KR20130141001A

KR20130141001A - 목적 단백질의 분리 및 정제를 위한 신규한 벡터 시스템

Info

Publication number: KR20130141001A
Application number: KR1020120064030A
Authority: KR
Inventors: 서경혜; 김숙경; 최준혁
Original assignee: 한국표준과학연구원
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2013-12-26

Abstract

본 발명은 목적 단백질의 분리 및 정제를 위한 신규한 벡터 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 엔테로키나아제(enterokinase) 또는 factor Xa 단백질 분해효소(factor Xa protease)를 인식하는 부위를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 세포주, 그리고 재조합 단백질의 생산방법으로, 본 발명에 따른 발현벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 과잉발현시키면, 간단하고 경제적인 분리·정제 과정을 통해 목적 단백질을 대량으로 얻을 수 있는 장점이 있다.

Description

목적 단백질의 분리 및 정제를 위한 신규한 벡터 시스템{A Novel vector system for isolation and purification of target proteins}

본 발명은 목적 단백질의 분리 및 정제를 위한 신규한 벡터 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 엔테로키나아제(enterokinase) 또는 factor Xa 단백질 분해효소(factor Xa protease)를 인식하는 부위를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 세포주, 그리고 재조합 단백질의 생산방법에 관한 것이다.

유전자 재조합 방법으로 사람 또는 동물장기에서 어렵게 얻어지던 여러 가지 중요한 단백질들을 미생물에서 생산하려면 목적 단백질의 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 얻고 이를 적당한 숙주세포에 형질전환시켜 배양하여야 한다. 대장균은 다른 생물체에 비하여 그의 유전자와 대사체계에 대한 정보가 가장 많이 알려져 있어 유전자 재조합 기술에 의하여 유용한 외래 목적 단백질을 생산하기 위한 숙주로 많이 이용되고 있다. 그러나 목적 단백질을 대장균에서 직접 발현시키는 경우, N-말단에 메티오닌(methionine)이 첨가된 형태로 만들어져 이를 천연형 단백질로 전환시키는 단계가 필요한데, 이는 목적 단백질의 N-말단에 메티오닌이 첨가된 상태로 인간이나 기타 동물에 적용되는 경우 면역 반응(immunogenecity)이 유발되거나, 구조가 불안정하여 본래의 단백질 기능을 수행하지 못하는 경우가 발생할 수 있기 때문이다. 또한, 발현되는 단백질이 항세균성 펩타이드 (antibacterial peptide)와 같이 매우 독성이 강한 경우 숙주의 성장을 저해하기도 하고, 분자량 10,000 이하의 작은 크기의 폴리펩타이드의 경우 숙주세포에 존재하는 단백질 분해효소에 의해 분해되어 안정적인 대량생산이 어렵게 된다.

이러한 현상을 해결하기 위한 방법으로 목적 단백질의 N-말단에 적절한 융합파트너 또는 단백질 태그를 융합시켜 발현시키는 유전자 발현 시스템이 개발되었다.

상기 유전자 발현 시스템은 발현 벡터에 외래 목적 단백질을 클로닝하고, 이를 동물세포에 형질 시킨 후, 특정 항생제에 내성이 있는 콜로니(colony)를 선별함으로써 안정된 형질도입체(stable transfectant)를 얻고, 이렇게 얻어진 클론(clone)을 배양하고, 궁극적으로 목적 단백질의 발현율을 증가시킬 수 있게 된다.

단백질체학 연구를 위한 고효율 단백질 생산의 또 다른 걸림돌은 융합 파트너 또는 단백질 태그의 제거에 있다. 융합 파트너 또는 단백질 태그는 목적 단백질의 가용성 증가와 정제 용이성을 위한 것이지만, 목적 단백질의 성질 혹은 기능에 영향을 미칠 수 있으므로 대부분의 후속 연구에서는 궁극적으로는 제거되는 것이 바람직하다. 이들 단백질 혹은 펩타이드의 제거는 부위 특이적 단백질 분해효소에 의해 이루어지고 있다. 이러한 단백질 분해효소의 선택에 있어서 가장 중요한 기준은 목적단백질과 융합 파트너의 사이만을 잘라내는 높은 절단 특이성이다. 융합 파트너 혹은 목적 단백질 내부에서 분해효소가 작용하는 경우 정제의 어려움 뿐 아니라, 목적단백질의 기능 상실 혹은 특성 변화 등을 초래할 수 있다.

따라서 융합 파트너와 목적 단백질의 내부에는 분해효소의 작용 위치가 존재하지 않는 것이 바람직하며, 단백질 분해효소는 매우 선택적인 기질 특이성을 가져야 한다. 현재 융합 파트너의 제거를 목적으로 가장 널리 쓰이고 있는 단백질 분해효소는 트롬빈이다. 하지만 이는 NusA 등 현재 사용되고 있는 융합 파트너를 여러 조각으로 자르기 때문에 보다 높은 작용특이성을 가지는 분해효소에 대한 필요성이 대두되었다.

KR 10-1103650 B1, 2009년 04월 15일

본 발명자들은 외래의 목적 단백질을 발현시키고 이를 효율적으로 분리할 수 있는 방법을 찾기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 발현하고자 하는 목적 단백질을 엔테로키나아제(enterokinase) 또는 factor Xa 단백질 분해효소(factor Xa protease)를 인식하는 부위를 포함하는 아미노산과 융합시켜 발현하는 경우, 재조합 단백질을 효율적으로 정제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 외래의 목적 단백질을 발현시키고 이를 효율적으로 분리할 수 있는 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포주를 사용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 외래의 목적 단백질을 발현시키고 이를 효율적으로 분리할 수 있는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포주를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포주를 사용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드와 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 포함하는, 목적 단백질 발현 카세트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1은 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys을 인식하는 부위로서 엔테로키나아제(enterokinase)를 인식하는 5개의 아미노산 서열인 것으로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가질 수 있고, 상기 서열번호 2는 Ile-Glu-Gly-Arg을 인식하는 부위로서 factor Xa 단백질 분해효소(factor Xa protease)를 인식하는 4개의 아미노산 서열인 것으로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명에 있어서, 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)는 목적 단백질을 코딩하는 DNA를 삽입할 수 있도록 다수의 상이한 제한 효소 부위를 포함하는 합성 DNA 서열을 나타낸다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질 발현 카세트는 목적 단백질의 정제효율을 높이고, 기질과의 결합력이 높은 활성형태로 발현하기 위해 상기 목적 단백질 발현 카세트의 상류 또는 하류에 단백질 태그를 코딩하는 뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

상기 단백질 태그를 코딩하는 뉴클레오티드는 (His)₆-태그, 말토오스 결합 단백질, 헤마글루티닌 A, 베타-갈락토시다제, 티미딘 키나제, 트랜스페린, myc-태그, VP16, FLAG, 또는 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제의 코딩서열로부터 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는 (His)₆-태그를 코딩하는 뉴클레오티드를 사용할 수 있다.

보다 바람직하게는 본 발명에 따른 목적 단백질 발현 카세트는 (His)₆-태그를 코딩하는 뉴클레오티드, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 및 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 순차적으로 포함하는 것으로, 바람직하게는 서열번호 5 내지 8로부터 선택되는 하나 이상의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 5와 서열번호 6은 (His)₆-태그를 코딩하는 뉴클레오티드, 엔테로키나아제(enterokinase)를 인식하는 서열번호 3의 뉴클레오티드 및 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 포함하는 단일가닥(single stranded)으로서 서로 상보적인 염기서열을 갖는 DNA 단편을 제조하여 이들을 결합시켜 이중가닥(double stranded)의 DNA 단편을 형성하도록 디자인하였다.

또한, 상기 서열번호 7과 서열번호 8은 (His)₆-태그를 코딩하는 뉴클레오티드, factor Xa 단백질 분해효소(factor Xa protease)를 인식하는 서열번호 4의 뉴클레오티드 및 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 포함하는 단일가닥(single stranded)으로서 서로 상보적인 염기서열을 갖는 DNA 단편을 제조하여 이들을 결합시켜 이중가닥(double stranded)의 DNA 단편을 형성하도록 하였다.

본 발명은 상기 목적 단백질 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 “재조합 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 일반적인 대장균 발현용 벡터에 본 발명의 목적 단백질 발현 카세트를 삽입함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장균 발현용 벡터로 pET28a를 사용하였으나 이에 특별히 한정되는 것은 아니며, 일반적으로 사용할 수 있는 모든 대장균 발현용 벡터가 제한 없이 사용될 수 있다.

본 발명의 재조합 발현벡터는 추가로 대장균에서 그 하류에 존재하는 유전자의 전사 및 발현을 지시할 수 있는 작동가능하게 연결된 프로모터 및 임의로 오퍼레이터를 포함한다. 상기 발현은 구성적이나 조절가능한 것일 수 있으나, 바람직하게는 조절 가능한 것이며, 예를 들어, 발현유도인자, 예를 들어 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside) 첨가에 의해 고효율로 유도되어 목적 단백질을 과잉발현할 수 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장균 발현용 벡터인 pET28a 벡터를 사용하고, 상기 (His)₆-태그를 코딩하는 뉴클레오티드, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 및 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)가 순차적으로 연결된 상기 목적 단백질 발현 카세트 DNA 절편을 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였고, "pEk", 또는 "pFxa"라 명명하였다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 2의 개열지도를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 상기 재조합 벡터는 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있으며, 이러한 재조합 벡터를 발현시킴으로써 목적하는 단백질을 고효율로 발현시킬 수 있다.

상기 목적 단백질이란, 일반적으로 생리활성 폴리펩타이드를 포함하는 개념으로서, 호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질과 같은 다양한 단백질 및 이들의 유도체 및 유사체들을 예시할 수 있으며, 구체적으로는 인간 성장 호르몬, 인터페론류 및 인터페론 수용체류, 콜로니 자극인자, 인터루킨류, 에리스로포이에틴, 인슐린, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, B 세포인자, T 세포인자, 신경 성장인자류, 세포 표면항원, 단일클론항체 및 바이러스 유래 백신 항원 등을 포함하며, 이들에 제한되는 것이 아니다.

상기 재조합 벡터는 숙주세포에 삽입되어 형질전환체를 형성하는데 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.

숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.

본 발명에서 숙주세포로의형질 전환"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 재조합 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양하는 단백질 생산 방법을 제공한다.

보다 상세하게는 (1) 상기 pEk vector, 또는 pFxa vector 플라스미드의 다중 클로닝 부위에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계; (2) 상기 플라스미드를 대장균에 형질전환시키고 영양배지에서 배양하는 단계; 및 (3) 상기 배양액으로부터 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계; 를 포함하는, 목적 단백질의 생산방법을 제공한다.

상기 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.

상기 생산방법은 단백질의 정제하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리, 정제가 가능하다. 이에는 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등), 등전점 포커싱 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 재조합 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양함으로써 본 발명에 따른 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 생산할 수 있다.

상기 융합단백질(fusion protien)은 원래의 목적 단백질의 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1은 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys을 인식하는 부위로서 엔테로키나아제(enterokinase)를 인식하는 5개의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하고, 상기 서열번호 2는 Ile-Glu-Gly-Arg을 인식하는 부위로서 factor Xa 단백질 분해효소(factor Xa protease)를 인식하는 부위인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 융합 단백질은 융합 단백질의 정제 효율을 높이고, 기질과의 결합력이 높은 활성형태로 발현하기 위해 상기 융합 단백질의 상류 또는 하류에 단백질 태그를 더 포함할 수 있다.

상기 단백질 태그는 (His)₆-태그, 말토오스 결합 단백질, 헤마글루티닌 A, 베타-갈락토시다제, 티미딘 키나제, 트랜스페린, myc-태그, VP16, FLAG, 또는 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제로부터 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는 (His)₆-태그를 사용할 수 있다.

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산을 코딩하는 핵산분자와 목적 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것으로, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류 또는 하류에 단백질 태그를 코딩하는 뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

보다 바람직하게는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 서열번호 4에 기재된 뉴클레오티드와 목적 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 (His)₆-태그를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 재조합 벡터 "pEk vector", 및 "pFxa vector"에 목적단백질인 AVP 단백질을 융합하여, 융합 단백질 pEk_avp 및, pFxa_avp를 제조하였다. 상기 융합단백질이 형질전환 된 단클론 세포주를 획득하고, 이를 대량 배양하여 대장균 배양체의 총 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과, IPTG 유도에 의하여, 대장균 내에서 약 18 kDa의 단백질이 효율적으로 발현됨을 확인하였다.

본 발명에 따른 재조합 발현벡터는 단백질 태그와 목적 단백질의 절단 시 잔여 아미노산이 없기 때문에 잔여 아미노산으로 인한 단백질의 기능 상실 또는 특성변화를 사전에 차단할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 따른 재조합 발현벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 과잉발현시키면, 간단하고 경제적인 분리·정제 과정을 통해 목적 단백질을 대량으로 얻을 수 있는 장점이 있다.

도 1은 pET28a 벡터와 엔테로키나아제(enterokinase) 또는 factor Xa 단백질 분해효소(factor Xa protease)를 인식하는 부위와의 결합 모습을 보여주는 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 재조합 벡터의 개열지도를 보여주는 것이며,
(A: pEk vector, B: pFxa vector)
도 3은 본 발명에 따른 재조합 백터 pEk vector에 목적단백질인 AVP 단백질을 융합하여 제조한 융합 단백질(pEk_avp)의 염기서열을 보여주는 것이고,
도 4는 본 발명에 따른 재조합 백터 pFxa vector에 목적단백질인 AVP 단백질을 융합하여 제조한 융합 단백질(pFxa_avp)의 염기서열을 보여주는 것이며,
도 5는 본 발명에 따른 재조합 벡터의 대장균에서 단백질 발현 여부를 확인한 결과이다.
(1: pFxa_avp, 2: pEk_avp, 3: pET3a_avp)

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

[실시예 1] DNA 단편의 제조

목적 단백질의 발현을 위한 카세트 구조를 만들기 위하여, 엔테로키나아제(enterokinase)를 인식부위를 갖는 5개의 아미노산 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(서열번호 1)로부터 서열번호 3의 뉴클레오티드(GAT GAC GAT GAC AAG) 및 factor Xa 단백질 분해효소(factor Xa protease)를 인식부위를 갖는 4개의 아미노산 Ile-Glu-Gly-Arg(서열번호 2)로부터 서열번호 4의 뉴클레오티드(ATA GAG GGT CGT)를 합성하였다.

친화성 크로마토그래피를 사용하여 단백질정제가 가능하도록 (His)₆-태그 (CAT CAT CAT CAT CAC CAC)를 융합파트너의 N-아미노산 말단에 존재하도록 제작하였다. 그리고 순수단백질을 얻기 위해, (His)6-태그를 제거하기 위한 엔테로키나아제(enterokinase)를 인식부위를 갖는 5개의 아미노산 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(서열번호 1)로부터 서열번호 3의 뉴클레오티드(GAT GAC GAT GAC AAG) 및 factor Xa 단백질 분해효소(factor Xa protease)를 인식부위를 갖는 4개의 아미노산 Ile-Glu-Gly-Arg(서열번호 2)를 존재하도록 제작, 다양한 목적단백질의 융합을 위해 쉽게 사용하는 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 제작하였다. 각 프라이머의 말단에 제한효소의 염기서열인, Nco1 (5`말단)과 Xho1 (3`말단)를 넣어 제작하였다.

하기 표 1의 프라이머를 이용하여 DNA 단편을 클로닝 하였다.

정제된 증류수에 녹아 있는 단일가닥 상태의 상기 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머, 서열번호 7의 프라이머와 서열번호 8의 프라이머 각각을 새로운 튜브에 동량 첨가한 후 서로의 상보적 염기서열에 의하여 결합할 수 있도록 55℃에서 10분 동안 방치하여 이중가닥의 DNA 단편들을 확보하였다.

확보된 이중가닥의 DNA 단편은 각 말단에 Nco1과 Xho1의 제한효소 자리가 있으므로 pET28a(Novagen 사, 미국) 벡터에 벡터 고유의 단백질 태그와 다중 클로닝 부위를 제거하기 위해 제한효소 Nco1과 Xho1 으로 처리한 후 최종적으로 목적 단백질 발현을 위해 제작한 프라이머를 삽입하였다.

[실시예 2] 발현벡터의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 이중가닥 형태의 DNA 단편을 포함하는 pET28a 클로닝 벡터를 제조하기 위하여, 제한효소 Nco1 및 Xho1로 절단한 pET28a(Novagen 사, 미국)와 상기 실시예 1에서 제조한 이중가닥 형태의 DNA 단편을 T4 DNA 라이게이즈(T4 DNA ligase, Roche Co.) 및 완충용액(650 mM Tris-HCl, pH 8.3; 50 mM MgCl₂; 10 mM KCl; 1% Triton X-100)을 첨가하여 혼합한 후 16℃에서 16 내지 24시간 동안 반응시켜 pET28a 플라스미드 DNA 벡터에 DNA 단편이 삽입(ligation)된 재조합 플라스미드 벡터를 제조하였고, 이를 "pEk vector", 또는 "pFxa vector"라 명명하였다. 도 2를 참조한다.

[실시예 3] 대장균에서 단백질 발현 여부 확인

상기 실시예 2에서 제조된 재조합 벡터 "pEk vector", 및 "pFxa vector"에 목적단백질인 AVP 단백질을 융합하여, 융합 단백질 pEk_avp(서열번호 9) 및, pFxa_avp(서열번호 10)를 제조하였다.

상기 AVP 단백질은 RC216816 플라스미드(Origen 사, 미국)로부터 사람의 AVP(Arginine vasopressin) 단백질 가운데 시그널 펩타이드를 제외한 나머지 활성 부위(30 - 165 아미노산)를 재조합하였다.

재조합 벡터 "pEk vector", 및 "pFxa vector" 의 다중 클로닝 사이트 중 Nde1과 BamH1을 이용하기 위하여 프라이머를 제작하였다. 상기 프라이머는 Nde1의 염기서열을 포함한 정방향 프라이머(GCG CAT ATG TAC TTC CAG AAC TGC CCG AGG)와 BamH1의 염기서열을 포함한 역방향 프라이머(GCG GGA TCC TCA GTA GGC GTC GGG CTG GG)를 제작하였다. 각 프라이머와 RC216816 플라스미드를 사용하여 95℃에서 40초, 55도에서 40초 72℃에서 1분의 조건으로 중합효소 연쇄반응을 하여 AVP 목적단백질을 증폭하였다.

pEk vector 및 pFxa vector 벡터와 상기 AVP 중합효소연쇄 반응 산물을 Nde1과 BamH1 제한효소를 처리한 후, 제한효소가 처리된 AVP와 pEk vector 및 pFxa vector의 DNA 단편을 T4 DNA 라이게이즈(T4 DNA ligase, Roche Co.) 및 완충용액(650 mM Tris-HCl, pH 8.3; 50 mM MgCl₂; 10 mM KCl; 1% Triton X-100)을 첨가하여 혼합한 후, 16℃에서 16 내지 24시간 동안 반응시켜 pEk vector 및 pFxa vector 플라스미드 DNA 벡터에 AVP 단편이 삽입(ligation)된 pEk_avp 및, pFxa_avp 재조합 융합 단백질을 제조하였다.

상기 실시예의 재조합 발현벡터와의 단백질 발현량을 비교하기 위하여, 기존에 많이 사용되고 있는 발현 벡터인 pET3a vector를 이용하였으며, 상기와 동일한 방법으로 AVP 단편을 삽입하여 pET3a_avp 재조합 융합 단백질을 제조하였다.

상기 제조된 융합 단백질을 각각 대장균으로 형질전환한 후 LB-Broth 미디어에 접종하여 진탕 배양한 다음, 배양세포의 농도가 600 nm에서 0.6의 흡광도를 나타낼 때, 최종 1 mM IPTG를 배양액에 첨가하여 단백질을 유도한 후, 일정시간 동안 30℃에서 진탕배양을 계속하였다.

상기 배양된 대장균 배양체의 총 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 IPTG 유도에 의하여, 상기 실시예에 따른 재조합 발현벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 도입된 경우, 대장균 내에서 약 18 kDa의 목적 단백질을 기존의 발현벡터에 비하여 간단하고 경제적인 분리·정제 과정을 통해 대량으로 얻을 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF STANDARDS AND SCIENCE <120> A Novel vector system for isolation and purification of target proteins <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> enterokinase <400> 1 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> factor Xa <400> 2 Ile Glu Gly Arg 1 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> enterokinase <400> 3 gatgacgatg acaag 15 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> factor Xa <400> 4 atagagggtc gt 12 <210> 5 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6His-Enterokinase primer <400> 5 catgggccat catcatcatc accacgatga cgatgacaag catatgaagc ttggtaccga 60 gctcgaattc ggatcctcta gac 83 <210> 6 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6His-Enterokinase primer <400> 6 tcgagtctag aggatccgaa ttcgagctcg gtaccaagct tcatatgctt gtcatggtca 60 tcgtggtgat gatgatgatg gcc 83 <210> 7 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6His-Factor Xa primer <400> 7 catgggccat catcatcatc accacataga gggtcgtcat atgaagcttg gtaccgagct 60 cgaattcgga tcctctagac 80 <210> 8 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6His-Factor Xa primer <400> 8 tcgagtctag aggatccgaa ttcgagctcg gtaccaagct tcatatgacg accctctatg 60 tggtgatgat gatgatggcc 80 <210> 9 <211> 480 <212> DNA <213> pEk_avp fusion protein <400> 9 catcatcatc atcaccacga tgacgatgac aagcatatgt acttccagaa ctgcccgagg 60 ggcggcaaga gggccatgtc cgacctggag ctgagacagt gcctcccctg cggccccggg 120 ggcaaaggcc gctgcttcgg gcccagcatc tgctgcgcgg acgagctggg ctgcttcgtg 180 ggcacggctg aggcgctgcg ctgccaggag gagaactacc tgccgtcgcc ctgccagtcc 240 ggccagaagg cgtgcgggag cgggggccgc tgcgccgcct tcggcgtttg ctgcaacgac 300 gagagctgcg tgaccgagcc cgagtgccgc gagggctttc accgccgcgc ccgcgccagc 360 gaccggagca acgccacgca gctggacggg ccggccgggg ccttgctgct gcggctggtg 420 cagctggccg gggcgcccga gcccttcgag cccgcccagc ccgacgccta ctgaggatcc 480 480 <210> 10 <211> 477 <212> DNA <213> pFxa_avp fusion protein <400> 10 catcatcatc atcaccacat agagggtcgt catatgtact tccagaactg cccgaggggc 60 ggcaagaggg ccatgtccga cctggagctg agacagtgcc tcccctgcgg ccccgggggc 120 aaaggccgct gcttcgggcc cagcatctgc tgcgcggacg agctgggctg cttcgtgggc 180 acggctgagg cgctgcgctg ccaggaggag aactacctgc cgtcgccctg ccagtccggc 240 cagaaggcgt gcgggagcgg gggccgctgc gccgccttcg gcgtttgctg caacgacgag 300 agctgcgtga ccgagcccga gtgccgcgag ggctttcacc gccgcgcccg cgccagcgac 360 cggagcaacg ccacgcagct ggacgggccg gccggggcct tgctgctgcg gctggtgcag 420 ctggccgggg cgcccgagcc cttcgagccc gcccagcccg acgcctactg aggatcc 477

Claims

서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드와 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 포함하는, 목적 단백질 발현 카세트.
제 2항에 있어서,
상기 서열번호 1 또는 서열번호 2는 엔테로키나아제(enterokinase) 또는 factor Xa 단백질 분해효소(factor Xa protease)를 인식하는 부위인 것을 특징으로 하는 목적 단백질 발현 카세트.
제 1항에 있어서,
상기 카세트는 카세트 상류 또는 하류에 (His)₆-태그를 코딩하는 뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질 발현 카세트.
제 3항에 있어서,
상기 카세트는 서열번호 5 내지 8로부터 선택되는 하나 이상의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 목적 단백질 발현 카세트.
제 1항 내지 제 4항에서 선택되는 어느 한 항의 목적 단백질 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터.
제 5항에 있어서,
상기 벡터는 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 추가적으로 목적 단백질 발현 유도 카세트에 작동적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 5항에 있어서,
상기 벡터는 도 2의 개열지도를 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 5항 내지 제 7항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 재조합 벡터로 형질전환 된 세포주.
제 8항의 세포주를 배양하고, 단백질을 발현하는 단계를 포함하는 단백질의 생산방법.
제 9항에 있어서,
상기 생산방법은 단백질의 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 생산방법.
제 9항에 따른 단백질 생산방법으로 생산된, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질.
제 11항에 있어서,
상기 서열번호 1 또는 서열번호 2는 엔테로키나아제(enterokinase) 또는 factor Xa 단백질 분해효소(factor Xa protease)를 인식하는 부위인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제 11항에 있어서,
상기 융합 단백질은 융합 단백질의 상류 또는 하류에 (His)₆-태그를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제 11항 내지 제 13항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.