KR100335584B1

KR100335584B1 - 혈관내피세포성장인자에대한길항제

Info

Publication number: KR100335584B1
Application number: KR1019950701621A
Authority: KR
Inventors: 나폴레온 페라라; 경 진 김
Original assignee: 제넨테크, 인코포레이티드
Priority date: 1992-10-28
Filing date: 1992-10-28
Publication date: 2002-11-29
Anticipated expiration: 2012-10-28
Also published as: ATE399181T1; CA2145985C; DE69232539T3; NO321825B1; AU2928992A; ES2278663T3; ES2173873T5; DK0666868T4; HUT70810A; FI951987L; KR950704355A; DK1975181T3; AU687727B2; SK55195A3; EP1975181B1; EP0666868B1; SK285035B6; EP1167384A1; HU225646B1; EP1975181A1

Abstract

본 발명은 hVEGF의 유사 분열 촉진, 맥관 형성 또는 다른 생물학적 활성을 억제하는 모노클로날 항체, hVEGF 수용체, 및 hVEGF 변종을 비롯한 혈관 내피 세포 성장 인자 (hVEGF) 길항제를 제공한다. 따라서, 이 길항제는 불필요하거나 또는 과도한 내피 세포 증식 또는 혈관 신생에 의해 특징지워지는 질환 및 이상의 치료에 유용하다. 본 발명의 모노클로날 항체 및 수용체는 또한 시험 시료 중의 hVEGF의 존재를 측정하는 진단 및 분석 방법에 유용하다.

Description

혈관 내피 세포 성장 인자에 대한 길항제

발명의 분야

본 발명은 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF)에 대한 길항제 및 이 길항제를 함유하는 치료용 조성물 및 진단과 치료를 위한 길항제의 사용 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

혈관계를 구성하는 2 가지 주요 세포는 내피 세포와 평활근 세포이다. 내피 세포는 모든 혈관 내부의 표면층을 형성하며 혈액과 조직 사이에 있는 무응혈성 계면을 구성한다. 또한, 내피 세포는 새로운 모세혈관과 혈관 성장에 중요한 성분이므로 종양 증식과 전이에 관련된 맥관 형성 또는 혈관 신생시 그리고 다양한 비종양성 질병 또는 장애시에 증식한다.

내피 세포의 증식은 여러 천연 발생의 폴리펩티드에 의해 유도되는 것으로 보고되었다. 염기성 및 산성 섬유아세포 성장 인자(FGF)(Burgess and Maciag, Annual Rev. Biochem., 58:575(1989)), 혈소판 유래 내피 세포 성장 인자(PD-ECGF)(Ishikawa, et al., Nature, 338:557(1989)), 및 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF)(Leung, et al., Science, 246:1306 (1989); Ferrara & Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun. 161:851 (1989); Tischer, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165:1198 (1989); Ferrara, et al., PCT 특허출원 공개 공보 제WO 90/13649호(1990. 11. 15에 공개됨); Ferrara, et al., 미국 특허 출원 제07/360,229호)가 이 폴리펩티드에 속한다.

VEGF는 소의 뇌하수체 포상 세포 또는 성상 세포로 조정된 배지에서 처음 확인되었다. 생화학 분석에 의하여 소 VEGF가 겉보기 분자량이 약 45,000 달톤이고,혈관 내피 세포에 대한 외견상 유사 분열 촉진 특이성이 있는 이량체 단백질임을 알게 되었다. 소 VEGF를 코딩하는 DNA는 상기한 세포로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 이 단백질의 아미노 말단 아미노산 서열에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드를 혼성화 프로브로 사용하여 선별하여 분리되었다.

인간의 VEGF는 소의 VEGF cDNA를 혼성화 프로브로 사용하여 인체 세포로 부터 제조된 cDNA 라이브러리를 선별함으로써 처음으로 얻어졌다. 이렇게 확인된 하나의 cDNA는 소의 VEGF와 95 % 이상의 상동성을 가지며 인간의 VEGF(hVEGF)로 불리는 165-아미노산 단백질을 코딩한다. 인간 VEGF의 유사 분열 촉진 활성은 인간의 VEGF cDNA를 포유동물 숙주세포 내에 발현시킴으로써 확인되었다. 대조 세포와는 반대로 인간의 VEGF cDNA로 형질감염된 세포로 조정된 배지는 모세혈관 내피 세포의 증식을 촉진하였다(Leung, et al., Science 246:1306(1989)).

hVEGF의 121-, 189- 및 206-아미노산 이소 형태(총체적으로 hVEGF-관련 단백질로 불림)를 코딩하는 수 개의 cDNA가 인체의 cDNA 라이브러리 안에서 추가로 확인되었다. 121-아미노산 단백질은 hVEGF 중의 잔기 116과 159 사이의 44 아미노산이 결실된 것이 hVEGF와 다르다. 189-아미노산 단백질은 hVEGF 중의 잔기 116에 24 아미노산이 삽입된 것이 hVEGF와 다르며 인간의 혈관 투과성 인자(hVPF)와 동일함이 명백하다. 206-아미노산 단백질은 hVEGF 중의 잔기 116에 41 아미노산이 삽입된 것이 hVEGF와 다르다(Houck, et al., Mol. Endocrin. 5:1806(1991); Ferrara, et al., J. Cell. Biochem. 47:211(1991); Ferrara, et al., Endocrine Reviews 13:18(1992); Keck, et al., Science 246:1309 (1989); Connolly, et al., J. Biol. Chem. 264:20017 (1989); Keck, et al., 유럽 특허 공보 제0370989호 (1990년 5월 30일에 공고됨)).

VEGF는 혈관 내피 세포의 증식을 촉진시킬 뿐 아니라 혈관 투과성과 맥관 형성을 유도한다. 기존 내피 세포로부터 새로운 혈관의 형성을 수반하는 맥관 형성은 종양 증식과 전이, 류머티스성 관절염, 건선, 아테롬성 동맥경화증, 당뇨병성 망막증, 후수정체 섬유증식증, 혈관 신생 녹내장, 혈관종, 이식된 각막 조직 및 기타 조직의 면역 거부 반응, 및 만성 염증을 비롯한 다양한 질환 및 질병의 주요 증상이다. 종양 증식 경우에는, 맥관 형성이 과형성을 신형성으로 전이시키고 성장하는 충실성 종양에 영양분을 제공하는데 결정적인 역할을 한다(Folkman, et al., Nature 339:58(1989)). 또한 맥관 형성은 종양이 숙주세포의 혈관상 (vascular bed)과 접촉하도록 허용하여 종양 세포 전이의 경로를 제공할 수 있다. 예를 들면, 종양이 전이하는데 있어서 맥관 형성의 역할에 대한 증거는 침입성 인체 유방암종으로부터 얻은 조직 절편 안에 있는 미소혈관의 수 및 밀도와 실제로 존재하는 원거리 전이 사이의 상호 관계를 제시한 연구에 의해 제공된다(Weidner, et al., New Engl. J. Med. 324:1 (1991)).

혈관 내피 세포 증식과 맥관 형성의 역할 및 여러 질환 및 질병에 있어서 이과정의 역할을 고려하면, 적어도 하나 이상의 VEGF의 생물학적 효과를 감소하거나 억제하는 수단을 갖는 것이 바람직하며, 정상적인 조건이나 병변 조건, 특히 암에서 VEGF의 존재를 평가 분석하는 수단을 갖는 것도 또한 바람직하다.

발명의 개요

본 발명은 (a) hVEGF, hVEGF 수용체, 또는 hVEGF 수용체와 hVEGF이 결합된 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 및 그의 변이체, (b) hVEGF 수용체 및 그의 변이체, 및 (c) hVEGF 변이체를 포함하는 VEGF의 길항제를 제공한다. 길항제는 hVEGF의 유사 분열 촉진, 맥관 형성, 또는 다른 생체 활성을 억제하여 표본 종양, 특히 충실성 악성 종양, 류머티스성 관절염, 건선, 아테롬성 동맥경화증, 당뇨병성 및 다른 망막증, 후수정체 섬유증식증, 혈관 신생 녹내장, 혈관종, 갑상선 과형성증(그레이브 질환을 포함), 각막 및 기타 조직 이식, 및 만성 염증을 비롯하여 불필요한 혈관 신생이 과도한 특징이 있는 질병 또는 장애를 치료하는 데 유용하다. 또한 이 길항제는 뇌암과 관련된 부종, 악성 종양과 연관된 복수증, 메이그스 증후군, 폐렴, 신증 증후군, 심낭 삼출(심낭염과 연관된 것) 및 흉막 삼출을 비롯하여 비이상적으로 혈관 투과성이 과다한 특징이 있는 질병 또는 장애를 치료하는 데 유용하다.

다른 관점에서 보면 VEGF 길항제는 (a) 비-hVEGF 에피토프, 예를 들면 혈전 형성이나 혈전 붕괴에 관여하는 단백질이나 종양 세포 표면 항원의 에피토프, 및 (b) hVEGF, hVEGF 수용체, 또는 hVEGF 수용체와 hVEGF이 결합된 복합체에 결합할 수 있는 다중 특이성 모노클로날 항체이다.

또 다른 관점에서 보면, VEGF 길항제는 세포 독성 잔기와 접합되어 있다.

다른 하나의 관점에서 보면, 본 발명은 상기한 바와 같이 모노클로날 항체를 코딩하는 분리된 핵산, 및 그러한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다.

다른 하나의 관점에서 보면, 본 발명은 hVEGF에 의해 매개되는 포유동물의 유사 분열 촉진이나 맥관 형성 활성을 감소시키거나 제거하는 데 효과적인 양의 VEGF 길항제를 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다.

다른 관점에서 보면, 본 발명은 포유동물, 특히 치료가 필요한 환자에게 생리학상 유효량의 VEGF 길항제를 투여하는 것으로 이루어진 치료 방법에 관한 것이다. 필요시에, VEGF 길항제는 하나 이상의 다른 VEGF 길항제 또는 항암 물질 또는 맥관 형성 억제 물질과 함께 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다.

다른 관점에서 보면, 본 발명은 검사 시료를 hVEGF에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시켜 그러한 결합도를 측정함으로써 검사 시료에서 hVEGF를 검출하는 방법에 관한 것이다.

제1도는 항-hVEGF 모노클로날 항체가 hVEGF에 결합하는 것에 대한 항-hVEGF 모노클로날 항체(A4.6.1 또는 B2.6.2) 또는 무관한 간세포 성장 억제 인자항체(항-HGF)의 영향을 나타낸다.

제2도는 소의 부신피질 모세혈관 내피(ACE) 세포의 배양액 중에서의 hVEGF의 생체 활성에 대한 항-hVEGF 모노클로날 항체(A4.6.1 또는 B2.6.2) 또는 무관한 항-HGF 항체의 영향을 나타낸다.

제3도는 hVEGF가 소의 ACE 세포들에 결합하는 것에 대한 항-hVEGF 모노클로날 항체(A4.6.1, B2.6.2, 또는 A2.6.1)의 영향을 나타낸다.

제4도는 마우스의 NEG55 종양 성장 속도에 대한 A4.6.1 항-hVEGF 모노클로날 항체로의 처리 효과를 나타낸다.

제5도는 처리한 지 5주 후에 마우스의 NEG55 종양 크기에 대한 A4.6.1 항-hVEGF 모노클로날 항체로의 처리 효과를 나타낸다.

제6도는 마우스의 SK-LMS-1 종양 성장에 대한 A4.6.1 항-hVEGF 모노클로날 항체(VEGF Ab)로의 처리 효과를 나타낸다.

제7도는 마우스의 A673 종양 성장에 대한 다양한 투여량의 A4.6.1 항-hVEGF 모노클로날 항체(VEGF Ab)로의 처리 효과를 나타낸다.

제8도는 배양액에서의 NEG55(G55) 신경교아종 세포의 성장과 생존에 대한 A4.6.1 항-hVEGF 모노클로날 항체의 영향을 나타낸다.

제9도는 배양액에서의 A673 황문근육종 세포의 성장과 생존에 A4.6.1 항-hVEGF 모노클로날 항체의 영향을 나타낸다.

제10도는 인간의 활막액으로 유도된 인간의 내피 세포 화학 주성에 대한 A4.6.1 항-hVEGF 모노클로날 영향을 효과를 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 "hVEGF"란 용어는 문헌[Leung, et al., Science 246:1306 (1989) 및 Houck, et al., Mol. Endocrin, 5:1806 (1991)]에 기재된 바와같이 인간의 165-아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자 및 이의 친족인 121-, 189- 및 206-아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자는 물론 자연적으로 발생하는 이들 성장 인자들의 대립 형질 형태와 프로세싱된 형태를 의미한다.

본 발명은 hVEGF의 하나 이상의 생체 활성, 예를 들면 이의 유사 분열 촉진 또는 맥관 형성 활성을 억제할 수 있는 hVEGF의 길항제를 제공한다. hVEGF 길항제는 hVEGF가 세포 수용체에 결합하는 것을 방해하거나, hVEGF에 의해서 활성화된 세포들을 불활성화 또는 사멸시키거나, 또는 hVEGF가 세포 수용체에 결합한 후에 혈관 내피 세포의 활성화를 방해함으로써 작용한다. hVEGF 길항제의 그러한 개입 지점은 모두 본 발명의 목적상 동일하게 간주될 것이다. 따라서, hVEGF, hVEGF 수용체, 또는 hVEGF 수용체와 hVEGF이 결합된 복합체에 결합하는 항체, 특히 모노클로날 항체, 또는 이들의 단편들이 본 발명의 범위 안에 포함된다. 또한, hVEGF 수용체에 결합하지만 천연적인 hVEGF의 생체 활성을 나타내지 않는 hVEGF의 단편 및 아미노산 서열 변이체들도 본 발명의 범위 안에 포함된다. 또한 본 발명의 범위에는 hVEGF와 결합할 수 있는 hVEGF 수용체 및 이의 단편 및 아미노산 서열 변이체들이 포함된다.

본 명세서에서 사용된 "hVEGF 수용체" 또는 "hVEGFr"이란 용어는 hVEGF을 위한 세포의 수용체, 보통 혈관 내피 세포 위에서 발견되는 세포 표면 수용체 및 hVEGF에 결합하는 능력을 보유한 이들의 변이체를 의미한다. 전형적으로 hVEGF 길항제인 hVEGF 수용체 및 그의 변이체들은 세포막에 통합되거나 세포 표면에 고정되어 있는 자연 상태와는 달리 분리된 형태로 있을 것이다. hVEGF 수용체의 일례는티로신 키나제 족의 막횡단(transmembrane) 수용체인 fms형 티로신 키나제(flt)이다(DeVries, et al., Science 255:989 (1992); Shibuya, et al., Oncogene 5:519(1990)). flt 수용체는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 티로신 키나제 활성이 있는 세포내 도메인으로 이루어진다. 세포외 도메인은 hVEGF 결합에 관여하는 반면, 세포내 도메인은 신호 전달에 관여한다.

hVEGF 수용체의 다른 예는 flk-1 수용체이다(KDR로도 일컫음). (Matthews, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88:9026 (1991); Terman et al., Oncogene 6:1677 (1991); Terman, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579 (1992)). flt 수용체에 hVEGF이 결합되면 겉보기 분자량이 205,000 및 300,000 달톤인 고분자량 복합체가 2개 이상 형성된다. 300,000 달톤의 복합체는 2개의 수용체 분자로 이루어진 이량체가 hVEGF 단일 분자에 결합된 것으로 믿어진다.

또한 hVEGFr의 변이체들도 본 발명의 범위 안에 포함된다. 대표적인 예로는 수용체에서 막횡단 및 세포질 도메인을 제거한 절단된 형태의 수용체, 및 비-hVEGFr 중합체 또는 폴리펩티드가 hVEGFr, 또는 특히 그의 절단된 형태에 접합된 융합 단백질을 포함한다. 그러한 비-hVEGFr 폴리펩티드의 일례는 면역글로불린이다. 예를 들면, 그러한 경우에는 hVEGFr의 세포외 도메인이 면역글로불린의 경쇄 또는 (바람직하게는) 중쇄의 Fv 영역을 대체하여, 수용체 세포외 도메인의 C-말단이 중쇄의 CH1, 힌지(hinge), CH2 또는 다른 단편의 아미노 말단에 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 변이체들은 공지된 면역성 유착과 같은 방법으로 만들어진다[예를 들면, Gascoigne, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84:2936 (1987); Capon,et al., Nature 337:525 (1989); Aruffo, et al., Cell 61:1303 (1990); Ashkenazi, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88:10535 (1991); Bennett, et al., J. Biol. Chem. 266:23060(1991) 참조]. 다른 실시태양에서는, hVEGFr가 폴리에틸렌 글리콜(PEG) (예를 들면, Davis, et al., 미국 특허 제4,179,337호; Goodson, et al., BioTechnology 8:343-346(1990) ; Abuchowski, et al., J. Biol. Chem. 252:3578(1977); Abuchowski, et al., J. Biol. Chem. 252:3582 (1977) 참조) 또는 탄수화물(예를 들면, Marshall, et al., Arch. Biochem. Biophys., 167:77 (1975) 참조)과 같은 비단백성 중합체에 접합되어 있다. 이것은 hVEGFr의 생체내 반감기를 연장하는 데 도움이 되고 그 수용체가 투여된 포유동물에서 수용체가 면역반응을 유발할 가능성을 감소시킨다. hVEGF에 대한 길항제의 친화력 및 그의 발런시(valency)를 고려하면 hVEGFr는 hVEGF에 대한 항체와 실질적으로 같은 방법으로 사용된다.

hVEGF 수용체의 세포외 도메인을 이용하면 숙주 안에 있으면서도 세포 표면 상의 hVEGFr에는 결합되지 않은 상태의 hVEGF를 감출 수 있기 때문에 그 자체만으로 또는 면역글로불린 폴리펩티드나 다른 운반체 폴리펩티드와 융합되어 hVEGF의 길항제로서 특히 유용하게 사용된다.

또한 hVEGFr과 그의 변이체들은 hVEGF의 작동 물질(agonist) 및 길항제를 확인하는 스크리닝 분석에 유용하다. hVEGFr(예를 들면, flt 또는 flk1)를 코딩하는 DNA로 형질감염된 숙주세포들은 세포 표면에 수용체 폴리펩티드를 과발현시키므로 그러한 재조합 숙주세포는 hVEGFr에 결합하는 시험 화합물(예를 들면, 소분자, 선형 또는 환형 펩티드, 또는 폴리펩티드)의 능력을 분석하는 데 이상적이다. hVEGFr 및 hVEGFr-IgG 융합단백질과 같은 hVEGFr 융합 단백질은 이와 비슷한 방법으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질을 고정화된 지지체에 결합시키고 융합 단백질의 hVEGFr 도메인으로부터 방사능 표지된 hVEGF를 대체하는 시험 화합물의 능력을 측정한다.

hVEGF, hVEGF 수용체, 모노클로날 항체 또는 그외 단백질에 관하여 사용된 "재조합"이란 용어는 숙주세포 안에서의 재조합 DNA 발현에 의해 생성된 단백질을 의미한다. 그 숙주세포는 원핵(예를 들면, 대장균과 같은 세균 세포) 또는 진핵 세포(예를 들면, 효모 또는 포유동물 세포)일 수 있다.

길항제 모노클로날 항체

본 명세서에서 사용한 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종의(homogeneous) 항체 집단으로부터 얻은 항체를 말한다. 즉, 무시할만한 양으로 자연발생하는 돌연변이를 제외하면 그 집단을 형성하는 개개 항체가 특이성 및 친화력 면에서 동일하다는 뜻이다. 본 발명의 모노클로날 항체의 조성물은 hVEGF, hVEGFr, 또는 hVEGFr과 hVEGF이 결합된 복합체("hVEGF-hVEGFr 복합체")에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 주로 포함하나, 그러한 천연 발생 돌연변이 등의 결과로서 소량의 다른 항체도 포함할 수 있다는 것을 인식하여야 한다.

따라서 "모노클로날"이란 수식어는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻은 항체의 특징을 나타내며 특별한 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 예를 들면, 본 발명의 모노클로날 항체는 문헌[Kohler와Milstein, Nature 256:495 (1975)]에 처음으로 설명된 하이브리도마 방법을 사용하여 만들어지거나, 또는 재조합 DNA 방법으로 만들어질 수 있다(Cabilly, et al., 미국 특허 제4,816,567호).

하이브리도마 방법에서는 마우스 또는 다른 적당한 숙주 동물에 피하로, 복강내로, 또는 근육내로 항원을 면역접종하여, 면역접종에 사용된 단백질(들)에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 항체를 생산할 수 있는 임파세포를 유도한다. 이와 다르게는 임파세포를 시험관 내에서 면역접종할 수도 있다. 그 후에 임파세포를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적당한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

항원은 hVEGF, hVEGFr 또는 hVEGF-hVEGFr 복합체일 수 있다. 경우에 따라 항원은 hVEGF가 그 수용체들 중 하나와 결합하는데 관여하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는, hVEGF 또는 hVEGFr 중 어느 하나의 단편이거나 부분일 수 있다. 예를 들면, hVEGFr의 세포외 도메인(즉, 막횡단 및 세포내 도메인이 결여된 절단된 hVEGFr 폴리펩티드)은 그 자신이 hVEGF 결합에 참여하기 때문에 이를 사용하는 면역법은 hVEGF 길항제인 항체를 생산하는데 특히 유용할 것이다.

hVEGF-hVEGFr 복합체와 결합할 수 있는 모노클로날 항체는 만약 이들이 비결합상태 (복합되지 않음)의 hVEGF와 hVEGFr에 결합하지 않는다면 유용하다. 그러한 항체는 hVEGF에 의해 이제 막 활성화된 세포에만 결합하므로 보통 포유동물에서 발견되는 바와 같이 유리 hVEGF 또는 hVEGFr에 의해 숨겨지지 않는다. 그러한 항체는통상적으로 수용체와 hVEGF 사이에 하나 이상의 접촉점에 걸친 에피토프에 결합한다. 그러한 항체는 다른 리간드 수용체 복합체에 대해 제조된 바 있으며 본 발명에서도 같은 방식으로 형성될 수 있다. 이들 항체들은 비결합된 hVEGF 또는 hVEGFr에 결합할 수 있는지 없는지 몰라도, 비결합된 hVEGF 또는 hVEGFr의 생체 활성을 중화하거나 억제하지 않을 수 있고 또한 억제할 필요도 없다.

이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 어버이 골수종 세포의 성장이나 생존을 방해하는 하나 이상의 물질을 포함하고 있는 적당한 배양 배지에 시딩하고 증식시킨다. 예를 들어 어버이 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없다면, 하이브리도마를 위한 전형적인 배양 배지는 HGPRT-결핍 세포들의 성장을 방지하는 물질들인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)를 포함한다.

바람직한 골수종 세포들은 선택된 항체 생성 세포들에 효율적으로 융합되어 그 항체 생성 세포에 의한 항체 발현을 높은 수준으로 안정하게 유지하며 HAT 배지와 같은 배지에 민감한 세포들이다. 이들 중에서 특히 바람직한 골수종 세포주는 소크 인스티튜트 셀 디스트리퓨션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center; San Diego, California USA)로부터 입수한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; Rockville, Maryland USA)으로부터 입수한 SP-2 세포들, 및 문헌[Yelton, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1(1978)]에 기재된 P3X63Ag8U.1 세포들로부터 유도된 것과 같은 쥐 골수종 세포주이다. 인간의 골수종과 마우스-인간 이종 골수종 세포주도인간의 모노클로날 항체를 생성하는데 사용되었다(Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New Youk, 1987)).

하이브리도마 세포들이 증식하는 배양 배지를 그 항원에 특이적인 모노클로날 항체의 생산 여부에 대해 분석한다. 특히 하이브리도마 세포가 생산하는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역 침전 또는 방사성 면역 측정법(RIA) 또는 효소 결합된 면역 흡착법(ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석법에 의해 결정된다. 본 발명의 모노클로날 항체들은 우선적으로 hVEGF, hVEGFr 또는 hVEGF-hVEGFr 복합체를 면역 침전하는 것이나 결합 분석에서 그 항원들 중의 적어도 하나에 우선적 결합하여 hVEGF의 생체 활성을 억제할 수 있는 것들이다.

하이브리도마 세포들이 원하는 특이성, 친화력 및 활성을 가진 길항제 항체들을 생성하는 것이 확인된 후, 그 클론은 희석 절차를 제한함으로써 서브 클론될 수 있고 표준 방법으로 성장될 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-104(Academic Press, 1986)). 예를 들면, 이러한 목적을 위한 적당한 배양 배지는 둘베코 변형된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포들은 동물 내의 복수증 종양과 같이 생체 내에서도 성장할 수 있다.

서브 클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 과정에 의해 배양 배지, 복수(腹水), 또는 혈청으로부터 적당하게 분리된다.

본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여(즉, 쥐 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 분리하여 서열분석한다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 근원으로 사용된다. 일단 분리가 되면, DNA는 발현 벡터에 넣어, 형질전환 전에는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 원숭이의 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포과 같은 숙주 세포를 형질감염시켜 재조합 숙주세포 안에서 모노클로날 항체를 합성한다.

DNA는 그의 발현 생성물인 면역글로불린의 특성을 변화시키기 위해서 선택적으로 변형할 수 있다. 예를 들면, 쥐 항체 가변 도메인의 상보성 결정 영역(CDR)을 인간 항체의 대응하는 영역 대신 사용하여 쥐 항체의 인간화된 형태를 제조한다. 어떤 경우에는, 쥐 항체의 선택된 골격 영역(FR)에 있는 아미노산 잔기들이 인간의 항체 안에 있는 대응하는 아미노산 잔기 대신 사용되기도 한다(Carter, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 89:4285(1992); Carter, et al., BioTechnology 10:163 (1992)). 또한 선택된 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 코딩 서열을 쥐의 상동성 서열 대신 사용하여 쥐 항체의 키메라 형태들이 제조된다(Cabilly, et al., 미국 특허 제4,816,567호; Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984)).

본 발명의 범위에 속하는 항체들은 hVEGF, hVEGFr, hVEGF-hVEGFr 복합체 또는 비-hVEGF 에피토프에 결합할 수 있는 면역글로불린 사슬을 포함하는 키메라(인간화된 것 포함) 항체 및 혼성화 항체와 같은 변이체 항체들을 포함한다.

본 발명에서 항체는 hVEGF, hVEGFr 또는 hVEGF-hVEGFr 복합체에 결합할 수 있고 hVEGF의 생체 활성에 대해 길항 작용을 할 수 있는 한 모든 기원의 종과 면역글로불린류(예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM) 및 아류는 물론 항체의 단편(예를 들면, Fab, F(ab')₂및 Fv)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 모노클로날 항체는 문헌[Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980)]에 기재된 스캣챠드(Scatchard) 분석법에 의해 측정된 바와 같이 약 10⁹리터/몰 이상의 면역성 항원에 대한 친화성을 가질 것이다. 또한, 예를 들면, 실시예 2에 기재한 바와 같이 시험관내 세포 생존 또는 증식을 분석하여 측정하면, 모노클로날 항체는 전형적으로 hVEGF의 유사 분열 촉진 또는 맥관 형성 활성을 50 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상까지 억제할 것이다.

치료와 진단 응용에 있어서, 모노클로날 항체는 hVEGF의 다른 모든 분자 형태보다 반응성이 적은 것이 이상적이다. 예를 들면, 165-아미노산 서열 hVEGF에 특이적으로 결합할 수 있으나 121-아미노산 또는 189-아미노산 서열 hVEGF 폴리펩티드에는 결합하지 않는 모노클로날 항체를 갖는 것이 이상적이다. 그러한 항체는 비교 ELISA 분석법이나 다른 hVEGF 폴리펩티드의 비교 면역침전법에 의해 용이하게 확인된다.

세포 독성 잔기와의 접합체

몇몇 실시태양에서는, hVEGF 특이성 모노클로날 항체 또는 hVEGFr에 접합된 세포 독성 잔기를 제공하는 것이 바람직하다. 이런 경우에서는 세포 독소가 hVEGF 또는 그의 수용체를 발현하거나 결합하는 세포들을 불활성화시키거나 또는 사멸하는데 사용된다. 이 접합체는 hVEGF, hVEGFr 또는 hVEGF-hVEGFr 복합체에 결합할 수 있는 도메인에 의해 세포로 표적화된다. 따라서, hVEGF, hVEGFr 또는 hVEGF-hVEGFr 복합체에 결합할 수 있는 모노클로날 항체는 세포 독소에 접합된다. 마찬가지로, hVEGFr도 세포 독소에 배합된다. 모노클로날 항체가 hVEGF만의 활성을 (세포 독소 없이) 최적 상태로 중화할 수 있긴 하지만, 모노클로날 항체 또는 수용체는 hVEGF, hVEGFr 또는 hVEGF-hVEGFr 복합체에 결합할 수만 있으면 이 실시태양에서 만족스러운 것이 된다.

어떤 면역글로불린류의 경우에는 모노클로날 항체의 Fc 도메인 그 자체가 세포 독소를 제공하는 역할을 하지만(예를 들면, 보체를 고정할 수 있고 항체 의존성 세포질의 독성 (ADCC)에 관여할 수 있는 IgG2 항체의 경우), 전형적으로 세포 독소는 단백질 세포 독소, 예를 들면 디프테리아, 리신 또는 슈도모나스속 독소이다. 그러나, 세포 독소는 항상 단백질일 필요가 없고 예를 들면 이제까지 종양 치료에 사용된 화학요법약을 포함할 수도 있다.

세포 독소는 전형적으로 항체의 Fc 도메인 내의 주쇄 아미드 결합에 의해(또는 Fc 도메인의 전부 또는 일부 대신) 모노클로날 항체 또는 이의 단편에 연결된다. hVEGFr이 표적 기능을 제공하는 경우에는, 세포 독성 잔기가 hVEGF 결합에 참여하지 않는 수용체의 어떤 도메인 위에 치환된다. 바람직하게는 그 성분이 수용체의 막횡단 및(또는) 세포질 도메인 대신에 또는 그 위에 치환된다. 최적 치환 장소는 정규 실험에 의해 결정될 것이며 통상의 기술 범위내에서 수행할 수 있다.

단백질 융합체인 접합체는 그 접합체를 코딩하는 유전자를 발현시켜 재조합 세포배양액 안에서 쉽게 만들어진다. 이와 다른 접합체 제조법으로는 예를 들어 이미노티올레이트와 메틸-4-메르캅토부티르이마데이트를 이용하여 티오에스테르 결합을 통해 이황화 교환하거나 또는 결합하는 방법과 같은 공지된 방법을 사용하여 세포독성 잔기를 항체 또는 수용체의 아미노산 잔기 측쇄 또는 C-말단 카르복실기에 공유 결합으로 가교시키는 것이다.

다른 성분과의 접합체

hVEGF의 길항제인 모노클로날 항체 및 hVEGFr는 세포 독소로 분류되지 않으나 본 발명의 조성물의 활성을 증가시키는 물질에 접합되기도 한다. 예를 들면, hVEGF, hVEGFr 또는 hVEGF-hVEGFr 복합체에 결합할 수 있는 모노클로날 항체 또는 hVEGFr은 바이러스의 서열과 같은 이형의 폴리펩티드와, 세포 수용체와, TNF, 인터페론 또는 인터루킨과 같은 사이토킨과, 응혈촉진제의 작용을 하는 폴리펩티드와 그리고 다른 생물학적 또는 면역학적 활성인 폴리펩티드와 융합된다. 이러한 융합은 재조합 방법에 의해 쉽게 성취된다. 전형적으로 그러한 비면역글로불린 폴리펩티드는 항-hVEGF 또는 항-hVEGF-hVEGFr 복합체 항체의 불변 도메인(들) 또는 hVEGFr의 막횡단 및(또는) 세포내 도메인 대신 사용된다. 별법으로, 그들은 본 명세서에서 설명된 항-hVEGF 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신 사용된다.

바람직한 실시태양에서는 그러한 비면역글로불린 폴리펩티드가 본 명세서에 기재된 항체의 불변 도메인에 연결되거나 또는 대신 사용된다(Bennett, et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991)). 별법으로, 그들은 본 발명의 항체의 Fv 대신 사용되어 hVEGF, hVEGFr 또는 hVEGF-hVEGFr 복합체에 대해 특이성을 갖는 것으로 남아있는 적어도 하나의 항원 결합 부위 및 기능 또는 특이성이 원래 항체와는 완전히 다른 대리 항원 결합 부위로 이루어진 키메라 폴리발런트 항체를 형성한다.

이종 특이성인 항체

hVEGF, hVEGFr 또는 hVEGF-hVEGFr 복합체에 결합할 수 있는 모노클로날 항체는 수많은 에피토프에 대해 단 하나만의 결합 부위, 일반적으로 하나의 중-경쇄 또는 이의 단편을 필요로 한다. 그러나, 그러한 항체는 hVEGF, hVEGFr 또는 hVEGF-hVEGFr 복합체의 어디에서도 발견되지 않는 에피토프에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인도 또한 가질 수 있다. 예를 들면, 원래 항-hVEGF, 항-hVEGFr, 항-hVEGF-hVEGFr 복합체 항체의 해당 아미노산 서열 또는 아미노산 잔기들을 hVEGF, hVEGFr 또는 hVEGF-hVEGFr 복합체 이외의 항원에 대해 특이성을 가지는 항체의 상보성 결정 부위 또는 필요에 따라 항체의 골격 부위로 대체시키면, hVEGF, hVEGFr 또는 hVEGF-hVEGFr 복합체에 특이적인 한 항원 결합 부위 및 비-hVEGF, hVEGFr 또는 hVEGF-hVEGFr 복합체에 특이적인 다른 항원 결합 부위를 함유하는 다중 특이성 항체를 형성할 것이다. 이들 항체들은 선택된 항체 분류 안에 있는 항원 결합 부위의 수에 따라 적어도 바이발런트이거나 폴리발런트일 수 있다. 예를 들면, IgM류 항체는 폴리발런트일 것이다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 그러한 항체가 hVEGF 또는 hVEGFr 에피토프와 결합할 수 있고, (a) 단백질 C나 조직 인자와 같은 혈액 응고제 작용을 하는 폴리펩티드, (b) 종양 괴사 인자 (TNF)와 같은 세포 독소 단백질, 또는 (c) CD4 또는 HER-2 수용체와 같은 비-hVEGFr 세포 표면 수용체 중의 하나와 결합할 수 있다(Maddon, et al., Cell 42:93 (1985); Coussens, et al., Science 230:1137 (1985)). 이종특이적이고 폴리발런트인 항체는 두 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 DNA로 숙주세포를 동시 형질전환시킨 후에 발현된 항체 중 원하는 항원 결합 특성을 가진 일부를 면역친화성 크로마토그래피 등의 방법으로 회수함으로써 용이하게 만들어진다. 별법으로, 시험관 안에서 단일특이적인 항체를 재조합하여 그러한 항체를 만들 수 있다.

모노발런트 항체

hVEGFr 또는 hVEGF-hVEGFr 복합체에 결합할 수 있는 모노발런트 항체는 특히 hVEGF의 길항제로 유용하다. 본 발명은 어떤 특별한 생체 활성 기작에 한정되지 않으나, 세포 hVEGF 수용체의 활성화는 세포 hVEGF 수용체에 hVEGF이 결합되어 수용체간의 응집을 유도하면 세포 내의 수용체 키나제 활성이 촉진되는 기작에 의해 진행되는 것으로 믿어진다. 모노발런트 항-hVEGF 수용체 항체는 이러한 응집을 유도할 수 없으므로 이러한 기작에 의해 hVEGF 수용체를 활성화할 수 없기 때문에 hVEGF의 아주 이상적인 길항제이다.

그러나, 이러한 항체들은 수용체의 hVEGF 결합 부위에 대해 유도되거나 그렇지 않으면 hVEGF가 수용체에 접근하는 것을 입체적으로 방해하는 등의 방식으로hVEGF 수용체에 대한 hVEGF의 결합을 방해할 수 있어야 한다. 이 명세서의 다른 부분에서 설명된 바와 같이, hVEGF 결합을 방해할 수 없는 항-hVEGFr 항체는 비면역글로불린 성분, 예를 들어 세포 독소에 접합될 때 유용하다.

모노발런트 항체를 만드는 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 한 방법은 면역글로불린의 경쇄와 변형된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 일반적으로 중쇄는 중쇄의 가교를 방지하기 위해 Fc 영역의 어느 위치에서든지 절단된다. 가교를 방지하는 또 다른 방법은 이에 연관된 시스테인 잔기를 결실시키거나 또는 다른 아미노산기로 치환한다. 시험관내 방법들도 모노발런트 항체를 만드는 데 적당하다. 예를 들면, Fab 단편들은 손상되지 않은 항체를 효소적 분해시켜 만든다.

진단 용도

진단용으로는 전형적으로 본 발명의 항체 또는 hVEGFr를 검출가능한 물질로 표지한다. 검출가능한 물질이란 직접적으로 또는 간접적으로 검출할 수 있는 신호를 만들 수 있는 것을 말한다. 예를 들면 검출가능한 물질은³H,¹⁴C,³²P,³⁵S 또는¹²⁵I와 같은 방사성 동위원소, 형광 이소티오시아네이트, 로다민, 또는 루시페린과 같은 형광 또는 화학 발광 화합물;¹²⁵I,³²P,¹⁴C 또는³H와 같은 방사성 동위 원소 표지, 또는 알킬리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 양고추냉이의 과산화효소 같은 효소일 수 있다.

문헌[Hunter, et al., Nature 144:945(1962); David, et al., Biochemistry 13:1014(1974); Pain, et. al., J. Immunol. Meth. 40:219(1981); 및 Nygren, J.Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)]에 기재된 방법을 비롯해서 검출가능한 물질을 항체 또는 hVEGFr에 별도로 접합하는 기술로 알려진 모든 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 항체와 수용체는 경쟁 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치식 분석법, 그리고 면역 침전 분석법과 같은 공지된 모든 분석 방법에 이용될 수 있다(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).

경쟁 결합 분석법은 표지된 기준 물질(hVEGF 또는 그의 면역학적 반응성 부분)이 한정된 양의 항체와 결합하기 위해 시험 시료 분석물(hVEGF)과 경쟁하는 능력에 좌우된다. 시험 시료 안에 있는 hVEGF의 양은 항체 또는 수용체에 결합되는 기준 물질의 양에 반비례한다. 결합되는 기준 물질의 양을 용이하게 측정하기 위해 항체 또는 수용체는, 그에 결합된 기준 물질과 분석 물질이 결합되지 않고 남아 있는 기준 물질과 분석 물질로부터 용이하게 분리되도록 항체 또는 수용체는 경쟁 전이나 경쟁 후에 불용성화된다.

샌드위치 분석법은 검출될 단백질의 다른 면역원 부분 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 두개의 항체 또는 수용체를 사용한다. 샌드위치 분석법에서 분석 시료는 고체 지지체 위에 고정시킨 첫번째 항체 또는 수용체에 의해 결합된 후, 두번째 항체가 분석 물질과 결합함으로써 3개의 불용성 부분 복합체를 형성한다(David & Greene, 미국 특허 제4,376,110호). 두번째 항체 또는 수용체 그 자체는 검출가능한 물질로 표지되거나(직접 샌드위치 분석법) 검출가능한 물질로표지된 비면역글로불린 항체를 사용하여 측정될 수 있다(간접 샌드위치 분석법). 예를 들면, 샌드위치 분석법의 한 타입은 검출가능한 물질이 효소인 ELISA 분석법이다.

본 명세서에서 항체 또는 수용체는 생체내 영상화에 또한 유용하다. 검출가능한 물질로 표지된 항체 또는 hVEGFr이 환자에게 투여된(혈류에 투여하는 것이 이상적임) 후에, 환자 안에서의 표지된 항체 또는 수용체의 존재 및 위치를 평가 분석한다. 이러한 영상화 기술은 이상 조직의 발달 단계를 추정하고 이상 조직을 치료하는 데 유용하다. 항체 또는 hVEGFr는 핵 자기 공명, 방사선 의학, 또는 다른 공지된 검출 수단으로 포유동물에서 검출가능한 물질로 표지된다.

hVEGF의 길항제 변이체

본 명세서에 기재된 항체 이외에, hVEGF의 다른 유용한 길항제는 hVEGF 수용체에 결합하지만 천연 hVEGF의 생체 활성을 갖지 않는 천연 hVEGF의 단편 및 아미노산 서열 변이체들을 포함한다. 예를 들면, 그러한 길항제는 세포질 hVEGF 수용체의 응집이나 활성화를 유도하는 능력이 부족한 단편 또는 아미노산 서열 변이체의 경우에서와 같이, hVEGF의 수용체 결합 도메인으로 이루어지지만 생체 활성이 있는 도메인이 결핍되거나 그렇지 않으면 세포질 hVEGF 수용체를 활성화할 수 없는 단편 및 아미노산 서열 변이체들을 포함한다. "수용체 결합 도메인"이란 용어는 hVEGF 수용체 결합에 참여하는 hVEGF의 아미노산 서열을 의미한다. "생물학적 작용 도메인" 또는 "생체 활성을 부여하는 도메인"이란 용어는 유사분열 촉진 또는 맥관 형성 작용과 같은 그 인자의 특별한 생체 활성을 부여하는 hVEGF의 아미노산 서열을의미한다.

hVEGF가 세포 표면 위에서 2개 이상의 hVEGFr 분자와 복합체를 형성할 수 있는 것 같다는 관찰은 hVEGF가 적어도 2개의 다른 부위에서 hVEGFr와 결합하고 그것이 성장 호르몬, 프롤락틴 등의 방식에서와 같이 활성화가 일어나기 전에 먼저 한 부위에서 그리고 다른 부위에서 연속적으로 그러한 세포질 수용체에 결합한다는 것을 암시한다(Cunningham, et al., Science 254:821 (1991): deVos, et al., Science 255:306 (1992); Fuh, et. al., Science 256:1677 (1992) 참조). 따라서 hVEGF의 길항제 변이체들이 hVEGF의 한 수용체 결합 부위(전형적으로 hVEGF가 hVEGFr에 결합하는 초기에 참여하는 부위)는 변형되지 않은 채로 남아 있고(만약 변형되었다면, 결합력을 증가시키도록 변화됨), 두번째 hVEGF의 수용체 결합 부위는 결합 부위가 효력이 잃도록 하기 위해 비보존적 아미노산 잔기의 치환(들) 또는 결실(들)에 의해 변형되도록 선택된다.

hVEGF 안의 수용체 결합 도메인과 hVEGFr 안의 hVEGF 결합 도메인은 X-선 연구, 돌연변이 분석 및 항체 결합 연구와 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 결정된다. 돌연변이 방법은 회피 돌연변이체의 선택과 관련이 있는 무작위 포화 변이 유발 방법과 부착 변이 유발 방법을 포함한다. 리간드 안에 있는 수용체 결합 도메인을 확인하는 데 적당한 다른 방법은 알라닌(Ala)-주사(Scanning) 변이 유발방법으로 알려진 것이다(Cunningham, et al., Science 244, 1081-1985 (1989)). 이 방법은 하전된 아미노산 측쇄를 포함하는 영역을 확인하는 것이다. 확인된 각 영역안의 하전된 잔기(즉, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu)는 Ala로 대체되고 (돌연변이체 분자당 한 영역) 얻어진 리간드의 수용체 결합을 시험하여 수용체 결합에 있어서 특별한 영역의 중요성을 분석한다. 수용체 결합 도메인의 정위화를 위한 더 강력한 방법은 중화하는 항-hVEGF 항체를 이용하는 것이다(Kim, et al., Growth Factors 7:53 (1992)). 일반적으로, 이 방법과 그의 유사한 방법들이 수용체 결합에 관여하는 도메인을 정위화하는 데 사용된다.

hVEGF에 관련되어 사용되는 "아미노산 서열 변이체"이란 용어는 천연 형태의 hVEGF의 아미노산 서열과 어느 정도 다른 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, 길항제 아미노산 서열 변이체는 천연 hVEGF의 적어도 하나의 수용체 결합 도메인과 약 70 % 이상의 상동성을 가지며, 바람직하게는 천연 hVEGF의 수용체 결합 도메인과 약 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 90 % 이상의 상동성을 가질 것이다. 아미노산 서열 변이체들은 천연 hVEGF의 아미노산 서열 내의 어떤 지점에서 치환, 결실 및(또는) 삽입되므로, 그 변이체는 hVEGF 수용체에 결합할 능력을 갖지만(그러므로 hVEGF 수용체에 결합하기 위해 천연 hVEGF와 경쟁한다), hVEGF의 내피 세포 증식, 맥관 형성, 또는 혈관 투과성과 같은 생물학적 작용을 하나도 유도하지 못하게 된다.

"상동성"은 서열을 정렬하고 최대 퍼센트의 상동성을 얻기 위해 필요하면 빈틈을 도입한 후 천연 hVEGF의 수용체 결합 도메인의 아미노산 서열 내의 잔기와 동일한 아미노산 서열 변이체의 잔기를 퍼센트로 정의한 것이다. 정렬 방법과 콤퓨터 프로그램은 업계에 공지된 기술이다. 그러한 한 프로그램은 "Align 2"로 제넨테크, 인크.에 의해 유나이티드 스테이츠 카피라이트 오피스(United States CopyrightOffice; Washington, DC 20559)에 사용자 문서로 1991년 12월 10일에 신청되어 있다. 치환 변이체는 원래의 서열로부터 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거된 후 같은 장소에 다른 아미노산을 삽입한 것이다. 그 치환은 그 분자 안에 오직 한 아미노산이 치환된 단일 치환일 수 있고 동일 분자에서 두개 이상의 아미노산이 치환된 다중 치환일 수도 있다.

삽입 변이체는 원래 서열에서 특별한 위치의 아미노산 바로 옆에 1개 이상의 아미노산이 삽입된 것이다. 아미노산 바로 옆이라는 것은 아미노산의 α-카르복시기 또는 α-아미노 관능기에 연결된 것을 의미한다.

결실 변이체는 1개 이상의 아미노산 잔기가 원래 서열에서 제거된 것이다. 통상적으로, 결실 변이체는 1개 또는 2개의 아미노산이 그 분자의 특별한 영역으로부터 결실된 것이다.

hVEGF의 단편과 아미노산 서열 변이체는 천연 인자를 코딩하는 DNA의 위치지정 돌연변이유발법과 같은 잘 알려진 방법에 의해 쉽게 제조된다. 돌연변이 유발된 DNA를 적당한 발현 벡터에 삽입한 후 이 재조합 벡터로 숙주세포를 형질감염시킨다. 재조합 숙주세포를 적당한 배양 배지에서 증식시킨 후에, 숙주세포 안에서 발현된 원하는 단편이나 아미노산 서열 변이체들을 재조합 세포 배양액으로부터 크로마토그래피 또는 다른 정제 방법으로 회수한다.

별법으로는, hVEGF의 단편과 아미노산 서열 변이체를 예를 들어 천연 hVEGF의 단백질 분해, 또는 문헌[Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)]에 기재된 바와 같이 표준 고상 펩티드 합성 과정을 이용하는 합성법에 의해 시험관내에서 제조한다. 알려진 다른 동등한 화학 합성법도 사용될 수 있다. 고상 합성은 보호된 α-아미노산을 적당한 수지에 결합시킴으로써 그 펩티드의 C-말단으로부터 개시된다. 아미노산은 당업계에 공지된 펩티드 결합 형성 기술을 이용하여 펩티드 사슬에 결합된다.

치료 용도

치료용으로 본 발명의 길항제는 제약학상 허용되는 투약 형태로 포유동물에게, 바람직하게는 인간에게 정맥 내로 한번 주입하거나 일정한 기간 동안 지속 주입하거나, 근육 내, 복강 내, 뇌척수 내, 피하, 관절 내, 활액낭 내, 포막 내, 경구, 국소 또는 흡입 경로로 투여한다. 길항제는 종양 내, 종양 주위, 병변 내, 병변 주위 경로에 의해 적당히 투여되어 국부와 전신 치료 효과를 발휘한다. 복강 내 경로는 예를 들어 난소 종양을 치료하는 데 특히 유용한 것으로 기대된다.

그러한 투약 형태는 무독성이고 치료성이 없는 제약학상 허용되는 담체를 본래 포함한다. 그러한 담제의 예로는 이온교환기, 알루미나, 스테아린산 알루미늄, 레시틴, 인간의 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 인산염과 같은 완충제 물질, 글리신, 소르빈산, 소르빈산 칼륨, 식물 포화 지방산의 일부 글리세리드 혼합물, 물, 염, 또는 황산프로타민, 인산 수소 이나트륨, 인산 수소 칼륨, 염화 나트륨, 아연염, 콜로이드상 실리카, 3규산 마그네슘, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스 기재 물질 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 전해질을 들 수가 있다. 국소적 또는 겔 형태의 길항제를 위한 담체는 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 또는 메틸셀룰로오스와 같은 다당류, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블럭 중합체, 폴리에틸렌글리콜 및 목납 알코올을 포함한다. 모든 투여의 경우, 통상적인 저장 형태가 적당하게 사용된다. 예를 들면, 그러한 형태로는 마이크로 캡슐, 나노 캡슐, 리포좀, 기브스, 흡입기, 코분무기, 설하정(sublingual tablets) 및 서방형 제제를 포함한다. 길항제는 전형적으로 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 농도로 이러한 비히클 안에서 제형화될 것이다.

서방형 제제의 적당한 예로는 길항제를 포함하는 고상의 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 있으며, 그 매트릭스는 피막이나 마이크로 캡슐과 같은 형상의 제품들이다. 서방형 제제의 예로는 폴리에스테르, 문헌[Langer, et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167(1981) 및 Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)]에 기재된 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리비닐알코올, 폴리액티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman, et al., Biopolymers, 22:547(1983), 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트(Langer, et al., 상기 참조), Lupron Depot(상표)와 같은 분해성 락트산과 글리콜산의 공중합체(락트산과 글리콜산의 공중합체와 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트와 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출할 수 있는 반면, 어떤 히드로겔은 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 폴리펩티드 길항제가 오랫동안 인체에 머무르면, 37 ℃에서 습기에 노출된 결과로서 변질되거나 응집되어 생체 활성이 손실될 수 있고 면역유전성이 변형될 가능성이 있다. 작용되는 기작에 따라 안정화를 위해 합리적인 대책이 고안될 수 있다.예를 들면, 응집기작이 티오-이황화 상호 교환을 통해 분자 내의 S-S 결합 형성으로 발견되면, 적당한 첨가제를 사용하여 설프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조하여 습기의 양을 조절하고 특이한 중합체 매트릭스 조성물에서 전개함으로써 안정화를 성취할 수 있다.

또한 서방형 hVEGF 길항제 조성물은 리포좀(liposome)으로 둘러싼 길항제 항체와 hVEGFr을 포함한다. 길항제를 함유하는 리포좀은 문헌[Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688(1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030(1980); 미국 특허 제4,485,045호; 미국 특허 제4,544,545호]에 기재된 바와 같은 공지된 방법으로 만들 수 있다. 보통 리포좀은 작은(200-800 Å) 단층의 형태로서 지질의 함유량은 약 30 몰% 이상이 콜레스테롤이고 선택된 비율은 최적의 HRG 치료를 위해 조절될 것이다. 순환 기간이 길어진 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 기재되어 있다.

본 발명의 다른 용도는 hVEGF 길항제를 이미 형성된 제품에 넣는 것이다. 그러한 제품은 내피 세포 성장 및 맥관 형성을 조절하는 데 사용할 수 있다. 또한, 종양 침입과 전이도 이들 제품으로 조절될 수 있다.

질병의 예방 또는 치료를 위해 길항제의 적당한 투약량은 상기 정의한 바와 같이 치료될 질병의 종류, 그 질병의 심도와 발전 단계, 항체 투여가 예방을 위한 것인지 또는 치료를 위한 것인지 여부, 이전의 치료법, 환자의 임상 병력과 길항길에 대한 반응 및 담당 의사의 판단에 따라 다를 것이다. 길항제는 단일 투여 또는 연속적 투여하는 치료에 적당하다.

hVEGF 길항제는 다양한 이상 조직을 생성하거나 이상 조직을 생성하지 않는 질병 및 질환을 치료하는 데 유용하다. 이 치료로 효과를 볼 수 있는 이상 조직 생성 및 관련 질환으로는 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 결장 직장암, 간암, 난소암, 난포막종, 남성화 세포 종양, 자궁암, 자궁내막암, 자궁내막과형성, 자궁내막증, 섬유육종, 융모막암, 머리와 목 암, 비인강암, 후두암, 악성 간종양, 카포시 육종, 색소세포종, 피부암, 혈관종, 공동혈관종, 혈관아세포종, 췌장암, 망막아종, 성세포종, 고아종, 신경초종, 핍(乏) 돌기 신경교종, 수아세포종, 신경아세포종, 횡문근육종, 골형성육종, 평활근육종, 요로암, 갑상선암, 빌림스 종양, 신장세포암, 전립선암, 모반증과 관련된 비정상적 혈관 증식, 부종(뇌암과 연관된 것) 및 메이그스 증후군을 포함한다.

이 치료로 효과를 볼 수 있는 이상 조직을 생성하지 않는 질병은 류머티스성 관절염, 전선, 아테롬성 동맥경화증, 당뇨병성 망막증과 다른 망막증, 후수정체 섬유증식증, 혈관 신생 녹내장, 갑상선 과형성증(그레이브 질환을 포함), 각막조직과 다른 조직 이식, 만성 염증, 폐렴, 신증 증후군, 자간전증, 복수증, 심낭 삼출(심낭염과 연관된 것) 및 흉막 삼출을 포함한다.

병의 종류와 병의 심도에 따라 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg의 길항제를 초기 투약량으로 예를 들어 한번 이상 주입하거나 지속 주입하여 환자에게 투여한다. 상기 인자에 따라 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상을 전형적인 1일 투약량으로 사용할 수 있다. 상태에 따라 몇일 이상 동안 반복하여 주입할 때는 병 증상이 원하는 정도로 억제될 때까지 치료를 계속 반복한다. 그러나, 이때 다른 투약 요법이유용할 수도 있다. 이 치료의 진행 사항은 방사선 종양 영상화를 포함한 기존의 기술과 분석법에 의해 쉽게 모니터될 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양에 의하면, 병을 예방하거나 또는 치료하는 데 있어서의 길항제의 효능은 이에 효과가 있는 다른 약제와 연속적으로 투여하거나 또는 병합하여 투여함으로써 개선될 것이다. 병합하는 약품의 예로는 종양괴사인자(TNF), 염기성 또는 산성 섬유아세포 성장 인자(FGF) 또는 간세포 성장 인자(HGF)의 맥관 형성 활성을 억제하거나 또는 중화할 수 있는 항체, 조직 인자의 응고 작용을 억제하거나 또는 중화할 수 있는 항체, 단백질 C, 또는 단백질 S(Esmon, et al., 1991년 2월 21일에 공개된 PCT 특허출원 공개 제WO91/01753호 참조), 또는 하나 이상의 통상적인 치료제, 예를 들면 알킬화제, 엽산 길항제, 핵산 대사의 비대사산물, 항생물질, 피리딘 동족체, 5-플루오로우라실, 퓨린 뉴클레오사이드, 아민, 아미노산, 트리아졸 뉴클레오사이드, 또는 코르티코스테로이드가 있다. 그러한 다른 약제는 투여하는 조성물에 넣거나 따로 투여한다. 또한 이 길항제는 방사선 물질로 조사하거나 투여하는 방사선 치료와 연속적으로 투여하거나 병합하여 투여할 수 있다.

본 발명의 한 실시태양에서는, 병용 요법은 종양의 혈관화를 공격한다. 만약 있다면, 종양의 괴사 또는 전이 병소를 관찰하여 결정된 치료상 유효 투약량으로 종양이 있는 환자에게 하나 이상의 hVEGF 길항제를 투여한다. 이 요법은 더 이상 유익한 효과를 관찰할 수 없거나 임상 검진으로 종양이나 다른 전이 병소를 추적할 수 없을 때까지 계속한다. 그후에 TNF만 투여하거나 보조제, 예를 들면 일피-, 베타 또는 감마-인터페론, 항-HER2 항체, 헤레글린, 항-헤레글린 항체, D-인자, 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 과립구-대식 세포 군집 자극제(GM-CSF), 또는 항-단백질 C 항체, 항-단백질 S 항체, 또는 C4b 결합 단백질과 같은 종양에서 미소혈관 응고를 촉진하는 약제(Esmon, et al., 1991년 2월 21에 공개된 PCT 특허출원 공개 제WO91/01753호) 또는 열 또는 방사선과 병합하여 투여한다.

보조제의 효능은 상당히 다르므로 종래의 방법으로 매트릭스를 스크리닝하여 종양에 대한 그들의 영향을 비교하는 것이 바람직하다. hVEGF 길항제와 TNF의 투여는 원하는 임상 결과를 얻을 때까지 반복한다. 별법으로, hVEGF 길항제(들)을 TNF 및 임의로 보조약과 함께 투여한다. 고체 종양이 지절이나 일반 순환으로 부터 고립되기 쉬운 다른 장소에서 발견된 경우에는 본 명세서에 기재된 치료제를 고립된 종양이나 기관에 투여한다. 다른 실시태양에서, FGF 또는, 항-FGF 또는 항-PDGF 중화 항체와 같은 혈소판 성장 인자(PDGF) 길항제는 hVEGF 길항제와 함께 환자에게 투여한다. hVEGF 길항제에 의한 치료는 상처가 회복되는 기간이나 원하는 혈관 신생 기간 동안에 중단되어야 한다.

기타 용도

본 발명의 항-hVEGF 항체는 또한 친화성 정제용 작용제로서도 유용하다. 이러한 목적에서, hVEGF에 대한 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 세파덱스 수지 또는 여과지와 같은 적절한 지지체 상에 고정된다. 고정된 항체를 정제될 hVEGF를 함유하는 시료와 접촉시키고, 그 이후에 지지체를 고정된 항체에 결합된, hVEGF를 제외한 시료의 실질적인 모든 물질을 제거할 적당한 용매로 세척한다. 마지막으로, 지지체를 항체로부터 hVEGF를 방출할 글리신 완충액(pH 5.0)과 같은 다른 적당한 용매로 세척한다.

다음 실시예는 임의의 방법으로 본 발명을 예시하려는 것일 뿐 제한하려는 것은 아니다.

실시예 1

항-hVEGF 모노클로날 항체의 제조

면역반응 유발용으로 키홀 조개(keyhole limpet) 헤모시아닌 (KLH)에 접합된 hVEGF를 얻기 위하여, 재조합 hVEGF (165 아미노산)[Leung, et al., Science 246:1306 (1989)]를 0.05% 글루타르알데히드의 존재하에 4:1의 비율로 KLH와 혼합하고, 그 혼합물을 서서히 교반시키며 3시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 혼합물을 4 ℃에서 밤새 인산염 완충 염수(PBS)에 대해 투석하였다.

Balb/c 마우스에 KLH 20 μg에 접합된 hVEGF 5 μg를 복강내 주사하여 2주마다 4회 면역접종하고 세포 융합 4일 전에 KLH에 접합된 hVEGF의 동일 용량으로 추가 접종하였다.

면역접종된 마우스로부터 얻은 비장 세포를 문헌[Yarmush, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 77: 2899 (1980)]에 기재된 바와 같이 35% 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하여 P3X63Ag8U.1 골수종 세포[Yelton, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1 (1978)]와 융합시켰다. 하이브리도마를 HAT 배지에서 선택하였다.

하이브리도마 세포 배양액으로부터 얻은 상층액을 hVEGF-코팅된 마이크로 타이터 플레이트를 사용하는 ELISA 분석법에 의해 항-hVEGF 항체의 생산 여부를 스크리닝하였다. 각 웰에서 hVEGF에 결합된 항체를 알칼리 포스파타제-접합된 염소 항-마우스 IgG 면역글로불린 및 색원성 기질인 p-니트로페닐 인산염을 사용하여 측정하였다[Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, p597 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)]. 항-hVEGF 항체를 생산하는 것으로 측정된 하이브리도마 세포를 제한 희석법에 의해 서브클로닝하고, 이 클론 중 2개, A4.6.1 및 B2.6.2를 다음 연구를 위해 선택하였다.

실시예 2

항-hVEGF 모노클로날 항체의 특징 분석

A. 항원 특이성

A4.6.1 및 B2.6.2 하이브리도마에 의해 생산되는 항-hVEGF 모노클로날 항체의 결합 특이성을 ELISA 법으로 측정하였다. 모노클로날 항체를 hVEGF, FGF, HGF 또는 내피 세포 성장 인자 (EGF)로 사전 코팅해 둔 마이크로타이터 플레이트의 웰애 첨가하였다. 결합된 항체를 과산화효소 접합 염소 항-마우스 IgG 면역글로불린으로 검출하였다. 이 분석 결과 A4.6.1 및 B2.6.2 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체가 hVEGF에는 결합하지만, 다른 단백질 성장 인자에는 검출 가능한 정도로 결합하지 않는다는 것을 확인하였다.

B. 에피토프 맵핑(Mapping)

경쟁 결합 ELISA법을 사용하여 A4.6.1 및 B2.6.2 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체가 hVEGF 내의 동일하거나 또는 다른 에피토프 (부위)에 결합하는 지를 결정하였다[Kim, et al., Infect. Immun. 57: 944 (1989)]. 개개의 비표지된 항-hVEGF 모노클로날 항체 (A4.6.1 또는 B2.6.2) 또는 무관한 항-HGF 항체(IgG1 이소 타입)를 hVEGF로 사전에 코팅해 둔 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하였다. 그 다음 바이오틴화된 항-hVEGF 모노클로날 항체(바이오-A4.6.1 또는 바이오-B2.6.2)를 첨가하였다. 비표지된 항체에 대한 바이오틴화된 항체의 비율은 1:1000이었다. 바이오틴화된 항체의 결합을 아비딘-접합된 과산화 효소, o-페닐렌디아민 이염산염 및 과산화수소를 차례로 첨가하여 육안으로 관찰하였다. 바이오틴화된 항체 결합량을 나타내는 발색 반응을 495 nm 파장에서 광학 밀도 (O.D.)를 측정하여 관찰하였다.

제1도에 나타낸 바와 같이, 각 경우에 바이오틴화된 항-hVEGF 항체의 결합은 대응하는 비표지화된 항체에 의해 억제되었으나, 다른 비표지된 항-hVEGF 항체 또는 항-HGF 항체에 의해서는 억제되지 않았다. 이 결과는 A4.6.1 및 B2.6.2 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체가 hVEGF 내의 다른 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다.

C. 이소 타입화 (Isotyping)

A4.6.1 및 B2.6.2 하이브리도마에 의해 생산되는 항-hVEGF 모노클로날 항체의 이소 타입을 ELISA법에 의해 측정하였다. 각 하이브리도마가 증식하고 있는 배양 배지의 시료 (상층액)를 hVEGF로 사전에 코팅해 둔 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하였다. 포착된 항-hVEGF 모노클로날 항체를 다른 이소 타입 특이성 알칼리 포스파타제-접합된 염소 항-마우스 면역글로불린과 함께 인큐베이션시키고, 항-hVEGF 모노클로날 항체에 대한 접합된 항체의 결합을 p-니트로페닐 인산염을 첨가하여 측정하였다. 발색 반응은 ELISA 플레이트 판독기로 405 nm에서 측정하였다.

이 방법에 의하여, A4.6.1 및 B2.6.2 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체의 이소 타입은 IgG1인 것으로 결정되었다.

D. 결합 친화성

hVEGF에 대한 A4.6.1 및 B2.6.2 하이브리도마에 의해 생성된 항-hVEGF 모노클로날 항체의 친화력을 경쟁 결합 분석에 의해 측정하였다. 정해진 최적 농도 가운데 하나의 농도로 모노클로날 항체를 20,000-40,000 cpm¹²⁵I-hVEGF(1-2 ng) 및 각종 양(이미 알고 있는 양)의 비표지된 hVEGF(1-1000 ng)가 함유된 시료에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 방치한 후에, 염소 항-마우스 Ig 항혈청(Pel-Freez, Rogers, AR USA) 100 μl를 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 더 인큐베이션시켰다. 4 ℃에서 6% 폴리에틸렌 글리콜(PEG, 몰 중량 8000) 500 μl를 첨가하고, 이어서 4 ℃에서 2000 x G로 20분 동안 원심분리시켜 항체와 결합된 단백질의 복합체(면역 복합체)를 침전시켰다. 각 시료 중의 항-hVEGF 모노클로날 항체에 결합된¹²⁵I-hVEGF의 양을 감마 카운터 중의 펠렛화된 물질을 계수함으로써 측정하였다.

친화력 상수를 스캣챠드 분석에 의해 상기 데이타로부터 계산하였다. A4.6.1 하이브리도마에 의해 생성된 항-hVEGF 모노클로날 항체의 친화력은 1.2 x 10⁹리터/몰인 것으로 계산되었다. B2.6.2 하이브리도마에 의해 생성된 항-hVEGF 모노클로날항체의 친화력은 2.5 x 10⁹리터/몰인 것으로 계산되었다.

E. hVEGF 유사 분열 촉진 활성의 억제

소 부신피질 모세혈관 내피 (ACE) 세포[Ferrara, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 5773 (1987)]를 12 멀티웰 플레이트 중에 10⁴세포/ml의 밀도로 시딩하고, hVEGF 2.5 ng/ml를 A4.6.1 또는 B2.6.2 하이브리도마에 의해 생성된 다양한 농도의 항-hVEGF 모노클로날 항체, 또는 무관한 항-HGF 항체의 존재 또는 부재하에 각 웰에 첨가하였다. 5일 동안 배양한 후, 각 웰의 세포를 코울터 계수기로 계수하였다. 대조군으로서 ACE 세포를 hVEGF 첨가하지 않고 배양시켰다.

제2도에 나타낸 바와 같이, 항-hVEGF 모노클로날 항체들은 모두 소 ACE 세포의 성장 또는 생존을 지지하기 위해 첨가된 hVEGF의 능력을 억제하였다. A4.6.1 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체는 hVEGF의 유사 분열 촉진 활성을 완전히 억제한 반면 (약 90% 이상 억제함), B2.6.2 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체는 hVEGF의 유사 분열 촉진 활성을 부분적으로만 억제하였다.

F. hVEGF 결합의 억제

소 ACE 세포를 10% 송아지 혈청, 2 mM 글루타민, 및 1 ng/ml 염기성 섬유 아세포 성장 인자를 함유하는 둘베코 변형된 이글스 배지 (DMEM) 중의 24 웰 마이크로타이터 플레이트에 2.5 x 10⁴세포/0.5 ml/웰의 밀도로 시딩했다. 밤새 배양시킨 후에, 세포를 결합 완충액(동일 부피의 DMEM 및 F12 배지 + 25 mM HEPES 및 1% 소 혈청 알부민)으로 4 ℃에서 한번 세척하였다.

12,000 cpm¹²⁵I-hVEGF(약 5 x 10⁴cpm/ng/ml)를 A4.6.1, B2.6.2, 또는 A2.6.1 하이브리도마(총 부피 250 μl)에 의해 생성된 항-hVEGF 모노클로날 항체 5μg으로 30분 동안 예비인큐베이션시킨 후에, 그 혼합물을 마이크로타이터 플레이트 중의 소 ACE 세포에 첨가하였다. 세포를 4 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 세포를 4 ℃에서 결합 완충액으로 3회 세척하고, 0.2 N NaOH 0.5 ml를 첨가하여 가용화시키고 감마 계수기로 계수하였다.

제3도(상단)에서 알 수 있는 바와 같이, A4.6.1 및 B2.6.2 하이브리도마에 의해 생성된 항-hVEGF 모노클로날 항체는 소 ACE 세포에 대한 hVEGF의 결합을 억제하였다. 대조적으로, A2.6.1 하이브리도마에 의해 생성된 항-hVEGF 모노클로날 항체는 소 ACE 세포와 hVEGF의 결합에 대한 뚜렷한 효과를 나타내지 않았다. 상기한 세포 증식 분석에서 얻어진 결과와 일치하는 결과로, A4.6.1 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체는 B2.6.2 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체 보다 더 큰 정도로 hVEGF의 결합을 억제하였다.

제3도(하단)에서 알 수 있는 바와 같이, A4.6.1 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체는 항체에 대한 hVEGF의 1:250 몰비로 소 ACE 세포에 대한 hVEGF의 결합을 완전히 억제하였다.

G. 기타 VEGF 이소 형태와의 교차 반응성

A4.6.1 하이브리도마에 의해 생성된 항-hVEGF 모노클로날 항체가 hVEGF의 121- 및 189-아미노산 형태와 반응성이 있는 여부를 결정하기 위하여, 이들 폴리펩티드를 면역침전시키는 항체의 능력을 분석하였다.

인간 293 세포를 상기한 바와 같이 121- 및 189-아미노산 hVEGF 폴리펩티드의 서열을 코딩하는 뉴클레오티드을 포함하는 벡터로 형질감염시켰다[Leung, et al., Science 246: 1306 (1989)]. 형질감염시킨지 2일 후에, 세포를 시스테인과 메티오닌 결핍된 배지로 옮겼다. 세포를 이 배지에서 30분 동안 인큐베이션시키고,³⁵S-메티오닌 및³⁵S-시스테인을 100 μCi/ml씩 배지에 첨가하고, 세포를 2시간 동안 더 인큐베이션시켰다. 세포를 무혈청 배지에 옮기고 3시간 동안 인큐베이션시킴으로써 표지화를 행하였다. 세포 배양 배지를 모으고, 세포를 용균 완충액(150 mM NaCl, 1% NP40, 0.5% 데옥시콜레이트, 0.1% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 50 mM Tris, pH 8.0)에서 30분 동안 인큐베이션시켜 용해시켰다. 이 용해물을 200 x G에서 30분 동안 원심분리시켜 그로부터 세포 잔해를 제거하였다.

세포 배양 배지 및 세포 용해물의 시료 500 μl를 4 ℃에서 1시간 동안 A4.6.1 하이브리도마 항체(2.4 mg/ml) 2 μl와 함께 인큐베이션시킨 다음, 4 ℃에서 1시간 동안 토끼 항-마우스 IgG 면역글로불린 5 μl와 함께 인큐베이션시켰다.³⁵S-표지된 hVEGF 및 항-hVEGF 모노클로날 항체의 면역 복합체를 단백질-A 세파로스(파르마시아 제품)로 침전시킨 다음, 환원 조건하에 SDS-12% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동시켰다. 겔을 X-선 필름으로 노출시켜 방사선사진술에 의해 면역 침전된 방사능 표지 단백질을 분석했다.

이 분석의 결과는 A4.6.1 하이브리도마에 의해 생성된 항-hVEGF 모노클로날항체가 hVEGF의 121- 및 189-아미노산 형태 모두와 교차 반응성이 있는 것임을 나타내었다.

실시예 3

hVEGF 수용체 - IgG 융합 단백질의 제조

flt hVEGF 수용체의 뉴클레오티드 및 아미노산 코딩 서열은 문헌[Shibuya, et al., Oncogene 5: 519-524 (1990)]에 기재되어 있다. flt hVEGF 수용체의 세포외 도메인의 코딩 서열을 인간 IgG1 중쇄의 코딩 서열에 2 단계 과정으로 융합시켰다.

위치지정 돌연변이유발법을 이용하여 BstB1 제한 부위를 flt의 아미노산 759을 위한 코돈의 5' 위치에서 flt 코딩 DNA에 도입하고 플라스미드 pBSSKFC 안에 유일한 BstEII 제한 부위[Bennett, et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067(1991)]를 BstBI로 전환시켰다. 이 변형된 플라스미드를 EcoRI 및 BstB1로 잘라 생긴 플라스미드 DNA의 큰 단편은 flt hVEGF 수용체의 세포외 도메인(아미노산 1-758)을 코딩하는 flt DNA의 EcoRI-BstBI 단편과 라이게이션시켰다.

얻어진 구조물을 Clal와 Notl로 잘라 약 3.3 kb 단편들을 얻은 후, 이를 포유동물의 발현 벡터 pHEBO2 (Leung, et al, Neuron 8:1045(1992))의 다중 클로닝 부위에 라이게이션시켜 삽입했다. 3.3 kb 단편의 말단을 예를 들면 링커를 추가하여 변형시킨 후 이 단편을 발현 맞는 올바른 배열로 벡터에 삽입한 삽입체를 얻었다.

포유동물 숙주세포(예를 들면, CEN4 세포(Leung, et al, 앞의 책))를 전기천공법을 써서 flt 삽입체 포함 pHEBO2 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포들은 막 10 % 태송아지 혈청과 2 mM 글루타민과 항생제가 함유된 배지에서 배양하고 약 75 % 컨플루언스(confluence)일 때, 혈청이 없는 배지로 옮겼다. 회수하기 전 3-4일 동안 배지를 조정하고 문헌(Bennett, et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991))에 기재된 바와 같이 이 조정 배지로부터 단백질-A 친화성 매트릭스를 이용한 크로마토그래피를 통해 flt-IgG 융합 단백질을 정제했다.

실시예 4

hVEGF 길항제에 의한 종양 성장 억제

배양액 내에서 증식하는 각종 인간 종양 세포주를 ELISA에 의해 hVEGF의 생성에 대해 분석하였다. 난소, 폐, 결장, 위, 유방 및 뇌 종양 세포주가 hVEGF를 생산한다는 것이 밝혀졌다. hVEGF를 만드는 3개의 세포주, 즉 NEG 55(G55라고도 불림) (독일 함부르크시 University Hospital eppendor의 신경외과에서 근무하는 Dr. M. Westphal로부터 얻은 인간 신경교종 세포주), A-673 (American Type Culture Collection(ATCC), Rockville, Maryland USA 20852로부터 입수한, 세포주 번호가 CRL 1598인 횡문근육종 세포주) 및 SK-LMS-1(ATCC로부터 입수한 세포주 번호가 HTB 88인 평활근육종 세포주)이 추가 연구시에 사용되었다.

6 내지 10주 된 베이지/누드 마우스 암컷(Charles River Laboratory, Wilmington, Massachusetts USA)에게 PBS 100-200 μl 중의 1-5 x 10⁶종양 세포를 피하 주사했다. 종양 성장이 이루어진 후, 여러 다른 시간대에 A4.6.1 항-hVEGF 모노클로날 항체, 무관한 항-gp120 모노클로날 항체 (5B6) 또는 PBS를 다양한 용량으로 일주일에 한번이나 두번씩 마우스의 복강 내로 주사하였다. 종양의 크기를 매주 측정하였고 이 연구가 끝난 후 그 종양들을 베어내어 무게를 쟀다.

다양한 양의 A4.6.1 항-hVEGF 모노클로날 항체가 마우스의 NEG 55 종양 성장에 미치는 영향은 제4도와 제5도에서 보여준다. 제4도에 나타낸 바와 같이, NEG 55 세포로 접종한 후 일주일부터 25 μg 또는 100 μg의 A4.6.1항-hVEGF 모노클로날 항체로 처리한 마우스는 무관한 항체나 PBS로 처리된 마우스들에 비해 상당히 감소된 종양 성장 속도를 보였다. 제5도에서 보는 바와 같이, NEG 55 세포로 접종한 지 5주 후, A4.6.1 항-hVEGF 모노클로날 항체로 처리된 마우스 내의 종양 크기는 무관한 항체나 PBS로 처리된 마우스의 종양 크기보다 약 50 %(항체 투여량 25 μg으로 처리된 마우스의 경우) 내지 85 %(항체 투여량 100 μg으로 처리된 마우스의 경우) 더 작았다.

A4.6.1 항-hVEGF 모노클로날 항체가 마우스의 SK-LMS-1 종양 성장에 미치는 영향은 제6도에서 보여준다. SK-LMS-1 세포로 접종한 지 5주 후, A4.6.1 항-hVEGF 항체로 처리된 마우스의 종양의 평균 크기는 무관한 항체나 PBS로 처리된 마우스들의 종양 크기보다 약 75% 작았다.

A4.6.1 항-hVEGF 모노클로날 항체가 마우스의 A673 종양 성장에 미치는 영향은 제7도에서 보여준다. A673 세포로 접종한 지 4주 후, A4.6.1 항-hVEGF 항체로 처리된 마우스의 종양의 평균 크기는 무관한 항체나 PBS로 처리된 마우스들의 종양 크기 보다 약 60%(항체 투여량 10 μg으로 처리된 마우스의 경우) 내지 90 % 이상(항체 투여량 50-400 μg으로 처리된 마우스의 경우)더 작았다.

실시예 5

배양액에서 증식하는 종양 세포에 대한 항-hVEGF 항체의 직접적인 영향의 분석

NEG 55 인간의 신경 교아종 세포나 A673 횡문근육종 세포를 멀티웰 플레이트(12 웰/플레이트) 안에 10 % 태송아지 혈청과 2 mM 글루타민과 항생제가 함유된 F12/DMEM 배지에 7 x 10³세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 이어서, A4.6.1 항-hVEGF 항체를 세포 배양액에 첨가하여 최종 농도를 0-20.0 μg 항체/ml로 되게 하였다. 5일 후에 웰에서 성장하는 세포들을 트립신에 노출하여 분리시킨 후, 코울터 계수기를 사용하여 계수하였다.

제8도와 제9도는 이들 연구의 결과를 보여준다. 명백히 알 수 있는 바와 같이, A4.6.1 항-hVEGF 항체는 배양액 중에서의 NEG 55 또는 A673 세포의 성장에 어떠한 중대한 영향을 주지 않았다. 이 결과는 A4.6.1 항-hVEGF 항체가 세포 독성이 없음을 나타내며, 그 항체의 관찰된 항종양 효과가 VEGF 개재성 혈관 신생을 억제하여 발생한 것임을 강력하게 암시한다.

실시예 6

내피 세포 화학주성에 주는 항-hVEGF 항체의 영향

단핵세포와 임파세포를 포함하는 내피 세포 또는 다른 세포들의 화학주성은 류머티스성 관절염의 병원성에 중요한 역활을 한다. 내피 세포의 이동과 증식은 류머티스성 활막에서 생기는 맥관 형성을 수반한다. 혈관화된 조직은 (판누스) 관절 연골을 침입하여 파괴한다.

hVEGF 길항제가 이 과정을 방해하는지 알기 위해서, A4.6-1 항-hVEGF 항체가 류머티스성 관절염 환자로부터 얻어진 활막액에 의해 자극된 내피 세포의 화학주성에 미치는 영향을 분석하였다. 대조군으로서 항-hVEGF 항체가 골관절염 환자로부터 얻어진 활막액에 의해 자극된 내피 세포의 화학주성에 미치는 영향을 분석하였다.

내피 세포의 화학주성은 확립된 방법에 따라 변형된 보이덴실을 사용하여 분석되었다[Thompson et al., Cancer Res. 51:2670(1991); Phillips, et al., Proc. Exp. Biol. Med. 97:458(1991) 참조]. 약 10⁴개의 인간의 개정맥 내피 세포를 0.1 % 태송아지 혈청을 포함하는 배양 배지 중의 48개 웰의 미소 챔버 안에서 젤라틴 코팅된 여과기(0.8 미크론 세공 크기)에 달라 붙도록 했다. 약 2시간 후에 그 미소 챔버를 뒤집어 시험 시료(류머티스성 관절염 활막액, 골관절염 활막액, 염기성 FGF(bFGF), (최종 농도가 1 μg/ml로 되게) 또는 PBS)와 A4.6.1 항-hVEGF 항체(최종 농도가 10 μg/ml로 되게)를 웰에 첨가하였다. 2-4시간 후에 이동된 세포들을 염색하여 세었다.

제10도는 이 연구들의 평균치를 보여준다. "활막액"으로 표시된 란과 대조를 위한 그 페이지의 밑에 있는 값들은 활막액이나 bFGF 또는 PBS만의 존재 하에서 이동된 내피 세포의 평균치이다. "활막액 + mAB VEGF"로 표시된 란에 있는 값들은 활막액과 첨가된 A4.6.1 항-hVEGF 항체의 존재 하에서 이동된 내피 세포의 평균치이다. "% 억제"로 표시된 란의 값들은 A4.6.1 항-hVEGF 항체의 첨가로 인해 활막액에 의해 유도된 내피 세포 이동의 % 감소를 나타낸다. 제시된 바와 같이, A4.6.1 항-hVEGF 항체는 골관절염의 활막액(평균 13.64 % 억제)이 아닌, 류머티스성 관절염의 활막액의 활성(평균 53.40 % 억제)을 상당히 억제하여 내피 세포의 이동을 유도하였다.

Claims

인간 혈관 내피세포 성장 인자 (hVEGF)에 결합해서 이에 대한 억제 효과를 나타낼 수 있는, hVEGF 수용체(hVEGFr)의 세포외 도메인을 포함하는 hVEGFr 변이체를 포함하는 hVEGF 길항제.
제1항에 있어서, 상기 hVEGFr 변이체가 가용성 hVEGFr인 hVEGF 길항제.
제2항에 있어서, 상기 hVEGFr이 flt 수용체인 hVEGF 길항제.
제2항에 있어서, 상기 hVEGFr이 flk-1 수용체인 hVEGF 길항제.
제1항에 있어서, 상기 hVEGFr 변이체가 비(非)-hVEGFr 폴리펩티드에 융합된 hVEGF 길항제.
제5항에 있어서, 상기 비-hVEGFr 폴리펩티드가 면역글로불린 쇄인 hVEGF 길항제.
제6항에 있어서, flt 단편이 IgG1 중쇄 도메인에 융합된 hVEGF 길항제.
제1항에 있어서, 상기 hVEGFr 변이체에 접합된 중합체를 더 포함하는 hVEGF 길항제.