DE68905119T2

DE68905119T2 - Methode zur kontrolle von pneumocystis carinii.

Info

Publication number: DE68905119T2
Application number: DE8989309257T
Authority: DE
Inventors: Dennis M Schmatz
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1988-09-12
Filing date: 1989-09-12
Publication date: 1993-08-26
Anticipated expiration: 2009-09-13
Also published as: IE892924L; DK446389A; EP0359529B1; JPH0725692B2; ES2054017T3; DK446389D0; CA1333150C; JPH02288837A; DE68905119D1; DK173802B1; EP0359529A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Pneumocystis carinii ist ein opportunistischer Organismus, der weit verbreitet ist, aber gewöhnlich ruht, bis die körperlichen Abwehrkräfte des Wirts beeinträchtigt sind, worauf er sich im Wirt fortpflanzt und Krankheiten verursacht. Er befindet sich im allgemeinen in den Lungen, obwohl auch über Infektionen außerhalb der Lunge berichtet wurde. Durch diesen Organismus hervorgerufene Infektionen der Lunge bei Personen, deren Immunsystem beeinträchtigt ist, führen im allgemeinen zu Pneumonien und sind gewöhnlich tödlich, wenn sie nicht behandelt werden. Man hat darauf hingewiesen, daß bei Personen, deren Immunsystem beeinträchtigt ist, auch eine Übertragung von einem Patienten zum anderen vorkommen kann. Der Zustand der Personen, deren Immunsystem beeinträchtigt ist, wird gewöhnlich von genetischen Defekten, von lymphoprolerativen Krankheiten, von den Folgen einer Krebstherapie oder einer Behandlung mit immunsuppressiven Arzneimitteln oder als deren Folge von AIDS begleitet. Die meisten AIDS-Patienten ziehen sich schließlich eine Pneumocystis-carinii- Pneumonie (PCP) zu, sie lieferten in der letzten Zeit die Mehrzahl der Fälle dieser Krankheit. PCP ist fast immer tödlich, wenn sie nicht behandelt wird.
Die derzeitige Methode zur Behandlung der Pneumocystis- carinii-Pneumonie besteht in der Behandlung mit Trimethoprim/Sulfamethoxazol oder mit Pentamidin. Die Behandlung mit Trimethoprim/Sulfamethoxazol (TMP/SMZ) wird von einem hohen Grad an toxischen Nebenwirkungen begleitet, einschließlich Hautausschlag, erhöhter Leberfunktion, Übelkeit und Erbrechen, Anämie, Erhöhung der Kreatinwerte und in extremen Fällen vom Stevens-Johnson-Syndrom. Die durch TMP/SMZ verursachten Nebenwirkungen sind viel häufiger bei an AIDS leidenden Patienten. Die Behandlung mit Pentamidin ist ebenfalls von einem hohen Grad an Nebenwirkungen begleitet, einschließlich Nierenversagen, Hepatotoxizität, Hypoglykämie, hämatologischen Anomalien und Schmerzen oder Abszessen an der Injektionsstelle. Die durch die Behandlung verursachte Mortalität kann 20 bis 30 Prozent erreichen. Eine verbesserte Behandlungsmethode der Pneumocystis- carinii-Pneumonie bei Patienten mit beeinträchtigtem Immunsystem ist dringend erforderlich.
Die DE-A-28 03 581 beschreibt eine Gruppe von Derivaten des Echinocandin B, von denen über eine antimykotische Wirkung berichtet wird.
Die EP-A-00 32 009 hingegen beschreibt eine verwandte Klasse von halbsynthetischen cyklischen Peptiden, von denen über eine antimykotische Wirkung berichtet wird.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer antiinfektiösen oder einer die Infektion beherrschenden Menge einer Cyclohexapeptidverbindung zur Herstellung eines Arzneimittels, das für die Behandlung oder für die Vorbeugung von durch Pneumocystis carinii hervorgerufene Infektionen bei Säugetieren verwendbar ist.
Die Verbindungen, die von der vorliegenden Erfindung umfaßt werden, umfassen einen Pilzmetaboliten vom bekannten Echinocandin-Typ der Antibiotika, die lipophile Cyclohexapeptide mit einer Fettsäurenseitenkette sind, wie er weiter unten detailliert beschrieben wird; ferner einfache Derivate der Antibiotika vom Echinocandin-Typ, wie an der Seitenkette reduzierte Dihydro- und Tetrahydroprodukte, Ringether- und -esterderivate und halbsynthetische Produkte, in denen der Cyclohexapeptidring beibehalten wird, aber die Fettsäurenseitenkette ausgetauscht ist. Von den meisten in der Literatur beschriebenen Verbindungen wird gesagt, daß es sich um antimykotische Mittel handelt.
Die für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignete Verbindungen, die nicht nur in der Natur vorkommende Antibiotika, sondern auch einfache Derivate dieser Antibiotika und halbsynthetische Verbindungen umfassen, wie sie weiter unten detailliert beschrieben sind, können durch die allgemeine Formel (I) dargestellt werden.
In dieser und in den nachstehenden Formeln bedeuten
R' H oder OH;
R'' H oder OH;
R''' H, OH, -O-Alkyl(C&sub1;-C&sub6;), -O-Benzyl oder
wobei R¹ H, C&sub1;-C&sub1;&sub2; Alkyl, C&sub3;-C&sub7; Cycloalkyl, Hydroxyethyl, C&sub1;&submin;&sub6; Alkoxyalkyl, Furylmethyl, Tetrahydrofurylmethyl, Phenyl, Phenylalkyl, worin der Phenylrest durch Halogen, Hydroxy, C&sub1;&submin;&sub6; Alkyl oder C&sub1;&submin;&sub6; Alkoxy substituiert sein kann,
R² H oder C&sub1;&submin;&sub6; Alkyl oder
R¹ und R² zusammen den Rest -(CH&sub2;)&sub2;Q(CH&sub2;)&sub2;-, in dem Q -CH&sub2;-, -NH- oder -N-(C&sub1;&submin;&sub6;)Alkyl ist, darstellen und m 0 bis 4 ist;
R'''' H oder OH;
R''''' H, CH&sub3; oder CH&sub2;CONH&sub2;;
R'''''' H oder CH&sub3;, und
R
(A) - -Alkyl mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen,
(B) - -Alkenyl mit 6 bis 24 Kohlensatoffatomen,
(C) falls R', R'', R''' und R''' OH sind und R''''' und R'''''' CH&sub3; sind, einen der Reste
in denen A bivalenten Sauerstoff, Schwefel, Sulfinyl oder Sulfonyl;
A¹ bivalenten Sauerstoff, Schwefel, Sulfinyl, Sulfonyl oder -NH-;
X Wasserstoff, Chlor, Brom, Jod, Nitro, C&sub1;-C&sub3; Alkyl, Hydroxy, C&sub1;-C&sub3; Alkoxy, Mercapto, C&sub1;-C&sub3; Alkylthio, Carbamoyl oder C&sub1;-C&sub3; Alkylcarbamoyl;
X¹ Chlor, Brom oder Jod;
R¹ Wasserstoff, C&sub1;-C&sub1;&sub8; Alkyl oder C&sub2;-C&sub1;&sub8; Alkenyl; und W C&sub1;-C&sub1;&sub0; Alkylen oder C&sub2;-C&sub1;&sub0; Alkenylen darstellen und
m, n und p 0 oder 1 sind, wobei jedoch, wenn m 0 ist, n auch 0 sein muß;
vorausgesetzt daß die Summe der Kohlenstoffatome in den Resten R¹ und W größer als 4 ist und 21 nicht überschreitet, daß A und A¹ nicht Sulfinyl oder Sulfonyl sein können, wenn X Mercapto bedeutet, und daß, wenn A und A¹ Sulfinyl oder Sulfonyl bedeuten, sie auf der gleichen Oxidationsstufe sein müssen;
(D) falls R' OH ist und R'', R''' und R'''' H sind, dann
-Y- -R&sub2;
wobei Y ein bivalentes Aminoacylradikal der Formeln
a)
- -Z-NH-
worin Z C&sub1;-C&sub1;&sub0; Alkylen oder C&sub5;-C&sub6; Cycloalkylen ist,
b)
worin R&sub3; Hydroxymethyl, Hydroxyethyl, Mercaptomethyl, Mercaptoethyl, Methylthioethyl, 2-Thienyl, 3-Indolylmethyl, Phenyl, Benzyl, Halogenphenyl, Halogenbenzyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylphenyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylbenzyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylthiophenyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylthiobenzyl, Carbamoylphenyl, Carbamoylbenzyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylcarbamoylphenyl oder C&sub1;-C&sub3; Alkylcarbamoylbenzyl ist; oder
c)
worin X² Wasserstoff oder Halogen ist, darstellt.
Mit dem Bezeichnung "Alkyl" ist ein einwertiger gesättigter geradkettiger oder verzweigter Kohlenwasserstoffrest gemeint. Mit der Bezeichnung "Alkenyl" ist ein einwertiger ungesättigter geradkettiger oder verzweigter Kohlenwasserstoffrest gemeint, der nicht mehr als drei Doppelbindungen enthält. Mit der Bezeichnung "Halogen" ist Chlor, Brom, Fluor oder Jod gemeint.
Bei den Verbindungen, die für die Methode zur Behandlung oder zur Vorbeugung von Infektionen durch Pneumocystis carinii bei Säugetieren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, handelt es sich im allgemeinen um weiße kristalline oder pulverförmige Substanzen. Sie sind im allgemeinen in Alkoholen wie Methanol und Ethanol gut löslich, in Wasser und in Kohlenwasserstoffen wie Hexan schwer löslich und besitzen in vielen üblichen Lösungsmitteln eine dazwischen liegende Löslichkeit. Die Eigenschaften der Löslichkeit sowie andere Eigenschaften von vielen der natürlich vorkommenden Cycklohexapeptide sind im CRC Handbook of Antibiotic Compounds, Vol. IV, Part I, 355-367, CRC Press. Inc. Boca Raton, Florida 1980, zusammengefaßt.
Eine besonders bevorzugte Verbindung ist ein neuer Pilzmetabolit, bei dein R', R'', R'''und R'''' OH bedeuten, R''''' -CH&sub2;CONH&sub2;, R'''''' CH&sub3; und
sind, dargestellt durch die Formel IA
Die Verbindung kann 1-[4,5-Dihydroxy-N²-(10,12-dimethyl- 1-oxotetradecyl)-L-ornithin]-5-(threo-3-hydroxy-1-glutamin)- echinocandin B genannt werden, aber der Einfachkeit halber wird sie im Folgenden als Verbindung IA bezeichnet werden. Besonders bevorzugt ist das Isomere, 1-[(4R,5R)-4,5-Dihydro-xy-N²-(10,12-dimethyl- 1-oxotetradecyl-L-ornithin]-5-(threo-3-hydroxy-1-glutamin)echinocandin B. Die Herstellung und die Eigenschaften der Verbindung IA werden weiter unten beschrieben, sie sind auch der Gegenstand der gleichzeitig anhängigen Patentanmeldungen Serial No. 105.795, eingereicht am 07. Oktober 1987, die der EP 311 193 entspricht, und Serial No 105.797, eingereicht am 07. Oktober 1987, die der EP 311 194 entspricht, sie sind dort ausführlicher beschrieben.
Die Verbindung IA, die bevorzugte Verbindung, ist eine weiße Substanz, die durch die nachstehenden physikalischen Eigenschaften charakterisiert werden kann:
Die Zersetzungstemperatur beträgt 206-214ºC;
die Summenformel lautet C&sub5;&sub1;H&sub8;&sub2;N&sub8;O&sub1;&sub7;, sie wurde mittels High Resolution FAB (massenspektrometrische "Fast Atom Bombardement" Messung, berechnet für C&sub5;&sub1;H&sub8;&sub2;N&sub8;O&sub1;&sub7; + Li 1085,5958, gefunden 1085,6146) bestimmt;
die Zusammensetzung der Aminosäuren wurde mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie des Trimethylsilylderivats der gesamten sauren Hydrolysate bestimmt, es wurde je ein Äquivalent von Threonin, Hydroxyprolin, Methylhydroxyprolin und Hydroxyglutarsäure gefunden;
das ¹H NMR-Spektrum in CD&sub3;OD bei 400 MHz wird in der Figur 1 gezeigt;
die chemischen Verschiebungen des ¹³C-NMR, die in CD&sub3;OD bei 100 MHz erhalten wurden, waren wie folgt 11,20, 11,64, 19,75, 20,25, 20,78, 27,00, 28,07, 30,33, 30,37, 30,61, 30,76, 31,19, 31,29, 32,94, 34,83, 36,69, 38,10, 38,54, 39,07, 39,53, 45,93, 51,39, 53,01, 55,59, 56,31, 57,11, 58,35, 62,43, 68,18, 70,08, 70,55, 70,61, 71,26, 73,94, 75,72, 75,84, 76,86, 116,06(x2), 129,43(x2), 132,86, 158,22, 168,80, 172,16, 172,35, 172,40, 173,12, 174,24, 175,47, 176,88 ppm.
Die Verbindung ist in einer Reihe von organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Ethanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und ähnlichen, löslich.
Die Herstellung der vorliegende Erfindung IA, einer neuen Verbindung, wird weiter unten detailliert beschrieben. Die anderen Verbindungen, die für die vorliegende Erfindung verwendbar sind, können auf ähnliche Weise durch Verwendung eines geeigneten Mikroorganismus oder mittels anderer Verfahren, als sie nachstehend beschrieben sind, erhalten werden.
Die Verbindung IA kann durch Kultivierung eines Stammes eines Mikroorganismus, der in der Kulturensammlung von Merck & Co., Rahway, N.J., als MF 5171 bezeichnet uned als Zalerion arboricola identifiziert wurde, und durch Isolierung dieses Wirkstoffs aus dem Nährmedium erhalten werden. Eine Probe der Kultur, die fähig ist, die Verbindung IA zu produzieren, wurde gemäß dem Budapester Vertrag bei der Kulturensammlung der American Type Culture Collection in 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, hinterlegt. Die Probe wurde nter der Nummer ATCC 20868 registriert.
Die Beschreibung der Kolonien und der Morphologie von TCC 20868 folgt nachstehend:

A.Morphologische Beschreibung:

Kugelförmige, dickwandige, dunkel gefärbte Strukturen mit einem Durchmesser von etwa 6,0 Mikron, die sich ähnlich den Clamydosporen entlang eines Mycels entwickeln und oft intercalar aussehen. Diese Strukturen treten geteilt auf und bilden mehrzellige Gruppen von 4-8 Zellen, die nicht leicht aufzuaschließen sind. In einigen Medien kleben die Mycelstränge zusammen, wobei sie seilähnliche Strukturen bilden, und die mehrzelligen Gruppen bilden große Cluster, wie wen sie durch schleimige Substanzen zusammengehalten würden.

Beschreibung der Kolonien

1. Czapek-Dox-Agar

Die Kolonien wachsen langsam, das Wachstum ist nicht extensiv, sie sind flach mit unregelmäßigen Rändern. Das Mycel ist schwarz, glänzend; wenn die Kolonie altert, wird die Oberfläche matt, von körnigem Aussehen, schwarz bis grünlich-braun.

2. Maisagar

Die Kolonien wachsen langsam. Das Wachstum ist nicht extensiv. Das Mycel ist schwarz; wenn die Kolonie altert, wird die glänzende Oberfläche matt schwarz und pulverförmig.

3. Kartoffel-Dextroseagar, Sabouraud-Maltoseagar und Hefeextrakt-Malzextrakt-Dextroseagar

Die Kolonien wachsen langsam. Das Wachstum ist nicht extensiv, im Zentrum etwas verstärkt, strahlig gefurcht mit unregelmäßigen Rändern mit Ausnahme des Sabouraud-Maltose-agars, bei dem die Ränder glasig und regelmäßig sind. Das Mycel ist schwarz, glänzend; wenn die Kolonie altert, wird es ein mattes, schwarzes Pulver.
Obwohl die Erfindung nachstehend hauptsächlich im Hinblick auf den speziellen Stamm besprochen wird, können, wie der Fachwelt wohl bekannt ist, die Eigenschaften von Mikroorganismen natürlich und künstlich geändert werden. Es werden daher alle Stämme des Genus ATCC 20868 einschließlich der Varianten und Mutanten als unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallend angesehen, gleichgültig ob sie durch natürliche Selektion erhalten wurden oder durch Einwirkung von mutationsauslösenden Mitteln, wie ionisierende Strahlen oder ultraviolette Bestrahlung, oder durch Einwirkung von chemischen mutationsauslösenden Mitteln wie Nitrosoguanidin hergestellt wurden.
Die Verbindung IA kann in einer Form, die als Arzneimittel verwendbar ist, durch Züchtung des Stamms ATCC 20868 von Zalerion arboricola in einem Nährmedium, bis eine wesentliche Menge einer antibiotischen Wirksamkeit in dem Nährmedium, im allgemeinen in seinem Mycelteil, festgestellt wird, und anschließende Gewinnung des Wirkstoffs aus dem Fermentationsmycel in einem geeigneten Lösungsmittel, Konzentration der Lösung des Wirkstoffs und anschließende chromatographische Auftrennung des konzentrierten Materials hergestellt werden.
Die Fermentation wird in einem Medium durchgeführt, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die von den Mikroorganismen assimiliert werden können, und im allgemeinen geringe Konzentrationen von anorganischen Salzen enthält. Das Medium kann zusätzlich durch Spurenmetalle ergänzt werden, obwohl diese, wenn komplexe Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet werden, in diesen komplexen Quellen bereits enthalten sind.
Die Kohlenstoffquellen umfassen Glycerin, verschieden Zucker und Stärken oder andere Kohlehydrate oder Derivate von Kohlehydraten wie Dextran oder Cerelose, ebenso komplexe Nährstoffe wie Hafermehl, Maismehl, Hirse und Mais. Die genaue Menge der Kohlenstoffquelle, die in dem Medium verwendet wird, hängt teilweise von den anderen Inhaltsstoffen des Mediums ab, aber es wurde gewöhnlich gefunden, daß eine Menge von 0,5 bis 5% an Kohlehydrat zufriedenstellend ist. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden oder es können mehrere solcher Stoffe in dem gleichen Medium kombiniert werden.
Die Stickstoffquellen umfassen Aminosäuren wie Glycin, Arginin, Threonin, Methionin und ähnliche, ebenso auch komplexe Quellen wie Hefehydrolysate, Hefeautolysate, Hefezellen, Tomatenpaste, Sojabohnenmehl, Kaseinhydrolysate, Hefeextrakte, Brühe von geguollenem Mais, Schlempe, Baumwollsameninehl und Fleischextrakt. Die verschiedenen Stickstoffquellen können einzeln oder in Kombination in Mengen zwischen 0,2 bis 90 Gewichtsprozenten verwendet werden.
Zu den anorganischen Nährsalzen, die dem Nährmedium zugegeben werden können, gehören die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen liefern können. Umfaßt werden auch Spurenmetalle wie Kobalt, Mangan, Eisen, Molybdän, Zink und Cadmium.
Die Medien, die zur Durchführung der Fermentation geeignet sind, können fest oder flüssig sein.
Feste Medien haben Hirse, Mais, Hafer, Sojabohnen oder Weizen als Grundlage. Ein Medium mit Hirse als Grundlage ist das Medium 2 im Beispiel A. Andere typische feste Medien sind folgende: Medien Gewicht oder Volumen pro 250 ml Kolben Medien Medium Mais (gemahlen) Hefeexrakt Natriumtartrat Mononatriumsalz der Glutaminsäure Maisöl Eisen(II) sulfat.7H&sub2;O Wasser Hirse Saccharose Luzerne Silicagel Mononatriumsalz der Glutaminsäure Maisöl Wasser Medium Hirse Hefeextrakt Natriumtartrat Eisen(III)sulfat.7H&sub2;O
Außerdem können Medien hergestellt werden, indem die oben erwähnten Hirse oder Mais durch Weizen, Gerste, Hafer oder Sojabohnen ersetzt werden.
Flüssige Medien können ebenfalls verwendet werden. Die Fermentation in einem größeren Maßstab wird im allgemeinen zweckmäßiger unter Verwendung eines flüssigen Mediums durchgeführt. wurde gefunden, daß, obwohl auch übliche flüssige Medien zur Herstellung der Verbindung IA verwendet werden können, solche Medien nicht geeignet für die Erreichung von guten Ausbeuten des gewünschten Antibiotikums sind. Es wurde jedoch gefunden, daß durch Zugabe von 6 bis 9 Gewichts% von Glycerin gute Ausbeuten des gewünschten Antibiotikums erreicht werden können. Geeignete flüssige Medien umfassen folgende:

Medium E

Glycerin 85 g
Pektin 10 g
Erdnußpulver 4g
Peptonisierte Milch 4g
Tomatenpaste 4g
Maisbrühe 4g
Schmalzöl 4g
Glycin 2g
KH&sub2;PO&sub4; 2g
Destilliertes Wasser ad 1000 ml
pH 7,0

Medium F

Dextrose 10 g
Glycerin 10 ml
Sojamehl 4g
Peptonisierte Milch 4g
Tomatenpaste 4g
Schmalzöl 4g
Kaliumdihydrogenphosphat 2g
Kobaltchlorid-Hexahydrat 0,01 g
Destilliertes Wasser ad 1000 ml
pH 7,0
Zur Herstellung der Verbindung IA wird ein ATCC 20868 haltiges Fermentationsmedium durch Animpfen von Sporen oder Mycel des das Antibiotikum erzeugenden Organismus in ein geeinetes Medium und anschließendes Züchten unter aeroben Bedingungen bereitgestellt.
Das Verfahren besteht allgemein darin, daß zuerst eine vorrätige Quelle der Kultur von einer Agarscheibe, die das Nährmedium enthält, auf ein das Nährgut produzierendes Medium überimpft wird und so, vorzugsweise in einem zweistufigen Verfahren, ein Wachstum der Organismen erreicht wird, die dann als Impflinge bei der Herstellung des Antipneumocystis-Mittels dienen.
Bei diesem Verfahren wird ein Aliquot der vorrätigen Kultur von ACTT 20868 auf ein geeignetes flüssiges nährguthaltiges Medium mit einem pH im Bereich von 5 bis 8,1, am besten von 6 bis 7,5, überimpft und die Kolben werden, mit oder ohne Rühren, bei Temperaturen im Bereich von etwa 15ºC bis etwa 30ºC, vorzugsweise bei 20ºC bis 28ºC, inkubiert. Falls gerührt wird, können es bis zu 400 Umdrehungen/Minute sein, vorzugsweise etwa 200 bis 220 U/min. Die Inkubation wird über einen Zeitraum von 2 bis 30 Tagen durchgeführt, vorzugsweise 2 bis 14 Tage. Wenn das Wachstum sehr stark ist, gewöhnlich zwischen 2 und 5 Tagen, kann die gezüchtete Kultur zur Impfung des Produktionsmediums für die Herstellung des Antipneumocystis-Mittels verwendet werden. Vorzugsweise wird jedoch eine zweite Stufe der Fermentation durchgeführt, indem mit einem Teil der gezüchteten Kultur geimpft wird und dann ähnliche Bedingungen angewendet werden, jedoch mit einer verkürzten Inkubationsdauer von 1 bis 3 Tagen. Die gezüchtete Kultur wird dann zur Impfung des Produktionsmediums verwendet.
Das mit der gezüchteten Kultur angeimpfte Fermentationsmedium für die Produktion wird 3 bis 30 Tage, gewöhnlich 7 bis 14 Tage, mit oder ohne Rühren inkubiert. Die Fermentation kann aerobisch bei Temperaturen zwischen 20ºC bis 40ºC durchgeführt werden. Um optimale Ergebnisse zu erreichen, ist es am zweckmäßigsten, diese Fermentationen bei Temperaturen im Bereich von etwa 24ºC bis etwa 30ºC durchzuführen. Temperaturen von etwa 24ºC bis 28ºC sind am meisten bevorzugt. Der pH-Wert des Nährmediums, der für die Produktion der vorliegenden Verbindungen geeignet ist, kann zwischen 5,0 und 8,5 variieren, mit einem bevorzugten Bereich von etwa 6,0 bis 7,5. Nach der geeigneten Zeitdauer für die Produktion der gewünschten Verbindung oder Verbindungen werden diese aus dem Fermentationsmedium isoliert, wie nachstehend genauer beschrieben wird.
Der Wirkstoff kann aus dem Fermentationsmedium mittels Verfahrensstufen isoliert werden, die Folgendes umfassen:
(1) Zugabe von Alkohol zu diesem Medium, Rühren und Filtrieren, um den Wirkstoff in die erhaltene wässrig alkoholische Lösung zu überführen;
(2) Konzentrieren der wässrig-alkoholischen Lösung bis auf ein kleines Volumen im Vergleich zur ursprünglichen wässrigen Lösung;
(3) intensives Mischen der erhaltenen konzentrierten wässrigalkoholischen Lösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, um den Wirkstoff zu extrahieren oder darin zu verteilen, und Konzentrieren; oder Durchführen einer HP-20 Adsorption mit der konzentrierten Lösung und Eluieren; und
(4) Durchführen von mindestens einer chromatographischen Trennung der in Stufe (3) erhaltenen Substanz, wobei bei jeder chromatographischen Trennung die wirkstoffhaltigen Eluate, die eine Wirkung gegen Candida albicans aufweisen, vereinigt und konzentriert werden, um die Verbindung IA zu isolieren.
Die Verfahrensstufen im einzelnen können etwas variieren, abhängig davon, ob die Fermentation in einem flüssigen oder einem festen Medium durchgeführt wurde, welches Lösungsmittel verwendet wurde und welches Adsorbens oder welche Adsorbentien verwendet wurden.
Wenn die Fermentation in einem festen Medium durchgeführt wurde, kann die erste Stufe durchgeführt werden, indem ein alkoholisches Lösungsmittel zu dem Fermentationsmedium zugegeben wird, sorgfältig gemischt und anschließend filtriert und das erhaltene wässrig-alkoholische Filtrat konzentriert wird. Vorteilhat wird das konzentrierte Filtrat zunächst mit einem aus einem niederen aliphatischen Kohlenwasserstoff, wie Hexan oder ein anderes Alkan, bestehenden Lösungsmittel reextrahiert oder gewaschen, um in Alkanen lösliche Verunreinigungen zu entfernen. Das mit einem Alkan gewaschene Filtrat kann extrahiert werden oder es kann eine Verteilung mit einem mit Wasser nicht mischbaren sauerstoffhaltigen organischen Lösungsmittel stattfinden, die erhaltene Lösung wird konzentriert und dann auf eine Säule aufgegeben, um mindestens einen, im allgemeinen mehrere chromatographische Trennungsschritte durchzuführen. Geeignete Säulen sind Silicagel-, Reverse-Phase- und SEPHADEX LH-2a-Säulen.
Wenn die Fermentation in einem flüssigen Medium durchgeführt wird, werden bei einer Verfahrensweise die Mycelkörper aus dem Fermentationsmedium abfiltriert. Zu dem Mycelkuchen wird Alkohol zugegeben und der Mycelkörper wird mit dem Alkohol sorgfältig durchmischt und abfiltriert, das Filtrat wird gesammelt und konzentriert. Bei einer alternativen Verfahrensweise wird die gesamte Kulturlösung durch Zugabe vom gleichen Volumen eines Alkanols, vorzugsweise Methanol, extrahiert und filtriert, um die festen Verunreinigungen zu entfernen. Der Alkanolextrakt wird dann an DIAION SP-207 oder an ein anderes im Handel erhältliches Styrol- Divinylbenzol-Copolymeres adsorbiert. Eine zweite, aus Verdünnung/HP-20 Adsorption/Elution bestehende Stufe wird durchgeführt, um die Probe zur Vorbereitung für chromato graphische Trennungen zu konzentrieren. Manchmal kann eine dritte, aus Verdünnung/HP-20 Adsorption/Elution bestehende Stufe zur Verringerung des Volumens wünschenswert sein.
Das alkoholische Lösungsmittel, das bei der anfänglichen Extraktion des Wirkstoffs aus dem festen Nährmedium oder aus dem Mycelpolster verwenbar ist, kann ein beliebiger niederer Alkohol wie Methanol, Ethanol, Isopropanol und ähnliche sein. Methanol wird bevorzugt.
Das mit Wasser nicht mischbare unpolare organische Lösungsmittel, das für die Extraktion oder die Verteilung des Wirkstoffs aus der alkanolischen oder methanolischen Lösung verwendbar ist, ist ein Ester, wie Ethylacetat, Isopropylacetat oder Butylacetat, oder ein Keton wie Methylethylketon. Niedere aliphatische Ester werden bevorzugt.
Die chromatographische Trennung kann unter Verwendung der konventionellen Säulenchromatographie mit einem nichtionischen Harz oder unter Verwendung von Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) mit einem Reverse-Phase-Harz durchgeführt werden. Die Fraktionen, die die antibiotische Verbindung IA enthalten, können mittels Bioautographie unter Verwendung von Candida albicans aufgefunden werden. Im allgemeinen wird mehr als ein chromatographischer Trennungsschritt durchgeführt. Bei der am meisten bevorzugten Verfahrensweiseweise werden eine oder mehrere Trennungen mittels Säulenchromatographie und eine letzte Trennung unter Verwendung von HPLC mit einem C&sub1;&sub8; Reverse-Phase-Harz durchgeführt.
Wenn für die chromatographischen Trennungen die konventionelle Säulenchromatographie verwendet wird, ist Silicagel das bevorzugte Adsorbens. Gewöhnlich ist mehr als eine chroinatographische Trennung erforderlich. Silicagel kann bei allen Trennungen verwendet werden, auch wenn verschiedene Eluierungsmittel eingesetzt werden. Es kann jedoch vorteilhaft mit einem anderen Adsorbens kombiniert werden, beispielsweise einem Dextrangel, wie es unter dein Handelsnamen SEPHADEX LH-20 (Pharmacia) erhältlich ist. Andere Adsorbentien wie Aluminiumoxid, Styrol-Divinylbenzol-Copolymere, die im Handel als DIAION HP-20, HP-39, HP-40, SP-207 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) und AMBERLITE XAD-2, XAD-4, XAD-16 (Rohm and Haas Co.) erhältlich sind, können auch verwendet werden.
Bei der Fraktionierung und Gewinnung des Wirkstoffs mittels Chromatographie an Silicagel werden mit Ester/Alkohol-Gemischen mit steigender Konzentration von Alkohol gute Trennungen erreicht. Eine Mischung von Ethylacetat und Methanol wurde als besonders günstig gefunden. Diese können in isokratischen stufenweisen Gradienten oder in kontinuierlichen Gradientensysteinen verwendet werden. Wenn ein Dextranadsorbens, wie SEPHADEX LH-20, eingesetzt wird, kann ein Chlorkohlenwasserstoff/Kohlenwasserstoff/Alkohol-Lösungsmittelsystem verwendet werden. Es wurde gefunden, daß eine Mischung von Methylenchlorid/Hexan/Methanol besonders gut verwendbar ist.
Wenn eine HPLC-Trennung durchgeführt wird, wird die die Substanz enthaltende alkoholische Lösung, die mittels konventioneller Chromatographie erhalten wurde, konzentriert, der Rückstand in Methanol gelöst und auf eine Säule, die mit einem handelsüblichen Reverse-Phase-Harz gefüllt ist, aufgegeben oder auf eine Säule, die mit Silicagel/C&sub1;&sub8; Reverse-Phase-Harz, dessen Herstellung in der Literatur ausreichend beschrieben ist, gefüllt ist. Alternativ kann die alkoholische Lösung auf 50% mit Wasser verdünnt und auf die Kolonne gepumpt werden. Die Kolonne wird unter Verwendung von Methan/Wasser (1:1 oder gegebenenfalls andere Verhältnisse) bei 800-2000 psi [(5,5-13,8) x 10&sup6; Pa] betrieben, wodurch eine Durchflußgeschwindigkeit von etwa 20 ml/Min. erreicht wird. Die Trennung wird bei 210 nm überwacht.
Die Fraktionen werden auf ihre Wirkung gegen Candida albicans untersucht. Das Produkt wird mittels chromatographischer Verfahren durch Vereinigung der aktiven Fraktionen und Konzentrierung unter vermindertem Druck erhalten. Das Produkt kann dann mittels konventioneller Chromatographie oder präparativer HPLC gereinigt werden.
Andere Naturprodukte, die von der vorliegenden Erfindung umfaßt werden, schließen solche in der Literatur beschriebene Produkte ein wie Echinocandine, Aculeacine, Mulundocandine, Athlestain (auch als Echinocandin T bezeichnet), Sporiofungin oder solche mit Bezeichnungen durch Kennziffern. In einigen Fällen sind die Strukturen nicht vollständig aufgeklärt, aber es ist bekannt, daß es sich um neutrale Cycklohexapeptide mit einer Fettsäurenseitenkette handelt.
Die Echinocandine umfassen Echinocandin-A (auch bekannt als A-32204-A), produziert von Aspergillus nidulans-echinulatus (CH-A 568 386), Echinocandin-B (auch bekannt als A-32204-B und SF-7810 F), produziert von Aspergillus nidulans (CH-A 568 386) und Aspergillus rugulosus (Helv. Chim. Acta 62, 11252 (1979), DE-A 2 549 127, BE-A 834 289), Echinocandin-C (auch bekannt als SL-7810-FII), produziert von Aspergillus regulosus (DE-A 2 549 127, BE-A 834 289), Echinocandin-D (auch bekannt als SL-7810-FIII), produziert von Aspergillus rugulosus (DE-A 2 549 127, BE-A 834 289).
Die Echinocandine B, C und D können gemeinsam durch die Fermentation eines Stammes von Aspergillus rugulosus produziert werden. Der Hauptmetabolit bei der Fermentation von Aspergillus rugulosus ist Echinocandin B mit einer Summenformel von C&sub5;&sub2;H&sub8;&sub1;N&sub7;O&sub1;&sub6;. Echinocandin C und D, die Nebenmetaboliten sind, unterscheiden sich durch bestimmte Aminosäuren, die den cyklischen Peptidring bilden. So enthält Echinocandin C mit einer Summenformel von C&sub5;&sub2;H&sub8;&sub1;N&sub7;O&sub1;&sub5; 3-Hydroxyhomotyrosin statt dem 3,4-Dihydroxyhomotyrosin, das im Echinocandin B enthalten ist. Echinocandin D mit einer Summenformel von C&sub5;&sub2;H&sub8;&sub1;N&sub7;O&sub1;&sub3; enthält 3-Hydroxyhomotyrosin und Ornithin statt 3,4-Dihydroxyhomotyrosin und 4,5-Dihydroxyornithin.
Echinocandin B kann auch durch Züchtung von Emericella nidulans produziert werden, wie es im Ausführungsbeispiel beschrieben wird.
Die Aculeacine umfassen Aculeacin-A, Aculeacin-B, Aculeacin-C, Aculeacin-D, Aculeacin-E, Aculeacin-F, Aculeacin-G, Aculeacin-A A", Aculeacin-D A", Aculeacin-A G", Aculeacin-Aα und Aτ, und Aculeacin-Dα und Dτ. Die Aculeacine können mittels Fermentation von Aspergillus aculeatus (entweder in einer flüssigen oder in einer festen Kultur) (vorzugsweise M4214 FERM-P 2324), anschließendes Extrahieren des Mycels mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, Konzentrieren und Reinigen mittels Chromatographie produziert werden, wie es im US-A 3 978 210 und 4 212 858, im DE-B 2 509 820 und im BE-A 826 393 beschrieben wird.
Ein anderes in der Literatur beschriebenes Cyclohexapeptidantibiotikum ist Mulundocandin (R', R'', R''', R'''' sind OH, R'''''ist H, R ist -CO(CH&sub2;)&sub1;&sub0;-CH&sub3;CH&sub2;-CH&sub2;CH&sub3;), produziert von Aspergillus sydowic No. Y-30462 (J. Antibiotics 40, 275 und 40, 281 (1987)). Das Antibiotikum, das sowohl in der Kultur als auch im Mycel vorhanden ist, kann aus dem Ethylacetatextrakt eines Kulturfiltrats mittels Silicagel-Säulenchromatographie und Tropfen-Gegenstromchromatographie isoliert werden, wie es von Roy et al., J. Antibiotics 40, 275-280, (1987), ausführlicher beschrieben wird.
Noch ein weiteres in der Literatur erwähntes Cyclohexapeptid vom Echinocandin-Typ ist Sporiofungin (R', R''' und R'''' sind OH, R'' ist H, R''''' ist CH&sub2;CONH&sub2;, R'''''' ist H und R ist ein C&sub1;&sub6; Fettsäurerest mit einer verzweigten Kette), das durch Züchtung von Cryptosporiopsis (WIPO-Veröffentlichung WO 82/00587), Stamm ATCC 20594 oder NRLL 12192, auf verschiedenen üblichen Nährmedien als aerobische Oberflächenkultur oder als Submerskultur, Abtrennung des Mycels von der Nährlösung und Gewinnung in üblicher Weise, wie Homogenisierung des Mycels mit Methanol, Extraktion vom Methanol mit einem mit Wasser beschränkt mischbaren organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat, Entfernung des Lösungsmittels und chromatographische Reinigung produziert werden kann, wie es ausführlicher in WO 82/00587 beschrieben ist.
Andere Cyclohexapeptide vom Echinocandin-Typ umfassen X-73, produziert von Aspergillus rugulosus (Ind.J.B. Biochem. 2, 81 (1970)), Athlestain produziert von Aspergillus niger (Jap.J. Ant. 17, 268 (1964), JA-A 66/12688; CA 65, 19274, 70, 27607), S-31794-F-1 produziert von Acrophialophora limonispora (US-A 4.173.629, DE-A 26 28 965), A-30912-A oder A-22082 produziert von Aspergillus nidulans und Aspergillus rugulosus (US-A 4.074.246, 4.074.245, 4.288.549, DE-A 26 43 485, CA 87, 20612), A-30912-B, A-30912-C und A-30912-D, produziert von Aspergillus rugulosus (US-A 4.024.245).
Verbindungen, die Modifikationen von Naturstoffen darstellen, umfassen solche, in denen die Seitenkette, also R, falls es sich um eine ungesättigte Fettsäure handelt, durch Reduktion modifiziert wurde. Dies kann katalytisch unter Verwendung von Palladiumkohle bei Normaldruck durchgeführt werden.
Verbindungen, in welchen R''' -O-Alkyl(C&sub1;-C&sub6;) oder -O-Benzyl bedeuten, können hergestellt werden, indem die entsprechende Verbindung, in der R''' OH bedeutet, mit dem entsprechenden Alkanol unter sauren Bedingungen bei Raumtemperatur mehrere Stunden oder über Nacht gerührt wird, um in der Mischung den entsprechenden Ether zu erhalten, und vorzugsweise die Reaktion mit verdünnter Bicarbonatlösung abgebrochen und die Verbindung mit üblichen Methoden isoliert wird. Zusätzlich zu der Herstellungsvorschrift in dem Ausführungsbeispiel wird die Herstellung einer Anzahl von diesen Verbindungen in der GB-A 2.050.385 ausführlicher beschrieben.
Verbindungen, in denen R''' den Rest
bedeutet, in dem R¹ Wasserstoff, Alkyl oder ein substituiertes Alkyl, wie es früher definiert wurde, R² Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub4; Alkyl, oder R¹ und R² zusammen den Rest -(CH&sub2;)&sub2;-Q-(CH&sub2;)-, in dem Q eine verbindende Gruppe wie -CH&sub2;-, -NH- oder -N(niedriges Alkyl) ist, darstellen, können durch Umsetzung einer Verbindung der Formel
in Gegenwart einer organischen Säure wie p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure oder einer Mineralsäure in einem aprotischen Lösungsmittel wie Dimethylformamid hergestellt werden, wie es ausführlicher im BE-A 851.310 beschrieben wird.
Halbsynthetische Verbindungen, in denen die Acylseitenkette, also R in der obigen Formel, in der Weise modifiziert wurde, daß die natürlich vorkommenden Fettsäuren durch strukturell unterschiedliche Acylgruppen ersetzt wurden, können hergestellt werden, indem zuerst die Fettsäurenseitenkette entfernt und dann eine unterschiedliche Acylgrupe eingeführt wird. Die Fettsäurenseitenkette wird bevorzugt enzymatisch entfernt. Das Enzym, das für die Deacylierung des Cyclohexapeptids verwendbar ist, um einen Cyclopeptidring zu erhalten, ist dasjenige, daß durch bestimmte Mikroorganismen der Familie Actinoplanaceae produziert wird, insbesondere der Mikroorganismus Actinoplanes utahensis NRLL 12052, der bei dem Northern Regional Research Center, USDA, Agricultural Research Service, Peoria Ill. 61604 verfügbar ist, oder als A. utahensis ATCC 14539, der bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20582, erhältlich ist.
Das Enzym kann durch Züchtung von Actinoplanaceae bei Temperaturen zwischen etwa 25ºC und 30ºC und bei einem pH zwischen etwa 5,0 und 8,0, vorzugsweise zwischen 6,0 und 7,0, unter etwa 40 bis etwa 60 stündigem Rühren und Belüftung in einem Kulturmedium hergestellt werden, das (a) eine assimilierbare Kohlenstoff-Quelle wie Saccharose, Glucose oder Glycerin, (b) eine Stickstoff-Quelle wie Pepton, Harnstoff oder Ammonsulfat, (c) eine Phosphat-Quelle wie ein lösliches Phosphat und (d) ein wachstumförderndes anorganisches Salz enthält.
Bei der Deacylierung wird die Cyclohexapeptidverbindung oder das Substrat, welches das Cyclohexapeptid enthält, zu der Kultur von Actinoplanaceae zugegeben, nachdem die Kultur mindestens 48 Stunden inkubiert worden war. Nach Zugabe des Substrats wird die Inkubation der Kultur etwa 24 Stunden oder länger bei Temperaturen im Bereich von etwa 25ºC bis etwa 30ºC fortgesetzt.
Der Verlauf der Reaktion kann durch Prüfung gegen Candida albicans überwacht werden. Das als Ausgangsverbindung verwendete Cyclohexapeptid ist gegen C. albicans wirksam, aber die deacylierte nur aus dem Kern bestehende Verbindung ist biologisch unwirksam.
Die deacylierte Kernverbindung kann dann zur Herstellung von halbsynthetischen Verbindungen verwendet werden. Die üblichen Acylierungsverfahren können eingesetzt werden. Bei einer bevorzugten Methode wird ein 2,4,5-Trichlorphenylester der gewünschten Säure mit der deacylierten Kernverbindung in einem inerten Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, bei Raumtemperatur über etwa 15 bis 18 Stunden umgesetzt. Dies kann mit einem speziellen Beispiel wie folgt erläutert werden:
Ein deacylierter Kern einer Verbindung der folgenden Struktur, worin in der Formel (IB) E Wasserstoff bedeutet (Verbindung IBi)
kann hergestellt werden, indem zuerst ein deacylierendes Enzym durch Fermentation von Actinoplanes utahensis NRRL 12052 bereitgestellt wird, wobei zuerst ein Aliquot mit dem Organismus angeimpft wird, dieses Aliquot bei 30ºC 8 bis 10 Tage inkubiert wird und dann der Bewuchs des Aliquots verwendet wird, um 50 ml des vegetativen Mediums anzuimpfen, das bei 30ºC etwa 72 Stunden unter Schütteln inkubiert wird. Das inkubierte vegetative Medium kann verwendet werden, um 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe, das die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Medium der ersten Stufe aufweist, anzuimpfen und bei 30ºC etwa 48 Stunden unter schütteln zu inkubieren. Danach können 800 ml des besagten Mediums verwendet werden, um 100 l des produktionsmediums anzuimpfen, das man bei etwa 30ºC 42 Stunden unter Rühren und Belüftung, um den Gehalt an gelöstem Sauerstoff oberhalb von 30% der Luftsättigung bei Normaldruck aufrechtzuerhalten, fermentieren läßt, um so darin das gewünschte deacylierende Enzym zu erhalten.
Das Medium zur Herstellung des Aliquots kann folgende Zusammensetzung aufweisen: Babyhafermehl 60,0 g; Hefe 2,5 g; K&sub2;HPO&sub4; 1,0 g; Czapeks mineralische Mischung 5,0 g; Agar 25 g; entionisiertes Wasser ad 1 l. Czapeks mineralische Mischung weist folgende Zusammensetzung auf: FeSO&sub4;.7H&sub2;O (in 2 ml konz. HCl) 2 g; KCl 100 g; MgSO&sub4;.7H&sub2;O 100 g; entionisiertes Wasser ad 1 l mit einem zum Schluß eingestellten pH-Wert von 6,7.
Das Medium, das als Medium für die erste und die zweite Stufe geeignet ist, kann folgende Zusammensetzung aufweisen: Babyhafermehl 20,0 g; Saccharose 20,0 g, Hefe 2,5 g; getrocknete Getreidekörner 5,0 g; K&sub2;HPO&sub4; 1,0 g; Czapeks mineralische Mischung 5,0 ml und entionisiertes Wasser ad l l, endgültiger pH-Wert 6,8.
Das produktionsmedium kann folgende zusammensetzung aufweisen: Erdnußmehl 10,0 g; lösliches Fleischpepton 5,0 G; Saccharose 20,0 g; KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g; K&sub2;HPO&sub4; 1,2 g; MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,25 g; Leitungswasser ad 1 l.
Eine alkoholische Lösung eines Cyclohexapeptids (IB), in dem E Stearoyl (Tetrahydroechinocandin) oder Palmitoyl (Aculeacin A) bedeutet, wird zu dem oben beschriebenen Produktionsfermentations medium zugegeben und die Deacylierung durch Prüfung gegen Candida albicans überwacht.
Nach Beendigung der Deacylierung wird die Fermentationslösung, welche die aus dem Kern bestehende Verbindung enthält, filtriert, über HP-20-Harz laufen gelassen, um diese Kernverbindung auf die Säule aufzubringen und die Verbindung durch Elution mit Wasser/Methanol (7/3) mit einer Geschwindigkeit von 200-300 ml/Minute zu erhalten. Das Eluat wird auf seinen Gehalt an der Kernverbindung durch Behandlung mit dem säurechlorid und Prüfung seiner Wirkung gegen Candida albicans überwacht. Die Fraktionen des Eluats, die eine Wirkung zeigen, werden konzentriert, um die Kernverbindung (IBi) zu erhalten.
Die so erhaltene deacylierte Cyclohexapeptidverbindung wird durch Auflösung in Wasser/Acetonitril/Essigsäure/Pyridin (96/2/1/1) *und Reinigung mittels Reversed-Phase Flüssigchromatographie (LICHROPREP RP-18) mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 60 ml pro Minute und Überwachung der Abtrennung bei 280 nm unter Verwendung eines UV-Monitors gereinigt. Die Fraktionen, welche die gewünschte Verbindung enthalten, werden auf Basis der Absorption von 280 nm vereinigt, unter vermindertem Druck konzentriert und für die Acylierung verwendet oder für eine spätere Verwendung lyophilisiert.
Die Herstellung der deacylierten Cyclohexapeptidverbindung, die den gleichen Kern wie die Naturprodukte vom Echinocandintyp aufweist. wird im US-A 4.293.482 ausführlicher beschrieben. Ähnliche Herstellungsverfahren von anderen deacylierten Cyclohexapeptidverbindungen mit ähnlichen Kernen kann man in den US-A 4.173.629, 4.293.490, 4.299.763, 4,299.762 und 4.304.716 beschrieben finden.
Die deacylierten Verbindungen können dann zur Herstellung neuer und/oder ungewöhnlich acylierter Verbindungen verwendet werden.
Die Acylierung der Verbindung mit dem deacylierten Kern zur Herstellung von ungewöhnlichen Acylderivaten kann anhand der Herstellung einer Verbindung, in der E der Formel (IB) den Rest
darstellt (Verbindung IBii), erläutert werden. So eine Verbindung würde auch ein Beispiel für eine Verbindung der Formel (I) sein, in der R ein Rest ist, wie er unter (C) (i) definiert wird.
Bei der Acylierung wird die Acylgruppe vorzugsweise mittels eines Trichlorphenylesters eingeführt. So kann zuerst der Trichlorphenylester durch Behandlung der für die Seitenkette vorgesehenen Säure mit 2,4,5-Trichlorphenol in Gegenwart eines Kupplungsmittels wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in einem inerten Lösungsmittel wie Methylenchlorid hergestellt werden. Etwa 1,1 Mole des 2,4,5-Trichlorphenols und 1,0 Mol des Kupplungsmittels werden pro Mol der Alkoxybenzoesäure verwendet. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 15 bis 18 Stunden gerührt und ein Ester erhalten, der durch Abfiltrieren des Niederschlags, Eindampfens des Filtrats unter vermindertem Druck und Umkristallisation des Rückstands isoliert werden kann.
Der so hergestellte Ester wird zu einer Lösung der Ringverbindung in Dimethylformamid zugegeben, etwa 18 Stunden gerührt und dann das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wird gewaschen und über Silicagel chromatographiert, wobei Ethylacetat-Methanol (3/2) als Eluent verwendet wird, um das gewünschte Octyloxybenzoylderivat zu erhalten, das durch die Formel IB mit der Octyloxybenzoylgruppe als E dargestellt werden kann. So eine Verbindung kann 1-[(4R,5R)-4,5- Dihydroxy-N²-[4-(octyloxy)benzoyl)-L-ornithin)-echinocandin benannt werden (Verbindung IBii).
Außer der Verbindung IA umfassen andere bevorzugte Verbindungen Verbindung IBii; Echinocandin B (R', R'', R''', R'''' bedeuten OH, R''''' und R'''''' bedeuten CH&sub3;; R bedeutet den Rest - (CH&sub2;)&sub4;CH=CH(CH&sub2;)&sub7;CH&sub3;; Tetrahydroechinocandin B (R', R'', R''', R'''' bedeuten OH; R''''' und R'''''' bedeuten CH&sub3;; R bedeutet den Rest - (CH&sub2;)&sub1;&sub6;CH&sub3;; O-Methyltetrahydroechinocandin B (R', R'' und R'''' bedeuten OH, R'''bedeutet -OCH&sub3;; R''''' und R'''''' bedeuten 2OCH&sub3;; R bedeutet den Rest - (CH&sub2;)&sub1;&sub6;CH&sub3;; und O-Benzyl-tetrahydroechinocandin B (R', R'' und R'''' bedeuten OH, R''' bedeutet -OCH&sub2;C6H&sub5;, R''''' und R'''''' bedeuten CH&sub3;; R bedeutet den Rest - (CH&sub2;)&sub1;&sub6;CH&sub3;.
Die Cyclohexapeptidverbindungen der Formel I, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können infizierten Patienten oder solchen mit geschwächtem Immunsystem, die für Infektionen mit Pneumocystis carinii anfällig sind, in therapeutisch wirksamen oder antiinfektiösen Mengen verabreicht werden.
Die Wirksamkeit der Cyclohexapeptidverbindungen für therapeutische und antiinfektiöse Zwecke bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem kann zuerst mittels Studien mit Ratten und Mäusen mit unterdrückter Immunantwort ermittelt werden.
Bei einer typischen Studie unter Verwendung der Verbindung IA bei Ratten wurde die Immunantwort von neun männlichen Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von ungefähr je 200 g durch Zugabe von Dexamethason zum Trinkwasser (2,0 mg/1) 6 Wochen lang unterdrückt, um die Entwicklung von Infektionen durch Pneumocystis carinii zu induzieren. Um die Infektion zu verstärken, wurden die Ratten auch auf einer niedrigen Protein-Diät gehalten. Zu Beginn der siebenten Woche wurden die Ratten in drei Gruppen mit jeweils drei Tieren geteilt. Alle drei Gruppen erhielten weiter Dexamethason im Trinkwasser und eine niedrige Protein-Diät bis zur Beendigung der Studie. Die Ratten der Gruppe I wurden als infizierte Kontrollen nicht behandelt, denjenigen der Gruppe II wurden 2 Wochen lang zweimal täglich 2 mg der Verbindung IA in 0,5 ml dest. Wasser intraperitoneal injiziert und die der Gruppe III wurden 2 Wochen lang mit Triinethoprim-Sulfamethoxazol (TMP-SMZ) im Trinkwasser (208 mg TMP und 1,040 g SMZ/Liter) behandelt, eine bekannte Behandlungsweise von Infektionen durch Pneumocystis carinii. Zwei Ratten starben bald während des Experiments, eine von der Gruppe II (Ratte 72 A) und die andere von der Gruppe III (Ratte 75 A). Es wurde nicht geklärt, ob sie durch Pneumocystis carinii starben.
Am Ende der zweiwöchentlichen Behandlungszeit (insgesamt 8 Wochen der Unterdrückung der Immunantwort) wurden die Tiere getötet und das Lungengewebe entfernt. Die Lungen von jedem Tier wurden gewogen und dann aufgearbeitet, um die Anzahl der Zysten und der Parasitenkerne bei jedem Tier zu bestimmen. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in der Tabelle I gezeigt. TABELLE I IN VIVO TESTS ÜBER DIE WIRKSAMKEIT DER VERBINDUNG IA UND VON TMP-SMZ GEGEN P. CARINII Ratte Summe der Zysten Summe der Kerne Gewicht d.Lunge (g) gefundene Zysten Gruppe (Kontrolle) (Verbindung IA) pro Lunge pro g Lunge *N.D. = Keine Zysten wurden in 50 Feldern gefunden, wodurch angezeigt wird, daß weniger als 2 x 10&sup5; (Grenze des Auflösungsvermögens) vorhanden waren
Diese Resultate zeigen, daß die Verbindung IA gegen durch Pneumocystis carinii hervorgerufene Infektionen wirksam ist. In den Lungen von allen mit der Verbindung IA behandelten Ratten konnten keine Zysten gefunden werden, verglichen mit den Kontrolltieren mit Anteilen im Bereich von 3,2 x 10&sup8; bis 1,5 x 10&sup9;. Bei diesen Tieren gab es auch eine Verringerung der Zahl der Parasitenkerne (1,0-2,1 x 10&sup9; bis 1,4 x 10¹&sup0;) im Vergleich zu den Kontrollen (5,8 x 10&sup9; bis 1,4 x 10¹&sup0;). Diese Resultate sind denjenigen überlegen, die bei mit TMP-SMZ behandelten Tieren, einer bekannten Behandlungsweise bei Pneumocystis-carinii-Infektionen, beobachtet wurden, da die TMP-SMZ Ratten eine nachweisbare Anzahl von Pneumocystis-carinii-Zysten aufwiesen.
Eine ähnliche Studie an Ratten wurde durchgeführt, um die Antipneumocystis-Wirkung von 1-[(4R,5R)-4,5-Dihydroxy-N²-[4- (octyloxy)-benzoyl]-L-ornithin]-echinocandin B (Verbindung IBii) zu bestimmen. Nachdem die Iinmunantwort 6 Wochen lang unterdrückt worden war, wurde den Ratten 7 Tage lang zweimal täglich das Vehikel allein, die Verbindung IBii (2 mg/kg) oder die Verbindung IA (2 mg/kg) injiziert, wobei während dieser Zeit die Unterdrückung der Immunantwort fortgesetzt wurde. Am Ende der Behandlungszeit wurden die Tiere getötet und die Zahl der Zysten pro Lunge ermittelt. Die Verbindung IA verringerte die Zahl der Zysten um > 99%, während die Verbindung IBii die Zahl der Zysten um etwa 84% verringerte (verglichen mit der Vehikelkontrolle, 10%iges DMSO).
Auch mit Mäusen und auch mit anderen Verbindungen, die unter die Formel I fallen, wurden Studien durchgeführt. Eine typische Methode, die bei den Studien mit Mäusen und mit anderen Verbindungen durchgeführt wurde, ist die folgende:
Bei männlichen C3H/HeN-Mäusen, von denen jede 22-24 g wog, wurde durch Zugabe von Dexainethason zum Trinkwasser über 6 Wochen die Immunantwort unterdrückt, um die Entwicklung von Pneumocystis- carinii-Infektionen zu induzieren. Um die Infektion zu verstärken, wurden die Mäuse auch auf einer niedrigen Protein-Diät gehalten. Zu Beginn der siebenten Woche wurden die Mäuse willkürlich in Gruppen von je 6 Tieren aufgeteilt. Alle Gruppen erhielten weiterhin für den Rest der Studie Dexamethason im Trinkwasser und eine niedrige Protein- Diät. Den Mäusen jeder Gruppe wurden zweimal täglich intraperitoneal 0,5 ml einer 10%igen DMSO-Lösung als Kontrolle injiziert und die gleiche Lösung mit dem Arzneistoff, um eine Dosis von 2 mg/kg zu erreichen. Dies wurde eine Woche lang durchgeführt.
Am Ende der Behandlungsperiode (insgesamt wurde 7 Wochen die Immunantwort unterdrückt) wurden die Tiere getötet und das Lungengewebe entfernt. Das Gewebe wurde dann aufgearbeitet, um die Anzahl der Zysten bei jedem Tier zu bestimmen.
Die mit den verschiedenen Verbindungen erhaltenen Resultate können der Tabelle II entnommen werden. TABELLE II Verbindung Dosis Verringerung der Zysten in % Tetrahydroechinocandin B (TEB) O-Methyl-TEB O-Benzyl-TEB Echinocandin B Verbindung IA
Aufgrund der obigen Testergebnisse und aufgrund des bekannten Dosisbereichs von TMP-SMZ für die Verabreichung am Menschen wird festgestellt, daß allgemein von etwa 0,5 bis etwa 20,0 mg/kg Körpergewicht des Antipneumocystismittels auf Cyclohexapeptidbasis (Verbindung I) angewendet werden können, wenn der Gesundheitszustand, das Gewicht, das Alter des Patienten und andere Faktoren berücksichtigt werden, welche die Reaktion auf ein Arzneimittel beeinflussen können, gleichgültig, ob es einem menschlichen Patienten oder einem Tier verabreicht wird. Wenn sie als für den Menschen geeignete Dosen ausgedrückt werden sollen, liegen diese Werte im Bereich von etwa 35 mg bis etwa 1500 mg pro Tag, vorzugsweise mittels parenteraler Verabreichung.
Die hervorragendem Eigenschaften können sehr wirkungsvoll genutzt werden, wenn die Verbindung zu neuen Pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger entsprechend den üblichen Pharmazeutischen Herstellungsmethoden formuliert wird.
Die neuen Zusammensetzungen enthalten mindestens 1 Gew.% des Wirkstoffs. Bei der Herstellung der Zusammensetzungen wird die Verbindung I innig mit irgendeinem der üblichen pharmazeutisch annehmbaren Träger gemischt.
Die Zusammensetzungen umfassen für orale, rektale, topische Parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre und intravenöse) pulmonale (nasale und bukkale), nasale Verabreichung oder für Verabreichung durch Einblasen geeignete Zusammensetzungen.
Das Antipneumocystismittel auf Basis eines Cyclohexapeptids, Verbindung I, wird vorzugsweise zu Zusammensetzungen für Injektionen formuliert und kann in Form von Einzeldosen in Ampullen oder in Behältern mit mehreren Einzeldosen vorliegen: falls erforderlich, wird ein Konservierungsmittel zugesetzt. Die Zusammensetzungen können auch in Form von Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in Öl oder in Vehikeln wie 20/80 Ethanol/Propylenglykol oder 20-35%igem Polyethylenglykol 300 vorliegen und können Formulierungshilfsmittel wie Suspendierungs-, Stabilisierungs- und/oder Dispergierungsmittel enthalten. Alternativ können die Wirkstoffe in Pulverform vorliegen, um vor der Anwendung mit einem geeigneten Vehikel verdünnt zu werden, oder um zum Einblasen verwendet zu werden.
Die Bezeichnung "in Form von Einzeldosen", wie er in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge des Wirkstoffs enthält, die berechnet wurde, um zusammen mit dem pharmazeutischen Träger den erwünschten therapeutischen Effekt zu bewirken. Beispiele solcher Einzeldosen sind abgemessene Einheiten in Ampullen oder in Mehrdosenbehältern und ähnlichen. Eine Einzeldosis gemäß der vorliegenden Erfindung wird im allgemeinen 100 bis 1000 mg des Antipneumocystismittels auf Cyclohexapeptidbasis enthalten.
Jede geeignete Verabreichungsweise kann angewendet werden, um einem Patienten eine wirksame Dosis einer Verbindung der Formel I zuzuführen. Beispielsweise können orale, rektale, topische, parenterale, okulare, pulmonale, nasale und ähnliche angewendet werden. Die Dosierungsformen umfassen Tabletten, Pastillen, Dispersionen, Suspensionen, Lösungen, Kapseln, Cremes, Salben, Aerosole, Pulver zum Einblasen und ähnliche.
Die Zusammensetzungen umfassen für orale, rektale, topische, parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre und intravenöse), pulmonale (nasale oder bukkale Inhalation), nasale Verabreichung oder zum Einblasen geeignete Zusammensetzungen.
Für die Verabreichung mittels Inhalation werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zweckmäßig in Form von Aerosolspray-Präparaten aus unter Druck stehenden Behältern oder aus Zerstäubern zur Verfügung gestellt. Die Verbindungen können auch als Pulver abgegeben werden, welche dann formuliert werden können, und die pulverhaltigen Zusammensetzungen können mit Hilfe einer Inhalationsvorrichtung zum Einblasen von Pulver inhaliert werden. Das bevorzugte Abgabesystem für die Inhalation ist eine Dosieraerosol- Inhalation (MDI), die als Suspension oder Lösung der Verbindung I in einem geeigneten Treibgas, wie fluorierten Kohlenwasserstoffen oder Kohlenwasserstoffen, formuliert sein kann.
Da die Verbindung in pharmazeutisch annehmbaren flüssigen Trägern schwer löslich ist und da es wünschenswert ist, die Lunge und die Bronchien direkt zu behandeln, ist die Verabreichung mittels einem Aerosol eine bevorzugte Verabreichungsmethode. Einblasen ist ebenfalls eine erwünschte Methode, besonders wenn sich die Infektion auf die Ohren und andere Körperhöhlen ausgebreitet haben könnte.
Alternativ kann auch eine parenterale Verabreichung in Form einer intravenösen Tropfinfusion verwendet werden. Bei einer solchen Methode kann das Arzneimittel in Alkohol/Propylenglykol- oder in Polyethylenglykol-Zusammensetzungen solubilisiert werden. Auch eine intraperitoneale Injektion ist möglich.
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der Verbindung IA und anderer lipophiler Cyclohexapeptidverbindungen der Formel I und die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die für die Bekämpfung von Pneumocystis carinii brauchbar sind.

HERSTELLUNG DER VERBINDUNG IA

BEISPIEL A

Fermentation

Eine gefrorene Kultur des Isolats 2 der Kultur 8525-307P in Glycerin, die ursprünglich aus Wasser isoliert worden war, identifizierbar als Zalerion Arboricola, ATCC 20868, und aufbewahrt in der Kulturensammlung von Merck, wurde bei der Fermentation eingesetzt.
Ein Anteil von 2 ml der gefrorenen Kultur wurde aufgetaut und aseptisch in einen glattwandigen Erlenmeyerkolben von 250 ml, der 54 ml des Mediums 1 enthielt, überführt. Nach der Animpfung wurde das Medium 1 bei 28ºC unter Rotationsrührung (220 Umdrehungen/Minute, 2"- Wurfschüttler) 3 Tage inkubiert. Nach dieser Zeit wurden je 2,0 ml des bewachsenen Mediums aseptisch in mehrere glattwandige Erlenmeyerkolben von 250 ml überführt, die das Medium 1 enthielten. Die beimpften Kolben wurde 2 Tage bei 28ºC inkubiert.
12,5 ml der reifen Impfkulturlösung wurden in 5 Produktionskolben, die das Medium 2 enthielten, überimpft und 7 Tage ohne Schütteln bei 25ºC inkubiert, wobei in dem Fermentationsmediuin eine antibiotische Verbindung erhalten wurde.
Die bei der obigen Fermentation verwendeten Medien waren folgende:

MEDIUM 1 (KF Impfmedium)

Maisbrühe 5g
Tomatenpaste 40 g
Hafermehl 10 g
Glucose 10 g
Mischung von Spurenelementen 10 ml
Destilliertes Wasser ad 1000 ml
pH 8,6

Mischung von Spurenelementen

FeSO&sub4;.7H&sub2;O
MnSO&sub4;.4H&sub2;O 1g
CuCl&sub2;.2H&sub2;O 25 mg
CaCl&sub2; 100 mg
H&sub3;BO&sub3; 56 mg
(NH&sub4;)&sub6;MoO&sub2;.4H&sub2;O 19 mg
ZnSO&sub4;.7H&sub2;O 200 mg
Destilliertes Wasser ad 1000 ml

MEDIUM 2 (F204 Festes Medium)

Hirse (Grundlage) 15 g
Hefeextrakt 0,5 g
Natriumtartrat 0,1 g
Eisen(II)sulfat-Kristalle 0,01 g
Mononatriumsalz der Glutaminsäure 0,1 g
Maisöl 0,1 ml

Isolierung

500 ml Methanol wurden zu jedem der 5 Zweiliterkolben der Festphasenfermentation gegeben. Die Inhalte der Kolben wurden dann vereinigt und gerührt, um das methanollösliche Material zu extrahieren, dann wurde die Mischung filtriert. Der angefallene Filterkuchen wurde mit zusätzlichen 2500 ml Methanol gerührt, um weiteres methanollösliches Material zu extrahieren, dann wurde die Mischung filtriert.
Das Filtrat und die Waschlösung wurden vereinigt und auf 500 ml konzentriert.
Das so erhaltene wässrig-methanolische Konzentrat wurde dann zweimal mit 500 ml Ethylacetat extrahiert. Die angefallene wässrige Lösung wurde auf eine DIAION HP-20-Säule aufgegeben, um den Wirkstoff darauf zu adsorbieren, dieser wurde dann mit Methanol extrahiert. Die Eluate wurden mit den vorher angefallenen Ethylacetatextrakten vereinigt und die vereinten Ethylacetatlösungen wurden zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde über 200 ml SEPHADEX LH-20 chromatographiert, wobei 5:5:2 Methylenchlorid/Hexan/Methanol als Eluierungsmittel verwendet wurden.
Die mit Candida albicans ermittelten wirksamen Fraktionen wurden vereinigt und über 200 ml Silicagel (EM Science, KIESELGEL 60, 230-400 mesh) chromatographiert, wobei eine Gradientenelution mit Ethylacetat/Methanol verwendet wurde. Die aktiven Fraktionen dieser chr*omatographischen Reinigung wurden vereinigt, konzentriert und über Silicagel chromatographiert, wobei ein isokratisches System aus Ethylacetat/Methanol, 75:25, verwendet wurde.
Die durch diese Chromatographie ermittelten aktiven Anteile wurden vereinigt und auf 100 ml SEPHADEX LH-20 aufgegeben, Methanol wurde als Eluierungsmittel verwendet. Nach Abdampfen des Lösungsmittels ergab das Eluat 95 mg einer gereinigten Verbindung. Die Verbindung war eine weiße Substanz mit einem ¹H NMR-Spektrum, wie es in Figur 1 zu sehen ist.

BEISPIEL B

Fermentation

Der Inhalt einer gefrorenen Ampulle von ATCC 20868 aus der Kulturensammlung von Merck wurde in ähnlicher Weise, wie im Beispiel A beschrieben, aufgetaut und und aseptisch in einen glattwandigen 250 ml Kolben überführt, der 54 ml des KF Mediums (Medium 1) mit 0,4% Agar enthielt. Das modifizierte Medium 1 wurde nach Animpfen bei 28ºC unter Rühren mit 220 Umdr./Min. 48 Stunden inkubiert. Nach dieser Zeit wurden 10 ml des bewachsenen Mediums in einen glattwandigen Zweiliter-Kolben, der 500 ml des KF Mediums mit 0,4% Agar enthielt, überführt. Nach Animpfung wurde das resultierende Medium 24 Stunden bei 28ºC unter Ruhren mit 220 Umdr./Min. inkubiert.
20 Zweiliterkolben, von denen jeder 120 g des Mediums 2 und 120 ml einer Vorratslösung, die aus
Hefeextrakt 5 Gewichtsteile
Natriumtartrat 1 Gewichtsteil
Eisen(II)sulfat-Kristalle 0,1 Gewichtsteil
Mononatriumsalz der Glutaminsäure 1 Gewichtsteil
Maisöl 1 Gewichtsteil
bestand, wurden 20 Minuten bei 122ºC im Autoklaven erhitzt und dann nochmals mit 80 ml Wasser weitere 20 Minuten im Autoklaven auf 122ºC erhitzt. Die Kolben ließ man abkühlen und beimpfte sie mit 20 ml des Impfmediums, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, und inkubierte die angeimpften Kolben 14 Tage bei 25ºC ohne Schütteln.

Isolierung

Zu jedem der 19 Zweiliter-Kolben der Festphasenfermentation wurde 1 l Methanol zugegeben und die Inhalte wurden vereinigt, gerührt und filtriert. Der angefallene Filterkuchen wurde zweimal mit je 6 l Methanol extrahiert. Die wässrigen Methanolfiltrate wurden dann eingeengt und das Konzentrat zweimal mit je 3 l Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetat-Extrakte wurden vereinigt, getrocknet und auf etwa 100 ml konzentriert.
Das Konzentrat wurde dann auf Silicagel aufgegeben, indem 100 ml Methanol und 100 ml Silicagel zugegeben wurden, die Komponenten innig in Kontakt gebracht wurden und das Lösungsmittel dann mittels eines Rotationsverdampfers entfernt wurde. Das getrocknete Silicagel wurde dann auf eine Säule von 500 ml Silicagel aufgegeben, die Säule wurde mit Ethylacetat gewaschen, um die Verunreinigungen zu entfernen, und mit 9:1 Ethylacetat/Methanol eluiert. Die Eluate, die bei Prüfung gegen Candida albicans positiv antibiotisch wirksame Substanzen enthielten, wurden abgetrennt und vereinigt.
Die Fraktion von der Silicagelchromatographie, die einen hohen Gehalt an antibiotisch wirksamer Substanz aufwies, wurde in 200 ml von 10:10:1 Methylenchlorid/Hexan/Methanol gelöst und die erhaltene Lösung zu 40 ml SEPHADEX LH-20 (das vorher hergestellt worden war, indem es über Nacht in Methanol eingeweicht und anschließend zweimal mit 200 ml Methylenchlorid/Hexan/Methanol gewaschen wurde) gegeben. Nach wenigen Minuten wurde der überstand durch Filtration entfernt und das SEPHADEX LH-20 wurde mit 200 ml Methylenchlorid/Hexan/Methanol gewaschen und dann abfiltriert. In den Filtraten wurde kein Wirkstoff befunden und sie wurden verworfen. Der Wirkstoff, welcher in die SEPHADEX LH-20 Dextrankügelchen verteilt worden war, wurde daraus durch zweimaliges Waschen mit je 200 ml Methanol entfernt, und diese methanolischen Waschflüssigkeiten wurden vereinigt und konzentriert.
Das methanolische Konzentrat wurde dann auf 200 ml Silicagel aufgegeben und mit Ethylacetat/Methanol, 75:25, eluiert, die Eluate wurden vereinigt und das Lösungsmittel abgedampft, wodurch die Verbindung IA erhalten wurde. Die Verbindung IA ist ein weißes Pulver mit einem Zersetzungsschmelzpunkt von 206-214ºC.

HERSTELLUNG VON DERIVATEN DES ECHINOCANDIN B

BEISPIEL C

Herstellung von Echinocandin B

A. Fermentation

Die Kultur MF 5100 Emericella nidulans ATCC 20956 aus der Kulturensammlung von Merck wurde folgendermaßen für die Entwicklung einer Impfreihe verwendet: Eine gefrorene Ampulle (etwa 2,5 ml) von MF 5100 wurde für die Impfung von 54 ml KF Medium verwendet und in glattwandigen Erlenmeyerkolben von 250 ml bei 28ºC und Rühren mit 220 Umdr./Min. über 72 Stunden gezüchtet, um die Kultur der "B" Stufe zu erhalten. 5 ml dieser Kultur der "B" Stufe wurden zur Impfung von ml KF Medium in glattwandigen Zweiliter-Erlenmeyerkolben verwendet, es wurde bei 28ºC und unter Rühren mit 220 Umdr./Min. 48 Stunden inkubiert. Vier Kolben mit der "C" Stufe wurden verwendet, um 160 l KF Medium mit der Mischung von Spurenelementen #2 in einer "D" Stufe zu beimpfen (300 l Bioreaktor unter Rühren).
Die drei Stufen der Impfreihe wurden für die Fermentation der "E" Stufe in einem 800 1 Bioreaktor verwendet. Die Fermentation wurde 23 Stunden lang bei 28ºC durchgeführt, Rückdruck 0,7 kg/cm², Belüftung mit 0,300m (53 Liter pro Minute) und Rühren mit 100 Umdr./Min.
Die "E" Stufe der Produktion wurde mit 5% Impfmaterial der "D" Stufe in 5700 l eines produktionsmediums der nachstehenden Zusammensetzung beimpft:
Glycerin 85 g/l
Pektin 10 g/l
Erdnußmehl 4 g/l
Peptonisiertes Mehl 4 g/l
Peptonisierte Milch 4 g/l
Tomatenpaste 4 g/l
Maisbrühe 4 g/l
Schmalzöl 4 g/l
Glycin 2 g/l
Monobasisches Kaliumphosphat 2 g/l
Polyethylenglykol P-2000 1 ml/L
Das Medium wurde 25 Minuten bei 123ºC sterilisiert und die Fermentation dann bei einer Temperatur von 28ºC durchgeführt, positiver Druck etwa 0,8 kg/cm², Belüftung 6000 Liter pro Minute, Rührgeschwindigkeit 120 Umdr./Min.; pH im Bereich von 5,5-6,5, der Gehalt an gelöstem Sauerstoff wurde für 36 Stunden oberhalb von 30% gehalten.

B. Isolierung

Die gesamte Kulturlösung der obigen Fermentation, die gemäß Prüfung mittels HPLC 355 g Echinocandin B enthielt (verglichen mit einem Standardechinocandin B) wurde über Nacht mit dem gleichen Volumen Methanol extrahiert. Die verdünnte Lösung wurde zentrifugiert, um feste Bestandteile in der Lösung zu entfernen, und das Zentrifugat wurde an einer 450 l SP 207 Säule, welche mit 50:50 Methanol/ Wasser äquilibriert worden war, adsorbiert. Nach Waschen mit 1000 l Wasser und mit 1000 l 50:50 Methanol/Wasser wurde die Säule mit Methanol eluiert, das Eluat auf 189 l eingeengt und gegen Methylenchlorid verteilt. Die wässrige Methanolschicht wurde durch Zugabe von Wasser auf eine Konzentration von 50:50 Methanol/Wasser eingestellt und an einer HP-20 Säule von 100 l, die vorher mit Methanol gewaschen und mit 50:50 Methanol/Wasser äquilibriert worden war, adsorbiert. Nachdem mit 50:50 Methanol/Wasser gewaschen worden war, wurde die Säule mit 80:20 Methanol/Wasser eluiert. Das 80:20-Eluat wurde mit Wasser auf 50:50 eingestellt und dann an einer SP 207 Säule, die vorher wie beschrieben äquilibriert worden war, adsorbiert. Die Säule wurde dann mit Methanol eluiert.
Ein aliqoter Teil von 19 g des SP 207-Eluats wurde mit Wasser auf 50:50 Methanol/Wasser verdünnt und an einer präparativen Amicon-C-18-Säule von 19 l adsorbiert. Ein Gradient von Acetonitril/Wasser (25:75), auf 100% Acetonitril in 75 Minuten gesteigert, wurde zur Eluierung der Verbindung verwendet. Eine ausgewählte Fraktion nach Konzentrierung und Lyophilisierung aus Acetonitril/Wasser lieferte 16 g Echinocandin B mit einer Reinheit von 87-91%.
Die Identität und die Reinheit des oben erwähnten Echinocandin B wurde mittels HPLC und mittels Spektralvergleich mit einer Probe von Echinocandin B mit den unten beschriebenen Eigenschaften, das vorher hergestellt und gereinigt worden war und dessen Identität durch Vergleich mit einer veröffentlichten Struktur von Echinocandin B bewiesen war, ermittelt.

BEISPIEL D

Herstellung von Tetrahydroechinocandin B

5,0 g Echinocandin B (EB) von etwa 87%iger Reinheit (HPLC) wurden in 150 ml von absolutem Ethanol gelöst und zu 10%iger Pd-C in 80 ml Ethanol, unter Wasserstoff bei einem Druck von einer Atmosphäre 20 Minuten vorreduziert, zugegeben. Nach der Zugabe wurde die Mischung unter Wasserstoff bei einem Druck von einer Atmosphäre 4 Stunden schnell gerührt. Die Analyse mittels HPLC unter Verwendung von CH&sub3;/H&sub2;O (81/19) auf einer C8 ZORBAX Säule bei 30ºC und einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Minute zeigte, daß zu diesem Zeitpunkt die Reaktion praktisch vollständig war.
Die Reduktionsmischung wurde über einen Celitbausch filtriert, der Bausch mit Ethanol gewaschen und die Mischung im Vakuum konzentriert und eine feste Substanz erhalten. Die feste Substanz wurde in 10 Chargen gereinigt, wobei jeweils 0,5 g in 5 ml CH&sub3;CN/H&sub2;O gelöst wurden. Die HPLC wurde an einer C8 ZORBAX-Säule von 1 Inch durchgeführt und mit 80% Methanol/20% Wasser bei einer Fließgeschwindigkeit von 15 ml/Minute eluiert. Eine Gesamtausbeute von 3,15 g (79%) an Tetrahydroechinocandin B wurde erhalten.

BEISPIEL E

Herstellung von O-Methyltetrahydroechinocandin B

55 mg Tetrahydroechinocandin B wurden in 4 ml Methanol gelöst. Zu der Lösung wurden 4,0 mg p-Toluolsulfonsäure zugegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Eine HPLC-Analyse ergab, daß die Reaktion zu diesem Zeitpunkt beendet war.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1N Natriumbicarbonatlösung beendet und die Mischung wurde zweimal mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und dann mit 200 ml Isopropanol/Chloroform (2/7) verdünnt.
Die organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, das Lösungsmittel abgedampft und ein fast weißer Festkörper als Rückstand erhalten. Dieser wurde zuerst mit Methanol gereinigt, dann mit H&sub2;O/CH&sub3;CN (2:3) und mittels HPLC in H&sub2;O/CH&sub3;CN (2:3) über eine C8 LOBAR Säule Größe A in Fraktionen von 4 ml chromatographiert. Die Verbindung wurde in einer Ausbeute von 42,4 mg (76%) erhalten.

BEISPIEL F

Herstellung von O-Benzyltetrahydroechinocandin B

50 mg Tetrahydroechinocandin B wurden in 1 ml Tetrahydrofuran gelöst. 97 ml wasserfreier Benzylalkohol wurden hinzugefügt und die erhaltene Mischung gerührt, bis alles vollständig gelöst war. Zu der erhaltenen Lösung wurde 1 mg p-Toluolsulfonsäure-monohydrat zugegeben und die Mischung 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wonach eine HPLC-Analyse zeigte, daß die Reaktion vollständig war. Die Reaktionsmischung wurde mit 1 N Natriumbicarbonatlösung verdünnt, anschließend mit Isopropanol/Chloroform (3:7). Die organische Schichte wurde zweimal mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft, um das Produkt als Rückstand zu erhalten.
Die nachstehenden Beispiele erläutern neue Zusammensetzungen, die bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung in der Praxis verwendbar sind.
Aerosol-Zusammensetzungen können unter Verwendung folgender Formulierungen hergestellt werden: BEISPIEL I pro Behälter Verbindung IA Lecithin, NF flüssiges Konzentrat Trichlorfluormethan Dichlordifluormethan BEISPIEL II pro Behälter Echinocandin B Ölsäure Trichlorfluormethan Dichlordifluormethan BEISPIEL III pro Behälter O-Methyltetrahydroechinocandin B Sorbitantrioleat Trichlorfluormethan Dichlordifluormethan BEISPIEL IV Verbindung IA Methylcellulose Tween 80 Benzylalkohol Benzalkoniumchlorid Wasser ad 1 ml

Allgemeine Information über Echinocandin B

Emericella nidulans (ein späteres Wachstumsstadium von Aspergillus nidulans, etabliert als Produktionsorganismus für Echinocandin B), aufbewahrt als MF 5100 in der Kulturensammlung von Merck, wurde für die Fermentation verwendet. Eine Kultur wurde gemäß dein Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection hinterlegt und unter ATCC No. 20956 registriert.
Echinocandin B wurde wie im Beispiel C beschrieben hergestellt und hinsichtlich seiner prozentuellen Reinheit mit früher hergestelltem Echinocandin B verglichen, es weist das folgende Massenspektrum und NMR-Spektrum auf und wurde durch Vergleich mit der veröffentlichten Struktur von Echinocandin B identifiziert.

Massenspektrale Daten:

FAB-Massenspektren wurden auf einem VG 20-253 Massenspektrometer registriert. Es wurde eine Matrix von Dithiothreitol-dithiocrythritol-LiJ verwendet und M+Li wurde bei m/z 1066 beobachtet, was einem Molekulargewicht von 1059 entspricht.

¹H NMR-Spektrum:

Das Spektrum, Figur 2, wurde in CD&sub3;OD auf einem Varian XL-300 NMR-Spektrometer bei 300 MHz registriert. Die chemischen Verschiebungen werden in ppm, bezugnehinend auf Tetramethylsilan (TMS) als 0 ppm, gezeigt, wobei der Peak des Lösungsmittels bei 3,30 als interne Referenz verwendet wird.

¹³C NMR-Daten:

Das Spektrum wurde in CD&sub3;OD bei 24ºC auf einem Varian XL-400 NMR-Spektrometer bei 100 MHz registriert. Die Chemischen Verschiebungen werden in ppm, bezugnehmend auf Tetramethylsilan als 0 ppm, angegeben, wobei der Peak des Lösungsmittels von 49,0 ppm als interne Referenz verwendet wird.
¹³C Chemische Verschiebungen (CD&sub3;OD, 100 MHz): 11,28, 14,43, 19,66, 20,04, 23,62, 26,54, 27,05, 28,15, 28,20, 30,27(x2), 30,42, 30,46, 30,78, 32,65, 35,08, 36,83, 38,60, 39,06, 51,62, 52,94, 56,32, 56,84, 57,19, 58,61, 62,46, 68,33, 69,59, 69,70, 70,87, 71,29, 74,60, 75,52, 75,77, 76,94, 116,21(x2), 129,06(x2), 129,60(x2), 1320,94, 130,96, 133,09, 158,46, 169,97, 172,48, 172,51, 172,79, 173,53, 174,35, 176,19.

Claims

1. Verwendung einer Cyclohexapeptidverbindung, dargestellt durch die Formel

in der

R' H oder OH;

R'' H oder OH;

R''' H, OH, -O-Alkyl(C&sub1;-C&sub6;), -O-Benzyl oder

wobei R¹ H, C&sub1;-C&sub1;&sub2; Alkyl, C&sub3;-C&sub7; Cycloalkyl, Hydroxyethyl, C&sub1;&submin;&sub6; Alkoxyalkyl, Furylmethyl, Tetrahydrofurylmethyl, Phenyl, Phenylalkyl, worin der Phenylrest durch Halogen, Hydroxy, C&sub1;&submin;&sub6; Alkyl oder C&sub1;&submin;&sub6; Alkoxy substituiert sein kann, R² H oder C&sub1;&submin;&sub6; Alkyl oder

R¹ und R² zusammen den Rest -(CH&sub2;)&sub2;Q(CH&sub2;)&sub2;-, in dem Q -CH&sub2;-, -NH- oder -N-(C&sub1;&submin;&sub6;)Alkyl ist, darstellen und m 0 bis 4 ist;

R'''' H oder OH;

R''''' H, CH&sub3; oder CH&sub2;CONH&sub2;;

R'''''' H oder CH&sub3; bedeuten und in der

R eine der folgenden Bedeutungen aufweist:

(A) - -Alkyl mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen,

(B) - -Alkenyl mit 6 bis 24 Kohlensatoffatomen,

(C) falls R', R'', R''' und R'''' OH sind und R''''' CH&sub3; ist, einen der Reste

in denen A bivalenten Sauerstoff, Schwefel, Sulfinyl oder Sulfonyl;

A¹ bivalenten Sauerstoff, Schwefel, sulfinyl, Sulfonyl oder -NH-;

X Wasserstoff, Chlor, Brom, Jod, Nitro, C&sub1;-C&sub3; Alkyl, Hydroxy, C&sub1;-C&sub3; Alkoxy, Mercapto, C&sub1;-C&sub3; Alkylthio, Carbamoyl oder C&sub1;-&sub3; Alkylcarbamoyl;

X¹ Chlor, Brom oder Jod;

R¹ Wasserstoff, C&sub1;-C&sub1;&sub8; Alkyl oder C&sub2;-C&sub1;&sub8; Alkenyl; und W C&sub1;-C&sub1;&sub0; Alkylen oder C&sub2;-C&sub1;&sub0; Alkenylen darstellen und

m, n und p 0 oder 1 sind, wobei jedoch, wenn m 0 ist, n auch 0 sein muß;

vorausgesetzt daß die Summe der Kohlenstoffatome in den Resten R¹ und W größer als 4 ist und 21 nicht überschreitet, daß A und A¹ nicht Sulfinyl oder Sulfonyl sein können, wenn X Mercapto bedeutet, und daß, wenn A und A¹ Sulfinyl oder Sulfonyl bedeuten, sie auf der gleichen Oxidationsstufe sein müssen;

(D) falls R' OH ist und R'', R''' und R'''' H sind, dann

-Y- -R&sub2;

wobei Y ein bivalentes Aminoacylradikal der Formeln

a)

- -Z-NH-

worin Z C&sub1;-C&sub1;&sub0; Alkylen oder C&sub5;-C&sub6; Cycloalkylen ist,

b)

worin R&sub3; Hydroxymethyl, Hydroxyethyl, Mercaptomethyl, Mercaptoethyl, Methylthioethyl, 2-Thienyl, 3-Indolmethyl, Phenyl, Benzyl, Halogenphenyl, Halogenbenzyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylphenyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylbenzyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylthiophenyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylthiobenzyl, Carbamoylphenyl, Carbamoylbenzyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylcarbamoylphenyl oder C&sub1;-C&sub3; Alkylcarbamoylbenzyl ist; und

worin X² Wasserstoff oder Halogen ist;

darstellt,

für die Herstellung eines Arzneimittels, welches für die Behandlung oder für die Vorbeugung von Infektionen durch Pneumocystis carinii verwendbar ist.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Cyclohexapeptidverbindung in einer Dosis von 0,5 bis 20,0 mg/kg Säugetier verabreicht wird.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Cyclohexapeptidverbindung einem mit Pneumocystis carinii infizierten Patienten mit geschwächtein Immunsystem verabreicht wird.

4. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Cyclohexapeptidverbindung einem mit Pneumocystis carinii infizierten, an AIDS leidenden Patienten verabreicht wird.

5. Eine Zusammensetzung, die für die Behandlung von Infektionen durch Pneumocystis carinii bei Säugetieren verwendbar und für die Verabreichung durch Inhalation angepaßt ist, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine Cyclohexapeptidverbindung mit der Formel

in der

R' H oder OH;

R'' H oder OH;

R''' H, OH, -O-Alkyl(C&sub1;-C&sub6;), -O-Benzyl oder

wobei R¹ H, C&sub1;-C&sub1;&sub2; Alkyl, C&sub3;-C&sub7; Cycloalkyl, Hydroxyethyl, C&sub1;&submin;&sub6; Alkoxyalkyl, Furylmethyl, Tetrahydrofurylmethyl, Phenyl, Phenylalkyl, worin der Phenylrest durch Halogen, Hydroxy, C&sub1;&submin;&sub6; Alkyl oder C&sub1;&submin;&sub6; Alkoxy substituiert sein kann,

R² H oder C&sub1;&submin;&sub6; Alkyl oder

R¹ und R² zusammen den Rest -(CH&sub2;)&sub2;Q(CH&sub2;)&sub2;-, in dem Q -CH&sub2;-, -NH- oder -N-(C&sub1;&submin;&sub6;)Alkyl ist, darstellen und m eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist;

R'''' H oder OH;

R''''' H, CH&sub3; oder CH&sub2;CONH2;

R'''''' H oder CH&sub3; bedeuten und in der

R eine der folgenden Bedeutungen aufweist:

(A) - -Alkyl mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen,

(B) - -Alkenyl mit 6 bis 24 Kohlensatoffatomen,

in denen A bivalenten Sauerstoff, Schwefel, Sulfinyl oder Sulfonyl;

A¹ bivalenten Sauerstoff, Schwefel, Sulfinyl, Sulfonyl oder -NH-;

X Wasserstoff, Chlor, Brom, Jod, Nitro, C&sub1;-C&sub3; Alkyl, Hydroxy, C&sub1;-C&sub3; Alkoxy, Mercapto, C&sub1;-C&sub3; Alkylthio, Carbamoyl oder C&sub1;-C&sub3; Alkylcarbamoyl;

X¹ Chlor, Brom oder Jod;

m, n und p 0 oder 1 sind, wobei jedoch, wenn m 0 ist, n auch 0 sein muß;

(D) falls R' OH ist und R'', R''' und R'''' H sind, dann

-Y- -R&sub2;

wobei Y ein bivalentes Aminoacylradikal der Formeln

a)

- -Z-NH-

worin Z C&sub1;-C&sub1;&sub0; Alkylen oder C&sub5;-C&sub6; Cycloalkylen ist,

b)

worin R&sub3; Hydroxymethyl, Hydroxyethyl, Mercaptomethyl, Mercaptoethyl, Methylthioethyl, 2-Thienyl, 3-Indolmethyl, Phenyl, Benzyl, Halogenphenyl, Halogenbenzyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylphenyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylbenzyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylthiophenyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylthiobenzyl, Carbamoylphenyl, Carbamoylbenzyl, C&sub1;-C&sub3; Alkylcarbamoylphenyl oder C&sub1;-C&sub3; Alkylcarbainoylbenzyl ist; und

c)

worin X² Wasserstoff oder Halogen ist;

darstellt.

6. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei es sich um eine Verbindung mit der Formel

handelt.

7. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung 1-[(4R,5R)-4,5-Dihydroxy-N²-(10, 12-dimethyl- 1-oxotetradecyl)-L-ornithin]-5-(threo-3-hydroxy-1-glutamin)echinocandin B ist.

8. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung 1-[(4R,5R)-4,5-Dihydroxy-N²-[4-(octyloxy)benzoyl]-L-ornithin]-echinocandin B ist.

9. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung Echinocandin B ist.

10. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung Tetrahydroechinocandin B ist.

11. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung O-Methyltetrahydroechinocandin B ist

12. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung O-Benzyltetrahydroechinocandin B ist.