KR101781328B1 - 신규 리파제 신호서열 및 이를 이용한 리파제 발현방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 리파제를 대량 발현시키기 위한 신규 신호서열, 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신규 리파제 신호서열; 상기 신호서열 및 리파제 유전자를 포함하는 발현벡터; 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물; 및 상기 재조합미생물을 배양하여 리파제를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규 신호서열을 포함하는 발현벡터를 이용하면 특정 리파제뿐만 아니라 다른 목적단백질의 대량 발현 및 분비를 유도할 수 있어, 특정 리파제 및 다른 목적단백질의 안정적인 대량 생산에 있어 매우 유용하다.
Description
본 발명은 리파제를 대량 발현시키기 위한 신규 신호서열, 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신규 리파제 신호서열; 상기 신호서열 및 리파제 유전자를 포함하는 발현벡터; 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물; 및 상기 재조합미생물을 배양하여 리파제를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
산업용으로 사용되는 여러 종류의 단백질은 안정성이 널리 알려져 있는 사카로마이세스(Saccharomyces), 아스퍼질러스 나이거, 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus orryzae), 트리코더마 리제이(Trichoderma reesei)를 사용하여 생산하여 왔고 목적 단백질을 발현 및 분비시키기 위하여 전사 촉진서열인 프로모터(promoter), 분비 신호 서열을 코딩하는 DNA, 목적 단백질의 구조 유전자 및 전사 종결자(transcription terminator)로 구성된 발현 분비 플라스미드 벡터를 사용하여왔다.
아스퍼질러스 나이거에서 목적 단백질을 분비시키기 위해 현재 사용되고 있는 분비 신호 서열로는 발현하고자하는 유전자의 자체 신호서열과 아스퍼질러스 나이거 글루코아밀라제 신호서열이 사용되어 왔고, 강력한 프로모터로는 글루코아밀라제 (glaA)프로모터가 사용되고 있다.
그러나 지금까지 알려진 신호 서열만으로는 원하는 단백질을 대량 발현 할 수 없는 실정이다.
아스퍼질러스 나이거는 글루코아밀라제의 경우 산업적 공정 개발을 통해 30 g/L 이상의 고수율로 생산이 가능하다. 또한 아스퍼질러스 나이거에서 유래된 상업적으로 판매 되는 리파제들이 많으며, 이는 전통적인 돌연변이 유발법과 유도 물질로 리파제를 유도하여 아스퍼질러스 나이거에서 리파제를 효율적으로 생산할 수 있게 한다. 따라서, 아스퍼질러스 나이거 유전체상에서 세포 밖으로의 리파제 단백질의 분비촉진을 할 수 있는 방법이 요구되고 있는 실정이다. 즉, 상업적으로 중요한 효소인 단백질을 보다 효율적으로 대량 생산할 수 있는 신호서열 탐색이 중요하며, 재조합 미생물 재조합미생물의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 발현의 한계를 극복하기 위하여 유전공학적 방법을 이용하여 리파제를 대량생산하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 리파제를 발현하기 위한 신규한 신호서열을 발굴하고, 상기 신호서열을 이용할 경우 리파제가 대량으로 발현되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 리파제를 대량으로 발현시키기 위한 신규 리파제 신호서열; 상기 신호서열 및 리파제 유전자를 포함하는 발현벡터; 및 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합미생물을 배양하여 리파제를 대량 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 An03g06560(서열번호 1), An14g00860(서열번호 2), An07g00440(서열번호 3), An02g09690(서열번호 4), An16g08870(서열번호 5), An06g00350(서열번호 6), An16g01880(서열번호 7), An12g06560(서열번호 8), An09g02270(서열번호 9), An15g02210(서열번호 10), An13g02820(서열번호 11), 및 Anllg00100(서열번호 12)로 구성된 군에서 선택되는리파제 신호서열; 및 An03g06560(서열번호 13), An14g00860(서열번호 14), An07g00440(서열번호 15), An02g09690(서열번호 16), An16g08870(서열번호 17), An06g00350(서열번호 18), An16g01880(서열번호 19), An12g06560(서열번호 20), An09g02270(서열번호 21), An15g02210(서열번호 22), An13g02820(서열번호 23), 및 Anllg00100(서열번호 24)로 구성된 군에서 선택되는, 상기 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 신호서열을 코딩하는 핵산과 목적단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합미생물을 배양하여 목적단백질을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규 신호서열을 포함하는 발현벡터를 이용하면 특정 리파제뿐만 아니라 다른 목적단백질의 대량 발현 및 분비를 유도할 수 있어, 특정 리파제 및 다른 목적단백질의 안정적인 대량 생산에 있어 매우 유용하다.
도 1은 본 발명의 발현벡터의 모식도로써, glaA 프로모터와 pdcA 종결인자를 사용하고, 리파제 신호서열 다음에, TLL 유전자를, Nae I/ Not I에 클로닝할 수 있음을 나타낸다.
도 2는 실시예 1의 pASP504 벡터를 나타낸 이미지로, pASP504 벡터는 glaA 프로모터와 pdcA 종결인자를 포함하고, 하이그로마이신 내성 유전자와 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제를 포함하고 있으며, 각각의 리파제 신호서열을 클로닝 할 수 있는 벡터이다.
도 3은 실시예 1의 pASP600s 벡터를 나타낸 이미지로, 각각의 리파제 신호서열을 클로닝한 벡터 중 대표적인 것이다.
도 2는 실시예 1의 pASP504 벡터를 나타낸 이미지로, pASP504 벡터는 glaA 프로모터와 pdcA 종결인자를 포함하고, 하이그로마이신 내성 유전자와 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제를 포함하고 있으며, 각각의 리파제 신호서열을 클로닝 할 수 있는 벡터이다.
도 3은 실시예 1의 pASP600s 벡터를 나타낸 이미지로, 각각의 리파제 신호서열을 클로닝한 벡터 중 대표적인 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 특정 리파제 및 다른 목적단백질을 다량 발현시킬 수 있는 리파제 신호서열; 상기 신호서열과 목적단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터; 및 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물을 제조하였다. 그 결과, 제조된 재조합미생물을 배양시켜 리파제를 다량으로 생산할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 목적단백질을 코딩하는 핵산으로 썸모마이세스 렌기노수스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파제 (TLL) 유전자를 이용하여, 본 발명의 신규 리파제 신호서열을 이용하는 경우 리파제가 다량으로 생산됨을 확인하였다. 그러나, 이는 하나의 예시에 불과한바, 특정 리파제 뿐만 아니라 다른 목적단백질에도 본 발명을 적용할 수 있음은 당업자에게 있어서 자명한 것이다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, An03g06560(서열번호 1), An14g00860(서열번호 2), An07g00440(서열번호 3), An02g09690(서열번호 4), An16g08870(서열번호 5), An06g00350(서열번호 6), An16g01880(서열번호 7), An12g06560(서열번호 8), An09g02270(서열번호 9), An15g02210(서열번호 10), An13g02820(서열번호 11), 및 Anllg00100(서열번호 12)로 구성된 군에서 선택되는 리파제 신호서열에 관한 것이다.
본 발명에 있어서,상기 신호서열은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래인 것을 특징으로할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, An03g06560(서열번호 13), An14g00860(서열번호 14), An07g00440(서열번호 15), An02g09690(서열번호 16), An16g08870(서열번호 17), An06g00350(서열번호 18), An16g01880(서열번호 19), An12g06560(서열번호 20), An09g02270(서열번호 21), An15g02210(서열번호 22), An13g02820(서열번호 23), 및 Anllg00100(서열번호 24)로 구성된 군에서 선택되는, 상기 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산 및 목적단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현 시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물 일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백개의 플라스미드벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation) 할 수 있다.
아울러, 상기 유전자는 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들) 일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션 (연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 발명에 있어서, 상기 목적단백질은 리파제인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 리파제는 썸모마이세스 렌기노수스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파제 (TLL)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 글루코아밀라아제 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 글루코아밀라아제 프로모터는 아스퍼질러스 나이거 글루코아밀라아제(glaA) 프로모터인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 pASP601TLL, pASP602TLL, pASP603TLL, pASP604TLL, pASP605TLL, pASP606TLL, pASP607TLL, pASP608TLL, pASP609TLL, pASP610TLL, pASP611TLL, 및 pASP612TLL로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산과 목적단백질의 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물; 또는 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합미생물은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합미생물은 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 이용가능하고, 본 발명의 실시예에서는 아스퍼질러스 나이거를 사용하였으나, 이에 한정되지 않고, 상기 리파제가 충분히 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 종류의 미생물이라도 무방하다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않고, 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 상태에서, 다른 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에 서 복제되어야만 하기 때문이고, 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
상기 형질전환된 재조합 미생물은 임의의 형질전환 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명의 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.
또한, 본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.
또한, 형질전환방법에는 발현벡터를 이용한 방법 외에도, 숙주세포의 염색체상에 직접 삽입하는 방법도 이용될 수 있다.
일반적으로 전기천공법(electroporaton), 리포펙션, 탄도법, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 바이론, 화학물질 촉진 DNA 유입, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2)침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 이용될 수 있다.
소소노포레이션, 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 이용한 방법도 핵산의 전달에 사용할 수 있으며, 다른 대표적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Maryland) 및 BTX Molesular Syetem(Holliston, MA)의 방법을 포함한다. 리포펙션 방법은 미국특허 제5,049,386호, 미국특허 제4,946,787호 및 미국특허 제4,897,355호에 명시되어 있으며 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있으며, 예를 들어, TRANSFECTAMTM 및 LIPOFECTINTM 이 있다. 폴리뉴클레오티드의 효과적인 리셉터-인식 리포펙션에 적당한 양이온 또는 중성 지질은 Felgner의 지질을 포함하며 (WO91/17424 및 WO91/16024), 생체 외 도입을 통해 세포로, 생체 내 도입을 통해 표적 조직으로 전달할 수 있다. 면역지질 복합체 등 표적 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조 방법은 당해 업계에 잘 알려져 있다 (Crystal, Science., 270:404-410, 1995; Blaese et al., Cancer Gene Ther ., 2:291-297, 1995; Behr et al., Bioconjugate Chem., 5:382389, 1994; Remy et al., Bioconjugate Chem ., 5:647-654, 1994; Gao et al., Gene Therapy., 2:710-722, 1995; Ahmad et al., Cancer Res., 52:4817-4820, 1992; 미국특허 제4,186,183호; 미국특허 제4,217,344호; 미국특허 제4,235,871호; 미국특허 제4,261,975호; 미국특허 제4,485,054호; 미국특허 제4,501,728호; 미국특허 제4,774,085호; 미국특허 제4,837,028호; 미국특허 제4,946,787호).
본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 재조합미생물을 배양하여 목적단백질을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 목적단백질을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 생산방법에 관한 것이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예
1: 발현벡터
pASP600s의
제조
TLL를 아스퍼질러스 나이거 외부로 분비하기 위하여 하기 서열번호 1 내지 12의 아미노산 서열(표 1)을 코딩하는, 서열번호 13 내지 24의 신호서열(표 2)을 화학합성하였다. 신호서열 염기서열의 양 말단에 제한효소 ClaI과 NaeI의 인식부위를 갖도록 각각 단일 사슬의 올리고뉴클리오티드(oligonucleotide)들을 화학합성하였고, 상기 단일사슬의 올리고뉴클리오티드로부터 이중사슬의 올리고뉴클리오티드를 제조하기 위하여 어닐링(annealing) 반응을 실시하였다. 각각 신호서열 DNA 절편을 회수하였다.
회수된 절편을 pASP503 벡터에 제한효소 Cla I와 Nae I으로 커팅하고 클로닝하여 각각 순서 번호로 pASP601, pASP602, pASP603, pASP604, pASP60pASP605, pASP606, pASP607, pASP608, pASP609, pASP610, pASP611, pASP612라 명하였다.
pASP504 벡터는 glaA 프로모터와 pdcA 종결 인자를 포함하고 있으며, 하이그로마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제를 포함한다(도 1 및 도 2). 하이드로마이신 B는 리보좀내의 펩티딜-tRNA에 삽입되어 펩티딜-tRNA의 번역(translation)을 방해한다. 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 효소는 하이그로마이신 B를 불활성화시키므로 재조합미생물을 선별할 수 있다.
| Gene ID | 효소 | 신호서열(SS) | 아미노산 (AA) |
SS No. | N-region | H-region | C-region |
| An03g06560 | triacyl glycerol lipase |
maimkallwlslslavwa (서열번호 1) |
562 | 18 | 1-5 | 6-15 | 15-18 |
| An14g00860 | triacyl glycerol lipase |
masallwlsllggstla (서열번호 2) |
582 | 17 | 1 | 2-12 | 13-17 |
| An07g00440 | triacyl glycerol lipase |
myipsvlllaaslfhgata (서열번호 3) |
418 | 19 | 1-2 | 3-14 | 15-19 |
| An02g09690 | triacyl glycerol lipase |
mlklavalfsllavgna (서열번호 4) |
561 | 17 | 1-3 | 4-12 | 13-17 |
| An16g08870 | triacyl glycerol lipase |
miffhlapffflfglvvs (서열번호 5) |
538 | 19 | 1-5 | 6-14 | 15-19 |
| An06g00350 | triacyl glycerol lipase |
mvalltsfawagltalalg (서열번호 6) |
529 | 19 | 1-2 | 3-14 | 15-19 |
| An16g01880 | triacyl glycerol lipase |
mfsgrfgvlltalaalsaa (서열번호 7) |
298 | 19 | 1-5 | 6-14 | 15-19 |
| An12g06560 | triacyl glycerol lipase |
mfvsslallaliaplia (서열번호 8) |
580 | 17 | 1 | 2-12 | 13-17 |
| An09g02270 | triacyl glycerol lipase |
mlnarsialaslpvllllfaqqlas (서열번호 9) |
592 | 25 | 1-7 | 8-19 | 20-25 |
| An15g02210 | triacyl glycerol lipase |
mkgmlptlswlalgmaslatc (서열번호 10) |
564 | 21 | 1-4 | 5-13 | 14-21 |
| An13g02820 | triacyl glycerol lipase |
mrlsslalassailpalg (서열번호 11) |
277 | 18 | 1-2 | 3-14 | 15-18 |
| An11g00100 | triacyl glycerol lipase |
mgvmrktadqalgltatalalvsaaqa (서열번호 12) |
581 | 27 | 1-10 | 11-22 | 23-27 |
| Gene ID | 신호서열(SS) 염기서열 |
| An03g06560 | atgtggaacgccgcggtattctgcaggatgaactcatatgtcccgttgcggaaa (서열번호 13) |
| An14g00860 | atggcgagcgcactcctctggctctccctgctgggtggcagcaccctagcc (서열번호 14) |
| An07g00440 | atgtatatcccctcggtgctgcttctggccgcgagcctgttccatggcgcaacg (서열번호 15) |
| An02g09690 | atgctaaagctcgctgttgctcttttttcgttacttgccgtgggcaatgca (서열번호 16) |
| An16g08870 | atgattttctttcatctggcaccgttcttctttctctttggtctagtagtatcttcta (서열번호 17) |
| An06g00350 | atggtggccttgctcacttcatttgcctgggcagggcttactgct (서열번호 18) |
| An16g01880 | atgttctctggacggtttggagtgcttttgacggcgctcgctgcgctgagtgctgcg (서열번호 19) |
| An12g06560 | atgtttgtttcctcgcttgctctattagcacttattgctcctttgatcgca (서열번호 20) |
| An09g02270 | atgctgaatgcacgctccattgctctggcctcgttgccagttcttctcctactattcgcccagcaacttgcctct (서열번호 21) |
| An15g02210 | atgaagggaatgctcccgacgcttagttggttggcactgggcatggccagcctggcaacctgc (서열번호 22) |
| An13g02820 | tcacctgccgggagatcccagcgagcagacgaactcacgcttcggcgtagagtc (서열번호 23) |
| An11g00100 | atgggcgtgatgcgcaagactgctgaccaggccttgggcctgaccgccaccgccctggctctggtcagtg ccgcccaggcc (서열번호 24) |
실시예
2:
TLL
발현벡터의 제조
TLL은 291개의 아미노산을 암호화하고 있으며, 17개의 아미노산으로 이루어진 신호서열과 5개의 아미노산으로 이루어진 프리서열을 포함한다. 성숙한 TLL은 269개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 분자량은 29.3kD이다.
신호서열을 포함하지 않은 TLL DNA는 서열의 5' 말단에 제한효소 인식부위를 갖지 않는 서열번호 25의 프라이머(TLLF: atgaggagctcccttgtgctg)와 서열의 3' 말단에 단일한 제한효소 NotI 인식부위를 갖는 서열번호 26의 프라이머(TLLNotR: gcggccgcctaaagacatgtcccaattaac)를 화학합성하였으며, 두 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 2145 bp 절편을 확보하였다. 확보된 절편은 pASP600s벡터를 NaeI과 NotI으로 절단하여 클로닝하였으며, 각각 순서 번호로 pASP601TLL, pASP602TLL, pASP603TLL, pASP604TLL, pASP605TLL, pASP606TLL, pASP607TLL, pASP608TLL, pASP609TLL, pASP610TLL, pASP611TLL, pASP612TLL이라고 명명하였다.
실시예 3: 발현벡터를 도입한 재조합미생물의 제조 및 재조합미생물의 선별방법
실시예 2의 발현벡터를 아스퍼질러스 나이거에 도입하여 형질전환하였다(Tilburn et al., Gene., 26:205-221, 1983). 형질전환을 위하여, 액상 배양한 균사체에 세포벽 분해 효소를 처리하여 프로토플라스트를 만든 후 pASP600s DNA를 유전체에 삽입하였다. 또한, 재조합미생물 선별을 위하여, 하이그로마시신이 첨가된 아가 배지에서 선별하여 계대배양하였다.
실시예
4: 재조합미생물의 플라스크 배양
실시예 3의 재조합미생물 중에서 하이그로마이신 B에 내성을 가지는 재조합미생물들을 동일한 아가배지에 점 접종하여 1차 계대를 한다. 4일 후 아가완전 배지에 재조합미생물 포자를 골고루 분산시킨 후 30℃에서 포자가 골고루 형성될때까지 5-6일간 배양한다.
5일간 배양한 배양접시로부터 0.1% Tween 80으로 무성포자를 1X106 cell/ml로 수확하여 이 희석액을 1ml 액상 완전배지에 접종한다. 진탕배양기에서 28℃, 200rpm, 4일 동안 배양한다. 배양액을 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 회수한 배양상등액에서 활성을 확인하였다. 각각의 재조합벡터의 아스퍼질러스 나이거재조합미생물 플라스크 배양은 각각 20개씩 수행하였다.
실시예
5:
TLL
효소의 활성 측정
1U는 분당 1 mole의 butyric acid 유리시키는 효소의 양이다. 1% 건 아카시아 용액에 트리부틸린(Tributyrin) 13.5ml, 2% 칼슘클로라이드(calcium chloride), 1M 소듐크로라이드(NaCl) 1.0ml을 첨가하여 pH10으로 용액을 만든다. pH 스텟(STAT)에 상기용액에 21ml과 발효액 1ml를 첨가하여 30℃에서 15분간 반응시킨다. 반응 과정에서 투입된 0.05M NaOH 용액의 소비 ml에 대한 분당 적정 곡선을 작성한다.
U/ml=(Slope determinde by titration in ml/min*DF*0.05/W
DF: 희석 배수, 0.05-NaOH 용액의 규정농도(M)
W: 시료용액 1ml에 함유된 시료의 양(g)
TLL 자체서열보다 An03g06560, An13g02820, An14g00860, An07g00440, An02g09690, An06g00350 An16g01880, An12g06560, An15g02210 리파제 신호서열에서 최대 7배 높은 활성을 나타내었다(표 3).
| 발현벡터 | 신호서열(SS) | 활성 U/ml |
| pASP43TLL | TLL SS | 850 |
| pASP601TLL | An03g06560 | 2.130 |
| pASP602TLL | An14g00860 | 5.029 |
| pASP603TLL | An07g00440 | 6.012 |
| pASP604TLL | An02g09690 | 1.020 |
| pASP605TLL | An16g08870 | 310 |
| pASP606TLL | An06g00350 | 5.050 |
| pASP607TLL | An16g01880 | 1.009 |
| pASP608TLL | An12g06560 | 3.251 |
| pASP609TLL | An09g02270 | 10 |
| pASP610TLL | An15g02210 | 2.669 |
| pASP611TLL | An13g02820 | 532 |
| pASP612TLL | An11g00100 | 9 |
| 숙주세포 | - | 11 |
SDS PAGE 분석 결과 TLL 분자량은 29.3 kD 크기이나 글라이코실레이션(Glysosylation) 되어 실제 크기는 31 kD임을 확인하였다. 이로써 본 발명의 아스퍼질러스 나이거 리파제 신호서열들에 의해 재조합 단백질이 아스퍼질러스 나이거 외부로 분비됨을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Genofocus, Inc.
<120> New Lipase Signal Sequences and Expression Method Using The Same
<130> P14-B176
<160> 26
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 1
Met Ala Ile Met Lys Ala Leu Leu Trp Leu Ser Leu Ser Leu Ala Val
1 5 10 15
Trp Ala
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 2
Met Ala Ser Ala Leu Leu Trp Leu Ser Leu Leu Gly Gly Ser Thr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 3
Met Tyr Ile Pro Ser Val Leu Leu Leu Ala Ala Ser Leu Phe His Gly
1 5 10 15
Ala Thr Ala
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 4
Met Leu Lys Leu Ala Val Ala Leu Phe Ser Leu Leu Ala Val Gly Asn
1 5 10 15
Ala
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 5
Met Ile Phe Phe His Leu Ala Pro Phe Phe Phe Leu Phe Gly Leu Val
1 5 10 15
Val Ser
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 6
Met Val Ala Leu Leu Thr Ser Phe Ala Trp Ala Gly Leu Thr Ala Leu
1 5 10 15
Ala Leu Gly
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 7
Met Phe Ser Gly Arg Phe Gly Val Leu Leu Thr Ala Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 8
Met Phe Val Ser Ser Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ile Ala Pro Leu Ile
1 5 10 15
Ala
<210> 9
<211> 25
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 9
Met Leu Asn Ala Arg Ser Ile Ala Leu Ala Ser Leu Pro Val Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Phe Ala Gln Gln Leu Ala Ser
20 25
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 10
Met Lys Gly Met Leu Pro Thr Leu Ser Trp Leu Ala Leu Gly Met Ala
1 5 10 15
Ser Leu Ala Thr Cys
20
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 11
Met Arg Leu Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Ser Ala Ile Leu Pro Ala
1 5 10 15
Leu Gly
<210> 12
<211> 27
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 12
Met Gly Val Met Arg Lys Thr Ala Asp Gln Ala Leu Gly Leu Thr Ala
1 5 10 15
Thr Ala Leu Ala Leu Val Ser Ala Ala Gln Ala
20 25
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 13
atgtggaacg ccgcggtatt ctgcaggatg aactcatatg tcccgttgcg gaaa 54
<210> 14
<211> 51
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 14
atggcgagcg cactcctctg gctctccctg ctgggtggca gcaccctagc c 51
<210> 15
<211> 54
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 15
atgtatatcc cctcggtgct gcttctggcc gcgagcctgt tccatggcgc aacg 54
<210> 16
<211> 51
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 16
atgctaaagc tcgctgttgc tcttttttcg ttacttgccg tgggcaatgc a 51
<210> 17
<211> 58
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 17
atgattttct ttcatctggc accgttcttc tttctctttg gtctagtagt atcttcta 58
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 18
atggtggcct tgctcacttc atttgcctgg gcagggctta ctgct 45
<210> 19
<211> 57
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 19
atgttctctg gacggtttgg agtgcttttg acggcgctcg ctgcgctgag tgctgcg 57
<210> 20
<211> 51
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 20
atgtttgttt cctcgcttgc tctattagca cttattgctc ctttgatcgc a 51
<210> 21
<211> 75
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 21
atgctgaatg cacgctccat tgctctggcc tcgttgccag ttcttctcct actattcgcc 60
cagcaacttg cctct 75
<210> 22
<211> 63
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 22
atgaagggaa tgctcccgac gcttagttgg ttggcactgg gcatggccag cctggcaacc 60
tgc 63
<210> 23
<211> 54
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 23
tcacctgccg ggagatccca gcgagcagac gaactcacgc ttcggcgtag agtc 54
<210> 24
<211> 81
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 24
atgggcgtga tgcgcaagac tgctgaccag gccttgggcc tgaccgccac cgccctggct 60
ctggtcagtg ccgcccaggc c 81
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TLLF
<400> 25
atgaggagct cccttgtgct g 21
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TLLNotR
<400> 26
gcggccgcct aaagacatgt cccaattaac 30
Claims (14)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 6으로 표시되는 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산 및 외래 목적단백질의 유전자를 포함하는 외래 목적단백질의 세포외 분비를 위한 발현벡터.
- 제4항에 있어서, 상기 외래 목적단백질은 리파제인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제5항에 있어서, 상기 리파제는 썸모마이세스 렌기노수스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파제 (TLL)인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제4항에 있어서, 글루코아밀라아제 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제7항에 있어서, 상기 글루코아밀라아제 프로모터는 아스퍼질러스 나이거 글루코아밀라아제(glaA) 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 삭제
- 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 발현벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
- 제10항에 있어서, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 서열번호 6으로 표시되는 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산과 외래 목적단백질의 유전자가 작동가능하게 연결되어 있는 유전자 구조물이 도입되어 있는 재조합 미생물.
- 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 외래 목적단백질의 생산방법:
(a) 제10항의 재조합미생물을 배양하여 외래 목적단백질을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 외래 목적단백질을 분리하는 단계.
- 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 외래 목적단백질의 생산방법:
(a) 제12항의 재조합미생물을 배양하여 외래 목적단백질을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 외래 목적단백질을 분리하는 단계.
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-
2016
- 2016-11-14 KR KR1020160151004A patent/KR101781328B1/ko active Active
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| Title |
|---|
| GenBank Accession Number CAK41885 (2011.02.17.)* |
| Vadhana 등. Enzyme and Microbial Technology. Vol 52, No. 3, 페이지 177-183 (2013.03.05.)* |
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