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CN115851802A - 谷氨酸高产菌株的构建方法及其在谷氨酸生产中的应用 - Google Patents

谷氨酸高产菌株的构建方法及其在谷氨酸生产中的应用 Download PDF

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CN115851802A
CN115851802A CN202310069165.3A CN202310069165A CN115851802A CN 115851802 A CN115851802 A CN 115851802A CN 202310069165 A CN202310069165 A CN 202310069165A CN 115851802 A CN115851802 A CN 115851802A
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China
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glutamic acid
dna ligase
strain
corynebacterium glutamicum
mutant
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Pending
Application number
CN202310069165.3A
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李德衡
郑平
周文娟
孙际宾
陈久洲
李广玉
蔡柠匀
赵兰坤
倪晓蒙
侍述志
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Hulunbeier Northeast Fufeng Biotechnologies Co ltd
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Original Assignee
Hulunbeier Northeast Fufeng Biotechnologies Co ltd
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及DNA连接酶突变体用于谷氨酸高产菌株的构建方法及其在谷氨酸生产中的应用。该DNA连接酶突变体在对应于SEQ ID NO:3所示的DNA连接酶或其同源酶的基础上，其第442位的苏氨酸被异亮氨酸取代，且其第535位的亮氨酸被苯丙氨酸取代。所述突变体能够明显提高L‑谷氨酸产量及糖酸转化率，可用于构建高产谷氨酸菌株，因而在L‑谷氨酸及其衍生物生产中具有较好的应用前景，由此大大降低谷氨酸的生产成本，为大规模生产提供了新的选择，具有较大应用价值。

Description

谷氨酸高产菌株的构建方法及其在谷氨酸生产中的应用
技术领域
本发明涉及微生物与生物技术领域，具体涉及谷氨酸高产菌株的构建方法及其在谷氨酸生产中的应用，其由突变型DNA连接酶构建L-谷氨酸生产菌株并用于生产L-谷氨酸。
背景技术
L-谷氨酸是世界第一大氨基酸产品，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应，主要用于生产味精、鸡精等调味料以及各种食品，并在医药、化工、畜牧等领域应用广泛。由于需求量大，产能高，L-谷氨酸的工业发酵一直是我国重要的发酵产业之一。
目前，L-谷氨酸的生产主要通过微生物发酵法生产，其中最主要的生产菌株为谷氨酸棒杆菌。在谷氨酸棒杆菌中，主要由TCA循环的中间产物α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的作用下生产L-谷氨酸，合成路径较短，可用于改造菌株以便提升L-谷氨酸产量的靶点也相对较少，L-谷氨酸生产菌株的性能提升受到较大限制。因此，本领域急需进一步挖掘新的可用于L-谷氨酸改造的靶点，以便进一步提升L-谷氨酸的产量和转化率。
发明内容
本发明通过对前期筛选获得的谷氨酸高产菌株SL4基因组序列分析，发现其DNA连接酶基因编码基因ligA存在点突变，并进一步研究发现由其编码的第442位的苏氨酸被异亮氨酸取代，且其第535位的亮氨酸被苯丙氨酸取代的DNA连接酶可以提高菌株的谷氨酸产量，进而可以提升谷氨酸的生产效率，降低生产成本。在此基础上，完成本发明。
本发明首先提供一种谷氨酸高产菌株的构建方法，其特征在于，出发菌株是L-谷氨酸的生产菌株，且其中导入有DNA连接酶蛋白突变体编码基因，所述DNA连接酶蛋白突变体的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的第442位苏氨酸被异亮氨酸取代，以及第535位的亮氨酸被苯丙氨酸取代。
优选地，出发菌株选自棒状杆菌属(Corynebacterium)、泛菌属(Pantoea)、短杆菌属(Brevibacteriumsp)的产谷氨酸菌株；优选地，其为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)更优选地，其为谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生谷氨酸的突变菌株。
进一步地，其出发菌株是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869基础上改造获得的菌株，所述改造包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
a.编码机械敏感通道蛋白的yggB基因(CN108250278A)；
b.编码磷酸转酮酶的fxpk基因(WO2006016705A1)；
c.编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(WO2004069996A2)；
d.编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因(CN103205390A)；
e.编码碳酸酐酶的基因(WO2011024583A1)；
任选地，还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：
a.编码α-酮戊二酸脱氢酶的odhA基因(WO2006028298A2)；
b.编码转录调控基因的amtR基因(EP2276845A1)；
c.编码转录抑制子的acnR基因(CN111334535A)；
更进一步地，在所述菌中的编号为BBD29_06760的基因(NCgl1221同源基因或yggB)中引入A111V突变，柠檬酸合酶GltA引入C361Y突变，获得的谷氨酸生产菌株。
本发明也提供DNA连接酶突变体，所述突变体为氨基酸序列在对应于SEQ ID NO：3所示序列的第442位的苏氨酸被异亮氨酸取代，且其第535位的亮氨酸被苯丙氨酸取代。
进一步地，所述DNA连接酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
其中，本文所述的“DNA连接酶”及其缩写名称“LigA”是指来源于谷氨酸棒杆菌的蛋白，该蛋白可以催化双链DNA中5'-磷酸基和3'-羟基之间的磷酸二酯酶键的形成，对DNA复制和修复受损DNA至关重要。如本文所使用，LigA不被具体限制，只要其具有相应的活性，并且其可以是衍生自谷氨酸棒状杆菌，但是不限于此。例如，LigA可以是如SEQ ID NO:3的氨基酸序列的野生型序列或者与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少75％，具体地至少80％，更具体地85％，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的氨基酸序列。另外，如果氨基酸序列与上述序列具有同源性并且与SEQ ID NO:3的蛋白质具有基本上相同或相应的生物学活性，则具有缺失、修饰、置换或添加的氨基酸序列也应当属于本公开内容的范围是显而易见的。在本发明中，编码LigA的任何多核苷酸序列都属于本公开内容的范围。例如，多核苷酸序列可以是与SEQ IDNO:4的多核苷酸序列具有至少75％，具体地至少80％，更具体地85％，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的多核苷酸序列。另外，基于密码子简并性或考虑生物体表达蛋白质优选的密码子，编码蛋白质的多核苷酸序列可以在不改变从编码区表达的蛋白质的氨基酸序列的范围内具有编码区上的各种变体。
所述“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
所述“片段”意指从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的一种多肽或一个催化或碳水化合物结合模块。在具体的实施方式中，所述片段具有DNA连接酶活性。
所述“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。在一些实施方式中，本发明中野生型的DNA连接酶是指野生型LigA蛋白，也即如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。
所述“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺的多核苷酸，其中，取代是指用不同的核苷酸置换占用一个位置的核苷酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸之后添加核苷酸。在具体的实施方式中，所述“突变”为“取代”，是由一个或多个核苷酸中的碱基被另一个不同的碱基取代所引起的突变，也称为碱基置换突变(substitution)或点突变(point mutation)。
所述“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本发明中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。
在一些实施方式中，所述的“突变”包含在SEQ ID NO：3所示序列的第442位的苏氨酸被异亮氨酸取代，且其第535位的亮氨酸被苯丙氨酸取代。与SEQ ID NO：3所示序列的DNA连接酶相比，含有该突变体的菌株其L-谷氨酸产量提高11％以上。
本发明还提供编码所述DNA连接酶的编码多核苷酸。
所述“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
具体地，本发明的DNA连接酶的编码多核苷酸包括SEQ ID NO:4所示的多核苷酸，且在其1325位和1603位存在突变的多核苷酸。此外，本发明的多核苷酸还包括与SEQ IDNO:4所示多核苷酸具有75％或更高，具体地80％或更高，更具体地85％或更高，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、和99％或更高的同源性的任何多核苷酸。
本发明的术语“同源性”指的是两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分比。一个部分与另一个部分的序列之间的同源性可以通过本领域中已知的技术测定。例如，同源性可以通过使用容易可获得的计算机程序直接排列两个多核苷酸分子或两个多肽分子的序列信息来测定。计算机程序的实例可以包括BLAST(NCBI)、CLC Main Workbench(CLCbio)、MegAlignTM(DNASTAR Inc.)等。另外，多核苷酸之间的同源性可以通过如下步骤来测定：在同源区之间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸，利用单链特异性核酸酶分解，然后对分解的片段进行大小测定。
本发明提供进而提供含有所述DNA连接酶突变体或其编码基因的重组宿主细胞或重组菌株。特别是，所述宿主细胞是L-谷氨酸的生产菌株。
本发明所述的L-谷氨酸生产菌株的构建，是通过将DNA连接酶或其编码基因转化进入宿主细胞中，或者通过同源重组的方式导入宿主细胞中来实现的。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本发明所述“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本发明的具有启动子活性的核酸的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本发明的具有启动子活性的核酸，并且与某一基因可操作性地连接介导该基因的转录。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC14067，以及由上述菌株制备的产生L-氨基酸的突变体或菌株。
同时，本发明提供所述DNA连接酶突变体或其编码基因或重组宿主细胞在提高L-谷氨酸产量和转化率中的应用。
另外，本发明提供了一种生产L-谷氨酸的方法，所述方法包括培养第三方面的宿主细胞使之生产L-谷氨酸，进一步包括例如从培养基中分离提取或回收L-谷氨酸的步骤。其中，在本发明中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
本发明的有益效果：本发明提供的DNA连接酶突变体，可以提高菌株L-谷氨酸的产量和转化率，可用于构建谷氨酸高产菌株，因此可以降低谷氨酸的生产成本，为大规模生产谷氨酸提供了新的选择。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例中所用的培养基如下：
TSB平板培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9g/L；尿素，3g/L；丁二酸，0.5g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.1g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，20g/L；琼脂粉，15g/L。
TSB液体培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9g/L；尿素，3g/L；丁二酸，0.5g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.1g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，20g/L。
谷氨酸发酵实验使用的种子培养基成份为：葡萄糖，25g/L；KH2PO4·3H2O，2.2g/L；尿素，3g/L；玉米浆，33mL；MgSO4·7H2O，0.9g/L；豆饼水解液，22mL；MOPS，20g/L；初始pH7.2。
谷氨酸发酵实验使用的发酵培养基成份为：葡萄糖，80g/L；KH2PO4，1g/L；尿素，10g/L；玉米浆干粉，5g/L；MgSO4·7H2O，0.4g/L；FeSO4·7H2O，10mg/L；MnSO4·4H2O，10mg/L；VB1，200μg/L；MOPS，40g/L；初始pH7.5。
实施例1、LigA突变体编辑质粒构建
发明人前期通过诱变筛选，获得一株能够高产谷氨酸的突变菌株，并命名为SL4(Liu Jiao,et al.,Mutations in Peptidoglycan Synthesis Gene ponA ImproveElectrotransformation Efficiency of Corynebacterium glutamicum ATCC13869.Appl.Environ.Microbiol.,2018,84,e02225-02218.)。通过对SL4菌株的基因组进行测序分析，发现其DNA连接酶发生了突变。鉴于DNA连接酶对DNA复制和修复受损DNA至关重要，我们推测该突变可能在菌株的高产谷氨酸的合成过程中起到一定的作用。
根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组(GenBank:CP016335.1)序列，设计扩增引物ligA-F1/R1、ligA-F2/R2和ligA-F3/R3，以ATCC 13869基因组为模板，PCR扩增获得包含LigAT442I,L535F突变位点的基因片段以及上下游重组片段。根据质粒pK18mobsacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mobsacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段。本实施例所用引物见表1。上述四个片段回收后重组连接，获得带有LigAT442I,L535F突变体的编辑质粒pK18-LigAT442I,L535F。
表1构建突变体编辑质粒引物
引物 核苷酸序列
pK-F AAGCTTGGCACTGGCCGTCG
pK-R GAATTCGTAATCATGTCATAGCTGT
ligA-F1 tgacatgattacgaattcTGATGAATATCCTGTGCCTG
ligA-R1 caaggtagAtcaaacgcgtggacagctga
ligA-F2 gcgtttgaTctaccttgctggtcgtggcg
ligA-R2 acctgcaaAggcgcgcgctgcggtggggc
ligA-F3 cgcgcgccTttgcaggtcgctatcattcc
ligA-R3 cgacggccagtgccaagcttAGAAATGGTCGATGTCATCC
实施例2、突变型LigA的谷氨酸生产菌株构建
(1)L-谷氨酸生产菌株构建
已有文献报道了在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组NCgl1221同源基因(BBD29_06760或yggB)中引入A111V突变，可以使菌株具备组成型合成分泌L-谷氨酸的能力。为了验证上述突变体在L-谷氨酸生产中的应用，首先在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组中引入上述突变。
根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组(GenBank:CP016335.1)序列，设计引物A111V-UH-F/R和A111V-DH-F/R。以ATCC13869基因组为模板，分别利用上述引物通过PCR扩增获得带有YggBA111V突变的DNA片段；根据质粒pK18mobsacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mobsacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段；上述三片段回收后重组连接，对化转后所获得的克隆进行收集并提取质粒，获得YggBA111V突变的编辑载体pK18-YggBA111V。
采用文献报道的方法制备C.glutamicum ATCC 13869感受态细胞(Improving theelectro-transformation efficiency of Corynebacterium glutamicum by weakeningits cell wall and increasing the cytoplasmic membrane fluidity,BiotechnologyLetters,2015,37:2445-52.)，向上述制备获得的13869感受态细胞电转化1μg的pK18-YggBA111V质粒，加入1mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6min，30℃孵育3h，涂布含有25μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养1天，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养6h后涂布于添加100g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得L-谷氨酸生产菌株SCgGC5。
前期研究表明，GltAC361Y突变可显著提高菌株的L-谷氨酸产量，因此，本发明将该突变体引入到SCgGC5中，获得更高产量的L-谷氨酸生产菌株。具体操作如下：根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组(GenBank:CP016335.1)序列，设计引物gltA-F1/R1和gltA-F2/R2，以ATCC 13869基因组为模板，扩增包含GltAC361Y突变体的上游和下游重组片段。根据质粒pK18mobsacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mobsacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段。上述三片段回收后重组连接，获得带有GltAC361Y突变体的编辑质粒pK18-GltAC361Y。
采用同样的方法制备SCgGC5感受态细胞，向SCgGC5感受态细胞电转化1μg的pK18-GltAC361Y质粒，加入1mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6min，30℃孵育3h，涂布含有25μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养24h，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养4h后涂布于添加100g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得带有YggBA111V和GltAC361Y突变体的菌株SCgGC7。本实施例所用引物见表2。
表2本实施例所用引物
引物 核苷酸序列
A111V-UH-F tgacatgattacgaattcATCCACTGGAGTTTTGCCAATTCTC
A111V-UH-R gtcttggtGTGcagtcgattgttgcg
A111V-DH-F atcgactgCACaccaagaccaatggc
A111V-DH-R cgacggccagtgccaagcttTGGAGGAATAGAGCGGGTCATACAC
pK-F AAGCTTGGCACTGGCCGTCG
pK-R GAATTCGTAATCATGTCATAGCTGT
gltA-F1 tgacatgattacgaattcTTTGACCCAGGTTATGTGAG
gltA-R1 aatcatcagccagtgcaatttct
gltA-F2 cactggctgatgattActtcatctcccgcaa
gltA-R2 cgacggccagtgccaagcttCGGAAATCATAGAGCGACAA
(2)含有LigA突变体的生产菌株的构建
采用同样的方法制备L-谷氨酸生产菌株SCgGC7感受态细胞，向上述制备获得的SCgGC7感受态细胞电转化1μg的pK18-LigAT442I,L535F质粒，加入1mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6min，30℃孵育3h，涂布含有25μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养24h，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养4h后涂布于添加100g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得带有突变型LigA的L-谷氨酸生产菌株SCgGC7-LigAT442I,L535F，该菌株中表达突变后的LigA(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，其对应的野生型LigA的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
其中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列如下：
MTEDNAQLRRTWNDLAEKVRYHRDRYYNEQPEIPDADFDALFKQLQQLEEDHPELAVPDSPTMVVG
APVAEQSSFDNVEHLERMLSLDNVFDEQELRDWLGRTPAKQYLTELKIDGLSIDLVYRNGQLERAATR
GDGRVGEDITANARVIEDIPHQLQGTDEYPVPAVLEIRGEVFITVEDFPEVNAQRIADGGKPFANPRNA
AAGSLRQKNIEDVKKRRLRMISHGIGFTEGFSPASQHDAYLALAAWGLPTSPYTEAVTDPEDVVKKVS
YWADHRHDALHEMDGLVIKVDDIASQRALGSTSRAPRWAIAYKYPPEEVTTKLLDIQVGVGRTGRVT
PFAVMEPVLVAGSTVSMATLHNQSEVKRKGVLIGDTVVIRKAGEVIPEVLGPVVELRDGTEREYIFPTL
CPECGTRLAPAKADDVDWRCPNMQSCPGQLSTRLIYLAGRGAFDIEALGEKGADDLIRTGILLDESGL
FDLTEDDLLSSNVYTTNAGKVNASGKKLLDNLQKSKQTDLWRVLVALSIRHVGPTAARAFAGRYHSIQ
ALNDAPLEELSETDGVGTIIAQSFKDWFEVDWHKAIVDKWAAAGVTMEEEVGEVAEQTLEGLTIVVT
GGLEGFTRDSVKEAIISRGGKASGSVSKKTDYVVVGENAGSKATKAEELGLRILDEAGFVRLLNTGSA
DE。
SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列如下：
gtgactgaagataatgctcaactgcgtagaacgtggaacgacttagccgagaaggttcgttatcaccgagatcgttattacaacgaacagccagagatccctgat
gctgattttgatgcgctttttaagcagcttcagcagttggaagaagaccacccggagctcgccgtccctgatagccccacgatggttgtgggcgctccggtggca
gagcaatcaagctttgacaatgttgagcacttggagcgaatgctcagcttggacaatgtttttgatgagcaggagttgcgtgattggttgggcaggacgccagcca
agcagtatttgacggagttgaaaattgatggcttgtccatcgacttggtgtatcgcaatggccagttagagcgtgcggctactcgtggtgatggtcgcgtgggcga
ggacatcacggccaatgctcgcgtgatcgaagatatcccgcaccagcttcagggcactgatgaatatcctgtgcctgctgtgctggagattcgcggtgaggtgtt
catcactgtggaggatttcccagaggtcaacgcgcagcgcattgctgatggtggcaagccgtttgccaacccgcgtaatgctgcggctggttctctgcgtcagaa
aaatattgaggacgtgaagaagcgtcgcctgcggatgatcagccatggcatcggtttcactgaaggctttagccctgcgtctcagcatgatgcgtatctggcattg
gctgcctggggtttgcccacctcgccgtacacagaggctgtgactgatccagaagatgtggtgaaaaaggtcagctactgggctgatcaccgccacgacgcac
tccatgagatggatggcctggtgattaaggtcgatgacatcgcatctcagcgtgctttgggctccaccagccgcgcgcctcgctgggccattgcgtataagtacc
ctccggaggaggtcaccaccaagctgcttgatattcaggttggcgttggtcgcaccggccgtgtcaccccattcgcggtcatggagcctgttcttgttgcaggatc
aacggtgtctatggcgacgctgcataaccagagcgaagtcaagcgtaaaggcgtgctcatcggtgacaccgtggtcatccgcaaggcgggcgaggttatccc
agaggtgcttggccctgtcgtagagcttcgtgacggcacagagcgcgagtacatcttcccaacgctgtgcccagaatgcggtacccgtctggcgcccgcgaag
gccgatgacgtggattggcgttgccccaacatgcaaagctgtccaggtcagctgtccacgcgtttgaTctaccttgctggtcgtggcgcttttgatattgaagcatt
gggcgaaaagggcgctgatgacctcatccgcaccggcattttgcttgacgagtctggcctgttcgacctcacagaggacgatctgctgagctccaatgtctacac
caccaacgccggcaaagtaaatgccagcggcaagaaactgctggacaacctgcaaaaatccaagcagaccgacctctggcgagtcctcgtggcactatctatc
aggcacgtaggccccaccgcagcgcgcgccTttgcaggtcgctatcattccatccaggcgcttaacgacgcccccctcgaggaactctccgaaaccgatgga
gtaggtaccatcattgcccaatccttcaaggactggttcgaggttgattggcacaaggccatcgtggacaagtgggcagccgctggtgtgactatggaggaaga
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cgtggcggaaaagcctctggatctgtctcgaagaaaactgactacgtggtggttggtgaaaacgcaggttccaaggccaccaaggcagaagaactagggctg
cgcattctggatgaggcaggattcgtccgtttgctcaataccggctcagctgacgaatag。
SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列如下：
MTEDNAQLRRTWNDLAEKVRYHRDRYYNEQPEIPDADFDALFKQLQQLEEDHPELAVPDSPTMVVG
APVAEQSSFDNVEHLERMLSLDNVFDEQELRDWLGRTPAKQYLTELKIDGLSIDLVYRNGQLERAATR
GDGRVGEDITANARVIEDIPHQLQGTDEYPVPAVLEIRGEVFITVEDFPEVNAQRIADGGKPFANPRNA
AAGSLRQKNIEDVKKRRLRMISHGIGFTEGFSPASQHDAYLALAAWGLPTSPYTEAVTDPEDVVKKVS
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PFAVMEPVLVAGSTVSMATLHNQSEVKRKGVLIGDTVVIRKAGEVIPEVLGPVVELRDGTEREYIFPTL
CPECGTRLAPAKADDVDWRCPNMQSCPGQLSTRLTYLAGRGAFDIEALGEKGADDLIRTGILLDESGL
FDLTEDDLLSSNVYTTNAGKVNASGKKLLDNLQKSKQTDLWRVLVALSIRHVGPTAARALAGRYHSI
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TGGLEGFTRDSVKEAIISRGGKASGSVSKKTDYVVVGENAGSKATKAEELGLRILDEAGFVRLLNTGS
ADE。
实施例3、LigA突变体对L-谷氨酸合成的影响
为了验证LigA突变体对谷氨酸产量的效果，对上述构建的SCgGC7-LigAT442I,L535F菌株进行发酵测试，同时以菌株SCgGC7作为对照。
首先将菌株接种到种子培养基中培养8h，培养物作为种子接种到每孔含有800μL发酵培养基的24孔板中，初始OD600控制约为0.5，孔板摇床转速为800rpm，每个菌株3个平行，30℃培养，21h补加5g/L尿素，25h发酵结束，检测L-谷氨酸产量和葡萄糖消耗量，并计算从葡萄糖到L-谷氨酸的糖酸转化率。结果如表3所示。
表3L-谷氨酸生产
菌株 L-谷氨酸(g/L) 糖酸转化率(g/g，％)
ATCC 13869 0.20±0.00 0.27±0.00
SCgGC5 4.50±0.22 5.86±0.33
SCgGC7 8.53±0.31 12.03±0.56
SCgGC7-LigA<sup>T44</sup>2I,L535F 9.53±0.92 13.14±1.44
从表中可知，突变体LigAT442I,L535F相对于对照菌株SCgGC7，L-谷氨酸的产量提高了约12％，可见其能够明显提高L-谷氨酸产量及糖酸转化率，与YggB以及GltA突变体组合改造同样可以显著提高L-谷氨酸的生产水平，在L-谷氨酸及其衍生物生产中具有应用价值。

Claims (10)

1.一种谷氨酸高产菌株的构建方法，其特征在于，出发菌株是L-谷氨酸的生产菌株，且其中导入有DNA连接酶蛋白突变体编码基因，所述DNA连接酶蛋白突变体的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的第442位苏氨酸被异亮氨酸取代，以及第535位的亮氨酸被苯丙氨酸取代。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，出发菌株选自棒状杆菌属（Corynebacterium）、泛菌属（Pantoea）、短杆菌属（Brevibacteriumsp）的产谷氨酸菌株；优选地，其为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）。更优选地，其为谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生谷氨酸的突变菌株。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，其出发菌株是在谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869基础上改造获得的菌株，所述改造包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
a. 编码机械敏感通道蛋白的yggB基因；
b. 编码磷酸转酮酶的fxpk基因；
c. 编码丙酮酸羧化酶的pyc基因；
d．编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因；
e．编码碳酸酐酶的基因；
任选地，还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：
a.编码α-酮戊二酸脱氢酶的odhA基因；
b.编码转录调控基因的amtR基因；
c.编码转录抑制子的acnR基因；
更进一步地，在所述菌中的编号为BBD29_06760的基因（NCgl1221同源基因或yggB）中引入A111V突变，柠檬酸合酶GltA引入C361Y突变，获得的谷氨酸生产菌株。
4.一种DNA连接酶蛋白突变体，其特征在于，其氨基酸序列在对应于SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的第442位苏氨酸被异亮氨酸取代，以及第535位的亮氨酸被苯丙氨酸取代。
5.如权利要求4所述DNA连接酶蛋白突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
6.如权利要求4或5所述DNA连接酶蛋白突变体的编码多核苷酸，优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 4。
7.含有如权利要求6所述的编码多核苷酸的表达载体。
8.含有如权利要求6所述的编码多核苷酸的重组宿主细胞。
9.如权利要求4或5所述的DNA连接酶蛋白突变体、或如权利要求6所述的编码多核苷酸、或如权利要求7所述的表达载体，或如权利要求8所述的重组宿主细胞在生产L-谷氨酸中的应用。
10.一种制备L-谷氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：
培养如权利要求1-3任一项所述的构建方法得到的谷氨酸高产菌株，使之产生含L-谷氨酸的培养液；和任选地从所述培养液中分离产生的L-谷氨酸。
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