DE69224497T2

DE69224497T2 - Faktor C2a des Antibiotikums CE 2270

Info

Publication number: DE69224497T2
Application number: DE69224497T
Authority: DE
Inventors: Luigi Colombo; Maurizio Denaro; Enrico Selva; Sergio Stella
Original assignee: Biosearch Italia SpA
Current assignee: Vicuron Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1991-08-30
Filing date: 1992-08-12
Publication date: 1998-07-02
Anticipated expiration: 2012-08-13
Also published as: ES2113391T3; JP3122248B2; DK0529410T3; KR100249871B1; CA2077102C; JPH0649087A; US5514649A; DE69224497D1; KR930004471A; EP0529410A3; EP0529410B1; ATE163428T1; CA2077102A1; EP0529410A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue antibiotische Substanz, die als Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a bezeichnet wird, deren Additionssalze, die Arzneimittel davon und ihre Verwendung als Medikament, insbesondere in der Behandlung von Infektionskrankheiten unter Beteiligung von Mikroorganismen, die hiergegen empfindlich sind.
Die erfindungsgemäße Verbindung ist außerdem als wachstumsförderndes Mittel bei Tieren, wie z.B. Geflügel, Schwein, Wiederkäuern usw., wirksam.
Die erfindungsgemäße Verbindung wird aus den Kulturen von Planobispora rosea ATCC 53773 oder einer das Antibiotikum GE 2270 produzierenden Variante oder Mutante davon isoliert, die zur Herstellung des Faktors C2a befähigt ist. Insbesondere wird sie im Myzel und auch in den Fermentationsbrühen des gezüchteten Mikroorganismus gefunden.
Planobispora rosea ATCC 53773 wurde aus einer Bodenprobe isoliert und am 14. Juni 1988 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 Maryland, USA, unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt.
Der Stamm erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 53773. Dieser Stamm wurde bereits in der Europaischen Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 359062 in Zusammenhang mit der Herstellung einer neuen antibiotischen Substanz mit der Bezeichnung Antibiotikum GE 2270-Faktor A beschrieben.
Die erfindungsgemäße Verbindung wird durch den vorstehend genannten mikrobiellen Stamm zusammen mit dem Antibiotikum GE 2270-Faktor A, der normalerweise als größte Fraktion vorliegt, und mit den Faktoren B&sub1;, B&sub2;, C&sub1;, C&sub2;, D&sub1;, D&sub2;, E und T des Antibiotikums GE 2270 produziert, die in der europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 451486, die der US-Patentanmeldung Serien-Nr. 856 857 entspricht, wobei beide die Priorität vom 8. März 1990 und 22. Oktober 1990 beanspruchen, und in den europäischen Patentanmeldungen mit der Serien-Nr. 90104409.9 bzw. der Serien-Nr. 90120214.3, beschrieben werden.
Die Herstellung von Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a erfolgt durch Züchtung eines zur Herstellung dieser Substanz befähigten Planobispora-Stammes, d.h. von Planobispora rosea ATCC 53773 oder einer das Antibiotikum GE 2270 produzierenden Variante oder Mutante davon, die zur Herstellung des Faktors C2a befähigt ist, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält. Hierfür können viele der Nährmedien verwendet werden, die üblicherweise auf dem Fachgebiet der Fermentation eingesetzt werden, jedoch sind bestimmte Medien bevorzugt. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Glucose, Mannose, Galactose, Stärke, Maismehl und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Ammoniak, Nitrate, Sojamehl, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trypton, Aminosäuren und dergleichen. Zu den anorganischen Salzen, die in den Kulturmedium enthalten sein können, zählen herkömmliche lösliche Salze, die Natrium-, Kalium-, Eisen-, Zink-, Kobalt-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat-, Phosphat-, Nitrat- und dergleichen Ionen liefern können.
Üblicherweise wird der das Antibiotikum produzierende Stamm in einem Schüttelkolben vorkultiviert, und diese Kultur wird dann für die Beimpfung von Glasfermentern zur Herstellung von großen Mengen der antibiotischen Substanzen verwendet. Für die Vorkultivierung kann das gleiche Medium verwendet werden, das auch für die größeren Fermentationen eingesetzt wird, jedoch können auch andere Medien verwendet werden. Der das Antibiotikum GE 2270 produzierende Stamm kann bei Temperaturen zwischen 20 und 40ºC, vorzugsweise zwischen 24 und 35ºC, gezüchtet werden.
Während der Fermentation kann die Erzeugung des Antibiotikums überwacht werden, indem Proben der Brühe oder des Myzelextraktes auf antibiotische Aktivität getestet werden, wobei z.B. Biotests oder DC- oder HPLC-Verfahren verwendet werden können.
Organismen, die gegen den Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a empfindlich sind, wie z.B. Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus, können als Testorganismen verwendet werden. Der Biotest wird günstigerweise nach dem Agardiffusionsverfahren auf Agarplatten durchgeführt. Maximale Produktion der antibiotischen Aktivität findet im allgemeinen zwischen dem zweiten und dem achten Tag der Fermentation statt.
Der Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a wird durch Züchtung des Stammes Planobispora rosea ATCC 53773 oder einer das Antibiotikum GE 2270 produzierenden Mutante oder Variante davon, die zur Herstellung des Faktors C2a befähigt ist, erzeugt und hauptsächlich im Myzel gefunden, auch wenn eine bestimmte Menge des Produktes aus der Fermentationsbrühe isoliert werden kann.
Die morphologischen, physiologischen und chemotaxonomischen Merkmale des Stammes Planobispora rosea ATCC 53773 werden in der vorstehend erwähnten EP-A 359062 beschrieben.
Wie bei anderen Mikroorganismen sind auch die Merkmale der Stämme, die den Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a produzieren, Variationen unterworfen. So können z.B. künstliche Varianten und Mutanten des Stammes durch Behandlung mit verschiedenen bekannten Mutagenen erhalten werden, z.B. Uv-Strahlen, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen, radioaktive Strahlen und Chemikalien, wie z.B. salpetrige Säure, N-Methyl-N'-nitro- N-nitrosoguanidin und viele andere. Alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten, die zu einer Art der Gattung Planobispora gehören und den Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a erzeugen, werden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als äquivalent zu dem Stamm Planobispora rosea ATCC 53773 angesehen.
Wie vorstehend erwähnt wird der Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a hauptsächlich im Myzel des produzierenden Stammes gefunden, während ein kleinerer Teil der Substanz auch in der Fermentationsbrühe gefunden wird.

Gewinnung und Isolierung des Antibiotikums der vorliegenden Erfindung

Die Gewinnung von Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a aus dem Myzel oder den Fermentationsbrühen des produzierenden Mikroorganismus wird nach bekannten Techniken durchgeführt, z.B. mittels Extraktion mit Lösungsmitteln, Fällung durch Zusatz von Nicht-Lösungsmitteln oder durch Änderung des pH-Wertes der Lösung, Verteilungschromatographie, Adsorptionschromatographie Umkehrphasen-Verteilungschromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Molekülausschluß-Chromatographie und dergleichen.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäßen antibiotischen Substanz aus dem Myzel umfaßt die Extraktion des abfiltrierten oder abzentrifugierten Myzels mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, das Einengen des Extraktes und die Gewinnung der rohen antibiotischen Substanz durch Fällung, gegebenenfalls unter Zusatz eines Fällungsmittels, durch Extraktion des wäßrigen Restes mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel oder durch Adsorptions-Chromatographie und anschließende Elution des gewünschten Produktes von der Adsorptionsmatrix.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Antibiotikums aus der Fermentationsbrühe umfaßt die Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, gefolgt von der Fällung aus den eingeengten Extrakten, gegebenenfalls unter Zusatz eines Fällungsmittels, oder durch weitere Extraktion eines wäßrigen Rückstands davon mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel. In einer anderen Ausführungsform kann die Fermentationsbrühe mit einer Adsorptions-Matrix in Kontakt gebracht werden, worauf die Elution mit einem polaren Elutionsgemisch folgt. Dieses chromatographische Verfahren kann auch, anstatt mit der Brühe selbst, mit einem aus der Fermentationsbrühe erhaltenen eingeengten Extrakt durchgeführt werden.
Die in dieser Anmeldung verwendete Bezeichnung "mit Wasser mischbares Lösungsmittel" soll die Bedeutung haben, die sie üblicherweise auf dem Fachgebiet hat, und betrifft Lösungsmittel, die unter den eingesetzten Bedingungen mit Wasser in einem angemessen großen Konzentrationsbereich mischbar sind.
Beispiele der mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, die zur Extraktion der erfindungsgemäßen antibiotischen Substanz aus der Myzelmasse verwendet werden können, sind: Niederalkanole, z.B. (C&sub1;-C&sub3;)-Alkanole, wie Methanol, Ethanol und Propanol; Niederketone, z.B. (C&sub3;-C&sub4;)-Ketone, wie Aceton und Methylethylketon; zyklische Ether, wie Dioxan und Tetrahydrofuran; Glykole und ihre Produkte einer partiellen Veretherung, wie Ethylenglykol, Propylenglykol und Ethylenglykolmonomethylether; Niederamide, wie Dimethylform-amid und Diethylformamid; und Dimethylsulfoxid.
Die in dieser Anmeldung verwendete Bezeichnung "mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel" soll die Bedeutung haben, die sie üblicherweise auf dem Fachgebiet hat, und betrifft Lösungsmittel, die unter den eingesetzten Bedingungen mit Wasser in einem angemessen großen, für die geplante Verwendung geeigneten Konzentrationsbereich schwach mischbar oder praktisch nicht mischbar sind.
Beispiele von mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln, die zur Extraktion der erfindungsgemäßen antibiotischen Substanz aus der Fermentationsbrühe verwendet werden können, sind: die herkömmlichen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, die linear, verzweigt oder zyklisch sein können, wie Hexan oder Cyclohexan; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan, Fluorbromethan, Dibromethan, Trichlorpropan, Chlortrifluoroctan und dergleichen; aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol, xylol und dergleichen; Ester mit mindestens vier Kohlenstoffatomen, wie Essigsäureethylester, Essigsäurepropylester, Buttersäureethylester und dergleichen; Alkanole mit mindestens vier Kohlenstoffatomen, die linear, verzweigt oder zyklisch sein können, wie Butanol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3- Pentanol, 1-Hexanol, 2-Hexanol, 3-Hexanol, 3,3-Dimethyl-1-butanol, 4-Methyl-1-pentanol; 3-Methyl-1-pentanol, 2,2-Dimethyl-3-pentanol, 2,4-Dimethyl-3-pentanol, 4,4-Dimethyl-2-pentanol, 5-Methyl-2-hexanol, 1-Heptanol, 2-Heptanol, 5-Methyl-1-hexanol, 2-Ethyl-1-hexanol, 2-Methyl-3-hexanol, 1-Octanol, 2-Octanol, Cyclopentanol, 2-Cyclopentylethanol, 3-Cyclopentyl-1-propanol, Cyclohexanol, Cycloheptanol, Cyclooctanol, 2,3-Dimethylcyclohexanol, 4-Ethylcyclohexanol, Cyclo-octylmethanol, 6- Methyl-5-hepten-2-ol, 1-Nonanol, 2-Nonanol, 1-Decanol, 2-Decanol und 3-Decanol; unverzweigte oder verzweigte Alkylether und Gemische davon, wie Ethylether, Propylether, Butylether usw.; und Gemische oder funktionelle Derivate davon.
Wie dem Fachmann bekannt ist, kann die Extraktion des Produktes durch Salzzugabe zu dem das Produkt enthaltenden wäßrigen Phase verbessert werden.
Wenn bei Durchführung einer Extraktion eine wäßrige Phase gewonnen wird, die eine wesentliche Menge eines organischen Lösungsmittels enthält, kann es günstig sein, das Wasser daraus azeotrop abzudestillieren. Im allgemeinen erfordert dies die Zugabe eines Lösungsmittels, das mit Wasser minimale azeotrope Gemische erzeugen kann, worauf gegebenenfalls die Zugabe eines Fällungsmittels folgt, um das gewünschte Produkt auszufällen. Repräsentative Beispiele von organischen Lösungsmitteln, die mit Wasser minimale azeotrope Gemische erzeugen können, sind n-Butanol, Benzol, Toluol, Butylether, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, Cyclohexan, 2,5-Dimethylfuran, Hexan und m-Xylol; wobei n-Butanol das bevorzugte Lösungsmittel ist.
Beispiele von Fällungsmitteln sind Petrolether, Niederalkylether, wie Ethylether, Propylether und Butylether, und Niederalkylketone, wie Aceton.
Nach Gewinnung des Rohgemisches, wie vorstehend beschrieben, kann es gegebenenfalls erforderlich sein, es einem weiteren Reinigungs/Einengungsschritt zu unterwerfen, bevor die einzelne erfindungsgemäße antibiotische Substanz abgetrennt wird. Ein chromatographisches Verfahren ist in diesem Fall die erste Wahl.
Wie vorstehend erwähnt, wird der erfindungsgemäße Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a normalerweise zusammen mit den Antibiotikum GE 2270-Faktoren A, B&sub1;, B&sub2;, C&sub1;, C&sub2;, D&sub1;, D&sub2;, E und T erzeugt. Aus diesem Grund ist es im allgemeinen erforderlich, den Faktor C2a von dem Hauptfaktor (d.h. Faktor A) und den anderen, in geringeren Mengen erzeugten Faktoren (d.h. den Faktoren B&sub1;, B&sub2;, C&sub1;, C&sub2;, D&sub1;, D&sub2;, E und T) abzutrennen.
Im allgemeinen wird das aus der Fermentation gewonnene Rohgemisch einer Reinigung unterworfen, wodurch ein gereinigtes Gemisch erhalten wird, das den Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a zusammen mit gewissen Mengen der anderen Faktoren enthält. Dieses Material wird sodann weiter gereinigt, wodurch die reine erfindungsgemäße Substanz erhalten wird.
Beispiele von Chromatographiesystemen, die zweckmäßigerweise im vorstehend erwähnten ersten Reinigungsschritt verwendet werden können, sind Polystyrol- oder gemischte Polystyrol- Divinylbenzol-Harze, wie Amberlite XAD2 oder XAD4 (Rohm und Haas), Dowex S112 (Dow Chemical Co.) und Diaion HP 20 (Mitsubishi); Acrylharze, wie XAD7 oder XAD8 (Rohm und Haas); Polyamide, wie Polycaprolactame, Nylon-Produkte und vernetzte Polyvinylpyrrolidone, die im allgemeinen ein Porenvolumen (ml/g) im Bereich zwischen 1 und 5, eine Oberfläche (m²/g) im Bereich zwischen 1 und 100, eine offensichtliche Dichte (g/ml) im Bereich zwischen 0,15 und 0,50, einen durchschnittlichen Porendurchmesser (Angström-Einheiten) im Bereich zwischen 100 und 3000 und eine Partikelgrößenverteilung aufweisen, wobei mindestens 40 % der Partikel kleiner als 300 µm sind, wie z.B. Polyamid-CC 6, Polyamid-SC 6, Polyamid-CC 6,6, Polyamid-CC 6AC und Polyamid-SC 6AC (Macherey-Nagel & Co., BRD), das Polyvinylpyrrolidon-Harz PVP-CL (Aldrich Chemie GmbH & Co. KG, BRD), das Polyamid-Harz PA 400 (M. Woelm Ag., BRD); und Kohlenstoff.
Ein bevorzugtes Elutionsmittel ist im Fall von Polystyrol- oder Acrylharz ein polares Lösungsmittelgemisch aus mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie den vorstehend erwähnten; das Elutionsmittel im Fall eines Polyamidharzes ist vorzugsweise ein wäßriges Gemisch eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie den vorstehend erwähnten, während ein bevorzugtes Elutionsmittel für Kohlenstoff ein Niederketon, wie Aceton, oder ein Niederalkohol, wie Methanol, ist.
Weitere chromatographische Verfahren, die im vorstehend beschriebenen Schritt günstigerweise verwendet werden können, umfassen auch eine Chromatographie auf stationären Phasen, wie Kieselgel, Aluminiumoxiden, Kieselgur und dergleichen, mit einer organischen Eluierungsphase, die aus Lösungsmitteln besteht, umfassend halogenierte Niederkohlenwasserstoffe, Niederalkanole, Ether und höhere Ketone des bereits vorstehend erwähnten Typs und Gemische davon.
Günstigerweise kann auch die sogenannte sterische Ausschlußchromatographie mit guten Reinigungsergebnissen verwendet werden. In diesem Fall werden insbesondere vernetzte Dextrane mit kontrollierter Porengröße nutzbringend eingesetzt, bei denen die meisten Hydroxylgruppen alkyliert sind, z.B. Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, AB).
Gegebenenfalls können die vorstehend erwähnten Verfahren wiederholt und/oder kombiniert werden.
Gemäß den vorstehend beschriebenen herkömmlichen Verfahren wird üblicherweise ein gereinigtes Gemisch erhalten, das neben der erfindungsgemäßen Verbindung noch gewisse Mengen der Antibiotikum GE 2270-Faktoren A, B&sub1;, B&sub2;, C&sub1;, C&sub2;, D&sub1;, D&sub2;, E und T enthalten kann.
Die Abtrennung des Antibiotikum GE 2270-Faktors C2a aus dem gereinigten Gemisch kann mit Hilfe von Verfahren erfolgen, die im allgemeinen aus den chromatographischen Techniken, z.B. den vorstehend erwähnten, ausgewählt werden. Jedoch scheint die Umkehrphasen-Chromatographie eine bevorzugte Trenntechnik zu sein. Neben der herkömmlichen Umkehrphasen-Säulen-Chromatographie kann auch eine präparative HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasensäule nutzbringend eingesetzt werden.
Die stationäre Phase kann bei dieser Chromatographietechnik z.B. silanisiertes Kieselgel mit verschiedenen funktionellen Derivatisierungen sein, und das Elutionsmittel kann ein wäßriges Gemisch aus den vorstehend erwähnten, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln sein.
Beispiele von funktionalisierten silanisierten Kieselgelen sind solche, die (C&sub8;-C&sub2;&sub2;)-Alkylreste, bei denen die funktionellen Gruppen z.B. Octadecylsilan- oder Octylsilan-Einheiten sind, oder Cyclohexan-, Phenyl- und ähnliche funktionelle Reste tragen. Diese Harze sind im Handel verfügbar, wobei regelmäßig neue Produkte angeboten werden, die ähnliche oder sogar verbesserte Eigenschaften besitzen und im erfindungsgemäßen Verfahren nutzbringend verwendet werden können.
Eine besonders bevorzugte präparative HPLC-Technik umfaßt ein Octadecyl-funktionalisiertes Kieselgel und ein Elutionsgemisch, das Acetonitril, Tetrahydrofuran und wäßriges Ammoniumformiat enthält.
Eine besonders bevorzugte Elutionsart stellt eine Elution mit einem linearen Gradienten aus der Phase A und der Phase B von etwa 40 % bis etwa 50 % der Phase A dar, wobei die Phase A ein Gemisch aus Acetonitril:Tetrahydrofuran:40 mM Ammoniumformiat von 40:40:20 und die Phase B ein Gemisch aus den gleichen Bestandteilen, jedoch im Verhältnis 10:10:80 ist.
Die Fraktionen werden wie üblich gemäß ihrer Beschaffenheit gesammelt, z.B. indem man das Elutionsprofil mit Hilfe eines herkömmlichen UV-Detektors bei 254 nm verfolgt, anschließend werden die Lösungsmittel durch bekannte Techniken entfernt (z.B. durch Eindampfen unter vermindertem Druck, Gefriertrocknung usw.), wodurch das erfindungsgemäße reine Antibiotikum isoliert wird, das gegebenenfalls von den in den Elutionsphasen vorliegenden Salzen noch weiter gereinigt werden kann, z.B. durch Adsorption an ein Polystyrol- oder ein gemischtes Polystyrol-Divinylbenzol-Harz, anschließendes Auswaschen der Salze mit destilliertem Wasser und Elution des Antibiotikums mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, und/oder das aus Niederalkanolen, wie Methanol, Ethanol, Propanol und Isopropanol, auskristallisiert werden kann.
Wie es auf dem Fachgebiet üblich ist, können die Herstellung wie auch die Gewinnungs- und Reinigungsschritte durch eine Vielzahl von Analyseverfahren überwacht werden, umfassend Biotests wie Papierscheiben- oder Agar-Diffusionstests auf empfindlichen Mikroorganismen, DC- oder HPLC-Verfahren, die gegebenenfalls einen Nachweisschritt mittels UV oder Mikroorganismen umfassen.
Eine bevorzugte HPLC-Analysentechnik ist eine Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Säule mit porösen und kugelförmigen Partikeln aus silanisiertem Kieselgel, z.B. Kieselgel, das mit C-8-Alkylgruppen funktionalisiert ist und einen gleichmäßigen Durchmesser aufweist (z.B. 5 µm Bakerbond C8, Baker Research Products, USA), und eines Elutionsmittels, das ein lineares Gradientengemisch eines polaren mit Wasser misch baren Lösungsmittels, wie vorstehend beschrieben, mit einem Gradienten steigender Polarität darstellt.
Ein bevorzugtes Elutionsgemisch sieht in diesem Fall folgendermaßen aus:
Phase A: CH&sub3;CN:Tetrahydrofuran:40 mM HCOONH&sub4;, 40:40:20,
Phase B: CH&sub3;CN:Tetrahydrofuran:40 mM HCOONH&sub4;, 10:10:80,
während ein bevorzugter Elutionsmodus ein linearer Gradient von 20 bis 30 % von Phase A in Phase B in etwa 20 Minuten, mit einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 1,8 ml/min und einem UV-Nachweis bei 254 nm ist.

Physikalisch-chemische Eigenschaften des Antibiotikum GE 2270- Faktors C2a

A) Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum, das mit einem Perkin Eimer Modell 320-Spektrometer aufgezeichnet wurde, zeigt die folgenden Absorptionsmaxima:
B. Das ¹H-NMR-Spektrum von Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a wurde bei 250 mHz mit einem Bruker-Spektrometer aufgezeichnet. Das Spektrum des Antibiotikums in DMSO-d&sub6; (Hexadeuterodimethylsulfoxid) unter Verwendung von TMS als interner Standard (0,00 ppm) zeigt die folgenden Signalgruppen [δ, ppm, Multiplizät] (s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, m = Multiplett, Py = Pyridin, Tz = Thiazol]:
9,03, d, (NH) ; 8,70, d, (2 NH's) ; 8,60, s, 8,54, s, 8,29, s und 7,38, s, (Tz-CH's) ; 8,48, m,
(Glycin NH); 8,43, d und 8,27, d, (Py-CH's); 7,35-7,20, m, (aromatische CH's und primäres Amid- NH); 6,98, s, (primäres Amid NH); 6,04, d, (OH); 5,80, t, (OH); 5,35-5,15, m, (αCH's); 5,04, m, (Phenylserin-βCH) ; 4,98, 5, [CH&sub2;(OCH&sub3;)] ; 4,87, d, [CH&sub2;(OH)]; 4,81, m und 4,56, m, (Oxazolin- CH&sub2;); 4,35-3,75, m, (CH&sub2; von Glycin und Prolinamid-CH's); 3,39, s, (OCH&sub3;); 2,71, m und 1,30, m, (CH&sub2; von Asparagin); 2,48, d, (NCH&sub3; von N-Methylasparagin); 2,22-1,80, m, (Isopropyl-CH und Prolinamid-CH's); 0,88 und 0,84, d, (Valin-CH&sub3;'s)
Figur 1 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum des Antibiotikum GE 2270-Faktors C2a.
C) Der Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a zeigt eine Retentionszeit (Rt) von 12,6 Minuten und eine Retentionszeit, bezogen auf den Antibiotikum GE 2270-Faktor A (Rt 16,6 min) von 0,76, wenn die Analyse mit dem folgenden Umkehrphasen-HPLC-System erfolgt:
Säule: Bakerbond C8 (5 µm), 4,6 x 250 mm (Bakerbond ist ein Warenzeichen für Umkehrphasen-Octylsilyl-Kieselgel- HPLC-Säulen, die von J. T. Baker Research Product, Phillisburg, New Jersey, 08865, USA, geliefert werden),
Durchflußgeschwindigkeit: 1,8 ml/Minute,
Phase A: CH&sub3;CN:Tetrahydrofuran:40 mM HCOONH&sub4;, 40:40:20,
Phase B: CH&sub3;CN:Tetrahydrofuran:40 mM HCOONH&sub4;, 10:10:80,
Elution: linearer Gradient von 20 % bis 30 % von Phase A in 20 Minuten;
Nachweis: UV 254 nm
D) Der Haupt-FAB-MS-Peak von Faktor C2a des Antibiotikums GE 2270 liegt bei 1306 Dalton. Dies entspricht mit größter Wahrscheinlichkeit dem niedrigsten Isotop des protonierten Molekülions. Die Analyse erfolgte auf dem doppelfokussierenden Massenspektrometer Kratos MS-50 unter Einsatz einer Beschleunigungsspannung von 8 kV und einer Sattelfeld-Atomkanone ("saddle field atom gun") mit Xe- Gas (2 x 10&supmin;&sup5; Torr Druck, angezeigt auf dem Meßgerät der Ionenquelle) bei 6 kV Spannung und 1 mA Strom. Das Antibiotikum wurde für die FAB-MS-Analyse mit einer Thioglycerin-Matrix, enthaltend 0,1 M Essigsäure, gemischt.
Aufgrund der vorstehend dargestellten physikalisch-chemischen Daten kann dem Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a vorläufig die folgenden Strukturformel zugeteilt werden:
Wie aus der vorstehenden Formel ersichtlich ist, enthält der Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a mehrere heterozyklische Baseneinheiten, die mit Säuren, wie Mineralsäuren und organischen Säuren, Additionssalze erzeugen können. Insbesondere sind Salze mit pharmazeutisch verträglichen Säuren bevorzugt.
Die antimikrobielle Aktivität des Antibiotikum GE 2270- Faktors C2a kann anhand einer Reihe von Standardtests in vitro gezeigt werden.
Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) wurden durch das Verfahren der Mikroverdünnung der Brühe bestimmt. Das Impfmaterial umfaßte jeweils 10&sup4; bis 10&sup5; KBE pro ml. Alle Mikroorganismen wurden bei 37ºC gezüchtet. MHK wurden nach 18 bis 24 Stunden abgelesen, mit Ausnahme von Neisseria gonorrhoeae, Bacteroides fragilis und Propionibacterium acnes (48 Stunden). N. gonorrhoeae wurde in einer 5 % CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert; Anaerobier wurden in einem anaeroben Gasgemisch inkubiert. Die folgenden Medien wurden verwendet: Oxoid Iso-Sensitest-Brühe (Staphylokokken, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa); Difco Todd-Hewitt-Brühe (Streptokokken); Difco GC-Base-Brühe mit 1 % BBL Isovitalex für N. gonorrhoeae; Difco Wilkins-Chaigren-Brühe für die Anaerobier.
Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK, µg/ml) des Antibiotikums sind nachstehend in Tabelle I dargestellt. TABELLE I In vitro-Aktivität des Antibiotikum GE 2270-Faktors C2a
Angesichts dieser Eigenschaften kann die erfindungsgemäße Verbindung als Wirkstoff zur Herstellung von Medikamenten für die Behandlung von Mensch oder Tier eingesetzt werden.
Insbesondere ist der Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a ein antimikrobielles Mittel, der hauptsächlich gegen gram-positive Bakterien und sowohl gram-positive als auch gram-negative Anaerobier wirksam ist. Er zeigt keine Kreuzresistenz mit Meticillin, Aminoglycosiden oder Glycopeptid-Antibiotika.
Die wichtigste therapeutische Indikation der erfindungsgemäßen antibiotischen Substanz besteht in der Behandlung von Infektionen unter Beteiligung eines Mikroorganismus, der dagegen empfindlich ist.
Der Begriff "Behandlung" soll auch die Prophylaxe, Therapie und Heilung umfassen.
Der Patient, der diese Behandlung erhält, ist ein beliebiges tierisches Lebewesen, das eine solche Behandlung nötig hat, einschließlich Primaten, insbesondere Menschen, und anderen Säugern, wie z.B. Pferd, Rind, Schwein und Schaf, außerdem Geflügel und Haustiere im allgemeinen.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann als solche oder als Gemisch mit pharmazeutisch verträglichen Trägern verabreicht werden, außerdem kann sie zusammen mit anderen antimikrobiellen Mitteln verabreicht werden, wie z.B. Penicillinen, Cephalosporinen, Aminoglycosiden und Glycopeptiden. Eine solche Kombinationstherapie umfaßt die aufeinanderfolgende, gleichzeitige und getrennte Verabreichung der Wirkstoffe in einer Weise, daß die therapeutischen Effekte des ersten verabreichten Wirkstoffs nicht vollständig verschwunden sind, wenn der nächste Wirkstoff verabreicht wird.
Eine bevorzugte pharmazeutische Formulierung ist eine Formulierung, die für eine örtliche Verabreichung auf intakte oder geschädigte Haut oder Schleimhaut geeignet ist. Beispiele solcher Formulierungen sind Pulver, Salben, Cremes und Lotionen. Die Excipienten in diesen Formulierungen sind die herkömmlichen pharmazeutisch verträglichen Vehikel, wie ölhaltige Salbengrundlagen (z.B. Cetylester-Wachs, Ölsäure, Olivenöl, Paraffin, Spermaceti, Stärkeglycerit); absorbierende Salbengrundlagen (z.B. wasserfreies Lanolin, hydrophiles Petrolatum), Emulsions-Salbengundlagen (z.B. Cetylalkohol, Glycerylmonostearat, Lanolin, Stearinsäure), wasserlösliche Salbengrundlagen (z.B. Glykolether und ihre Derivate, umfassend Polyethylenglykole, Poly(oxy-1,2-ethandiyl)-alpha-hydro-omegahydroxyoctadecanoat, Polysorbate und Polyethylenglykolmonostearate)
Diese Formulierungen können andere bekannte Excipienten, wie Konservierungsmittel, enthalten und werden nach Verfahren hergestellt, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und in herkömmlichen Nachschlagewerken, wie Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, 1985, Mack Publishing Co., beschrieben werden.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann auch als Formulierungen zubereitet werden&sub1; die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, wobei Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet per se bekannt sind und in Nachschlagewerken wie dem vorstehend erwähnten beschrieben werden.
Eine erfindungsgemäße Verbindung wird z.B. mit einem Solubilisierungsmittel, wie Polypropylenglykol oder Dimethylacetamid, und einem grenzflächenaktiven Mittel, wie Polyoxyethylensorbitanmonooleat oder polyethoxyliertem Rizinusöl in sterilem Wasser für die Injektion formuliert.
Ein Beispiel einer typischen Formulierung zur parenteralen Verabreichung umfaßt 10 mg des Antibiotikum GE 2270-Faktors C2a pro ml des endgültigen Präparates, 10 bis 20 % eines grenzflächenaktiven Mittels, das ein Polyoxyethylen-sorbitan- Fettsäureester, ein Polyoxyethylen-Rizinusöl-Derivat oder ein Polyoxyethylen-hydriertes Rizinusöl-Derivat sein kann, und bis 20 %, vorzugsweise 10 bis 20 % eines Solubilisierungsmittels, wie Propylenglykol, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, tert-Butyl-N-hydroxycarbamat, 1,2-, 1,3- oder 1,4-Butandiol, Ethyloleat, Tetrahydrofurfurylpolyethylen-glykol 200, Dimethylisosorbid, Benzylalkohol und dergleichen. Ein bevorzugtes Solubilisierungsmittel ist Propylenglykol.
Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureester sind im Handel erhältlich, und einige von ihnen werden unter dem Handelsnamen "Tween" vermarktet. Sie sind auch unter dem nicht-geschützten Namen der "Polysorbate" bekannt. Beispiele sind Polysorbat 20, 21, 40, 60, 61, 65, 80, 81 und 85. Für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Formulierungen ist Polysorbat 80 (Sorbitanmono-9-octadecanoat, Poly(oxy-1,2-ethandiyl)-Derivate) bevorzugt.
Polyoxyethylen-Rizinusöl und Polyoxyethylen-hydriertes- Rizinusöl sind auch im Handel erhältlich. Einige dieser Produkte werden unter dem Handelsnamen "Cremophor" vermarktet. Solche Verbindungen sind z.B. als Cremophor EL (polyethoxyliertes Rizinusöl), Cremophor RH 40 (polyethoxyliertes hydriertes Rizinusöl), Cremophor RH 60 (PEG 60 hydriertes Rizinusöl) oder Emulphor EL-719 (polyoxyethyliertes pflanzliches Öl) bekannt.
Eine Formulierung zur Injektion sollte vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von 7 ± 0,5 aufweisen. Gegebenenfalls kann es ratsam sein, den pH-Wert des Präparates mit einem geeigneten Puffer einzustellen. Am besten können hierfür TRIS- (d.h. Trishydroxymethylaminomethan) oder Phosphat - Puffer verwendet werden.
Eine bevorzugte Formulierung zur parenteralen Verabreichung umfaßt die folgenden Excipienten: Cremophor EL (Polyoxyl-35-Ricinusöl USP/NF) 20 %, Propylenglykol 5 bis 20 %, vorzugsweise 10 bis 20 .
Im allgemeinen können diese Formulierungen hergestellt werden, indem der Wirkstoff im organischen Lösungsmittel gelöst, anschließend der grenzflächenaktive Bestandteil zugegeben und schließlich mit sterilem Wasser zur Injektion auf das gewünschte Volumen verdünnt wird.
Andere Excipienten, wie z.B. Konservierungsmittel oder Stabilisatoren, können zugegeben werden, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist.
Ein Beispiel einer parenteralen Formulierung sieht folgendermaßen aus:
Antibiotikum GE 2270, Faktor C2a 10 mg
PEG 40 Rizinusöl (Cremophor EL) 0,2 ml Propylenglykol 0,2 ml
para-Hydroxybenzoesäuremethylester 0,5 mg
para-Hydroxybenzoesäurepropylester 0,5 mg Wasser zur Injektion q.s. 1 ml
In einer anderen Ausführungsform kann der Wirkstoff als gefriergetrocknetes Pulver hergestellt werden, das vor Verwendung aufgelöst wird.
Sofern das gefriergetrocknete Produkt aus einem Gemisch hergestellt wird, das den Wirkstoff und das grenzflächenaktive Mittel, wie Polyethylenglykol 60-hydriertes Rizinusöl, enthält, kann es zweckmäßigerweise in dem wäßrigen Medium alleine ohne Zusatz eines organischen Lösungsmittels gelöst werden.
Gegebenenfalls kann ein herkömmliches Gefriertrocknungs- Hilfsmittel zugegeben werden, um ein gefriergetrocknetes Material in Pulverform zu erhalten.
Vorzugsweise werden alle diese Formulierungen zur i.v.- Verabreichung zur Behandlung einer beliebigen Infektion verwendet, bei der ein Mikroorganismus beteiligt ist, der gegen das erfindungsgemäße Antibiotikum empfindlich ist.
Bei der Behandlung der pseudomembranösen Kolitis oder anderer Krankheiten, die auf das Vorliegen von Anaerobiern im Gastrointestinaltrakt zurückzuführen sind, kann eine wirksame Dosis der erfindungsgemäßen Verbindung in geeigneter pharmazeutischer Form oral verabreicht werden, z.B. als Kapsel, Tablette oder als wäßrige Suspension.
Die Dosierung des Wirkstoffs hängt von vielen Faktoren ab, umfassend Art, Alter und Zustand des Patienten, den spezifischen Wirkstoff und die für die Verabreichung gewählte Formulierung, das Verabreichungsschema usw.
Im allgemeinen werden wirksame antimikrobielle Dosierungen mittels einer einzelnen Einheitsdosierungsform verabreicht.
Wiederholte Anwendungen/Verabreichungen, z.B. zwei- bis sechsmal täglich, sind im allgemeinen bevorzugt. Eine wirksame Dosis kann im allgemeinen im Bereich von 0,5 bis 50 mg pro kg Körpergewicht pro Tag liegen.
Ein bevorzugtes örtlich appuzierbares Präparat ist eine Salbe, die 1 bis 10 % der erfindungsgemäßen Verbindung enthält.
In jedem Fall wird der verschreibende Arzt in der Lage sein, die optimale Dosierung für einen bestimmten Patienten in der jeweiligen Situation festlegen.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann neben ihrer Verwendung als Medikament zur Behandlung von Mensch und Tier auch als wachstumsförderndes Mittel bei Tieren eingesetzt werden.
Für diesen Zweck wird die erfindungsgemäße Verbindung in einem geeigneten Futtermittel oral verabreicht. Die genaue verwendete Konzentration ist diejenige, die erforderlich ist, damit der Wirkstoff beim Verzehr normaler Futtermengen in einer wirksamen wachstumsfördernden Menge bereitgestellt wird.
Der Zusatz des erfindungsgemäßen Wirkstoffs zum Tierfutter wird vorzugsweise durchgeführt, indem zuerst ein geeignetes Futtermittel-Vorgemisch hergestellt wird, das den Wirkstoff in einer wirksamen Menge enthält, und sodann das Vorgemisch in die gesamte Ration eingemischt wird.
In einer anderen Ausführungsform kann ein intermediäres Konzentrat oder ein Futtermittelzusatz, das/der den Wirkstoff enthält, unter das Futter gemischt werden. Die Art und Weise, wie solche Futtermittel-Vorgemische und komplette Rationen zubereitet und verabreicht werden können, werden in Nachschlagewerken beschrieben (wie E. W. Crampton et al., "Applied Animal Nutrition", W. H. Freedman und Co., S. Francisco, USA, 1969, oder D. C. Church, "Livestock Feeds and Feeding", O and B Books, Corvallis, Oregon, USA, 1977).
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung der Erfindung und sollen in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken.

Beispiel 1

Herstellung der Antibiotikum GE 2270-Faktoren durch Fermentation

Zwei 500 ml-Erlenmeyerkolben, die 100 ml Anzuchtmedium enthielten (Stärke 2 %, Polypepton 0,5 %, Hefeextrakt 0,3 %, Fleischextrakt 0,2 % Sojabohnenmehl 0,2 %, Calciumcarbonat 0,1 %, vor der Sterilisation auf pH 7,0 eingestellt) wurden mit einer auf Schrägagar gezüchteten Kultur von Planobispora rosea ATCC 53773 beimpft. Drei 500 ml-Erlenmeyerkolben mit Vorkulturmedium wurden mit der Kultur beimpft (5 % Impfgut), die 96 Stunden bei 28ºC auf einem Kreisschüttler (200 UpM) inkubiert worden war.
Die Kulturen in den drei Erlenmeyerkolben wurden 72 Stunden bei 28ºC auf einem Kreisschüttler (200 UpM) inkubiert und anschließend wurde ein 10 l-Glasfermenter damit beimpft, der 6 1 des Anzuchtmediums enthielt. Nach 72 Stunden Inkubation bei 28ºC unter Rühren bei 900 UpM und Belüftung (etwa ein Standard-Liter Luft pro Volumen pro Minute) wurde ein Glasfermenter, der 200 1 Produktionsmedium enthielt (Stärke 2 %, Pepton 0,25 %, hydrolysiertes Casein 0,25 %, Hefeextrakt 0,3 %, Fleischextrakt 0,2 % Sojamehl 0,2 % Calciumcarbonat 0,1 %, vor der Sterilisation auf pH 7,4 eingestellt), mit der Kultur beimpft.
Nach 126 Stunden Fermentation bei 28ºC unter Rühren bei 180 UpM und Belüftung (etwa 0,5 Standard Liter Luft pro Volumen pro Minute) enthielt die geerntete Brühe das erfindungsgemäße Antibiotikum zusammen mit den anderen GE 2270-Faktoren.

Beispiel 2

a) Gewinnung der rohen GE 2270-Faktoren

Das Myzel wurde durch Filtration mit einem Hyflo- Filtrierhilfsmittel aus der geernteten Brühe gewonnen. Der Myzelkuchen wurde nacheinander mit 60 und 20 1 Aceton extrahiert und die vereinigten Extrakte unter vermindertem Druck eingeengt. Der rohe antibiotische Komplex wurde durch Zentrifugation in einem Flüssigkeit-Feststoff-Separator vom wäßrigen Rückstand abgetrennt. Das feuchte Material wurde in 2-Propanol solubilisiert und die Lösung unter vermindertem Druck eingeengt, um das Wasser zu entfernen. Der rohe antibiotische Komplex (50 g) fiel aus dem eingeengten Rückstand aus. Dieser rohe Komplex enthält eine Hauptmenge an Antibiotikum GE 2270- Faktor A, zusammen mit dem Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a und den anderen vorstehend erwähnten in kleineren Mengen vorliegenden Faktoren.

b) Isolierung eines gereinigten Gemisches, das Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a als Gemisch mit anderen Faktoren enthält

Die Präparate der rohen GE 2270-Faktoren aus sechs wiederholten Fermentationen wurden vereinigt und mit 12 l CH&sub2;Cl&sub2;:Methanol (93:7) gerührt. Das unlösliche Material wurde abfutriert und die den antibiotischen Komplex enthaltende Lösung auf eine Säule aus 13 kg (230-400 Mesh) Kieselgel, äquilibriert in CH&sub2;c1&sub2;:Methanol (93:7), aufgetragen. Der Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a wurde von der Säule mit CH&sub2;Cl&sub2;:Methanol (93:7) eluiert. Die Fraktionen, die das erfindungsgemäße Antibiotikum enthielten (HPLC-Analyse) wurden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und getrocknet, wodurch 23,5 g des Antibiotikum GE 2270-Faktors C2a im Gemisch mit anderen, in kleineren Mengen vorliegenden Faktoren erhalten wurden.
Ein Teil (5,5 g) dieses Präparats wurde erneut durch Flash-Chromatographie auf einer Säule gereinigt, die 400 g Kieselgel (230-400 Mesh) enthielt, äquilibriert in Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;). Die Säule wurde zuerst in Methylenchlorid (1 Liter) und dann nacheinander mit einer Serie von Gemischen aus Methylenchlorid/Methanol in den folgenden Verhältnissen (Vol./Vol.) entwickelt: 96/4 (3 Liter); 94/6 (1 Liter); 92/8 (2 Liter) ; 90/10 (6 Liter) und 88/12 (4 Liter)
Die Fraktionen, die hauptsächlich Antibiotikum GE 2270- Faktor C2a enthielten (HPLC-Analyse), wurden vereinigt und eingeengt. Das Antibiotikum-Präparat (646 mg) wurde durch Zusatz von Petrolether ausgefällt.

Beispiel 3

Isolierung des reinen Antibiotikum GE 2270-Faktors C2a

Das gereinigte Gemisch, das hauptsächlich den Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a enthielt, wurde aus dem vorstehend beschriebenen Präparat weiter durch präparative HPLC gereinigt.
Ein Teil des vorstehend beschriebenen Präparats des Antibiotikums (10 mg) wurde in 1 ml Phase A (CH&sub3;CN: Tetrahydrofuran:40 mM HCOONH&sub4; - 40:40:20) und 1 ml Phase B (CH&sub3;CN: Tetrahydrofuran:40 mM HCOONH&sub4; - 10:10:80) solubilisiert und in eine HPLC-Hibar-Säule, 250 x 20 mm, injiziert (E. Merck, Darmstadt, BRD), die mit 7 µm Nucleosil C18 (Kieselgel, funktionalisiert mit Octadecylsilangruppen), äquilibriert mit einem Gemisch aus 40 % Phase A und 60 % Phase B gepackt war. Die Säule wurde bei 15 ml/min Durchflußgeschwindigkeit über 22 Minuten mit einem linearen Gradienten von 40 bis 50 % Phase A eluiert. Der UV- Nachweis erfolgte bei 254 nm. Die Fraktionen aus 10 aufeinanderfolgenden chromatographischen Läufen, die das reine erfindungsgemäße Antibiotikum enthielten, wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, um CH&sub3;CN zu entfernen. Der Antibiotikum GE 2270-Faktor C2a fiel in Wasser aus. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch 66 mg des reinen Antibiotikums erhalten wurden.

Claims

1. Antibiotikum GE 2270-Faktor C2al der die folgenden Eigenschaften aufweist:

A) Ultraviolett-Absorptionsspektrum, das die folgenden Absorptionsmaxima zeigt:

B) ¹H-NMR-Spektrum, das die folgenden Signalgruppen in DMSO-d&sub6; (Hexadeuterodimethylsulfoxid) unter Verwendung von TMS als internem Standard (0,00 ppm) zeigt [δ, ppm, Multiplizität] (s Singulett, d = Dublett, t = Triplett, m = Multiplett, Py = Pyridin, Tz = Thiazol) 9,03, d, (NH); 8,70, d, (2 NH's); 8,60, s, 8,54, s, 8,29, s und 7,38, 5, (Tz-CH's) ; 8,48, m, (Glycin-NH); 8,43, d und 8,27, d, (PYCH's); 7,35-7,20, m, (aromatische CH's und primäres Amid- NH); 6,98, s, (primäres Amid- NH); 6,04, d, (OH); 5,80, t, (OH); 5,35-5,15, m, (αCH's) ; 5,04, m, (Phenylserin-βCH); 4,98, s, (CH&sub2;(OCH&sub3;)]; 4,87, d[CH&sub2; (OH)]; 4,81, m und 4,56, m, (Oxazolin- CH&sub2;); 4,35-3,75, m, (CH&sub2; von Glycin und Prolinamid-CH's); 3,39, 5, (OCH&sub3;); 2,71, m und 1,30, m, (CH&sub2; von Asparagin); 2,48, d, (NCH&sub3; von N-Methylasparagin); 2,22-1,80, m, (Isopropyl-CH und Prolinamid-CH's); 0,88 und 0,84, d, (Valin CH&sub3;'s)

C) Retentionszeit (Rt) von 12,6 Minuten und eine Retentionszeit, bezogen auf den Antibiotikum GE 2270-Faktor A (Rt 16,6 min) von 0,76 im folgenden Umkehrphasen-HPLC System:

Säule: Bakerbond C8 (5 µm), 4,6 x 250 mm,

Durchflußgeschwindigkeit: 1, 8 ml/Minute,

Phase A: CH&sub3;CN:Tetrahydrofuran:40 mM HCOONH&sub4;, 40:40:20,

Phase B: CH&sub3;CN:Tetrahydrofuran:40 mM HCOONH&sub4;, 10:10:80, Elution: linearer Gradient von 20 % bis 30 % von Phase A in 20 Minuten;

Nachweis: UV 254 nm;

D) Haupt-FAB-MS-Peak, entsprechend dem niedrigsten Isotop des protonierten Molekülions, der einen Wert von 1306 Dalton zeigt, erhalten auf dem doppelfokussierenden Massenspektrometer Kratos MS-50 unter Einsatz einer Beschleunigungsspannung von 8 kV und einer Sattelfeld- Atomkanone ("saddle field atom gun") mit Xe-Gas (2 x 10&supmin;&sup5; Torr Druck, angezeigt auf dem Meßgerät der Ionenquelle), bei 6 kV Spannung und 1 InA Strom, wobei die Probe mit $ einer Thioglycerin-Matrix, enthaltend 0,1 M Essigsäure, gemischt wird;

und seine Additionssalze.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikum GE 2270- Faktors C2a, der die folgenden Eigenschaften aufweist:

A) Ultraviolett-Absorptionsspektrum, das die folgenden Absorptionsmaxima zeigt:

B) ¹H-NMR-Spektrum, das die folgenden Signaigruppen in DMSO-d&sub6; (Hexadeuterodimethylsulfoxid) unter Verwendung von TMS als internem Standard (0,00 ppm) zeigt [δ, ppm, Multiplizität] (s = Singulett, d = Dublett, t Triplett, m Multiplett, Py Pyridin, Tz Thiazol)

9,03, d, (NH); 8,70, d, (2 NH's); 8,60, s, 8,54, s, 8,29, s und 7,38, 5, (Tz-CH's); 8,48, m, (Glycin-NH); 8,43, d und 8,27, d, (Py-CH's); 7,35-7,20, m, (aromatische CH's und primäres Amid- NH); 6,98, s, (primäres Amid-NH); 6,04, d, (OH); 5,80, t, (OH); 5,35-5,15, m, (αCH's) ; 5,04, m, (Phenylserin-βCH); 4,98, 5, [CH&sub2;(OCH&sub3;)]; 4,87, d, CCH&sub2;(OH)]; 4,81, m und 4,56, m, (Oxazolin- CH&sub2;); 4,35-3,75, m, (CH&sub2; von Glycin und Prolinamid-CH's); 3,39, s, (OCH&sub3;); 2,71, m und 1,30, m, (CH&sub2; von Asparagin); 2,48, d, (NCH&sub3; von N-Methylasparagin); 2,22-1,80, m, (Isopropyl-CH und Prolinamid-CH's); 0,88 und 0,84, d, (Valin-CH&sub3;'s)

Säule: Bakerbond C8 (5 µm), 4,6 x 250 mm,

Durchflußgeschwindigkeit: 1, 8 ml/Minute,

Phase A: CH&sub3;CN:Tetrahydrofuran:40 mM HCOONH&sub4;, 40:40:20,

Phase B: CH&sub3;CN:Tetrahydrofuran:40 mM HCOONH&sub4;, 10:10:80, Elution: linearer Gradient von 20 % bis 30 % von Phase A in 20 Ninuten,

Nachweis: UV 254 nm;

D) Haupt-FAB-MS-Peak, entsprechend dem niedrigsten Isotop des protonierten Molekülions, der einen Wert von 1306 Dalton zeigt, erhalten auf dem doppelfokussierenden Massenspektrometer Kratos MS-50 unter Einsatz einer Beschleunigungsspannung von 8 kV und einer Sattelfeld- Atomkanone mit Xe-Gas (2 x 10&supmin;&sup5; Torr Druck, angezeigt auf dem Meßgerät der Ionenquelle), bei 6 kV Spannung und 1 mA Strom, wobei die Probe mit einer Thioglycerin-Matrix, enthaltend 0,1 M Essigsäure, gemischt wird;

und seiner Additionssalze, umfassend die Trennung des Antibiotika-Gemisches, das aus der Fermentation von Planobispora rosea ATCC 53773 oder einer den GE 2270-Faktor C2a produzierenden Mutante oder Variante davon unter submersen aeroben Bedingungen erhalten wurde, mittels einer chromatogaphischen Technik.

Verfahren nach Anspruch 2, wobei die chromatographische Technik eine Umkehrphasen-Chromatographie umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Umkehrphasen-Chromatographie eine HPLC-Umkehrphasen-Chromatographie ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die stationäre Phase der Umkehrphasen-Chromatographie ein funktionalisiertes Kieselgel ist, das C&sub8;-C&sub2;&sub2;-Alkyl-, Cyclohexyl- oder Phenylreste trägt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die stationäre Phase ein funktionalisiertes Octadecyl-Kieselgel ist und die Elution mit einem Gemisch erfolgt, das Acetonitril, Tetrahydrofuran und Ammoniumformiat enthält.

Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das aus der Fermentation von Planobispora rosea ATCC 53773 oder einer den GE 2270-Faktor C2a produzierenden Mutante oder Variante davon erhaltene Antibiotika-Gemisch, das dem Trennschritt unterworfen wird, durch Extraktion des Myzels mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel und anschließende Gewinnung des rohen Antibiotika-Gemisches aus dem eingeengten wäßrigen Extrakt erhalten wird und das erhaltene Rohgemisch der GE 2270-Faktoren vor Durchführung der HPLC-Umkehrphasen-Chromatographie einem intermediären chromatographischen Reinigungschritt unterworfen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der intermediäre chromatographische Reinigungsschritt unter Verwendung von Kieselgel als stationärer Phase und halogenierten Niederkohlenwasserstoffen, Niederalkanolen oder Gemischen davon als eluierender Phase durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei das rohe Antibiotika-Gemisch aus dem eingeengten wäßrigen Extrakt durch azeotrope Entfernung des Wassers daraus und Zusatz eines Fällungsmittels zu der eingeengten Lösung gewonnen wird.

10. Arzneimittel, das die Verbindung nach Anspruch 1 im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.

11. Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament.

12. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zum antimikrobiellen Einsatz.

13. Nicht-medizinische Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 als wachstumsförderndes Mittel bei Tieren.