KR100225763B1

KR100225763B1 - 항생 물질 ge 2270 인자의 아미드

Info

Publication number: KR100225763B1
Application number: KR1019930701997A
Authority: KR
Inventors: 파올로 타베치아; 서지오 로시우로; 로메오 시아배티; 엔리코 셀바
Original assignee: 클라우디오 쿼르타; 바이오써치 이탈리아 에스.피.에이.
Priority date: 1991-01-03
Filing date: 1992-01-02
Publication date: 1999-10-15
Anticipated expiration: 2012-01-02
Also published as: JP3183508B2; CN1063110A; HU9301941D0; FI932944L; US5599791A; HUT64085A; KR930703355A; EP0565567B1; AU662122B2; MX9200015A; ES2067325T3; DE69201236D1; CA2093219C; DE69201236T2; JPH06504768A; FI932944A0; HU224072B1; ZA927B; IL100572A0; EP0565567A1

Abstract

본 발명은 항생 물질 GE 2270 화합물의 신규 아미드 유도체 및 그의 제조 방법을 제공한다. 상기 아미드 유도체는 그람양성균 및 그람음성균에 대해 활성을 갖는 항균제이다.

Description

[발명의 명칭]

항생 물질 GE 2270 인자의 아미드

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 하기 일반식(I)의 항생 물질 GE 2270의 신규한 아미드 유도체 및 그의 제약학적 부가염에 관한 것이다.

상기 식 중, R은 수소, 히드록시메틸 또는 메톡시메틸을 나타내고, R₁은 수소 및 메틸을 나타내고, Y는 식의 기를 나타내고, R₂는 수소, (C₁-C₄)알킬, 아미노(C₂-C₄)알킬, (C₁-C₄)알킬아미노-(C₁-C₄)알킬 또는 디-(C₁-C₄)알킬아미노-(C₁-C₄)알킬을 나타내고, R₃은 수소, 카르복시; 술포; 포스포노; 저급 알콕시카르보닐 또는 벤질옥시카르보닐기에 의해 임의로 보호된 아미노; (C₁-C₄)알킬아미노(여기서, 알킬 부분은 카르복시기에 의해 임의 치환됨); 디-(C₁-C₄)알킬아미노; 히드록시; 할로; (C₁-C₄)알콕시(여기서, 알킬 부분은 카르복시기에 의해 임의 치환됨); (C₁-C₄)알콕시카르보닐; 메르캅토; (C₁-C₄)알킬티오(여기서, 알킬 부분은 카르복시기에 의해 임의 치환됨); 카르복시, 술포, 히드록시, 할로 및 메르캅토로부터 선택되는 치환체 1 내지 3개로 임의 치환되는 페닐; 카르바밀; (C₁-C₆)알킬카르바밀(여기서, 알킬 부분은 카르복시, 아미노, (C₁-C₄)알킬아미노 및 디-(C₁-C₄)알킬아미노로부터 선택되는 치환체 1 또는 2개로 임의 치환됨); 디-(C₁-C₄)알킬카르바밀(여기서, 알킬 부분은 인접하는 질소 원자와 함께 5 내지 7원의 포화 헤테로시클릭 고리를 나타낼 수 있으며, 이 고리는 고리 탄소 중의 어느 하나 상에서 카르복시 또는 카르바밀기로 임의 치환되고 또한 O, S 및 N으로부터 선택되는 추가의 헤테로 기를 임의로 함유할 수 있음); 벤조일아미노(여기서, 페닐기는 1 내지 3개의 히드록시기로 치환될 수 있음), 질소 함유 5 내지 6원 헤테로시클릭 고리(이 고리는 불포화, 부분 포화 또는 완전 포화될 수 있고, N, S 또는 O로부터 선택되는 헤테로 원자 1 내지 3개를 더 함유할 수 있으며, 고리 탄소 중의 하나는 카르복시, 술포, 카르복시(C₁-C₄)알킬 및 술포(C₁-C₄)알킬기를 임의로 함유할 수 있으며, 고리의 질소 원자는 (C₁-C₄)알킬, 카르복시(C₁-C₄)알킬, 술포(C₁-C₄)알킬 및 벤질에 의해 임의 치환될 수 있음)로부터 선택되는 1 내지 3개의 치환체를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄(C₁-C₄)알킬기, 카르복시 또는 술포에 의해 임의 치환된(C₃-C₆)알케닐, 1-데옥시-1-글루시틸, 2-데옥시-2-글루코실, 완전 포화된 질소 함유 5 내지 7원 헤테로시클릭 고리(여기서, 질소 원자는 (C₁-C₄)알킬 또는 벤질에 의해 임의 치환될 수 있으며, 고리 골격내에 존재하는 1 또는 2개의 탄소(C₁-C₄)알킬, 카르복시 및 술포로부터 선택되는 치환체를 함유할 수 있음)를 나타내거나, 또는 R₂및 R₃은 인접하는 질소 원자와 함께 완전 포화된 5 내지 7원 헤테로시클릭 고리(이 고리는 O, S 및 N으로부터 선택되는 헤테로 원자를 임의로 더 함유할 수 있으며, 고리 탄소 상에서 (C₁-C₄)알킬, 벤질, 카르복시, 술포, 카르복시(C₁-C₄)알킬 및 술포(C₁-C₄)알킬로부터 선택되는 1 또는 2개의 치환체를 임의로 함유할 수 있음)를 나타내고, R₄는 수소, 메틸 또는 히드록시메틸을 나타내고, 단 R₄가 수소 또는 히드록시메틸인 경우, R은 메톡시메틸이고 동시에 R₁은 메틸이다.

또한, 본 발명은 하기 일반식(II)의 대응하는 출발 화합물로부터 본 발명의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

식 중, W는 카르복실 관능기 또는 그의 활성화 에스테르이다.

항생 물질 GE 2270은 플라노비스포라 로세아(Planobispora rosea) ATCC 53773 시료 또는 그의 생산 변이체 또는 돌연변이체를 배양시키고, 균사체 및(또는) 발효 브로스(broth)로부터 목적하는 항생 물질을 단리시킴으로써 제조할 수 있다. 플라노비스포라 로세아 ATCC 53773은 토양 시료로부터 단리시켜서, 부다페스트 조약의 규정 하에 미합중국 20852 메어리랜드주 록빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 1988년 6월 14일자로 기탁하였다.

이 균주는 수탁 번호 ATCC 53773이 부여되었다.

항생 물질 GE 2270 인자 A는 항생 물질 GE 2270 복합체의 주성분이다.

항생 물질 GE 2270 인자 A 및 플라노비스포라 로세아 ATCC 53773은 유럽 특허 출원 공개 제359062호에 기재되어 있다.

최근 연구에 따르면, 항생 물질 GE 2270 인자 A는 하기 일반식(III)으로 나타낼 수 있는 것으로 밝혀졌다.

항생 물질 GE 2270 인자 A를 선택적 가수 분해 조건하에서 처리하면, 항생 물질 GE 2270 인자 A₁, A₂및 A₃으로 명명된 몇개의 유도체가 얻어진다. 상기 인자 A₁, A₂및 A₃과 이들을 제조하기 위한 가수 분해 방법은 유럽 특허 출원 공개 제406745호 및 미합중국 특허 출원 제547647호에 기재되어 있다.

일반적으로, 상기 가수 분해 조건은 완충시키거나 또는 완충시키지 않은 수성 산성 매질과 극성 유기 용매의 혼합물을 이용하는 것을 포함한다. 반응 온도는 사용된 산의 강도 및 농도와 같은 요인에 따라 가변적이며, 일반적으로 -10℃ 내지 90℃이다. 또한, 반응 시간은 온도, 산 강도 및 산 농도와 같은 변수에 따라 상당히 가변적이며, 일반적으로 수 분 내지 수 시간일 수 있다.

일반적으로, 온화한 가수 분해 조건이 이용되는 경우, 즉 반응 시간이 짧고 반응 온도가 낮으며 산 강도 또는 농도가 낮은 경우에는, 통상적으로 항생 물질 GE 2270 인자 A₁이 얻어지지만, 가수 분해 조건이 보다 강한 경우에는 항생 물질 GE 2270 인자 A₂가 얻어진다. 항생 물질 GE 2270 인자 A₃을 얻기 위해서는, 훨씬 더 격렬한 가수 분해 조건이 필요하다.

항생 물질 GE 2270 인자 A₂및 A₃은 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 출발물질로서 직접 이용할 수 있지만, 항생 물질 GE 2270 인자 A₁은 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 출발물질로서 적당하지 못하다. 그러나, 후술하는 바와 같이 항생 물질 GE 2270 인자 A₁은 상기 출발 물질의 전구체로서 이용할 수 있다.

항생 물질 GE 2270 인자 A₂및 A₃은 그 분자의 상부쪽에 각각 에스테르 및 카르복시 관능기를 갖는 특징이 있다. 특히, 항생 물질 GE 2270 인자 A₂및 A₃은, W가 COOH(항생 물질 GE 2270 인자 A₃인 경우) 또는 에스테르 부분(항생 물질 GE 2270 인자 A₂인 경우)을 나타내고,

R이 메톡시메틸이고, R₁이 메틸이고, R₄가 메틸인 일반식(II)로 나타낼 수 있다.

본 발명의 화합물을 제조하기 위한 출발 물질로서 적합하기로는 항생 물질 GE 2270 인자 A₂및 인자 A₃(및 이들의 화합물)을 모두 사용할 수 있지만, 보다 바람직한 것은 인자 A₃이다. 인자 A₂는 활성화 에스테르로서 직접 사용할 수 있거나, 또는 상기한 바와 같은 격렬한 산 가수 분해 조건을 이용하거나 또는 묽은 알칼리를 사용한 염기성 가수 분해(유럽 특허 출원 공개 제406745호 및 미합중국 특허 출원 제547,647호에 기재됨)을 이용하여 인자 A₃으로 전환시킬 수 있다.

최근, 플라노비스포라 로세아 ATCC 53773 또는 항생 물질 GE 2270을 생산하는 그의 변이체 또는 돌연 변이체의 배양물로부터 기타 다른 소량 성분을 단리시킬 수 있다는 것이 발견되었다(유럽 특허 출원 공개 제451486호 및 미합중국 특허 출원 제665612호). 특히, 이들 소량 성분은 균사체에서 발견될 뿐만 아니라 배양 미생물의 발효 브로스에서도 발견되었다.

균사로체로부터 항생 물질 GE 2270의 상기 소량 성분을 회수하기 위해 바람직한 방법은 여과 또는 원심 분리시킨 균사체를 수혼화성 유기 용매를 이용하여 추출시키고, 추출물을 농축시키고, 조 항생 물질을 (임의로 침전제를 첨가하여) 침전시키거나, 수불혼화성 유기 용매를 사용하여 수성 잔분을 추출하거나 또는 흡착 크로마토그라피시킨 후 흡착 매트릭스로부터 목적물을 용출시키는 방법에 의해 회수하는 것을 포함한다.

최근, 상기 플라노비스포라 로세아 ATCC 53773의 동일 배양물로부터 추가의 소량 성분(인자 C_2a)을 단리시킬 수 있다는 것이 발견되었다(유럽 특허 출원 제91114667.8).

항생 물질 GE 2270 C_2a의 물리 화학적 특성은 다음과 같다.

A) 피킨 엘머 모델(Perkin Elmer) 320 분광계를 이용하여 자외선 흡수 스펙트럼을 측정한 결과, 다음과 같은 최대 흡수 파장을 나타냄 :

B)¹H-NMR 스펙트럼

브루커(Bruker) 분광계를 이용하고, 내부 표준(0.00 ppm) 물질로서 TMS를, 용매로서 DMSO-d₆(헥사듀테로디메틸술폭시드)를 사용하여 250 MHZ에서 항생 물질 GE 2270 인자 C_2a의¹H-NMR 스펙트럼을 측정한 결과 다음과 같은 시그널 군을 나타냄 : [δ, ppm, m] (s=단일선, d=이중선, t=삼중선, m=다중선, Py=피리딘, Tz=티아졸)

9.03, d (NH); 8.70, d (2NH); 8.60, s, 8.54, s, 8.29, s 및 7.38, s (Tz CH); 8.48, m (글리신 NH); 8.43, d 및 8.27, d (Py CH); 7.35-7.20, m (방향족 CH 및 1급 아미드 NH); 6.98, s (1급 아미드 NH); 6.04, d (OH); 5.80, t (OH); 5.35-5.15, m (CH); 5.04, m (페닐세린CH); 4.98, s [CH₂(OCH₃)]; 4.87, d [CH₂(OH)]; 4.81, m 및 4.56, m (옥사졸린 CH₂); 4.35-3.75, m (글리신 CH₂및 프롤린아미드 CH); 3.39, s (OCH₃); 2.71, m 및 1.30, m (아스파라긴 CH₂); 2.48, d (N-메틸 아스파라긴 NCH₃); 2.22-1.80, m (이소프로필 CH 및 프롤린아미드 CH); 0.88 및 0.84, d (발린 CH₃)

C) 역상 HPLC

다음과 같은 역상 HPLC 시스템으로 분석한 결과, 항생 물질 GE 2270 인자 C_2a의 체류 시간(R_t)는 12.6분이었으며, 항생 물질 GE 2270 인자 A(R_t=16.6분)를 기준으로 하였을 때 항생 물질 GE 2270 인자 C_2a의 체류 시간은 0.76이었다 :

칼럼 : 베이커본드(Bakerbond) C8(5㎛) 4.6×250㎜(베이커본드은 미합중국 08865 뉴저지주 필리스버그 소재 J.T. Baker Research Product에서 공급하는 역상 옥틸실릴 실리카겔 HPLC 칼럼의 상표명임)

유속 : 1.8 ml/분

상 A : CH₃CN : 테트라히드로푸란 : 40mM HCOONH₄=40:40:20

상 B : CH₃CN : 테트라히드로푸란 : 40mM HCOONH₄=10:10:80

용출 : 20분 동안 상 A를 20%에서부터 30%까지 선형 구배

검출 : UV 254nm

D) FAB-MS

항생 물질 GE 2270 인자 C_2a의 FAB-MS 주피이크는 1306 달톤이다. 이것은 양성자가 첨가된 분자 이온의 가장 작은 동위 원소에 대응할 것이다. 이 분석은 8kV의 가속 전압 Xe 기체(소스 이온 게이지 상에 표시된 압력이 2×10^-5torr임)를 이용한 새들 필드(saddle field) 원자총을 사용하여, 6kV 전압 및 1mA 전류에서 크라토스(Kratos) MS-50 이중 촛점 질량 분석기로 수행하였다. FAB-MS 분석을 하기 위하여 항생 물질을 0.1 M 아세트산을 함유하는 티오글리세롤 매트릭스와 혼합시켰다.

상기 항생 물질 GE 2270의 소량 성분 중 몇몇 성분(즉, 인자 B₁, B₂, C₁, C₂, C_2a, D₁, D₂및 E)은 상기 일반식(II)에서,

W가부분을 나타내고, R이, GE 2270 인자 C₁및 D₁의 경우에는 수소이고, 인자 B₂의 경우에는 메틸이고, 인자 D₂및 E의 경우에는 히드록시메틸이고, 인자 B₁, C₂및 C_2a의 경우에는 메톡시메틸이고, R₁이, GE 2270 인자 B₁, D₁및 E의 경우에는 수소이고, GE 2270 인자 B₂, C₁, C₂, C_2a및 D₂의 경우에는 메틸이고, R₄가, GE 2270 인자 C₂의 경우에는 수소이고, GE 2270 인자 B₁, B₂, C₁, D₁, D₂및 E의 경우에는 메틸이고, 인자 C_2a의 경우에는 히드록시메틸인 일반식(II)로 나타낼 수 있다.

항생 물질 GE 2270 인자 A로부터 항생 물질 GE 2270 인자 A₂및 A₃을 제조하기 위해 앞에서 약술하고 (유럽 특허 출원 공개 제406745호 및 미합중국 특허 출원 제547,647호에 기재된) 가수분해 방법과 동일한 방법으로 항생 물질 GE 2270 인자 D₁, D₂및 E 또는 이들의 혼합물을 처리하였을 때, 상기 공통 부분 W는 가수분해되어 카르복시 부분으로 전환되지만, 치환체 R, R₁및 R₄는 변하지 않는다.

따라서, W가 카르복시 또는 활성화 에스테르 관능기이고, R이 수소, 히드록시메틸 또는 메톡시메틸이고, R₁이 수소 또는 메틸이고, R₄가 수소, 메틸 또는 히드록시메틸이되, 단 R₄가 수소 또는 히드록시메틸인 경우, R은 메톡시메틸이고 R₁은 메틸인 일반식(II)의 유도체는 본 발명의 출발 물질로서 사용될 수 있다. 다른 미생물의 경우와 마찬가지로, GE 2270 생산 균주의 특성도 변이되기 쉽다는 점은 명백하다. 예를 들면, 그 균주의 인공 변이체 및 돌연 변이체는 UV선, X선, 고주파수 파, 방사선, 및 아질산, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소-구아니딘 등과 같은 화학 물질과 같은 공지된 여러가지 돌연변이 유발 물질로 처리함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 목적상, 항생 물질 GE 2270을 생성하는 플라노비스포라속에 속하는 모든 천연 및 인공 변이체 및 돌연 변이체는 플라노비스포라 로세아 ATCC 53773 균주와 동등한 것으로 간주한다.

본 명세서에서, 단독으로 사용되거나 또는 다른 치환체와 함께 사용되는 알킬이라는 용어는 직쇄 및 분지쇄 탄화수소기를 포함하며, 더 구체적으로 말하자면, (C₁-C₁₄)알킬이라는 용어는 탄소 원자수 1 내지 14의 직쇄 또는 분지쇄 지방족 탄화수소 사슬, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 1-메틸에틸, 부틸, 1-메틸프로필, 1,1-디메틸에틸, 펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 3,3-디메틸-1-부틸, 4-메틸-1-펜틸 및 3-메틸-1-펜틸, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실 및 테트라데실 등을 나타낸다. 마찬가지로, (C₁-C₄)알킬이라는 용어는 상기 예시한 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬과 같은 탄소 원자수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 사슬을 의미한다.

상기한 바와 같이, (C₁-C₁₄)알킬 부분은 1 내지 3개의 치환체를 가질 수 있다.

할로라는 용어는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오드로부터 선택되는 할로겐 원자 라디칼을 의미한다.

본 명세서에서, (C₃-C₆)알케닐이라는 용어는 3 내지 6개의 탄소 원자 및 이중 결합을 갖는 알킬렌 라디칼을 의미하며, 이러한 라디칼로는 프로페닐, 3-부테닐, 2-부테닐, 2-메틸프로페닐, 2-펜테닐, 3-헥세닐 등을 들 수 있으며, 이들은 카르복시 또는 술포기에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 N, S 및 O로부터 선택되는 헤테로 원자 1 내지 3개를 추가로 함유할 수 있는 질소 함유 5 내지 6원 헤테로시클릭 고리라는 용어는 피리딘, 피리미딘, 피라진, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 옥사졸, 옥사졸린, 옥사졸리딘, 피라졸린, 피라졸리딘, 티아졸리딘, 모르폴린, 티오모르폴린, 피롤, 피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 티아디아졸, 옥사디아졸 및 테트라졸과 같은 불포화, 부분 포화 및 완전 포화 고리계를 포함한다.

상기 질소 함유 5 내지 6원 헤테로시클릭 고리에서, 고리내에 존재하는 1 내지 3개의 탄소는 카르복시, 술포, 카르복시(C₁-C₄)알킬 및 술포(C₁-C₄)알킬을 임의로 가질 수 있고, 고리내에 존재하는 질소 원자는 (C₁-C₄)알킬, 카르복시(C₁-C₄)알킬, 술포(C₁-C₄)알킬 및 벤질에 의해 임의로 치환될 수 있다.

질소 원자가 (C₁-C₄)알킬 또는 벤질에 의해 임의로 치환될 수 있는, 완전 포화된 5 내지 7원 질소 함유 헤테로시클릭 고리라는 탄소 골격이 (C₁-C₄)알킬, 카르복시 및 술포로부터 선택되는 치환체 1 또는 2개를 임의로 함유할 수 있으며, (C₁-C₄)알킬 또는 벤질에 의해 임의 치환될 수 있는 질소 원자를 함유하는 완전 포화된 5 내지 7원 헤테로사이클을 의미한다. 상기 헤테로시클릭 고리는잔기의 질소 부분과 헤테로시클릭 잔기의 탄소 원자 사이의 결합을 통해 이 질소 부분과 연결되어 있다. 상기 라디칼의 예로는 1-메틸-4-피롤리디닐, 3-피페리디닐, 1-에틸-4-피페리디닐, 1-벤질-2,6-디메틸-4-피페리디닐 및 4-카르복시-1-메틸-2-피페리디닐을 들 수 있다.

R₂및 R₃이 인접하는 질소 원자와 함께 O, S 및 N으로부터 선택되는 추가의 헤테로 원자를 임의로 함유할 수 있는 완전 포화된 5 내지 7원 헤테로시클릭 고리를 나타내는 경우, 이 표현은 예를 들면 피롤리디노, 모르폴리노, 피페리디노, 피페라지노, 티오모르폴리노, 피라졸리디노, 1,3-옥사졸리디노, 1,3-티아졸리디노 및 헥사히드로아제피노와 같은 헤테로사이클기를 포함한다. 추가로 함유하는 헤테로 원자가 N인 경우, 이 헤테로 원자는 (C₁-C₄)알킬, 벤질, 카르복시, 카르복시(C₁-C₄)알킬, 술포 및 술포(C₁-C₄)알킬로부터 선택되는 치환체를 임의로 함유할 수 있다.

1-데옥시-1-글루시틸이라는 용어는 Y가 글루카민으로부터 유래하는 라디칼, 즉 1-아미노-1-데옥시-글루시톨인 일반식(I)의 화합물을 의미한다. 2-데옥시-2-글루코실이라는 용어는 Y가 글루코사민으로부터 유래하는 라디칼, 즉 2-아미노-2-데옥시글루코스인 일반식(I)의 화합물을 의미한다.

본 발명의 화합물 중 바람직한 군은 R이 메톡시메틸을 나타내고, R₁및 R₄가 메틸기를 나타내며, 다른 치환체들은 상기 정의한 바와 같은 일반식(I)의 화합물이다.

본 발명의 화합물 중 또다른 바람직한 군은 R이 메톡시메틸을 나타내고, R₁및 R₄가 메틸기를 나타내고, Y가 식(여기서, R₂는 수소이고, R₃은 상기 정의한 바와 같음)의 기를 나타내는 일반식(I)의 화합물이다.

본 발명의 화합물 중 또다른 바람직한 군은 R이 메톡시메틸이고, R₁및 R₄가 메틸기이고, Y가 예를 들면 글리신, 오르니틴, 세린, 아스파르트산, 티로신, 로이신, 페닐알라닌, 메티오닌, 프롤린, 트레오닌, 리신과 같은 천연 아미노산, 또는 글리실리신, 세릴프롤린, 글리실프롤린아미드, 티로실프롤린아미드, 트레오닐프롤린아미드, 로이실프롤린아미드와 같은 합성 디펩티드로부터 유래하는 아미노 부분인 일반식(I)의 화합물이다.

또다른 바람직한 화합물 군은 R이 메톡시메틸이고, R₁및 R₄가 메틸이고, Y가 NR₂R₃(여기서, R₂는 수소이고, R₃은 COOH, SO₃H 및 PO₃H₂로부터 선택되는 기로 치환되는 바람직하게는 탄소 원자수 3 내지 12, 더 바람직하게는 탄소 원자수 3 내지 7의 직쇄 알킬 사슬인 일반식(I)의 화합물로 이루어진다.

가장 바람직한 화합물은 R이 메톡시메틸이고, R₁및 R₄가 메틸이고, Y가 식 NR₂R₃(여기서, R₂는 수소이고, R₃은 CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-COOH임)의 기인 일반식(I)의 화합물이다.

본 발명의 화합물 중 또다른 바람직한 군은 R이 수소, 히드록시메틸 및 메톡시메틸이고, R₁이 수소 또는 메틸기이고, Y가 식(여기서, R₂는 수소이고, R₃은 상기 정의한 바와 같음)의 기인 일반식(I)의 화합물이다.

본 발명의 화합물 중 또다른 바람직한 군은 R이 수소, 히드록시메틸 및 메톡시메틸이고, R₁이 수소 또는 메틸기이고, R₄가 수소, 메틸 또는 히드록시메틸이되, 단 R₄가 수소 또는 히드록시메틸인 경우 R은 메톡시메틸이고 R₁은 메틸이며, Y는 예를 들면 글리신, 오르니틴, 세린, 아스파르트산, 티로신, 로이신, 페닐알라닌, 메티오닌, 프롤린, 트레오닌, 리신과 같은 천연 아미노산 또는 글리실리신, 세릴프롤린, 글리실프롤린아미드, 티로실프롤린아미드, 트레오닐프롤린아미드, 로이실프롤린아미드와 같은 합성 디펩티드로부터 유래하는 아미노 부분인 일반식(I)의 화합물이다.

또다른 바람직한 화합물 군은 R이 수소, 히드록시메틸 또는 메톡시메틸이고, R₁이 수소 또는 메틸기이고, R₄가 수소, 메틸 또는 히드록시메틸이되, 단 R₄가 수소 또는 히드록시메틸인 경우 R은 메톡시메틸이고 R₁은 메틸이며, Y가 식 NR₂R₃(여기서, R₂는 수소이고, R₃은 COOH, SO₃H 및 PO₃H₂로부터 선택되는 기로 치환되는 바람직하게는 탄소 원자수 3 내지 12, 더 바람직하게는 탄소 원자수 3 내지 7의 직쇄 알킬 사슬인 일반식(I)의 화합물로 이루어진다.

마지막으로, 바람직한 화합물 군은 R이 수소, 히드록시메틸 또는 메톡시메틸이고, R₁이 수소 또는 메틸이고, R₄가 상기 정의한 바와 같고, Y가 식 NR₂R₃(여기서, R₂는 수소이고, R₃은 CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-COOH임)의 기인 일반식(I)의 화합물이다.

본 발명의 화합물의 대표적인 예로는 R, R₁, R₄및 Y가 상기 정의한 바와 같고,이 다음과 같이 정의되는 일반식(I)의 화합물이다:

(여기서, n은 2, 3 또는 4이다)

(여기서, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다)

(여기서, n은 2, 3, 4 또는 5이고, m은 1, 2, 3 또는 4이다)

(여기서, n은 1, 2 또는 3이고, m은 0, 1 또는 2이다)

본 발명의 화합물은 통상의 방법에 따라 염을 형성할 수 있다.

특히, 식 -NR₂R₃의 기가 추가의 아민 관능기를 함유하는 일반식(I)의 화합물은 산 부가염을 형성한다.

또한, -NR₂R₃부분에 산 관능기를 함유하는 본 발명의 화합물은 염기 부가염을 형성할 수 있다.

일반적으로, 산 및 염기 관능기를 함유하는 본 발명의 화합물은 내부 염을 형성할 수 있다. 본 발명의 범위상, 내부 염은 비염형태의 정의에 포함된다.

본 발명의 화합물의 바람직한 부가염은 제약학적으로 허용되는 산 및(또는) 염기 부가염이다.

제약학적으로 허용되는 산 및(또는) 염기 부가염은 생물학적, 제법적 및 제제학적 관점에서 제약학적 실용성 뿐만 아니라 동물 성장 촉진 용도와 부합할 수 있는 산 및(또는) 염기를 이용하여 얻어지는 염을 의미한다.

일반식(I)의 화합물의 대표적인 적당한 산 부가염은 예를들면, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 숙신산, 시트르산, 아스코르브산, 락트산, 말레산, 푸마르산, 팔미트산, 콜산, 팜산, 점액산, 글루탐산, 캄포르산, 글루타르산, 글리콜산, 프탈산, 타르타르산, 라우르산, 스테아르산, 살리실산, 메탄술폰산, 도데실술폰산(에스톨산), 벤젠술폰산, 소르브산, 피크린산, 벤조산, 신남산 등과 같은 유기산 및 무기산을 이용한 표준 반응에 의해 형성된 염을 포함한다.

대표적인 염기의 예로는 나트륨, 칼륨 및 수산화칼륨과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속 수산화물; 암모니아, 및 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올(TRIS), 피콜린과 같은 지방족, 지환족 또는 방향족 유기 아민; 및 리신, 오르니틴, 아르기닌 및 히스티틴과 같은 염기성 아미노산이 있다.

본 발명의 유리 아미노 또는 비염 화합물을 대응하는 부가염으로 전환시키는 것, 및 이와는 반대로 본 발명의 화합물의 부가염을 비염 또는 유리 아미노 형태로 전환시키는 것은 통상적인 기술의 범위이며, 본 발명은 이를 포함한다.

예를 들면, 일반식(I)의 화합물은 비염 형태를 수성 용매 중에 용해시키고, 선택된 산 또는 염기를 약간 과량(몰량 기준)으로 첨가함으로써 대응하는 산 또는 염기 부가염으로 전환시킬 수 있다. 이어서, 이 결과 얻은 용액 또는 현탁액을 동결 건조시켜서 목적 염을 회수한다. 어떤 경우에는, 동결 건조 대신에, 유기 용매를 이용하여 추출시키고, 분리된 유기상을 작은 부피가 되도록 농축시키고, 비용매를 첨가하여 침전시킴으로써 최종 염을 회수할 수 있다.

비염 형태 화합물이 가용성인 유기 용매중에서 최종 염이 불용성인 경우에, 최종 염은 비염 형태 화합물의 유기 용액에 선택된 산 또는 염기를 약간 과량(몰량 기준)으로 또는 화학양론량으로 첨가한 후 이 유기 용액으로부터 여과시켜서 회수한다.

비염 형태는 대응하는 산 또는 염기 부가염을 수성 용매 중에 용해시킨 후 중성화시켜서 비염 형태를 유리시킴으로써 제조할 수 있다. 이어서, 비염 형태는 예를 들면 유기 용매를 이용하여 추출시켜서 회수하거나, 또는 선택된 산 또는 염기를 첨가하고 상기와 같이 처리하여 또다른 염기 또는 산 부가염으로 전환시킨다.

중성화시킨 후 탈염시키는 것이 필요한 경우에는, 통상적인 탈염 방법을 이용할 수 있다.

예를 들면, 조절된 다공성 폴리덱스트란 수지(예: 세파덱스(Sephadex) LH20) 또는 실란화 실리카겔 상에서의 칼럼 크로마토그래피가 통상적으로 이용될 수 있다. 수용액으로 불필요한 염을 용출시킨 후, 물 및 극성 또는 비극성 유기 용매의 혼합물을 선형 구배시키거나 또는 단계적으로 구배시켜서 예를 들면 아세토니트릴/물을 50:50에서부터 아세토니트릴 약 100%까지 구배시켜서 목적하는 생성물을 용출시킨다.

당업계에 공지된 바와 같이, 제약학적으로 허용되는 산(염기) 또는 비(非)제약학적으로 허용되는 산(염기)를 이용한 염 형성은 통상의 정제 기술로서 이용될 수 있다. 일반식(I)의 화합물의 염 형태를 형성시키고, 단리시킨 후, 이 염 형태를 대응하는 비염 또는 제약학적으로 허용되는 염으로 전환시킬 수 있다.

몇몇 경우에서, 일반식(I)의 화합물의 산 부가염은 물 및 친수성 용매에서 더 잘 용해되고, 화학적 안정성이 증가된다.

그러나, 일반식(I)의 화합물 및 그들의 염의 특성이 유사하다는 점을 고려할 때, 일반식(I)의 화합물의 생물학적 활성을 취급하면서 본 출원에서 언급하는 사항은 그들의 제약학적으로 허용되는 염에도 적용되며, 또한 이와 반대로 제약학적으로 허용되는 염에 대해서 언급하는 사항은 비염 형태에 대해서 적용된다.

특성의 관점에서 볼 때, 본 발명의 화합물은 사람 또는 동물 치료용 의약 제조시 활성 성분으로서 이용할 수 있다.

특히, 일반식(I)의 항생 물질 GE 2270 화합물의 아미드 유도체는 그람 양성균, 및 그람 양성 및 그람 음성 혐기균에 대해 중요한 활성을 갖는 항균제이다.

본 발명의 화합물을 제조하기 위한 일반적인 방법은 불활성 유기 용매 중에서, 그리고 W가 카르복시인 경우에는 축합제 존재 하에, 일반식(II)의 적당한 항생 물질 GE 2270 화합물을 일반식 HNR₂R₃(여기서, R₂및 R₃은 상기 정의한 바와 같음)의 선택된 아민과 반응(아미드화)시키는 것으로 이루어진다.

식 중, W는 카르복시 또는 활성화 에스테르 관능기이고, R은 수소, 히드록시메틸 또는 메톡시메틸이고, R₁은 수소 또는 메틸이고, R₄는 수소 또는 메틸 또는 히드록시메틸이되, 단 R₄가 수소 또는 히드록시메틸이면, R은 메톡시메틸이고, R₁은 메틸이다.

본 발명의 화합물을 제조하기 위해 아미드화를 수행함에 있어서, 아미드화 반응에 관여하지 않지만 반응 조건에 대해 민감하거나 또는 반응 경로에 악영향을 미치는 예를 들면 불필요한 부산물을 생성시키는 반응 물질의 관능기를 보호시키는 것이 편리하다.

게다가, 아미노산이 아미드화 과정을 방해할 수 있는 아미노, 카르복시 또는 메르캅토기와 같은 추가의 반응성 관능기를 함유하는 경우, 이 관능기들을 이. 그로스(E. Gross) 및 메이엔호퍼(Meienhofer)의 The Peptides 제3권(미합중국 뉴욕주 소재 Academic Press 출판, 1981) 및 엠. 보단츠키(M. Bodanszky)와 에이. 보단츠키(A. Bodanszky)의 The Practice of Peptide Synthesis(독일연방공화국 베를린 하이델베르크 소재 Springer-Verlag 출판, 1984)과 같은 참고 문헌에 기재된 방법과 같이 당업계에 공지된 방법을 이용하여 보호시킨다. 이 보호기들은 아미드화 반응이 일어나는 조건에서 안정하여야 하며, 반응 종결시에는 새로이 형성된 아미드 결합 또는 그 분자 내의 어떠한 다른 부분에 전혀 영향을 미치지 않은 채로 쉽게 제거될 수 있어야 한다.

아미노 관능기를 보호하기 위하여 본 발명의 방법에서 유리하게 이용될 수 있는 N-보호기의 대표적인 예는 1,1-디메틸프로피닐-옥시카르보닐, t-부틸옥시카르보닐, 비닐옥시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 신나밀옥시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐-3,4-디메톡시-6-니트로벤질-옥시카르보닐, 2,4-디클로로벤질옥시카르보닐, 5-벤즈이속사졸릴메틸옥시카르보닐, 9-안트라닐메틸옥시카르보닐, 디페닐 메틸옥시카르보닐, 이소니코티닐옥시카르보닐, 디페닐메틸옥시카르보닐, 이소니코티닐옥시카르보닐, S-벤질옥시카르보닐 등과 같은 옥시카르보닐기에 의해 특징지워지는 카르바메이트 형성 시약이다.

반응성 카르복실산 관능기를 위한 적당한 보호는 예를들면 에스테르 관능기를 형성하는 것이다.

또한, 당업계 숙련자는 본 명세서를 기초로 하여 아민 HNR₂R₃의 어느 관능기를 보호시켜야 할지, 이 관능기들을 어떻게 보호시켜야 할지, 그리고 최종 화합물을 유리시키는데 필요한 적당한 보호기 제거 반응이 무엇인지에 대해 결정할 수 있다.

당업계 숙련자들은 인식하고 있는 바와 같이, 특정 보호기의 궁극적인 선택은 목적하는 특정 아미드 유도체의 특성에 좌우된다. 사실상, 최종 화합물의 이러한 아미드 관능기는 보호기(들) 제거 조건에서 안정하여야 한다.

여러가지 보호기들을 제거하기 위한 조건들이 공지되어 있기 때문에, 당업계 숙련자는 적당한 보호기를 선택할 수 있다.

축합 반응에 유용한 불활성 유기 용매는 반응 과정에 대해 불리하게 방해하지 않으며 출발 항생 물질을 적어도 부분적으로 가용화시킬 수 있는 용매이다.

상기 불활성 용매의 예는 유기 아미드, 글리콜 및 폴리올의 에테르, 포스포르아미드, 술폭시드이다. 바람직한 불활성 용매의 예는 디메틸포름아미드, 디메톡시에탄, 헥사메틸포스포르아미드, 디메틸술폭시드, 디옥산 및 이들의 혼합물이다.

때때로, 물은 반응 조건에 따라 적절하게 이용될 수 있다.

W가 카르복시인 경우 본 발명의 방법에서 이용되는 축합제는 유기 화합물 및 특히 펩티드 합성에서 아미드 결합을 형성하기에 적당한 것이다.

대표적이고 바람직한 축합제의 예는 디페닐-포스포르아지데이트(DPPA), 디에틸-포스포르아지데이트, 디(4-니트로페닐)포스포르아지데이트, 디모르폴릴 포스포르아지데이트와 같은 (C₁-C₄)알킬, 페닐 및 헤테로시클릭 포스포르아지데이트 및 디페닐포스포로클로리데이트 또는 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리피롤리디노 포스포늄헥사플루오로포스페이트(PyBOP)이다. 바람직한 축합제는 디페닐 포스포르아지데이트(DPPA)이다.

본 발명의 방법에 있어서, 아민 반응 물질 HNR₂R₃은 일반적으로 약간 과량(몰량 기준)으로 이용한다.

일반적으로, 1배 내지 2배의 몰 과량이 이용되지만 1.2배 내지 1.5배의 몰 과량이 바람직하다.

아미드화를 진행시키기 위하여, 아민 HNR₂R₃은 출발 항생 물질의 카르복시 관능기와 염을 형성할 수 있는 것이 필요하다. 아민 HNR₂R₃이 선택된 반응 매질에서 이러한 염을 형성하기에 충분할 정도로 강하지 않은 경우에는, 출발 항생 물질에 대해 적어도 등몰량으로 반응 혼합물에 염 형성 염기를 첨가할 필요가 있다.

상기 염 형성 염기의 예로는 트리메틸아민, 트리에틸아민, N-메틸 피롤리딘과 같은 지방족 또는 지환족 3급 유기 아민 또는 피콜린과 같은 헤테로시클릭 염기 등이 있다.

일반적으로, 축합제는 출발 항생 물질 GE 2270 화합물에 대해 약간 과량(몰량 기준)으로 즉, 출발 항생 물질의 1.1 내지 1.5배, 바람직하게는 1.2배의 양으로 이용한다.

이밖에, 아민 반응 물질 HNR₂R₃은 반응 매질에 대응하는 산 부가염, 예를 들면 염산염으로서 도입시키는 것이 편리할 수도 있다. 이러한 경우, 대응하는 염으로부터 HNR₂R₃아민을 유리시킬 수 있는 강염기를 적어도 2배의 몰 과량으로, 바람직하게는 2 내지 3배의 몰 과량으로 이용한다. 또한, 이러한 경우, 적당한 염기는 상기 예시한 바와 같은 삼급 유기 지방족 또는 지환족 아민이다. 사실상, 적어도 몇몇 경우에서는, 특히 아민 HNR₂R₃의 염이 대응하는 유리 아민보다 더 안정한 경우에는, 상기 염기에 의해 자체적으로 유리되는 아민 염을 이용하는 것이 매우 바람직하다.

반응 온도는 특정 출발 물질 및 반응 조건에 따라 상당히 좌우되어 변한다. 일반적으로, 반응은 0 내지 20℃의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다.

또한, 반응 시간은 다른 반응 변수에 따라 상당히 좌우되어 변한다. 일반적으로, 축합 반응은 약 5 내지 24시간 내에서 완결된다.

어떤 경우이든, 반응 과정은 당업계 공지 방법에 따른 TLC, 바람직하게는 HPLC에 의해 모니터한다.

이러한 분석의 결과를 토대로 하여, 당업계 숙련자는 반응 과정을 평가할 수 있으며, 반응을 언제 종결시켜야 하는지를 결정하게 되고, 반응 혼합물에 대한 처리 예를 들면, 용매를 이용한 추출, 비용매 첨가에 의해 침전, 칼럼 크로마토그래피에 의한 추가 분리 및 정제를 포함하는 공지 기술에 의한 처리를 언제 시작해야 하는지를 결정하게 된다.

상기한 바와 같이, HNR₂R₃반응 물질의 보호가 필요한 경우, 주로 관련된 보호기에 따라서 선택한 당업계 공지 기술에 의해 보호된 최종 화합물로부터 보호기를 제거한다.

활성화 에스테르를 GE 2270 출발 물질로 이용하는 경우, 상기 에스테르는, 에스테르화 알코올이 그 분자의 다른 부분에 변경을 가하지 않는 반응 조건하에서 아민 HNR₂R₃에 의해 쉽게 대체되고 치환될 수 있는 이탈기를 제공하는 것이다. 일반적으로, 아민 반응 물질은 상기 용매 및 저급 알칸올로부터 선택되는 용매 중에서 활성화 에스테르에 대해 몰 과량으로 사용한다. 일반적으로, 반응 온도는 0℃ 내지 100℃이다. 활성화 에스테르의 예로는 저급 알킬 에스테르(여기서, 저급 알킬 부분은 시아노 및 니트로에 의해 임의 치환됨), 할로 및 니트로기에 의해 치환된 페닐 에스테르, 및 GE 2270 인자 A₂에 함유된 에스테르 부분을 들 수 있다.

많은 경우에서, 본 발명의 화합물은 한 가지 이상의 방법으로 제조할 수 있으며, 본 발명의 화합물은 공지 반응을 이용하여 또다른 화합물로 전환시킬 수 있다는 점이 명백하다.

아민 HNR₂R₃이 대응 아미드 유도체로 더 전환될 수 있는 카르복시 또는 에스테르 관능기를 함유하는 경우, 일반식(I)의 목적 화합물은 먼저 상기 아민과 선택된 GE 2270 출발 물질을 축합시킨 후, 적당한 아민과 반응시켜서 카르복시 또는 에스테르 관능기를 아미드로 전환시킴으로써 제조할 수 있다.

다음 표에는 본 발명의 화합물 중 대표적인 몇몇 화합물의 구조식(표 I) 및 제조 방법(실시예 부분에서 상세히 기술함), 출발 물질 및 반응 수율(표 II)을 기재하였다.

하기 표(표 I)에는 본 발명의 화합물 중 대표적인 화합물의 구조식을 나타내었다.

[표 1a]

[표 1b]

[표 1c]

[표 1d]

[표 1e]

[표 1f]

[표 1g]

[표 1h]

[표 1i]

[표 1j]

화합물 2, 11, 12, 34, 36은 트리플루오로아세트산염으로서 단리되었다.

[표 2a]

[표 2b]

[표 2c]

[표 2d]

[표 2e]

[표 2f]

[표 2g]

[표 2h]

[표 2i]

[표 2j]

TFA=트리플루오로아세트산

PTSA=p-톨루엔술폰산

[HPLC 분석]

하기 표(표 III)에는 본 발명의 화합물 중 대표적인 화합물의 R_t를 나타내었다.

이 경우, 분석은 10μl 루우프 주입기 및 베어리언(Varian) 2050 가변 파장 검출기(254nm)가 장착된 베어리언 모델 5000 LC 펌프를 이용하여 수행하였다.

[표 3a]

HPLC 분석

K=상대 체류 시간

[표 3b]

K=상대 체류 시간

[표 3c]

K=상대 체류 시간

K=상대 체류 시간=적당한 GE 2270 출발 물질(즉, W가 COOH인 일반식(II)의 화합물)의 R_t에 대한 아미드의 R_t의 비

[실험]

표 IV-NMR

¹H-NMR 스펙트럼은 브루커 분광계를 이용하고, 내부 표준 물질(0.00 ppm)로서 TMS를, 용매로서 DMSO-d₆(헥사듀테로디메틸술폭시드)를 이용하여 250MHz 및 (또는) 500MHz에서 기록하였다.[δ, ppm, m], (s=단일선, br s=브로드 단일선, d=이중선, dd=이중선의 반복, t=삼중선, m=다중선).

표 V-IR

적외선 스펙트럼(IR)은 뉴졸 멀(mull)을 이용하여 피킨 엘머 모델 580 분광 광도계로 기록하였다.

표 VI-UV

자외선 흡수 스펙트럼은 피킨 엘머 모델 320 분광계로 기록하였다.

당업계 숙련자에게는 하기 표 IV, V 및 VI에 나타낸 데이타들이 얻어진 피이크에 대한 모든 값을 나타내는 것이 아니라 단일 물질을 특성화할 수 있는 피이크들의 값만을 나타내는 것이라는 점이 명백해질 것이다.

[표 4a]

NMR 스펙트럼

[표 4b]

[표 4c]

[표 4d]

[표 4e]

[표 4f]

[표 4g]

[표 4h]

[표 4i]

[표 4j]

[표 5a]

IR 스펙트럼

[표 5b]

[표 5c]

[표 5d]

[표 6a]

UV 데이타 λ_max

[표 6b]

[표 6c]

[표 6d]

본 발명의 화합물의 항균 활성은 시험관 내에서의 표준 시험에 의해 입증할 수 있다.

프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 및 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)의 MIC는 한천 희석법(접종물 10⁴/10⁵CFU/스포트))에 의해 결정하였다. 다른 생물체에 대한 MIC는 마이크로브로스 희석법(접종물 10⁴내지 10⁵CFU/ml)에 의해 결정하였다. 배양 시간은 18 내지 24시간이며, 단 인플루엔자균, 프로피오니박테리움 아크네스, 박테로이데스 프라길리스의 배양시간은 48시간이었다. 모든 생물체는 37℃에서 배양하였으며, 인플루엔자균은 5％ CO₂분위기 하에서 배양하였으며, 혐기균은 혐기성 기체 혼합물 중에서 배양하였다. 매질로는, 포도상구균, 대변 연쇄상구균, 대장균, 심상 변형균에 대해서는 이소-센시테스트(Iso-Sensitest) 브로스(옥소이드(Oxoid)사 제품)을 이용하고, 인플루엔자균에 대해서는 브레인 하트 인퓨젼(brain heart infusion) 브로스(디프코(Difco)사 제품)+1％ 보충액 C(디프코사 제품)를 이용하였다.

몇몇 미생물에 대한 최소 억제 농도(MIC, ㎍/ml)를 하기 표 VII에 나타내었다.

[표 7a]

(MIC, ㎍/ml)

[표 7b]

[표 7c]

[표 7d]

[표 7e]

본 발명의 화합물은 그들의 특성을 고려해 볼 때 사람 또는 동물 치료를 위한 의약 제조시 활성 성분으로서 이용될 수 있다.

특히, 일반식(I)의 항생 물질 GE 2270 화합물의 아미드 유도체는 그람 양성균, 및 그람 양성 혐기균 및 그람 음성 협기균에 대해서 중요한 활성을 갖는 항균제이다.

따라서, 본 발명의 항생 물질의 주요 치료 목적은 이 항생 물질에 대해 민감한 미생물이 존재함으로써 야기되는 감염을 치료하는데 있다.

치료라는 용어는 예방, 처치 및 치유를 포함한다.

이러한 치료를 받는 환자는 영장 동물, 특히 사람, 및 말, 소, 돼지 및 양과 같은 다른 포유 동물, 및 가금 및 애완 동물을 포함하는, 이러한 치료를 필요로 하는 동물이다.

본 발명의 화합물은 그 자체로 투여하거나 또는 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 투여할 수 있으며, 또한 다른 항균제와 병용해서 투여할 수 있다. 병용 치료는 먼저 투여한 항균제의 치료 효과가 또다른 항균제를 후속하여 투여하였을 때 완전히 없어지지 않는 방식으로 활성 화합물들을 연속, 동시 및 분리 투여하는 것을 포함한다.

바람직한 제약 제제는 손상되지 않거나 또는 손상된 피부 또는 점막 상에 국부 투여하기에 적당한 제제이다. 이러한 제제의 예로는 분말제, 연고제, 크림제 및 로숀제가 있다. 이러한 제제에 이용되는 부형제로는 유성 연고 기제(예 : 세틸 에스테르 왁스, 올레산, 올리브유, 파라핀, 경랍, 글리세린 연고), 흡수성 연고 기제(예 : 무수 라놀린, 친수성 와셀린), 에멀젼 연고 기제(예 : 세틸 알코올, 글리세릴 모노스테아레이트, 라놀린, 스테아르산), 수용성 연고 기제[예 : 글리콜에테르 및 그의 유도체(폴리에틸렌 글리콜, 폴리(옥시-1,2-에탄에틸)-알파-히드로-오메가-히드록시-옥타데카노에이트, 폴리소르베이트 및 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트)]와 같은 통상적으로 이용되는 제약학적으로 허용되는 비히클이 있다.

이러한 제제는 방부제와 같은 다른 공지 부형제를 함유할 수 있으며, 참고문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 제17판(1985), Mack Publishing Co]에 기재되어 있으며, 공지된 방법에 의해 제조된다.

또한, 본 발명의 화합물은 당업계 공지 방법에 따라 비경구 투여하기에 적당한 제제로 제제화할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 폴리프로필렌 글리콜 또는 디메틸아세트아미드, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 또는 폴리에톡실화된 피마자유와 같은 계면 활성제를 이용하여 제제화한다.

비경구 투여를 위해 바람직한 제제는 크레모포르(Cremophor) EL(폴리옥실 35 피마자유 USP INF) 20％, 프로필렌 글리콜 5 내지 10％와 같은 부형제를 함유한다.

바람직하게는, 이 제제는 본 발명의 항생 물질에 대해 민감한 미생물에 기인하는 감염을 치료하기 위해 정맥내 투여하는데 이용된다.

정맥내 투여에 이용하기에 적당한 제제의 예는 다음과 같다 :

화합물 19 100mg

프로필렌 글리콜 1ml

주사용 증류수 총 부피가 5ml가 되게 하는 양

인산염 완충액(pH 8-8.5)

위장관에 혐기균이 존재함으로써 유발되는 위막 대장염 또는 기타 다른 질병을 치료함에 있어서, 본 발명의 화합물 유효량을 캡슐제 또는 수성 현탁액제와 같은 적당한 제제로 경구 투여할 수 있다.

활성 성분의 투여량은 환자의 유형, 연령 및 증상, 투여하기 위해 선택된 특정 활성 성분 및 제제, 투여 계획 등을 포함하는 여러 가지 요인에 따라 좌우된다.

일반적으로, 단일 단위 투여형에 대해 항균적 유효량을 이용한다. 일반적으로, 이러한 투여형들을 반복 투여, 예를 들면 1일 2 내지 6회 투여하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 유효 투여량은 0.5 내지 50mg/kg(체중)/일이다.

바람직한 국부 투여용 제제는 본 발명의 화합물 1％ 내지 10％를 함유하는 연고제이다.

어쨋든, 처방하는 내과 의사는 특정 증상의 환자에게 적합한 최적 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 화합물은 인체 및 동물 치료시 의약으로서 이용하는 것 이외에, 동물성장 촉진제로도 이용될 수 있다.

이러한 목적을 위해, 본 발명의 화합물은 적당한 사료 중에 함유시켜 경구 투여한다. 이때 사용되는 정확한 농도는, 정상적인 양의 사료를 소비할 때 성장 촉진 유효량의 활성제를 제공하는데 필요한 농도이다.

동물 사료에 본 발명의 활성 화합물을 첨가하는 것은 유효량의 활성 화합물을 함유하는 적당한 사료 프리믹스를 제조하고, 이 프리믹스를 완전 식량에 혼입시켜서 수행하는 것이 바람직하다.

다른 한편, 활성 성분을 함유하는 중간 농축물 또는 사료 보충물을 사료에 혼합시킬 수 있다. 이러한 사료 프리믹스 및 완전 식량을 제조 및 투여할 수 있는 방법은 참고 문헌[Applied Animal Nutrition(미합중국 샌프란시스코 소재 W. H. Freedman and Co. 출판, 1969) 또는 Livestock Feeds and Feeding(미합중국 오레곤주 코르발리스 소재 O and B books 출판, 1977)]에 기재되어 있다.

다음 실시예는 본 발명을 더 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

[본 발명의 실시예]

방법 A-GE 2270 인자 A₃출발 물질과 선택된 아민과의 반응

[실시예 1]

화합물 15, 29, 30, 32, 33의 제조

디메틸포름아미드(DMF) 10ml 중에 GE 2270 인자 A₃(유럽 특허 출원 공개 제406745호에 기재된 방법으로 제조함) 1mmol을 교반시키면서 용해시킨 용액에 선택된 아민 1.2mmol, 트리에틸아민(TEA) 1.4mmol 및 디페닐포스포르아지데이트(DPPA) 1.2mmol을 0℃에서 첨가하였다. (만일 선택된 아민의 염(클로라이드, p-톨루엔술포네이트 등)이 이용된다면, TEA를 2배 이용하여야 한다). 온도가 실온으로 승온하게 하고, 약 4시간 동안 교반을 계속하였다. 이어서, 반응 혼합물을 1N HCl 수용액으로 산성화시켜서 약 pH 3으로 만들고, 이어서 물로 희석시켜서 생성물을 완전 침전시켰다. 습윤 고체를 공기중에서 건조시킨 후, 클로로포름 중에서 메탄올을 3％에서부터 5％까지 구배시켜 용출시킴으로써 실리카겔 60상에서 플래쉬 크로마토그래피(230-400 메쉬 ASTM, 머크사 제품)시켜서 정제하였다. 표제 화합물을 함유하는 분획을 한데 모으고, 용매를 증발시켰다. 고체를 에틸 에테르로 처리하여 표제 화합물을 미분말로서 얻었다.

방법 A1-반응성 관능기(들)(이 관능기들은 모두 보호됨)을 추가 함유하는 선택된 아민과 GE 2270 인자 A₃출발 물질의 반응 및 이에 후속하는 보호기(들)의 제거.

[실시예 2]

화합물 34, 36의 제조

실시예 1에 기재된 방법과 실질적으로 유사하게 반응을 수행하였다. 일단 반응 생성물을 플래쉬크로마토그래피로 정제시키고, 얻어진 고체 1mmol을 차가운 트리플루오로아세트산(TFA) 7ml로 처리하였다. 이와 같이 하여 얻어진 현탁액을 용액이 될 때까지 수 분동안 와류시키고, 차가운 용액에서 TFA를 진공 증발시켰다. 이어서, 소량의 TFA를 여전히 함유하는 고무질 생성물을 에틸 에테르로 처리하여, 표제 화합물을 미분말 형태의 트리플루오로아세트산염으로서 얻었다.

[실시예 3]

화합물 1, 3 내지 10, 18 내지 21, 39의 제조

실시예 1에 기재된 바와 실질적으로 유사한 방법으로 반응을 수행하였다. 일단 반응 생성물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제시키고, 얻어진 고체 1mmol을 디옥산 20ml 중에 용해시키고, 1N NaOH 수용액 1.2ml를 실온에서 교반하에 첨가하였다. 5시간 후, 용액을 1N HCl 수용액으로 산성화시켜서 pH 2로 만들고, 물로 희석시켜서 표제 화합물을 완전 침전시키고, 이 표제 화합물을 여과시켜서, 공기 중에서 건조시킴으로써 표제 화합물을 미분말로서 얻었다.

[실시예 4]

화합물 2의 제조

실시예 3에 기재된 방법으로 반응을 수행하였다. 에스테르 관능기를 가수분해시키자마자, 이 화합물을 공기중에서 건조시키고, 얻어진 고체 1mmol을 TFA 20ml 중에 용해시키고, 키소(Y. Kiso) 등의 방법[Chem. Pharm. Bull. 제28권 제673페이지(1980)]에 따라서 실온에서 교반시키면서 티오아니솔 50mmol을 첨가하였다. 3.5시간 후, 차가운 분위기 하에서 TFA를 진공 증발시키고, 그 잔분을 클로로포름 중의 1％ 메탄올 소량 중에 용해시켰다. 에틸 에테르를 첨가시켜서, 표제 화합물을 침전시키고, 이 침전물을 여과시키고, 다시 에틸 에테르로 세척하고, 진공 건조시켜서 표제 화합물의 트리플루오로아세트산염을 미분말로서 얻었다.

[실시예 4-1]

화합물 37의 제조

실시예 1에 기재된 방법과 실질적으로 유사한 방법으로 반응을 수행하였다. 출발 물질이 반응 혼합물로부터 사라지자마자, 물을 첨가하고, 얻어진 침전물을 여과시키고, 다시 물을 이용하여 세척시키고, 공기 중에서 건조시켰다. 이어서, 얻어진 조 물질을 THF 3ml 중에 용해시키고, 10％ HCl 수용액 존재하에 실온에서 철야 교반시켰다. 물로 희석시켜서 생성물을 완전 희석시키고, 이 생성물을 여과시켜서 공기 중에서 건조시켰다. 이어서, 얻어진 고체는 클로로포름 중에서 메탄올을 2％에서부터 4％까지 구배시키면서 용출시킴으로써 실리카 겔 60(230-400 메쉬, 머크사 제품) 상에서 플래쉬 크로마토그래피시켜서 정제시켰다. 표제 화합물을 함유하는 분획을 한데 모으고, 용매를 증발시켜서 담황색 분말을 얻었다.

방법 B : 보호되지 않은 산 부분을 함유하는 선택된 아민과 GE 2270 인자 A₃출발 물질의 반응

[실시예 5]

화합물 19, 22 내지 28, 40, 41의 제조

DMF 10ml 중에 GE 2270 인자 A₃1mmol 및 TEA 1.5mmol을 교반시키면서 용해시킨 용액에 DPPA 1.1mmol을 0℃에서 첨가하였다. 온도가 실온으로 승온하게 하고, 다시 4.5시간 동안 교반을 계속하였다. 이어서, 이 용액에 선택된 아민 1.5mmol 및 TEA 2mmol을 실온에서 첨가하고, 실온에서 5시간 더 교반시켰다(만일 선택된 아민이 1개 이상의 산 관능기를 함유한다면, TEA의 양은 아미노기를 유리시킬 수 있는 양이 되도록 조정하였다). 이어서, 반응 혼합물을 1N HCl 수용액으로 산성화시켜서 약 pH 2가 되게 한 후, 물로 희석시켜서 생성물을 완전 침전시켰다. 습윤 고체를 공기중에서 건조시킨 후, 클로로포름 중에서 메탄올을 5％에서부터 10％까지 구배시키면서 용출시킴으로써 실리카 겔 60(230-400 메쉬 ASTM, 머크사 제품) 상에서 플래쉬 크로마토그래피시켜서 정제시켰다. 표제 화합물을 함유하는 분획을 한데 모으고, 용매를 증발시켰다. 얻어진 고체를 에틸 에테르로 처리하여 표제 화합물을 미분말로서 얻었다.

방법 B1 : 보호되지 않은 산 기(들)을 함유할 뿐만 아니라 반응성 관능기(들)(이 관능기(들)은 모두 다양하게 보호됨)을 함유하는 선택된 아민과 GE 2270 인자 A₃출발 물질의 반응 및 이에 후속하는 보호기(들)의 제거

[실시예 6]

화합물 11, 12의 제조

실시예 5에 기재된 방법과 실질적으로 유사한 방법으로 반응을 수행하였다. 반응 생성물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제시키자마자, 얻어진 고체 1mmol을 TFA 20ml 중에 용해시키고, 실온에서 교반 하에 티오아니솔 50mmol을 첨가하였다. 3.5시간 후, 차가운 분위기 하에서 TFA를 진공 증발시키고, 잔분을 클로로포름 중의 1％ 메탄올 소량중에 용해시켰다. 에틸 에테르를 첨가해서 표제 화합물을 침전시키고, 여과시켜서, 다시 에틸 에테르로 세척시키고, 진공 중에서 건조시켜서 표제 화합물의 트리플루오로아세트산염을 미분말로서 얻었다.

방법 C-GE 2270 인자 A₃의 선택된 아미드 유도체 출발 물질과 선택된 시약의 반응

[실시예 7]

화합물 1, 5, 10, 6으로 부터 각각 화합물 14, 15, 16, 17의 제조

DMF 10ml 중에 GE 2270 인자 A₃의 적당한 아미드 유도체(상기 실시예들에 기재된 방법으로 제조함) 1mmol을 교반시키면서 용해시킨 용액에 선택된 아민 1.2mmol, TEA 1.4mmol 및 DPPA 1.2mmol을 0℃에서 첨가하였다.(만일 선택된 아민의 염(클로라이드, p-톨루엔술포네이트 등)이 이용된다면, TEA의 양을 2배 이용한다). 온도가 실온으로 승온하게 하고, 약 4시간 동안 교반을 계속하였다. 이어서, 반응 혼합물을 1N HCl 수용액으로 산성화시키면서 약 pH 3이 되게 한 후, 물로 희석시켜서 생성물을 완전 침전시켰다. 습윤 고체를 공기 중에서 건조시킨 후, 클로로포름 중에서 메탄올을 3％에서부터 5％까지 구배시키면서 용출시킴으로써 실리카 겔 60(230-400 메쉬 ASTM, 머크사 제품)상에서 플래쉬 크로마토그래피시켜서 정제하였다. 표제 화합물을 함유하는 분획을 한데 모으고, 용매를 증발시켰다. 고체를 에틸 에테르로 처리해서 표제 화합물을 미분말로서 얻었다.

방법 C1 : 반응성 관능기(들)(이 관능기(들)은 모두 보호됨)을 추가 함유하는 선택된 시약과 선택된 GE 2270 인자 A₃의 아미드 유도체 출발 물질의 반응 및 이에 후속하는 보호기(들)의 제거

[실시예 8]

화합물 3으로부터 화합물 13의 제조

실시예 7에 기재된 방법에 따라서 반응을 수행하였다. 반응 생성물을 플래쉬 크로마토그래피시켜서 정제시키자마자, 얻어진 고체 1mmol을 디옥산 20ml 중에 용해시키고, 실온에서 교반하에 1N NaOH 수용액 1.2ml를 첨가하였다. 5시간 후, 용액을 1N HCl 수용액으로 산성화시켜서 pH 2가 되게 하고, 물로 희석시켜서 표제 화합물을 완전 침전시키고, 여과시켜서, 공기 중에서 건조시킴으로서 표제 화합물을 미분말로서 얻었다.

[실시예 9]

화합물 36으로부터 화합물 31의 제조

메탄올 중의 10％ 클로로포름 10ml 중에 적당한 GE 2270 인자 A₃의 아미드 유도체(상기 실시예들에 기재된 방법으로 제조) 1mmol을 교반시키면서 용해시킨 용액에 TEA 1.2mmol 및 선택된 시약(표 참조) 1.1mmol을 실온에서 첨가하였다. 20분 후, 용매를 진공 증발시키고, 잔분을 5％ Na₂CO₃수용액으로 처리하였다. 얻어진 고체를 여과시키고, 다시 5％ Na₂CO₃수용액 및 물로 세척시키고, 최종적으로 메탄올 10ml 중에 다시 용해시켰다. 이 용액에 물 0.5ml 및 p-톨루엔술폰산 0.1mmol을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 철야 교반시켰다. 이어서, 진공 하에서 용액을 작은 부피(약 2ml)가 될 때까지 감소시키고, 물을 첨가해서 표제 화합물을 침전시키고, 공기 중에서 건조시킨 후, 미분말로서 얻었다.

[실시예 9-1]

화합물 37으로부터 화합물 38의 제조

에탄올 40ml 중에 적당한 GE 2270 인자 A₃의 아미드 유도체(상기 실시예들에 기재된 방법으로 제조함) 0.23mmol을 교반시키면서 용해시킨 용액에 아세트산 9.2mmol, 아세트산나트륨 9.2mmol 및 선택된 시약(표 II 참조) 0.506mmol을 실온에서 첨가하였다. 2시간 후, NaBH₄(플루카(Fluka)사 제품) 0.46mmol을 첨가하고, 동일 온도에서 철야 교반시켰다. 용매를 증발시켜서 조 물질을 얻었으며, 이 물질을 1N HCl 10ml로 세척하고, 여과시켜서, 공기 중에서 건조시켰다. 이어서, 고체를 디클로로메탄 중에서 메탄올을 0％에서부터 10％까지 구배시키면서 용출시킴으로써 실리카겔 60(230-400 메쉬 ASTM, 머크사 제품) 상에서 플래쉬 크로마토그래피시켜서 정제하였다. 표제 화합물의 메틸 에스테르(중간체)를 함유하는 분획을 한데 모으고, 용매를 증발시켜서 고체를 얻고, 이 고체를 디옥산 2ml 중에 용해시키고, 실온에서 1 N NaOH 1.2 몰 과량으로 철야 처리하였다. 용매를 증발시켜서 고체를 얻고, 이 고체를 에틸 아세테이트:메탄올의 혼합물(1:1)로 처리하여 정제함으로써 표제 화합물을 미분말로서 얻었다.

방법 D : GE 2270 인자 A₂출발 물질과 선택된 아민의 반응

[실시예 10]

화합물 35의 제조

메탄올 중에 암모니아를 용해시킨 포화 용액 10ml 중에 GE 2270 인자 A₂(유럽 특허 출원 공개 제406745호에 기재된 방법으로 제조함) 1mmol을 용해시켰다. 이 용액을 3일 동안 실온에서 방치시킨 후 진공 증발시켰다. 잔분을 메탄올 2ml 중에 용해시키고, 표제 화합물을 물로 침전시켜서, 여과시키고, 공기 중에서 건조시켰다. 에틸 에테르로 처리하여 표제 화합물을 미분말로서 얻었다.

방법 E-본 발명의 화합물의 염 제조

[실시예 11]

화합물 19의 아르기닌염 제조

디옥산 180ml 중에 화합물 193g(2.42mmol)을 현탁시킨 현탁액에 물 120ml 중의 L-아르기닌 423mg(2.42mmol)을 용해시킨 용액을 교반하에 첨가하고, 맑지 않은 용액을 동결 건조시켜서 목적 염을 회수하였다.

방법 F-GE 2270 성분 C_2a출발 물질(즉, R이 메톡시메틸이고 R₁이 메틸이고 R₄가 히드록시메틸이고 W가 COOH인 일반식(II)의 화합물)과 반응성 관능기(들)(이 관능기(들)은 모두 보호됨)을 추가로 함유하는 선택된 아민의 반응 및 이에 후속하는 보호기(들)의 제거

[실시예 12]

화합물 42의 제조

실시예 3에서 인자 A₃대신에 GE 2270 성분 C_2a출발 물질을 이용하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 반응을 수행하였다.

방법 G-방법 F에 기재된 GE 2270 성분 C_2a출발 물질과 보호되지 않은 산 부분을 함유하는 선택된 아민과의 반응

[실시예 13]

화합물 42의 제조

실시예 5에서 인자 A₃대신에 GE 2270 성분 C_2a출발 물질을 이용하는 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 방법으로 반응을 수행하였다.

방법 H-GE 2270 성분 D₁출발 물질(즉, R 및 R₁이 수소이고 R₄가 메틸이며 W가 COOH인 일반식(II)의 화합물)과 반응성 관능기(들)(이 관능기(들)은 모두 보호됨)을 추가 함유하는 선택된 아민의 반응 및 이에 후속하는 보호기(들)의 제거

[실시예 14]

화합물 43의 제조

실시예 3에서 인자 A₃대신에 GE 2270 성분 D₁출발 물질을 이용하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 반응을 수행하였다.

방법 I-방법 H에 기재된 GE 2270 성분 D₁출발 물질과 보호되지 않은 산 부분을 함유하는 선택된 아민의 반응

[실시예 15]

화합물 43의 제조

실시예 5에서 인자 A₃대신에 GE 2270 성분 D₁출발 물질을 이용하는 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 방법으로 반응을 수행하였다.

방법 J-GE 2270 성분 D₂출발 물질(즉, R이 히드록시메틸이고 R₁및 R₄가 메틸이고 W가 COOH인 일반식(II)의 화합물)과 반응성 관능기(들)(이 관능기(들)은 모두 보호됨)을 추가 함유하는 선택된 아민의 반응 및 이에 후속하는 보호기(들)의 제거

[실시예 16]

화합물 44의 제조

실시예 3에서 인자 A₃대신에 GE 2270 성분 D₂출발 물질을 이용하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 반응을 수행하였다.

방법 K-방법 J에 기재된 GE 2270 성분 D₂출발 물질과 보호되지 않은 산 부분을 함유하는 선택된 아민의 반응

[실시예 17]

화합물 44의 제조

실시예 5에서 인자 A₃대신에 GE 2270 성분 D₂출발 물질을 이용하는 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 방법으로 반응을 수행하였다.

방법 L-항생 물질 GE 2270의 소량 성분(C_2a, D₁, D₂및 E)의 혼합물(출발 물질)과 반응성 관능기(들)(이 관능기(들)은 모두 보호됨)을 추가 함유하는 선택된 아민의 반응 및 이에 후속하는 보호기(들)의 제거

[실시예 18]

실시예 3에서 인자 A₃대신에 항생 물질 GE 2270 출발 물질의 소량 성분(C_2a, D₁, D₂및 E) 혼합물 및 메틸 6-아미노카프로에이트 히드로클로라이드(플루카사 제품)를 이용하는 것을 제외하고는 실시예 3에 기재된 방법과 동일한 방법으로 반응을 수행하였다. R_t(분)은 상기 HPLC 분석편에 기재된 HPLC 방법 M을 참조한다.

Y가 -NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOCH₃인 경우, R_t(분)은, GE 2270 인자 C_2a의 경우에는 43.43이고, GE 2270 인자 D₁의 경우에는 39.42이고, GE 2270 인자 D₂의 경우에는 42.29이고, GE 2270 인자 E의 경우에는 37.41이었다.

Y가 -NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH인 경우, R_t(분)은, GE 2270 인자 C_2a의 경우에는 17.23이고, GE 2270 인자 D₁의 경우에는 15.76이고, GE 2270 인자 D₂의 경우에는 16.64이고, GE 2270 인자 E의 경우에는 15.13이었다.

방법 M-항생 물질 GE 2270의 소량 성분(C_2a, D₁, D₂및 E)의 선택된 혼합물(출발 물질)과 보호되지 않은 산 부분을 함유하는 선택된 아민의 반응

[실시예 19]

실시예 5에서 인자 A₃대신에 출발 물질로서 항생 물질 GE 2270의 소량 성분(C_2a, D₁, D₂및 E)의 선택된 혼합물을 이용하고 6-아미노카프론산을 이용하는 것을 제외하고는 실시예 5에 기재된 방법과 동일한 방법으로 반응을 수행하였다.

R_t(분)은 상기 HPLC 분석편에 기재된 방법 M을 참조하며, GE 2270 인자 C_2a의 경우에는 17.23이고, GE 2270 인자 D₁의 경우에는 15.76이고, GE 2270 인자 D₂의 경우에는 16.64이고, GE 2270 인자 E의 경우에는 15.13이었다.

출발 물질의 제조

1. 다음 출발 물질은 플루카사(Fluka, Chemika-Biochemika, Buchs, 스위스연방)로부터 구입하였다 :

글리신 에틸 에스테르 히드로클로라이드, L-트레오닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드, L-티로신 메틸 에스테르 히드로클로라이드, L-로이신 메틸 에스테르 히드로클로라이드, L-페닐알라닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드, L-메티오닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드, L-프롤린 메틸 에스테르 히드로클로라이드, L-트레오닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드, N-Cbz-L-리신, 메틸 4-아미노부티레이트 히드로클로라이드, 메틸 6-아미노카프로에이트 히드로클로라이드, 6-아미노카프론산, 4-(메틸아미노)벤조산, 피페리딘-4-카르복실산, N-메틸-D-글루카민, D(+)-글루코사민 히드로클로라이드, 2-디메틸아미노에틸아민, 아미노 아세트알데히드 디메틸아세탈,-알라닌 에틸 에스테르 히드로클로라이드

2. 다음 출발 물질은 시그마사(Sigma, Biochemicals Organic Compounds, 미합중국 세인트루이스 소재)로부터 구입하였다 :

Nδ-Cbz-L-오르니틴, L-아스파르트산 디메틸 에스테르 히드로클로라이드

3. 다음 출발 물질은 알드리치사(Aldrich, Catalogo Prodotti di Chimica Fine, 이탈리아 밀라노 소재)로부터 구입하였다 :

L-프롤린아미드, 타우린, 3-아미노-1-프로판술폰산, 3-아미노프로필포스폰산, 4-아미노-1-벤질피페리딘.

4. 항생 물질 GE 2270 인자 A, B₁, B₂, C₁, C₂, C_2a, D₁, D₂및 E를 제조하기 위한 항생 물질 GE 2270의 생성

플라노비스포라 로세아 ATCC 53773의 배양물을 28 내지 30℃에서 2주일 동안 오우트밀 한천 슬랜트(slant) 상에서 성장시킨 후, 하기 조성을 갖은 시드(seed) 배지 100ml를 함유하는 500ml 플라스크에 접종하였다.

전분 20g/ℓ

폴리펩톤 5g/ℓ

효모 추출물 3g/ℓ

소고기 추출물 2g/ℓ

콩 미일(meal) 2g/ℓ

탄산칼슘 1g/ℓ

증류수 최종 부피가 100ml가 되게 하는 양

(멸균전에 pH 7.0으로 조정)

플라스크를 회전 진탕기(회전 속도 : 200rpm)에서 28 내지 30℃에서 92시간 동안 배양시켰다. 이어서, 얻어진 배양물을 상기와 동일한 배지 4리터를 함유하는 자르(jar)형 발효기에 접종시키고, 배양물을 교반(약 900rpm) 및 통기(약 1ℓ 공기/부피/분)시키면서 48시간 동안 28 내지 30℃에서 배양시켰다.

얻어진 브로스를 하기 조성을 갖는 생산 배지 50ℓ를 함유하는 발효기에 옮겼다.

전분 20g/ℓ

펩톤 2.5g/ℓ

가수분해된 카제인 2.5g/ℓ

효모 추출물 3g/ℓ

소고기 추출물 2g/ℓ

콩 미일 2g/ℓ

탄산칼슘 1g/ℓ

증류수 충분량

(멸균 전에 pH 7.0으로 조절하고, 28 내지 30℃에서 약 72시간 동안 배양시킴)

항생 물질 생산은 데이비스 배지에서 성장시킨 박테로이데스 서브틸리스(B. subtilis) ATCC 6633을 이용하여 종이 디스크 한천 분석법에 의해 모니터하였다. 35℃에서 철야 배양시킨 후 억제 대역을 평가하였다.

4a) 조 항생물질 GE 2270의 회수

상기에서 얻어진 발효 매스(mass) 50ℓ를 회수하고, 여과 보조기(클라르셀(Clarcell)사 제품) 존재하에 여과시켰다.

항생물질 GE 2270은 주로 균사체에서 발견되지만, 어느 정도는 여액으로부터 회수할 수 있었다.

여액을 약 pH 7.0으로 조정하고, 에틸 아세테이트 50ℓ로 추출시켰다. 원심 분리시켜서 유기상을 분리하고, 감압하에서 작은 부피가 될 때까지 농축시켰다. 얻어진 오일 잔분을 석유 에테르로 처리하여 조 항생물질 GE 2270을 침전시키고, 이것을 여과시키고, 모아서, 건조시켰다. 조 항생물질 GE 2270 복합체 415mg을 얻었다.

균사체를 메탄올 20ℓ로 2회 추출시키고, 추출물을 한데 모아서 감압 하에서 농축시켜서 수성 잔분을 얻고, 이것을 에틸 아세테이트로 2회 추출시켰다. 유기상을 농축시키고, 석유 에테르를 첨가해서 조 항생물질 GE 2270 6.06g을 침전시켰다.

4b) 항생 물질 GE 2270 인자 A의 단리

상기 방법에 따라서 균사체로부터 얻은 조 항생물질 3g을 테트라히드로푸란 중에 용해시키고, 실리카겔 (230-400 메쉬) 존재 하에 감압 하에 농축시켰다. 얻어진 고체 잔분을 회수하고, 염화메틸렌(CH₂Cl₂)으로 평형화시킨 실리카겔 (230-400 메쉬) 300g을 함유하는 크로마토그래피 칼럼에 넣었다. 칼럼을 먼저 염화메틸렌 2ℓ로 전개시킨 후, 다음과 같은 혼합 비율의 염화메틸렌/메탄올 혼합물을 순차적으로 1.5ℓ씩 사용하여 전개시켰다 : 98/2, 96/4, 94/6, 92/8, 90/10 및 88/12(v/v).

분획을 한데 모아서, 박테로이데스 서브틸리스에 대해 TLC, HPLC 또는 미생물학적 방법으로 분석하고, 항생 물질 함량에 따라서 모았다.

항생 물질 GE 2270 인자 A를 함유하는 분획을 한데 모아서 감압 하에 농축시킴으로써 오일상 잔분을 얻고, 이 잔분을 테트라히드로푸란으로 용해시켰다. 이 용액에 석유 에테르를 첨가하여 항생 물질 GE 2270 인자 A 600mg을 침전시켰다.

4b-I) 항생 물질 GE 2270의 소량 성분 혼합물의 단리

소량 성분 C_2a, D₁, D₂및 E 각각의 분석 시료에 대한 HPLC와 비교함으로써 특히 소량 성분 C_2a, D₁, D₂및 E가 함유되어 있는 대표적인 혼합물을 얻었다.

R_t(분)은 HPLC 분석편에 기재된 HPLC 방법 M을 참조하며, GE 2270 인자 C_2a의 경우에는 20.55이고, GE 2270 인자 D₁의 경우에는 17.43이고, GE 2270 인자 D₂의 경우에는 18.17이고, GE 2270 인자 E의 경우에는 16.61이었다.

이 분획을 감압 하에서 농축시켜서 오일상 잔분을 얻고, 이 잔분을 테트라히드로푸란 중에 다시 용해시켜서, 이 용액에 석유 에테르를 첨가함으로써 백색 분말을 침전시켰다.

4c) 항생 물질 GE 2270 인자 B₁, B₂, C₁, C₂, D₁, D₂및 E의 분리 및 단리

뉴클레오실(Nucleosil) C18(옥타데실실란 관능기를 갖는 실리카겔)(5㎛)으로 충전시킨 250×20㎜ 칼럼을 사용하는 예비 HPLC에 의해 상기 조 혼합물로부터 항생 물질 GE 2270 인자 D₁, D₂및 E를 분리 및 정제시키고, 다음과 같은 혼합물로 용출시켰다. 상 A : CH₃CN : 테트라히드로푸란 : 40mM HCOONH₄=40:40:20; 상 B : CH₃CN : 테트라히드로푸란 : 40mM HCOONH₄=10:10:80. 항생 물질 혼합물 6mg을 상 B 3ml 및 상 A 1ml 중에 용해시키고, HPLC 칼럼에 주입시켰다. 이것을 상 A 및 B의 혼합물(26:74)을 이용하여 유속 14ml/분으로 용출시켰다. 용출시킨 분획을 254nm에서의 UV 흡수 프로필에 따라서 수집하였다. 연속적인 크로마토그래피 수행에 의해 얻어진 동일 함량을 갖는 분획을 한데 모으고, 감압하에서 농축시켜서 CH₃CN을 제거하였다. 이와 같이 하여 얻은 용액에 대해 종이 디스크 분석을 행한 결과, 이 용액은 황색포도상구균에 대해 항균 활성을 나타내었다. 이 용액을 적어도 3회 동결 건조시켜서, HPLC상으로부터 HCOONH₄완충액 잔분을 완전히 제거하였다.

수득량은 다음과 같았다 : 항생 물질 GE 2270 인자 E, 11mg; 항생 물질 GE 2270 인자 D₁, 12mg; 항생 물질 GE 2270 인자 D₂, 10mg.

4d) 항생 물질 GE 2270 인자 C_2a및 다른 GE 2270 인자의 혼합물을 함유하는 정제된 혼합물의 단리

6회 반복 실시한 발효로부터 얻은 조 GE 2270 인자들을 한데 모으고, CH₂Cl₂: 메탄올(93:7) 12ℓ 중에 용해시켰다. 여과시켜서 불용성 물질을 제거하고, 이와 같이 하여 얻어진 항생 물질 복합체를 함유하는 용액을 CH₂Cl₂: 메탄올(93:7) 중에서 평형화시킨 실리카겔 칼럼 13kg(230-400 메쉬)에 넣었다. CH₂Cl₂: 메탄올(93:7)을 사용하여 칼럼으로부터 항생 물질 GE 2270 인자 C_2a를 용출시켰다. 본 발명의 항생 물질을 함유하는 분획(HPLC 분석)을 한데 모아서, 감압하에서 농축시키고, 건조시켜서 다른 소량 인자와의 혼합물로서 항생 물질 GE 2270 인자 C_2a를 23.5g 얻었다.

이와 같이 하여 얻은 생성물의 일부(5.5g)를 염화메틸렌(CH₂Cl₂)으로 평형화시킨 실리카겔(230-400 메쉬) 400g을 함유하는 칼럼 상에서 플래쉬 크로마토그래피시켜서 다시 정제하였다. 이 칼럼을 먼저 염화메틸렌 1ℓ로 전개시킨 후, 다음과 같은 혼합 비율(v/v)의 염화메틸렌/메탄올의 혼합물을 순차적으로 이용하여 전개시켰다 : 96/4(3ℓ) : 94/6(1ℓ) : 92/8(2ℓ) : 90/10(6ℓ) 및 88/12(4ℓ).

주로 GE 2270 인자 C_2a를 함유하는 분획(HPLC 분석)을 한데 모으고, 농축시켰다. 여기에 석유 에테르를 첨가하여 항생 물질 혼합물 646mg을 침전시켰다.

4e) 순수 항생 물질 GE 2270 인자 C_2a의 단리

예비 HPLC에 의해 상기 혼합물로 부터 주로 항생 물질 GE 2270 인자 C_2a를 함유하는 정제된 혼합물을 더 정제시켰다.

상기 항생 물질 혼합물의 일부(10mg)를 상 A(CH₃CN : 테트라히드로푸란 : 40mM HCOONH₄=40:40:20) 1ml 및 상 B(CH₃CN : 테트라히드로푸란 : 40mM HCOONH₄=10:10:80) 1ml 중에 용해시키고 상 A 40％ 및 상 B 60％의 혼합물로 평형화시킨 7㎛ 뉴클레오실C18(옥타데실실란 관능기를 갖는 실리카겔)로 충전시킨 HPLC 250×20㎜ 하이버(Hibar) 칼럼(독일연방공화국 다르마스타트 소재 E. Merk사 제품)에 주입시켰다. 이 칼럼을 상 A를 40％에서 부터 50％까지 선형 구배시키면서 22분 동안 15ml/분의 유속으로 용출시켰다. UV 검출은 254nm 파장에서 수행하였다. 10회 연속 크로마토그래피를 수행해서 얻은 본 발명의 순수 항생 물질을 함유하는 분획을 한데 모으고, 감압 하에서 농축시켜서 CH₃CN을 제거하였다. 물을 이용하여 항생 물질 GE 2270 인자 C_2a를 침전시켰다. 원심 분리하여 침전물을 한데 모으고, 증류수로 2회 세척해서, 진공 하에 건조시킴으로써 순수한 항생 물질 66mg을 얻었다.

5. 항생 물질 GE 2270 인자 A₂의 제조

항생 물질 GE 2270 인자 A(상기 방법으로 제조함) 86mg을 95％ 에탄올 17ml 및 아세트산 1.7ml 중에 용해시켰다. 60℃에서 24시간 동안 배양시킨 후, 이 결과 얻은 용액을 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 100ml로 희석시키고, 1M 수산화나트륨을 이용하여 pH 7.5로 조정하였다. 감압 하에서 증발시켜서 에탄올을 제거하고, 수성 잔분을 에틸 아세테이트 100ml로 2회 추출하였다. 유기상을 감압하에 농축시켜서 고체 잔분을 얻었으며, 이 잔분을 테트라히드로푸란 중에 용해시킨 후, 석유 에테르를 첨가하여 침전시켰다. 이 결과, 소량의 항생 물질 GE 2270 인자 A 및 A₁와의 혼합물로서 항생 물질 GE 2270 인자 A₂62mg을 얻었다. 다음과 같이 예비 HPLC를 수행하여 순수 항생 물질 GE 2270 인자 A₂를 얻었다.

상기 조 생성물 10mg을 테트라히드로푸란 중에 용해시키고, 물을 첨가하여 용해도 한계까지 희석시키고, 이어서 스타크로마(Stacroma)에 의해 뉴클레오실C18(5㎛) 역상 실리카겔로 충전시킨 칼럼(250×20㎜)이 장착된 HPLC 시스템에 주입시키고, 상 A 중에서 상 B를 64％에서부터 93％까지 선형 구배시키면서 유속 약 15ml/분으로 20분 동안 용출시켰다. 이 시스템에서, 상 A는 18mM 인산나트륨(pH 7.2) 및 아세토니트릴의 90:10(v/v) 혼합물이고, 상 B는 18mM 인산나트륨(pH 7.2) 및 아세토니트릴의 40:60(v/v) 혼합물이었다. 5회 연속 수행하여 얻은 분획을 한데 모아서, 330nm에서 UV로 모니터하였다. UV 용출 프로필의 주요 피이크에 대응하는 항생 물질 GE 2270 인자 A₂를 상당량 함유하는 분획들을 한데 모아서, 감압 하에 수성상이 될 때까지 농축시키고, 이것을 에틸 아세테이트로 2회 추출시켰다. 이어서, 이 유기상을 증류수로 세척시켜서 잔류하는 무기염을 제거하고, 농축시켜서, 고체 잔분을 침전시키고, 이어서 테트라히드로푸란 중에 용해시키고, 석유 에테르로 재침전시킴으로써 순수한 항생 물질 GE 2270 인자 A₂45mg을 얻었다.

항생 물질 GE 2270 인자 A의 주요 반응 생성물로서 항생 물질 GE 2270 인자 A₂를 제조하는 또 다른 방법은 유럽 특허 출원 공개 제406745호에 기재되어 있다.

6. 항생 물질 GE 2270 인자 A₃의 제조

항생 물질 GE 2270 인자 A₂를 0.5M 탄산나트륨 중에서 실온하에 1시간 동안 배양시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 차가운 물로 희석시키고, 염산을 첨가해서 pH 6.5로 조정하였다. 이와 같이 중화시킨 용액은 주요 반응 생성물로서 항생 물질 GE 2270 인자 A₃을 함유하였다. 에틸 아세테이트를 이용하여 수성상으로부터 항생 물질을 추출시킨 후, 유기상을 농축시키고 석유 에테르를 첨가하여 침전시켰다.

하기하는 바와 같이 칼럼 크로마토그래피하여 순수 항생 물질 GE 2270 인자 A₃을 얻었다 :

조 GE 2270 A₃1.5g을 메탄올 및 디클로로메탄의 1/1(v/v) 혼합물 60ml 중에 용해시키고, 감압 하에서 용매를 증발시킴으로써 실리카겔(75-230 메쉬) 상에 흡착시켰다. 이어서, 고체 잔분을 디클로로메탄으로 평형화시킨 실리카겔(75-230 메쉬) 칼럼(베드 높이=40㎝) 상부에 넣었다. 이어서, 이 칼럼을 다음과 같은 혼합 비율의 디클로로메탄과 메탄올의 혼합물로 순차적으로 용출시켰다. 1) 2％ 메탄올(450ml), 2) 5％ 메탄올(500ml), 3) 10％ 메탄올(600ml), 4) 15％ 메탄올(500ml), 5) 20％ 메탄올(500ml), 6) 30％ 메탄올(250ml).

분획을 한데 모아서, TLC 및 박테로이데스 서브틸리스 ATCC 6633에 대한 미생물학적 분석으로 모니터하였다. 일반적으로 항생 물질 GE 2270 인자 A₃은 약 15 내지 20％의 메탄올을 함유하는 용출물 중에 존재하였다.

목적 생성물을 함유하는 분획을 한데 모으고, 감압하에서 농축시켰다. 잔분에 석유 에테르를 첨가하자, 항생 물질 GE 2270 인자 A₃이 침전하였다(순수 생성물 854mg).

7. 항생 물질 인자 D₁, D₂, E 및 C_2a로부터 적당한 출발 물질의 제조

상기 5항 및 6항에 기재된 방법과 동일 방법으로 수행하되, 인자 A 대신에 항생 물질 GE 2270의 단일 인자 D₁, D₂, E 및 C_2a로부터 출발하여, W가 COOH 또는 활성화 에스테르이고 R이 수소 또는 CH₂OH이고 R₁이 CH₃또는 수소이고 R₄가 히드록시메틸 또는 메틸인 일반식(III)의 적당한 출발 물질을 얻었다.

7a) 항생 물질 GE 2270의 소량 성분(C_2a, D₁, D₂및 E)의 혼합물로부터 적당한 출발 물질의 제조

상기 5항 및 6항에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행하되, 단일 인자 A 대신에 항생 물질 GE 2270의 소량 성분(C_2a, D₁, D₂및 E)의 혼합물로부터 출발하여, W가 COOH 또는 활성화 에스테르이고 R, R₁및 R₄가, C_2a의 경우에는 각각 메톡시메틸, 메틸 및 히드록시메틸이고, D₁의 경우에는 각각 수소, 수소 및 메틸이고, D₂의 경우에는 각각 히드록시메틸, 메틸 및 메틸이고, E의 경우에는 각각 히드록시메틸, 수소 및 메틸인 일반식(III)의 적당한 출발 물질을 얻었다.

R_t(분)은 HPLC 분석편에 기재된 HPLC 방법 M을 참조한다.

W가 활성화 에스테르인 경우, R_t(분)은, GE 2270 인자 C_2a의 경우에는 22.51이고, GE 2270 인자 D₁의 경우에는 19.80이고, GE 2270 인자 D₂의 경우에는 20.41이고, GE 2270 인자 E의 경우에는 18.92이었다.

W가 COOH인 경우, R_t(분)는, GE 2270 인자 C_2a의 경우에는 12.99이고, GE 2270 인자 D₁의 경우에는 10.38이고, GE 2270 인자 D₂의 경우에는 11.08이고, GE 2270 인자 E의 경우에는 9.03이었다.

8. 글리실-Nε-Cbz-L-리신 트리플루오로아세테이트의 제조

무수 DMF 50ml 중에 BOC-글리신(플루카사 제품) 3.5g(20mmol) 및 Nε-Cbz-L-리신 메틸 에스테르 히드로클로라이드(플루카사 제품) 7.28g(22mmol)을 교반시키면서 충분히 용해시킨 용액에 DPPA 48ml(22mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 이 용액에 무수 DMF 50ml 중에 TEA 5.8ml(42mmol)을 용해시킨 용액을 0℃에서 10 내지 15분 동안 첨가하였다. 0℃에서 2시간 더 교반시킨 후, 실온에서 철야 교반시켰다. 반응 혼합물을 톨루엔 250ml 및 에틸 아세테이트 500ml로 희석시키고, 1N HCl 수용액(3회), 물, NaHCO₃포화 용액 및 염수로 세척하였다. Na₂SO₄상에서 건조시키고 용매를 증발시켜서 농후한 오일 9.7g을 얻었으며, 이 오일은 결정화시키기 위한 어떠한 시도에 의해서도 결정화되지 않았다. 이 오일의 NMR은 BOC-글리실-Nε-Cbz-L-리신 메틸 에스테르 구조와 완전히 일치하였다.

이 오일을 아세톤/디옥산 혼합물(1:1) 200ml 중에 용해시키고, 1N NaOH 수용액 22ml를 교반시키면서 0℃에서 30분 동안 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반시키고, 차가운 물 300ml로 희석시고, 1N HCl 수용액 25ml로 산성화시켜서, 클로로포름(3회) 및 에틸 아세테이트(3회)로 추출시켰다. Na₂SO₄상에서 건조시키고, 용매를 증발시켜서 고무질 물질 9.4g을 얻었으며, 이 물질은 결정화를 위한 어떠한 시도에 의해서도 결정화되지 않았다. 이 고무질 물질의 NMR은 BOC-글리실-Nε-Cbz-L-리신의 구조와 완전히 일치하였다.

이 고무질 화합물을 차가운 트리플루오로아세트산(TFA) 20ml로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 모든 화합물이 용해될 때까지 실온에서 와류시켰다. 이 차가운 용액을 작은 부피가 되도록 감소시킨 후, 에틸 에테르를 첨가하여 표제 화합물을 침전시켰다. 글리실-Nε-Cbz-L-리신 트리플루오로아세테이트 9.6g을 백색 분말로서 얻었다. NMR은 글리실-Nε-Cbz-L-리신의 구조와 완전히 일치하였다.

9. L-티로실-L-프롤린아미드의 제조

무수 DMF 50ml 중에 BOC-L-티로신(플루카사 제품) 538mg(2mmol), L-프롤린아미드(알드리치사 제품) 228.3mg(2mmol) 및 NaHCO₃168mg을 교반시키면서 충분히 용해시킨 용액에 DPPA 0.48ml(2mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시키고, 이어서 물 50ml로 희석시키고, 클로로포름으로 3회 추출시켰다. 유기상을 물로 세척하고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 용매를 증발시켜서 오일을 얻었으며, 이 오일을 헥산/아세톤 혼합물(2:3)로 용출시키면서 실리카 겔 60(230-400 메쉬 ASTM, 머크사 제품) 상에서 플래쉬 크로마토그래피시켜서 정제하였다. 이와 같이 하여 BOC-L-티로실-L-프롤린아미드 420mg을 백색 고체로서 얻었다. NMR은 생성물의 구조와 일치하였다.

얻어진 고체를 에틸 아세테이트 6ml 중에 용해시키고, 3N HCl 수용액 4ml 존재하에 실온에서 48시간 동안 교반시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 진공 중에서 증발 건조시키고, 얻어진 잔분을 에탄올 중에 다시 용해시키고, 용액에 에틸에테르를 첨가하여 침전시켰다. L-티로실-L-프롤린아미드 302mg을 백색 분말로서 얻었다. NMR은 L-티로실-L-프롤린아미드의 구조와 완전히 일치하였다.

10. 메틸 8-아미노카프릴레이트 및 메틸 11-아미노운데카노에이트 p-톨루엔술포네이트의 제조

메탄올 200ml 중에 선택된 아미노산(플루카사 제품) 40mmol 및 p-톨루엔술폰산 1수화물(플루카사 제품) 15.2g(80mmol)을 용해시킨 용액을 철야 환류시켰다. 이어서, 용매를 진공 증발시키고, 그 잔분을 에틸 에테르 중에 다시 용해시켰다. 몇 시간 후, 표제 화합물이 정량적으로 결정화되었다. 두 화합물의 NMR은 그들의 구조와 일치하였다.

11. 5-아미노펜틸포스폰산 제조

5-아미노-1-펜탄올(플루카사 제품) 3.48g(33.7mmol) 및 무수프탈산(플루카사 제품) 5.0g(33.7mmol)을 함께 180℃에서 용융시켰다. 이 온도는 물이 더 이상 생기지 않을 때까지 90분 동안 유지시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 오일상 혼합물을 클로로포름 중의 2％ 메탄올로 용출시키면서 실리카겔 60(230-400 메쉬 ASTM, 머크사 제품) 상에서 크로마토그래피시켰다. 순수한 오일 5.9g을 얻었다. NMR은 그 오일의 구조와 일치하였다.

오일상 중간체 5.9g(25mmol)에 PBr₃1.6ml(17mmol)을 발열 반응을 조절할 수 있을 정도로 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 1.5시간 동안 가열시킨 후, 분쇄시킨 얼음에 부었다. 분리된 고체 물질을 여과시키고, 공기 중에서 철야 건조시켰다. 순수한 브로모 중간체 6.6g을 얻었다. 질량 스펙트럼은 예상 분자량과 일치하였다.

순수한 브로모 중간체 500mg(1.69mmol) 및 트리에틸 포스파이트(플루카사 제품) 140mg(0.84mmol)을 함께 150℃에서 약 1시간 동안 가열시켰다. 이어서, 동일 온도에서 30분 간격으로 트리에틸 포스파이트 140mg을 3회에 걸쳐서 다시 첨가하였다. 모든 출발 물질이 사라졌을 때, 트리에틸 포스파이트 과량을 증류시키고, 조 물질을 디클로로메탄 중의 2％ 메탄올로 용출시키면서 실라카 겔 60(230-400 메쉬 ASTM, 머크사 제품) 상에서 플래쉬 크로마토그래피시켜서 정제하였다. 예상대로 디에틸 포스페이트 468mg을 농후한 오일로서 얻었다. NMR은 그 오일의 구조와 일치하였다.

디에틸 포스페이트 중간체 468mg을 메탄올 중의 0.2M 히드라진 용액 3ml로 실온에서 철야 처리하였다. 침전된 프탈히드리지드를 여과시키고, 남아 있는 여액을 진공 중에서 증발 건조시켰다. 잔분을 1N HCl 수용액 중에 용해시키고, 용액을 에틸 아세테이트로 세척하고, NaOH로 염기성화시키고, n-부탄올로 수회 추출시켰다. 부탄올 상을 Na₂SO₄상에서 건조시키고, 증발 건조시켜서 농후한 오일 175mg을 얻었으며, NMR은 예상 생성물과 일치하였다.

디에틸 5-아미노펜틸포스포네이트 175mg을 진한 HCl 0.6ml 중에서 20시간 동안 환류시켰다. 이어서, 산 용액을 n-부탄올 존재 하에 진공 중에서 공비 증류에 의해 증발 건조시켰다. 이와 같이 얻은 유리질 오일의 NMR은 5-아미노펜틸포스폰산임을 입증하였다.

12. 5-(5-아미노펜틸)테트라졸 제조

테트라히드로푸란 80ml 중에 6-아미노카프로니트릴(플루카사 제품) 10ml 및 TEA 13.3ml(96mmol)을 용해시킨 용액에 벤질 클로로포르메이트(플루카사 제품) 12.48ml(88mmol)을 교반시키면서 0℃에서 적가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반시키고, 진공 중에서 증발시켰다. 잔분을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 1N HCl 수용액, 물로 세척한 후, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 용매를 증발시켜서 시럽상 물질 19.6g을 얻었으며, 이 물질의 NMR은 그 구조와 일치하였다.

1-메틸-2-피롤리돈 40ml 중의 보호된 6-아미노 카프로니트릴 1g(4.06mmol)을 소듐 아지드 793mg(12.2mmol) 및 트리에틸아민 히드로클로라이드 834mg(6.1mmol) 존재 하에 아르곤 분위기 하에서 150℃에서 가열시켰다. 4시간 후, 반응 혼합물을 물 120ml로 희석시킨 후, 10％ HCl 수용액을 조심스럽게 첨가하면서 산성화시켜서 pH 1이 되게 하였다.(주의 : 아조티드르산이 형성됨). 이 용액을 에틸 아세테이트로 추출시키고, 유기상을 10％ NaOH 수용액으로 2회 재추출시키고, 염기성 용액을 에틸 에테르로 세척하고, 진한 HCl로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 3회 추출시켰다. 유기상을 건조 및 증발시켜 시럽상 물질을 얻고, 이 물질을 메탄올/물을 이용하여 결정화시켰다. 미분말 260mg을 얻었다. NMR 및 질량 스펙트럼은 그 구조와 일치하였다.

N-보호된 아미노 테트라졸 250mg(0.86mmol)을 티오아니솔 5ml(43.25mmol) 및 트리플루오로아세트산 17.5ml로 3시간 동안 실온에서 처리하였다. 트리플루오로아세트산을 차가운 분위기 하에서 진공 농축시키고, 에틸 에테르를 첨가해서 표제 화합물을 트리플루오로아세트산염으로서 침전시켰다. NMR 및 질량 스펙트럼은 그 구조와 일치하였다.

13. N-[3,4-디-(O-테트라히드로피라닐)벤조일]티아졸리딘-2-티온 제조

메탄올 40ml 중에 3, 4-디히드록시벤조산(플루카사 제품) 4.62g을 용해시킨 용액을 진한 H₂SO₄0.325ml 존재 하에 24시간 동안 환류시켰다. 용액을 실온까지 냉각시킨 후, 약간의 고체 NaHCO₃를 첨가하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 진분을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 물로 세척하고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 용매를 증발시켜서 시럽상 물질을 얻었으며, 이 물질을 에틸 아세테이트/헥산 혼합물로부터 결정화시켰다. 백색 결정 3.53g을 얻었다. 에틸 아세테이트 4ml 및 디클로로메탄 25ml 중에 메틸 3,4-디히드록시벤조에이트 1.68g(10mmol)을 교반시키면서 용해시킨 용액에 디히드로피란(플루카사 제품) 9.1ml(0.1mmol) 및 피리듐 p-톨루엔술포네이트 250mg(1mmol)을 실온에서 첨가하였다. 4일 후, 반응 혼합물을 NaHCO₃포화 용액으로 세척하고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 증발 건조시켜서 오일상 물질 3.36g을 얻었으며, 이 물질은 더 이상 정제하지 않은 채로 다음 단계로 이용하였다.

상기 반응으로부터 얻은 조 생성물을 아세톤 40ml 중에 용해시키고 교반시킨 용액에 물 20ml, K₂CO₃2.76g(20mmol) 및 1N NaOH 수용액 10ml(10mmol)을 첨가하고, 실온에서 7일 동안 교반을 계속하였다. 진공 중에서 아세톤을 증발시키고, 잔류하는 수성상을 에틸 아세테이트로 세척시켰다. 수성상을 동일 부피의 클로로포름을 함유하는 플라스크에 옮겨서, 0℃까지 냉각시키고, 교반시키면서 1N HCl 수용액 50ml를조심스럽게 첨가하여 산성화시켰다. 이어서, 수성상을 클로로포름으로 3회 더 추출시키고, 유기상을 한데 모아서, 0.2％ 포름산암모늄으로 세척하고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 증발 건조시켜서 시럽상 물질을 얻었으며, 헥산을 첨가해서 결정화시켰다. 백색 고체 2.34g을 얻었다. NMR은 그 구조와 일치하였다.

에틸 아세테이트/디클로로메탄 혼합물(5:2) 14ml 중에 벤조산 중간체 644mg(2mmol)을 교반시키면서 용해시킨 용액에 2-티아졸린-2-티올(플루카사 제품) 333mg(2.8mmol), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(플루카사 제품) 577mg(2.8mmol) 및 4-디메틸아미노-피리딘 35mg을 순차적으로 첨가하였다. 실온에서 철야 교반시키고, 침전된 디시클로헥실우레아를 여과시키고, 황색 용액을 진공 중에서 증발시켜서 황색 오일을 얻었으며, 이 오일을 헥산 중의 25％ 아세톤으로 용출시키면서 실라카겔 60(230-400 메쉬 ASTM, 머크사 제품) 상에서 플래쉬 크로마토그래피시켜서 정제하였다. 아세톤/헥산을 이용하여 황색 결정 700mg을 얻었다. NMR 및 IR은 이 화합물이 표제 화합물임을 입증하였다.

14. N¹-N⁸-디-tert-부톡시카르보닐스페르미딘 제조

0℃에서 냉각시킨 탈기된 THF 40ml 중에 스페르미딘(알드리치사 제품) 5.8g(40mmol)을 교반시키면서 용해시킨 용액에 탈기된 THF 60ml 중에 BOC-ON(알드리치사 제품) 19.72g(80mmol)을 용해시킨 용액을 아르곤 분위기하에 1시간 동안 적가하였다. 이어서 반응 혼합물을 실온에서 철야 교반시킨 후, 증발 건조시켰다. 잔분을 에틸 에테르 중에 용해시키고, 1N NaOH 수용액으로 4회 세척시키고, 물로 4회 세척시키고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 용매를 진공 농축시켜 작은 부피가 되게 하였다. 에틸 에테르를 첨가하자 백색 분말 11g이 침전되었다. NMR은 표제 화합물과 일치하였다.

15. N-tert-부톡시카르보닐프로필렌디아민 제조

디옥산 10ml, 물 10ml 및 트리에틸아민 3.3ml의 혼합물에 3-아미노프로피오니트릴 푸마레이트(알드리치사 제품) 2g(15.6mmol)을 교반시키면서 용해시킨 용액에 BOC-ON(알드리치사 제품) 4.2g(17.2mmol)을 실온에서 첨가하였다. 3시간 후, 반응 혼합물을 물로 희석시키고, 디클로로메탄으로 3회 추출시켰다. 유기층을 한데 모으고, 1N NaOH 수용액으로 3회, 물로 3회 세척하고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 잔류하는 오일을 에틸 에테르 중에 용해시키고, 헥산을 첨가하여 침전시켜서 백색 분말 2.2g을 얻었다.

에탄올 중의 1N NaOH 용액 7ml 중에서 N-BOC-보호된 중간체 1g(5.9mmol)을 라네이 니켈(물 중의 50％ 슬러리, pH9)(알드리치사 제품) 130mg 존재 하에 40시간 동안 40psi에서 수소 첨가시켰다. 라네이 니켈을 여과시키고, 용매를 증발 건조시켰다. 잔분을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 1N NaOH 수용액으로 세척하고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 용매를 진공 중에서 제거하여 무색 오일 950mg을 얻었으며, 이 오일은 방치시키자 고화되었다. NMR은 표제 화합물과 일치하였다.

16. 3-(2-아미노에틸티오)프로판산 메틸 에스테르 트리플루오로아세테이트 제조

CH₂Cl₂5ml 중에 시스테아민(플루카사 제품) 0.5g(6.48mmol)을 용해시킨 용액에 CH₂Cl₂5ml 중의 디-tert-부틸디카르보네이트(알드리치사 제품) 1.4g(6.48mmol)을 실온에서 교반하면서 첨가하였다. 30분 후, 유기 용매를 증발시키고, 조 물질을 무수 에탄올 5ml 중에 용해시켰다. 이 에탄올 용액에 TEA 2.7ml(19.1mmol) 및 메틸 3-브로모프로피오네이트(플루카사 제품) 1.07ml(9.57mmol)을 순차적으로 첨가하였다. 반응은 약 30분 이내에 종결되었다. 에탄올을 진공 중에서 제거하고, 클로로포름 15ml를 첨가하였다. 이어서, 유기상을 물로 세척하고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 용매를 증발시켜서 오일을 얻었으며, 최종적으로 이 오일을 0℃에서 5분동안 트리플루오로아세트산 1ml로 처리하였다. 증발 건조시켜서 담황색 오일 270mg을 얻었다. NMR 및 IR은 표제 화합물과 일치하였다.

17. 6-아미노-2(E)-헥센산 제조

CH₂Cl₂5ml 중에 4-아미노-부티르알데히드 디에틸 아세탈(플루카사 제품) 2ml(11.6mmol) 및 TEA 3.6ml(25.6mmol)을 교반시키면서 용해시킨 용액에 CH₂Cl₂5ml 중에 염화벤조일(플루카사 제품) 1.5ml(12.9mmol)을 용해시킨 용액을 실온에서 30분 이내에 첨가하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 다시 CH₂Cl₂10ml로 희석시키고, 물로 세척하고, 유기상을 Na₂SO₄상에서 건조시키고, 부피가 20ml가 되도록 조정하였다. 이와 같이 하여 얻은 용액을 실온에서 TEA 1.6ml(11.5mmol), 디-tert-부틸 디카르보네이트(알드리치사 제품) 10.2g(46.8mmol), 및 4-디메틸아미노피리딘(플루카사 제품) 1.4g(11.5mmol) 존재 하에 아르곤 분위기 하에서 3일 동안 반응시켰다. 용매를 제거하여 갈색 오일을 얻고, 이 오일을 n-헥산 중의 20％ 에틸 아세테이트로 용출시킴으로써 실리카겔 60(230-400 메쉬 ASTM, 머크사 제품) 상에서 플래쉬 크로마토그래피시켜서 정제시킴으로써 N,N-탈보호된 4-아미노부티르알데히드 디에틸 아세탈을 무색 오일로서 1.6g 얻었다. NMR은 그 구조와 일치하였다.

이어서, 얻어진 오일을 THF 5ml 중에 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 1N HCl 5ml로 처리하였다. 진공 중에서 THF를 제거하고, 잔류하는 용액을 클로로포름(2ml×3)으로 세척하였다. 이어서, 유기상을 Na₂CO₃용액, 물로 세척하고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 증발 건조시켜서 오일을 얻었으며, 이 오일은 더 이상 정제하지 않은 채로 다음 단계로 이용하였다.

아르곤 분위기하 0℃에서 무수 THF 5ml 중에 60％ NaH 160mg(4mmol)을 현탁시킨 현탁액에 트리에틸포스포노아세테이트(플루카사 제품) 0.837ml(4.3mmol)을 첨가하였다. 30분 후, 상기에서 얻은 알데히드 1.17g(4.02mmol)을 무수 THF 2ml 중에 용해시킨 용액을 첨가하고, 온도가 실온까지 승온하게 하였다. 반응 혼합물을 철야 교반시킨 후, 다시 60％ NaH 50mg을 0℃에서 첨가하였다. 실온에서 2시간 후, 반응 혼합물을 묽은 HCl 10ml로 처리하고, 에틸 아세테이트(5ml×3)으로 추출시켰다. 유기상을 한데 모으고, 물로 세척시키고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 조 물질을 n-헥산 중의 15％ 에틸 아세테이트로 용출시키면서 실리카겔 60(230-400 메쉬 ASTM, 머크사 제품) 상에서 플래쉬 크로마토그래피시켜서 정제시킴으로써 시럽상 물질 765mg을 얻었다. NMR은 이중 결합이 E 배열을 취하는 (J=16Hz) 예상 생성물과 일치하였다.

THF 10ml 중에 상기에서 얻은 불포화 에스테르 739mg(2.05mmol)을 용해시킨 용액에 1N LiOH 6.15ml(6.15mmol)을 실온에서 교반시키면서 첨가하였다. 출발 물질이 사라졌을 때, 반응 혼합물을 30℃(조 온도)에서 진공 농축시켰다. 수용액을 1N HCl을 첨가하여 산성화시켜서 pH 2가 되게 한 후, 에틸 아세테이트로 추출시켰다. 유기상을 한데 모아서, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 여과시키고, 용매를 증발시켜서 오일을 얻었으며, 이 오일은 진공 하에 방치시키자 고화되었다. NMR 및 MS는 6-N-BOC-아미노-2(E)-헥센산과 일치하였다.

0℃에서 순수 트리플루오로아세트산 중에서 N-BOC 보호기를 제거하여 표제 화합물을 얻은 후 즉시 적당한 GE 2270 출발 물질과 커플링시켰다.

18. 3-(2-아미노에톡시)프로판산 트리플루오로아세테이트 제조

-78℃에서 무수 THF 10ml 중에 N-BOC-에탄올아민[에탄올아민(플루카사 제품)으로부터 고전적인 방법으로 제조함] 1g을 교반시키면서 용해시킨 용액에 1.6M 부틸리튬(플루카사 제품) 용액 3.88ml(6.22mmol)을 아르곤 분위기하에 첨가하였다. 30분 후, t-부틸 3-브로모 프로파노에이트 [3-브로모프로판산(플루카사 제품)으로부터 고전적인 방법으로 제조함] 1.3g(6.22mmol)을 첨가하고, 온도를 실온까지 승온시키고, 이와 같이 하여 얻은 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반시켰다. 물로 희석시킨 후, 반응 혼합물을 n-헥산(5ml×2)으로 추출시켰다. 용매를 제거하여, 조 물질을 얻었으며, 이 물질은 n-헥산 중의 20％ 에틸 아세테이트로 용출시키면서 실리카 겔 60(230-400 메쉬 ASTM, 머크사 제품) 상에서 플래쉬 크로마토그래피시켜서 정제시킴으로써 오일 1.43g을 얻었다. NMR은 상기 커플링된 화합물과 일치하였다.

커플링된 화합물의 보호기를 완전히 제거한 후 즉시 실온에서 약 5분 동안 트리플루오로아세트산 중에서 교반시키면서 적당한 GE 2270 출발 물질에 첨가하였다. 진공 중에서 트리플루오로아세트산을 제거하여 표제 화합물을 얻었다.

Claims

하기 일반식(I)의 항생 물질 GE 2270의 아미드 유도체 및 그의 제약학적 부가염.

상기 식 중, R은 수소, 히드록시메틸 또는 메톡시메틸을 나타내고, R₁은 수소 또는 메틸을 나타내고, Y는 식의 기를 나타내고, R₂는 수소, (C₁-C₄)알킬, 아미노(C₂-C₄)알킬, (C₁-C₄)알킬아미노-(C₁-C₄)알킬 또는 디-(C₁-C₄)알킬아미노-(C₁-C₄)알킬을 나타내고, R₃은 수소, 카르복시; 술포; 포스포노; 저급 알콕시카르보닐 또는 벤질옥시카르보닐기에 의해 임의로 보호된 아미노; (C₁-C₄)알킬아미노(여기서, 알킬 부분은 카르복시기에 의해 임의 치환됨); 디-(C₁-C₄)알킬아미노; 히드록시; 할로; (C₁-C₄)알콕시(여기서, 알킬 부분은 카르복시기에 의해 임의 치환됨); (C₁-C₄)알콕시카르보닐; 메르캅토; (C₁-C₄)알킬티오(여기서, 알킬 부분은 카르복시기에 의해 임의 치환됨); 카르복시, 술포, 히드록시, 할로 및 메르캅토로부터 선택되는 치환체 1 내지 3개로 임의 치환되는 페닐; 카르바밀; (C₁-C₆)알킬카르바밀(여기서, 알킬 부분은 카르복시, 아미노, (C₁-C₄)알킬아미노 및 디-(C₁-C₄)알킬아미노로부터 선택되는 치환체 1 또는 2개로 임의 치환됨); 디-(C₁-C₄)알킬카르바밀(여기서, 알킬 부분은 인접하는 질소 원자와 함께 5 내지 7원의 포화 헤테로시클릭 고리를 나타낼 수 있으며, 이 고리는 고리 탄소 중의 어느 하나 상에서 카르복시 또는 카르바밀기로 임의 치환되고 또한 O, S 및 N으로부터 선택되는 추가의 헤테로 기를 임의로 함유할 수 있음); 벤조일아미노(여기서, 페닐기는 1 내지 3개의 히드록시기로 치환될 수 있음), 질소 함유 5 내지 6원 헤테로시클릭 고리(이 고리는 불포화, 부분 포화 또는 완전 포화될 수 있고, N, S 또는 O로부터 선택되는 헤테로 원자 1 내지 3개를 더 함유할 수 있으며, 고리 탄소 중의 하나는 카르복시, 술포, 카르복시(C₁-C₄)알킬 및 술포(C₁-C₄)알킬기를 임의로 함유할 수 있으며, 고리의 질소 원자는 (C₁-C₄)알킬, 카르복시(C₁-C₄)알킬, 술포(C₁-C₄)알킬 및 벤질에 의해 임의 치환될수 있음)로부터 선택되는 1 내지 3개의 치환체를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄(C₁-C₄)알킬기, 카르복시 또는 술포에 의해 임의 치환된(C₃-C₆)알케닐, 1-데옥시-1-글루시틸, 2-데옥시-2-글루코실, 완전 포화된 질소 함유 5 내지 7원 헤테로시클릭 고리(여기서, 질소 원자는 (C₁-C₄)알킬 또는 벤질에 의해 임의 치환될 수 있으며, 고리 골격내에 존재하는 1 또는 2개의 탄소(C₁-C₄)알킬, 카르복시 및 술포로부터 선택되는 치환체를 함유할 수 있음)를 나타내거나, 또는 R₂및 R₃은 인접하는 질소 원자와 함께 완전 포화된 5 내지 7원 헤테로시클릭 고리(이 고리는 O, S 및 N으로부터 선택되는 헤테로 원자를 임의로 더 함유할 수 있으며, 고리 탄소 상에서 (C₁-C₄)알킬, 벤질, 카르복시, 술포, 카르복시(C₁-C₄)알킬 및 술포(C₁-C₄)알킬로부터 선택되는 1 또는 2개의 치환체를 임의로 함유할 수 있음)를 나타내고, R₄는 수소, 메틸 또는 히드록시메틸을 나타내고, 단 R₄가 수소 또는 히드록시메틸인 경우, R은 메톡시메틸이고 동시에 R₁은 메틸이다.
제1항에 있어서, R이 메톡시메틸이고, 다른 치환제들은 제1항에 정의된 바와 같은 것인 화합물.
제1항에 있어서, R이 메톡시메틸이고, R₁및 R₄가 메틸이고, Y가 식(여기서, R₂는 수소이고, R₃은 제1항에 정의된 바와 같음)의 기인 화합물.
제1항에 있어서, R이 수소, 히드록시메틸 또는 메톡시메틸이고, R₁이 수소 또는 메틸이고, R₄가 수소, 메틸 또는 히드록시메틸이고, Y가 식 NR₂R₃(여기서, R₂는 수소이고, R₃은 COOH, SO₃H 및 PO₃H₂로부터 선택된 기로 치환된, 바람직하게는 탄소 원자수 3 내지 12, 더 바람직하게는 탄소 원자수 3 내지 7의 직쇄 알킬 사슬임)의 기인 화합물.
제1항에 있어서, R이 수소, 히드록시메틸 또는 메톡시메틸이고, R₁이 수소 또는 메틸이고, R₄가 수소, 메틸 또는 히드록시메틸이고, Y가 식 NR₂R₃(여기서, R₂는 수소이고, R₃은 CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-COOH임)의 기인 화합물.
불활성 유기 용매 중에서, 그리고 W가 카르복시인 경우에는 축합제 존재 하에서 하기 일반식(II)의 항생 물질 GE 2270 화합물을 일반식 HNR₂R₃(여기서, R₂및 R₃은 제1항에 정의된 바와 같은)의 선택된 아민과 반응시키는 것으로 이루어지는 제1항의 화합물의 제조 방법.

상기 식 중, W는 카르복시 또는 활성화 에스테르 관능기이고, R은 수소, 히드록시메틸 또는 메톡시메틸이고, R₁은 수소 또는 메틸이고, R₄는 수소, 메틸 또는 히드록시메틸이되, 단, R₄가 수소 또는 히드록시메틸인 경우, R은 메톡시메틸이고 동시에 R₁은 메틸이다.
제6항에 있어서, 상기 축합제가 디페닐포스포르아지데이트(DPPA), 디에틸 포스포르아지데이트, 디(4-니트로페닐)포스포르아지데이트, 디모르폴릴포스포르아지데이트와 같은 (C₁-C₄)알킬-, 페닐- 또는 헤테로시클릭 포스포르아지데이트 및 디페닐포스포로클로리데이트로부터 선택된 것인 방법.
제6항 또는 7항에 있어서, 아민 반응 물질 HNR₂R₃이 출발 항생 물질에 대해 1 내지 2배의 몰 과량으로 사용되고, 반응 온도가 0 내지 20℃인 방법.
활성 성분으로서 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 화합물과 제약학적으로 허용되는 담체와의 혼합물로 이루어진, 항생제로서 사용하기 위한 제약조성물.