CN112725316B

CN112725316B - 碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法

Info

Publication number: CN112725316B
Application number: CN202110240335.0A
Authority: CN
Inventors: 马立新; 翟超; 高榕
Original assignee: Cangzhou Xiasheng Enzyme Biotechnology Co ltd; Ningxia Sunson Industry Group Co ltd; Hubei University
Current assignee: Cangzhou Xiasheng Enzyme Biotechnology Co ltd; Ningxia Sunson Industry Group Co ltd; Hubei University
Priority date: 2021-03-04
Filing date: 2021-03-04
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2041-03-04
Also published as: CN112725316A

Abstract

本发明涉及蛋白质工程领域，特别涉及碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法。本发明的突变体是在SEQ ID No.1所示的氨基酸的基础上，将第253位丙氨酸突变成赖氨酸。本发明得到的突变体在毕赤酵母中表达，摇瓶培养后，测定该突变体比酶活为6290U/mg，相比较野生型比酶活提高了18％左右。本发明的碱性蛋白酶2018突变体可以广泛应用于各种领域。

Description

碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，特别涉及碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法。

背景技术

碱性蛋白酶2018是一种来自于林伯氏白色念球菌(Tritirachium album limber)的丝氨酸蛋白酶，分子量约为28.9kDa。碱性蛋白酶2018具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，对天然蛋白质具有广谱高效的切割能力，该酶偏好于切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键，从而将蛋白质大分子降解为氨基酸和短肽。该酶的最适反应条件是37℃，pH7.5-9.0，同时能够在广谱的pH和温度条件下保持高活性，并且对SDS、尿素等具有一定的抗性，因此在洗涤业、饲料行业，以及污水处理、造纸、食品等领域均展现出良好的应用效果。

1989年Gunkel等第一次实现了碱性蛋白酶2018在大肠杆菌细胞中的异源表达，并对其基本性质进行了研究。随着技术的进步，碱性蛋白酶2018的晶体结构被解析出来，发现其含有两个Ca²⁺结合位点以及两对二硫键，相比于其他蛋白酶，其活性、热稳定性、酸碱耐受性和底物谱均有较大优势，但该蛋白在林伯氏白色念球菌中的表达量却十分低，使其难以运用于实际生产中。为了进一步提高碱性蛋白酶2018的表达水平，本团队前期工作实现了碱性蛋白酶2018在毕赤酵母中的高效分泌表达，重组蛋白表达水平达到约8mg/mL，酶活达到约100000U/mL。与此同时，碱性蛋白酶2018分子的改造也取得了突破。Jeremy Minshull的团队在2007年通过机器学习的方法筛选到6个比活力提高10倍以上的突变体，大幅提高蛋白酶K的活性和稳定性。2020年，Tao Tu团队通过理性设计获得R218S突变体，该突变体的比酶活提高15％以上，而且60℃，1h孵育后的残余酶活是野生型的1.6倍左右。以上成果为碱性蛋白酶2018的应用提供重要技术支撑。

现有碱性蛋白酶2018在碱性条件下活性高，并且能够耐受一定浓度的去污剂，在洗涤行业具有很好的应用前景，但是该酶与国外商品化洗涤用蛋白酶相比，活性还有一定差距。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法。本发明通过理性设计的方法对该蛋白酶分子进行改造，提高了它的比活性，为其在洗涤行业的应用提供了可能。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了碱性蛋白酶2018突变体，野生型碱性蛋白酶2018的第253位氨基酸被取代。野生型碱性蛋白酶2018的第253位丙氨酸被赖氨酸取代。所述野生型碱性蛋白酶2018具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。所述野生型碱性蛋白酶2018由如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的碱性蛋白酶2018突变体具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一个：

(Ⅰ)碱性蛋白酶2018突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

(Ⅱ)与SEQ ID No.3具有至少70％同一性的序列或经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

(Ⅲ)由如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列；

所述取代为取代1个氨基酸。

此外，本发明还提供了编码所述的碱性蛋白酶2018突变体的DNA分子。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的DNA分子具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

本发明还提供了具有所述DNA分子的载体。

此外，本发明还提供了宿主细胞，包含本发明所述的载体。

基于上述，本发明还提供了所述碱性蛋白酶2018突变体的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：获取编码具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一个的DNA分子：

(Ⅰ)碱性蛋白酶2018突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

步骤2：将步骤1获得的所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，转化宿主细胞；

步骤3：诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。

本发明通过蛋白质工程对碱性蛋白酶2018进行改造，获得碱性蛋白酶2018突变体，提高其酶活或者稳定性，从而降低碱性蛋白酶2018的应用成本，促进其在洗涤、饲料和食品等多种行业的应用。

本发明首先提供了一种酶活提高的碱性蛋白酶2018突变体，其氨基酸序列是SEQIDNO.3所示的序列。编码所述突变体的核苷酸序列是SEQ ID NO.4所示的序列。

本发明以碱性蛋白酶2018的晶体结构为基础，选取了多个碱性蛋白酶2018活性中心附近的氨基酸位点，通过定点突变技术对这些位点逐一进行了突变，结果显示突变体A253K的比酶活较野生型提高约18％。本发明表明253位氨基酸残基对酶的催化活性有一定影响，对该酶的催化机理的研究提供了重要线索，并进一步提高了该酶的工业应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明利用SDS-PAGE检测重组碱性蛋白酶2018及其突变体PK-A253K在GS115酵母细胞中的表达结果示意图。

具体实施方式

本发明公开了碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

根据本发明的数据，野生型碱性蛋白酶2018的比酶活是5325.50U/mg，而本发明提供的A253K突变体的比酶活是6290.17U/mg，该位点的突变能够提高碱性蛋白酶2018活性的结果之前未见报道。本发明的关键创新点是发现碱性蛋白酶2018的A253K突变体的活性比野生型提高约18％，同时不影响该酶在毕赤酵母中的表达量。因此可以取代现有野生型碱性蛋白酶2018来进行工业化生产、应用。

本发明提供的碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1碱性蛋白酶2018突变体表达质粒的构建

(1)A253K突变体的获得：以SEQ ID No.1所示序列为模板，F primer、A253K-Rprimer；A253K-F primer、R primer为引物，进行PCR即得到以突变点为两端的两段基因序列。再以两段为模板，F primer和R primer为引物将其连接起来，得到SEQ IDNo.3所示的重组基因。

F primer：5’-gtagaattaagatcccgacacatggctccagccgttgaacaaagatc-3’(如SEQID No.5所示)

A253K-R primer：5’-caaatcacccttattagctgtatcCTTaatatatctgca-3’(如SEQ IDNo.6所示)

A253K-F primer：5’-ctaacgcttgcagatatattAAGgatacagctaat-3’(如SEQ IDNo.7所示)

R primer：5’-gtctaaggcgaattaattcgcacttaatggtgatggtgatggtgagctt-3’(如SEQ ID No.8所示)

下划线处为突变位点。

(2)将毕赤酵母表达载体pHBM905BDM用NotⅠ、CpoⅠ双酶切，回收后与PCR获得的目的片段用T5核酸外切酶在冰水混合物上处理3-5min。再将其转入大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞。转化液涂布含氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板，提取质粒，菌落PCR验证构建的重组质粒，命名为pHBM905BDM-A253K。测序工作由上海生工完成。

菌落PCR-F primer：5’-gcatcttctgctttggctgctc-3’(如SEQ ID No.9所示)

菌落PCR-R primer：5’-cgagataggctgatcaggagcaag-3’(如SEQ ID No.10所示)

实施例2重组碱性蛋白酶2018突变体质粒在毕赤酵母中的转化及筛选

(1)将重组碱性蛋白酶2018突变体表达载体pHBM905BDM-A253K转化到毕赤酵母GS115感受态细胞。利用限制性内切酶SalI酶切重组碱性蛋白酶2018突变体载体pHBM905BDM-A253K，再对其做胶回收，取10μL线性片段与100μL GS115酵母感受态细胞混匀，转移至冰预冷的电转杯(两极间隙2mm)中，放入电转仪中电击，电击参数：1500V，25μF，200Ω；之后迅速向电转杯中加入200μL 1M山梨醇，再加入200μL MD培养基，混匀后转至1.5mL EP管中，28℃摇床活化2h；将菌体悬液离心去上清，加入80μL MD培养基重悬，涂布于MD平板(葡萄糖20.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 10.0g/L，YNB 13.4g/L，琼脂2％，500×Biotin(0.02％)2mL，倒置于28℃培养箱中，培养至出现单个菌落。

(2)将转化得到的酵母单菌落同时点到BMGY平板和MD平板上，同一单菌落标记一致；约36-48小时后，将BMGY平板上的菌落对应点到1％酪素BMMY平板,标记保持一致；每12小时加入200μL甲醇于滤纸上进行诱导；诱导48-60小时后观察酪素平板上的水解圈，出现水解圈对应的单菌落即为碱性蛋白酶2018重组菌落；将重组菌落用YPD培养基培养至OD₆₀₀为0.2-0.3，取500μL菌液与等体积50％甘油于冻干管中混匀，储存于-80℃冰箱。

实施例3碱性蛋白酶2018基因及其突变体在毕赤酵母中的摇瓶表达

(1)将野生型和A253K突变体表达菌株分别接种于l00mL BMGY培养基中，28℃摇床培养至OD₆₀₀为6-10。之后3000rpm离心5min，弃上清，收集菌体，再用50mL BMMY培养基重悬。28℃摇床培养，每隔12小时添加甲醇至终浓度为1％，持续诱导约120小时，期间定时取样品检测。诱导120小时后，将诱导后的菌液，离心(4000rpm，5min)，上清用0.22μm滤膜过滤，滤液存放于无菌50mL离心管中，暂存于4℃冰箱。

(2)蛋白超滤换液，将过滤后的蛋白转移到10kD超滤管中，4000rpm，4℃离心，并用3倍体积的PBS缓冲液换液，最后浓缩的样品放置4℃保存备用。同时利用Bradford蛋白浓度测定试剂盒绘制标准曲线，并计算出相应的蛋白浓度。

实施例4碱性蛋白酶2018及其突变体的酶学性质测定

(1)酶活定义:在一定温度和pH条件下，在1min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活单位，以U表示。

(2)碱性蛋白酶2018酶活测定方法：主要参考国标BG/T 28715-2012，但是缩小了反应体系。反应过程如下：1.5mL EP管中加入100μL酶液，55℃水浴预热3min，加入同样预热的1％酪蛋白溶液100μL，摇匀后55℃水浴10min，加入200μL三氯乙酸溶液，摇匀(空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液)。取出冷却至室温，12000rpm离心10min。取上清液100μL，加碳酸钠溶液500μL，加稀福林试剂(商品化Folin：ddH₂O＝1：2)100μL，40℃显色20min，于680nm波长用酶标仪测定吸光度。

酶活测定结果如下所示：

表1

由SDS-PAGE胶图以及酶活数据可见，本发明制备得到的重组碱性蛋白酶2018突变体A253K表达量与原始碱性蛋白酶2018并没有太大差别，而其酶活提高了约18％，具有显著差异。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖南夏盛酶技术有限公司

<120> 碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法

<130> MP21002987

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Ala Gln Thr Asn Ala Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr

1 5 10 15

Ser Pro Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Asn Glu Ser Ala Gly Gln Gly

20 25 30

Ser Cys Val Tyr Val Ile Asp Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu

35 40 45

Phe Glu Gly Arg Ala Gln Met Val Lys Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg

50 55 60

Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu

85 90 95

Asp Asp Asn Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp

100 105 110

Phe Val Ala Ser Asp His Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val

115 120 125

Ala Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala

130 135 140

Ala Ala Arg Leu Gln Ser Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly

145 150 155 160

Asn Asn Asn Ala Asp Ala Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser

165 170 175

Val Cys Thr Val Gly Ala Thr Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe

180 185 190

Ser Asn Tyr Gly Ser Val Leu Asp Ile Phe Ala Pro Gly Thr Ser Ile

195 200 205

Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser

210 215 220

Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu

225 230 235 240

Gly Arg Thr Thr Ala Ala Asn Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala

245 250 255

Asn Lys Gly Asp Leu Ser Asn Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu

260 265 270

Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln Ala

275

<210> 2

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctgcacaaa ctaacgctcc atggggattg gctagaattt cttctacttc tccaggtact 60

tcaacatact actatgatga atctgcaggt cagggtagtt gtgtttacgt tattgatact 120

ggtattgagg cttctcatcc agaatttgaa ggtagggctc aaatggtgaa gacttattac 180

gcttcatcaa gagatggtaa cggtcatggt actcattgtg ctggtaccgt tggttctagg 240

acttacggtg ttgctaagaa gactcaactg tttggtgtta aggttttgga tgataatggc 300

agtggtcaat attctactat tattgcaggt atggattttg ttgcatctga tcataacaac 360

agaaactgtc caaagggtgt tgttgcttct ttgtctttgg gcggtggtta ctcttcttct 420

gtgaactctg ccgcagcccg tttgcagtct agtggtgtaa tggtcgctgt tgcagcaggt 480

aacaacaacg cagatgctag aaattactct cccgcttctg agccatctgt atgcacggtt 540

ggagccactg acagatacga tagacgttct agtttttcta actacggctc tgttcttgac 600

atttttgctc caggaacttc tattttgtct acttggattg gaggctctac aaggtctata 660

tcaggtacat ctatggctac tccacacgtt gccggtttgg ctgcctactt aatgactttg 720

ggtagaacta ctgctgctaa cgcttgcaga tatattgccg atacagctaa taagggtgat 780

ttgagtaaca ttccatttgg tactgtcaat ttgttggctt acaataacta ccaagcttaa 840

<210> 3

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Ala Gln Thr Asn Ala Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr

1 5 10 15

Ser Pro Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Asn Glu Ser Ala Gly Gln Gly

20 25 30

Ser Cys Val Tyr Val Ile Asp Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu

35 40 45

Phe Glu Gly Arg Ala Gln Met Val Lys Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg

50 55 60

Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu

85 90 95

Asp Asp Asn Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp

100 105 110

Phe Val Ala Ser Asp His Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val

115 120 125

Ala Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala

130 135 140

Ala Ala Arg Leu Gln Ser Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly

145 150 155 160

Asn Asn Asn Ala Asp Ala Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser

165 170 175

Val Cys Thr Val Gly Ala Thr Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe

180 185 190

Ser Asn Tyr Gly Ser Val Leu Asp Ile Phe Ala Pro Gly Thr Ser Ile

195 200 205

Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser

210 215 220

Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu

225 230 235 240

Gly Arg Thr Thr Ala Ala Asn Ala Cys Arg Tyr Ile Lys Asp Thr Ala

245 250 255

Asn Lys Gly Asp Leu Ser Asn Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu

260 265 270

Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln Ala

275

<210> 4

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctgcacaaa ctaacgctcc atggggattg gctagaattt cttctacttc tccaggtact 60

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ggtattgagg cttctcatcc agaatttgaa ggtagggctc aaatggtgaa gacttattac 180

gcttcatcaa gagatggtaa cggtcatggt actcattgtg ctggtaccgt tggttctagg 240

acttacggtg ttgctaagaa gactcaactg tttggtgtta aggttttgga tgataatggc 300

agtggtcaat attctactat tattgcaggt atggattttg ttgcatctga tcataacaac 360

agaaactgtc caaagggtgt tgttgcttct ttgtctttgg gcggtggtta ctcttcttct 420

gtgaactctg ccgcagcccg tttgcagtct agtggtgtaa tggtcgctgt tgcagcaggt 480

aacaacaacg cagatgctag aaattactct cccgcttctg agccatctgt atgcacggtt 540

ggagccactg acagatacga tagacgttct agtttttcta actacggctc tgttcttgac 600

atttttgctc caggaacttc tattttgtct acttggattg gaggctctac aaggtctata 660

tcaggtacat ctatggctac tccacacgtt gccggtttgg ctgcctactt aatgactttg 720

ggtagaacta ctgctgctaa cgcttgcaga tatattaagg atacagctaa taagggtgat 780

ttgagtaaca ttccatttgg tactgtcaat ttgttggctt acaataacta ccaagcttaa 840

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtagaattaa gatcccgaca catggctcca gccgttgaac aaagatc 47

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caaatcaccc ttattagctg tatccttaat atatctgca 39

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctaacgcttg cagatatatt aaggatacag ctaat 35

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtctaaggcg aattaattcg cacttaatgg tgatggtgat ggtgagctt 49

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcatcttctg ctttggctgc tc 22

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgagataggc tgatcaggag caag 24

Claims

1.碱性蛋白酶2018突变体，其特征在于，野生型碱性蛋白酶2018的第253位丙氨酸被赖氨酸取代；

所述野生型碱性蛋白酶2018的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的碱性蛋白酶2018突变体，其特征在于，所述野生型碱性蛋白酶2018由如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码。

3.如权利要求1或2所述的碱性蛋白酶2018突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶2018突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.编码如权利要求3所述的碱性蛋白酶2018突变体的DNA分子。

5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

6.具有如权利要求4或5所述DNA分子的载体。

7.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求6所述的载体。

8.根据权利要求1至3任一项所述碱性蛋白酶2018突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：获取编码如SEQ ID No.3所示氨基酸序列DNA分子；