KR101373297B1

KR101373297B1 - 대장균 포스포글리세르산 인산화효소 유전자를 융합 파트너로서 포함하는 발현벡터

Info

Publication number: KR101373297B1
Application number: KR1020120017666A
Authority: KR
Inventors: 이지원; 송종암; 박진승
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2012-02-21
Filing date: 2012-02-21
Publication date: 2014-03-11
Anticipated expiration: 2032-02-21
Also published as: KR20130096111A

Abstract

본 발명은 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (Escherichia coli phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자를 융합파트너(fusion partner)로서 포함하는 발현벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 융합파트너는 난발현 단백질의 활성 발현을 유도하고, 목적 단백질의 수용성도(solubility) 및 발현율을 향상시킴으로써, 향후 의료용 및 산업용 단백질 생산 및 개발에 유용하다.

Description

대장균 포스포글리세르산 인산화효소 유전자를 융합 파트너로서 포함하는 발현벡터 {Expression Vector Comprising Gene coding for E. coli Phosphoglycerate kinase As a Novel Fusion Partner}

본 발명은 대장균 포스포글리세르산 인산화효소 유전자를 융합 파트너로서 포함하는 발현 벡터에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (Escherichia coli phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자를 융합파트너(fusion partner)로 포함하는 발현벡터 또는 유전자 구조체(gene construct) 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

생명공학 기술에 의해 생산되는 단백질에는 일반적으로 면역 조절 및 효소 저해제 및 호르몬 같은 의약 및 연구용 단백질과 진단용 단백질이나 반응 첨가 효소와 같은 산업용 단백질로 대별될 수 있으며 이 두 가지 단백질들을 중심으로 생산 공정 기술 개발 및 산업화가 추진되고 있다. 특히 재조합 미생물 기술을 이용하여 유용한 재조합 단백질을 생산할 때, 유전정보가 잘 알려져 있으며 다양한 벡터 시스템을 구축하고 있고, 비교적 값싼 배지에서 빠르게 고농도로 배양할 수 있는 장점을 가진 대장균이 연구 또는 상업적 목적으로 많이 사용되고 있다.

대장균에서 재조합 단백질을 생산함에 있어 강력한 유도성(inducible) 프로모터를 갖춘 다양한 발현벡터가 개발되어 목적 단백질의 생산에 이용되어 왔다. 그러나 숙주세포로 대장균을 이용하는 경우 제조하고자 하는 단백질이 대장균 내의 단백질 분해효소에 의해 분해되어 수율이 낮아지는 경우가 많으며, 특히 분자량이 10kDa 이하의 작은 크기의 폴리펩타이드의 발현에서 이러한 경향이 심한 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 재조합 단백질이 대장균에서 과다 발현시 응집체(inclusion body)로 알려진 불용성 응집체를 형성하는 경우가 많다고 알려져 있으며 응집체로 발현된 폴리펩타이드의 경우 접힘(folding) 중간체가 분자 상호간의 다이설파이드 결합(intermolecular disulfide bond) 또는 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해 숙주세포의 다른 단백질 불순물들[샤페론(chaperon), 라이보좀(ribosome), 초기인자 등]과 비선택적으로 결합함으로써 목적 폴리펩타이드의 응집체 내 순도가 떨어지는 단점이 있다. 또한 이렇게 발현된 단백질을 활성형으로 만들기 위해서는 구아니딘-하이드로클로라이드(Guanidine hychloride)나 우레아(urea)같은 변성제를 사용하여 용해시킨 후 희석하는 재접힘(refolding) 과정을 거쳐야 하는데 이때 단백질이 활성형으로 접히지 않는 등 생산 수율이 감소하는 문제점이 있다(Marston FA, Biochem J 240(1):1-12, 1986).

대장균에서 활성형의 재조합 단백질을 고 수율로 얻기 위해 대장균의 단백질 발현속도를 낮추어 목적 단백질의 수용도를 높이는 저온 발현 실행(Hammarstrom et al., Protein Sci. 11:313-321, 2002), 다양한 프로모터를 사용하거나 유도(induction) 조건을 최적화하는 방법(Qing et al ., Nat Biotechnol . 22:877-882, 2004) 및 분자 샤페론 또는 단백질 접힘 조절자와 목적 단백질을 동시발현시키는 방법(de Marco & De Marco, J Biotechnol . 109:45-52, 2004) 등이 많이 시도되고 있지만, 정제와 목적 단백질의 접힘을 돕는 융합파트너와 목적 단백질을 융합하여 발현하는 것이 가장 일반적인 방법이다.

실제로 대장균 내에서 목적 단백질의 수용성 높은 발현을 유도하는 여러 융합파트너가 지난 수년 동안 연구되고 보고되어왔다(Esposito & Chatterjee, Curr Opin Biotechnol . 17:353-358 2006; Kapust & Waugh, Protein Sci . 8:1668-1674, 1999; Sachdev & Chirgwin, Biochem . Biophys . Res . Commun . 244:933-937, 1998).

가장 많이 연구된 대표적인 융합파트너로는 말토오즈 결합 단백질(Maltose binding protein; MBP), 글루타치온-S-전이효소(Glutathione-S-transferase; GST), 티오레독신(Thioredoxin; Trx), NusA 등이 있다. 말토오스 결합 단백질의 경우 이량체 형성에 관여하는 부분에 소수성을 띠는 아미노산이 모여 만들어진 넓은 소수성 틈새가 새로 합성되는 단백질의 소수성 부위를 효과적으로 감춰주어 목적 단백질이 불용성 응집체가 되는 것을 방지해 주며, 티오레독신은 목적 단백질의 다이설파이드 결합을 도와주고, NusA의 경우 대장균에서 과량으로 발현되었을 때 활성형으로 접히는 능력이 매우 뛰어나므로 뒤따라 발현되는 목적 단백질의 올바른 접힘을 유도한다(Bach H et al ., J Mol Biol 312:79-93, 2001; Edward RL et al ., Nat Biotechnol 11:187-193, 1993; Davis GD et al ., Biotechnol Bioeng 65:382-388, 1999).

이러한 융합파트너는 친화 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법을 이용하여 융합발현된 목적 단백질을 쉽게 정제할 수 있다는 장점이 있으며 각기 다른 분자생물학적 특성을 이용하여 목적 단백질의 접힘을 돕는다고 알려져 있다. 하지만 이러한 융합파트너들은 목적 단백질에 비해 상대적으로 크기가 커서 융합 부분의 크기에 따라 목적 단백질의 수율이 현저히 떨어진다는 단점과 의료목적 또는 산업적으로 유용한 단백질들에 모두 범용적으로 작용하지 않는다는 단점이 있다. 또한, 목적 단백질을 수용성으로의 발현을 유도하더라도 고유한 기능을 수행하는 활성형으로의 발현을 유도하는 데는 실패하는 경우가 많고, 적합한 용도로 이용되기 위하여 융합파트너의 제거 과정이 추가되어야 하는 공정상의 불합리성을 지닌다는 문제점이 있다.

지금까지 생명공학 기술에 의해 산업적으로 생산된 국내의 재조합 단백질은 발현 가능한 재조합 단백질들의 생산 공정개발에 치중되어 있어서 핵심 원천 기술인 발현시스템 개발은 외국에 비해 상대적으로 모방 또는 개량 수준의 부가기술로서 개발되고 있는 상태이며 상업적으로나 의약적으로 매우 중요한 단백질은 분비 단백질(secretory protein) 및 막 단백질(membrane protein)들로서 대장균 내에서 발현시 불용성 응집체를 만드는 난발현성 단백질(difficult-to-express proteins)이여서 개발이 지연되고 있다. 이를 극복하기 위해서는 대장균 내에서 난발현 단백질의 발현시스템에 관한 원천 기반기술을 확보하는 것이 중요하다. 또한 상기한 바와 같이 각각의 융합파트너는 각기 다른 분자생물학적 특성을 가짐으로써 융합된 재조합 단백질이 접힘을 돕는 기작도 다르기 때문에 모든 단백질에서 동일한 효과를 나타내지 못한다.

이에 본 발명자들은, 범용적으로 재조합 단백질의 접힘을 효과적으로 돕는 융합파트너를 이용한 발현 시스템을 구축하기 위해 예의 노력한 결과, 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자를 융합파트너로 이용하여 목적 단백질과 융합 발현시킬 경우, 재조합 단백질의 수용성도(solubility) 및 발현율이 현저히 향상되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자를 융합파트너로 이용하여 목적 단백질의 수용성도를 높히고 접힘(folding)을 향상시킬 수 있는, 재조합 단백질 생산용 유전자 구조체(gene construct) 및 발현벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 단백질 생산용 유전자 구조체(gene construct) 또는 발현벡터로 형질전환되어있는 재조합 미생물 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 목적 단백질 유전자를 포함하는 발현벡터에 있어서, 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자를 융합파트너로서 포함하는 재조합 단백질 생산용 발현벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 이러한 재조합 미생물을 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도한 다음 이를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 연결되어 있는 유전자 구조체(gene construct)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자 구조체가 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 있는 재조합 미생물 및 이러한 재조합 미생물을 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도한 다음 이를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 ePGK와 ePGK의 N-도메인의 유전자를 융합 파트너로 이용한 것으로, 본 발명에 따른 융합 파트너는 난발현 단백질의 활성 발현을 유도하고, 목적 단백질의 수용성도(solubility) 및 발현율을 향상시키며, 다양한 목적 단백질에 이용될 수 있어, 난발현 단백질을 초고속, 고효율로 활성 발현시키는데 유용하며, 향후 의료용 및 산업용 단백질 생산 및 개발에도 유용하다.

도 1은 목적단백질 유전자만을 단독으로 포함하는 발현벡터(A), F-ePGK 유전자와 목적단백질 유전자의 융합 발현벡터(B), N-ePGK 유전자와 목적단백질 유전자의 융합 발현벡터(C) 및 N-ePGK 유전자와 목적단백질 유전자 사이에 엔테로키나제 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결된 융합 발현벡터(D)의 도식도이다.
도 2는 8개의 난발현 단백질들을 대장균에서 단독 발현시킨 경우의 재조합 단백질의 발현량을 SDS-PAGE로 나타낸 결과이다 (M: 분자 마커; S: 가용성 분획; IS: 비가용성 분획).
도 3은 8개의 난발현 단백질들을 대장균에서 F-ePGK 유전자와 융합 발현시킨 경우의 재조합 단백질의 발현량을 SDS-PAGE로 나타낸 결과이다 (M: 분자 마커; S: 가용성 분획; IS: 비가용성 분획).
도 4는 8개의 난발현 단백질들을 대장균에서 N-ePGK 유전자와 융합 발현시킨 경우의 재조합 단백질의 발현량을 SDS-PAGE로 나타낸 결과이다 (M: 분자 마커; S: 가용성 분획; IS: 비가용성 분획).
도 5는 8개의 난발현 단백질들을 대장균에서 단독 발현, F-ePGK 유전자 또는 N-ePGK 유전자와 융합발현시, 용해도(solubility)(A) 및 발현 수준(expression level)(B)을 비교한 그래프이다.
도 6은 상기 엔테로키나제 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 제거 전 및 제거후의 목적 단백질의 SDS-PAGE (line 1-3, 7, 및 8) 및 western blot (line 4-6) 결과, CD 스펙트럼을 통한 목적 단백질의 2차 구조 분석 결과를 나타낸 그래프(B) 및 SDS-PAGE 결과(C)를 나타낸 것이다.
도 7은 N-ePGK와 융합발현된 hFTN-L(Human ferritin light chain)의 정제(A) 및 TEM 이미지(B)를 나타낸 것이다.
도 8은 N-ePGK와 융합발현된 ADI(Arginine deiminase from Mycoplasma) (lane 1) 및 N-ePGK로부터 분리된 ADI (lane 2)의 SDS-PAGE 결과 데이타(A), 및 융합 발현된 ADI의 activity 분석 그래프(B)이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명자는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자를 융합파트너로 이용하여 다양한 목적 단백질을 생산함으로써, 범용적으로 적용 가능한 미생물 기반 단백질 활성 발현 시스템을 구축하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 목적 단백질 유전자를 포함하는 발현벡터에 있어서, 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자를 융합파트너로서 포함하는 재조합 단백질 생산용 발현벡터에 관한 것이다.

대장균에서 목적 단백질은 불용성 응집체로 발현되는 경우가 많다. 단백질의 접힘을 저해하는 조건에서도 활성이 유지되며 발현량이 우수한 단백질은 단백질의 잘못된 접힘(misfolding)을 극복하기 위한 대장균의 생체 메커니즘에 관여할 수 있고, 단백질 구조가 안정적이며 자체 접힘 능력이 뛰어나다는 것을 보여주므로 융합단백질로서 효과적으로 이용될 수 있다.

Escherichia coli phosphoglycerate kinase (accession no. P11665; ePGK, 40.9kDa)는 해당계에서 제1의 기질 수준의 인산화부위에 관여하는 매우 안정한 구조를 가진 효소이다. 1,3-2포스포글리세르산과 ADP에서 3포스포글리세르산과 ATP를 생성한다. ePGK는 단백질 분해효소가 존재하는 환경에서도 여러 날 동안 활성형으로 그리고 수용성 상태로 존재할 수 있다.

전체크기의 ePGK(full-length ePGK, 이하 F-ePGK)는 N-도메인(N-domain ePGK, 이하 N-ePGK)과 C-도메인(C-domain ePGK, 이하 C-ePGK), 2개의 도메인으로 이루어져 있으며 이 두 도메인은 알파 나선형 연결자로 연결되어 있다. N-도메인과 C-도메인은 유사한 크기와 구조를 이루고 있지만 서로 다른 구조적 특징을 가지고 있다. ePGK의 C-도메인은 ePGK의 N-도메인 없이는 단독으로는 정확한 구조로 접혀서 발현될 수 없고 반면 ePGK의 N-도메인은 독립적으로 존재하여도 대장균 내에서 정확한 구조로 접혀서 존재 할 수 있다.

이에 본 발명자들은 단백질의 올바른 접힘을 유도하기 위해 ePGK와 ePGK의 N-도메인을 융합파트너로 사용하였고, 그 결과 재조합 단백질의 수용성 발현이 현저히 향상되었음을 규명하였다.

본 발명의 재조합 단백질의 융합파트너 N-ePGK는 크기가 작아서 목적 단백질의 수율이 이전의 융합파트너에 비해 훨씬 향상될 수 있으며, 도 3, 4에서 나타난 바와 같이 의료목적 또는 산업적으로 유용한 단백질들에 모두 범용적으로 적용될 수 있고, 도 6, 7, 8에 나타난 바와 같이 목적 단백질의 수용성 발현을 유도할 뿐만 아니라 고유한 기능을 수행하는 활성형으로의 발현을 유도하는 데 적합하다.

본원에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현벡터가 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 뼈대 벡터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a, pET-22b(+) 및 pGEX로 이루어진 군으로부터 선택되는 대장균에 형질전환 가능한 다양한 벡터를 사용할 수 있다.

염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

아울러, 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자는 숙주세포의 게놈에 도입되어 염색체 상 인자로서 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 구조체(gene construct) 및 유전자 구조체가 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 목적 단백질 유전자와 융합파트너로서의 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자가 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 상기 융합파트너의 유전자와 목적 단백질의 유전자를 일련의 순서로 포함함으로써 상기 융합파트너와 목적 단백질을 재조합 단백질로 발현할 수 있다(도 1 참조).

또한, 본 발명은, 상기 목적 단백질 유전자와 상기 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자 사이에 단백질 절단 효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

융합파트너와 융합할 목적 단백질이 산업용 단백질일 경우, 융합파트너가 목적 단백질의 기능을 저하할 수도 있으며, 의학용 단백질일 경우는 항원항체 반응을 야기할 수 있으므로 융합파트너는 제거되는 것이 바람직하다. 이때, 상기 단백질 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 또는 퓨린(Furin) 인식부위가 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다.

발명의 일 실시예에서는, pET28a 뼈대 벡터에 상기 융합파트너의 유전자, 단백질 절단효소 인식부위 및 목적 단백질의 유전자를 일련의 순서로 포함하는 벡터를 제조한 뒤, 상기 융합파트너와 목적 단백질을 재조합 단백질로 발현할 수 있음을 확인하였다(도 1 참조). 또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 엔테로키나제 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 연결하여, 단백질 발현 및 정제 후 엔테로키나제로 융합파트너를 제거하고, 제거 후에도 목적 단백질의 수용성이 유지되는 것을 확인하였다(도 6 참조).

아울러, 재조합 단백질의 분리 정제가 용이하도록, 본 발명의 벡터의 융합파트너 또는 목적 단백질의 유전자에 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 작동 가능하도록 연결할 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, poly-His 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다. 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 벡터는 pT7 뼈대 벡터에 상기 융합파트너의 유전자, 목적 단백질의 유전자 및 분리정제용 태그를 일련의 순서로 포함함으로써 상기 융합파트너, 목적 단백질 및 분리정제용 태그를 포함하는 재조합 단백질을 발현할 수 있다.

상기 목적 단백질의 유전자는 제한효소 부위를 통해 클로닝 될 수 있고, 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 사용된 경우에는 상기 폴리뉴클레오티드와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 목적 단백질 분비 후 단백질 절단효소로 절단하여, 원래 형태의 목적 단백질을 생산할 수 있도록 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 할 수 있다.

이때, "목적 단백질(target protein)" 또는 "외래 단백질(heterologous protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다. 또한, 본 발명에서, "재조합 융합 단백질"이란, 목적단백질과 ePGK 또는 N-ePGK가 융합되어 있는 형태의 단백질을 의미한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 당업자가 원하는 모든 단백질에 적용 가능하며, 특히, 의료, 연구용 및 산업용 단백질, 예를 들어, 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청, 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성을 갖는 다양한 목적 단백질을 재조합 단백질 형태로 발현할 수 있다.

본 발명에서는 F-ePGK 및 N-ePGK가 목적 단백질의 접힘을 돕는 융합파트너로서의 가능성을 검증하기 위하여, 대장균에서 융합파트너 없이 단독으로 발현하였을 때 불용성 응집체를 형성한다고 알려진 8개의 단백질과 융합 발현시켰다. 즉, 의료, 연구용 단백질로는 대표적으로 인간 미니프로인슐린(human minipro-insulin, 이하 mp-INS), 아르기닌 디이미나아제(Arginine deiminase, 이하 ADI), 인간 프리프로-그렐린(human prepro-ghrelin, 이하 ppGRN), 인간 글루타메이트 디카르복실레이즈(human glutamate decarboxylase, 이하 GAD_448-585), 수도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 유래의 큐티네이즈(cutinase, 이하 CUT), 인간 페리틴 가벼운 사슬(human ferritin light chain, 이하 hFTN-L), 인간 과립구 집락-자극인자(human granulocyte colony-stimulating factor, 이하 G-CSF) 및 인간 활성유도 시티딘 디아미네이즈(human activation induced cytidine deaminase, 이하 AID)를 목적 단백질로 융합 발현하였고 산업용 단백질로는 제1형 당뇨병의 진단 마커로 알려진 글루탐산 탈카르복시화 효소의 448 내지 558 아미노산(glutamate decarboxylase_448-585, 이하 'GAD_448-585')과 섬유의 전처리에 이용되고 플라스틱 분해능을 가져 친환경 산업용 효소로 각광받고 있는 수도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 유래의 큐티네이즈(cutinase, 이하 'CUT')를 목적 단백질로 선정하여 각각 F-ePGK 및 N-ePGK의 카르복실 말단에 삽입한 발현벡터를 제조한 후(도 1 참조) 이를 대장균에 형질전환시키고 이로부터 재조합 단백질 형태로 생산하였다. 각각의 재조합 단백질의 발현량을 확인한 결과, 단독 발현한 목적 단백질의 수용성 발현량(도2 참조)보다 F-ePGK 및 N-ePGK와 융합한 목적 단백질에서 수용성 발현량이 매우 증가하는 것을 확인하였다(도 3, 4 참조). 특히 F-ePGK와 융합발현하였을 경우 GAD_448-585,MP-INS, AID는 여전히 낮은 수용성도를 보이는 반면 N-ePGK와 융합발현하였을 경우에는 이 목적 단백질들을 포함하여 현저히 증가된 수용성도 뿐만 아니라 발현율 또한 더욱 증가되는 것을 확인 할 수 있다(도 5 참조). 또한, 본 발명의 융합파트너와의 융합 발현이 재조합 단백질의 활성 및 구조형성에 영향을 미치는지 검증하기 위해, hG-CSF의 2차구조형성 확인(도 6 참조) 및 ADI의 활성측정(도 8 참조) 그리고 hFTN-L의 단백질 나노입자 형성 여부(도 7 참조)도 병행하였다.

본 발명에 있어서, 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자는 서열번호 39로 표시되고, 상기 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자는 서열번호 40으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자를 융합파트너로서 포함하는 재조합 단백질 생산용 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도한 다음, 이를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

이때, 상기 제조방법은 상기 재조합 단백질로부터 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자를 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 ePGK와 ePGK의 N-도메인의 유전자를 융합파트너로 사용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법은 기존의 융합파트너가 가지고 있는 수용성과 접힘에 관한 한계를 극복할 수 있고, 단백질 의약품 및 산업용 생산에 폭 넓게 이용될 수 있는 특징이 있다.

실시예

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 목적 단백질로서, 난발현 단백질로 알려진 8개 단백질, 즉, 아르기닌 디이미나아제(Arginine deiminase, 이하 ADI; NCBI Nucleotide accession number X54141; 서열번호 41), 미니프로인슐린(human minipro-insulin, 이하 mp-INS; EF518215:1-180bp), 인간 프리프로-그렐린(human prepro-ghrelin, 이하 ppGRN; NCBI Nucleotide accession number NM;016362: 109-393), 인간 글루타메이트 디카르복실레이즈(human glutamate decarboxylase, 이하 GAD₄₄₈ _-585; 서열번호 22), 수도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 유래의 큐티네이즈(cutinase, 이하 CUT; 서열번호 42), 인간 페리틴 가벼운 사슬(human ferritin light chain, 이하 hFTN-L; NM;000146:200-727bp; 서열번호 43), 인간 과립구 집락-자극인자(human granulocyte colony-stimulating factor, 이하 G-CSF; NCBI Nucleotide accession number NM;172219: 131-655bp) 및 인간 활성유도 시티딘 디아미네이즈(human activation induced cytidine deaminase, 이하 AID; NCBI Nucleotide accession number NM;020661: 77-673bp)를 대상으로 실험하였으나, 이에 제한되지 않고 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질이라면 종류와 무관하게 적용 가능하다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

실시예 1: 아미노 말단에 F- ePGK 및 N- ePGK 을 융합파트너로 포함하는 발현벡터의 제조

단백질 분해효소가 존재하는 환경에서도 수 일간 수용성상태로 구조 및 활성을 유지할 수 있는 본연의 구조안정성을 갖는 전체 크기의 ePGK(F-ePGK)와 단독으로 존재하여도 대장균 내에서 정확한 구조로 접혀서 존재할 수 있는 ePGK의 N-도메인(N-ePGK)부위를 융합파트너로 포함하는 발현벡터를 제조하였다.

F-ePGK 유전자(서열번호 39)를 암호화하는 뉴클레오티드를 획득하기 위해, 정지 코돈을 제외한 F-ePGK 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머쌍을 제작하였다. 또한, 상기 프라이머쌍의 센스 프라이머(서열번호 1: cat atg cat cat cac cac cat cat tct gta att aag)에는 NdeI 제한효소 인식서열을, 안티센스 프라이머(서열번호 2: ctc gag ctt ctt agc gcg ctc ttc)에는 XhoI 제한효소 인식서열을 포함하도록 제작하였다. PCR은 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH₄)₂SO₄; 20 mM Tris-HCl(pH8.8); 2 mM MgSO₄; 0.1% Triton X-100)에 대장균으로부터 분리한 염색체를 주형 DNA로 100 ng, 서열번호 1 내지 2로 기재되는 프라이머쌍을 각각 50 pmol을 넣은 다음 Taq DNA 중합효소를 이용하여 수행되었다. 반응 조건은 94℃/30초(변성), 52℃/30초(어닐링), 72℃/30초(신장)로 총 30회 수행하였으며, 그 결과 증폭된 DNA절편의 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 XhoI 제한 효소 부위를 포함하는 PCR 산물을 수득하였다. 증폭된 PCR 산물을 제한효소 NdeI과 XhoI으로 각각 처리하여 pT7-7(Novagen, USA)의 제한효소 NdeI과 XhoI자리에 삽입하였고 이를 pT7-F-ePGK이라고 명명하였다.

N-ePGK 유전자((서열번호 40), 1-177bp & 371-387bp)를 암호화하는 뉴클레오티드를 획득하기 위해, 정지 코돈을 제외한 6개의 히스티딘을 만드는 유전자가 포함된 N-ePGK 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머쌍을 제작하였다. 또한, 상기 프라이머쌍의 센스 프라이머(서열번호 1: cat atg cat cat cac cac cat cat tct gta att aag)에는 NdeI 제한효소 인식서열을, 안티센스 프라이머(서열번호 3: cag tac ttt acc ttc gcc acc tgc ttt acc cag cgc, 서열번호 4: ttc gag cat cgc tac tgc agg cag tac ttt acc ttc, 서열번호 5: ctc gag ctt ctt agc gcg ctc ttc gag cat cgc tac)에는 XhoI 제한효소 인식서열을 포함하도록 제작하였다. Assembly PCR 방법을 통하여 실시를 하였고 PCR은 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH₄)₂SO₄; 20 mM Tris-HCl(pH8.8); 2 mM MgSO₄; 0.1% Triton X-100)에 대장균으로부터 분리한 염색체를 주형 DNA로 100 ng, 서열번호 1 내지 3, 4, 5로 기재되는 프라이머쌍을 각각 50 pmol을 넣은 다음 Taq DNA 중합효소를 이용하여 수행되었다. 반응 조건은 94℃/30초(변성), 52℃/30초(어닐링), 72℃/30초(신장)로 총 30회 수행하였으며, 그 결과 증폭된 DNA절편의 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 XhoI 제한 효소 부위를 포함하는 PCR 산물을 수득하였다. 증폭된 PCR 산물을 제한효소 NdeI과 XhoI으로 각각 처리하여 pT7-7(Novagen, USA)의 제한효소 NdeI과 XhoI자리에 삽입하였고 이를 pT7-N-ePGK이라고 명명하였다.

실시예 2: 외래단백질을 융합단백질 형태로 제조하는 발현벡터

F-ePGK 및 N-ePGK를 융합파트너로 이용하여 다양한 외래단백질의 수용성 발현의 증가를 확인하기 위해 외래단백질의 단독 발현벡터, 융합파트너와의 융합 발현벡터 및 단백질 절단효소 인식부위를 포함하는 융합 발현벡터를 제작하였다.

2-1: 외래단백질 단독 발현벡터

아르기닌 디이미나아제(Arginine deiminase, 이하 ADI; NCBI Nucleotide accession number X54141; 서열번호 41), 미니프로인슐린(human minipro-insulin, 이하 mp-INS; EF518215:1-180bp), 인간 프리프로-그렐린(human prepro-ghrelin, 이하 ppGRN; NCBI Nucleotide accession number NM;016362: 109-393), 인간 글루타메이트 디카르복실레이즈(human glutamate decarboxylase, 이하 GAD_448-585; 서열번호 22), 수도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 유래의 큐티네이즈(cutinase, 이하 CUT; 서열번호 42), 인간 페리틴 가벼운 사슬(human ferritin light chain, 이하 hFTN-L; NM;000146:200-727bp; 서열번호 43), 인간 과립구 집락-자극인자(human granulocyte colony-stimulating factor, 이하 G-CSF; NCBI Nucleotide accession number NM;172219: 131-655bp) 및 인간 활성유도 시티딘 디아미네이즈(human activation induced cytidine deaminase, 이하 AID; NCBI Nucleotide accession number NM;020661: 77-673bp) 등의 외래단백질의 5'-말단에 NdeI 제한효소 인식서열과 3'-말단에 HindIII 제한효소 인식서열을 포함하도록 제작된 표 1의 프라이머쌍을 각각 50 pmol씩 포함한 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH₄)₂SO₄; 20 mM Tris-HCl(pH8.8); 2 mM MgSO₄; 0.1% Triton X-100)에 주형 DNA 100 ng을 넣은 다음 Taq DNA 중합효소를 이용하여 94℃/30초(변성), 52℃/30초(어닐링), 72℃/30초(신장)로 총 30회 PCR을 수행하였다.

구체적으로 ADI, ppGRN, mp-INS, AID, CUT, G-CSF 및 hFTN-L은 시작 코돈을 제외하고 정지 코돈을 포함하는 아미노산 서열을 증폭하였고, GAD₄₄₈ _-585의 경우는 448번째 아미노산부터 585번째에 해당하는 138개의 아미노산 서열을(서열번호 22)증폭하였다. 이때, GAD₄₄₈ _-585의 경우는 3'-말단에 ClaI 제한효소 인식서열을 포함하도록 프라이머를 제작하였다.

또한, mp-INS, ppGRN, GAD₄₄₈ _-585, AID, hFTN-L 및 G-CSF의 주형 DNA는 상기 단백질들이 많이 발현하는 인간 조직으로부터 RNeasy mini kit(QIAGEN, USA)를 이용하여 전체 RNA를 추출한 뒤, 전체 RNA 1 과 oligo-d(T) 1 (Invitrogen, USA, 0.5 /)에 증류수를 50㎕ 까지 채운 후, AccuPower RT-premix(Bioneer, 한국)에 넣어 RT-PCR(reverse transcription polymerasechain reaction) 반응시켰다. 70℃에서 5분, 4℃에서 5분, 42℃에서 60분, 94℃에서 5분, 4℃에서 5분간 반응하여 cDNA를 합성함으로써 수득하였다. 상기 mp-INS는 인간 췌장 조직, ppGRN은 인간 태반, hFTN-L, G-CSF는 인간 백혈구, AID는 인간 측두엽 세포 및 GAD_448-585는 인간 해마 조직에서 각각 클로닝 하였다. CUT의 경우는 Genomic DNA Purification. kit(promega, USA)을 슈도모나스 푸티다로부터 이용하여 추출한 DNA를 주형 DNA로 사용하였다.

프라이머 서열

유전자명	프라이머	서열번호	염기서열
ADI	센스	서열번호 6	cat atg tct gta ttt gac agt
ADI	안티센스	서열번호 7	aag ctt cta tca ctt aac atc
mp-INS	센스	서열번호 8	cat atg ttt gtc aac caa cat
mp-INS	안티센스	서열번호 9	aag ctt tta gtt aca gta gtt c
ppGRN	센스	서열번호 10	cat atg ggc tcc agc ttc ctg
ppGRN	안티센스	서열번호 11	aag ctt tca ctt gtc ggc t
AID	센스	서열번호 12	cat atg gac agc ctc ttg atg aac
AID	안티센스	서열번호 13	aag ctt tca taa caa aag tcc ca
GAD₄₄₈ _-585	센스	서열번호 14	cat atg cgc cac gtt gat gt
GAD₄₄₈ _-585	안티센스	서열번호 15	atc gat tta taa atc ttg tcc
CUT	센스	서열번호 16	cat atg gct ccc ctg ccg gat ac
CUT	안티센스	서열번호 17	aag ctt tta aag ccc gcg gcg ct
hFTN-L	센스	서열번호 18	cat atg agc tcc cag att cgt
hFTN-L	안티센스	서열번호 19	aag ctt tta gtc gtg ctt gag agt
hG-CSF	센스	서열번호 20	cat atg act cca ctc gga cct g
hG-CSF	안티센스	서열번호 21	aag ctt tca tgg ctg tgc aag

상기 PCR 증폭 산물을 NdeI/HindIII(GAD₄₄₈ _-585의 경우는 NdeI/ClaI) 제한 효소로 처리한 후, 대장균 발현벡터 pT7(Novagen, USA)의 NdeI/HindIII(GAD₄₄₈ _-585의 경우는 NdeI/ClaI) 자리에 삽입함으로써 외래단백질의 단독 발현벡터를 수득하였다.

2-2: 외래단백질의 융합파트너와의 융합 발현벡터

ADI, mp-INS, ppGRN, AID, GAD₄₄₈ _-585, CUT, hFTN-L 및 G-CSF등의 외래단백질의 5'-말단에 XhoI 제한효소 인식서열과 3'-말단에 HindIII 제한효소 인식서열을 포함하도록 제작된 표 3의 프라이머쌍을 각각 50 pmol씩 포함한 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH₄)₂SO₄; 20 mM Tris-HCl(pH8.8); 2 mM MgSO₄; 0.1% Triton X-100)에 주형 DNA 100 ng을 넣은 다음 Taq DNA 중합효소를 이용하여 94℃/30초(변성), 52℃/30초(어닐링), 72℃/30초(신장)로 총 30회 PCR을 수행하였다. 구체적으로 hFTN-L, ADI, mp-INS, ppGRN, AID, G-CSF, CUT는 시작 코돈을 제외하고 정지 코돈을 포함하는 아미노산 서열을 증폭하였고, GAD₄₄₈ _-585의 경우는 448번째 아미노산부터 585번째에 해당하는 138개의 아미노산 서열을 증폭하였다(서열번호 22). 이때, GAD₄₄₈ _-585의 경우는 3'-말단에 ClaI 제한효소 인식서열을 포함하도록 프라이머를 제작하였다.

프라이머 서열

유전자명	프라이머	서열번호	염기서열
ADI	센스	서열번호 23	ctc gag gat gac gat gac aag tct gta ttt ga
ADI	안티센스	서열번호 24	aag ctt cta tca ctt aac atc
mp-INS	센스	서열번호 25	ctc gag ttt gtc aac caa cat
mp-INS	안티센스	서열번호 26	aag ctt tta gtt aca gta gtt c
ppGRN	센스	서열번호 27	ctc gag ggc tcc agc ttc ctg
ppGRN	안티센스	서열번호 28	aag ctt tca ctt gtc ggc t
AID	센스	서열번호 29	ctc gag gac agc ctc ttg atg aac
AID	안티센스	서열번호 30	aag ctt tca taa caa aag tcc ca
GAD₄₄₈ _-585	센스	서열번호 31	ctc gag cgc cac gtt gat gt
GAD₄₄₈ _-585	안티센스	서열번호 32	atc gat tta taa atc ttg tcc
CUT	센스	서열번호 33	ctc gag gct ccc ctg ccg gat ac
CUT	안티센스	서열번호 34	aag ctt tta aag ccc gcg gcg ct
hFTN-L	센스	서열번호 35	ctc gag agc tcc cag att cgt
hFTN-L	안티센스	서열번호 36	aag ctt tta gtc gtg ctt gag agt
hG-CSF	센스	서열번호 37	ctc gag acc ccc ctg ggc cct gcc
hG-CSF	안티센스	서열번호 38	aag ctt tca tgg ctg tgc aag

상기 PCR 증폭 산물을 XhoI/HindIII(GAD₄₄₈ _-585의 경우는 XhoI/ClaI) 제한 효소로 처리한 후, 실시예 1의 방법으로 제작한 발현벡터 pT7-F-ePGK 및 pT7-N-ePGK의 XhoI/HindIII(GAD₄₄₈ _-585의 경우는 XhoI/ClaI) 자리에 삽입함으로써 외래단백질의 융합파트너와의 융합 발현벡터를 수득하였다. 상기의 방법으로 만들어진 플라스미드를 각각 pT7-F-ePGK:FTN-L, pT7-F-ePGK:AID, pT7-F-ePGK:mp-INS, pT7-F-ePGK:hG-CSF, pT7-F-ePGK:ADI, pT7-F-ePGK:CUT, pT7-F-ePGK:ppGRN 및 pT7-F-ePGK:GAD₄₄₈ _-585 라고 명명하였다. 또한 각각 pT7-N-ePGK:FTN-L, pT7-N-ePGK:AID, pT7-N-ePGK:mp-INS, pT7-N-ePGK:hG-CSF, pT7-N-ePGK:ADI, pT7-N-ePGK:CUT, pT7-N-ePGK:ppGRN 및 pT7-N-ePGK:GAD_448-585 라고 명명하였다.

2-3: 단백질 절단효소 인식부위를 포함하는 융합 발현벡터

융합파트너와 목적단백질 사이에 단백질 절단효소 인식부위를 포함하는 융합발현벡터를 하기와 같은 과정을 통해 제조하였다.

먼저, N-ePGK 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 상기 실시예 1에서 증폭된 것을 사용하였다. 이어, 엔테로키나제 인식부위를 N-말단에 갖는 hG-CSF 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편은 센스 프라이머(서열번호 44: ctc gag gac gat gac gat aaa acc ccc ctg ggc cct gcc) 및 안티센스 프라이머(서열번호 38: aag ctt tca tgg ctg tgc aag), ADI 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편은 센스 프라이머(서열번호 23: ctc gag gat gac gat gac aag tct gta ttt ga) 및 안티센스 프라이머(서열번호 24: aag ctt cta tca ctt aac atc)를50 pmol씩 포함한 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH₄)₂SO₄; 20 mM Tris-HCl(pH8.8); 2 mM MgSO₄; 0.1% Triton X-100)에 주형 DNA 100 ng을 넣은 다음 Taq DNA 중합효소를 이용하여 94℃/30초(변성), 52℃/30초(어닐링), 72℃/30초(신장)로 총 30회 PCR을 수행하였다.

실시예 1에서 제작한 pT7-N-ePGK의 XhoI과 HindIII 자리에 이어서 증폭된 hG-CSF, ADI의 PCR 산물을 제한효소 XhoI과 HindIII으로 처리하여 삽입하였고 이를 pT7-N-ePGK:EK:hG-CSF, pT7-N-ePGK:EK:ADI이라고 명명하였다.

실시예 3: 재조합 단백질의 수용성 발현

실시예 2의 방법으로 제조한 외래단백질의 단독 발현벡터, 융합파트너와의 융합 발현벡터 및 단백질 절단효소 인식부위를 포함하는 융합 발현벡터를 대장균에 형질전환하여 배양한 뒤, IPTG로 재조합 단백질의 발현을 유도함으로써 본 발명의 융합파트너에 의한 수용성 발현의 효과를 확인하였다.

3-1: 대장균 형질전환 및 재조합 단백질의 발현

하나한(Hanahan)이 기술한 방법(Hanahan D, DNA Cloning vol.1 109-135, IRS press 1985)에 의해 실시예 2의 벡터들을 대장균에 형질전환 하였다.

구체적으로 CaCl₂로 처리한 대장균 BL21(DE3)에 실시예 2의 벡터들을 열충격 방법으로 형질전환시킨 후, 앰피실린(ampicillin)이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 앰피실린 저항성을 나타내는 콜로니를 선별하였다. 융합파트너와의 융합 발현벡터 pT7-F-ePGK 및 pT7-N-ePGK으로 형질전환된 대장균을 BL21(DE3):pT7-F-ePGK 및 BL21(DE3):pT7-N-ePGK으로 명명하였다. 상기 콜로니를 하룻밤 동안 LB 배지에서 배양한 종균 배양액의 일부를 100㎎/㎖ 앰피실린을 포함하는 LB 배지에 접종한 다음 37℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 배양액의 OD₆₀₀이 0.5~0.6에 이르렀을 때 IPTG를 첨가(1 mM)하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 동일한 조건으로 5~6시간 더 배양하였다.

3-2: SDS - PAGE 를 이용한 가용성으로 생산된 재조합 단백질 확인

실시예 3-1의 방법으로 배양한 대장균을 4,500 rpm으로 10분간 원심분리하여 균체 침전물을 회수한 후 7ml의 파쇄 용액(10 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 10 mM EDTA)에 현탁하여 초음파 파쇄기(Branson sonifier, USA)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄한 후 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액의 단백질 농도는 바이오-라드 단백질 분석 키트(Bio-Rad protein assay kit, USA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 상등액과 불용성 응집체를 각각 5xSDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)과 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 12% SDS-PAGE겔의 웰에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 쿠마시 염색 방법으로 염색한 후 탈색하여 각각의 재조합 단백질의 발현량을 농도계(Densitometer, Bio-Rad, USA)로 확인하고, 수학식 1에 따라 용해도(%)를 계산하였다.

수학식1

그 결과, F-ePGK 및 N-ePGK과 융합한 외래단백질의 발현이 대부분 불용성 응집체보다 수용성 발현에서 더 많은 것을 확인하였다(도 3, 4 참조). 또한, 단독 발현한 외래단백질의 수용성 발현량보다 F-ePGK 및 N-ePGK과 융합한 외래단백질에서 용해도가 매우 증가하는 것을 확인하였다(도 3, 4 참조). 특히 F-ePGK와 융합발현하였을 경우 GAD₄₄₈ _-585,MP-INS, AID는 여전히 낮은 수용성도를 보이는 반면 N-ePGK와 융합발현하였을 경우에는 이 외래단백질들을 포함하여 현저히 증가된 수용성도 뿐만 아니라 발현율 또한 더욱 증가되는 것을 확인할 수 있다(도 5 참조).

3-3: 재조합 단백질로부터 N- ePGK 의 제거

실시예 2-3의 방법으로 제조한 단백질 절단효소 인식부위를 포함하는 융합 발현벡터를 실시예 3-1의 하나한(Hanahan)이 기술한 방법(Hanahan D, DNA Cloning vol.1 109-135, IRS press 1985)에 의해 대장균 BL21(DE3)에 형질전환한 후, 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. 상기 형질전환된 BL21(DE3)을 실시예 3-2의 방법으로 파쇄한 뒤, 원심분리함으로써 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다.

상기 상등액으로부터 친화성 크로마토그래피법에 의해 재조합 단백질 (His₆)N-ePGK::(엔테로키나제)hG-CSF, (His₆)N-ePGK::(엔테로키나제)ADI를 정제하였다. 구체적으로 500㎖의 Ni-NTA 아가로즈 비드(Qiagen, USA)에 상등액을 첨가함으로써 재조합 단백질을 결합시키고, 엔테로키나제 용액(엔테로키나제 5㎕, 10x완충액 50㎕, PBS 445㎕ ; Invitrogen, USA) 500㎕를 첨가하여 20℃에서 12시간 동안 반응시킨 뒤, 용출된 분획을 수집하여 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리함으로써 수용성 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다.

분리된 상등액과 불용성 응집체를 각각 5×SDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)과 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 10% SDS-PAGE 겔의 웰에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 쿠마시 염색 방법으로 염색한 후 탈색하여 각각의 재조합 단백질의 발현량을 확인하였다.

그 결과, N-ePGK가 제거된 hG-CSF가 수용성 상태로 존재하는 것을 확인하였다(도 6 참조).

3-4: 원평광 이색성 분광( CD ) 분석을 통한 정제된 hG - CSF 와 천연의 hG - CSF 와의 단백질 2차구조 비교 분석

실시예 3-3에서 정제된 재조합 hG-CSF 용액에서 enterokinase를 제거하기 위해 EK-Away^TMresin (Invitrogen, Germany, Cat. No. R180-01)을 사용하였으며 enterokinase가 제거된 다음 microcon YM-10 (Millipore, Ireland)으로 농축(0.4167㎍/㎕)하여 샘플을 준비했다. 준비된 재조합 hG-CSF 샘플은 원평광 이색성 분광(CD) 분석을 위하여 한국기초과학지원연구원(오창)에 의뢰하였으며 사용된 기기는 JASCO J-710 spectropolarimeter 이다. 상기 방법으로 정제된 재조합 hG-CSF와 천연의 hG-CSF[Grasin Prefilled- Syringe (Filgrastim), Kirin, Japan)]의 단백질 2차 구조의 변형 여부를 확인/비교하여 측정할 수 있었으며 이를 통해 정제된 재조합 hG-CSF가 천연형 hG-CSF와 같은 단백질 2차 구조를 가짐을 확인하였다 (도 6 참조).

3-5: N- ePGK 와 융합 발현한 아르기닌 디이미나아제(ADI)의 효소 활성

이미 발표된 문헌[Noh EJ et al., Mol cells 13:137-143, 2002; Misawa S et al., Biotechnol 36:145-155, 1994]의 실험 방법을 사용하여 실시예 3-2 내지 3-3을 통해서 확보한 N-ePGK 융합발현된 아르기닌 디이미나아제(이하 N-ePGK:ADI) 그리고 N-ePGK가 제거된 아르기닌 디이미나아제(이하 N-ePGK-free ADI)의 효소활성을 측정하였다.

아르기닌 디이미나아제는 L-아르기닌을 가수분해하여 L-시트룰린과 암모니아를 생합성하는 효소이다 각종 효모 및 세균에는 아르기닌의 아미노기 대사에 연결하여 ATP를 생산하는 경로가 존재하는데, 이 효소는 그 경로의 최초단계에서 작용한다. 활성의 측정은 L-아르기닌으로부터 반응에서 생성되는 L-시트룰린을 아치볼드비색법(산성에서 디아세틸모노옥심을 작용시켜 산화제를 가하면 요소와 그 유도체가 황색에서 적색으로 변하는반응)으로 측정한다. 미카엘리스상수 K _m값 0.5×10^-4M (아르기닌), 10^-3M(카나바닌)이고, 최적 pH는 6.7~6.8이며 p-메르쿠리벤조산(PMB)에 의해 저해된다. OD₅₃₀nm 의 파장에서 흡광도를 측정하여 시간단위로 반응을 기록하였다. 그 결과 상기 수용성 재조합 단백질 N-ePGK:ADI 그리고 N-ePGK-free ADI의 효소활성이 확인되어 L-아르기닌이 L-시트룰린으로 효과적으로 가수분해됨을 확인하였다(도 8 참조).

3-6: 투과전자현미경( TEM ) 분석을 통한 hFTN -L의 단백질 나노입자 형성 확인

융합 발현된 hFTN-L은 Ni-NTA Agarose bead(QIAGEN) 500㎕을 사용하여 Ni⁺²금속 친화 크로마토그래피를 통해 정제하였다.

정제한 N-ePGK:hFTN-L을 Philips Tecnai 20 (200kv) 전자 현미경을 통해 확인한 결과 단백질 나노입자가 형성되었음을 확인하였다 (도 7 참조).

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

목적 단백질 유전자를 포함하는 발현벡터에 있어서, 서열번호 39로 표시되는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 서열번호 40으로 표시되는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자를 융합파트너(fusion partner)로서 포함하는 재조합 단백질 생산용 발현벡터.
제 1항에 있어서, 상기 목적 단백질 유전자와 상기 융합파트너로서의 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 생산용 발현벡터.
제 2항에 있어서, 상기 목적 단백질 유전자와 상기 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자 사이에 단백질 절단 효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 생산용 발현벡터.
제 2항에 있어서, 상기 목적 단백질 유전자와 상기 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자는 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하도록 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 생산용 발현벡터.
제 1항에 있어서, 상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 생산용 발현벡터.
삭제
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
제 7항의 재조합 미생물을 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도한 다음, 이를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법.
제 8항에 있어서, 상기 재조합 단백질로부터 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자를 제거하는 단계를 추가적으로 포함하는 재조합 단백질의 제조방법.
제 8항의 방법에 의해 제조되고, ePGK 또는 N-ePGK와 목적 단백질이 융합된 재조합 융합 단백질.
목적 단백질을 코딩하는 유전자와 서열번호 39로 표시되는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 서열번호 40으로 표시되는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자가 연결되어 있는 유전자 구조체(gene construct).
제 11항에 있어서, 상기 목적 단백질 유전자와 상기 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자 사이에 단백질 절단 효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 구조체(gene construct).
제 11항에 있어서, 상기 목적 단백질 유전자와 상기 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자는 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하도록 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 구조체(gene construct).
삭제
제 11항의 유전자 구조체(gene construct)가 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 있는 재조합 미생물.
제 15항의 재조합 미생물을 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도한 다음, 이를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 재조합 단백질로부터 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소 (phosphoglycerate kinase, ePGK) 유전자 또는 대장균의 포스포글리세르산 인산화효소의 N-도메인 (N-ePGK) 유전자를 제거하는 단계를 추가적으로 포함하는 재조합 단백질의 제조방법.