当該塩基配列からなるＤＮＡである。
ここで、ＬＤＨは、乳酸菌などの原核生物もしくはカビ
などの真核微生物の解糖系、または高等生物の筋肉組織
において、ピルビン酸からＬ−乳酸を産生する反応を媒
介する酵素として知られている。また、本明細書におい
て、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡな
ど、その由来を問うものではない。また、１本鎖でも、
その相補鎖を有する２本鎖であってもよい。また、天然
のあるいは人工のヌクレオチド誘導体を含んでいてもよ
い。

【００１１】ＬＤＨとしては、生物の種類に応じてある
いは生体内においても各種同族体が存在する。本発明に
おけるＬＤＨ活性を備えるタンパク質としては、天然由
来のＬＤＨの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人
工的に合成されたＬＤＨも包含している。ＬＤＨとして
は、好ましくは、乳酸菌などの原核生物もしくはカビな
どの真核微生物由来であり、より好ましくは、植物、動
物、昆虫などの高等真核生物由来であり、さらに好まし
くは、ウシを始めとする哺乳類を含む高等真核生物由来
である。最も好ましくは、ウシ由来のＬＤＨである。例
えば、ウシ由来のＬＤＨとして配列番号２に示すアミノ
酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。さら
に、本発明におけるＬＤＨは、これらのＬＤＨのホモロ
グも包含している。ＬＤＨホモログは、天然由来のＬＤ
Ｈのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸
の置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸
でありかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質、およ
び、天然由来のＬＤＨとアミノ配列の相同性が少なくと
も７０％、好ましくは８０％以上を有しかつＬＤＨ活性
を有しているタンパク質を含んでいる。

【００１２】本発明のＤＮＡは、形質転換しようとする
宿主生物において多用されるコドン用法を用いた塩基配
列を有することができる。例えば、本ＤＮＡは、サッカ
ロマイセス属、とくに、サッカロマイセス・セレビシエ
におけるコドン用法を用いて遺伝暗号化された塩基配列
を有することができる。サッカロマイセス・セレビシエ
におけるコドン用法を図２示す。このコドン用法におい
て、下線が施してあるコドンを、それに対応つけられて
いるアミノ酸のコドンとして用いることが好ましい。す
なわち、ＵＵＵ（Ｐｈｅ）、ＵＣＵ（Ｓｅｒ）、ＵＡＵ
（Ｔｙｒ）、ＵＧＵ（Ｃｙｓ）、ＵＵＧ（Ｌｅｕ）、Ｃ
ＡＵ（Ｈｉｓ）、ＣＣＡ（Ｐｒｏ）、ＣＡＡ（Ｇｌ
ｎ）、ＡＵＵ（Ｉｌｅ）、ＡＣＵ（Ｔｈｒ）、ＡＡＵ
（Ａｓｎ）、ＡＡＡ（Ｌｙｓ）、ＡＧＡ（Ａｒｇ）、Ａ
ＵＧ（Ｍｅｔ）、ＧＵＵ（Ｖａｌ）、ＧＣＵ（Ａｌ
ａ）、ＧＡＵ（Ａｓｐ），ＧＧＵ（Ｇｌｙ）、ＧＡＡ
（Ｇｌｕ）を用いることが好ましい。なお、これらはい
ずれもＲＮＡ上の塩基配列の形態で示されているが、Ｄ
ＮＡの場合は、ＵがＴとなる。

【００１３】ＬＤＨをコードするＤＮＡに対して、サッ
カロマイセス属など異種生物のコドン用法に基づいて改
変して新たな塩基配列のＤＮＡを設計する場合、改変前
（天然由来）の塩基配列のコドンの７０％以上にこのコ
ドン用法が適用されていることが好ましく、より好まし
くは、８０％以上であり、さらに好ましくは、９０％以
上であり、もっとも好ましくは、全てのコドンについて
このコドン用法が適用されている。

【００１４】本発明のＤＮＡの好ましい態様として、ウ
シ由来のＬＤＨの塩基配列（配列番号４１）を上記コド
ン用法（サッカロマイセス・セレビシエのコドン用法）
を適用して設計したＤＮＡを挙げることができる。なか
でも、配列番号１および配列番号３に記載の塩基配列を
有する、あるいはこれらの塩基配列からなるＤＮＡが好
適な態様である。当該塩基配列のコード領域の塩基配列
においては、メチオニン以外の全てのアミノ酸におい
て、本来のコドンと異なるコドンが用いられている。

【００１５】また、好ましい態様として、ＬＤＨ活性を
有するタンパク質のコード領域の開始コドン近傍に（開
始コドンを挟んで）コザック配列を有することが好まし
い。具体的には、ＤＮＡにあっては、５’−ＡＮＮＡＴ
ＧＧ−３’ただし、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧのいず
れであってもよい。）を有するようにすることが好まし
い（なお、ＲＮＡにあっては、この配列に対してＴをＵ
に置換した形態をいうものとする。）。例えば、配列番
号３に記載の塩基配列では、開始コドン（ＡＴＧ）を挟
んで、５’−ＡＣＡＡＴＧＧ−３’の塩基配列を有して
いる。

【００１６】また、本ＤＮＡにおいては、ｍＲＮＡを不
安定化する配列を含まないようにすることが好ましい。
例えば、ポリＡシグナル配列、ステムループ構造を含む
配列、ＴＡＴＡＴＡ配列などの配列の他、著しい繰り返
し配列を含まないようすることが好ましい。例えば、１
０ｂｐ程度の配列の出現率がＤＮＡ（特にタンパク質の
コード領域）において２％以下となるようにすることが
好ましく、より好ましくは、全く含まないものとする。

【００１７】また、ＤＮＡ全体において、ＧＣ含量の偏
りに差がでないように設計することが好ましい。例え
ば、５’側（特に、開始コドン）から１００塩基毎に区
切られる複数の領域のＧＣ含量がそれぞれ約２０％以上
約４０％以下の範囲であることが好ましい。また、全体
のＧＣ含量が約２０％以上約４０％以下であることが好
ましい。ウシ由来の天然のＬＤＨ配列（配列番号４１）
の全体のＧＣ含量が４４．９４％であることと、例え
ば、配列番号１および３に記載の塩基配列においては、
全体のＧＣ含量が、それぞれ３１．４％、３２．０％と
なっているからである。より好ましくは、約２５％以上
約３５％以下である。あるいは、天然のＤＮＡ配列に比
較して、全体のＧＣ含量を１０％以上１５％以下程度、
好ましくは、１３％以上１４％以下程度減少させるよう
に設計することが好ましい。

【００１８】本発明のＤＮＡとしては、導入しようとす
る宿主生物におけるコドン用法の適用、コザック配列の
存在、好適なＧＣ含量（ＧＣ含量の分散性、全体のＧＣ
含量）のうち、少なくとも１種類の特徴を有することが
好ましい。より好ましくは、２種類以上、もっとも好ま
しくは３種類の特徴を有する。また、本ＤＮＡにおいて
は、宿主生物におけるコドン用法が適用されていること
が好ましい。特に、サッカロマイセス属（セレビシエ種
を含む）を宿主として形質転換する場合には、サッカロ
マイセス属（特に、セレビシエ種）におけるコドン用法
が適用されていることが好ましい。

【００１９】さらに、ＤＮＡにおいて、特にコード領域
において遺伝子クローニング工程上不適当な制限酵素部
位を有しないように設計されていることが好ましい。具
体的には、Eco RI, Xho I、Afl IIなどのサイトを含ま
ないことが好ましい。また一方、遺伝子クローニング操
作を考慮すれば、コード領域の外側には操作上有用な制
限酵素部位を備えていることが好ましい。例えば、Eco
RI, Xho I、Afl IIなどのサイトをコード領域の上流お
よび／または下流に有することができる。例えば、配列
番号１および３に記載の塩基配列においては、開始コド
ンから終止コドンまでの範囲においては、Eco RI、Xho
I、Afl IIのサイトを備えていない。また、配列番号３
に記載の塩基配列においては、開始コドンの上流側に、
Eco RIサイトを備え、終止コドンの下流側には、Xho
I、Afl IIを備えている。

【００２０】本発明のＤＮＡは、配列番号１および３に
示す塩基配列からなるＤＮＡのホモログも包含してい
る。ホモログとしては、例えば、これらのＤＮＡとスト
リンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを挙げ
ることができる。すなわち、これらのいずれかのＤＮＡ
の全体若しくは一部あるいはその相補鎖とストリンジェ
ントな条件でハイブリダイズするＤＮＡである。かかる
ホモログは、同時にＬＤＨ活性を備えるタンパク質をコ
ードしている。ストリンジェントな条件でハイブリダイ
ズするＤＮＡとは、例えば、もとの塩基配列の任意の少
なくとも２０個、好ましくは２５個、より好ましくは少
なくとも３０個の連続した配列を一つあるいは複数個選
択したＤＮＡをプローブＤＮＡとして、当業者の周知の
ハイブリダイセーション技術（Current Protocols I Mo
lecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publi
sh . John Wily & SonsSectoin 6.3-6.4）などを用い
て、ハイブリダイズするＤＮＡである。ここでストリン
ジェントな条件としては、５０％ホルムアミド存在下で
ハイブリダイゼーション温度が３７℃であり、より厳し
い条件としては、約４２℃である。さらに厳しい条件と
してはホルムアミド存在下で約６５℃とすることができ
る。

【００２１】また、ウシ由来のＬＤＨのアミノ酸配列
（例えば、配列番号２）において、１若しくは数個のア
ミノ酸が、置換、欠失、挿入および／または付加された
アミノ酸配列からなり、ＬＤＨ活性を有するタンパク質
をコードするとともに、前記ウシ由来のＬＤＨをコード
する塩基配列（例えば、配列番号１または３に記載の塩
基配列）の全部若しくは一部からなるＤＮＡあるいはそ
の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズす
る、ＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。また、配列
番号１あるいは配列番号３のコード領域に記載の塩基配
列によってコードされるアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および／また
は付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＤＨ活性を有す
るタンパク質をコードするとともに、配列番号１あるい
は配列番号３のコード領域において、前記アミノ酸の置
換などに対応する塩基の改変がなされた塩基配列を有す
るＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。なお、アミノ
酸配列における変異の数は、もとのタンパク質の機能が
維持できる限り制限されないが、全アミノ酸の７０％以
内であることが好ましく、より好ましくは、３０％以内
であり、さらに好ましくは２０％以内である。

【００２２】また、このようなＤＮＡのホモログは、も
とのＤＮＡの塩基配列のコード領域に対して、少なくと
も８０％、好ましくは、９０％以上のホモロジーを有す
る塩基配列を含む、あるいは当該塩基配列からなるＤＮ
Ａであることが好ましい。なお、ＤＮＡの塩基配列のホ
モロジーは、遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴなどによ
って決定することができる。

【００２３】なお、ＤＮＡは、化学的に合成することも
できるし、長鎖ＤＮＡの合成方法として知られている藤
本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞
工学シリーズ７植物のＰＣＲ実験プロトコール、１９
９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を採用することもでき
る。

【００２４】また、アミノ酸配列における改変は、改変
しようとするアミノ酸配列に、部位特異的変位導入法
（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausu
bel etal., (1987) Publish . John Wily & Sons Secto
in 8.1-8.5）等を用いて、適宜、置換、欠失、挿入、お
よび／または付加変異を導入することにより行うことが
できる。また、このような改変は、人工的に変異を導入
しあるいは合成したものに限られず、人工的な変異処理
に基づいてあるいはこれに限られず自然界におけるアミ
ノ酸の変異によっても生じたものも包含される。

【００２５】（ＤＮＡ構築物）本発明のＤＮＡを用いて
宿主細胞を形質転換して、このＤＮＡによってコードさ
れるタンパク質を発現させることにより、そのＬＤＨ活
性により宿主細胞においてＬ−乳酸を産生させることが
できる。形質転換にあたっては、本ＤＮＡからなるＤＮ
Ａセグメントを、宿主細胞内で発現可能とするＤＮＡ構
築物を用いる。形質転換のためのＤＮＡ構築物の態様と
しては、特に限定しないでプラスミド（ＤＮＡ）、バク
テリオファージ（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（Ｄ
ＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＭＡＣ
等）を、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色
体内）や宿主細胞の種類に応じて選択して採用すること
ができる。したがって、本ＤＮＡ構築物は、本ＤＮＡの
他、これらのいずれかの態様のベクターの構成セグメン
トを備えることができる。好ましい原核細胞性ベクタ
ー、真核細胞性ベクター、動物細胞性ベクター、植物細
胞性ベクターは当該分野において周知である。

【００２６】なお、プラスミドＤＮＡとしては、例え
ば、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６、ＹＣ
ｐ５０、ｐＡＵＲ１１２またはｐＡＵＲ１２３などのＹ
Ｃｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＹＥＳ３２ま
たはＹＥｐ１３などのＹＥｐ型大腸菌−酵母シャトルベ
クター、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、
ｐＲＳ４０６、ｐＡＵＲ１０１またはｐＡＵＲ１３５な
どのＹＩｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、大腸菌由
来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ
１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐ
ＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９
８、ｐＨＳＧ３９６又はｐＴｒｃ９９ＡなどのＣｏｌＥ
系プラスミド、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＡＣＹＣ１８４
などのｐ１Ａ系プラスミド、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１
９、ｐＭＷ２１８又はｐＭＷ２１９などのｐＳＣ１０１
系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、
ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）などを挙げることができ
る。ファージＤＮＡとしては、λファージ（Ｃｈａｒｏ
ｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ
４、λｇｔ１００、ｇｔ１１、ｚａｐ）、φＸ１７４、
Ｍ１３ｍｐ１８又はＭ１３ｍｐ１９などを挙げることが
できる。レトロトランスポゾンとしては、Ｔｙ因子など
を挙げることができる。ＹＡＣとしては、ｐＹＡＣＣ２
などを挙げることができる。

【００２７】本ＤＮＡ構築物を作製するには、本ＤＮＡ
を含むフラグメントなどを適当な制限酵素で切断し、使
用するベクターＤＮＡの制限酵素部位あるいはマルチク
ローニングサイトに挿入などすることによる。本ＤＮＡ
構築物の第１の態様は、本ＤＮＡからなるＤＮＡセグメ
ントを発現可能に連結されるプロモーターセグメントを
備えている。すなわち、プロモーターにより制御可能に
そのプロモーターの下流側に本ＤＮＡセグメントが連結
されている。

【００２８】本ＤＮＡ、すなわち、ＬＤＨ活性を備える
タンパク質の発現にあっては、酵母における発現が好ま
しいことから、酵母中で発現するプロモーターを使用す
ることが好ましい。かかるプロモーターとしては、例え
ば、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーター、ｇａｌ
１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショ
ックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、
ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプ
ロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモータ
ーなどを使用することが好ましい。特に、サッカロマイ
セス属由来のピルビン酸脱炭酸酵素（１）プロモーター
が好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ由来のピル
ビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターを利用すること
がより好ましい。これらのプロモーターは、サッカロマ
イセス属（セレビシエ）のエタノール発酵経路において
高発現されているからである。なお、かかるプロモータ
ー配列は、サッカロマイセス属酵母のピルビン酸脱炭酸
酵素１遺伝子のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅法
によって単離することができる。サッカロマイセス・セ
レビシエ由来の当該プロモーターの塩基配列を、配列番
号４０に示す。なお、本ＤＮＡ構築物におけるプロモー
ターセグメントには、この配列番号４０記載の塩基配列
からなるＤＮＡの他、この塩基配列において１若しくは
数個の塩基が欠失,置換若しくは付加された塩基配列か
らなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ、配列番
号４０で示される塩基配列の全部若しくは一部の配列か
ら調製されたＤＮＡあるいはその相補鎖とストリンジェ
ントな条件でハイブリダイズし、かつプロモーター活性
を有するＤＮＡ（換言すれば、当該プロモーターのホモ
ログ）を用いることができる。

【００２９】また、本ＤＮＡ構築物の他の態様である第
２のＤＮＡ構築物は、本ＤＮＡの他、宿主染色体を相同
組換えのためのＤＮＡセグメントを備える。相同組換え
用ＤＮＡセグメントは、宿主染色体において本ＤＮＡを
導入しようとするターゲット部位近傍のＤＮＡ配列と相
同なＤＮＡ配列である。相同組換え用ＤＮＡセグメント
は、少なくとも１個備えられ、好ましくは、２個備えら
れている。例えば、２個の相同組換え用ＤＮＡセグメン
トを、染色体上のターゲット部位の上流側と下流側のＤ
ＮＡに相同なＤＮＡ配列とし、これらのＤＮＡセグメン
トの間に本ＤＮＡを連結することが好ましい。

【００３０】相同組換えにより宿主染色体に本ＤＮＡを
導入する場合、宿主染色体上のプロモーターにより制御
可能に本ＤＮＡを導入することができる。この場合、目
的遺伝子の導入によって、同時に、本来当該プロモータ
ーによって制御されるべき内在性遺伝子を破壊し、この
内在性遺伝子に替えて外来の本ＤＮＡを発現させること
ができる。特に、当該プロモーターが、宿主細胞におい
て高発現プロモーターである場合に有用である。

【００３１】かかる発現系を宿主染色体上に創出するに
は、宿主染色体において高発現遺伝子をターゲットと
し、この遺伝子を制御するプロモーターの下流にプロモ
ーターにより制御を受けるように本ＤＮＡを導入するよ
うにすることが好ましい。酵母などのエタノール発酵性
微生物を宿主とする場合、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子
（特に、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子）をターゲット
とし、内在性のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモータ
ーの制御下にＬＤＨ活性タンパク質をコードするＤＮＡ
を導入することができる。この場合、相同組換え用ＤＮ
Ａセグメントは、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のＬＤ
Ｈの構造遺伝子領域あるいはその近傍の配列（開始コド
ンの近傍の配列、開始コドンの上流域の配列、構造遺伝
子内の配列などを含む）と相同とすることができる。好
ましくは、サッカロマイセス属（特にセレビシエ）を宿
主として、この宿主のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子を
ターゲットとするＤＮＡ構築物とする。かかるＤＮＡ構
築物によれば、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子の破壊と
この構造遺伝子部分のＬＤＨによる置換を一つのベクタ
ーで達成することができる。ピルビン酸脱炭酸酵素１
は、ピルビン酸からアセトアルデヒドへの付加逆反応を
媒介する酵素であり、この遺伝子を破壊することによ
り、アセトアルデヒドを経たエタノール産生が抑制され
ることが期待されるとともに、ピルビン酸を基質とする
ＬＤＨによる乳酸産生が促進されることが期待できる。

【００３２】なお、第１のＤＮＡ構築物あっても、宿主
染色体との相同組換えのためのＤＮＡセグメントを備え
ることにより、相同組換え用のＤＮＡ構築物とすること
ができる。第１のＤＮＡ構築物にあっては、ＤＮＡ構築
物中のプロモーターセグメントを、宿主染色体との相同
組換え用のＤＮＡセグメントに兼用することもできる。
例えば、宿主サッカロマイセス・セレビシエに対して、
サッカロマイセス・セレビシエ宿主染色体にあるプロモ
ーター、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモ
ーターをプロモーターセグメントとして有するＤＮＡ構
築物は、当該遺伝子をターゲット部位とするターゲティ
ングベクターを構成する。この場合、ピルビン酸脱炭酸
酵素１遺伝子の構造遺伝子領域に対する相同配列を備え
ることが好ましい。

【００３３】なお、ＤＮＡ構築物には、ターミネーター
他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、
スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マ
ーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結するこ
とができる。選択マーカーとしては、特に限定しない
で、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めと
する公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。例え
ば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺
伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を使用することができ
る。

【００３４】（ＤＮＡ構築物による形質転換）一旦、Ｄ
ＮＡ構築物が構築されたら、適当な宿主細胞に、トラン
スフォーメーション法や、トランスフェクション法、接
合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション
法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティク
ルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウ
ム法、ＰＥＧ法、直接マイクロインジェクション法等の
各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入するこ
とができる。するＤＮＡ構築物の導入後、その受容細胞
は、選択培地で培養される。

【００３５】宿主細胞は、Eshrichia coli、Bacillus s
ubtilisなどの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ、シ
ゾサッカロマイセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、
ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母、
ｓｆ９、ｓｆ２１等の昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニ
ーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの動物細
胞、サツマイモ、タバコなどの植物細胞などとすること
ができる。好ましくは、酵母などのアルコール発酵を行
う微生物あるいは耐酸性微生物であり、例えば、サッカ
ロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属を始
めとする酵母である。具体的には、サッカロマイセス・
セレビシエＩＦＯ２２６０株や同ＹＰＨ株である。

【００３６】ＤＮＡ構築物によって形質転換された形質
転換体においては、ＤＮＡ構築物の構成成分が染色体上
あるいは染色体外因子（人工染色体を含む）上に存在す
ることになる。なお、ＤＮＡ構築物が染色体外に維持さ
れている場合、あるいは、ランダムインテグレーション
により染色体に組み込まれている場合には、ＬＤＨの基
質であるピルビン酸を基質とする他の酵素、例えば、ピ
ルビン酸脱炭酸酵素の遺伝子（サッカロマイセス属酵母
においては、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子）は、ター
ゲティングベクターによりノックアウトされていること
が好ましい。上述のＤＮＡ構築物であって、相同組換え
を達成できるＤＮＡ構築物が導入されると、宿主染色体
上の所望のプロモーターあるいは当該プロモーターと置
換された当該プロモーターのホモログの下流に当該プロ
モーターによって制御可能に連結された本ＤＮＡである
ＤＮＡセグメントが存在することになる。サッカロマイ
セス属酵母の形質転換体にあっては、宿主染色体上にお
いて、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターある
いは当該プロモーターと置換された当該プロモーターの
ホモログの下流に当該プロモーターによって制御可能に
本ＤＮＡを備えることが好ましい。また、通常、相同組
換え体における本ＤＮＡの下流側には、選択マーカー遺
伝子や、破壊された構造遺伝子の一部（ＤＮＡ構築物上
の相同配列に対応する部位）が存在する。

【００３７】なお、所望のプロモーター下に本ＤＮＡが
導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法やサザンハイブリ
ダイゼーション法により行うことができる。例えば、形
質転換体からＤＮＡを調製し、導入部位特異的プライマ
ーによりＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物について、電気泳動
において予期されるバンドを検出することによって確認
できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーで
ＰＣＲを行うことでも確認できる。これらの方法は、当
業者において周知である。

【００３８】（乳酸の製造）ＤＮＡ構築物が導入されて
得られる形質転換体を培養することにより、培養物中に
外来遺伝子の発現産物である乳酸が生成する。培養物か
ら乳酸を分離する工程を実施することにより、乳酸を得
ることができる。なお、本発明において培養物とは、培
養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体
の破砕物を包含している。本発明の形質転換体の培養に
あたっては、形質転換体の種類に応じて培養条件を選択
することができる。このような培養条件は、当業者にお
いては周知である。大腸菌や酵母等の微生物を宿主とし
て得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物
が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形
質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれ
ば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができ
る。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スク
ロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等
の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールを
用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩
化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のア
ンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプト
ン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いること
ができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン
酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、
硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムな
どを用いることができる。

【００３９】培養は、通常、振とう培養または通気攪拌
培養等の好気条件下、３０℃で６〜２４時間行う。培養
期間中、ｐＨは２．０〜６．０に保持することが好まし
い。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカ
リ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に
応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの構成物質
を培地に添加することができる。

【００４０】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する倍地としては、一般に使用されているＲＰＭ
Ｉ１６４０倍地、ＤＭＥＭ倍地またはこれらの培地にウ
シ胎児血清などを添加した培地を用いることができる。
培養は、通常、５％ＣＯ₂存在下、３７℃で１〜３０日
行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン
などの抗生物質を培地に添加してもよい。

【００４１】培養終了後、培養物から遺伝子産物を分離
するには、通常のタンパク質の生成手段などを使用する
ことができる。例えば、形質転換細胞内に生産された場
合は、常法により菌体を超音波破壊処理、摩砕処理、加
圧破砕などに細胞を破壊して,遺伝子産物を細胞と分離
することができる。この場合、必要に応じてプロテアー
ゼを添加する。また、培養上清に遺伝子産物が生産され
た場合には、この溶液を、ろ過、遠心分離などにより固
形分を除去し、必要によりプロトタミン処理などにより
核酸を除去する。

【００４２】これらの粗抽出画分に対して、硫安、アル
コール、アセトン等などを添加し分画し、沈殿物を採取
し、粗タンパク質溶液を得る。このタンパク溶液を、各
種クロマトグラフィー、電気泳動などにかけて精製酵素
標品を得ることができる。たとえば、セファデックス、
ウルトラゲルもしくはバイオゲルなどを用いるゲルろ
過、イオン交換体クロマトグラフィー、ポリアクリルア
ミドゲルなどを用いる電気泳動法、アフィニティクロマ
トグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を用いる分画
法を適宜選択し、又はこれらの組み合わせることによ
り、精製された目的の遺伝子産物を取得することができ
る。なお、精製された遺伝子産物が有するアミノ酸配列
は、公知のアミノ酸分析法により行うことができる。上
記した培養法、精製法は、一例であってこれに限定する
趣旨ではない。

【００４３】

【実施例】以下に、本発明の具体例を記載するが、本発
明を以下の具体例に限定する趣旨ではない。

【００４４】（実施例１：Ｌ−乳酸脱脂素酵素遺伝子の
ＤＮＡ配列の設計）高等真核生物であるウシ由来のタン
パク質であるＬ−乳酸脱水素酵素を、酵母サッカロマイ
セス・セレビシエ属において効率的に生産するために、
ウシ由来Ｌ−乳酸脱水素酵素のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ（配列番号４１）に対して、以下の項目を設計
指針として、天然にない新規な遺伝子配列を設計した。１）サッカロマイセス・セレビシエにおいて多用されて
いるコドンを用いた。２）開始コドンをはさんでコザック配列（ＡＮＮＡＴＧ
Ｇ）を付加した。３）ｍＲＮＡの不安定配列や繰り返し配列をできる限り
排除した４）全領域にわたってＧＣ含量の偏りに差がでないよう
にした。５）設計した配列中に遺伝子クローニングに不適当な制
限酵素部位ができないようにした。６）染色体導入型ベクターに組み込むための両末端に有
用な制限酵素EcoRI、XhoI、AflIII部位を付加した。酵
母におけるコドンの使用頻度は、コドンユーセージデー
タベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/）から得ら
れるサッカロマイセス・セレビシエのコドンユーセージ
を図２に示す。この図において特定アミノ酸に対応して
多用されているコドンを特定した（下線をしたコド
ン）。

【００４５】図２に示すコドンユーセージにおける多用
コドンの適用の他、上記２）〜５）の設計指針に基づい
て得られたＬＤＨ活性を有するタンパク質をコードする
新規なＤＮＡ配列（９９９ｂｐ）（以下、ＬＤＨＫＣＢ
遺伝子と称す。）を配列番号１に示す。また、配列番号
１に示すＤＮＡ配列とその開始コドンの上流側および終
止コドンの下流側を含むＤＮＡ配列（１０５２ｂｐ）
（以下、ＬＤＨＫＣＢ配列と称す。）を配列番号３およ
び図１に示す。

【００４６】配列番号１に記載のＤＮＡ配列において
は、メチオニン以外の全てのアミノ酸において、もとの
ＤＮＡ配列で使用したのと異なるコドンを使用してい
た。なお、新たに採用されたコドンは、全て図２に示す
多用コドンであった。さらに、もとのウシ由来のＬＤＨ
遺伝子とＬＤＨＫＣＢ遺伝子とについて、コンピュータ
ーによるホモロジー解析を行った結果を図３に示す。図
３から明らかなように、ＤＮＡ配列のほぼ全域にわたっ
て多数の置換を要することがわかった。

【００４７】（実施例２：ＬＤＨＫＣＢ配列の全合成）
本実施例では、長鎖ＤＮＡの合成方法として知られてい
る藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物
細胞工学シリーズ７植物のＰＣＲ実験プロトコール、
１９９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を用いた。この方
法の原理は、１００MER程度のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを３’末端に１０〜１２ｍｅｒ程度のオーバーラ
ップを持つように作製し、お互いのオリゴヌクレオチド
プライマーのオーバーラップ領域を利用して、欠損部分
を伸張させ、さらに両末端のプライマーを用いてＰＣＲ
を行うことによって増幅するというものである。この操
作を順次繰り返し、目的とする長鎖ＤＮＡを合成する。
ＰＣＲ増幅装置には、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲｓｙｓ
ｔｅｍ９７００（ＰＥ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ）を使用した。具体的には、最初に連結させた
い２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを混合し、Ｋ
ＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋
紡）存在下で、９６℃、２分、６８℃２分、５４℃２
分、７２℃３０分の反応条件でＤＮＡ伸張反応を行っ
た。次に、本試料の１／１０量を鋳型にして、両末端の
プライマー存在下で、９６℃２分後、（９６℃３０秒→
５５℃３０秒→７２℃９０秒）を２５サイクル行い、そ
の後４℃とするＰＣＲ反応をおこなった。反応における
バッファ、ｄＮＴＰｍｉｘなどは、ＤＮＡｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅに附属のものを使用した。一連のオーバーラ
ップＰＣＲ法を図４に従って順次行っていき、最終目的
とすつ遺伝子断片を作製した。図４に示す各種プライマ
ー（BA、B01、BB、B02、BC、B03、BD、B04、BE、B05、B
F、B06、BG、B07、BH、B08、BI、B09、BJ、B10、BK、B1
1、BL、B12、BM、B13、BN、B14の全２８種のプライマー
のＤＮＡ配列を配列番号５〜３２にそれぞれ示す。合成
したＬＤＨＫＣＢ配列について、塩基配列を確認した
後、ＥｃｏＲＩにて制限酵素処理し、同様にＥｃｏＲＩ
にて酵素処理したｐＣＲ２．１ＴＯＰＯＶｅｃｔｏｒ
（Ｉｎｖｉｔｉｒｏｇｅｎ）に常法により連結した。こ
のベクターをｐＢＴＯＰＯ−ＬＤＨＫＣＢベクターと称
した。

【００４８】（実施例３：酵母染色体導入用ベクターの
構築）実施例２において全合成したＬＤＨＫＣＢ配列を
用いて、酵母染色体導入型ベクターを構築した。このベ
クターを、pBTRP-PDC1-LDHKCBと称し、このプラスミド
マップを図５に示す。１．ｐBTrp-PDC１-LDHKCB構築のためのPDC1P断片の単離 PDC1P断片は、サッカロマイセス・セレビシエYPH株（St
ratagene社）のゲノムＤＮＡを鋳型として使用したPCR
増幅法によって単離を行った。

【００４９】サッカロマイセス・セレビシエYPH株のゲ
ノムＤＮＡは、ゲノム調製キットであるFast DNA Kit
（Bio 101社）を用い、詳細は、附属のプロトコールに
従い、調製した。ＤＮＡ濃度は分光光度計Ｕｌｔｒｏ
ｓｐｅｃ３０００（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａ
ｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社）にて測定した。

【００５０】PCR反応には、増幅酵素として、増幅断片
の正確性が高いとされるPyrobest DNA Polymerase（宝
酒造）を使用した。上記手法にて調製したサッカロマイ
セス・セレビシエＹＰＨ株のゲノムＤＮＡ５０ｎｇ／サ
ンプル、プライマーＤＮＡ５０ｐｍｏｌ／サンプル、及
びＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．
２ユニット／サンプルを合計で５０μｌの反応系に調製
した。反応溶液を、ＰＣＲ増幅装置ＧｅｎｅＡｍｐ
ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥＡｐｐｌｌｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）によってＤＮＡ増幅を行つた。
ＰＣＲ増幅装置の反応条件は、９６℃２分の後、（９
６℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃９０秒）を２５サイ
クル行い、その後４℃とした。ＰＤＣｌプライマーの増
幅断片を１％ＴＢＥアガロースゲル電気泳動にて遺伝子
増幅断片の確認を行つた。なお反応に使用したプライマ
ーＤＮＡは、合成ＤＮＡ（サワデーテクノロジー社）を
用い、このプライマーのＤＮＡ配列は以下の通りであっ
た。

【００５１】・ＰＤＣＩＰ−ＬＤＨ−Ｕ（３１ｍｅｒ，
Ｔｍ値５８．３℃）未端に制限酵素ＢａｍH1サイトを付
加：ＡＴＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＴＴＴＡＴ
ＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＣ（配列番号３３）・ＰＤＣｌＰ−ＬＤＨ−Ｄ（３１ｍｅｒ、Ｔｍ値５４．
４℃）末端に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを付加：ＡＴＡ
ＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＧＡＴＴＧＡＴＴＴ
ＧＡＣＴＧＴＧ（配列番号３４）

【００５２】２．プロモーター及び目的遺伝子を含む組
換えベクターの構築サッカロマイセス・セレビシエ由来のビルビン酸脱炭酸
酵素１遺伝子（ＰＤＣｌ）プロモーター配列の制御下
で、目的遺伝子としてウシ由来のL-乳酸脱水素酵素遺伝
子（ＬＤＨ遺伝子）を使用した。

【００５３】本組換えベクター構築のために新たに構築
した染色体導入型ベクターをｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−Ｌ
ＤＨＫＣＢと名付けた。以下に本ベクター構築例の詳細
を記す。なお本実施例の概要を図６〜９に示す。但し、
ベクター構築の手順はこれに限定されるものではない。
ベクターの構築にあたつて、必要な遺伝子断片であるＰ
ＤＣｌ遺伝子のプロモーター断片（ＰＤＣＩＰ）９７１
ｂｐと、ＰＤＣｌ遺伝子下流領域断片（ＰＤＣ１Ｄ）５
１８ｂｐは、上述のように、サッカロマイセス・セレビ
シエＹＰＨ株のゲノムＤＮＡを鋳型として使用したＰＣ
Ｒ増幅法によって単離を行った。ＰＣＲ増幅の手順は上
記の通りであるが、ＰＤＣｌ遺伝子下流領域断片の増幅
には、以下のプライマーを使用した。・ＰＤＣ１Ｄ−ＬＤＨ−Ｕ（３４ｍｅｒ、Ｔｍ値５５．
３℃）未端に制限酵素ＸｈｏＩサイトを付加：ＡＴＡ
ＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＧＣＴＡＡＣＴＴ
ＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣ（配列番号３５）・ＰＤＣＩＤ−ＬＤＨ−Ｄ（３１ｍｅｒ、Ｔｍ値５４．
４℃）末端に制限酵素ＡｐａＩサイトを付加：ＡＴＡ
ＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＧＡＴＴＧＡＴＴＴ
ＧＡＣＴＧＴＧ（配列番号３６）

【００５４】上記反応にて取得したＰＤＣ１Ｐ及びＰＤ
Ｃ１Ｄ各遺伝子増幅断片をそれぞれ、エタノール沈殿処
理によって精製した後、ＰＤＣ１Ｐ増幅断片を制限酵素
ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ及びＰＤＣ１Ｄ増幅断片を制限
酵素ＸｈｏＩ／ＡｐａＩにて制限酵素反応処理を行っ
た。なお、以下に用いた酵素類はすべて宝酒造社製のも
のを用いた。また、エタノール沈殿処理、制限酵素処理
の一連操作の詳細なマニュアルはＭｏｌｅｃｕｌａｒ
ＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｌｏｎ（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙｐｒｅｓｓ．１９８９）に従っ
た。

【００５５】ベクターの構築における一連の反応操作
は、一般的なＤＮＡサブクローニング法に準じて行っ
た。すなわち、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ（宝酒
造社）及び脱リン酸化酵素ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓ
ｐｈａｔａｓｅ（ＢＡＰ、宝酒造社）を施したｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋ベクター（東洋紡社）に、
上記ＰＣＲ法にて増幅し制限酵素処理を施したＰＤＣ１
Ｐ断片をＴ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ反応によって連結さ
せた（図６上段）。Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ反応に
は、ＬｉｇａＦａｓｔＲａｐｉｄＤＮＡＬｉｇａｔ
ｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、詳細は付
属のプロトコールに従った。

【００５６】次にＬｉｇａｔｉｏｎ反応を行った溶液を
用いて、コンピテント細胞への形質転換を行った。コン
ピテント細胞は大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡社）を用
い、詳細は付属のプロトコールに従って行った。得られ
た培養液は抗生物質アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含
有したＬＢプレートにまいて一晩培養した。生育したコ
ロニーにつき、インサート断片のプライマーＤＮＡを用
いたコロニーＰＣＲ法による確認、及びミニプレップに
よるプラスミドＤＮＡ調製溶液に対する制限酵素処理に
よる確認を行い、目的とするベクターｐＢＰＤＣ１Ｐベ
クターを単離した（図６中段）。

【００５７】ついで、図６の中段に示すように、株式会
社豊田中央研究所によって構築されたｐＢＴＯＰＯ−Ｌ
ＤＨＫＣＢベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ処理及び末端
修飾酵素Ｔ４ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理するこ
とで得られるＬＤＨＫＣＢ遺伝子断片を、同じく制限酵
素ＥｃｏＲＩ処理、末端修飾酵素Ｔ４ＤＮＡｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ処理を行ったｐＢＰＤＣ１Ｐベクター中
に、上述と同様の操作でサブクローニングを行い、ｐＢ
ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターを作製した（図６下
段）。

【００５８】一方、図７に示すように、トヨタ自動車
（株）によって構築されたｐＹＬＤｌベクターを制限酵
素ＥｃｏＲＩ／ＡａｔＩＩ処理及び末端修飾酵素Ｔ４
ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理することで得られるＬ
ＤＨ遺伝子（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来）断
片を、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ処理、末端修飾酵素Ｔ
４ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理を行ったｐＢＰＤ
Ｃ１Ｐベクター中に、上述と同様の操作でサブクローニ
ングを行い、ｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ１ベクターを作製
した（図７）。なお、上記のｐＹＬＤｌベクターは大腸
菌に導入され（名称：「Ｅ．ｃｏｌｌｐＹＬＤ
１」）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託
センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に、受託
番号ＦＥＲＭＢＰ−７４２３としてブダベスト条約に
基づき国際寄託されている（原寄託日：平成１１（１９
９９）年１０月２６日）。

【００５９】続いて、図８に示すように、このベクター
をＸｈｏＩ／ＡｐａＩ処理し、同様に制限酵素処理を施
した増幅ＰＤＣ１Ｄ断片を連結させてｐＢＰＤＣ１Ｐ−
ＬＤＨベクターを作製した（図８上段）。最後にｐＢＰ
ＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＩＩベクターをＥｃｏＲＶ処理したも
のに、ｐＲＳ４０４ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社）をＡａｔＩＩ／ＳｓｐＩ処理、Ｔ４ＤＮＡｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ処理して得られたＴｒｐマーカー断片を
連結させて、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨベクターを
構築した。

【００６０】次に、図９に示すように、ｐＢＰＤＣ１Ｐ
−ＬＤＨＫＣＢベクターをＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩにて制
限酵素処理し、一方、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨベ
クターを、制限酵素ＡｐａＩおよびＳｔｕＩで処理した
Ｔｒｐマーカーを含む断片に処理し、増幅させた断片を
連結させて、最終コンストラクトである染色体導入型ｐ
ＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢベクターを構築し
た。

【００６１】構築した染色体導入型ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ
１−ＬＤＨＫＣＢベクターの確認の為に塩基配列決定を
行った。塩基配列解析装置としてＡＢＩＰＲＩＳＭ３
１０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥＡｐｐｌ
ｉｅｄＢｌｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、試料の調
製法、及び機器の使用方法等の詳細は本装置付属のマニ
ュアルに従った。試料となるベクターＤＮＡはアルカリ
抽出法により調製したものを用い、これをＧＦＸＤＮ
ＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｎＰｈａｒｍａｃｉａＢｌｏｔｅｃｈ社）にてカラム
精製した後、分光光度計Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３０００
（ＡｍｅｒｓｈａｎＰｈａｒｍａｃｉａＢｌｏｔｅｃ
ｈ社）にてＤＮＡ濃度を測定したものを用いた。

【００６２】（実施例４：酵母の形質転換）酵母への遺
伝子導入法は、Ｉｔｏらの手法（Ito, H., Y. Fukuda,
K.Murata and A. Kimura, Transformation of intact y
east cells treated with alkali cations J. Bacterio
l. Vol.153, p163-168）に従った。すなわち、宿主であ
る酵母ＩＦＯ２２６０株（社団法人発酵研究所に登録さ
れている菌株）のトリプトファン合成能を欠損した株
を、１０ｍｌＹＰＤ培地にて３０℃で対数増殖期まで培
養を行い、集菌およびＴＥバッファによる洗浄を行っ
た。次に、０．５ｍｌＴＥバッファと０．５ｍｌ０．
２Ｍの酢酸リチウムを加え、３０℃にて１時間の振とう
培養を行った後に、実施例３の手法を用いて構築した染
色体導入型ベクターｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨＫＣ
Ｂベクターを、制限酵素ＡｐａＩおよびＳａｃＩ（いず
れも宝酒造）で処理して、これを添加した。

【００６３】本酵母懸濁液を３０℃で３０分振とう培養
後、１５０μｌの７０％ポリエチレングリコール４００
０（和光純薬）を加え、よく攪拌した。さらに、３０℃
にて１時間振とう培養した後、４２℃にて５分間ヒート
ショックを与え、菌体を洗浄した後、２００μｌの水に
懸濁したものをトリプトファン選択培地に塗沫した。

【００６４】得られたコロニーを新たなトリプトファン
選択培地に画線培養し、安定性が確認できた選抜株につ
いて、遺伝子導入の有無をＰＣＲ解析によって確認し
た。ＰＣＲに鋳型として用いる酵母のゲノムＤＮＡは、
シングルコロニーを２ｍｌＹＰＤ培地で一晩振とう培養
を行った後、集菌し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ５０
０μｌおよびガラスビーズ（４２５〜６００μｍ、Aｃ
ｉｄｗａｓｈｅｄ、ＳＩＧＭＡ）を加え、４℃で１５
分間ボルテックスを行うことにより調製した。本溶液の
上清を用いてエタノール沈殿を行い、滅菌水５０μｌに
溶解した、調製したゲノムＤＮＡ５μｌを鋳型として、
５０μｌの反応系でＰＣＲを行った。ＤＮＡ増幅酵素と
しては、ＥＸＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（宝酒造）を用い、ＰＣＲ増幅装置ＧｅｎｅＡｍｐＰ
ＣＲｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＰＣＲ増幅装置の反
応条件は、９６℃２分の後、（９６℃３０秒→５５℃３
０秒→７２℃９０秒）を３０サイクル行い、その後４℃
とした。使用したプライマーの配列は以下の通りであっ
た。ＬＤＨ−ＫＣＢ−Ｕ：ＴＧＧＴＴＧＡＴＧＴＴＡＴ
ＧＧＡＡＧＡＴ（２０ｍｅｒ）（配列番号３７）ＬＤＨ−ＫＣＢ−Ｄ：ＧＡＣＡＡＧＧＴＡＣＡＴＡ
ＡＡＡＣＣＣＡＧ（２１ｍｅｒ）（配列番号３８）ＰＤＣ１Ｐ−Ｕ３：ＧＴＡＡＴＡＡＡＣＡＣＡＣＣ
ＣＣＧＣＧ（１９ｍｅｒ）（配列番号３９）

【００６５】安定したトリプトファン合成能を有し、か
つ、これらのプライマーのもとでＰＣＲ増幅が確認でき
たものを、ＬＤＨＫＣＢ遺伝子が適切に導入された形質
転換株であると判断した。本実施例においては、かかる
形質転換株として、ＫＣＢ−２７株、ＫＣＢ−２１０
株、およびＫＣＢ−２１１株の３種の菌株を取得するこ
とができた。これら酵母サッカロマイセス・セレビシエ
形質転換体のゲノム染色体上の構造を図１０に示す。

【００６６】（実施例５：形質転換体におけるＬ−乳酸
生産量の測定）作製した３種の形質転換株について発酵
試験を行った。前培養として、グルコース濃度２％のＹ
ＰＤ液体培地で一晩培養を行い、これを集菌および洗浄
後、グルコース濃度１５％のＹＰＤ液体培地に菌体濃度
が１％（０．５ｇ／５０ｍｌ）になるように植菌し、３
０℃の静置培養にて数日間発酵を行った。本発酵液を２
４時間ごとに採取し、溶液中に含まれるＬ−乳酸量を想
定した。生産量の測定は、バイオセンサＢＦ−４（王子
計測機器）を用い、測定方法の詳細は、附属の取り扱い
説明書に従った。

【００６７】グルコース濃度１５％で発酵３日目におけ
る培養液中のＬ−乳酸量を測定した結果を図１１および
表１に示す。

【表１】ＬＤＨＫＣＢ遺伝子が導入された形質転換体（ＫＣＢ−
２７株、ＫＣＢ−２１０株、ＫＣＢ−２１１株）では、
それぞれＬＤＨＫＣＢ遺伝子が１コピーしか導入されて
いないのにもかかわらず、培養液１Ｌあたり、４．５〜
５．０％（４５．０〜５０．０ｇ）のＬ−乳酸生産が認
められた。本結果は、過去に報告されているサッカロマ
イセス・セレビシエにおけるＬ−乳酸生産と比較して飛
躍的な生産量の増大であることは明らかであった。ま
た、かかる生産量の増大は、ＬＤＨＫＣＢ遺伝子の導入
そのものに起因していると考えられる。さらに、１コピ
ーによってもかかる生産量の増大を得られることから、
２コピー以上が導入された場合には、さらなる生産量の
増大を確保できることが推測される。

【００６８】

【発明の効果】本発明によれば、外来の乳酸脱水素酵素
を酵母などの宿主生物において高発現させることができ
る発現系を提供することができる。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha <120> Synthetic DNA and Use thereof <130> 010769(P01-3850) <140> <141> <160> 41 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 999 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Modified DNA coding lactate dehydrogenase <221> CDS <222> (1)..(996) <400> 1 atg gct act ttg aaa gat caa ttg att caa aat ttg ttg aaa gaa gaa 48 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 cat gtt cca caa aat aaa att act att gtt ggt gtt ggt gct gtt ggt 96 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 atg gct tgt gct att tct att ttg atg aaa gat ttg gct gat gaa gtt 144 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val 35 40 45 gct ttg gtt gat gtt atg gaa gat aaa ttg aaa ggt gaa atg atg gat 192 Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 ttg caa cat ggt tct ttg ttt ttg aga act cca aaa att gtt tct ggt 240 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 aaa gat tat aat gtt act gct aat tct aga ttg gtt att att act gct 288 Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 ggt gct aga caa caa gaa ggt gaa tct aga ttg aat ttg gtt caa aga 336 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 aat gtt aat att ttt aaa ttt att att cca aat att gtt aaa tat tct 384 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 cca aat tgt aaa ttg ttg gtt gtt tct aat cca gtt gat att ttg act 432 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 tat gtt gct tgg aaa att tct ggt ttt cca aaa aat aga gtt att ggt 480 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 tct ggt tgt aat ttg gat tct gct aga ttt aga tat ttg atg ggt gaa 528 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 aga ttg ggt gtt cat cca ttg tct tgt cat ggt tgg att ttg ggt gaa 576 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu 180 185 190 cat ggt gat tct tct gtt cca gtt tgg tct ggt gtt aat gtt gct ggt 624 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 gtt tct ttg aaa aat ttg cat cca gaa ttg ggt act gat gct gat aaa 672 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 gaa caa tgg aaa gct gtt cat aaa caa gtt gtt gat tct gct tat gaa 720 Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 gtt att aaa ttg aaa ggt tat act tct tgg gct att ggt ttg tct gtt 768 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 gct gat ttg gct gaa tct att atg aaa aat ttg aga aga gtt cat cca 816 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 att tct act atg att aaa ggt ttg tat ggt att aaa gaa gat gtt ttt 864 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe 275 280 285 ttg tct gtt cca tgt att ttg ggt caa aat ggt att tct gat gtt gtt 912 Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 aaa gtt act ttg act cat gaa gaa gaa gct tgt ttg aaa aaa tct gct 960 Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 gat act ttg tgg ggt att caa aaa gaa ttg caa ttt taa 999 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 2 <211> 332 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Modified DNA coding lactate dehydrogenase <400> 2 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 3 <211> 1052 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Modified DNA coding lactate dehydrogenase <220> <221> CDS <222> (13)..(1008) <400> 3 acagaattca ca atg gct act ttg aaa gat caa ttg att caa aat ttg ttg 51 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu 1 5 10 aaa gaa gaa cat gtt cca caa aat aaa att act att gtt ggt gtt ggt 99 Lys Glu Glu His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly 15 20 25 gct gtt ggt atg gct tgt gct att tct att ttg atg aaa gat ttg gct 147 Ala Val Gly Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala 30 35 40 45 gat gaa gtt gct ttg gtt gat gtt atg gaa gat aaa ttg aaa ggt gaa 195 Asp Glu Val Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu 50 55 60 atg atg gat ttg caa cat ggt tct ttg ttt ttg aga act cca aaa att 243 Met Met Asp Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile 65 70 75 gtt tct ggt aaa gat tat aat gtt act gct aat tct aga ttg gtt att 291 Val Ser Gly Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile 80 85 90 att act gct ggt gct aga caa caa gaa ggt gaa tct aga ttg aat ttg 339 Ile Thr Ala Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu 95 100 105 gtt caa aga aat gtt aat att ttt aaa ttt att att cca aat att gtt 387 Val Gln Arg Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val 110 115 120 125 aaa tat tct cca aat tgt aaa ttg ttg gtt gtt tct aat cca gtt gat 435 Lys Tyr Ser Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp 130 135 140 att ttg act tat gtt gct tgg aaa att tct ggt ttt cca aaa aat aga 483 Ile Leu Thr Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg 145 150 155 gtt att ggt tct ggt tgt aat ttg gat tct gct aga ttt aga tat ttg 531 Val Ile Gly Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu 160 165 170 atg ggt gaa aga ttg ggt gtt cat cca ttg tct tgt cat ggt tgg att 579 Met Gly Glu Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile 175 180 185 ttg ggt gaa cat ggt gat tct tct gtt cca gtt tgg tct ggt gtt aat 627 Leu Gly Glu His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn 190 195 200 205 gtt gct ggt gtt tct ttg aaa aat ttg cat cca gaa ttg ggt act gat 675 Val Ala Gly Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp 210 215 220 gct gat aaa gaa caa tgg aaa gct gtt cat aaa caa gtt gtt gat tct 723 Ala Asp Lys Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser 225 230 235 gct tat gaa gtt att aaa ttg aaa ggt tat act tct tgg gct att ggt 771 Ala Tyr Glu Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly 240 245 250 ttg tct gtt gct gat ttg gct gaa tct att atg aaa aat ttg aga aga 819 Leu Ser Val Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg 255 260 265 gtt cat cca att tct act atg att aaa ggt ttg tat ggt att aaa gaa 867 Val His Pro Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu 270 275 280 285 gat gtt ttt ttg tct gtt cca tgt att ttg ggt caa aat ggt att tct 915 Asp Val Phe Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser 290 295 300 gat gtt gtt aaa gtt act ttg act cat gaa gaa gaa gct tgt ttg aaa 963 Asp Val Val Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys 305 310 315 aaa tct gct gat act ttg tgg ggt att caa aaa gaa ttg caa ttt 1008 Lys Ser Ala Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 320 325 330 taataactcg agcttggttg aacacgttgc caaggcttaa gtga 1052 <210> 4 <211> 332 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Modified DNA coding lactate dehydrogenase <400> 4 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 5 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 5 acagaattca caatggctac tttgaaagat caattgattc aaaatttgtt gaaagaagaa 60 catgttccac aaaataaaat tactattgtt ggtgttggtg 100 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 6 acagaattca caatggctac 20 <210> 7 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 7 atgataacaa ccacaaccac gacaaccata ccgaacacga taaagataaa actactttct 60 aaaccgacta cttcaacgaa accaactaca ataccttcta 100 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 8 atgataacaa ccacaaccac 20 <210> 9 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 9 tggttgatgt tatggaagat aaattgaaag gtgaaatgat ggatttgcaa catggttctt 60 tgtttttgag aactccaaaa attgtttctg gtaaagatta 100 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 10 tggttgatgt tatggaagat 20 <210> 11 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 11 taacaaagac catttctaat attacaatga cgattaagat ctaaccaata ataatgacga 60 ccacgatctg ttgttcttcc acttagatct aacttaaacc 100 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 12 taacaaagac catttctaat a 21 <210> 13 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 13 tgaatctaga ttgaatttgg ttcaaagaaa tgttaatatt tttaaattta ttattccaaa 60 tattgttaaa tattctccaa attgtaaatt gttggttgtt 100 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 14 tgaatctaga ttgaatttgg t 21 <210> 15 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 15 taacatttaa caaccaacaa agattaggtc aactataaaa ctgaatacaa cgaacctttt 60 aaagaccaaa aggtttttta tctcaataac caagaccaac 100 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 16 taacatttaa caaccaacaa a 21 <210> 17 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 17 agagttattg gttctggttg taatttggat tctgctagat ttagatattt gatgggtgaa 60 agattgggtg ttcatccatt gtcttgtcat ggttggattt 100 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 18 agagttattg gttctggttg t 21 <210> 19 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 19 cagaacagta ccaacctaaa acccacttgt accactaaga agacaaggtc aaaccagacc 60 acaattacaa cgaccacaaa gaaacttttt aaacgtaggt 100 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 20 cagaacagta ccaacctaaa a 21 <210> 21 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 21 ctttgaaaaa tttgcatcca gaattgggta ctgatgctga taaagaacaa tggaaagctg 60 ttcataaaca agttgttgat tctgcttatg aagttattaa 100 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 22 ctttgaaaaa tttgcatcca g 21 <210> 23 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 23 agacgaatac ttcaataatt taactttcca atatgaagaa cccgataacc aaacagacaa 60 cgactaaacc gacttagata atacttttta aactcttctc 100 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 24 agacgaatac ttcaataatt t 21 <210> 25 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 25 tatgaaaaat ttgagaagag ttcatccaat ttctactatg attaaaggtt tgtatggtat 60 taaagaagat gtttttttgt ctgttccatg tattttgggt 100 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 26 atgaaaaatt tgagaagagt 20 <210> 27 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 27 gacaaggtac ataaaaccca gttttaccat aaagactaca acaatttcaa tgaaactgag 60 tacttcttct tcgaacaaac ttttttagac gactatgaaa 100 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 28 gacaaggtac ataaaaccca g 21 <210> 29 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 29 aaaaaatctg ctgatacttt gtggggtatt caaaaagaat tgcaatttta ataactcgag 60 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 30 aaaaaatctg ctgatacttt g 21 <210> 31 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 31 acgttaaaat tattgagctc gaaccaactt gtgcaacggt tccgaattca ct 52 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 32 acgttaaaat tattgagctc g 21 <210> 33 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 33 atatatggat ccgcgtttat ttacctatct c 31 <210> 34 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 34 atatatgaat tctttgattg atttgactgt g 31 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 35 atatatctcg aggccagcta acttcttggt cgac 34 <210> 36 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 36 atatatgaat tctttgattg atttgactgt g 31 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 37 tggttgatgt tatggaagat 20 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 38 gacaaggtac ataaaaccca g 21 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 39 gtaataaaca caccccgcg 19 <210> 40 <211> 971 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 40 aagggtagcc tccccataac ataaactcaa taaaatatat agtcttcaac ttgaaaaagg 60 aacaagctca tgcaaagagg tggtacccgc acgccgaaat gcatgcaagt aacctattca 120 aagtaatatc tcatacatgt ttcatgaggg taacaacatg cgactgggtg agcatatgct 180 ccgctgatgt gatgtgcaag ataaacaagc aagacggaaa ctaacttctt cttcatgtaa 240 taaacacacc ccgcgtttat ttacctatct ttaaacttca acaccttata tcataactaa 300 tatttcttga gataagcaca ctgcacccat accttcctta aaagcgtagc ttccagtttt 360 tggtggttcc ggcttccttc ccgattccgc ccgctaaacg catatttttg ttgcctggtg 420 gcatttgcaa aatgcataac ctatgcattt aaaagattat gtatgctctt ctgacttttc 480 gtgtgatgaa gctcgtggaa aaaatgaata atttatgaat ttgagaacaa ttctgtgttg 540 ttacggtatt ttactatgga ataattaatc aattgaggat tttatgcaaa tatcgtttga 600 atatttttcc gaccctttga gtacttttct tcataattgc ataatattgt ccgctgcccg 660 tttttctgtt agacggtgtc ttgatctact tgctatcgtt caacaccacc ttattttcta 720 actatttttt ttttagctca tttgaatcag cttatggtga tggcacattt ttgcataaac 780 ctagctgtcc tcgttgaaca taggaaaaaa aaatatatta acaaggctct ttcactctcc 840 ttgcaatcag atttgggttt gttcccttta ttttcatatt tcttgtcata ttcctttctc 900 aattattatt ttctactcat aaccacacgc aaaataacac agtcaaatca atcaaagatc 960 ccccaattct c 971 <210> 41 <211> 999 <212> DNA <213> Bovine <400> 41 atggcaactc tcaaggatca gctgattcag aatcttctta aggaagaaca tgtcccccag 60 aataagatta caattgttgg ggttggtgct gttggcatgg cctgtgccat cagtatctta 120 atgaaggact tggcagatga agttgctctt gttgatgtca tggaagataa actgaaggga 180 gagatgatgg atctccaaca tggcagcctt ttccttagaa caccaaaaat tgtctctggc 240 aaagactata atgtgacagc aaactccagg ctggttatta tcacagctgg ggcacgtcag 300 caagagggag agagccgtct gaatttggtc cagcgtaacg tgaacatctt taaattcatc 360 attcctaata ttgtaaaata cagcccaaat tgcaagttgc ttgttgtttc caatccagtc 420 gatattttga cctatgtggc ttggaagata agtggctttc ccaaaaaccg tgttattgga 480 agtggttgca atctggattc agctcgcttc cgttatctca tgggggagag gctgggagtt 540 cacccattaa gctgccatgg gtggatcctt ggggagcatg gtgactctag tgtgcctgta 600 tggagtggag tgaatgttgc tggtgtctcc ctgaagaatt tacaccctga attaggcact 660 gatgcagata aggaacagtg gaaagcggtt cacaaacaag tggttgacag tgcttatgag 720 gtgatcaaac tgaaaggcta cacatcctgg gccattggac tgtcagtggc cgatttggca 780 gaaagtataa tgaagaatct taggcgggtg catccgattt ccaccatgat taagggtctc 840 tatggaataa aagaggatgt cttccttagt gttccttgca tcttgggaca gaatggaatc 900 tcagacgttg tgaaagtgac tctgactcat gaagaagagg cctgtttgaa gaagagtgca 960 gatacacttt gggggatcca gaaagaactg cagttttaa 999

【図面の簡単な説明】

【図１】全合成したＬＤＨ活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す図である。

【図２】サッカロマイセス・セレビシエにおけるコドン
用法と使用頻度を示す図である。

【図３】ウシ由来のＬＤＨの塩基配列とこれを改変設計
した塩基配列とのホモロジー解析結果を示す図である。
上段がウシ由来のＬＤＨ塩基配列であり、下段が改変塩
基配列であり、改変塩基配列においてウシ由来の塩基配
列と異なる塩基が記号（Ａ，Ｔ，ＣあるいはＧ）で記載
されている。

【図４】実施例１で用いたＰＣＲによる長鎖ＤＮＡ合成
に使用したプライマー構成と、合成ステップ（ステップ
１〜４）を示す図である。

【図５】構築されたベクターｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−Ｌ
ＤＨＫＣＢのプラスミドマップを示す図である。

【図６】図５に示すベクターの構築工程の一部を示す図
である。

【図７】ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨの構築工程の一
部を示す図である。

【図８】ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨの構築工程の一
部を示す図である。

【図９】図５に示すベクターの構築工程の一部（最終工
程）を示す図である。

【図１０】実施例において得られた形質転換体における
染色体ＤＮＡ上のターゲット部位の構造変化を示す図で
ある。

【図１１】実施例における乳酸生産量を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (72)発明者平井正名愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番地の１株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者今枝孝夫愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番地の１株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者宮崎力愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番地の１株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者徳弘健郎愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番地の１株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者齋藤聡志愛知県豊田市トヨタ町一番地トヨタ自動車株式会社内 (72)発明者早乙女理愛知県豊田市トヨタ町一番地トヨタ自動車株式会社内 (72)発明者保谷典子愛知県豊田市トヨタ町一番地トヨタ自動車株式会社内 (72)発明者松尾康生愛知県豊田市トヨタ町一番地トヨタ自動車株式会社内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 BA80 CA02 CA05 DA01 DA02 DA05 DA12 EA04 FA02 4B064 AD33 CA06 CA19 CC24 DA01 DA10 4B065 AA80 AA88 AA90 AB01 AC14 BA02 CA10 CA41 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（ａ）および（ｂ）のいずれかの特
徴を有するＤＮＡ。（ａ）乳酸脱水素酵素活性を備えるタンパク質をコード
し、配列番号１に記載の塩基配列を有する。（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列の全体若しくは一部
の配列からなるＤＮＡあるいはその相補鎖とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズし、乳酸脱水素酵素活性
を備えるタンパク質をコードする塩基配列を有する。
【請求項２】以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの特
徴を有するＤＮＡ。（ｃ）乳酸脱水素酵素活性を備えるタンパク質をコード
し、配列番号３に記載の塩基配列を有する。（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列の全体若しくは一部
の配列からなるＤＮＡあるいはその相補鎖とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズし、乳酸脱水素酵素活性
を備えるタンパク質をコードする塩基配列を有する。
【請求項３】開始コドンを挟んでコザック配列を有す
る、請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡであって、以下の特徴（ｅ）〜
（ｇ）：（ｅ）サッカロマイセス・セレビシエにおけるコドン用
法を用いて設計されている、（ｆ）開始コドンを挟んでコザック配列を有している、
および（ｇ）開始コドンから１００塩基毎に区切られる複数の
領域のＧＣ含量が２０％〜４０％の範囲である、のうち
少なくとも２種類を備える、ＤＮＡ。
【請求項５】前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク
質は、ウシ由来の乳酸脱水素酵素、あるいはウシ由来の
乳酸脱水素酵素のアミノ酸配列において、１若しくは数
個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および／または付加
されたアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項
４記載のＤＮＡ。
【請求項６】配列番号２に示すアミノ酸配列において、
１若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および
／または付加されたアミノ酸配列からなり、乳酸脱水素
酵素活性を有するタンパク質をコードし、配列番号１または３に記載の塩基配列の全部若しくはそ
の一部からなるＤＮＡドあるいはその相補鎖とストリン
ジェントな条件でハイブリダイズする、ＤＮＡ。
【請求項７】配列番号２に示すアミノ酸配列において、
１若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および
／または付加されたアミノ酸配列からなり、乳酸脱水素
酵素活性を有するタンパク質をコードし、配列番号１あるいは配列番号３のコード領域の塩基配列
において、前記アミノ酸の置換、欠失、挿入および／ま
たは付加による改変がなされた塩基配列を有する、ＤＮ
Ａ。
【請求項８】請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡか
らなるＤＮＡセグメントと、このＤＮＡセグメントを発現可能に連結されるプロモー
ターセグメント、とを備える、ＤＮＡ構築物。
【請求項９】前記プロモーターセグメントは、サッカロ
マイセス・セレビシエ由来のピルビン酸脱炭酸酵素１遺
伝子プロモーター活性を有する、請求項９記載のＤＮＡ
構築物。
【請求項１０】宿主染色体との相同組換えのためのＤＮ
Ａセグメントを備える、請求項８または９に記載のＤＮ
Ａ構築物。
【請求項１１】請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ
からなるＤＮＡセグメントと、宿主染色体との相同組換えのためのＤＮＡセグメント
と、とを備える、ＤＮＡ構築物。
【請求項１２】請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ
からなるＤＮＡセグメントが宿主染色体のプロモーター
によって制御可能となるように相同組換え用ＤＮＡセグ
メントを備える、請求項１１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１３】前記宿主染色体プロモーターは、サッカ
ロマイセス・セレビシエ由来のピルビン酸脱炭酸酵素１
遺伝子プロモーターである、請求項１１または１２に記
載のＤＮＡ構築物。
【請求項１４】前記ＤＮＡ構築物は、さらに、プラスミ
ド、バクテリオファージ、レトロトランスポゾンおよび
人工染色体からなる群から選択されるいずれかのベクタ
ーの構成セグメントを備える、請求項８〜１３のいずれ
かに記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１５】請求項８〜１３のいずれかに記載のＤＮ
Ａ構築物を用いて宿主細胞を形質転換させて得られる形
質転換体。
【請求項１６】前記宿主細胞は、細菌、酵母、動物細
胞、昆虫細胞および植物細胞のいずれかである、請求項
１５記載の形質転換体。
【請求項１７】前記宿主細胞は、サッカロマイセス・セ
レビシエである、請求項１５記載の形質転換体。
【請求項１８】宿主染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１
遺伝子プロモーターあるいは当該プロモーターと置換さ
れた当該プロモーターのホモログの下流に当該プロモー
ターによって制御可能に連結された、請求項１〜７のい
ずれかに記載のＤＮＡからなるＤＮＡセグメントを備え
る、形質転換サッカロマイセス属酵母。
【請求項１９】請求項１５〜１８のいずれかに記載の形
質転換体に由来する細胞を培養する工程と、前記工程でえられる培養物から乳酸を分離する工程、と
を備える、乳酸の製造方法。