KR101410845B1 - 새로운 프로리파제-보바인 트립시노겐 융합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 프로리파제-보바인 트립시노겐(PLBTR) 융합 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 이의 제조 및 이용에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 정상적으로 자가촉매 활성에 민감한 이종 폴리펩타이드를 포함하는 PLBTR 융합 단백질을 다량 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 재조합 숙주 세포에 의해 원하는 양으로 발현시킬 수 있는, 리파제 신호 서열에 융합된 세린 프로테아제와 같은 이종 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은, 또한, 이러한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 융합 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드/벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 상기 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 프로리파제-보바인 트립시노겐(PLBTR) 융합 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 이의 제조 및 이용에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 정상적으로는 자가촉매 활성에 민감한 이종 폴리펩타이드를 포함하는 PLBTR 융합 단백질을 적정량 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 재조합 숙주 세포에 의해 원하는 양으로 발현시킬 수 있는, 리파제 신호 서열에 융합된 세린 프로테아제와 같은 이종 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은, 또한, 이러한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 융합 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드/벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 상기 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
트립신은 많은 산업적 생의학적 활용성을 가지고 있는 매우 유용한 프로테아제이다. 특별한 특성을 가진 트립신에 대한 비-동물계 자원의 수요 증가는 상기 프로테아제를 미생물에 클로닝하여 발현시키고자 하는 관심을 불러 일으키고 있다. 재조합 트립신의 발현에 대한 보고서들은, 단백질의 발현과 관련된 어려움과 자가촉매 특성으로 인하여, 성공율에 큰 차이가 있다고 기술하고 있다. 효모 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)는 트립신 생산에 있어 가장 가능성있는 미생물 숙주인 것으로 보인다.
트립신은 췌장의 선방 세포에서 비활성 전구체인 트립시노겐으로서 분비되는 약 25 kDa의 세린 프로테아제이다. 아미노산 DDDDK로 이루어진 활성화 펩타이드는 트립시노겐에서 성숙형 트립신의 앞에 존재하며, 소장의 내강에서 엔테로키나제에 의해 절단된다. 활성화된 트립신은 접근가능한 아르기닌 (R) 및 라이신 (K) 아미노산 잔기들의 카르복시 말단에서 단백질을 절단한다. 트립신은 접근가능한 R 및 K를 포함하고 있는 모든 단백질들을 절단할 뿐만 아니라, 자신의 서열에 대해서도 접근가능한 R 및 K에 작용하여 스스로를 절단한다 (자가촉매 활성). 그래서, 미생물 또는 포유류계에서 재조합 트립신을 생산하기 매우 어렵다. 아울러, 발현 수준도 매우 낮다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 발명자들은 보바인 트립시노겐에 97개의 아미노산으로 구성된 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae)의 리파제 신호 서열을 융합시켜, 피키아 패스토리스에서 발현시켰다. 프로리파제 서열이 존재함으로써, 트립시노겐의 발현을 안정화시키고, 생체내에서의 활성화를 방지하는 것으로 보인다.
프로리파제는, 단백질을 막 안으로 또는 막을 통과하여 수송하거나 또는 세포외 기질로 분비하는데 필수적인 신호 서열과는 구별되는, 리파제의 N-말단의 연장으로서 작용한다. 리조푸스 오리재 유래 리파제의 69개의 아미노산 프로펩타이드 영역 바로 다음에는 26개의 아미노산 신호 서열이 존재한다. 기존 연구들을 통해, 프로리파제 영역에서의 돌연변이 (C56 -> S)가 리파제의 폴딩을 늦추는 것으로 확인되었다 (Beer H.D., Wohlfahrt G., Schmid R.D., McCarthy J.E.G., Biochem. J. 319:351-359, 1996). 천연 보바인 트립시노겐의 프로영역을 리조푸스 오리재의 리파제 유래 프로리파제 영역으로 대체시키면, 재조합 보바인 트립시노겐의 안정성과 수율이 놀라운 수준으로 개선되었다.
당해 기술 분야에서는 현재 일반적으로 적합한 숙주 세포에서 발현되는 이종의 융합 폴리펩타이드를 만족할만한 수준으로/최적으로 정제가능한 형태로 제조하는 적용가능한, 방법을 제공하지 못하고 있다.
따라서, 전술한 종래 기술의 한계가 해결된 방법에 대한 필요성이 광범위하게 인식되고 있으며, 따라서 이러한 방법을 제공하는 것이 매우 유익할 것이다.
본 발명의 변형된 새로운 프로리파제-보바인 트립시노겐 융합 단백질은 종래 기술의 전술한 다수의 다른 문제점들과 약점들을 해결한다.
본 발명의 주된 과제는 리파제 신호 서열과 융합된 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 주된 과제는 융합 폴리펩타이드를 발현하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 주된 과제는 전술한 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 주된 과제는 전술한 서열을 발현가능한 형태로 포함하는 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
이에, 본 발명은, 리파제 신호 서열과 융합된 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함하는 융합 폴리펩타이드로서, 메틸로트로픽 효모에서 발현되며 서열번호 1과 80% 이상 상동한 아미노산 서열을 가지는 융합 폴리펩타이드; 리파제 신호 서열에 융합된 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함하며, 서열번호 2와 80% 이상 상동한 뉴클레오티드 서열을 가지는 융합 폴리펩타이드; 메틸로트로픽 효모로부터 생산되는, 리파제 신호 서열과 융합된 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함하며, 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상 상동한 뉴클레오티드 서열을 갖는, 융합 폴리펩타이드의 발현 방법; 상기 서열을 포함하는 벡터; 및 상기 서열을 발현가능한 형태로 포함하는 형질전환된 세포에 관한 것이다.
도 1: 프로리파제 및 보바인 트립시노겐 코딩 서열의 PCR 증폭 산물.
도 2: 융합된 PLBTR의 PCR 증폭 산물.
도 3: XbaI 및 BamHI을 이용한 제한효소 분석에 의한 양성 클론들의 스크리닝.
도 4: A, 여러가지 클론들로부터 수득한 프로리파제 보바인 트립시노겐의 분석.
B, SDS PAGE 및 트립시노겐 항원을 이용한 웨스턴 블롯
C, 활성화된 PLBTR을 나타내는 SDS PAGE
레인 1: 단백질 분자량 마커
레인 2: PLBTR 클론 #1
레인 3: PLBTR 클론 #2
레인 4: PLBTR 클론 #3
레인 5: PLBTR 클론 #4
레인 6: PLBTR 클론 #5
레인 7: PLBTR 클론 #6
레인 8: GS115 모 균주
도 5: pMBL210 벡터 상세도
도 6: CPLBTR/pMBL210 클론 # 3의 제한효소 프로파일.
레인 1: CPLBTR/pMBL210 클론 #3, EcoRI + XhoI (5400 bp + 1030 bp)
레인 2: CPLBTR/pMBL210 클론 #3, SacI (개환, 6426 bp)
레인 M: 유전자 룰러(ruler) 1Kb DNA 래더(래더).
레인 3: CPLBTR/pMBL210 클론 #3, NdeI + KpnI (4781bp + 1645bp).
레인 4: CPLBTR/pMBL210 클론 #3, XbaI (5104bp + 806bp + 516bp)
도 7: CPLBTR/pMBL210 벡터 상세도.
도 8: 제오신 내성 클론들에 대한 게놈내 유전자 병합을 확인한 PCR.
레인 1-16: 9453 Zeo2500 내성 클로니들.
레인 17: 9453 숙주 (음성 대조군).
레인 18: 양성 대조군 (CPLBTR/pMBL210 플라스미드).
레인 M: 1 Kb DNA 래더.
레인 19-22: 9452 Zeo2500 내성 콜로니들.
레인 23: 9452 숙주 (음성 대조군).
도 9: A, 수개의 9450 클론으로부터 수득한 프로리파제 보바인 트립시노겐의 분석.
B, 수개의 9453 클론으로부터 수득한 프로리파제 보바인 트립시노겐의 분석.
C, SDS PAGE 및 트립시노겐 항체를 이용한 웨스턴 블롯
도 9A: 레인 M = 단백질 분자량 마커
레인 1 = PLBTR 클론 #1
레인 2 = CPLBTR 9450 클론 #1
레인 3 = CPLBTR 9450 클론 #2
레인 4 = CPLBTR 9450 클론 #3
레인 5 = CPLBTR 9450 클론 #4
레인 6 = CPLBTR 9450 클론 #5
레인 7 = CPLBTR 9450 클론 #6
레인 8 = CPLBTR 9450 클론 #7
레인 9 = CPLBTR 9450 클론 #8
도 9B: 레인 M = 단백질 분자량 마커
레인 1 = PLBTR 클론 #1
레인 2 = CPLBTR 9453 클론 #1
레인 3 = CPLBTR 9453 클론 #2
레인 4 = CPLBTR 9453 클론 #3
레인 5 = CPLBTR 9453 클론 #4
레인 6 = CPLBTR 9453 클론 #5
레인 7 = CPLBTR 9453 클론 #6
레인 8 = CPLBTR 9453 클론 #7
레인 9 = CPLBTR 9453 클론 #8
도 9C: 레인 M : 단백질 분자량 마커
레인 1: 표준 트립신
레인 2: 숙주 대조군
레인 3: PLBTR 클론 #1
레인 4: CPLBTR 9450 #1
레인 5: CPLBTR 9453 #6
도 10: SDS PAGE에서의 배지 상층물의 분석 (시료들 모두 15 ㎕로 주입하였음).
도 11: 발효기 운영에서의 전형적인 추세: (T, pH, DO, WCW)
(T = 온도, DO = 용해 산소, WCW = 습윤 세포 중량(wet cell weight)).
도 2: 융합된 PLBTR의 PCR 증폭 산물.
도 3: XbaI 및 BamHI을 이용한 제한효소 분석에 의한 양성 클론들의 스크리닝.
도 4: A, 여러가지 클론들로부터 수득한 프로리파제 보바인 트립시노겐의 분석.
B, SDS PAGE 및 트립시노겐 항원을 이용한 웨스턴 블롯
C, 활성화된 PLBTR을 나타내는 SDS PAGE
레인 1: 단백질 분자량 마커
레인 2: PLBTR 클론 #1
레인 3: PLBTR 클론 #2
레인 4: PLBTR 클론 #3
레인 5: PLBTR 클론 #4
레인 6: PLBTR 클론 #5
레인 7: PLBTR 클론 #6
레인 8: GS115 모 균주
도 5: pMBL210 벡터 상세도
도 6: CPLBTR/pMBL210 클론 # 3의 제한효소 프로파일.
레인 1: CPLBTR/pMBL210 클론 #3, EcoRI + XhoI (5400 bp + 1030 bp)
레인 2: CPLBTR/pMBL210 클론 #3, SacI (개환, 6426 bp)
레인 M: 유전자 룰러(ruler) 1Kb DNA 래더(래더).
레인 3: CPLBTR/pMBL210 클론 #3, NdeI + KpnI (4781bp + 1645bp).
레인 4: CPLBTR/pMBL210 클론 #3, XbaI (5104bp + 806bp + 516bp)
도 7: CPLBTR/pMBL210 벡터 상세도.
도 8: 제오신 내성 클론들에 대한 게놈내 유전자 병합을 확인한 PCR.
레인 1-16: 9453 Zeo2500 내성 클로니들.
레인 17: 9453 숙주 (음성 대조군).
레인 18: 양성 대조군 (CPLBTR/pMBL210 플라스미드).
레인 M: 1 Kb DNA 래더.
레인 19-22: 9452 Zeo2500 내성 콜로니들.
레인 23: 9452 숙주 (음성 대조군).
도 9: A, 수개의 9450 클론으로부터 수득한 프로리파제 보바인 트립시노겐의 분석.
B, 수개의 9453 클론으로부터 수득한 프로리파제 보바인 트립시노겐의 분석.
C, SDS PAGE 및 트립시노겐 항체를 이용한 웨스턴 블롯
도 9A: 레인 M = 단백질 분자량 마커
레인 1 = PLBTR 클론 #1
레인 2 = CPLBTR 9450 클론 #1
레인 3 = CPLBTR 9450 클론 #2
레인 4 = CPLBTR 9450 클론 #3
레인 5 = CPLBTR 9450 클론 #4
레인 6 = CPLBTR 9450 클론 #5
레인 7 = CPLBTR 9450 클론 #6
레인 8 = CPLBTR 9450 클론 #7
레인 9 = CPLBTR 9450 클론 #8
도 9B: 레인 M = 단백질 분자량 마커
레인 1 = PLBTR 클론 #1
레인 2 = CPLBTR 9453 클론 #1
레인 3 = CPLBTR 9453 클론 #2
레인 4 = CPLBTR 9453 클론 #3
레인 5 = CPLBTR 9453 클론 #4
레인 6 = CPLBTR 9453 클론 #5
레인 7 = CPLBTR 9453 클론 #6
레인 8 = CPLBTR 9453 클론 #7
레인 9 = CPLBTR 9453 클론 #8
도 9C: 레인 M : 단백질 분자량 마커
레인 1: 표준 트립신
레인 2: 숙주 대조군
레인 3: PLBTR 클론 #1
레인 4: CPLBTR 9450 #1
레인 5: CPLBTR 9453 #6
도 10: SDS PAGE에서의 배지 상층물의 분석 (시료들 모두 15 ㎕로 주입하였음).
도 11: 발효기 운영에서의 전형적인 추세: (T, pH, DO, WCW)
(T = 온도, DO = 용해 산소, WCW = 습윤 세포 중량(wet cell weight)).
본 발명은, 리파제 신호 서열이 융합된 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함하며, 메틸로트로픽 효모에서 발현되며, 서열번호 1과 80% 이상 상동한 아미노산 서열을 가지는, 융합 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명은, 리파제 신호 서열이 융합된 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함하며, 메틸로트로픽 효모에서 발현되며, 서열번호 2와 80% 이상 상동한 뉴클레오티드 서열을 가지는, 융합 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 서열번호 1 또는 2의 68번 및 69번의 아미노산은 아미노산 아르기닌 및 라이신으로 치환된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 68번의 아미노산으로 타이로신으로 치환된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 인슐린의 전구체 형태, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체를 대응되는 활성 형태로 50% 이상의 단계 수율로 변환시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 메틸로트로픽 효모는 피키아 속(Pichia sp.)에 속한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 메틸로트로픽 효모는 피키아 패스토리스이다.
본 발명은, 메틸로트로픽 효모로부터 생산되는, 리파제 신호 서열과 융합된 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함하며, 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상 상동한 뉴클레오티드 서열을 가지는, 융합 폴리펩타이드의 발현 방법에 관한 것이다.
본 발명의 구현예에서, 세린 프로테아제는 트립시노겐이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 메틸로트로픽 효소는 피키아 속에 속한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 메틸로트로픽 효모는 피키아 패스토리스이다.
본 발명은 전술한 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 전술한 서열을 발현가능한 형태로 포함하는 형질전환된 세포에 관한 것이다.
새로운 프로피라제-보바인 트립시노겐 (PLBTR) 융합 단백질 핵산 서열에 대응되는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 추가적으로, 폴리뉴클레오티드에 대응되는 아미노산 서열도 포함한다. 특히, 본 발명은 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 아울러, 본원에 기술된 핵산 분자 - 서열번호 2 - 에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가진 프로리파제-보바인 트립시노겐을 제공한다.
바람직한 융합된 트립신 세린 프로테아제-유사 단백질들은 천연적으로 형성되는 트립신 세린 프로테아제-유사 단백질이 가지고 있는 한가지 이상의 생물 활성을 가진다.
본 발명은 서열 목록에 기술된 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열과 실질적으로 상동적인 변이체 핵산 분자 및 폴리펩타이드를 포함한다. 아울러, 상기 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 단편 및 실질적으로 상동한 단편들도 제공한다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 핵산 분자의 재조합 발현을 위한 벡터 및 숙주 세포, 뿐만 아니라 상기한 벡터 및 숙주 세포의 제조 방법, 및 재조합 기법에 의해 본 발명의 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 제조하기 위한 이의 이용 방법을 제공한다.
본 발명의 원칙과 작동은 도면과 첨부된 설명을 참조하여 보다 쉽게 이해될 수 있다.
본 발명에 대한 한가지 이상의 구현예들을 상세하게 설명하기 이전에, 본 발명은 아래 설명에 기술되거나 실시예로 예시된 상세한 설명으로 본 발명이 제한되지 않는 것으로 이해된다. 본 발명은 다양한 방식으로 수행 또는 실시할 수 있거나 다른 구현예로 수행할 수 있다. 또한, 본원에서 사용된 표현 및 용어는 설명하기 위한 것일 뿐 이로 제한되는 것으로 간주되지 않는다.
본 발명의 원칙에 대한 설명을 제공하는, 본 발명에 대해 제시된 바람직한 구현예들을 아래 실시예와 더불어 상세하게 참조될 것이다.
아래 실시예들은 본 발명에 대한 설명을 보조하기 위한 것일 뿐, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 실시예들에는 벡터의 구축, 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 상기 벡터로의 삽입 또는 제조되는 플라스미드의 숙주로의 도입에 사용되는 통상적인 방법들에 대한 상세한 설명들이 포함하지 않는다. 또한, 실시예들에는 이러한 숙주 벡터 시스템에 의해 생산되는 폴리펩타이드를 분석하기 위해 사용되는 통상적인 방법에 대한 상세한 설명들도 포함되지 않는다. 이러한 방법들은 당해 기술 분야의 일반 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 예로서 여러가지 간행물들에 기술되어 있다.
다양한 재조합 DNA 기법, 형질전환 (예, 전기충격, 리포펙션) 및 분석에 표준 기법들이 사용된다. 재조합 기법 및 공정들은 일반적으로 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 통상적인 방법에 따라, 그리고 본원에서 인용되고 명세서 전반에 거쳐 기술된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참조문헌들에 기술된 바와 같이, 수행된다. 예로, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001))를 참조하며, 원용에 의해 본원에 포함된다.
본 발명의 설명 및 청구 내용에서, 본원에 기술된 정의에 따라 아래 용어들이 사용된다.
본원에서 달리 언급되지 않은 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 용어와 기술적 용어들은 당해 기술 분야의 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에 따라 다르게 요구되지 않은 한, 단수형 용어들은 복수를 포함하며, 복수형 용어들은 단수를 포함한다. 본 발명의 방법들과 기법들은 일반적으로 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 통상적인 방법에 따라 수행한다. 일반적으로, 본원에 기술된 분자 및 세포 생물학, 생화학, 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련되어 사용되는 명명 및 기법들은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있으며 통상적으로 사용되는 것이다. 본 발명의 방법 및 기법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 통상적인 방법에 따라 일반적으로 수행된다.
본원에서, 용어 "방법"은, 비제한적으로, 화학, 약학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 실무자들에게 공지된 방법, 수단, 기법 및 공정으로부터 쉽게 개발되거나 공지되는 방법, 수단, 기법 빛 공정 등을 비롯하여, 주어진 임무를 달성하기 위한 방법, 수단, 기법 및 공정들을 지칭한다.
본원에서, 용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 용어 "발현 벡터"는 벡터에 의해 운반되는 각 대응되는 재조합 유전자에 의해 코딩되는 대상 단백질을 합성할 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 파지를 포함한다. 바람직한 벡터는 연결된 핵산의 자율적인 복제 및/또는 발현을 행할 수 있는 것이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호 호환적으로 사용되나, 플라스미다가 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태이다. 아울러, 본 발명은 등가의 기능을 제공하며 이후 기술 분야에 공지되는 발현 벡터의 다른 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "재조합"은 본원에서 단백질 또는 폴리펩타이드가 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 제조되는 폴리펩타이드임을 나타낸다. 용어 "재조합"은 본원에서 세포가 재조합 벡터 또는 다른 전달체 DNA에 대한 수여체로 사용될 수 있거나 또는 수여체로 사용된 세포이며, 형질전환된 오리지날 세포의 후대를 포함한다는 것을 의미한다. 단일 모 세포의 후대는, 우발적인 또는 의도적인 돌연변이 유발로 인해, 오리지날 모체와 형태 또는 게놈이 완전히 동일하지 않거나 또는 오리지날 모체와 전체 DNA가 상보적이지 않을 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 원하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재와 같이, 관련 특성으로 특정화된 모체와 충분한 유사성을 가진 모 세포의 후대도 후대로 간주한다.
"대상 유전자" (GOI)는 전사 발현을 증가시킬 원하는 임의의 핵산 서열이다. GOI는 기능적 핵산 분자 (예, 안티센스 RNA 분자와 같은 RNA)를 코딩하거나, 또는 보다 전형적으로 생산 증가를 원하는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩할 수 있다. 본 발명의 벡터는 "이종의" 단백질을 발현하기 위해 사용할 수 있다. 본원에서, 용어 "이종의"는 외부 종으로부터 기원하거나 또는 동일 종으로부터 기원하거나, 또는 동일 종으로부터 유래된 경우 오리지날 형태로부터 실질적으로 변형된, 핵산 서열 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 또한, 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 변형된 또는 비변형된 핵산 서열 또는 폴리펩타이드도 이종으로 간주된다. 본 발명의 벡터는 동일한 또는 다른 삽입부에 삽입된 하나 이상의 GOI를 포함할 수 있으며, 각각의 GOI는 조절 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 GOI의 발현을 허용한다.
프로리파제는 단백질의 막 안으로 또는 막 통과를 통한 수송 또는 세포외 매질로의 분비에 필수적인 신호 서열과는 구별되는, 리파제의 N-말단의 연장으로서 작용한다. 리조푸스 오리재 유래 리파제의 69개의 아미노산으로 이루어진 프로펩타이드 영역 바로 다음에는, 26개의 아미노산 신호 서열이 존재한다. 이전의 연구들에서, 프로파제 영역에서의 돌연변이 (C56 -> S)가 리파제의 폴딩 속도를 낮추는 것으로 확인되었다 (Beer H.D., Wohlfahrt G., Schmid R.D., McCarthy J.E.G., Biochem. J. 319:351-359, 1996). 천연 보바인 트롭시노겐의 프로영역을 리조푸스 오리재 유래 리파제의 프로리파제 영역으로 치환하면, 재조합 보바인 트립시노겐의 안정성과 수율이 놀랍게도 향상되었다.
"작동 요소"는 본원에서 벡터 DNA의 적절한 전사 및 이후 번역에 필수적이거나 바람직한, 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 오퍼레이터, 하나 이상의 리더 서열, 하나 이상의 신-달가노 서열, 하나 이상의 종결자 코돈 및 임의의 다른 DNA 서열들을 포함한다. 특히, 이러한 벡터는, 하나 이상의 선별 마커 및 하나 이상의 프로모터 서열과 더불어, DNA 서열의 전사를 개시시킬 수 있는, 숙주 미생물에 의해 인지되는 하나 이상의 복제 오리진을 함유하는 것으로 이해된다. 벡터는, 일 구현예에서, 조절자로서 기능할 수 있는 특정 DNA 서열과, 조절자 단백질을 코딩할 수 있는 다른 DNA 서열을 포함하는 것도, 또한 바람직하다. 이들 조절자는, 일 구현예에서, 특정 환경 조건에서는 DNA 서열의 발현을 방지하고, 다른 환경 조건에서는 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질을 전사 및 이후 발현이 수행행되게 한다.
본원에서, "아미노산"은 단백질 서열 또는 이의 일부를 지칭한다. 용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 상호 호환적으로 사용된다.
본 발명은 신규 융합된 프로리파제-트립신 세린 프로테아제 분자를 제공한다. "프로리파제-트립신 세린 프로테아제 분자"는 PLBTR로서 지칭되는 새로운 서열, 이의 변형체 및 단편으로 의도된다. 전장의 유전자 서열 또는 이의 단편은 "PLBTR" 서열로서 지칭되며, 이는 이것이 트립신 세린 프로테아제 유전자와의 서열 유사성을 공유한다는 의미이다. 아미노산 서열이 서열번호 2 또는 이의 변형체나 단편으로서 제공되는, PLBTR 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 분리된 핵산 분자가 제공된다. PLBTR 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 표시된다. 서열은 트립신 세린 프로테아제 패밀리에 속한다.
본 발명의 융합 단백질을 발현시키기 위해, 핵산을 유전자 발현을 지시하는 시열과 작동가능하게 연결할 수 있다. 다른 핵산 서열과의 기능적인 관계로 배치될 때, 핵산은 "작동가능하게 연결"되는 것이다. 예컨대, 프로모터 또는 인핸서는, 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은, 연결되어진 핵산 서열들이 연속적이며, 2개의 단백질 코딩 영역들을 연결할 필요가 있을 경우에는 연속적으로 리딩 프래임으로 존재한다는 의미이다.
일반적으로, 발현용으로 선택된 숙주 세포 타입에서 재조합 핵산 서열의 발현을 효율적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 분자 생물학 분야의 당업자는 일반적으로 재조합 폴리펩타이드 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 타입의 조합들에 대해 숙지하고 있다 (예, Sambrook et al., 1989). 사용되는 조절 서열들은, 재조합 폴리펩타이드의 대량 생산에 유익한 등의, 구성적이거나, 조직-특이적이거나, 유도성이거나 및/또는 재조합 핵산 서열의 고수준의 발현을 지시하기 위한 적절한 농도에서 유용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는, 서열번호 1 또는 2와 65% 이상 유사한 아미노산 서열을 가진다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 캐리어 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 서열번호 1 또는 2의 유사성은, 약 66%, 더 바람직하게는 67%, 더 바람직하게는 68%, 더 바람직하게는 69%, 더 바람직하게는 70%, 더 바람직하게는 71%, 더 바람직하게는 72%, 더 바람직하게는 73%, 더 바람직하게는 74%, 더 바람직하게는 75%, 더 바람직하게는 76%, 더 바람직하게는 77%, 더 바람직하게는 78%, 더 바람직하게는 79%, 더 바람직하게는 80%, 더 바람직하게는 81%, 더 바람직하게는 82%, 더 바람직하게는 83%, 더 바람직하게는 84%, 더 바람직하게는 85%, 더 바람직하게는 86%, 더 바람직하게는 87%, 더 바람직하게는 88%, 더 바람직하게는 89%, 더 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 91%, 더 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 93%, 더 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 95%, 더 바람직하게는 96%, 더 바람직하게는 97%, 더 바람직하게는 98%, 더 바람직하게는 99%, 가장 바람직하게는 100%이다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 2와 동일한 아미노산 서열을 가진다.
재조합 발현 시스템은 원핵 및 진핵 숙주들로부터 선택된다. 진핵 숙주는, 효모 세포(예, 사카로마이세스 세레비지애 또는 피키아 패스토리스), 포유류 세포 또는 식물 세포를 포함한다. 박테리아 및 진핵 세포는 당해 기술 분야의 당업자에게 상업적인 소스, 예컨대 ATCC (American Type Culture Collection; Rockville, Md.)를 비롯하여, 여러가지 다수의 소스로부터 이용가능하다. 또한, 재조합 단백질 발현에 사용되는 상업적인 세포 소스는 세포의 용도에 대한 설명을 제공한다. 발현 시스템의 선택은 발현되는 폴리펩타이드에 바람직한 특징에 따라 결정된다.
따라서, 본 발명의 대상은, 피키아 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는, 특히 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica) 및 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효모로부터 유래된 세포에서 기능하는 발현 시스템 또는 카세트이며, 이는 발현에 필수적인 요소의 통제 하에 배치된 그것의 단백질 단편을 코딩하는 바람직한 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다.
숙주 세포는 바람직하게는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 재조합 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발현 조절 서열을 추가로 포함하며, 가용성 융합 단백질을 생산할 수 있도록 숙주 세포에서 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절할 수 있는, 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 일 측면에서, 가장 바람직한 숙주 세포는 메틸로트로픽 효소이다. 본 발명으로 변형시킬 수 있는 메틸로트로픽 효모 균주로는, 피키아, 칸디다(Cadida), 한세눌라(Hansenula) 또는 토룰롭시스(Torulopsis) 속의 효모와 같이, 메탄올에서 증식할 수 있는 효모 균주가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 바람직한 메틸로트로픽 효모는 피키아 속의 효모이다. 본 발명으로 변형시킬 수 있는 메틸로트로픽 효모 균주는 또한 하나 이상의 이종의 대상 단백질을 발현하도록 조작된 메틸로트로픽 효모 균주를 포함한다.
본원에서, 용어 "형질전환된" 또는 "안정적으로 형질전환된"은 비천연 (이종) 폴리뉴클레오티드 서열이 2 계대 이상으로 유지되는 에피좀 플라스미드로 통합되도록 제조된 세포를 지칭한다.
본원에서, "재조합"은 이종 핵산 서열의 도입에 의해 변형된 세포 또는 벡터를 지칭하거나, 또는 세포가 그렇게 변형된 세포로 유래되었음을 지칭한다.
벡터는, 비제한적인 예로서 전기충격, 바이러스 감염, 칼슘 포스페이트 침전, DEAE-덱스트란, 직접 미세주입, DNA-로딩된 리포좀 및 리포펙타민-DNA 복합체, 세포 소니케이션, 고속 마이크로추진을 이용한 유전자 발사 또는 당해 기술 분야에 공지되어 있거나 본원에 기술된 임의의 다른 수단 등의 수단에 의해, 숙주 세포내로 형질전환할 수 있다. 또한, 벡터에는 유전자 발현을 용이하게 하는 기능을 코딩하는 DNA 서열, 전형적으로 프로모터, 전사 개시부, 전사 종결 기능 및 폴리아데닐화 기능을 코딩하는 DNA 서열이 더 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은, 조건 하에, 단백질 화합물 또는 유사체 등을 생산하기에 적합한 배지 중에서, 원하는 최종 산물의 생산을 지시하는데 충분한 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자가 병합되어진 피키아 속과 같은 유기체에서, 발효시키는 단계를 포함하는, 원하는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 보바인 트립신을 재조합에 의해 제조하는 방법에 관한 것이다:
(a) 프로리파제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 보바인 트립시노겐 또는 이의 유도체를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 벡터로 숙주를 형질전환하는 단계;
(b) 상기 형질전환된 숙주를 보바인 트립시노겐을 발현시키고 배지로 분비시키는데 유효한 조건 하에 적정 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
(c) 보바인 트립시노겐 또는 트립신 또는 이의 유도체를 상기 배지에서 회수하는 단계.
본 발명의 추가적인 대상, 효과 및 새로운 특징들은 하기 실시예의 수행을 통해 당해 기술 분야의 당업자들에게 명확해질 것이나, 상기 실시예로 제한되는 것은 아니다. 또한, 전술한 바와 같이 아래 청구항에서 청구된 본 발명의 각각의 다양한 구현예들과 측면들은 아래 실시예들을 통해 실험적으로 뒷받침된다.
본 발명은 아래 실시예를 참조하여 충분히 설명되고 이해될 것이며, 아래 실시예들은 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
당해 기술 분야의 당업자는 용도 및 목적에 따라 본 발명의 가용성 융합 단백질을 생산하기 위해 적정 발현 벡터를 수득 및 이용하기 위한 필수적인 전문 지식을 가지고 있을 것이다. 재조합 폴리펩타이드를 발현하도록 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는데 이용할 수 있는 발현 벡터의 수득 및 이용과 관련된 일반적인 관련 지침들이 아래에 제공된다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 발현 벡터의 수득 및 이용은 실시예 부분에 제공된 가이드라인에 따라 수행된다. 아래 실시예 부분의 실시예들에서 기술되고 예시된 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질은 발현 벡터로 형질전환된 본 발명의 숙주 세포에 의해 적절하게 발현시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 재조합 폴리뉴클레오티드 및/또는 발현 벡터로 형질감염되거나 형질전환된 숙주 세포를 추가로 제공한다. 발현 벡터는 용도 및 목적에 따라 당해 기술 분야의 당업자가 일반적으로 수행하는 임의의 다양한 방식으로 수득할 수 잇다.
본 발명은 아래 실시예 및 도면을 참조하여 더욱 설명된다. 그러나, 이들 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1:
프로리파제-보바인 트립시노겐 융합 단백질의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 나타내며, 이의 아미노산 서열은 서열번호 2로 나타낸다.
리조푸스 오리재 리파제/pPIC9K 벡터로부터 고정확도의 PWO 중합효소 및 아래 프라이머를 이용하여, 프로리파제 유전자 단편을 증폭시켰다.
PRORHILIPFP2= 5'CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GTT CCT GTT TCT GGT AAA TC 3'
PLBTRRP=5' TTG TCA TCG TCA TCG GCG CTG TTG GTA GAT CCA GA 3'
보바인 트립시노겐/TA 벡터로부터 고정확도의 PWO 중합효소 및 아래 프라이머를 이용하여, 보바인 트립시노겐 유전자를 증폭시켰다. 이 보바인 트립시노겐 유전자의 코돈을 Entechelon 웹 기반의 코돈 최적화에 사용되는 소프트웨어를 이용하여 최적화하였다.
PLBTRFP=5' CTA CCA ACA GCG CCG ATG ACG ATG ACA AGA TTG TCG GA 3'
BTRPRP1=5' GCG GCC GCT TAG TTA GAC GCA ATT GTT TGC TTG 3'
이들 산물 2가지를 퀴아젠 겔 추출 키트로 정제하였다. 이 정제된 산물들 각각 2 ㎕를 주형으로 사용하였다. 중첩 PCR을 하기 프라이머를 이용하여 수행하여 프로리파제와 보바인 트립시노겐 코딩 서열을 인-프래임으로 융합하였다. 융합된 산물을 PLBTR로 칭하였다.
PRORHILIPFP2= 5' CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GTT CCT GTT TCT GGT AAA TC 3'
BTRPRP1= 5'GCG GCC GCT TAG TTA GAC GCA ATT GTT TGC TTG 3'
제조되는 PCR 산물을 1% 아가로스 겔로 분석하였다.
정확한 크기의 유전자 산물을 이 아가로스 겔에서 추출하여, 겔 추출에 의해 정제하였다. 산물을 pTZ57R/T 벡터에 16℃에서 하룻밤 라이게이션시켰다. 라이게이션 믹스를 컴피턴트 E.coli DH5α 세포로 형질감염시키고, 100 ㎍/ml 암피실린이 함유된 LB 아가 플레이트 상에서 콜로니를 선별하였다. 수득한 콜로니를 보일링 미니프렛 방법으로 스크리닝하였다. 삽입체를 제한 효소 XbaI 및 BamHI로 절단하여 분리시킴으로써, 삽입체의 존재를 검증하였다. 클론 #11을 선택하여, 퀴아젠 미니프랩 키트를 이용하여 더 많은 플라스미드를 분리하였다.
실시예 2:
pPIC9K로의 산물의 서브-클로닝:
PLBTR 단편을 XhoI 및 EcoRI 부위를 이용하여 잘라, pPIC9K의 동일 부위에 라이게이션하였다. 라이게이션 믹스를 컴피턴트 E.coli DH5α 세포에 형질감염시키고, 100 ㎍/ml 암피실린이 함유된 LB 아가 플레이트 상에서 콜로니를 선별하였다. 수득한 콜로니를 보일링 미니프렛 방법을 스크리닝하였다. 삽입체를 제한 효소 XhoI 및 EcoRI로 절단하여 분리시킴으로써, 삽입체의 존재를 검증하였다. 적합한 클론을 PLBTR/pPIC9k로 명명하고, 제한효소 절단으로 검증하였다.
PLBTR/ pPIC9K 플라스미드로 피키아 패스토리스 GS115 균주의 형질전환:
PLBTR/pPIC9K 벡터를 SacI으로 개환한 다음, 인트로겐 매뉴얼에 기술된 프로토콜에 따라 전기충격에 의해 피키아 패스토리스 GS115에 형질전환하였다. 콜로니 약 1200개를 0.5 mg/ml G418로 스크리닝하였다. 콜로니 41개가 0.5 mg/ml G418에 내성인 것으로 확인되었다. 이를 2 mg/ml G418의 조건 하에 접종하였다.
6개의 내성 콜로니 모두 대상 유전자가 게놈에 병합되어 있는지를 확인하였다. 이들 콜로니를 프로리파제-보바인 트립시노겐 융합 단백질 발현 유도에 대해 조사하였다.
아래 표는 모든 스크리닝 데이타를 나타낸다.
| CFU | 0.5 mg/ml G418 내성인 CFU | 2 mg/ml G418 내성 CFU | PCR 검증 |
| 1200 | 41 | 6 | 6 |
Mut
+
및 Mut
S
에 대한 스크리닝
Mut+ 및 Mut- 형질전환체에 대한 PCR 스크리닝을 AOX 프로모터 FP 프라이머 및 AOX 종결자 RP 프라이머를 이용하여 수행하였다.
GS115에서의 소규모 발현 연구:
교반 플라스크에서 소규모 발현 실험을 수행하였다. 간략하게는, 콜로니를 BMGY에서 30℃에서 배양한 다음, BMMY에서 30℃에서 메탄올로 유도하였다. 메탄올을 이용한 유도는 총 3일간 수행하였다. 발현 실험을 위해 콜로니 6개를 취하였다. 간략하게는, 콜로니를 BMGY에서 30℃에서 배양한 다음, BMMY에서 30℃에서 메탄올로 유도하였다. 메탄올을 이용한 유도는 총 3일간 수행하였다.
실시예 3:
사내 피키아 패스토리스 균주에서의 피키아 코돈으로 최적화된 프로리파제-보바인 트립시노겐(CPLBTR)의 발현
피키아 코돈으로 최적화한 프로리파제-보바인 트립시노겐 융합 단백질에 대한 합성 유전자를 서열번호 3으로 나타낸다.
pMBL210에서의 트립시노겐의 클로닝
1.
PCR 증폭:
프로리파제-보바인 트립시노겐에 대한 PCR 증폭을 Geneart로부터 입수한 플라스미드 0900098 Seq 3 pMA에서 프라이머 CPLBTRFP 및 CPLBTRRP를 이용하여 수행하였다.
- CPLBTRFP: 5' ACC TCG AGA AGA GAG TTC CAG T 3'
- CPLBTRRP: 5' GGG AAT TCT TAG TTA GAA GCG ATA GTT TGC 3'
| 물 | 37 ㎕ |
| 0900098 Seq 3 pMA | 1.5 ㎕ (50 ng) |
| dNTP 믹스 | 5 ㎕ |
| CPLBTRFP | 1 ㎕ (0.01 μmol) |
| CPLBTRRP | 1 ㎕ (0.01 μmol) |
| 10X 연장용 고정확도 분석 완충액 | 5 ㎕ |
| 연장용 고정확성의 중합효소 | 0.5 ㎕ |
| 총 부피 | 50 ㎕ |
| 초기 변성 (1회) | 증폭 (사이클 30회) | 최종 연장 |
| 94℃, 5분 | 94℃, 40초 | 72℃, 10분 |
| 58℃, 40초 | ||
| 72℃, 90초 |
PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 분석하였다.
이 PCR 산물은 전장 길이의 CPLBTR 코딩 서열을 가지고 있었다.
| 물 | 5.5 ㎕ |
| Taq 완충액 | 1.5 ㎕ |
| dATP | 1.5 ㎕ |
| CPLBTR 단편 | 6 ㎕ |
| Taq DNA 중합효소 | 0.5 ㎕ |
| 총 부피 | 15 ㎕ |
상기 반응 믹스를 20분간 72℃에서 인큐베이션하였다.
'A' 꼬리를 단 후, TA 라이게이션의 삽입체로 사용하였다.
2.
TA 라이게이션
벡터 - pTZ57R/T (2894 bp) 55 ng/㎕
삽입체 -'A' 꼬리 달기를 PCR 산물 CPLBTR (1050 bp)에 대해 행한 다음, TA 벡터에 라이게이션하였다.
라이게이션 반응:
| 5X 라이게이즈 완충액 | 4 ㎕ |
| TA 벡터 | 4 ㎕ |
| 삽입체 | 11 ㎕ |
| T4 DNA 라이게이즈 | 1 ㎕ |
| 총 부피 | 20 ㎕ |
라이게이션 반응 믹스를 16℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
3.
형질전환:
라이게이션 믹스를 이용하여 화학적 컴피턴트 E.coli DH5α 세포에 열 충격 방법을 이용하여 형질전환하였다. 재생 믹스를 암피실린 100 ㎍/ml이 함유된 LB 아가 플레이트에 접종하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
4.
스크리닝:
측면 벡터 프라이머 M13FP 및 M13RP를 이용한 콜로니 PCR에 의해 콜로니 24개를 스크리닝하였다. 예상되는 앰플리콘 크기는 1180 bp이었다. 콜로니 18개가 양성인 것으로 확인되었다. 추가적인 분석을 위해 클론 #2로부터 플라스미드 DNA를 준비하였다.
실시예 4
:
pMBL210로의 CPLBTR의 서브클로닝.
1.
라이게이션:
벡터 - pMBL210 (5422 bp)을 XhoI 및 EcoRI 제한 효소로 절단하고, 겔 밴드를 겔 정제함 40 ng/㎕.
삽입체 - CPLBTR/TA를 XhoI 및 EcoRI으로 절단하였다 - 55 ng/㎕.
라이게이션 반응 믹스:
| 물 | 4 ㎕ |
| 10 X 라이게이즈 완충액 | 2 ㎕ |
| 벡터 | 5 ㎕ |
| 삽입체 | 8 ㎕ |
| T 4 DNA 라이게이즈 | 1 ㎕ |
| 총 부피 | 20 ㎕ |
라이게이션 반응 설정은 16℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
pMBL 210 벡터의 상세 내용을 나타낸다.
| F1(IG) | 2-457 bp |
| AOX1 프로모터 | 615 - 1575 bp |
| Mat α 신호 서열 | 1593 - 1865 bp |
| PIC 정방향 프라이머 결합부 | 1801 - 1820 bp |
| PIC 정방향 프라이머 서열 | 5'CTA TTG CCA GCA TTG CTG CT 3' |
| PIC 역방향 프라이머 결합부 | 1913 - 1932 bp |
| PIC 역방향 프라이머 서열 | 5'TGC CCA ACT TGA ACT GAG GA 3' |
| AOX 종결자 | 1890 - 2230 bp |
| pTEF1 프로모터 | 2262 - 2673 bp |
| PEM7 | 2674 - 2741 bp |
| 제옥신 마커 | 2742 - 3116 bp |
| 암피실린 마커 | 4419 - 5279 bp |
피키아 패스토리스에서 PLBTR을 생산하기 위해 사용한 벡터는 pMBL 210 (5422 bp)이며, 이 벡터는 pTZ57R 벡터의 유도체이다. 이 벡터의 특징들 중 일부는 다음과 같다:
- AOX1 프로모터: BICC #9450으로부터 분리된 AOX1 프로모터를 함유하고 있는 단편 ~960 bp로서, 피키아 패스토리스에서 메탄올에 의한 고수준의 발현을 유도할 수 있으며, 또는 AOX1 유전자 좌로의 플라스미드 병합에 표적이 된다.
- α-인자 신호 서열: 사카로마이세스 새래비지애 MAT α-인자 신호 서열을 포함하는 270 bp의 단편으로, 배지로 원하는 단백질을 분비시킴.
- MCS: 발현 벡터에 원하는 유전자를 클로닝할 수 있는 다중 클로닝 부위. α-인자 분비 신호를 인-프래임으로 클로닝하기 위한 고유한 제한 효소 부위는 XhoI, EcoRI이다.
- 2개의 제한 효소: 피키아 게놈으로의 효율적인 병합을 돕는, 벡터의 개환용 BglII 및 SacI.
- 3' AOX1 종결자: AOX1 유전자 유래의 340 bp 서열이며, 3'에 TT 서열을 추가로 포함하고 있으며, AOX1 유전자 좌로의 플라스미드의 병합을 타겟팅함.
- 제옥신 마커: 피키아 패스토리스에서 형질전환을 선별할 수 있게 함.
- 암피실린 내성 유전자: E.coli에서 벡터의 선별 및 유지를 가능하게 함.
2.
형질전환:
라이게이션 믹스를 사용하여 열 충격 방법을 이용하여 화학적 컴피턴트 E.coli DH5α 세포로 형질전환하였다. 재생 믹스를 제옥신 25 ㎍/ml이 함유된 LB 아가 플레이트에 접종하였다. 플레이트를 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다.
3.
스크리닝:
측면 벡터 플라이머를 이용한 콜로니 PCR에 의해 20개의 클론을 스크리닝하였다. 예상되는 앰플리콘의 크기는 1128 bp이었다. 클론 18개는 양성이었다. 플라스미드 DNA를 추후 분석을 위해 클론 #3으로부터 준비하였다.
4.
재조합 플라스미드의 분석:
제한 효소 절단 및 서열 분석으로 CPLBTR/pMBL 210 클론 #3을 분석하였다.
실시예 5:
[B] 피키아 패스토리스에서의 프로리파제 보바인 트립시노겐의 발현
1. 피키아 패스토리스의 형질전환:
[CPLBTR/pMBL210] 클론 #3 플라스미드 DNA를 SacI으로 잘라, 사내 피키아 패스토리스 균주 BICC#9450, #9452 및 #9453의 전기컴피턴트 세포를 형질전환하였다. 컴피턴트 세포에 2000 볼트, 200 Ω 및 25 μFusing Bio-Rad Gene Pulsor XL로 전기충격을 가하였다. 재생 믹스를 YNBD 플레이트에 접종하여 30℃에서 48시간 인큐베이션하였다.
실시예 6:
멀티카피 구성 성분에 대한 스크리닝:
BICC #9450 유래의 형질전환체 약 1000주, BICC #9452 유래의 형질전환체 약 200주, 및 BICC #9453 유래의 형질전환체 600주를 적절한 대조군과 더불어 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 YPD 배지에 접종하였다. 플레이트를 30℃에서 24시간 인큐베이션한 다음, 제옥신 2.5 mg/ml이 함유된 YPD 아가 플레이트 상에 찍었다. 플레이트를 30℃에서 48시간 인큐베이션하였다. BICC #9450에서 Zeo2500 내성 콜로니 10주, BICC #9452에서 Zeo2500 내성 콜로니 4주, 및 BICC #9453에서 Zeo2500 내성 콜로니 21주를 수득하였다.
실시예 7:
PCR에 의한 게놈내 유전자의 병합 검증:
세포 용혈 방법에 의해 선별한 재조합 피키아 클론들로부터 게놈 DNA를 준비하였다. 게놈내 CPLBTR의 병합을 검증하기 위해, 벡터 특이적인 프라이머들 (PICFP 및 PICRP)을 이용한 PCR을 수행하였다. BICC #9450, #9452 및 #9453 숙주 균주들을 각 음성 대조군으로서 사용하였다.
실시예 8:
피키아 패스토리스에서의 소규모 발현 실험
교반 플라스크에서 소규모 발현 실험을 수행하였다. 간략하게는, 콜로니를 BMGY에서 30℃에서 배양한 다음, BMMY에서 30℃에서 메탄올로 유도하였다. 메탄올을 이용한 유도는 총 3일간 수행하였다. 발현 실험을 위해, BICC #9450 및 BICC #9453 각각에서 클론 8개, BICC #9452에서 클론 3개를 취하였다. 간략하게는, 클론을 BMGY에서 30℃에서 배양한 다음, BMMY에서 30℃에서 메탄올로 유도하였다. 메탄올을 이용한 유도는 총 3일간 수행하였다 (도 9).
실시예 9:
발현 분석:
(유도 후 2일 및 3일) 클론들 각각의 조 상층물을 SDS-PAGE 및 코마시 블루로 분석하였다. CPLBTR은 ~35 kDa의 단백질로 분비되었다.
결과:
1. 상기 유도 실험을 통해, CPLBTR 발현용으로 사용되는 피키아 패스토리스 3주들 중 BICC #9450이 최상인 것으로 검증되었다.
2. 테스트한 균주의 클론 8개들 중에서 CPLBTR 9450 클론 #1이 더 역가가 높은 것으로 나타났다.
3. 이후 모든 연구들에서는 이 균주를 사용하기로 정하였다.
세포 은행 조제물:
생산성 및 메탄올 소비 측면에서 CPLBTR 9450 클론 #1이 최상인 것으로 확인되었다. 이 클론을 연구 세포 은행을 만들기 위해 세포 배양 그룹에 제공하였다.
CPLBTR 9450 클론 #1에 할당된 RCB 번호는 BICC #9580이다.
실시예 10:
상위 및 하위 공정의 최적화
프로세스 최적화:
트립시노겐을 발현하는 클론 2종을 50 L 규모에서의 발효 및 산물 회수에 대해 평가하였다. 일반화된 프로세스의 상세 내용은 다음과 같다:
발효 배지 조성물:
| 성분 | 함량 (g/L) |
| CaSO4.2H2O | 0.93 |
| MgSO4.7H2O | 29.8 |
| K2SO4 | 36.4 |
| KOH | 4.13 |
| 글리세롤 | 40 |
| H3PO4 (밀도-1.7) | 22.95 |
| 유레아 | 6.0 |
각각의 성분들을 상기 언급된 순서로 최소량의 물에 녹이고, 1시간 동안 121℃에서 멸균처리하였다. 미량의 염 용액과 D-바이오틴 (여과에 의해 사전-멸균처리함)을 배지에 각각 4.35 ml/L(배지) (미량 염 용액의 농도는 1.05이고, D-바이오틴은 1.0임)의 비율로 무균적으로 첨가하였다.
미량 염 용액의 조성물:
| 성분 (염) | 함량 (g/L) |
| 황화구리, CuSO4.5H2O | 6.0 |
| 요오드화 나트륨, NaI | 0.08 |
| 망간 설페이트, MnSO4.H2O | 3.0 |
| 소듐 몰브데이트, Na2MoO4.2H2O | 0.20 |
| 붕산, H3BO3 | 0.02 |
| 코발트 클로라이드, CoCl2.6H2O | 0.50 |
| 염화 아연, ZnCl2 | 20.0 |
| 황산제일철, FeSO4.7H2O | 65.0 |
| 황산, H2SO4 | 5.0 mL |
염 성분들 모두 음용수에 하나씩 용해시키고, 멸균 등급의 여과 장치를 통한 여과에 의해 멸균 처리하였다.
바이오틴 용액 조제:
D-바이오틴 0.2 g/L
바이오틴을 음용수에 용해시키고, 멸균 등급의 여과 장치를 통한 여과에 의해 멸균 처리하였다.
효모 추출물 및 콩 펩톤 첨가:
추가적으로, 효모 추출물과 콩 펩톤 (YEP) 첨가물을 발현 동안에 첨가하였다. 이것은 다음과 같이 준비하였다:
| 성분 | 농도 (g/L) |
| 콩 펩톤 | 200 |
| 효모 추출물 | 100 |
각 성분들을 용해시키고, 음용수를 필요한 만큼 사용하여 부피를 적정하였다. 그런 후, 용액을 121 - 123 ℃에서 90분간 멸균하였다. YED 첨가물의 밀도는 약 1.05였다. 효모 추출물을 비활성/활성 효모의 유도체물들로 대체할 수 있다. 아울러, 콩 펩톤도 콩가루/밀 유도체들로 대체할 수 있다.
메탄올 투입:
투입하기 전에, 메탄올 1 L 당 미량 염 용액 12.0 ml, D-바이오틴 용액 12 mL, 및 유레아 40 g을 첨가하였다.
발효 공정:
발효 공정은 배치 세포 증식기, 선택적인 글리세롤 공급 배치기 및 메탄올 유도기를 포함한다.
배치 세포 증식기
배치 모니터링 및 조절
생산 발효기 파라미터를 먼저 아래와 같이 설정하여 제조하였다:
온도 : 30℃ ± 2℃
pH : 5 ± 0.2
DO : >10%
운영 시간 : 22 - 26hr
메탄올 유도기 (MIP)
배치기 종료 직후에 메탄올 투입을 개시하였다. 메탄올은 상업적으로 구입가능한 멸균 등급의 필터를 이용한 여과에 의해 멸균(온라인)하였다.
MIP 초기에, pH를 6.0 ± 0.2로 조정하고, 온도를 약 23 ± 2 ℃로 조정하였다.
동시에, 다른 첨가제, 효모 추출물 및 콩 펩톤 첨가물 (YEP) 역시 출발 부피에 0.4 g/L/h의 속도로 발효기에 첨가 개시하였다.
MIP 모니터링 및 제어
온도 : 23.0 ± 2℃
pH : 6.0 ± 0.2
DO : >1% (배지에서 메탄올 농도를 조절하기 위해 사용됨)
운영 시간 : 10-12일
본 발명의 다른 측면에서, 동결건조한 글리세롤 스톡 배양물을 최소 글리세롤 (MGY) 배지에서 배양함으로써, 접종원을 준비하였다. 기본 발효기 배지는 인비트로겐사의 "컨트롤 피키아 프로세스 가이드라인"에 따른 것으로, 오르소-포스포르산, 칼슘 설페이트 데하이드레이티드, 포타슘 설페이트, 마그네슘 설페이트 헵타-하이드레이티드, 포타슘 하이드록사이드, 글리세롤, 미량 염 및 D-바이오틴이 포함된다. 영양 배양 배지에는 Ca, Mg, Mn, Fe, K, Co, Cu, Zn, B, Mo, Br 및 I의 수용성 화합물과 같이 발효 배양 배지에 일반적으로 포함되는 공지된 화합물들이 소량 또는 미량으로 포함되어야 한다. 또한, 다른 미량의 염들도 존재할 수 있다.
하위 프로세스:
하위 프로토콜을 다음과 같다:
원심분리:
최종 발현 배지(EOF)와 일부 회수물들을 5000 rpm에서 30분간 4-8℃에서 원심분리하여야 한다.
미세 여과:
원심분리한 상층액 (CFS)을 PO 1.4 mm ID로 미세 여과하였다. pH는 전과정에서 3.0±0.05 (pH가 매우 중요함)로 유지하였다. 이를 최소 부피로 농축하고, 멸균수로 pH 3.0에서 정용 여과(diafiltration)를 수행하였다. 정용 여과하여 투석유물(retentate)로부터 산물을 수득한다.
초미세 여과:
초미세 여과는 PAN 6000 MWCO로 행하였다. 상층액을 MF 공급량의 약 20배로 농축하였다. 정용 여과를 멸균수(pH-3.0+/-0.05)로 행하여, pH 3.0 + 0.05에서 2 + 1 mS/cm에 가까운 전도성의 최종 투석유물을 수득하였다. 세포 결핍 상층액과 초미세 여과 농축물(UFC)의 전도성 & pH를 초미세 여과 전과 후에 기록하였다.
시약들:
A. 67 mM 소듐 포스페이트 완충액, pH 7.6에서 25℃
B. 0.25 mM Na-벤조일-L-아르기닌 에틸 에스테르 용액 (BAEE)
(시약 A 중에 50 ml로 제조됨)
C. 5 mM 하이드로클로르산 용액 (HCl)
D. 1 M 칼슘 클로라이드 용액 (CaCl2)
E. 1 mM 하이드로클로르산 용액 (HCl)
F. 400 mM 트리스 HCl 완충액, pH 8.4에서 25℃ (완충액)
G. 0.02% (w/v) 트립신 효소 용액 (트립신) (사용 직전 제조, 표준 트립신을 이용하여 시약 C 중에 3 ml로 준비함)
H. 트립시노겐 효소 용액 (트립시노겐) (사용 직전 제조, 시약 C 중에 트립시노겐 5 mg/ml로 함유된 용액으로 준비함)
공정:
아래 시약들을 적정 용액내로 파이펫팅(ml)하여, 활성 혼합물을 제조한다:
시약 D (CaCl2) - 2.00
시약 F (완충액) - 38.00
시약 G (트립신) - 2.00
스윌링에 의해 혼합한다.
단계 1: 총 트립신 활성
0시간에, 시약 H (트립시노겐) 0.1 ml을 활성 혼합물 1 ml에 넣고, 5℃에서 96-120시간 동안 인큐베이션한다. 그런 후, 0.1 ml을 10.2 ml로 시약 E (HCl)를 사용하여 희석한다. 트립신 분석을 수행한다.
계산:
아래 나타낸 계산식을 이용하여 트립시노겐의 총 트립신 활성을 결정할 수 있다.
트립신 활성 (U/ml) = (ΔA253nm/3분 Test - ΔA253nm/3분 Blank) X DF
(0.2*0.003*3)DF - 희석 인자
실시예 11
초기 배지 부피 12 L를 이용하여 상기 언급된 프로토콜에 따라 발효 배치 50 L을 수득하였다. 최종 수확한 배지 함량은 25 L이었다. 배지 샘플을 여러가지 시간 간격으로 취하여, 10000 rpm으로 스핀하여, 투명한 상층액을 수득하였다. 3일 후부터 상층액을 SDS-PAGE 겔로 분석하고, 결과를 아래에 나타낸다.
본 배치에서, 발현 수준은 밴드 두께로부터 확인되는 바와 같이 낮았다. 탄소원 메탄올, 잔류 포스페이트 및 질소원 - 암모늄 이온과 같은 주요 영양성분 (아래 표)의 수준이 보다 낮으면, 고갈을 증가시키거나 및/또는 단백질의 분해를 유도하는 유해한 조건을 유발한다.
| 시간 (h) | PO4 (ppm) | NH4 (ppm) | 잔류 메탄올 농도 (g/L) |
| 52 | 3200 | 3400 | 0.25 |
| 64 | 2286 | 3030 | 0.15 |
| 76 | 1832 | 3462 | 0.00 |
| 88 | 1610 | 3110 | 0.10 |
| 100 | 1519 | 2631 | 0.05 |
| 120 | 850 | 2080 | 0.07 |
| 138 | 211 | 1961 | 0.00 |
실시예 12
잔류 포스페이트 및 암모늄 이온으로 인한 임의의 제한을 피하기 위한 목적으로 50 L 발효 배치를 만들었다. 이는, 메탄올 유도기 동안에 기존 영양성 오르소-포스포르산 중 한가지를 투입함으로써 달성하였다. 유도를 개시한 후에, pH를 (오르소-포스포르산의 투입에 의해) 떨어뜨렸다. 약 38-40 시간내에 pH 3.0으로 떨어지는 것으로 확인되었다. 상기 전략을 수행함으로써, 주요 질소원 - 암모늄 이온 뿐만 아니라 잔류 포스페이트의 농도를 기존 배치에서 관찰되는 것 보다 훨씬 높은 수준으로 증가시킬 수 있었다 (아래 표 참조). 최종 수확되는 배지 함량 (최종 발효 및 부분 오버플로우(overflow))은 41 L였다. 배지 상층액을 4일째부터 SDS-PAGE 겔로 분석하였고, 결과는 도 10에 나타낸다.
포스페이트 및 암모늄 추세:
| 시간 (h) | PO4 (ppm) | NH4 (ppm) | 잔류 메탄올 농도 (g/L) |
| 39 | 14109 | 3246 | 0.24 |
| 60 | 10106 | 1954 | 0.16 |
| 85 | 7267 | 1164 | 0.01 |
| 91 | 16195 | 4254 | 0.00 |
| 116 | 25120 | 6100 | 0.03 |
| 131 | 30038 | 6800 | 0.04 |
| 156 | 28352 | 6500 | 0.00 |
| 188 | 30250 | 10557 | 0.01 |
| 203 | 29335 | 6262 | 0.04 |
| 227 | 23510 | 6100 | 0.00 |
| 251 | 24712 | 5993 | 0.01 |
실시예 13:
인슐린 하위 프로세스에서의 이용:
사내 피키아 숙주에서 발현되는 재조합 트립신: 인슐린 전구체 및 인슐린 유사체의 제품으로의 가공에 있어서의 이용
트립시노겐을 사내용 피키아 패스토리스에서 발현시키고, 발효를 수행하였다. 분리된 트립시노겐을 활성형 트립신으로 활성화시키고, 인슐린과, 인슐린 글라진(Insulin Glargine), 인슐린 리스프로(Insulin Lispro) 및 인슐린 아스파르트(Insulin Aspart)와 같은 인슐린 유사체로의 가공에 사용하였다. 각 실험에서, 일반 밴더(regular vendo)로부터 구입한 트립신 (r-DNA 오리진)을 대조 샘플로 사용하였다.
인슐린의 해당 전구체 형태 또는 유사체를 적정 완충액 중에서 취하였다. 반응 조건은 각 반응 조건 세트에 맞게 유지시켰다. r-DNA 오리진 트립신 (사내 및 밴더로부터 구입)을 대응되는 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 프로파일을 여러 시간 간격으로 모니터링하고, 최종 산물의 단계 수율이 최대화되었을 때 중지하였다.
사내용 r-DNA 오리진 트립신과 일반 판매사의 r-DNA 트립신을 이용하여, 인슐린 또는 그 유사체를 전구체 형태에서 산물로 변환시키는 단계의 수율에 대한 결과들은 아래 표에 나타낸다.
| 산물 | 트립신 소스 | 단계의 수율 (%) |
| 인슐린 | 사내 r-DNA 트립신 | 63 |
| 판매사에서 구입한 r-DNA 트립신 | 62 | |
| 인슐린 글라르진 | 사내 r-DNA 트립신 | 58 |
| 판매사에서 구입한 r-DNA 트립신 | 58 | |
| 인슐린 리스프로 | 사내 r-DNA 트립신 | 70 |
| 판매사에서 구입한 r-DNA 트립신 | 69.3 | |
| 인슐린 아스파르트 | 사내 r-DNA 트립신 | 82 |
| 판매사에서 구입한 r-DNA 트립신 | 79.4 | |
| IN-105 | 사내 r-DNA 트립신 | 77 |
| 판매사에서 구입한 r-DNA 트립신 | 79 |
SEQUENCE LISTING
<110> Biocon Limited
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<151> 2009-09-10
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<220>
<221> exon
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<400> 1
gtt cct gtt tct ggt aaa tct gga tct tcc aac acc gcc gtc tct gca 48
Val Pro Val Ser Gly Lys Ser Gly Ser Ser Asn Thr Ala Val Ser Ala
1 5 10 15
tct gac aat gct gcc ctc cct cct ctc atc tcc agc cgt tgt gct cct 96
Ser Asp Asn Ala Ala Leu Pro Pro Leu Ile Ser Ser Arg Cys Ala Pro
20 25 30
cct tct aac aag gga agt aaa agc gat ctc caa gct gaa cct tac aac 144
Pro Ser Asn Lys Gly Ser Lys Ser Asp Leu Gln Ala Glu Pro Tyr Asn
35 40 45
atg caa aag aat aca gaa tgg tat gag tcc cat ggt ggc aac ctg aca 192
Met Gln Lys Asn Thr Glu Trp Tyr Glu Ser His Gly Gly Asn Leu Thr
50 55 60
tcc atc gga aag cgt gat gac aac ttg gtt ggt ggc atg act ttg gac 240
Ser Ile Gly Lys Arg Asp Asp Asn Leu Val Gly Gly Met Thr Leu Asp
65 70 75 80
tta ccc agc gat gct cct cct atc agc ctc tct agc tct acc aac agc 288
Leu Pro Ser Asp Ala Pro Pro Ile Ser Leu Ser Ser Ser Thr Asn Ser
85 90 95
gcc gat gac gat gac aag att gtc gga ggc tac acc tgt ggt gca aac 336
Ala Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Gly Ala Asn
100 105 110
act gtg ccc tac caa gtg agc ctg aat tca gga tac cac ttt tgc ggt 384
Thr Val Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly
115 120 125
ggg tca tta atc aac tcg caa tgg gtt gta tct gcc gca cat tgt tac 432
Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr
130 135 140
aaa tca ggc att caa gtg aga ctt gga gaa gat aat att aat gtc gta 480
Lys Ser Gly Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu Asp Asn Ile Asn Val Val
145 150 155 160
gag ggt aat gaa cag ttc att agt gcc tct aaa tcc att gtt cat cct 528
Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Ser Ala Ser Lys Ser Ile Val His Pro
165 170 175
tct tat aat tcc aac acc ctt aac aat gat ata atg ttg ata aag cta 576
Ser Tyr Asn Ser Asn Thr Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu
180 185 190
aag tcc gct gcc agt ttg aat tct aga gtc gct tct atc tct ctg cca 624
Lys Ser Ala Ala Ser Leu Asn Ser Arg Val Ala Ser Ile Ser Leu Pro
195 200 205
act tcc tgt gca agc gct ggc act caa tgt ttg ata agt ggt tgg gga 672
Thr Ser Cys Ala Ser Ala Gly Thr Gln Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly
210 215 220
aac acg aag agt tcc ggt act agc tac cct gac gtt cta aag tgt ctc 720
Asn Thr Lys Ser Ser Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Val Leu Lys Cys Leu
225 230 235 240
aaa gct cca atc ttg tca gat tcc tca tgc aaa agt gct tat cct ggt 768
Lys Ala Pro Ile Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ala Tyr Pro Gly
245 250 255
cag atc aca tcg aac atg ttt tgt gct ggt tac ttg gag gga ggg aag 816
Gln Ile Thr Ser Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys
260 265 270
gat tct tgt cag gga gac tct gga ggt cca gtt gtc tgt tct gga aaa 864
Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Ser Gly Lys
275 280 285
tta cag ggt att gta tcg tgg ggt tca ggg tgc gca caa aag aac aaa 912
Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys
290 295 300
cca ggt gtt tat acc aag gtt tgc aat tat gtt tca tgg atc aag caa 960
Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Ser Trp Ile Lys Gln
305 310 315 320
aca att gcg tct aac taa 978
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20 25 30
Pro Ser Asn Lys Gly Ser Lys Ser Asp Leu Gln Ala Glu Pro Tyr Asn
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<221> exon
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act atc gct tct aac 975
Thr Ile Ala Ser Asn
325
Claims (13)
- 리파제 신호 서열과 융합된 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함하는 융합 폴리펩타이드로서,
상기 융합 폴리펩타이드는 메틸로트로픽 효모(methylotropic yeast)에서 발현되며,
상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는, 융합 폴리펩타이드. - 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 인슐린의 전구체 형태; 글라르진, 리스프로 및 아스파르트로 구성되는 군으로부터 선택되는 인슐린 유사체; 또는 인슐린 유도체 IN-105를 70% 이상의 단계 수율로 대응되는 활성 형태로 변환시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 메틸로트로픽 효모가 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩타이드.
- 메틸로트로픽 효모로부터 생산되는, 리파제 신호 서열과 융합된 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 수득하는 방법으로서,
상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며,
상기 방법은,
a. 세린 프로테아제를 프로리파제 신호 서열과 융합하여, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 가지는 융합 생성물 (PLBTR)을 수득하는 단계;
b. 상기 융합 생성물을 벡터에 삽입한 다음 상기 메틸로트로픽 효모를 상기 벡터로 형질전환시키는 단계; 및
c. 상기 뉴클레오티드 서열을 발현하기 위해 상기 메틸로트로픽 효모를 배양하여, 35 kDa 단백질의 융합 폴리펩타이드를 수득하는 단계를 포함하는,
융합 폴리펩타이드를 수득하는 방법. - 제5항에 있어서, 상기 세린 프로테아제가 트립시노겐인 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩타이드를 수득하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 메틸로트로픽 효모가 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩타이드를 수득하는 방법.
- 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
- 제8항에 따른 벡터를 발현가능한 형태로 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997000316A1 (en) * | 1995-06-16 | 1997-01-03 | Novo Nordisk A/S | A process for producing trypsin (trypsinogen) |
| US7276605B2 (en) * | 2001-02-01 | 2007-10-02 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Method for producing recombinant trypsin |
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Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| WO1997000316A1 (en) * | 1995-06-16 | 1997-01-03 | Novo Nordisk A/S | A process for producing trypsin (trypsinogen) |
| US7276605B2 (en) * | 2001-02-01 | 2007-10-02 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Method for producing recombinant trypsin |
| KR20080055843A (ko) * | 2005-09-14 | 2008-06-19 | 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하 | 트립신 변이체에 의한 인슐린 전구체의 절단 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J. Cell Biol. 105(2): 659-668(1987. 8.) * |
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