DE69104022T2

DE69104022T2 - Antibiotisches zyklisches Hexapeptid.

Info

Publication number: DE69104022T2
Application number: DE69104022T
Authority: DE
Inventors: Thomas C Hallada; Otto D Hensens; Jerrold M Liesch; Prakash S Masurekar; Robert E Schwartz; David F Sesin
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1990-12-19
Filing date: 1991-12-11
Publication date: 1995-04-13
Anticipated expiration: 2011-12-12
Also published as: ATE111487T1; IE914418A1; JP3067869B2; CA2057711A1; US5306708A; CA2057711C; JPH0692992A; DE69104022D1; EP0494515A1; EP0494515B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die EP-A-0359529 beschreibt echinocandinartige Antibiotika und ihre Verwendung zur Behandlung von Pneumocvstis carinii.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft eine Verbindung der Formel
worin R für H oder OH steht, und ein Verfahren zur Herstellung derselben.
Wenn R für H steht, wird die Verbindung im folgenden als Verbindung IA bezeichnet. Wenn R für OH steht, wird die Verbindung im folgenden als Verbindung IB bezeichnet.
Die Struktur der Verbindungen wurde durch ausführliche Analysen der spektralen Eigenschaften bestimmt. Verbindung IA besitzt die folgenden Spektraleigenschaften:

MASSENSPEKTRALDATEN

Elektronenstoß-(EI, 70 eV) und Fast-Atom-Bombardement- (FAB, MS und MS-MS)-Massenspektraldaten mit niedriger Auflösung wurden auf einem Finnigan-MAT-TSQ7OB-Massen spektrometer erhalten. Die GC-MS-Analysen der TMS-(Trimethylsilyl)-Derivate der Gesamtsäurehydrolysate wurden mit Hilfe desselben Instruments durchgeführt. Hochauf lösende FAB-Messungen wurden auf einen Finnigan-MAT-MAT90-Instrument durchgeführt.
Verbindung IA besitzt die Molekularformel C&sub5;&sub0;H&sub8;&sub0;N&sub8;O&sub1;&sub7; [aus M+Cs]&spplus;: ber. 1064,5641, gefunden 1064,5585 durch FAB-MS. Die GC-MS-Analyse des TMS-Derivats des gesamten Säurehydrolysats zeigte jeweils ein Äquivalent Threonin, 3-Hydroxyglutaminsäure und 10,12-Dimethyltetradecansäure plus zwei Äquivalente 4-Hydroxyprolin.

NMR-SPEKTRALDATEN

¹H-NMR-Spektrum: in CD&sub3;OD bei 400 MHz, ersichtlich in Figur 1, und chexnische ¹³C-NMR-Verschiebungen (CD&sub3;OD): 11,6, 19,7, 20,2, 20,7, 27,0, 28,1, 30,3 (2x), 30,6, 30,8, 31,2, 31,3, 32,9, 34,9, 36,7, 38,1, 38,5 (2x), 39,4, 45,9, 51,2 56,1, 56,3, 57, 1, 57, 9, 58,3, 60,7, 62,4, 68,2,70,6, 70,9, 71,0, 71,3, 73,8, 75,8, 76,9, 116,2 (2x), 129,6 (2x), 133,0, 158,5, 169,2, 172,5, 172,9, 173,4, 174,5, 174,6, 175,7, 177,3 ppm.
Verbindung IB besitzt die folgenden Spektraleigenschaften:

MASSENSPEKTRALDATEN

Verbindung IB besitzt die Molekülformel C&sub5;&sub0;H&sub8;&sub0;N&sub8;O&sub1;&sub8; (aus [M+Cs)&spplus;: ber. 1080,5590, gefunden 1080,5344) durch FAB-MS. Die GC-MS-Analyse des TMS-Derivats des Gesamtsäurehydrolysats zeigte jeweils ein Äquivalent Threonin, 4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyglutaminsäure, 3, 4-Dihydroxyprolin und 10, 12-Dimethyltetradecansäure.

NMR-SPEKTRALDATEN

¹H-NMR-Spektrum: in CD&sub3;OD bei 400 MHz ist in Figur 2 gezeigt und
¹³C-NMR-chemische Verschiebungen (CD&sub3;OD): 11,6, 19,7, 20,2, 20,8, 27,0, 28,0, 30,3, 30,6, 30,8, 31,2, 31,2, 32,9, 32,9, 34,8, 36,7, 38,1, 38,5, 39,4, 45,9, 51,2, 54,4, 55,3, 56,2, 57,0, 58,3, 62,5, 65,9, 68,2, 70,7, 70,8, 71,3, 71,9, 73,8, 75,8, 75,9, 77,0, 116,3 (2C), 129,7 (2C), 132,9, 158,4, 169,4, 172,5, 172,7, 173,2, 173,4, 174,5, 175,9, 177,2.
Auf der Grundlage dieser und weiterer Daten wird angenommen, daß Verbindung I mit ziemlicher Sicherheit die angegebene Struktur besitzt.
Die Verbindungen IA und IB sind farblose Feststoffe, in organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Ethanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Ethylacetat und dergleichen, löslich.
Verbindung I (IA und IB) besitzt fungizidische Eigenschaften sowohl gegen Schlauchpilze als auch Hefen. Sie ist besonders für Organismen geeignet, die pathogene Pilzinfektionen verursachen, wie Candida albicans, Candida Tropicalis, Candida pseudotropicalis, Candida parapsilosis und dergleichen.
Ferner ist das erfindungsgemäße Fungizid im Gegensatz zu einer Reihe von Fungiziden, wie Amphotericin B, die, obschon sie gegen Candida albicans und weitere Pilzpathogene aktiv sind, in ihrer Fähigkeit aufgrund ungerichteter und gefährlicher Nebenwirkungen eingeschränkt sind, nicht nur sehr wirkungsvoll, sondern im wesentlichen frei von unerwünschten Nebenreaktionen.
Eine Lyse roter Blutköperchen, eine gefährliche und potentiell lebensbedrohende Nebenreaktion, zeigt sich bei vielen Verbindungen in Konzentrationen, die sich der therapeutischen Dosis nähern. Diese Eigenschaft hat die Anwendbarkeit dieser Verbindungen als Arzneimittel eingeschränkt. Die erfindungsgemäße Verbindung würde eine Arzneimittelkonzentration weit oberhalb derjenigen erfordern, die zur therapeutischen Anwendung erforderlich ist, bevor eine Lyse roter Blutkörperchen eintreten könnte.
Verbindung I kann auch gegen Schlauchpilze, wie Aspergilgus- Spezies, Penicillium-Spezies, Fusarium-Spezies, Altemaria- Spezies, Neurospora-Spezies und dergleichen, eingesetzt werden.
Verbindung I kann ferner zur Behandlurig von Pneumocystiscarinii, der Ursache einer Lungenentzündung, eingesetzt werden, die für immunkomprpmittierte Patienten, wie für diejenigen mit dem erworbenen Immundefektsyndrom (AIDS), eine besondere Bedrohung darstellt.
Verbindung I wird zweckmäßigerweise durch Kultivieren einer mutagenen Form von Zalerion arboricola hergestellt, die wie im folgenden beschrieben hergestellt wird und in der Kultursammlung von Merck unter MF5533 aufbewahrt wird. MF5533 wurde unter dem Budapester Vertrag in der Kultursammlung von The American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, hinterlegt und bekam die Zugangsnummer ATCC 74030.
Zalerion arboricola ATCC 74030 ist eine mutagene Form von Zalerion arboricola ATCC 20957, die seinerseits eine mutagene Form von ATCC 20868 darstellt. Diese Mutante kann durch Kultivieren eines gefrorenen vegetativen Myzels von Zalerion arboricola ATCC 20957 mit einem Mutagen und durch anschließendes Ausplattieren, Inkubieren und Isolieren hergestellt werden, wie im folgenden ausführlicher beschrieben.
Das Hauptprodukt beim Kultivieren von Z. arboricola MF5533 ist Verbindung x, dargestellt durch die Formel
Zur Herstellung dieser Mutante können eine Reihe von Mitteln, die im allgemeinen zur Herstellung von Mutanten verwendet werden, eingesetzt werden, wie ultraviolette Strahlung, ein chemisches Mutagen oder ein Interkalationsmittel. Geeignete chemische Mutagene umfassen N-Nitroso-N-methylurethan und N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin.
Für die Zwecke der Erfindung wurde die Z. arboricola-Mutante MF5533, ATCC 74030, durch Überimpfen eines gefrorenen vegetativen Myzels von Z. arboricola MF5404, ATCC 20957, beschrieben und beansprucht in der mitanhängigen Anmeldung, Seriennummer 492024, entsprechend der EP-A-0405997, in ein Stammedium, Zugabe von N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin und Kultivieren, danach Ausplattieren eines Teils der Züchtung auf Kartoffel-Dextrose-Agar und Inkubieren, um Kolonien zu entwickeln, und anschließend Überführen der getrennten Kolonien in Schrägröhrchen mit Kartoffel-Dextrose-Agar und 14tägiges Inkubieren bei 25 ºC, um Kulturen der Mutanten von Z. arboricola zu erhalten, von denen eine als 47-19 bezeichnet wurde und anschließend in der Merck-Kultursammlung als MF5533 aufbewahrt wurde, erhalten.
Die Kolonie- und Morphologiebeschreibung von Z. arboricola MF5533, ATCC 74030, lauten wie folgt:
Kolonien auf Kartoffel-Dextrose-Agar (Difco) sind bei 20 ºC langsam wachsend, erreichen in einer Woche einen Durchmesser von 8-12 mm. Reife Kolonien (3-4 Wochen) auf Kartoffel- Dextrose-Agar zeigen Effusion, mit submersen Hyphen und Lufthyphen, Oberfläche haarig, wollig oder faserig, matt bis mäßig glänzend, Form erhaben, dicht kompakte Kolonien mit einer substromatären Textur aufgrund einer dichten Konidienbildung. Kolonienfarbe blaß olivbraun, oliv, olivbraun, schließlich olivschwarz, isabellfarben, Sayal-Braun, Tawny- Oliv, Saccardo-Umbra, Sepia, bräunliches Oliv, Umbra-Dunkeloliv, olivartiges Schwarz (Name der Hauptfarbe von R. Ridgway, 1912. Color Standards and Nomenclature, Washington, D.C.). Dieselben Farben in der Kolonie umgekehrt. Geruch, Exudate und lösliche Pigmente fehlen.
Hyphen (3 % KOH) blaß gelbbraun bis olivbraun, septiert, verzweigt, oft mit irregulären lateralen oder terminalen Lapppen, 1-3 um breit, dünn bis leicht dickwandig, mit glatten bis leicht krustigen oder verrukösen Wänden. Lufthyphen oft in Bündeln zusammenhaftend. Setae und Hyphophodien fehlen.
Konidiogene monoblastische Zellen, zerstreut bis dicht, integriert, terminal und interkalar, ragen direkt von der undifferenzierten Hyphe in einem rechten bis leicht spitzen Winkel empor. Konidien entspringen als unregelmäßige Kettenfäden oder Keulen, entwickeln sich später als kompakte irreguläre Massen von 2-6 Zellen. Einzelne konidiale Zellen von 3-6 um Durchmesser, kugelförmig, teilweise kugelförmig oder leicht irregulär bis gelappt, glatt bis fein verrukös, gelbbraun bis olivbraun.

HERSTELLUNG

Verbindung I kann erhalten werden, indem Z. arboricola MF5533 in einem geeigneten Nährmedium unter Bedingungen, die nachstehend beschrieben werden, kultiviert wird, bis eine wesentliche Menge der Fungizidaktivität in dem Kulturmedium nachgewiesen werden kann, indem die Ernte durch Extraktion der aktiven Komponente aus dem Fermentationsmedium mit einem geeigneten Lösungsmittel erfolgt, die Lösung, die die gewünschte Verbindung enthält, konzentriert wird, anschließend das konzentrierte Material einer chromatographischen Trennung zur Isolierung von Verbindung I von anderen Metaboliten, die ebenfalls in dem Kultivierungsmedium vorhanden sind, unterzogen wird.
Ein geeignetes Nährmedium zur Produktion von Verbindung I ist eines, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, dievon dem Mikroorganismus assimilierbar sind und auch niedrige Konzentrationen an anorganischen Salzen enthalten. Das Medium kann mit Spurenelementen ausgestattet sein, obwohl, falls komplexe Kohlenstoff- und Stickstoffquellen eingesetzt werden, die Spurenelemente im allgemeinen in den komplexen Quellen vorhanden sind.
Die Kohlenstoffquellen umfassen Glycerin, Zucker, Zuckeralkohole, Stärken und weitere Kohlenhydrate oder Kohlenhydratderivate, wie Dextran, Cellulose, sowie komplexe Nährstoffe, wie Haferrnehl, Maismehl, Hirse, Mais und dergleichen. Die genaue Menge der Kohlenstoffquelle, die in dem Medium verwendet wird, hängt teilweise von den weiteren Bestandteilen des Mediums ab, jedoch wurde gefunden, daß im allgemeinen eine Kohlenhydratmenge zwischen 0,5 und 40 Gew.-% des Mediums genügt. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden, oder mehrere solche Kohlenstoffquellen können in demselben Medium kombiniert werden.
Die Stickstoffquellen umfassen Aminosäuren, wie Glycin, Arginin, Threonin, Methionin und dergleichen, Amoniumsalze und komplexe Quellen, wie Hefehydrolysate, Hefeautolysate, Hefezellen, Tomatenpaste, Sojabohnenmehl, Caseinhydrolysate, Hefeextrakte, Getreideeinweichwasser, lösliche Destillationsrückstände, Baumwollmehl, Fleischextrakt und dergleichen. Die verschiedenen Stickstoffquellen können allein oder in Kombination in Mengen im Bereich von 0,2 bis 10 Gew.-% Medium verwendet werden.
Unter den anorganischen Nährstoffsalzen, die in das Kulturmedium eingearbeitet werden können, befinden sich üblicherweise Salze, die in der Lage sind, Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Phosphat, Sulfat, Chlorid, Carbonat und ähnliche Ionen abzugeben. Hierin eingeschlossen sind auch Spurenelemente, wie Cobalt, Mangan, Eisen, Molybdän, Zink, Cadmium und dergleichen.
Obwohl das Wachstumsmedium auf herkömmliche Weise aus den vorgenannten Nährstoffen hergestellt werden kann, fördert die Gegenwart bestimmter Nährstoffe und/oder einer bestimmten Kombination von Nährstoffen die Produktion von Verbindung I. So sind Ammoniumsalze als unmittelbare Stickstoffquelle wichtig, und monobasisches Kaliumphosphat ist zur pH-Kontrolle wichtig. Mannit ist in Gemischen besonders geeignet, nicht nur zur Verbesserung der Menge des gebildeten gewünschten Produkts, sondern auch zur Verbesserung der Produktionsgeschwindigkeit des gewünschten Produkts.
Das Kultivierungsmedium kann entweder flüssig oder fest sein. Beispielhafte geeignete Medien zur Produktion von Verbindung I sind folgende:

TG106-MEDIUM

pro Liter
D-Mannit 100 g
NZ-Amin Typ E* 33 g
Hefeextrakt 8005 von Fidco 10 g
(NH&sub4;) &sub2;SO&sub4; 5g
KH&sub2;PO&sub4; 9g
P-2000 2 ml
* Caseinhydrolysat, Sheffield Products, Kraft, Inc.

SP-5-MEDIUM

pro Liter
Mannit 80 g
KH&sub2;PO&sub4; 9g
Cerelose 10 g
PHARAAMEDIA* 20 g
vorsterilisiert pH 7,3
* gelbes Mehl aus Baumwollembryonen, enthaltend nicht hydrolysiertes, globuläres Protein, Traders Protein, Buckeye Oilseed Products Co., Memphis Tenn. RG2 -MEDIUM RG120-MEDIUM pro Liter Mannit Getreideeinweichwasser Speckwasser Pectin KH&sub2;PO&sub4; Tomatenpaste peptonisierte peptonisierte Milch Glycin Erdnußmehl pH eingestellt auf TG102-MEDIUM TG103-MEDIUM pro Liter D-Mannit Bacto-Pepton* Bacto-Hefeextrakt (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; KH&sub2;PO&sub4; keine pH- Einstellung S2-MEDIUM S6-MEDIUM pro Liter D-Mannit KH&sub2;PO&sub4; Glycin peptonisierte Milch Milchsäure Spurenelemente Sojaöl Sterilisation) F204-FESTMEDIUM pro 250-ml-Kolben Grundflüssigkeit pro Liter Hirse Grundflüssigkeit ARDAMIN pH (**) Natriumtartrat FeSO&sub4; &sub7;H&sub2;O Mononatriumglutamat Maisöl keine pH-Einstellüng ** Hefeautolysat, Yeast Products Inc. Clifton, New Jersey F4-SF-FESTMEDIUM pro 250-ml-Kolben Grundflüssigkeit pro Liter gequetschter Mais Grundflüssigkeit ARDAMIN pH (**) H&sub2;PO&sub4; MgSO&sub4; &sub7;H&sub2;O Natriumtartrat FeSO&sub4; &sub7;H&sub2;O ZnSO&sub4; &sub7;H&sub2;O keine pH-Einstellung
Die Produktion der gewünschten Verbindung unter Verwendung eines der vorgenannten oder ähnlicher Medien beginnt im allgemeinen, indem zuerst ein Nährmedium zur Anzucht mit einem gefrorenen vegetativen Myzel von Z. arboricola MF5533 angeimpft und das angeimpfte Medium wenigstens 3 Tage lang inkubiert wird, um eine Nährlösung zu produzieren, die Organismen enthält, die als Inokulum zur Produktion der Verbindungen der Formel (I) dienen.
Anstelle der Verwendung von allem oder eines Aliquots der Fermentationslösung zur Produktion kann ein Aliquot der Nährlösung in einer zweiten Stufe in der das Anzuchtmedium erzeugt wird, eingesetzt werden. Je nach Größe der betrachteten Produktion können mehrere Stufen einer Produktion von Anzuchtmedien vor der Verwendung der Fermentationslösung als Inokulum zur endgültigen Produktion von Verbinung I durchgeführt werden. Das Anzuchtmedium liegt im allgemeinen in einem pH-Bereich von 5 bis 8,1, optimalerweise von 6 bis 7,5.
Ein geeignetes Anzuchtmedium ist das Medium P34-2 der folgenden Zusammensetzung:
pro Liter
Getreideeinweichwasser 5 g
D-Mannit 25 g
Glucosemonohydrat 10 g
Pharmamedia 20 g
KH&sub2;PO&sub4; 9g
FeSO&sub4;H 7H&sub2;O 10 mg
MnSO&sub4; 4H&sub2;O 10 mg
CuCl&sub2; 2H&sub2;O 0,25 mg
CaCl&sub2; 2H&sub2;O 1 mg
H&sub3;BO&sub3; 0,56 mg
(NH&sub4;)&sub6;MO&sub7;O&sub2;&sub4; H&sub2;O 0,19 mg
ZnSO&sub4; 7H&sub2;O 2 mg
Ein weiteres geeignetes Stammedium ist KF-Medium der folgenden Zusammensetzung:
pro Liter
Getreideeinweichwasser 5 g
Tomatenpaste 40 g
Hafermehl 10 g
Glucose 10 g
FeSO&sub4;H 7H&sub2;O 10 mg
MnSO&sub4; 4H&sub2;O 10 mg
CuCl&sub2; 2H&sub2;O 0,25 mg
CaCl&sub2; 2H&sub2;O 1 mg
H&sub3;BO&sub3; 0,56 mg
(NH&sub4;)&sub6;MO&sub7;O&sub2;&sub4; H&sub2;O 0,19 mg
ZnSO&sub4; 7H&sub2;O 2 mg
Bei der Durchführung des Verfahrens wird ein Teil einer als Schrägkultur aufbewahrten Kultur von MF5533, ATCC 20958, in ein geeignetes Anzuchtmedium übergeimpft, und die Kolben werden mit oder ohne Schütteln bei Temperaturen im Bereich von etwa 15 ºC bis etwa 30 ºC 2 bis zu 30 Tage, vorzugsweise bei 20 ºC bis 28 ºC 2 bis zu 14 Tage, inkubiert. Wird Schütteln eingesetzt, so vorzugsweise im Bereich von 150 bis 220 Upm, jedoch sind bis zu 400 Upm möglich. Ist das Wadhstum reichlich, im allgemeinen zwischen 2 und 5 Tagen, kann die gewachsene Kultur verwendet werden, um das Prouktionsmedium zur Produktion der erfindungsgemäßen Verbindungen anzuimpfen. Vorzugsweise jedoch wird eine zweite Fermentationsstufe und häufig eine dritte oder vierte Fermentationsstufe durchgeführt, indem mit einem Teil der gewachsenen Kultur angeimpft wird und sodann ähnliche Bedingungen und eine Inkubationszeit von etwa 1 bis 6 Tagen eingesetzt werden. Die gewachsene Kultur wird sodann eingesetzt, um das Produktionsmedium anzuimpfen.
Das Produktionsmedium zur Fermentation, das mit der gewachsenen Kultur angeimpft worden ist, wird 3 bis 30 Tage, im allgemeinen 7 bis 14 Tage lang, mit oder ohne Rühren inkubiert. Die Fermentation kann aerob bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 ºC bis etwa 40 ºC durchgeführt werden. Für optimale Ergebnisse ist es am zweckmäßigsten, diese Fermentationen bei Temperaturen im Bereich von etwa 24 ºC bis etwa 30 ºC durchzuführen. Temperaturen von etwa 24 ºC bis 28 ºC werden am meisten bevorzugt. Der pH-Wert des Nährmediums, der zur Herstellung der erf indungsgemäßen Verbindungen geeignet ist, kann von etwa 5,0 bis 8,5, mit einem bevorzugten Bereich von etwa 5,5 bis 6,0, variieren. Nach einer geeigneten Zeitdauer zur Produktion der gewünschten Verbindung oder Verbindungen werden letztere aus dem Fermentationsmedium gewonnen, wie nachstehend ausführlicher beschrieben.

ERNTE UND ISOLIERUNG

Nach Beendigung der Kultivierung wird Verbindung I geerntet und aus dem Medium isoliert. Die genauen Stufen können etwas variieren, je nachdem, ob die Fermentation in einem flüssigen oder festen Medium durchgeführt wird.
Wird die Fermentation auf festem Medium durchgeführt, kann die erste Stufe die Zugabe einer alkoholischen Lösung zu dem Fermentationsmedium, sorgfältiges Mischen, danach Filtrieren, Gewinnen und Konzentrieren-des wäßrigen alkoholischen Filtrats darstellen. Das konzentrierte Filtrat kann zunächst rückextrahiert oder mit einem niederaliphatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel wie Hexan oder einem weiteren Alkan gewaschen werden, um die alkanlöslichen Verunreinigungen zu entfernen.
Wird die Fermentation in einem flüssigen Medium durchgeführt, können bei einem Verfahren die Myzelfeststoffe durch Filtration oder Zentrifugation abgetrennt und aus dem Fermentationsmedium gewonnen werden. Alkohol wird zu dem Myzelkuchen hinzugegeben und der Myzelfeststoff sorgfältig mit einem niederen Alkanol vermischt, um das gewünschte Produkt zu extrahieren. Das Gemisch wird filtriert oder zentrifugiert und das Filtrat oder der Überstand gesammelt und konzentriert. Bei einem alternativen Verfahren kann das gesamte Nährmedium durch Zugabe von einem Volumen eines niederen Alkanols, vorzugsweise Methanol, extrahiert werden und wird filtriert oder zentrifugiert, um die festen Verunreinigungen zu entfernen.
Das niedere Alkanol, das zur Extraktion des Wirkstoffes aus dem festen Nährmedium oder Myzelkuchen, der durch Zentrifugation oder Filtration erhalten worden ist, verwendet wird, schließt Methanol, Ethanol, Isopropanol oder höhere Alkanole ein. Methanol wird bevorzugt. Der Alkanolextrakt wird auf eine Säule zur Durchführung der chromatographischen Trennstufen aufgegeben. Adsorptionsmittel, die käuflich erhältlich sind, wie Styrol-Divinylbenzol-Copolymere, käuflich erhältlich als "DIAION" HP-20, HP-30, HP-40, SP-207 (Mitsubishi Chemical Industries, LTd.) und "BERLITE" XAD-2, XAD-4, XAD-16 (Rohm und Haas Co.), können für die ersten Isolierungsschritte verwendet werden.
Bei der Durchführung der Trennstufen wird die Zusammensetzung des Alkanolextrakts auf 50 % Wasser eingestellt und an HP-20 oder ein anderes ausgewähltes Harz adsorbiert und sodann mit 100 % Alkanol, vorzugsweise Methanol, eluiert.
Die herkömmliche Säulenchromatographie kann eingesetzt werden. Wird eine herkömmliche chromatographische Trennung angewendet, kann "SEPHADEX" LH-20 (Pharmacia) oder Kieselgel verwendet werden, wobei Kieselgel bevorzugt wird.
Bei der Fraktionierung und Gewinnung der aktiven Verbindung durch Chromatographie über Kieselgel kann Ester/Alkohol/ Wasser oder Dichlormethan/Alkohol/Wasser eingesetzt werden, um gute Trennungen zu liefern. Ein Gemisch von Ethylacetat, Methanol und Wasser oder 5 % wäßrige Essigsäure wurde als besonders geeignet befunden. Wird ein Dextranadsorbens, wie "SEPHADEX" LH-20, eingesetzt, kann ein Lösungsmittelsystem aus Chlorkohlenwasserstoff/Kohlenwasserstoff/Alkohol verwendet werden. Ein Gemisch aus Methylenchlorid/Hexan/Methanol erwies sich als besonders geeignet.
Zur Durchführung der HPLC-Trennung wird die alkoholische Lösung, die das aus der herkömmlichen Chromatographie gewonnene Material enthält, konzentriert und der Rückstand in Methylenchlorid/Methanol/Wasser oder Ethylacetat/Methanol/ Wasser in demselben Verhältnis wie es in der mobilen Phase vorkommt aufgelöst und auf eine Säule, gepackt mit handelsüblichem Kieselgelharz, aufgegeben und bei etwa 800 bis 2000 psi eluiert, was eine Fließgeschwindigkeit von etwa 10 ml/Minute erzeugt. Die Trennung wird mittles UV bei 276 nm überwacht.
Verbindung I ist aktiv gegen viele Pilze und ebenso gegen Pneumocystis carinii.
Die fungizidischen Eigenschaften können anhand der Bestimmungen der kleinstmöglichen Fungizidkonzentration (MFC) gegen bestimmte Candida-Organismen in einem Verdünnungstest der Nährlösung im Mikromaßstab, durchgeführt äuf Hefe-, Stickstoffgrundlage (Difco) mit 1 % Dextrose (YNBD), erläutert werden. Bei der Durchführung des Tests wurde Verbindung I in 10 % Dimethylsulfoxid (DM50) solubilisiert und auf 2560 ug/ml verdünnt. Die Verbindung wurde sodann in YNBD auf 256 ug/ml verdünnt. 0,15 ml der Suspension wurden in die oberste Reihe einer Platte mit 96 Vertiefungen (jede Vertiefung enthält 0,15 ml YNBD) gegeben, was zu einer Arzneimittelkonzentration von 128 ug/ml führt. Die zweimaligen Verdünnungen wurden sodann, ausgehend von der oberen Reihe, vorgenommen, um Endkonzentrationen des Arzneimittels im Bereich von 128 bis 0,06 ug/ml zu erhalten.
Die Hefekulturen, die auf Sabouraud-Dextroseagar gehalten wurden, wurden in YM-Nährlösung (Difco) übergeführt und über Nacht bei 35 ºC unter Schütteln (250 Upm) inkubiert. Nach der Inkubation wurde jede Kultur mit sterilem Wasser verdünnt, um eine Endkonzentration von 1-5 x 10&sup6; kolonienbildenden Einheiten (CFU)/ml zu erhalten.
Mikroplatten mit 96 Vertiefungen wurden unter Verwendung von MIC-2000 (Dynatech), das 1,5 ul pro Vertiefung abgibt, angeimpft, was zu einem End-Inokulum pro Vertiefung von 1,5-7,5 x 10³ Zellen führt. Die Mikroplatten wurden sodann bei 35 ºC 24 Stunden lang inkubiert. Die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MICs) wurden als die niedrigsten Arzneimittelkonzentrationen aufgezeichnet, die kein sichtbares Wachstum zeigten.
Nach der Aufzeichnung der MIC wurden die Platten geschüttelt, um die Zellen zu resuspendieren. Danach wurden 1,5-ul-Proben von den Vertiefungen in der Mikroplatte mit 96 Vertiefungen in eine Schale mit einer einzigen Vertiefung übergeführt, die Sabouraud-Dextrose-Agar enthielt. Die angeimpften Schalen wurden 24 Stunden lang bei 28 ºC inkubiert und dann analysiert. MFC wird als die geringste Arzneimittelkonzentration definiert, die kein Wachstum oder weniger-als 4-Kolonien-pro Fleck zeigt. Die Ergebnisse (3 Proben) gehen aus der folgenden Tabelle hervor: Pilzstammnummer kleinstmögliche fungizidische Konzentration (ug/ml) Verbindung Candida albicans Candida tropicalis Candida pseudotropicalis
Verbindung I ist zur Hemmung oder Linderung von Pneumocystis carmii-Infektionen geeignet. In einer repräsentativen Studie wurde die Wirksamkeit von Verbindung I bei Ratten bestimmt. Sprague-Dawley-Ratten (Gewicht etwa 250 g) wurden mit Dexason im Trinkwasser (2 g/ml) immunsupprimiert und 5 Wochen lang bei einer Diät mit wenig Protein gehalten, um die Entwicklung von Pneumocystis-Pneumonie ausgehend von einer latenten Infektion zu induzieren. Vor der Arzneimittelbehandlung wurden zwei Ratten getötet, um das Vorliegen einer Pneumocystis-carmii-Pneumonie (PCP) zu verifizieren. Beide Ratten wiesen Infektionen auf. Die restlichen Ratten (Gewicht etwa 150 g) wurden in Gruppen von 6 aufgeteilt und erhielten zweimal täglich 4 Tage lang subkutan eine Injektion mit der Verbindung in 0,25 ml Arzneimittelhilfsstoff (10 % DMSO in Wasser oder in Wasser). Die Kontrollgruppe von 5 Ratten erhielt nur den Arzneimittelhilfsstoff. Alle Tiere erhielten weiterhin Dexason im Trinkwasser und die Diät mit geringem Proteingehalt während des Zeitraums der Arzneimittelbehandlung. Nach Beendigung der Behandlung wurden alle Tiere getötet, die Lungen wurden entfernt und verarbeitet und das Ausmaß der Krankheit durch mikroskopische Analyse der angefärbten Objektträger bestimmt. Die Ergebnisse dieser Studie sind als mittlerer logarithmischer Wert von Zysten pro tierische Lunge, wie bestimmt durch Prüfen von mikroskopischen Feldern bei 20-100ºfacher Vergößerung (wie aus der folgenden Tabelle ersichtlich), und als Standardabweichung des geometrischen Mittels angegeben. Alle Gruppen wurden unter Anwendung des T-Tests von Student verglichen, die Ergebnisse, die mit (*) bezeichnet sind, sind signifikant. TABELLE logarithmischer Mittelwert der Zystenanzahl (± SEGM) Verringerung der Zysten Überlebende DMSO-Kontrolle Verbindung
Die außergewöhnlichen Eigenschaften werden am wirksamsten eingesetzt, wenn die Verbindung zu zwei neuen pharmazeutischen Präparaten mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff durch herkömmliche pharmazeutische Kompoundierungstechniken formuliert wird.
Die neuen Präparate enthalten wenigstens eine therapeutische fungizidische oder antipneumozystische Menge der aktiven Verbindung. Im allgemeinen enthält das Präparat wenigstens 1 Gew.-% von Verbindung I. Die Konzentratzusammensetzungen, die für Verdünnungen vor der Anwendung geeignet sind, können 90 Gew.-% oder mehr enthalten. Die Präparate umfassen Präparate, die zur oralen, rektalen, topischen, parenteralen (einschließlich der subkutanen, intramuskulären und intravenösen), pulmonalen (nasale oder buccale Inhalation), nasalen Verabreichung oder zur Insufflation geeignet sind. Die Präparate können durch inniges Vermischen von Verbindung I mit den für das gewünschte Medium geeigneten Komponenten vorgepackt werden.
Wenn die Verbindung für eine antifungizidische Anwendung gedacht ist, kann irgendeine Verabreichungsmethode eingesetzt werden. Zur Behandlung einer mykotischen Infektion wird häufig die orale Verabreichung bevorzugt. Soll eine orale Verabreichung angewendet werden, so kann sie mit einem flüssigen Präparat erfolgen. Für flüssige Präparationen wird das therapeutische Mittel mit flüssigen Trägerstoffen, wie Wasser, Glycolen, Ölen, Alkoholen und dergleichen, und für feste Präparationen, wie Kapseln und Tabletten, mit festen Trägerstoffen, wie Stärken, Zuckern, Kaolin, Ethylcellulose, Calcium- und Natriumcarbonat, Calciumphosohat, Kaolin, Talk, Lactose, im allgemeinen mit einem Gleitmittel, wie Calciumstearat, zusammen mit Bindemitteln, Zerfallshilfen und dergleichen formuliert. Aufgrund ihrer leichten Verabreichung stellen Tabletten und Kapseln die zweckmäßigste orale Dosierungsform dar. Es ist besonders vorteilhaft, die Präparate in einer Einheitsdosierungsform zur leichten Verabreichung und Gleichmäßigkeit der Dosis zu formulieren (wie im folgenden definiert). Präparate in Einheitsdosierungsform sind ein Gesichtspunkt der Erfindung.
Verbindung I kann auch in therapeutischen Präparaten zur intravenösen oder intraperitonealen Injektion formuliert werden und kann in einer Einheitsdosierungsform in Ampullen oder in Behältern mit mehreren Dosen, nötigenfalls mit einem zugesetzten Konservierungsstoff, vorliegen. Die Präparate können auch solche Formen annehmen, wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Hilfsstoffen, wie 85% Natriumchlorid oder 5 % Dextrose in Wasser, und können Formulierungshilfen, wie Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionshilfen, enthalten. Puffermittel sowie Zusatzstoffe, wie Salzlösung oder Glucose, können verwendet werden, um die Lösungen isoton zu machen. Das Arzneimittel kann auch in Alkohol/Propylenglycol oder Polyethylenglycol für eine intravenöse Tropf-Verabreichung solubilisiert werden. Vor der Verabreichung können die aktiven Bestandteile alternativ in Pulverform mit einem geeigneten Trägerstoff zur Aufbereitung vorliegen.
Die Bezeichnung "Einheitsdosierungsform", wie in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, wobei jede Einheit eine zuvor festgelegte Menge des aktiven Bestandteils enthält, die berechnet ist, um den gewünschten therapeutischen Effekt in Verbindung mit dem pharmazeutischen Trägerstoff zu erzeugen. Beispiele für solche Einheitsdosierungsformen sind Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulverpäckchen, Gitter, abgemessene Einheiten in Ampullen oder Behälter mit mehreren Dosen und dergleichen. Eine erfindungsgemäße Einheitsdosis enthält im allgemeinen 100-200 mg einer der Verbindungen.
Soll die Verbindung zur Kontrolle pneumozystischer Infektionen eingesetzt werden, ist es wünschenswert, Lunge und Bronchien direkt zu behandeln. Aus diesem Grund werden Inhalationsverfahren bevorzugt. Zur Verabreichung durch Inhalation werden die erfindungsgemäßen Verbindungen zweckmäßigerweise in Form einer Darreichungsform als Aerosolspray aus unter Druck stehenden Packungen über Zerstäuber abgegeben. Die Verbindungen können auch als Pulver abgegeben werden, die formuliert werden können, und das Pulverpräprarat kann mit Hilfe einer Insufflationsvorrichtung für Pulver inhaliert werden. Das bevorzugte Abgabesystem zur Inhalation ist ein Inhalationsaerosol in einer abgemessenen Dosis (MDI), das als Suspension oder Lösung von Verbindung I in geeigneten Treibmitteln, wie Fluorkohlenstoffen oder Kohlenwasserstoffen, formuliert sein kann.
Ein weiteres Verabreichungsverfahren stellt die Insufflation dar, insbesondere wenn sich die Infektion über die Ohren oder weitere Körperstellen ausgebreitet hat.
Bei topischer Verabreichung kann das Arzneimittel in herkömmlichen Cremes und Salben, wie weißem Petroleum, wasserfreiem Lanolin, Cetylalkohol, Cold Cream, Glycerylmonostearat, Rosenwasser und dergleichen, formuliert werden. Im allgemeinen wird eine 1-2%ige Cremelösung hergestellt und auf die zu behandelnde Fläche aufgetragen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, sollen sie jedoch nicht einschränken.

BEISPIEL 1

Herstellung der Mutante Z. arboricola MF5533, ATCC 74030
Ein gefrorenes vegetatives Myzel von Z. arboricola MF5404, ATCC 20957, wurde in 50 ml KF-Anzuchtmedium, das in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben enthalten war, übergeimpft. N-Methyl- N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) wurde bis zu einer Endkonzentration von 7,5 ug pro Milliliter zugegeben. Der Kolben wurde bei 220 Upm bei 25 ºC 5 Tage lang geschüttelt, um eine Nährlösung von in Gegenwart von NTG gewachsenen Zellen zu erhalten. Ein Teil der Nährlösung wurde auf die Oberfläche von Kartoffel-Dextrose-Agar ausplattiert und die Platten 14 Tage lang bei 25 ºC inkubiert, um Sporen des Mikroorganismus zu erhalten. Die Sporen wurden geerntet, in steriler Salzlösung verdünnt und auf die Oberfläche von Kartoffel-Dextrose-Agar ausplattiert und bei 25 ºC 7 Tage lang zur Kolonienbildung inkubiert. Die Kolonien wurden durch Überführen jeder Kolonie in getrennte Schrägkulturen aus Kartoffel-Dextrose-Agar isoliert. Die angeimpften Schrägkulturen wurden bei 25 ºC 14 Tage lang inkubiert und ein kleiner Teil der Schrägkulturen getrennt herangezogen und in 20 ml KF-Medium übergeführt, um eine Ausgangskultur zu erzeugen. Sodann wurden 2 ml Ausgangskultur verwendet, um 40 ml SP-5-Medium anzuimpfen, das sodann bei 25 ºC 14 Tage lang inkubiert wurde. Die Nährlösung wurde anschließend mit Methanol extrahiert und die Extrakte auf die Produktion von Verbindung X und weiteren Komponenten durch HPLC getestet. Eine der Schrägkulturen mit der Bezeichnung Kultur 47-19 wurde zur im folgenden beschriebenen Produktion verwendet. Kultur 47-19 wurde anschließend erneut isoliert und in der Merck-Kultursammlung als MF5533 aufbewahrt.

BEISPIEL 2

Fermentative Produktion von Verbindung I

Ausgangskulturen wurden zunächst in mehreren Stufen hergestellt. Als erste Stufe wurden 54 ml P34-2-Medium mit einem Stück einer gefrorenen Reagenzglaskultur von Zalerion arboricola, die vorläufig als Kultur 47-19 bezeichnet und anschließend reisoliert und in der Merck-Kultursammlung als MF5533 aufbewahrt wurde, angeimpft. Das angeimpfte Medium wurde unter Schütteln bei 220 Upm bei 25 ºC 4 Tage lang inkubiert. Eine 20-ml-Probe dieses Ausgangskulturmediums wurde zum Animpfen von jeweils vier 2-Literkolben verwendet, die 500 ml P34-2-Medium enthielten. Das angeimpfte Medium wurde bei 25 ºC 4 Tage lang bei 220 Upm inkubiert. Der Inhalt der Kolben wurde sodann vereinigt und verwendet, um einen 300-Liter-Fermenter für die Ausgangskultur anzuimpfen, der 180 Liter P34-2-Medium und 2 ml/l Polypropylenglycol P-2000 zur Schaumverringerung enthielt. Der Fermenter wurde 6 Tage lang bei einer Temperatur von 25 ºC, einem Luftstrom von 90 Litern Pro Minute, einem Überdruck von 0,7 kg/cm² und einer Schüttelgeschwindigkeit von 200 Upm betrieben. Eine 25-Liter-Probe dieser Ausgangskultur wurde sodann verwendet, um einen 800-Liter-Fermenter anzuimpfen, der 475 Liter P34-2-Medium und 2 ml/l P-2000 enthielt, und wurde 4 Tage lang bei 25 ºC, einem Luftstrom von 250 Litern/Minute, einem Überdruck von 0,7 kg/cm² und einer Schüttelgeschwindigkeit von 150 Upm kultiviert.
10 425 Liter der so hergestellten Samenlösung wurden in 13 700 1 TG-106-Medium in einen 19 000-Liter-Produktionsfermenter übergeimpft. Die Fermentation des Gemisches wurde bei einer Temperatur von 25 ºC, einem Luftstrom von 6 300 1/Minute, einem Überdruck von 0,7 kg/cm² und einer Schüttelgeschwindigkeit von 80 Upm durchgeführt. Der pH-Wert wurde von einem Anfangswert von 6,0 auf 5,5 abgesenkt und sodann bei 5,5 t 0,2 gehalten, indem Natriumhydroxid oder Schwefelsäure verwendet wurde. Die Kultivierung wurde 12 Tage lang fortgesetzt, wonach die Nährlösung zur Produktisolierung geerntet wurde.

BEISPIEL 3

Isolierung von Verbindung IA

3100 gal. Gesamtnährlösung wurden zunächst mit 1900 gal. Methanol extrahiert. Methanol wurde durch Zentrifugieren geklärt, um 4250 gal. geklärte Flüssigkeit als ersten Extrakt und 650 gal. Feststoff zu erhalten. Letzterer wurde mit 1500 gal. Methanol reextrahiert und zentrifugiert, um als zweiten Extrakt 1550 gal. geklärte Flüssigkeit zu erhalten. Die Feststoffe aus dieser Zentrifugation wurden mit 1500 gal. 80 % wäßrigem Methanol extrahiert und zentrifugiert, um einen dritten Extrakt zu erhalten.
Der erste Extrakt wurde auf eine SP-207-(bromiertes Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymer)-Absorptionssäule aufgegeben und mit 65 % wäßrigem Methanol gewaschen. Ein Teil des Produktdurchbruches wurde beim Spülen mit 65%igen Methanol beobachtet.
Die 65%ige Methanol-Waschlösung und ausgewählte Nebenfraktionen der ersten SP-207-Säule, die sich auf 900 gal. beliefen, wurden mit den zweiten und dritten Extrakten der Gesamtlösung vereinigt, und die vereinigten Extrakte, die insgesamt 4050 gal. ausmachten, wurden auf eine SP-207-Säule adsorbiert und mit 100 % Methanol eluiert.
Das produktreiche Eluat der ersten SP-207-Säule wurden verdünnt, adsorbiert und init 100 % Methanol von einer HP-20-Säule eluiert. Das produktreiche Eluat der zweiten SP-207-Säule wurde vereinigt, mit Wasser verdünnt auf zwei HP-20-Säulen adsorbiert und mit 100 % Methanol eluiert.
Die drei produktreichen HP-20-Eluate wurden vereinigt, mit Wasser verdünnt und sodann adsorbiert und mit 100 % Methanol von einer SP-207-Säule zur Konzentrierung und Entwässerung eluiert. Die Hauptfraktion wurde 4fach durch Destillation konzentriert.
Zu einem 500-ml-Aliguot des 4fachen Konzentrats aus den vorgenannten Säulen wurden 4,5 l Isopropylacetat gegeben, um das Produkt abzutrennen, das von P-2000 ausfällt, welches in Lösung bleibt.
Der Niederschlag wurde sodann zur präparativen HPLC vorbereitet, die auf einer herkömmlichen Säule, als Dorr- Oliver-Peak-Performer bezeichnet, ausgestattet mit Prochrom LC 150 VE 15 cm, durchgeführt wurde. Säulenpackung mit 3 kg unregelmäßigem Kieselgel "MATREX" (AMICON) von 20 um Teilchengröße, 60 Å Porengröße. Zur Vorbereitung wurde der Niederschlag zuerst filtriert, vakuumgetrocknet und in 550 ml Lösungsmittelgemisch aus 2:2:1 Ethylacetat/Methanol/ 5 % Essigsäure aufgelöst. Die Lösungsmittelzusammensetzung wurde dann auf die zugeführte Zusammensetzung von 76/16/8 Ethylacetat/ Methanol/5 % wäßriger Essigsäure eingestellt, und 715 ml des Cemisches wurden sofort auf eine Prochroma-LC- 150-VE-Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 605 ml/Minute unter Anwendung einer mobilen Phase von 80/10/5 Ethylacetat/ Methanol/5 % wäßriger Essigsäure aufgegeben, und 22 2-Liter-Fraktionen wurden gesammelt.
Fraktion 16 wurde zur Trockene konzentriert, und 100 mg davon wurden wieder in 2 ml 80:20:2 Methylenchlorid/Methanol/Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde filtriert, um sie zu klären, und die klare Lösung auf-eine Whatman-Kieselgel-HPLC-Säule von 15 cm x 22,5 mm injiziert. Die mobile Phase für die Chromatographie war 80:20:2 Methylenchlorid/Mehtanol/Wasser, und die Fließgeschwindigkeit betrug 10 ml/Minute. Die Chromatographie wurde unter Verwendung eines UV-Detektors bei 276 nm und auch durch analytische HPLC der Fraktionen überwacht. Beide Nachweisverfahren ergaben eine Grundlinientrennung von Verbindung IA, IB und X, die alle in dem Originalgemisch vorhanden waren.
Insgesamt wurden neun identische Injektionen auf die oben beschriebene Weise durchgeführt, und die Fraktionen, die Verbindung IA enthielten, wurden vereinigt, zur Trockene eingedampft und wieder in 100 ml 50:50 Methanol/Wasser aufgenommen. Die Lösung wurde auf eine 20-ml-HP-20-Säule, eluiert mit Methanol, adsorbiert und unter Vakuum getrocknet, um 91 mg von Verbindung IA zu ergeben.

BEISPIEL 4

Isolierung von Verbindung IB

Dem verbleibenden 4fachen Konzentrat aus der dritten
Sp-207-Säule in Beispiel 3 wurden 10 Volumina Isopropylacetat zugesetzt, um Verbindung X, IA und IB auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und das Material auf vier 500-ml-Kieselgelsäulen chromatographiert, die mit 85:10:5 Ethylacetat/Methanol/5 % wäßriger Essigsäure eluiert wurden. Ein Probenqemisch aus einer der Kieselgelsäulen, die 60 g von Verbindung IB, 20 g von Verbindung IA enthielt (bestimmt durch HPLC), wurde über eine 150-Liter- Kieselgelsäule, die ähnlich betrieben wurde, chromatographiert. Vier 50-Gallonen-Fraktionen und anschließend 23 15-Gallonen-Fraktionen wurden gesammelt. Eine der 15-Gallonen-Fraktionen, die reich an Verbindung 1B (> 95 %, bestimmt durch HPLC) war, wurde zur Trockene eingedampft, wieder in Ethylacetat/Methanol/Wasser (76:16:8) aufgenommen und noch auf einer 1-Liter-Kieselgelsäule, die mit 85:10:5 Ethylacetat/Methanol/5 % wäßriger Essigsäure eluiert wurde, gereinigt. Die produktreichen Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert, erneut in 50/50 MeoH/H&sub2;O aufgelöst und auf einer 40-ml-HP-20-Säule desiliciert. Verbindung IB wurde mit 100 % MeOH eluiert. Die Fraktionen, die reich an Verbindung IB waren, wurden vereinigt, einer Rotationsverdampfung zum Eindampfen von Methanol und zum Erhalt einer wäßrigen Lösung unterzogen, die lyophilisiert wurde, um Verbindung IB als farbloses Pulver zu erhalten. Das farblose Pulver besaß die zuvor für Verbindung IB aufgeführten Spektraleigenschaften.

BEISPIEL 5

Auf ähnliche Weise wie in Teil A von Beispiel 1 beschrieben wurde die Mutante MF 5533 aus MF 5404 erhalten, außer daß Ausgangs Substrat aus den Ausgangskulturkolben verwendet wurde, um 40 ml TG-106-Medium anzuimpfen, und letzteres bei 25 ºC unter Schütteln 14 Tage inkubiert wurde.

BEISPIEL 6

1000 Tabletten, die jeweils 500 mg von Verbindung 1A enthielten, werden aus der folgenden Rezeptur hergestellt:
Verbindung Gramm
Verbindung IA 500
Stärke 750
zweibasiges wasserfreies Calciumphoshat 5000
Calciumstearat 2, 5
Die fein gepulverten Bestandteile werden gut vermischt und mit 10 % Stärkepaste granuliert. Das Granulat wird getrocknet und zu Tabletten gepreßt.

BEISPIEL 7

1000 Hartgelatinekapse1n, die jeweils 500 mg von Verbindung IB enthalten, werden aus der folgenden Rezeptur hergestellt:
Verbindung Gramm
Verbindung IB 500
Stärke 250
Lactose 750
Talk 250
Calciumstearat 10
Ein einheitliches Gemisch der Bestandteile wird durch Vermischen hergestellt. Es wird verwendet, um zweiteilige Hartgelatinekapseln zu füllen.

BEISPIEL 8

250 ml einer injizierbaren Suspension werden durch herkömmliche Verfahren mit der folgenden Rezeptur hergestellt.
5 % DMSO/Wasser 250 ml
Verbindung IB 400 mg
Die Bestandteile werden vermischt und danach zur Verwendung sterilisiert.

BEISPIEL 9

Eine Salbe, die zur topischen Verabreichung geeignet ist, kann durch inniges Dispergieren von 13 mg von Verbindung IA in 1 g käuflich erhältlichem Polyethylen/Kohlenwasserstoffgel hergestellt werden.

BEISPIEL 10

Ein Aerosolpräparat kann hergestellt werden, das die folgende Rezeptur aufweist:
pro Behälter
Verbindung IB 24 mg
Lecithin NF, Flüssigkonzentrat 1,2 mg
Trichlorfluormethan 4,025 g
Dichlordifluormethan 12,15 g

HERSTELLUNG VON MF 5404

Eine Kultur von Z. arboricola ATCC 20868 wurde auf Kartoffel-Dextrose-Agar in Petrischalen bei 25 ºC 3 Wochen lang angezogen. 10 ml 0,3 M Tris-Puffer pH 7 wurden zu den Schalen gegeben und die Sporen mit einem sterilen Baumwollstäbchen von der Oberfläche in den Puffer geschabt. Die Suspension in dem Puffer wurde abdekantiert und das Verfahren zweimal wiederholt. Die Sporensuspensionen wurden vereinigt und durch Glaswolle filtriert, um große Klumpen von Sporen zu entfernen. Das Suspensionsfiltrat wurde zunächst bei 600 Upm, anschließend bei 700 Upm und schließlich bei 800 Upm jeweils 3 Minuten lang zentrifugiert, wobei das Pellet nach jeder Zentrifigation verworfen wurde. Der flüssige Überstand aus der dritten Zentrifugation wurde anschließend bei 3000 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert. Das Pellet aus dieser Zentrifugation wurde in 3 ml 0,3 M Tris-Puffer resuspendiert und zur Mutagenbehandlung verwendet. Diese Suspension enthielt 10³ bis 10&sup4; Sporen pro ml.
Zu der Sporensuspension wurden 100 ug/ml N-Nitroso-N-methylurethan gegeben und das resultierende Gemisch bei 300 Upm 20 Minuten lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Am Ende dieses Zeitraums wurde das Gemisch zentrifugiert, und der flüssige Überstand wurde entfernt. Das Pellet wurde-zweimal mit 0,3 M Tris-Puffer pH 7,0 gewaschen und anschließend in demselben Puffer resuspendiert und nach den geeigneten Verdünnungen auf Kartoffel-Dextrose-Agar ausplattiert, um isolierte Kolonien zu bilden. Die Platten wurden bei 25 ºC 2 Wochen lang zur Kolonienbildung inkubiert. Die Kolonien wurden durch separates Überführen auf Schrägkulturen von Kartoffel-Dextrose-Agar isoliert. Die angeimpften Schrägkulturen wurden bei 25 ºC 10-14 Tage lang inkubiert und ein Stück der Schrägkulturen herangezogen und auf die Produktion von Verbindung X und von weiteren Komponenten in der Fermentation durch einen HPLC-Test getestet. Ein Stück von einer der Schrägkulturen, die ursprünglich als Z7-9 bezeichnet wurde, wurde bei der Merck-Kultursammlung als MF 5404 und bei der American Type Culture Collection als ATCC 20957 hinterlegt.

SEQUENZLISTE

INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK
(A) LÄNGE: 6
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRÄNGIGKEIT: NA
(D) TOPOLOGIE: CIRCULÄR
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1
Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5

INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2

INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 3

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK
(A) LÄNGE: 6
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STPÄNGIGKEIT: NA
(D) TOPOLOGIE: CIRCULÄR
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1
Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5

Claims

1. Verbindung der Formel

worin R für Wasserstoff oder Hydroxy steht.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R für Wasserstoff steht.

3. Verbindung nach Anspruch 1, worin R für Hydroxy steht.

4. Präparat, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1 in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff.

5. Präparat nach Anspruch 4, das außerdem ein Fluorkohlenstoff-Treibmittel enthält.

6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, welches umfaßt Kultivieren von Zalerion arboricola MF 5533, ATCC 74030, in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, unter aeroben Bedingungen, bis eine ausreichende Menge der Verbindung produziert worden ist, und danach Abtrennen des Produkts von dem Medium.

10 7. Biologisch reine Kultur von Zalerion arboricola MF5533, ATCC 74030.

8. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Pneumocvstis-carinii-Infektionen bei Säugern.

9. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Pilzinfektionen.