CN103282490A - 在酵母中产生肠激酶的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本说明书公开了编码肠激酶的多核苷酸分子、包含酵母表达载体和编码肠激酶的多核苷酸分子的酵母表达构建体、包含此酵母表达构建体的酵母细胞、使用此类酵母细胞产生肠激酶的方法以及使用通过此类方法产生的肠激酶裂解或制备重组多肽的方法。
Description
Ian Fotheringham和Peter J.Sheffield
本专利申请根据35U.S.C.§119(e)要求2010年11月23日提交的美国临时专利申请No.61/416,622的优先权，该临时专利申请以引用方式整体并入。
肠激酶(EK，也称为肠肽酶(EP)；EC3.4.21.9)是一种由十二指肠细胞产生的异二聚体糖蛋白。作为丝氨酸蛋白酶的胰凝乳蛋白酶家族(chymotrypsin-clan)的一部分，肠激酶在从胃经过的摄入食物进入之后由小肠腺(利贝昆氏隐窝)分泌，并存在于十二指肠和空肠黏膜中。涉及在膳食蛋白的消化中，EK催化从胰蛋白酶原裂解N端酸性肽片段，从而将这种酶原转化成其活性形式，即胰蛋白酶。胰蛋白酶的活化引起蛋白水解级联反应，从而导致许多胰酶原的活化，包括胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶原、羧肽酶原和某些脂肪酶原。
肠激酶已从若干哺乳动物源(包括例如人、牛、大鼠和小鼠)克隆。在结构上，EK是一种包含约82-140kDa重链和约35-62kDa轻链的丝氨酸蛋白酶，所述重链将肠激酶锚定在肠刷状缘膜中，所述轻链包含催化亚基。轻链通过单个二硫桥接合到重链。除了此单个结构域间二硫桥外，轻链包含另外八个半胱氨酸残基，这些残基已表明可形成特定的结构域内二硫键。肠激酶轻链包含催化活性，并足以裂解。EK及其催化活性片段对五肽序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO：1)具有高特异性，从而裂解位于赖氨酸残基(DDDDK↓)之后的易裂解键。
由于高度特异性，已将EK用作生物化学和生物技术应用中的合适试剂。例如，包含通过EK裂解位点与此序列连接的C端纯化标签(诸如多聚-His)的融合蛋白可通过EK裂解以移除纯化标签，以便在蛋白纯化后获得靶蛋白。可选地，可使必须在活化前裂解的蛋白酶的N端前序列突变，以使得能够通过肠激酶活化。
已利用产生只涵盖催化轻链结构域的28kDa蛋白的基因，在如大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌和如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的酵母中成功地产生了重组肠激酶(rEK)。然而，在以足以实现商业应用的得率表达此重组酶方面，仍存在困难。本说明书公开了可用于以经济有效的方式以及可用于商业应用的量产生重组肠激酶的改进的表达构建。
发明概述
本说明书的多个方面公开编码肠激酶的多核苷酸分子。所公开的编码肠激酶的多核苷酸分子包括但不限于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、其核苷酸变体、其截短的变体和/或其补体。本文所公开的多核苷酸还可包含酵母表达载体。其他方面公开包含酵母表达载体和编码肠激酶的多核苷酸分子的酵母表达构建体。
本说明书的其他方面公开包含酵母表达构建体的酵母细胞，该酵母表达构建体包含编码肠激酶的多核苷酸分子。所公开的酵母表达构建体可瞬时包含在酵母细胞中或可稳定地包含在酵母细胞中。酵母细胞包括但不限于得自巴斯德毕赤酵母菌株的细胞、得自甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)菌株的细胞、得自安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)菌株的细胞、得自粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)菌株的细胞、得自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株的细胞或得自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株的细胞。
本说明书的另有其他方面公开使用酵母表达构建体产生肠激酶的方法。所公开的方法包括在酵母细胞中表达本文所公开的酵母表达构建体的步骤。其他方面提供产生肠激酶的方法，包括将本文所公开的酵母表达构建体引入酵母细胞并在酵母中表达该表达构建体的步骤。
本说明书的还有其他方面公开使用肠激酶裂解包含肠激酶裂解位点的多肽的方法。所公开的方法包括将包含肠激酶裂解位点的多肽与肠激酶接触的步骤，其中将多肽与肠激酶接触导致肠激酶裂解位点的特异性裂解。所用的肠激酶可以是通过本文所公开的多核苷酸分子编码、使用本文所公开的酵母表达构建体产生和/或通过在本文所公开的酵母细胞中表达而产生的肠激酶。
本说明书的其他方面公开使用肠激酶制备包含肠激酶裂解位点的多肽的方法。所公开的方法包括将包含肠激酶裂解位点的多肽与肠激酶接触的步骤，其中将多肽与肠激酶接触导致肠激酶裂解位点的特异性裂解。所用的肠激酶可以是通过本文所公开的多核苷酸分子编码、使用本文所公开的酵母表达构建体产生和/或通过在本文所公开的酵母细胞中表达而产生的肠激酶。
附图简述
图1显示了由包含本文所公开的整合EK盒的六种不同的酵母细胞系产生的肠激酶的平均酶活性的图线。
发明详述
酵母表达系统作为异源多肽的生产系统具有若干优势。首先，酵母细胞可在发酵罐中生长到高生物质(＞300g/L细胞湿重)，从而提供致密培养物，以便产生大量的所需多肽。其次，不同于原核表达系统，酵母表达系统可正确地控制翻译后折叠和其他真核多肽特异性修饰，从而确保保留异源多肽的生物活性、功能和稳定性。再次，酵母表达系统多能而灵活，从而提供1)染色体外或基于基因组的表达；2)组成型或诱导型表达控制；以及3)将表达的异源多肽导向特定细胞或细胞外区室以有利于分离和纯化的能力。
本说明书公开可用于以经济有效的方式以及可用于商业应用的足够大的量产生重组肠激酶的改进的表达构建。这些结果可使用所公开的编码肠激酶的基因工程化的多核苷酸分子的任何一种实现。一旦克隆进酵母表达载体并引入酵母细胞后，这些工程化的分子即可产生比目前可能的明显更大量的肠激酶。
因此，本说明书的多个方面部分地提供多核苷酸分子。本文所公开的多核苷酸分子可以是从生物体基因组分离的单链或双链DNA、重组产生的cDNA或化学合成的DNA分子。此外，“分离的”多核苷酸分子在从基因组来源中分离而得或通过重组技术产生时通常基本上不含其他细胞物质，或者通过化学方法合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。
本说明书的多个方面部分地提供编码肠激酶的多核苷酸分子。如本文所用，术语“肠激酶”与“EK”同义，并指可选择性识别五肽序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO：1)并在位于赖氨酸残基(DDDDK↓)之后的易裂解键处将该序列裂解的任何多肽。如本文所用，术语“选择性识别和裂解”在涉及肠激酶时是指肠激酶与包含SEQ ID NO：1的分子的辨识性相互作用和位于SEQ ID NO：1的赖氨酸残基之后的易裂解键的裂解，而基本上不与位于分子中的任何其他五肽序列相互作用和裂解这些五肽分子。因此，肠激酶是指包含通过单个二硫桥接合的约82-140kDa重链和约35-62kDa轻链的天然异二聚体糖蛋白以及任何催化活性轻链片段。制备编码肠激酶的多核苷酸分子的实例在实施例1、2和4-6中有所描述。
在一个实施方案中，编码肠激酶的多核苷酸分子可以是SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6或其补体。如本文所用，术语“补体”是指为编码肠激酶的有义分子的反义分子的多核苷酸分子。编码肠激酶的多核苷酸分子可包含编码其他类型的多肽分子的多核苷酸区域，诸如纯化标签、细胞分泌信号和/或亚细胞定位信号。一种示例性的此类多核苷酸分子为SEQ ID NO：6。编码肠激酶的多核苷酸分子还可以包含指导或有利于例如转录、翻译和/或翻译后加工等方面的控制或调节多核苷酸区域。
在另一个实施方案中，编码肠激酶的多核苷酸分子可以为SEQID NO：4、SEQ ID NO：6或其补体的核苷酸变体，前体条件是SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：6或其补体中的核苷酸变化不改变由多核苷酸变体编码的肠激酶的氨基酸序列。因此，本文所公开的SEQ ID NO：4多核苷酸变体编码SEQ ID NO：5的肠激酶，并且本文所公开的SEQID NO：6多核苷酸变体编码SEQ ID NO：7的肠激酶。
在该实施方案的多个方面，编码肠激酶的多核苷酸变体分子可以例如与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其补体的多核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
在该实施方案的其他方面，编码肠激酶的多核苷酸变体分子相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其补体可具有例如约1至约10、约1至约15、约1至约20、约1至约25、约1至约30、约5至约25、约5至约30、约5至约35、约5至约40、约5至约45、约10至约40、约10至约45、约10至约50、约10至约55或约10至约60个非连续核苷酸替换。在该实施方案的另有其他方面，编码肠激酶的多核苷酸变体分子相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其补体可具有例如约1至约10、约1至约15、约1至约20、约1至约25、约1至约30、约5至约25、约5至约30、约5至约35、约5至约40、约5至约45、约10至约40、约10至约45、约10至约50、约10至约55或约10至约60个连续核苷酸替换。
多种序列比对方法的任何一种均可用于确定本文所公开的多核苷酸或多肽的百分比同一性，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如片段接近方法。确定百分比同一性的方案是落在本领域技术人员知识范围内以及来自本文的教导的常规程序。
全局方法对分子从头至尾进行序列比对，并通过对各个残基对的评分求和以及通过利用空位罚分确定最佳比对。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，参见例如Julie D.Thompson等人，CLUSTAL W：Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence AlignmentThrough Sequence Weighting，Position-Specific Gap Penalties andWeight Matrix Choice，22(22)Nucleic Acids Research4673-4680(1994)；以及迭代优化，参见例如Osamu Gotoh，SignificantImprovement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments byIterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments，264(4)J.Mol.Biol.823-838(1996)。
局部方法通过识别所有输入序列共有的一个或多个保守基序而对序列进行比对。非限制性方法包括例如Match-box，参见例如EricDepiereux and Ernest Feytmans，Match-Box：A Fundamentally NewAlgorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences，8(5)CABIOS501-509(1992)；吉布斯采样，参见例如C.E.Lawrence等人，Detecting Subtle Sequence Signals：A Gibbs Sampling Strategy forMultiple Alignment，262(5131)Science208-214(1993)；Align-M，参见例如Ivo Van Walle等人，Align-M-A New Algorithm for MultipleAlignment of Highly Divergent Sequences，20(9)Bioinformatics，：1428-1435(2004)。
混合方法将全局和局部比对方法两者的功能方面相结合。非限制性方法包括例如段对段比较，参见例如Burkhard Morgenstern等人，Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based OnSegment-To-Segment Comparison，93(22)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.12098-12103(1996)；T-Coffee，参见例如Cédric Notredame等人，T-Coffee：A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment，302(1)J.Mol.Biol.205-217(2000)；MUSCLE，参见例如RobertC.Edgar，MUSCLE：Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy andHigh Throughput，32(5)Nucleic Acids Res.1792-1797(2004)；以及DIALIGN-T，参见例如Amarendran R Subramanian等人，DIALIGN-T：An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment，6(1)BMC Bioinformatics66(2005)。
在该实施方案的另外方面，编码肠激酶的多核苷酸变体分子可以是在严格条件下杂交到包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其补体的多核苷酸分子的多核苷酸变体。此类严格杂交条件是本领域技术人员已知的并可见于例如Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，该参考文献以引用方式整体并入。严格(例如高严格)杂交条件的非限制性实例为在约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50-65℃下在0.2x SSC，0.1％SDS中进行一次或多次洗涤。
在该实施方案的还有其他方面中，编码肠激酶的多核苷酸变体分子可以是表1中所公开的多核苷酸变体。该表包括肠激酶轻链的氨基酸序列、包含编码此轻链片段的SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的多核苷酸区域的开放阅读框的密码子以及可替换SEQ ID NO：4和SEQID NO：6的密码子的密码子变体。在该实施方案的多个方面，编码肠激酶的多核苷酸变体分子具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个替换SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中存在的相应密码子的表1中的变体密码子。在该实施方案的其他方面，编码肠激酶的多核苷酸变体分子具有例如至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个替换SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中存在的相应密码子的表1中的变体密码子。在该实施方案的另有其他方面，编码肠激酶的多核苷酸变体分子具有例如至多1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19或至多20个替换SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中存在的相应密码子的表1中的变体密码子。
在该实施方案的另外方面，编码肠激酶的多核苷酸分子可以是表2中所公开的多核苷酸变体。该表包括肠激酶轻链的氨基酸序列、包含编码此轻链片段的SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的多核苷酸区域的开放阅读框的密码子以及可替换SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的密码子的的密码子变体。在该实施方案的多个方面，编码肠激酶的多核苷酸变体分子具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个替换SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中存在的相应密码子的表2中的变体密码子。在该实施方案的其他方面，编码肠激酶的多核苷酸变体分子具有例如至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个替换SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中存在的相应密码子的表2中的变体密码子。在该实施方案的其他方面，编码肠激酶的多核苷酸变体分子具有例如至多1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19或至多20个替换SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中存在的相应密码子的表2中的变体密码子。
在另一个实施方案中，编码肠激酶的多核苷酸分子可以是SEQID NO：4、SEQ ID NO：6或其核苷酸变体的截短片段。如本文所用，术语“SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其任何核苷酸变体的截短片段”是指从体现为SEQ ID NO：4的710核苷酸序列或其核苷酸变体或从体现为SEQ ID NO：6的953核苷酸序列或其核苷酸变体移除核苷酸。可从SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其任何核苷酸变体的5’-末端、3’-末端或5’-末端和3’-末端两者移除核苷酸。
在该实施方案的多个方面，将1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸从SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其任何核苷酸变体或其补体的5’-末端、3’-末端或5’-末端和3’-末端两者移除。在该实施方案的其他方面，将至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50个核苷酸从SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其任何核苷酸变体或其补体的5’-末端、3’-末端或5’-末端和3’-末端两者移除。在该实施方案的另有其他方面，将至多1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多25、至多30、至多35、至多40、至多45或至多50个核苷酸从SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其任何核苷酸变体或其补体的5’-末端、3’-末端或5’-末端和3’-末端两者移除。
在该实施方案的其他方面，将1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个密码子从SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其任何核苷酸变体或其补体的5’-末端、3’-末端或5’-末端和3’-末端两者移除。在该实施方案的其他方面，将至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个密码子从SEQ ID NO：4、SEQID NO：6或其任何核苷酸变体或其补体的5’-末端、3’-末端或5’-末端和3’-末端两者移除。在该实施方案的另有其他方面，将至多1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19或至多20个密码子从SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6或其任何核苷酸变体或其补体的5’-末端、3’-末端或5’-末端和3’-末端两者移除。
本说明书的多个方面部分地公开包含酵母表达载体的多核苷酸分子。可将多种酵母表达载体用于表达编码EK的多核苷酸分子，包括但不限于巴斯德毕赤酵母表达载体、甲醇毕赤酵母表达载体、安格斯毕赤酵母表达载体、粟酒裂殖酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和解脂耶氏酵母表达载体。酵母表达载体的非限制性实例包括pGal-MF表达载体(DualsystemsBiotech，AG，Schlieren，CH)、pMET表达载体(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、PICHIAPINK表达载体(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、pPICZ表达载体(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、pPpT4α表达载体(Ingenza，Ltd.，Midlothian，UK)、pTEF-MF表达载体(DualsystemsBiotech，AG，Schlieren，CH)、pYES表达载体(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)。
酵母表达载体通常包含指导或有利于例如复制、整合、转录、翻译和/或翻译后加工等方面的控制或调节多核苷酸区域。例如，酵母表达载体可包含用于指导EK表达的组成型启动子和增强子元件和/或诱导型启动子和增强子元件。组成型表达载体的非限制性实例是采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子指导EK产生的表达载体。诱导型表达载体的非限制性实例是使用醛氧化酶1(AOX1)启动子并将甲醇作为诱导剂的表达载体。在任一情况下，可实现高水平的表达，每升得到的产物含高达若干克。例如，在甲醇诱导的酵母细胞中，AOX1可占总可溶性蛋白的30％。不含AOX1基因的菌株(也称为MutS菌株)仍可通过甲醇诱导，因为它们表达醇氧化酶2基因(AOX2)，但是将甲醇用作唯一的碳源时它们的生长比野生型菌株慢。然而，不使用主要针对AOX1蛋白产生的能量和资源，在MutS菌株中，AOX1启动子的作用力可主要涉及重组蛋白的产生。此外，可以采用较低含量的甲醇。
酵母表达载体可包含编码其他类型的多肽分子的多核苷酸区域，诸如纯化标签、细胞分泌信号和/或亚细胞定位信号。此类多核苷酸区域通常以融合多肽的形式可操作地连接到EK。纯化标签的非限制性实例包括组氨酸标签、myc标签、V5标签。信号序列的非限制性实例包括将EK导向细胞质、细胞器(诸如过氧化物酶体)或导向细胞外培养基的那些信号序列。例如，包含α因子肽信号使得EK能够分泌到培养基中。
本说明书的多个方面部分地公开包含酵母表达构建体的多核苷酸分子。酵母表达构建体包含如本文所公开的编码EK的多核苷酸分子，其可操作地连接到如本文所公开的酵母表达载体。酵母表达构建体的实例在实施例2和4-6中有所描述。
本说明书的多个方面部分地公开向酵母细胞中引入本文所公开的多核苷酸分子。引入细胞的多核苷酸分子可由该细胞瞬时或稳定保持。稳定保持的多核苷酸分子可以是染色体外的并且自主复制，或者它们可整合到细胞的染色体物质中并且非自主地复制。
据设想，用于将本文所公开的多核苷酸分子引入细胞的任何和所有方法均可使用。可用于将核酸分子引入细胞的方法包括但不限于化学介导的转染，诸如磷酸钙介导的、二乙氨乙基(DEAE)葡聚糖介导的、脂质介导的、聚乙烯亚胺(PEI)介导的、聚赖氨酸介导的和凝聚胺介导的；物理介导的转染，诸如基因枪递送、显微注射、原生质体融合和电穿孔；以及病毒介导的转染，诸如逆转录病毒介导的转染。本领域的技术人员将理解，对将表达构建体引入细胞的具体方法的选择将部分地取决于细胞将瞬时包含表达构建体还是细胞将稳定地包含表达构建体。这些方案是落在本领域技术人员知识范围内以及来自本文的教导的常规程序，参见例如Introducing Cloned Genes intoCultured Mammalian Cells，pp.16.1-16.62(Sambrook&Russell，编，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Vol.3，第3版.2001)。将本文所公开的酵母表达构建体引入酵母细胞的实例在实施例2和4-6中有所描述。
本说明书的多个方面部分地公开包含酵母表达构建体的酵母细胞，该酵母表达构建体含有如本文所公开的编码EK的多核苷酸分子。在该实施方案的一个方面，酵母细胞瞬时包含含有如本文所公开的编码EK的多核苷酸分子的酵母表达构建体。在该实施方案的另一个方面，酵母细胞稳定地包含含有如本文所公开的编码EK的多核苷酸分子的表达构建体。在该实施方案的多个方面，酵母细胞是来源于巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母、粟酒裂殖酵母、酿酒酵母或解脂耶氏酵母的酵母细胞株。在该实施方案的其他方面，酵母表达构建体是巴斯德毕赤酵母表达载体、甲醇毕赤酵母表达载体、安格斯毕赤酵母表达载体、粟酒裂殖酵母表达载体、酿酒酵母表达载体或解脂耶氏酵母表达载体。在该实施方案的还有其他方面，编码EK的多核苷酸分子是SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其任何核苷酸变体或其补体。
本说明书的多个方面部分地公开使用酵母表达系统由本文所公开的多核苷酸分子表达EK。使用酵母表达系统表达多核苷酸分子可包括多种特征中的任何一种，这些特征包括但不限于诱导型表达、非诱导型表达、组成型表达、病毒介导的表达、稳定整合的表达和瞬时表达。这些方案是落在本领域技术人员知识范围内以及来自本文的教导的常规程序。酵母表达系统的非限制性实例包括EASYSELECTTM毕赤酵母属表达试剂盒(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、EASYSELECTTM ECHOTM毕赤酵母属表达试剂盒(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、甲醇毕赤酵母表达系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、PICHIAPINKTM分泌蛋白试剂盒(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、YES-ECHOTM表达载体试剂盒(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)和SPECTRATM粟酒裂殖酵母表达系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)。使用酵母表达系统由本文所公开的多核苷酸分子表达EK的实例在实施例2-6中有所描述。
在一个实施方案，由包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6的多核苷酸分子或其任何多核苷酸变体的酵母表达构建体表达的EK的量与由SEQ ID NO：2表达的EK的量相比有所增加。
在该实施方案的多个方面，由包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6的多核苷酸分子或其任何多核苷酸变体的酵母表达构建体表达的EK的量与由SEQ ID NO：2表达的EK的量相比增加例如至少0.5倍、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍或至少40倍。在该实施方案的其他方面，由包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6的多核苷酸分子或其任何多核苷酸变体的酵母表达构建体表达的EK的量与由SEQ ID NO：2表达的EK的量相比增加例如约1倍至约5倍、约1倍至约10倍、约1倍至约15倍、约1倍至约20倍、约1倍至约25倍。
在该实施方案的其他方面，由包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6的多核苷酸分子或其任何多核苷酸变体的酵母表达构建体表达的EK的量为约100mg/L至约30g/L。在该实施方案的其他方面，由SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6的多核苷酸分子或其任何多核苷酸变体表达的EK的量可以为例如至少100mg/L、至少500mg/L、至少1g/L、至少1.5g/L、至少2.5g/L、至少5g/L、至少7.5g/L、至少10g/L、至少12.5g/L、至少15g/L、至少20g/L、至少25g/L或至少30g/L。在该实施方案的另有其他方面，由包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6的多核苷酸分子或其任何多核苷酸变体的酵母表达构建体表达的EK的量可以为例如约100mg/L至约5g/L、约100mg/L至约10g/L、约100mg/L至约15g/L、约500mg/L至约5g/L、约500mg/L至约10g/L、约500mg/L至约15g/L、约1g/L至约5g/L、约1g/L至约10g/L、约1g/L至约15g/L、约1g/L至约20g/L、约5g/L至约10g/L、约5g/L至约15g/L、约5g/L至约20g/L、约5g/L至约25g/L、约5g/L至约30g/L。
可使用多种方法中的任何一种从酵母细胞或培养基中纯化由本文所公开的酵母表达构建体表达的EK。纯化方法的实例包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、离子交换层析、磷酸纤维素层析、凝集素层析、亲和层析、疏水相互作用层析、尺寸排阻层析、凝胶过滤层析、吸附层析、羟基磷灰石层析、快速高效液相色谱(FPLC)和高效液相色谱(HPLC)。所关注的靶肽的结合部分可连接到多种物质中的任何一种，所述物质包括但不限于树脂、琼脂糖和磁珠。此外，可以使用多种处理技术中的任何一种，所述处理技术包括但不限于分批处理和重力流柱。蛋白质重折叠步骤也可能是必需的，以确保回收由本说明书中所公开的核酸分子编码的功能活性BoNT/A。用于纯化和回收蛋白质的具体方案的非限制性实例在例如John Abelson等人，GUIDE TO PROTEIN PURIFICATION，(Academic Press，1990)，PROTEINPURIFICATION：PRINCIPLES AND PRACTICE，(Robert K.Scopes等人编，Springer Verlag，第3版.1994)，PROTEIN PURIFICATION TECHNIQUES：APRACTICAL APPROACH，(Simon Roe编，Oxford University Press，第2版.2001)，MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，同上，(2001)，IanM.Rosenberg，PROTEIN ANALYSIS&PURIFICATION：BENCHTOPTECHNIQUES，(Springer Verlag，2002)中有所描述。这些方案是落在本领域技术人员知识范围内以及来自本文的教导的常规程序。
可使用多种方法中的任何一种在EK表达期间、完成EK表达之后和/或EK纯化之后对EK的量进行测量。蛋白质测量方法的实例包括但不限于凝胶电泳和蛋白质染色、Western印迹、ELISA、蛋白质标记、紫外吸收、Lowry测定法、双缩脲测定法、Smith铜/二喹啉甲酸(BCA)测定法和Bradford染料测定法，参见例如Christine V.Sapan等人，Colorimetric Protein Assay Techniques，29(2)BIOTECHNOL.APPL.BIOCHEM.99-108，(1999)。
本说明书的多个方面部分地公开使用EK裂解包含EK裂解位点的多肽的方法。在一个实施方案中，用于裂解包含EK裂解位点的多肽的方法包括将包含EK裂解位点的多肽与EK接触的步骤，该EK通过在酵母细胞中表达包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和其任何多核苷酸变体或其任何截短的变体的酵母表达构建体而产生，其中将重组多肽与肠激酶接触导致EK裂解位点的特异性裂解。在该实施方案的一个方面，EK裂解位点为SEQ ID NO：1。多肽可以是天然具有EK裂解位点的多肽或者可以是经基因工程改造以包含EK裂解位点的重组多肽。
本说明书的多个方面部分地公开使用EK制备包含EK裂解位点的多肽的方法。在一个实施方案中，用于制备包含EK裂解位点的多肽的方法包括将包含EK裂解位点的多肽与EK接触的步骤，该EK通过在酵母细胞中表达包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、其任何多核苷酸变体或其任何截短的变体的酵母表达构建体而产生，其中将重组多肽与肠激酶接触导致EK裂解位点的特异性裂解。在该实施方案的一个方面，EK裂解位点为SEQ ID NO：1。多肽可以是天然具有EK裂解位点的多肽或者可以是经基因工程改造以包含EK裂解位点的重组多肽。
使用EK裂解或制备包含EK裂解位点的多肽的方法可使用标准活体外蛋白水解裂解测定法进行。例如，可将包含EK裂解位点的多肽添加到包含20mM Tris-HCl(pH7.4)、50mM NaCl、20mM CaCl2和如本文所述产生的EK的反应混合物中，并在约20℃至约22℃孵育约2小时至约16小时。由此所产生的裂解的或制备的多肽的程度可使用标准程序进行评估，诸如SDS-PAGE分析、基于免疫的测定法(诸如Western印迹分析或ELISA)或多肽活性测定法。裂解的或制备的多肽也可使标准程序进行纯化。可用于裂解或制备包含EK裂解位点的多肽的测定法在例如Ogiwara，等人，Modified EnteropeptidaseProtein，US8,013,137；La Vallie，Cloning of Enterokinase and Method ofUse，US6,746,859中有所描述，这些参考文献均以引用方式整体并入。
本说明书的多个方面也可如下描述：
1.一种分离的多核苷酸分子，其包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、其多核苷酸变体或其截短的变体及其任何补体。
2.实施方案1的分离的多核苷酸分子，其中多核苷酸变体与SEQID NO：4、SEQ ID NO：6或其补体的多核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
3.实施方案1的分离的多核苷酸分子，其中多核苷酸变体相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其补体具有约1至约10、约1至约15、约1至约20、约1至约25、约1至约30、约5至约25、约5至约30、约5至约35、约5至约40、约5至约45、约10至约40、约10至约45、约10至约50、约10至约55或约10至约60个非连续核苷酸替换。
4.实施方案1的分离的多核苷酸分子，其中多核苷酸变体相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其补体具有约1至约10、约1至约15、约1至约20、约1至约25、约1至约30、约5至约25、约5至约30、约5至约35、约5至约40、约5至约45、约10至约40、约10至约45、约10至约50、约10至约55或约10至约60个连续核苷酸替换。
5.实施方案1的分离的多核苷酸分子，其中多核苷酸变体在严格条件下杂交到包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其补体的多核苷酸分子。
6.实施方案1的分离的多核苷酸分子，其中多核苷酸变体具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个替换SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中存在的相应密码子的表1中的变体密码子。
7.实施方案1的分离的多核苷酸分子，其中多核苷酸变体具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个替换SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中存在的相应密码子的表2中的变体密码子。
8.实施方案1的分离的多核苷酸分子，其中截短的变体具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50个从SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其任何核苷酸变体或其任何补体的5’-末端、3’-末端或5’-末端和3’-末端两者移除的核苷酸。
9.实施方案1的分离的多核苷酸分子，其中截短的变体具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个从SEQ ID NO：4、SEQID NO：6或其任何核苷酸变体或其补体的5’-末端、3’-末端或5’-末端和3’-末端两者移除的密码子。
10.实施方案1-9的分离的多核苷酸分子，其中分离的多核苷酸分子为酵母表达载体。
11.实施方案10的分离的多核苷酸分子，其中酵母表达载体为巴斯德毕赤酵母表达载体、甲醇毕赤酵母表达载体、安格斯毕赤酵母表达载体、粟酒裂殖酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和解脂耶氏酵母表达载体。
12.实施方案10或11的分离的多核苷酸分子，其中酵母表达载体包含指导实施方案1-9的多核苷酸分子表达的组成型启动子、组成型增强子、诱导型启动子、诱导型增强子或它们的任何组合。
13.实施方案12的分离的多核苷酸分子，其中诱导型启动子为醛氧化酶1(AOX1)启动子。
14.实施方案10-14的分离的多核苷酸分子，其中酵母表达载体包含编码信号序列的多核苷酸区域，该信号序列将由实施方案1-9的多核苷酸分子编码的EK导向特定的细胞或细胞外区室。
15.实施方案10-14的分离的多核苷酸分子，其中酵母表达载体包含编码信号序列的多核苷酸区域，该信号序列将由实施方案1-9的多核苷酸分子编码的EK导向细胞质、细胞器或导向细胞外培养基。
16.实施方案14或15的分离的多核苷酸分子，其中信号序列为α因子肽。
17.实施方案1-9的分离的多核苷酸分子，其中分离的多核苷酸分子为酵母表达构建体。
18.一种酵母表达构建体，其包含酵母表达载体和包含SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、其多核苷酸变体或其截短的变体及其任何补体的多核苷酸分子。
19.实施方案18的酵母表达构建体，其中多核苷酸变体与SEQID NO：4、SEQ ID NO：6或其补体的多核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
20.实施方案18的酵母表达构建体，其中多核苷酸变体相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其补体具有约1至约10、约1至约15、约1至约20、约1至约25、约1至约30、约5至约25、约5至约30、约5至约35、约5至约40、约5至约45、约10至约40、约10至约45、约10至约50、约10至约55或约10至约60个非连续核苷酸替换。
21.实施方案18的酵母表达构建体，其中多核苷酸变体相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其补体具有约1至约10、约1至约15、约1至约20、约1至约25、约1至约30、约5至约25、约5至约30、约5至约35、约5至约40、约5至约45、约10至约40、约10至约45、约10至约50、约10至约55或约10至约60个连续核苷酸替换。
22.实施方案18的酵母表达构建体，其中多核苷酸变体在严格条件下杂交到包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其补体的多核苷酸分子。
23.实施方案18的酵母表达构建体，其中多核苷酸变体具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个替换SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中存在的相应密码子的表1中的变体密码子。
24.实施方案18的酵母表达构建体，其中多核苷酸变体具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个替换SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中存在的相应密码子的表2中的变体密码子。
25.实施方案18的酵母表达构建体，其中截短的变体具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50个从SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其任何核苷酸变体或其任何补体的5’-末端、3’-末端或5’-末端和3’-末端两者移除的核苷酸。
26.实施方案18的酵母表达构建体，其中截短的变体具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个从SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其任何核苷酸变体或其补体的5’-末端、3’-末端或5’-末端和3’-末端两者移除的密码子。
27.实施方案18-26的酵母表达构建体，其中酵母表达载体为巴斯德毕赤酵母表达载体、甲醇毕赤酵母表达载体、安格斯毕赤酵母表达载体、粟酒裂殖酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和解脂耶氏酵母表达载体。
28.实施方案27的酵母表达构建体，其中酵母表达载体包含指导实施方案1-9的多核苷酸分子表达的组成型启动子、组成型增强子、诱导型启动子、诱导型增强子或它们的任何组合。
29.实施方案28的酵母表达构建体，其中诱导型启动子为醛氧化酶1(AOX1)启动子。
30.实施方案27-29的酵母表达构建体，其中酵母表达载体包含编码信号序列的多核苷酸区域，该信号序列将由实施方案1-9的多核苷酸分子编码的EK导向特定的细胞或细胞外区室。
31.实施方案27-29的酵母表达构建体，其中酵母表达载体包含编码信号序列的多核苷酸区域，该信号序列将由实施方案1-9的多核苷酸分子编码的EK导向细胞质、细胞器或导向细胞外培养基。
32.实施方案30或31的酵母表达构建体，其中信号序列为α因子肽。
33.一种酵母细胞，其包含实施方案1-17的多核苷酸。
34.实施方案33的酵母细胞，其中表达构建体瞬时包含在酵母细胞中。
35.实施方案33的酵母细胞，其中表达构建体稳定地包含在酵母细胞中。
37.实施方案33-35的酵母细胞，其中酵母细胞包括得自巴斯德毕赤酵母菌株的细胞、得自甲醇毕赤酵母菌株的细胞、得自安格斯毕赤酵母菌株的细胞、得自粟酒裂殖酵母菌株的细胞、得自酿酒酵母菌株的细胞或得自解脂耶氏酵母菌株的细胞。
38.实施方案33-35的酵母细胞，其中酵母细胞为得自巴斯德毕赤酵母菌株的细胞。
39.一种酵母细胞，其包含实施方案18-32的酵母表达构建体。
40.实施方案39的酵母细胞，其中表达构建体瞬时包含在酵母细胞中。
41.实施方案39的酵母细胞，其中表达构建体稳定地包含在酵母细胞中。
42.实施方案39-41的酵母细胞，其中酵母细胞包括得自巴斯德毕赤酵母菌株的细胞、得自甲醇毕赤酵母菌株的细胞、得自安格斯毕赤酵母菌株的细胞、得自粟酒裂殖酵母菌株的细胞、得自酿酒酵母菌株的细胞或得自解脂耶氏酵母菌株的细胞。
43.实施方案39-41的酵母细胞，其中酵母细胞为得自巴斯德毕赤酵母菌株的细胞。
44.一种产生肠激酶的方法，该方法包括使用实施方案33-43的酵母细胞表达肠激酶的步骤。
45.实施方案44的方法，其中该方法还包括纯化肠激酶。
46.一种裂解重组多肽的方法，该方法包括将包含SEQ ID NO：1的裂解位点的重组多肽与肠激酶接触的步骤，其中肠激酶通过实施方案44或45的方法产生，其中将重组多肽与肠激酶接触导致SEQ IDNO：1的特异性裂解。
47.一种制备重组多肽的方法，该方法包括将包含SEQ ID NO：1的裂解位点的重组多肽与肠激酶接触的步骤，其中肠激酶通过实施方案44或45的方法产生，其中将重组多肽与肠激酶接触导致SEQ IDNO：1的特异性裂解。
实施例
仅出于示意性的目的提供以下非限制性实施例，以便有利于更全面地理解现在设想的代表性实施方案。这些实施例不应解释为限制本说明书中所述的任何实施方案，包括属于使用如本文所公开的酵母表达系统表达EK的方法的那些实施方案。
实施例1
编码EK的多核苷酸分子的合成
使用标准化学程序(BlueHeron Biotechnology，Bothell，WA)合成多核苷酸分子SEQ ID NO：4。例如，使用标准亚磷酰胺合成法合成长度为20至50个碱基的寡核苷酸。将这些寡核苷酸杂交成连接在一起的双链体，以组装全长多核苷酸分子。使用标准分子生物学方法将该多核苷酸分子在SmaI位点克隆进pUCBHB1载体以生成pUCBHB1/EK。通过使用Big Dye TerminatorTM Chemistry3.1(AppliedBiosystems，Foster City，CA)和ABI3100测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行测序对合成的多核苷酸分子加以确认。使用类似的合成策略制备多核苷酸分子SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：4或SEQID NO：6的核苷酸变体以及SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的截短变体。
根据需要，合成基于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的表达优化的多核苷酸分子以便改善酵母细胞中的表达。对编码EK的多核苷酸分子进行修饰以1)包含通常存在于所选酵母菌株的天然多核苷酸分子中的同义密码子；2)包含与存在于所选酵母菌株中的天然多核苷酸分子的平均G+C含量更密切匹配的G+C含量；3)减少存在于多核苷酸分子内的多聚单核苷酸区域；和/或4)消除存在于多核苷酸分子内的内部调节或结构位点，参见例如Lance E.Steward等人，Optimizing Expression of A ctive Botulinum Toxin Type E，国际专利公布WO2006/011966(2006年2月6日)；Lance E.Steward等人，OptimizingExpression of Active Botulinum Toxin Type A，国际专利公布WO2006/017749(2006年2月16日)，它们均以引用方式整体并入。完成序列优化后，使用标准亚磷酰胺合成法合成长度为20至50个碱基的寡核苷酸。将这些寡核苷酸杂交成连接在一起的双链体，以组装全长多核苷酸分子。使用标准分子生物学方法将该多核苷酸分子在SmaI位点克隆进pUCBHB1载体以生成pUCBHB1/EK。通过使用Big DyeTerminatorTM Chemistry3.1(Applied Biosystems，Foster City，CA)和ABI3100测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行测序对合成的多核苷酸分子加以确认。使用类似的合成策略制备多核苷酸分子，所述多核苷酸分子为SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的核苷酸变体、或者SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的截短变体。
实施例2
pPpT4α/EK的构建和表达
为了构建包含如本文所公开的编码EK的多核苷酸分子的酵母表达构建体，将包含SEQ ID NO：4的pJ201/rEK构建体用XhoI和NotI消化以切除SEQ ID NO：4插入片段。将所得的限制性片段通过
凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Inc.，Valencia，CA)纯化，并将SEQ ID NO：4片段亚克隆进已用限制性内切酶XhoI和NotI消化的pPpT4α_S载体(Ingenza，Ltd.，Midlothian，UK)。pPpT4α_S载体包含α因子分泌信号序列、AOX1启动子的一部分、AOD和AOX1转录终止序列以及ZEOCINTM的开放阅读框。将片段和载体用T4DNA连接酶方案连接以产生pPpT4α/rEK，并将该连接混合物的等分试样通过标准电穿孔方案转化成电感受态NEB10细胞(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。将转化的细胞铺到包含25μg/mL ZEOCINTM的1.5％Luria-Bertani Lennox琼脂板(pH7.0)上，并置于37℃培养箱中过夜生长。作为ZEOCINTM耐性集落选择候选表达构建体。随后让耐性集落生长、收获并使用标准程序分离质粒DNA，通过使用XhoI和NotI、XbaI或NdeI的限制性消化筛选候选表达构建体，以确定正确插入片段的存在性和取向。让包含所需pPpT4α/rEK表达构建体的培养物生长、收获，并使用标准程序分离质粒DNA，对候选表达构建体测序以确认制备了正确的表达构建体。该克隆策略得到了包含SEQ ID NO：4的酵母表达构建体。将相似的策略用于制备包含SEQ ID NO：6、SEQID NO：4或SEQ ID NO：6的核苷酸变体、或SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6的截短变体的pPpT4α/EK表达构建体。可选地，如实施例1中所述合成SEQ ID NO：4的多核苷酸分子、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的核苷酸变体或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的截短变体。
为了构建表达由SEQ ID NO：4编码的肠激酶的酵母细胞系，使用SEQ ID NO：8的AOX正向引物以及SEQ ID NO：9的PUC反向引物，将pPpT4α/rEK表达构建体的DNA通过聚合酶链反应(PCR)扩增，以产生线性整合盒。AOX正向引物的前五个碱基对包含与pPpT4α/EK DNA序列不同的BglII位点。AOX正向引物结合在为AOX1启动子一部分的区域之后。虽然线性整合盒上不存在全长AOX1基因，但是在与巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)基因组整合后对整个全长AOX1基因重组。使用电穿孔方法将所得的线性化表达构建体转化到合适的巴斯德毕赤酵母MutS菌株CBS7435中。将转化混合物铺到含有100μg/mL、250μg/mL或500μg/mL ZEOCINTM的1.5％酵母蛋白胨葡萄糖山梨醇(YPDS)琼脂板(pH7.5)上，并置于28-30℃的培养箱中1-3天。通过对ZEOCINTM的集落耐性确定对在5’AOX1基因座整合了pPpT4α/EK片段的转化体的选择。从含有不同浓度ZEOCINTM的各种YPDS板中选择了六十二个重组集落，并接种到含有100μg/mL ZEOCINTM的酵母蛋白胨葡萄糖(YPD)肉汤中。分离的酵母细胞系如预期在含有ZEOCINTM的YPD肉汤中生长，从而表明菌株为Zeocin耐性的并包含整合的pPpT4α/EK盒。将含有分离的酵母细胞系的YPD培养物的等分试样置于具有1mL含有10％(v/v)甘油的YPD肉汤的小瓶中，以形成确立的酵母细胞系，并将小瓶保存在-80℃下。将相似的策略用于制备表达SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的核苷酸变体、或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的截短变体的肠激酶的酵母细胞系。
为了进一步确认整合的pPpT4α/E盒的存在性以及确定各分离的酵母细胞系中的相对EK基因拷贝数，对62个分离的细胞系执行了PCR分析。从上述YPD培养物中移除一毫升，进行裂解，并使用标准程序分离基因组DNA。使用SEQ ID NO：10的EK正向引物和SEQID NO：11的EK反向引物将分离的基因组DNA进行29轮PCR扩增，以由EK基因产生250-bp的产物。完成扩增后，在0.1Kb至10Kb大小的2-log DNA Ladder旁边，将反应混合物在含有多核苷酸染料的0.8％琼脂糖凝胶上分离。这些实验确认了对于所测试的61个细胞系，生成了预期的250-bp EK片段。使用相同的基因组DNA制备物但只以18个循环重复PCR扩增，以便估计菌株之间的相对拷贝数。虽然观察到了相对低水平的变化，但是四个细胞系表现出相对于其他细胞系更高的基因拷贝数。
实施例3
肠激酶活性的测定
为了测试所表达的肠激酶的存在性、质量和数量，将包含整合的pPpT4α/EK盒的细胞系用液体比色肠激酶(EK)测定法、SDS-PAGE、Western印迹和ELISA进行分析。为了诱导肠激酶从整合的pPpT4α/EK盒的表达，将各确立酵母细胞系的等分试样用于接种100mL带挡板的摇瓶，其中容纳有10mL含1.34％(w/v)酵母氮源(YNB)、200mM磷酸盐缓冲液、4×10-5％(w/v)生物素和1％(v/v)甘油的限定生长培养基。让接种物在约28-30℃下在摇床(250rpm)中生长约60-65小时。通过离心(3,000x g，22℃，5分钟)收获细胞。为了诱导肠激酶表达，将细胞沉淀重悬在1mL含有1.34％(w/v)酵母氮源(YNB)、200mM磷酸盐缓冲液、4×10-5％(w/v)生物素和5％(v/v)甲醇的初步诱导培养基中。将细胞在约28-30℃下在摇床(250rpm)中培养约8-10小时。向培养物添加100μL甲醇，培养约16-18小时，再每24小时将另外100μL甲醇加到培养基中，最后一次添加为诱导后约72-74小时。为了比较得自摇瓶样品的数据，将基准菌株B18(产生His-标记的肠激酶的巴斯德毕赤酵母CBS7435MutS pPpT4α/EK-HIS表达构建体)在整合的菌株旁在摇瓶中一式两份地培养。
为了确定所表达的肠激酶的酶活性，在培养诱导过程中采集样品，使用液体比色肠激酶活性测定法测定肠激酶活性。在培养后0小时、24小时、48小时、72小时和96小时，从上述酵母培养物中采集培养基的测试等分试样。将测试等分试样加到管中，以14,000rpm离心两次，以确保除去细胞。然后将制备的培养基样品的等分试样在存在5，5’二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的情况下加到含有1mM比色肽底物N-苄氧羰基-Lys-硫代苯甲酯(Z-Lys-SBZL；Bachem，AG，Bubendorf，CH)的反应混合物中。裂解反应引起颜色从无色变为黄色，在405nm的吸光度下以动力学模式在酶标仪上测量初始速率。调节酶浓度，以确保样品稀释度在测定法的线性范围内(0-100mOD/分钟)。在阴性和阳性对照旁，一式三份地测定样品。
在获得所有菌株的肠激酶活性测定结果后，使用四个具有最高肠激酶活性的确立酵母细胞系(称为YCL-48、YCL-49、YCL-98和YCL-99)和两个具有最低肠激酶活性的细胞系(称为YCL-40和YCL-88)重复液体比色肠激酶活性测定。使用单批底物，一式三份地对所有样品进行测定。图X显示了针对诱导后时间的各酵母细胞系的平均肠激酶活性。误差条表示一式三份摇瓶值之间的95％置信区间。从数据中可以看出，YCL-49具有最高的肠激酶活性，YCL-88具有最低的活性。
为了确定所表达的肠激酶的身份和质量，在YCL-40、YCL-48、YCL-49、YCL-88、YCL-98和YCL-99诱导后96-98小时时间点采集样品，使用SDS-PAGE和Western印迹分析法进行分析。将样品添加到2x SDS样品缓冲液中，使用10-20％Bis-Tris预制聚丙烯酰胺凝胶(Expedeon，Inc，San Diego，CA)在变性、还原条件下通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。对于SDS-PAGE分析，将凝胶用考马斯亮蓝染色，以显示蛋白带型。对于Western印迹分析，将分离的多肽转移到硝酸纤维素，并用多克隆α-肠激酶抗体染色。肠激酶多肽在SDS-PAGE和Western印迹上清楚地显现为大约38kDa处的单一条带。电泳迁移表明肠激酶发生了翻译后修饰。此外，不存在任何可检测的伪条带表明了具有整合的pPpT4α/EK盒的酵母细胞系表达的肠激酶的高质量。
为了测定所表达的肠激酶的浓度，采集了YCL-49、YCL-88和YCL-98诱导后96-98小时时间点的样品，并使用夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行了分析。由测试样品制备了序列稀释样，并在限定浓度的市售重组肠激酶标准品(EMD Biosciences-Novagen，Madison，WI)旁一式三份地进行了测定。由商业标准品稀释序列绘制的标准曲线使得能够对YCL-49和YCL-88样品定量。将ELISA结果用于计算在摇瓶生长和整合菌株表达后获得的完整肉汤样品的上清中存在的EK物质的水平(表3)。
上述分析表明，若干确立的酵母细胞系由整合pPpT4α/EK盒表达了高质量、具有酶活性的肠激酶。
实施例4
pPICZ A/EK-myc-His的构建和表达
为了构建包含如本文所公开的编码EK的多核苷酸分子的酵母表达构建体，将适用于将可操作地连接的核酸分子克隆进pPIC A载体(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)的限制性内切酶位点使用标准DNA合成程序掺入SEQ ID NO：4的5’-和3’-末端。将该构建体用具有以下功能的限制酶消化：1)切除编码肠激酶的SEQ ID NO：4，和2)使得该插入片段能够可操作地连接到pPIC A载体。将该插入片段用T4DNA连接酶程序亚克隆进用合适的限制性内切酶消化的pPIC A载体，以得到pPICA/BoNT/E-myc-His。使用热休克方法将连接混合物转化进化学感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)中，铺到含有25μg/mL ZEOCINTM的1.5％低盐Luria-Bertani琼脂板(pH7.5)上，然后置于37℃的培养箱中过夜生长。包含表达构建体的细菌被鉴定为ZEOCINTM耐性集落。使用碱裂解法质粒小量制备程序分离候选构建体，并通过限制性内切酶消化作图进行分析，以确定插入片段的存在性和取向。该克隆策略得到编码可操作地连接到羧基末端c-myc和多聚组氨酸结合肽的肠激酶的酵母表达构建体。将相似的策略用于制备包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的核苷酸变体、或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的截短变体的pPICA/EK表达构建体。
为了构建表达肠激酶的酵母细胞系，将pPICZ A/EK-myc-His用合适的限制性内切酶(即，SacI、PmeI或BstXI)消化，并使用电穿孔方法将所得的线性化表达构建体转化进合适的巴斯德毕赤酵母MutS菌株KM71H中。将转化混合物铺到含有100μg/mL ZEOCINTM的1.5％YPDS琼脂板(pH7.5)上，并置于28-30℃的培养箱中生长1-3天。通过对ZEOCINTM的集落耐性确定对在5’AOX1基因座整合了pPICZA/EK-myc-His的转化体的选择。然后测试整合了pPICZA/EK-myc-His构建体的细胞系的肠激酶表达。将从已整合了pPICZA/EK-myc-His的测试细胞系中分离的集落用于接种装有100mLMGYH培养基的1.0L带挡板培养瓶，在约28-30℃下在摇床(250rpm)中生长，直到培养物达到OD600＝2-6(约16-18小时)。通过离心(3,000xg，22℃，5分钟)收获细胞。为了诱导表达，将细胞沉淀重悬在15mLMMH培养基中，添加100％甲醇至0.5％的最终浓度。让培养物在约28-30℃下在摇床(250rpm)中生长六天。每24小时向培养物中添加另外的100％甲醇至0.5％的最终浓度。从0时间点开始到144小时时间点结束，每24小时从培养物中采集1.0mL测试等分试样。通过微量离心使细胞沉淀而从等分试样中收获细胞，并使用由-80℃5分钟然后37℃5分钟构成的三轮冻融循环进行裂解。将裂解样品加到2xSDS样品缓冲液(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)中，通过SDS-PAGE和Western印迹分析(如实施例3中所述)测量确立细胞系的表达。选择表现出最高肠激酶表达水平的巴斯德毕赤酵母MutS KM71H细胞系，用于使用商业发酵程序进行大规模表达。大规模表达的程序如上所述，不同的是，培养体积为在5L BioFlo3000发酵罐中生长的约2.5LMGYH培养基，并且所有试剂的浓度将针对此体积成比例地增加。有关此实施例中所述的所有程序的更多详细信息，参见EasySelectTM毕赤酵母属表达试剂盒，第G版，A Manual of Methods for Expressionof Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZαin Pichia pastoris，122701，25-0172(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)。将相似的策略用于制备表达SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的核苷酸变体、或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的截短变体的肠激酶的酵母细胞系。
实施例5
pMET/EK-V5-His的构建和表达
为了构建包含如本文所公开的编码EK的多核苷酸分子的酵母表达构建体，将适用于将可操作地连接的核酸分子克隆进pMET载体(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)的限制性内切酶位点使用标准DNA合成程序掺入SEQ ID NO：4的5’-和3’-末端。将该构建体用具有以下功能的限制酶消化：1)切除编码肠激酶的SEQ ID NO：4，和2)使得该插入片段能够可操作地连接到pMET载体。将该插入片段用T4DNA连接酶程序亚克隆进用合适的限制性内切酶消化的pMET载体，以得到pMET/BoNT/E-V5-His(图9)。使用热休克方法将连接混合物转化进化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)中，铺到含有100μg/mL氨苄青霉素的1.5％低盐Luria-Bertani琼脂板(pH7.5)上，然后置于37℃的培养箱中过夜生长。包含表达构建体的细菌被鉴定为氨苄青霉素耐性集落。使用碱裂解法质粒小量制备程序分离候选构建体，并通过限制性内切酶消化作图进行分析，以确定插入片段的存在性和取向。该克隆策略得到编码可操作地连接到羧基末端V5和多聚组氨酸结合肽的肠激酶的酵母表达构建体。将相似的策略用于制备包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的核苷酸变体、或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的截短变体的pMET/EK表达构建体。
为了构建表达肠激酶的酵母细胞系，将pMET/BoNT/E-V5-His用合适的限制性内切酶(即，ApaI、AscI、FseI、PacI、KpnI或PstI)消化，并使用电穿孔方法将所得的线性化表达构建体转化进合适的甲醇毕赤酵母(P.methanolica)MutS菌株PMAD16中。将转化混合物铺到不含腺嘌呤的1.5％MD琼脂板(pH7.5)上，在28-30℃的培养箱中生长3-4天。通过在腺嘌呤缺陷培养基上的集落生长确定对整合了pMET/EK-V5-His的转化体的选择。使用小规模表达测试，对整合了pMET/EK-V5-His构建体的Ade+细胞系测试肠激酶表达。将从已整合了pMET/EK-V5-His的测试细胞系中分离的Ade+集落用于接种15mLBMDY培养基，使细胞在约28-30℃下在摇床(250rpm)中生长，直到培养物达到OD600＝2-10(约16-18小时)。通过离心(1,500x g，22℃，5分钟)收获细胞。为了诱导表达，将细胞沉淀重悬在5mL BMMY培养基中，让培养物在约28-30℃下在摇床(250rpm)中生长。24小时后，移除500μL等分试样，添加甲醇到0.5％的最终浓度，并让培养物在约28-30℃下在摇床(250rpm)中生长。移除500μL等分试样，每24小时向培养物中添加另外的甲醇至0.5％的最终浓度，持续3-5天。将收获的细胞离心(1,500x g，4℃，5分钟)，在水中洗涤一次，将细胞沉淀保存在-80℃下直至使用。为了检测诱导的肠激酶的表达，将各时间点的细胞沉淀用酸洗玻璃珠方法裂解。将裂解样品加到2xSDS样品缓冲液(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)中，通过SDS-PAGE和Western印迹分析(如实施例3中所述)测量确立细胞系的表达。选择表现出最高肠激酶表达水平的甲醇毕赤酵母MutS PMAD16细胞系，用于使用商业发酵程序进行大规模表达。大规模表达的程序如上所述，不同的是，培养体积为在5L BioFlo3000发酵罐中生长的约2.5LBMDY/BMMY培养基，所有试剂的浓度将针对此体积成比例地增加。有关此实施例中所述的所有程序的更多详细信息，参见甲醇毕赤酵母表达试剂盒，第C版，A Manual of Methods for Expression ofRecombinant Proteins in Pichia methanolica，062101，25-0288(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)。将相似的策略用于制备表达SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的核苷酸变体、或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的截短变体的肠激酶的酵母细胞系。
实施例6
pYES2/EK-V5-His的构建和表达
为了构建包含如本文所公开的编码EK的多核苷酸分子的酵母表达构建体，将适用于将可操作地连接的核酸分子克隆进pYES2载体(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)的限制性内切酶位点使用标准DNA合成程序掺入SEQ ID NO：4的5’和3’-末端。将该构建体用具有以下功能的限制酶消化：1)切除编码肠激酶的SEQ ID NO：4，和2)使得该插入片段能够可操作地连接到pYES2载体。将该插入片段用T4DNA连接酶程序亚克隆进用合适的限制性内切酶消化的pYES2载体，以得到pYES2/EK-V5-His(图10)。使用热休克方法将连接混合物转化进化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)中，铺到含有100μg/mL氨苄青霉素的1.5％低盐Luria-Bertani琼脂板(pH7.5)上，然后置于37℃的培养箱中过夜生长。包含表达构建体的细菌被鉴定为氨苄青霉素耐性集落。使用碱裂解法质粒小量制备程序分离候选构建体，并通过限制性内切酶消化作图进行分析，以确定插入片段的存在性和取向。该克隆策略得到编码可操作地连接到羧基末端V5和多聚组氨酸结合肽的肠激酶的酵母表达构建体。将相似的策略用于制备包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的核苷酸变体、或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的截短变体的pYES2/EK表达构建体。
为了构建表达肠激酶的酵母细胞系，使用基于锂的转化方法，将pYES2/EK-V5-His转化进感受态酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株INVSc1中。将转化混合物铺在含有2％葡萄糖、具有0.01％尿嘧啶或不具有尿嘧啶的2％SC基本培养基琼脂板(pH7.5)上，置于28-30℃的培养箱中生长1-3天。通过只在含有尿嘧啶的板上的集落生长确定对含有pYES2/EK-V5-His的转化体的选择。使用小规模表达测试，测试了包含pYES2/EK-V5-His构建体的细胞的肠激酶表达。将从包含pYES2/EK-V5-His的测试细胞分离的集落用于接种装有15mL SC培养基(含2％葡萄糖和0.01％尿嘧啶)的50mL管，在约28-30℃下在摇床(250rpm)中生长过夜。测定过夜培养物的OD600，并进行等分，以得到50mL体积中0.4的OD600的细胞浓度。将这些等分试样离心(1,500x g，22℃，5分钟)，将所得到的细胞沉淀重悬在含有20％半乳糖和10％棉籽糖的SC培养基中。让细胞在约28-30℃下在摇床(250rpm)中生长，在0小时、4小时、8小时、12小时、16小时和24小时采集5mL等分试样，测定各样品的OD600浓度。将收获的细胞离心(1,500x g，4℃，5分钟)，在水中洗涤一次，将细胞沉淀保存在-80℃下直至使用。为了检测诱导的BoNT/E-V5-His的表达，将各时间点的细胞沉淀用酸洗玻璃珠方法裂解。将裂解样品加到2x SDS样品缓冲液(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)中，通过SDS-PAGE和Western印迹分析(如实施例3中所述)测量确立细胞系的表达。选择导致最高肠激酶表达水平的诱导条件，用于使用商业发酵程序进行大规模表达。大规模表达的程序如上所述，不同的是，培养体积为在5L BioFlo3000发酵罐中生长的约2.5L SC培养基，所有试剂的浓度将针对此体积成比例地增加。有关此实施例中所述的所有程序的更多详细信息，参见具有C端标签和营养缺陷型筛选标记的pYES2/CT、pYES3/CT和pYC2/CT酵母表达载体，第E版，25-0304，2003年1月27日(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)。将相似的策略用于制备表达SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的核苷酸变体、或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的截短变体的肠激酶的酵母细胞系。
在结束前，应当理解，虽然参照具体实施方案重点说明了本说明书的多个方面，但是本领域的技术人员将容易地认识到，这些所公开的是实施方案只是示例性地示出本文所公开的主题的原理。因此，应当理解，所公开的主题决不限于本文所述的特定方法、方案和/或试剂等。这样，可在不脱离本说明书精神的情况下根据本文的教导对所公开的主题进行各种修改或更改或得出可选的构造。最后，本文所用的术语只是为了阐述特定实施方案，不旨在限制只由权利要求书限定的本发明的范围。因此，本发明不限于准确示出和描述的那些方面。
在本文中描述了本发明的某些实施方案，包括实施本发明时发明人已知的最佳模式。当然，在阅读前述说明后，这些所述实施方案的变型形式将对本领域的普通技术人员变得显而易见。发明人预计技术人员可以视情况采用此类变型形式，并且发明人打算将本发明以本文具体描述之外的方式加以实践。因此，根据适用法律的许可，本发明包括所附权利要求书中列出的主题的所有修改形式和等同形式。此外，除非在本文中另外指明或上下文明显冲突，否则上述实施方案以其所有可能的变型形式的任何组合均被本发明所涵盖。
本发明的可选的实施方案、要素或步骤的分组不应解释为限制性的。每个小组成员可单独地或与本文所公开的其他小组成员任意组合地被提及和要求保护。据预计，出于便利和/或专利性的原因，小组的一个或多个成员可包括在一个小组内或从该小组内删除。当出现任何此类包括或删除时，将说明书视为包括如此修改的小组，从而满足所附权利要求书中所用的所有马库什组(Markush group)的书面说明。
除非另外指明，否则将表达本说明书和权利要求中所用的特征、项目、数量、参数、特性、术语等的所有数字理解为在所有情况下均由术语“约”来修饰。如本文所用，术语“约”意指如此限制的特征、项目、数量、参数、特性或术语涵盖在所述特征、项目、数量、参数、特性或术语的值以上和以下加减百分之十的范围。因此，除非相反指明，否则说明书和所附权利要求书中所示的数字参数均为可以变化的近似值。在最低程度上，并且不试图将等同原则的应用限制到权利要求书的范围，每个数字指示应至少按照所报告的有效数位并通过应用惯常的四含五入法加以解读。尽管示出了本发明广泛范围的数字范围和值为近似值，但是在具体实例中所示的数字范围和值被尽可能精确地报告。然而，任何数字范围和值都固有地包含因存在于其相应测试测量中的标准偏差而必然导致的某些误差。本文对值的数字范围的列举仅仅是为了用作单独提及落在该范围内的每个单独数值的快捷方法。除非本文另外指明，否则数字范围的每个单独的值均包括在本说明书中，就像在本文中单独列举一样。
除非本文另外指明或上下文明显冲突，否则用在描述本发明的上下文中(尤其是以下权利要求书的上下文中)的术语“一个”、“一种”、“该/所述”和相似指示物应被解释为涵盖单数和复数形式。除非本文另外指明或上下文明显冲突，否则本文所述的所有方法可以按任何合适的顺序执行。使用本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)仅仅是为了更好地阐明本发明，而不是对要求保护的本发明的范围进行限制。本说明书中的语言不应解释为是表示实践本发明所必需的任何未要求保护的要素。
本文所公开的具体实施方案可使用“由...组成”或“基本上由...组成”语言在权利要求书中进一步限制。当用在权利要求书中时，无论是在提交时还是根据修正进行添加时，过渡术语“由...组成”均排除未在该权利要求中指定的任何要素、步骤或成分。过渡术语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制到指定的材料或步骤以及不实质性影响基本特征和新特征的那些材料或步骤。如此要求保护的本发明的实施方案在本文固有地或明确地加以描述和应用。
在本所明书中参考和确定的所有专利、专利出版物和其他出版物单独地且明确地以引用方式整体并入本文，以用于描述和公开(例如)可结合本发明使用的在此类出版物中所述的组合物和方法。提供这些出版物仅是为了揭示在本申请的提交日之前的背景技术。就这一点而言，这些背景技术不应解释为承认在先发明揭示了本发明。至于日期的所有陈述或至于这些文献内容的表示方式基于申请人可以获得的信息，并不构成对日期或这些文献内容正确性的任何承认。
Claims (15)
1.一种分离的多核苷酸分子，其包含SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6。
2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸分子，其中所述核酸分子还包含酵母表达构建体。
3.一种酵母表达构建体，其包含可操作地连接到包含SEQ IDNO：4的多核苷酸的酵母表达载体。
4.根据权利要求3所述的酵母表达构建体，其中所述酵母表达构建体还包含编码可操作地连接到包含SEQ ID NO：4的多核苷酸的α因子的多核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的酵母表达构建体，其中编码可操作地连接到包含SEQ ID NO：4的多核苷酸的α因子的所述多核苷酸序列为SEQ ID NO：6。
6.一种酵母细胞，其包含含有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的酵母表达构建体。
7.根据权利要求6所述的酵母细胞，其中所述表达构建体瞬时包含在所述酵母细胞中。
8.根据权利要求6所述的酵母细胞，其中所述表达构建体稳定地包含在所述酵母细胞中。
9.根据权利要求6所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞包括得自巴斯德毕赤酵母菌株的细胞、得自甲醇毕赤酵母菌株的细胞、得自安格斯毕赤酵母菌株的细胞、得自粟酒裂殖酵母菌株的细胞、得自酿酒酵母菌株的细胞或得自解脂耶氏酵母菌株的细胞。
10.根据权利要求6所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞为得自巴斯德毕赤酵母菌株的细胞。
11.一种产生肠激酶的方法，所述方法包括在酵母细胞中表达含有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的酵母表达构建体的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酵母细胞包括得自巴斯德毕赤酵母菌株的细胞、得自甲醇毕赤酵母菌株的细胞、得自安格斯毕赤酵母菌株的细胞、得自粟酒裂殖酵母菌株的细胞、得自酿酒酵母菌株的细胞或得自解脂耶氏酵母菌株的细胞。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述酵母细胞为得自巴斯德毕赤酵母菌株的细胞。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法还包括纯化由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6编码的肠激酶。
15.一种裂解重组多肽的方法，所述方法包括将包含SEQ ID NO：1的裂解位点的多肽与肠激酶接触的步骤，所述肠激酶通过在酵母细胞中表达包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的酵母表达构建体而产生，其中将所述多肽与所述肠激酶接触导致SEQ ID NO：1的特异性裂解。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160921 |
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