DE69514928T2

DE69514928T2 - Gegen protozoen wirksamezyklische tetrapeptide

Info

Publication number: DE69514928T2
Application number: DE69514928T
Authority: DE
Inventors: Gerald F. Bills; Christine Lange Cannova; Gary K. Darland; Anne W. Dombrowski; Michael A. Goetz; Joyce A. Greene; Jon Polishook; Sandra J. Rattray; Sheo Bux Singh
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1994-07-27
Filing date: 1995-07-24
Publication date: 2000-08-17
Anticipated expiration: 2015-07-25
Also published as: EP0777683A1; WO1996003428A1; EP0777683B1; US5861375A; JPH10503368A; CY2183B1; ATE189460T1; DE69514928D1; AU3200495A; EP0777683A4; AU687602B2; CA2194999A1; US5620953A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Parasitische Protozoen sind für eine große Vielfalt von Infektionen bei Menschen und Tieren verantwortlich. Viele dieser Krankheiten sind für den Wirt lebensbedrohlich und verursachen beträchtliche volkswirtschaftliche Verluste in der landwirtschaftlichen Tierzucht. Beispielsweise bleibt Malaria trotz massiver internationaler Versuche, die Krankheit zu eliminieren, eine erhebliche Gesundheitsbedrohung für Menschen; Trypanosomiasis, wie z. B. Chagas-Krankheit, verursacht von Trypanosoma cruzi, und Afrikanische Schlafkrankheit, verursacht von T. brucei, sind in Afrika und Südamerika nicht selten; und opportunistische Infektionen in Wirten mit geschwächter Immunabwehr, verursacht durch Pneumocystis carinii Toxoplasma gondii, Cryptosporidium sp., gewinnen in den entwickelten Ländern zunehmend an Bedeutung.
Eine Protozoeninfektion von großer volkswirtschaftlicher Bedeutung ist Kokzidiose, eine weit verbreitete Erkrankung von Haustieren, die von Infektionen durch Protozoen der Gattung Eimeria hervorgerufen wird. Einige der wichtigsten Eimeria-Spezies sind diejenigen in Geflügel, nämlich E. tenella, E. acervulina, E. necatrix, E. brunetti und E. maxima. Die Krankheit ist für hohe Morbiditäts- und Sterblichkeitsniveaus bei Geflügel verantwortlich und kann zu extremen volkswirtschaftlichen Verlusten führen.
Bei einigen Protozoenkrankheiten, wie z. B. Chagas-Krankheit, gibt es keine zufriedenstellende Behandlung; bei anderen können sich arzneimittel-resistente Stämme der Protozoen entwickeln. Dementsprechend besteht eine andauernde Notwendigkeit zur Identifizierung neuer und wirksamer Arzneimittel gegen Protozoen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue cyclische Tetrapeptide, deren Verwendung als Mittel gegen Protozoen, pharmazeutische Zusammensetzungen davon und Verfahren zur Herstellung der cyclischen Tetrapeptide durch Fermentation.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung neue cyclische Tetrapeptide mit der Formel I:
worin
R¹ CH&sub3; oder CH&sub2;CH&sub3; ist;
R² H oder -OCH&sub3; ist;
R³ H ist und R&sup4; =O oder (H, OH) ist; oder
R³ OH ist und R&sup4; =O oder (H, H) ist; und
n 0 oder 1 ist;
mit der Maßgabe, daß, wenn n 0 ist, R¹ CH&sub2;CH&sub3; ist, R³ H ist und R&sup4; =O ist; und daß, wenn R¹ CH&sub3; ist, R³ H ist und R&sup4; =O ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
In der obigen Definition kann R&sup4; eine Oxogruppe, einen Wasserstoff und eine Hydroxygruppe oder zwei Wasserstoffatome darstellen.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthalten mehrere Asymmetriezentren und können so zu Diastereomeren und optischen Isomeren führen. Die vorliegende Erfindung soll solche möglichen Diastereomere ebenso wie deren racemische und aufgetrennte, enantiomerreine Formen und pharmazeutisch annehmbare Salze davon umfassen.
In einer Ausführungsform haben Verbindungen der vorliegenden Erfindung die folgende stereochemische Konfiguration (als Formel I' dargestellt):
Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind diejenigen der Formel I', worin die Substituenten wie folgt sind:
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I bereit, welches die Kultivierung eines Stammes von Fusarium pallidoroseum, der zur Herstellung dieser Verbindung imstande ist, in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, und die Gewinnung der Verbindung umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Stamm von Fusarium pallidoroseum einer mit den identifizierenden charakteristischen Eigenschaften von ATCC 74289.
In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel Ia, Ib, Ic, Ie, If oder Ig bereit, welches die Kultivierung eines Stammes von Fusarium sp. ATCC 74322, der zur Herstellung dieser Verbindung imstande ist, in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, und die Gewinnung der Verbindung umfaßt.
In einem vierten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verhütung von Protozoenkrankheiten bereit, welches umfaßt, daß eine gegen Protozoen wirksame Menge einer Verbindung der Formel I einem Wirt verabreicht wird, der einer Behandlung oder Verhütung bedarf.
In einem fünften Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine zur Behandlung oder Verhütung von Protozoenkrankheiten geeignete Zusammensetzung bereit, welche einen inerten Träger und eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel I umfaßt.
In einem sechsten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine biologisch reine Kultur von Fusarium pallidoroseum bereit, welche die identifizierenden charakteristischen Eigenschaften von ATCC 74289 aufweist und imstande ist, eine Verbindung der Formel I in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, herzustellen.
In einem siebten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine biologisch reine Kultur von Fusarium sp. bereit, welche die identifizierenden charakteristischen Eigenschaften von ATCC 74322 aufweist und imstande ist, eine Verbindung der Formel I in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, herzustellen.
Verbindungen der Formel I werden entweder aus der Fermentationsbouillon von produzierenden Organismen isoliert oder werden aus solchen natürlichen Produkten durch chemische Manipulationen hergestellt; einige Verbindungen können nach jedem dieser Verfahren erhalten werden.
Der Begriff "pharmazeutisch annehmbare Salze" bezieht sich auf Salze, die aus pharmazeutisch annehmbaren nicht-toxischen Basen oder Säuren hergestellt werden. Wenn die Verbindung der vorliegenden Erfindung sauer ist, können Salze aus pharmazeutisch annehmbaren nicht-toxischen Basen, einschließlich anorganischer Basen und organischer Basen, hergestellt werden. Salze, die sich von anorganischen Basen ableiten, umfassen Aluminium-, Ammonium-, Calcium-, Kupfer-, Eisen (III)-, Eisen (II)-, Lithium-, Magnesium-, Mangan (III)-, Mangan (II)-, Kalium-, Natrium-, Zinksalze und dgl. Besonders bevorzugt sind die Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Kalium- und Natriumsalze. Salze, die sich von pharmazeutisch annehmbaren organischen nicht-toxischen Basen ableiten, umfassen Salze von primären, sekundären und tertiären Aminen, substituierten Aminen, einschließlich natürlich vorkommender substituierter Amine, cyclischen Aminen und basischen Ionenaustauschharzen, wie z. B. Arginin, Betain, Koffein, Cholin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Diethylamin, 2- Diethylaminoethanol, 2-Dimethylaminoethanol, Ethanolamin, Ethylendiamin, N-Ethylmorpholin, N-Ethylpiperidin, Glucamin, Glucosamin, Histidin, Hydrabamin, Isopropylamin, Lysin, Methylglucamin, Morpholin, Piperazin, Piperidin, Polyamin-Harze, Procain, Purine, Theobromin, Triethylamin, Trimethylamin, Tripropylamin, Tromethamin und dgl.
Wenn die Verbindung der vorliegenden Erfindung basisch ist, können Salze von pharmazeutisch annehmbaren nicht-toxischen Säuren, einschließlich anorganischer und organischer Säuren, hergestellt werden. Solche Säuren schließen Essigsäure, Benzolsulfonsäure, Benzoesäure, Camphersulfonsäure, Citronensäure, Ethansulfonsäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Glutaminsäure, Bromwasserstoffsäure, Salzsäure, Isethionsäure, Milchsäure, Maleinsäure, Äpfelsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Mucinsäure, Salpetersäure, Pamoasäure, Pantothensäure, Phosphorsäure, Bernsteinsäure, Schwefelsäure, Weinsäure, p-Toluolsulfonsäure und dgl. ein. Besonders bevorzugt sind Citronensäure, Bromwasserstoffsäure, Salzsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und Weinsäure.

Beschreibung des produzierenden Organismus

Die Verbindungen Ia bis Ig werden durch die Fermentation des Pilzes Fusarium pallidoroseum (Cooke) Sacc. (Deuteromycotina, Hyphomycetes), isoliert von den Zweigen von Acacia sp., gewonnen im Santa Rosa National Park, Provinz Guanacaste, Costa Rica, hergestellt. Eine Kultur dieses Organismus wurde bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) am 6. Juli 1994 gemäß dem BUDAPESTER VERTRAG HINSICHTLICH DER INTERNATIONALEN ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FÜR DIE ZWECKE EINES PATENTVERFAHRENS hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 74289.
Der Pilz wurde durch das Oberflächensterilisationsverfahren isoliert, das in Bills und Polishook, Recovery of Endophytic Fungi from Chamaecyparis thyoides. Sydowia, 1992, 44: 1-12, mitgeteilt wurde. Bei den folgenden Beschreibungen stammen [englische] Farbnamen mit großen Anfangsbuchstaben von Ridgway, Color Standards and Color Nomenclature. Veröffentlichung vom Autor, Washington, D. C., S. 43 + S. 53 (1912).
Auf Weizenmehl-Agar (Difco) wurde eine Kolonie beobachtet, die nach 7 Tagen bei 25ºC, 67 % relativer Luftfeuchte und einer Photoperiode von 12 h Fluoreszenzlicht einen Durchmesser von 43 mm erreichte. Das Koloniegeflecht war weiß, baumwollflaumig, flockig. Das Luftmyzel war 2-3 mm hoch. Exsudat und lösliches Pigment fehlten und die Unterseite war ungefärbt. Kein Wachstum bei 37ºC.
Auf Hafermehl-Agar (Difco) wurde eine Kolonie beobachtet, die nach 7 Tagen unter den gleichen Bedingungen wie für Weizenmehl-Agar einen Durchmesser von 50 mm erreichte. Das Koloniegeflecht war weiß, durchgehend wollig, mit einer Zone von Gelb (Naples Yellow) in der Mitte der Kolonie. Das Luftmyzel war durchgehend 4-5 mm hoch. Exsudat und lösliches Pigment fehlten und die Unterseite war ungefärbt. Kein Wachstum bei 37ºC.
Auf Kartoffel-Dextrose-Agar (Difco) wurde eine Kolonie beobachtet, die nach 7 Tagen unter den gleichen Bedingungen wie für Weizenmehl-Agar einen Durchmesser von 22 mm erreichte. Das Koloniegeflecht war weiß, wollig. Das Luftmyzel wies ungleichmäßige Längen von 1-2 mm bis 4-5 mm Höhe auf, was der Kultur ein klumpiges Erscheinungsbild gab, und die Unterseite war blaßorange (Salmon Color, Salmon-Buff). Exsudat und lösliches Pigment fehlten. Kein Wachstum bei 37ºC.
Auf Maltose-Hefeextrakt-Agar (1% Malzextrakt, 0,2% Hefeextrakt) wurde eine Kolonie beobachtet, die nach 7 Tagen unter den gleichen Bedingungen wie für Weizenmehl-Agar einen Durchmesser von 45 mm erreichte. Das Koloniegeflecht war weiß, baumwollflaumig bis wollig, mit einer gelben (Picric Yellow, Pale Lemon Yellow) Zone mitten durch die Kolonie. Das Luftmyzel war durchgehend 2-3 mm hoch, der Rand durchsichtig, zusammengedrückt, und die Unterseite war blaßgelb (Light Ochraceous-Buff, Warm Buff). Exsudat und lösliches Pigment fehlten. Kein Wachstum bei 37ºC.
Die Lufthyphen waren dünnwandig, gewunden, unterteilt, durchsichtig, 3,0-4,0 um breit. Die Konidienträger waren durchsichtig, unterteilt, auf Luftmyzel und Bodenmyzel verstreut, die Phialides zylindrisch, 1 Konidie pro Öffnung bildend, sympodial verzweigt, 15-24 · 3,0-3,2 um. Die Makrokonidien waren spindelförmig, nahezu gerade, durchsichtig, gestielte Grundzelle, gewöhnlich 3-5fach unterteilt, in der Größe variabel, 30-44 · 3,2-4,8 um, Mikrokonidien, Sporodochien und Chlamydosporen fehlten. Es wurde kein Teleomorph beobachtet.
Die taxonomischen Schlüsselmerkmale dieser Spezies umfassen flockige Lufthyphen mit verstreuten Konidienträgern, Fehlen von Sporodochien und Mikrokonidien und eine pfirsichfarbene Unterseite in Kultur. Ferner sind die Makrokonidien nahezu gerade mit einer leichten Krümmung an jedem Ende. Diese Schlüsselmerkmale stimmen gut mit veröffentlichten Beschreibungen für F. pallidoroseum überein (Nelson et al., Fusarium species, an Illustrated Manual for Identification. The Pennsylvania University Press, University Park, PA, S. 193, 1983; und Domsch et al., Compendium of Soil Fungi, Bd. 1, Academic Press, New York, S. 859, 1980). (n der älteren Literatur wird dieser Pilz als Fusarium semitectum bezeichnet. Berk. & Rav. Booth und Sutton (in Fusarium pallidoroseum, the Correct Name for F. semitectum Auct., Trans. Br. Mycol. Soc. 83 (4): 702-704, 1984) wiesen darauf hin, daß dieser Doppelname nicht zutreffend war und zeigten, daß der korrekte Name für diesen Pilz F. pallidoroseum ist. Es wurde von keinem der bekannten Stämme von F. pallidoroseum berichtet, daß er cyclische Tetrapeptide produziert.

Beschreibung eines zweiten produzierenden Organismus

Die Verbindungen Ia, Ib, Ic, Ie, If und Ig werden ebenfalls hergestellt von einem neuen Fusarium sp. (MF6058), isoliert aus der inneren Rinde lebender Wurzeln von Languncularia racemosa (Combretaceae), gewonnen in den Mangroven des Flusses Rincón, Halbinsel Osa, Provinz Puntarenas, Costa Rica. Eine Kultur dieses Organismus wurde bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) am 26. Januar 1995 gemäß dem BUDAPESTER VERTRAG HINSICHTLICH DER INTERNATIONALEN ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FÜR DIE ZWECKE EINES PATENTVERFAHRENS hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 74322.
Die Kolonien wuchsen langsam auf YM-Agar (Difco Laboratories) und erreichten 20-21 mm Durchmesser nach 9 Tagen bei 25ºC, 12 h Photoperiode. Die Kolonien waren leicht erhaben, Ringzonen aufweisend, feucht, mit üppigen, blaß cremefarbenen Konidienmassen, die sich in den ältesten Bereichen ansammelten (Cream Color, Light Buff), mit spärlichem Luftmyzel, filzig, Rand weiß, eben. Die Unterseite war weiß bis matt cremefarben oder blaßgelb (Pale Ochraceous-Buff, Warm Buff). Exsudate und Gerüche fehlten. Kein Wachstum auf YM-Agar bei 37ºC.
Die Kolonien wuchsen langsam auf Kartoffel-Dextrose-Agar (Difco Laboratories) und erreichten 22-24 mm Durchmesser nach 10 Tagen bei 25ºC, 12 h Photoperiode. Die Kolonien waren zusammengedrückt, undeutliche Ringzonen aufweisend, feucht, wächsern, mit einem sehr spärlichen Luftmyzel, durchscheinend bis blaß graugelb (Cream Color, Light Buff). Die Unterseite besaß eine ähnliche Farbe. Exsudate und Gerüche fehlten.
Die Kolonien wuchsen langsam auf SNA (Spezieller Nährstoffarmer Agar, Nirenberg, H., 1976. Untersuchungen über die morphologische und biologische Differenzierung in der Fusarium-Sektion Liseola. Mitt. Biol. Bundesanst. Land-Forstwirtsch. Berlin-Dahlem 169: 1- 117) und erreichten 25 mm Durchmesser nach 9 Tagen bei 25ºC, 12 h Photoperiode. Die Kolonien waren zusammengedrückt, ohne Zonen, mit spärlichem Luftmyzel, durchscheinend, farblos, der Rand gerade, eingesunken. Die Unterseite war durchscheinend. Exsudate und Gerüche fehlten.
Die Mikromorphologie des Organismus wurde auf SNA und Weizenmehl-Dextrose-Agar (Difco Laboratories) beurteilt und die folgenden Beobachtungen gemacht:
Es gab zwei Typen von Konidien-Zuständen: ein selten auftretender, vorübergehender Mikrokonidien-Zustand, auf dem Luftmyzel gebildet; und ein häufig auftretender Makrokonidien-Zustand, auf der Oberfläche des Agars gebildet.
Makrokonidien-Zustand: Häufig auftretende Konidien in verstreuten bis konfluenten, durchsichtigen bis cremefarbenen Sporodochien oder Pionnoten. Konidienträger, die von der Agaroberfläche aufsteigen, mikronematöse oder semi-makronematöse, aus Aggregaten von unverzweigten, einzelnen konidiogenen Zellen bestehende oder spärlich verzweigte, gebündelte Konidienträger, wobei jeder Zweig der Konidienträger als individuelle konidiogene Zelle endet. Die konidiogenen Zellen waren phiolenförmig, zylindrisch oder zur Spitze hin konisch zulaufend, oft mit einer verbreiterten Basis, nicht unterteilt, 9-30 um lang, an der Spitze 1,5-2,5 um breit, in einem breiten konidiogenen Locus endend, mit deutlichen periklinalen Verdickungen, oft mit einem sich nach außen öffnenden kleinen Kragen. Die Konidien waren in der Aufsicht spindelförmig, in der Seitenansicht im mittleren Teil gerade mit leicht gekrümmten Enden, gewöhnlich mit einer leicht vortretenden Fußzelle, wobei die Scheitelzelle konisch zu einer gekrümmten gerundeten Spitze zulief, allerdings sind distale Zelle und Fußzelle aufgrund der Symmetrie von Konidien in der Seitenansicht oft schwer unterscheidbar, überwiegend 3fach unterteilt, 4-, 2- oder 1fach unterteilte Konidien wurden selten beobachtet, 35-47 · 6-9 um, mit einem refraktiven Zytoplasmagehalt, durchsichtig. Die Keimung einzelner Konidien geschah innerhalb von 8-24 h auf Weizenmehl-Dextrose-Agar, wobei der erste Keimschlauch gewöhnlich aus der Fußzelle hervortrat und der zweite Keimschlauch aus der Scheitelzelle.
Mikrokonidien-Zustand: Verticillium-ähnliche Konidienträger, bestehend aus einem oder zwei Wirtel(n) von wirtelig angeordneten konidiogenen Zellen, selten und auf jungem Luftmyzel verstreut. Die konidiogenen Zellen waren phiolenförmig, zylindrisch oder ahlenförmig, bis zu 10 um lang. Die Konidien waren schmal ellipsoid, 2-3 · 1,5-2 um, durchsichtig.
Chlamydosporen, Sklerotien oder Teleomorphe wurden nicht beobachtet, selbst in Kulturen, die bis zu 6 Wochen inkubiert wurden.
Dieser Pilz wird der anamorphen Gattung Fusarium zugeordnet, da er feuchte, spindelförmige, gekrümmte, unterteilte Konidien aus phiolenförmigen konidiogenen Zellen bildet. Die Konidien besitzen eine Fußzelle und somit wird MF6058 am besten in Fusarium und nicht in Cylindrocarpon eingeordnet. Die Einordnung dieses Stammes in die Gattung Fusarium ist aufgrund seines entschiedenen Mangels an feststellbaren morphologischen Merkmalen und seines Mangels an Pigmenten schwierig. Dieses Isolat gehört aufgrund seiner großen, oft unverzweigten konidiogenen Zellen, Makrokonidien mit stumpf gerundeten Spitzen, seinem wirteligen Mikrokonidien-Zustand und seiner blassen Färbung möglicherweise in die Abteilung Martiella von Fusarium (wie definiert von C. Booth, 1971. The genus Fusarium. Commonwealth Mycological Institute, Kew, U. K., S. 44). Dieser Stamm weist jedoch insofern mehrere atypische Merkmale für diese Gruppe Fusarium spp. mit dem wohlbekannten F. solani als typischem Vertreter auf, als er keine Chlamydosporen bildet, der Mikrokonidien-Zustand extrem reduziert ist und die Makrokonidien relativ kurz und von einheitlicher Größe sind.
Es versteht sich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung des speziellen Stammes von Fusarium pallidoroseum oder Fusarium sp. (MF6058) oder auf Organismen, welche den obigen Beschreibungen vollständig entsprechen, beschränkt ist, sondern einen beliebigen F. pallidoroseum oder Stämme von Fusarium einschließt, welche(r) imstande ist/sind, eine Verbindung der Formel I herzustellen. Insbesondere sollen andere Stämme oder Mutanten oder Varianten der Organismen eingeschlossen sein, welche aus den beschriebenen Organismen mittels bekannter Mittel wie z. B. Röntgenstrahlung, UV-Strahlung, Behandlung mit Stickstoff-Senfgas, Phagen-Exposition und dgl. erzeugt werden können und welche zur Herstellung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung imstande sind.

Fermentation des produzierenden Organismus

Verbindungen der Formel I werden hergestellt durch Kultivierung eines Stammes von Fusarium pallidoroseum, welcher imstande ist, die Verbindung auf einem herkömmlichen festen Medium oder in einem herkömmlichen wäßrigen Medium zu produzieren. Der Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet, welches bekannte Nährstoffquellen für ähnliche Pilze enthält, d. h., assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff plus gegebenenfalls anorganische Salze und andere bekannte Wachstumsfaktoren. Die zur Kultivierung von anderen ähnlichen Pilzen eingesetzten allgemeinen Verfahren sind auf die vorliegende Erfindung anwendbar.
Das Nährmedium sollte eine geeignete assimilierbare Kohlenstoffquelle wie Ribose, Glucose, Sucrose, Cellobiose und Fructose enthalten. Als Stickstoffquelle kann Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat etc. entweder allein oder in Kombination mit organischen Stickstoffquellen wie Pepton, Fischmehlextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Sojapulver, Baumwollsamenmehl etc. eingesetzt werden. Es können auch erforderlichenfalls anorganische Nährsalze zugesetzt werden, um Quellen von Natrium, Kalium, Calcium, Ammonium, Phosphat, Sulfat, Chlorid, Bromid, Carbonat, Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dgl. bereitzustellen.
Die Produktion von Verbindungen der Formel I kann bei jeder Temperatur bewirkt werden, die zu zufriedenstellendem Wachstum der produzierenden Organismen führt, z. B. 20º-30ºC. Für Fusarium pallidoroseum ATCC 74289 liegt die Produktionstemperatur vorzugsweise unter etwa 25ºC, noch bevorzugter bei etwa 20-22ºC. Gewöhnlich wird eine optimale Produktion der gewünschten Verbindung in Schüttelkolben nach Inkubationsperioden von 10-21 Tagen erhalten. Die Belüftung in Schüttelkolben wird durch mechanische Bewegung, z. B. Schütteln auf einem Rotationsschüttler, erzielt. Falls die Fermentation in Tank-Fermentern durchgeführt werden soll, ist es wünschenswert, ein vegetatives Impfgut in einer Nährbouillon zu erzeugen, indem die Bouillonkultur aus einer Schrägkultur oder einer lyophilisierten Kultur des Organismus angeimpft wird. Nachdem auf diese Weise ein aktives Impfgut erhalten wurde, wird es steril in das Fermentationstankmedium überführt. Die Produktion der gewünschten Verbindung in Tank-Fermentern erreicht gewöhnlich nach 7 bis 21 Tagen Inkubation das Optimum. Für die mechanische Bewegung in dem Tank-Fermenter wird durch Rühren gesorgt und die Belüftung kann durch Einblasen von Luft oder Sauerstoff in die gerührte Mischung erzielt werden. Die Produktion der Verbindung kann mit Hilfe von chromatographischen oder spektroskopischen Techniken oder durch einen herkömmlichen biologischen Assay überwacht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der produzierende Stamm Fusarium pallidoroseum mit den identifizierenden charakteristischen Eigenschaften von ATCC 74289 oder eine Mutante oder Variante davon. Noch bevorzugter ist der produzierende Stamm Fusarium pallidoroseum mit den identifizierenden charakteristischen Eigenschaften von ATCC 74289. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Fermentation vorzugsweise auf einem festem Medium wie Vermiculit durchgeführt.
Die Verbindungen Ia, Ib, Ic, Ie, If und Ig werden auch von Fusarium sp. (MF6058) unter ähnlichen Bedingungen wie oben beschrieben produziert. Der bevorzugte produzierende Stamm von Fusarium sp. (MF6058) ist einer, der die identifizierenden charakteristischen Eigenschaften von ATCC 74322 aufweist, welcher ein besserer Produzent der Verbindung la als Fusarium pallidoroseum (ATCC 74289) ist.

Isolierung und Reinigung der Verbindung

Verbindungen der Formel I werden unschwer aus der Fermentationsbouillon gewonnen durch Extraktion der gesamten Bouillon mit einem organischen Lösungsmittel wie Methylethylketon. Die Verbindungen können unter Anwendung von im Stand der Technik wohlbekannten Standardverfahren, wie z. B. Gelfiltrationschromatographie, Dünnschichtchromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Konzentration, Fällung und/oder Kristallisation, oder Kombinationen davon gereinigt werden. Alternativ kann die gesamte Bouillon oder ein organischer Extrakt davon sprühgetrocknet oder gefriergetrocknet werden, gefolgt von einer Reinigung wie oben erwähnt.
Die Verbindungen der Formel I, worin R² -OCH&sub3; ist, können in die Verbindungen der Formel I, worin R² H ist, durch übliche Verfahren wie Hydrogenolyse in Gegenwart eines Katalysators wie Palladium auf Kohlenstoff überführt werden.

Einsetzbarkeit

Die cyclischen Tetrapeptide der vorliegenden Erfindung eignen sich als Mittel gegen Protozoen. Als solche können sie bei der Behandlung und Verhütung von Protozoenkrankheiten bei Menschen und Tieren, einschließlich Geflügel, eingesetzt werden. Beispiele von Protozoenkrankheiten, gegen die Verbindungen der Formel I eingesetzt werden können, und deren jeweilige verursachende Pathogene umfassen: 1) Amoebiasis (Dientamoeba sp., Entamoeba histolytica); 2) Giardiasis (Giardia lamblia); 3) Malaria (Plasmodium-Spezies, einschließlich P. vivax, P. falciparum, P. malariae und P. ovale); 4) Leishmaniasis (Leishmania-Spezies, einschließlich L. donovani, L. tropica, L. mexicana und L. braziliensis); 5) Trypanosomiasis und Chagas-Krankheit (Trypanosoma-Spezies, einschließlich T brucei, T. theileri, T. rhodesiense, T. gambiense, T. evansi, T. equiperdum, T. equinum, T. congolense, T vivax und T. cruzi); 6) Toxoplasmose (Toxoplasma gondii); 7) Babesiose (Babesia sp.); 8) Kryptosporidiose (Cryptosporidium sp.); 9) Dysenterie (Balantidium coli); 10) Vaginitis (Trichomonas-Spezies, einschließlich T. vaginitis und Tritrichomonas foetus); 11) Kokzidiose (Eimeria-Spezies, einschließlich E. tenella, E. necatrix, E. acervulina, E. maxima und E. brunetti, E. mitis, E. bovis, E. melagramatis und Isospora sp.); 12) Enterohepatitis (Histomonas gallinarum) und 13) Infektionen, die von Anaplasma sp., Besnoitia sp., Leucocytozoan sp., Microsporidia sp., Sarcocystis sp., Theileria sp. und Pneumocystis carinii verursacht werden.
Verbindungen der Formel I werden vorzugsweise zur Behandlung oder Verhütung von Malaria, Toxoplasmose, Kryptosporidiose und Trypanosomiasis bei Menschen und Tieren eingesetzt und zur Bekämpfung von Kokzidiose, insbesondere bei Geflügel, um die Kokzidien- Infektion entweder zu behandeln oder das Auftreten einer solchen Infektion zu verhindern.

Dosierungsbereich

Die Verbindungen der Formel I können einem Wirt, der einer Behandlung bedarf, auf ähnliche Weise verabreicht werden wie sie für andere Mittel gegen Protozoen angewandt wird; beispielsweise können sie parenteral, oral, topisch oder rektal verabreicht werden. Die zu verabreichende Dosis wird variieren in Abhängigkeit von der speziell eingesetzten Verbindung, dem beteiligten infektiösen Organismus, dem speziellen Wirt, der Schwere der Erkrankung, dem physischen Zustand des Wirts und dem gewählten Verabreichungsweg; die geeignete Dosis kann von einem Fachmann unschwer bestimmt werden. Zur Behandlung von Protozoenkrankheiten bei Menschen kann die orale Dosis im Bereich von 1 mg/kg bis 1000 mg/kg und die parenterale Dosis im Bereich von 0,5 mg/kg bis 500 mg/kg liegen. Für eine veterinärmedizinische therapeutische Anwendung kann die orale Dosis im Bereich von 1 mg/kg bis 1000 mg/kg und die parenterale Dosis im Bereich von 0,5 mg/kg bis 500 mg/kg liegen. Für die prophylaktische Anwendung bei Menschen kann die orale Dosis im Bereich von 1 mg/kg bis 1000 mg/kg und die parenterale Dosis im Bereich von 0,5 mg/kg bis 500 mg/kg liegen. Für die prophylaktische Anwendung bei Tieren kann die orale Dosis im Bereich von 1 mg/kg bis 1000 mg/kg und die parenterale Dosis im Bereich von 0,5 mg/kg bis 500 mg/kg liegen. Für die Verwendung als Mittel gegen Kokzidien, insbesondere bei Geflügel, wird die Verbindung vorzugsweise in dem Futter oder Trinkwasser der Tiere verabreicht. Die Dosis liegt im Bereich von 1 mg/kg bis 1000 mg/kg.

Zusammensetzung

Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine Verbindung der Formel I und einen inerten Träger. Die Zusammensetzungen können in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur humanmedizinischen und veterinärmedizinischen Anwendung vorliegen oder in Form einer Futter-Zusammensetzung für die Bekämpfung von Kokzidiose bei Geflügel.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine Verbindung der Formel I als aktiven Bestandteil und können auch einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und gegebenenfalls andere therapeutische Bestandteile enthalten. Die Zusammensetzungen umfassen Verbindungen, die sich für orale, rektale, topische und parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre und intravenöse) Verabreichungen eignen, obwohl der geeignetste Weg in jedem gegebenen Fall von dem speziellen Wirt und der Art und der Schwere der Zustände, wegen denen der aktive Bestandteil verabreicht wird, abhängen wird. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können günstigerweise in Einheitsdosis-Form dargeboten werden und nach irgendeinem der auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannten Verfahren hergestellt werden.
Bei der praktischen Verwendung können Verbindungen der Formel I als aktiver Bestandteil in inniger Mischung mit einem pharmazeutischen Träger nach herkömmlichen pharmazeutischen Formulierungstechniken kombiniert werden. Der Träger kann eine Vielzahl von Formen einnehmen, je nach der zur Verabreichung gewünschten Präparationsform, z. B. oral oder parenteral (einschließlich intravenös).
Zur Herstellung der Zusammensetzungen für eine orale Dosierungsform können irgendwelche der üblichen pharmazeutischen Medien eingesetzt werden. Beispielsweise können im Falle von oralen flüssigen Präparationen, wie z. B. Suspensionen, Elixieren und Lösungen, Wasser, Glycole, Öle, Alkohole, Geschmacksmittel, Konservierungsstoffe, Färbemittel und dgl. eingesetzt werden; oder im Falle von oralen festen Präparationen, wie z. B. Pulver, Kapseln und Tabletten, können Träger wie Stärken, Zucker, mikrokristalline Cellulose, Verdünnungsmittel, Granulierungsmittel, Gleitmittel, Bindemittel, Desintegratoren und dgl. eingeschlossen sein. Aufgrund ihrer leichten Verabreichung stellen Tabletten und Kapseln die vorteilhafteste orale Dosierungseinheitsform dar, in welchem Falle offensichtlich feste pharmazeutische Träger eingesetzt werden. Gewünschtenfalls können Tabletten nach wäßrigen oder nichtwäßrigen Standardverfahren beschichtet werden. Neben den oben dargelegten üblichen Dosierungsformen können die Verbindungen der Formel I auch durch Mittel zur kontrollierten Freisetzung und/oder Abgabe-Vorrichtungen verabreicht werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die sich für die orale Verabreichung eignen, können als diskrete Einheiten wie Kapseln, Cachets oder Tabletten dargeboten werden, die jeweils eine vorbestimmte Menge des aktiven Bestandteils als Pulver oder Granulate oder als Lösung oder Suspension in einer wäßrigen Flüssigkeit, einer nicht- wäßrigen Flüssigkeit, einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder einer Wasser-in-Öl-Flüssigemulsion enthalten. Solche Zusammensetzungen können nach einem beliebigen pharmazeutischen Verfahren hergestellt werden, alle Verfahren beinhalten jedoch den Schritt, daß der aktive Bestandteil mit dem Träger assoziiert wird, welcher einen oder mehrere der erforderlichen Bestandteile ausmacht. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen hergestellt durch gleichmäßige und innige Mischung des aktiven Bestandteils mit flüssigen Trägern oder feinteiligen festen Trägern oder beiden und dann, falls erforderlich, Formen des Produkts zur gewünschten Darreichungsform. Beispielsweise kann eine Tablette hergestellt werden durch Pressen oder Gießen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Hilfsbestandteil(en). Gepreßte Tabletten können hergestellt werden durch Pressen des aktiven Bestandteils in einer freifließenden Form wie Pulver oder Granulat, gegebenfalls mit einem Bindemittel, Gleitmittel, inerten Verdünnungsmittel, oberflächenaktiven oder dispergierenden Mittel gemischt, in einer geeigneten Maschine. Gegossene Tabletten können hergestellt werden durch Gießen einer Mischung der gepulverten Verbindung, die mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchtet ist, in einer geeigneten Maschine. Wünschenswerterweise enthält jede Tablette etwa 1 mg bis etwa 500 mg des aktiven Bestandteils und jedes Cachet oder jede Kapsel enthält etwa 1 bis etwa 500 mg des aktiven Bestandteils.
Pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die sich für die parenterale Verabreichung eignen, können hergestellt werden als Lösung oder Suspensionen dieser aktiven Verbindungen in Wasser, geeigneterweise mit einem oberflächenaktiven Mittel wie Hydroxypropylcellulose gemischt. Dispersionen können auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglycolen und Mischungen davon in Ölen hergestellt werden. Unter normalen Bedingungen der Lagerung und des Einsatzes enthalten diese Präparationen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die pharmazeutischen Formen, die sich für die Injektionsanwendung eignen, umfassen sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die spontane Vorbereitung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muß die Form steril sein und in einem solchen Grad fluid, daß eine leichte Einspritzbarkeit gegeben ist. Sie muß unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein und gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen geschützt sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, enthaltend beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol), geeignete Mischungen davon und pflanzliche Öle.
Geeignete topische Formulierungen umfassen transdermale Vorrichtungen, Aerosole, Cremes, Salben, Lotionen, Pulver zum Verstäuben und dgl. Diese Formulierungen, enthaltend den aktiven Bestandteil, können mittels üblicher Verfahren hergestellt werden. Zur Erläuterung, eine Creme oder Salbe wird präpariert, indem ausreichende Mengen an hydrophilem Material und Wasser, enthaltend etwa 5-10 Gewichtsprozent der Verbindung, in ausreichenden Mengen gemischt werden, um eine Creme oder Salbe mit der gewünschten Konsistenz herzustellen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die sich für die rektale Verabreichung eignen, bei denen der Träger ein Feststoff ist, werden am meisten bevorzugt als Einheitsdosis-Zäpfchen dargeboten. Geeignete Träger umfassen Kokosnußöl und andere Materialien, die üblicherweise auf dem Gebiet eingesetzt werden, und die Zäpfchen können günstigerweise durch Mischung der Kombination mit dem(n) erweichten oder geschmolzenen Träger(n), gefolgt von Abkühlen und Gießformen, geformt werden.
Es versteht sich, daß die oben beschriebenen pharmazeutischen Formulierungen, falls es angebracht ist, neben den vorgenannten Träger-Bestandteilen einen oder mehrere zusätzliche(n) Träger-Bestandteil(e) wie Verdünnungsmittel, Puffer, Geschmacksmittel, Bindemittel, oberflächenaktive Mittel, Verdickungsmittel, Gleitmittel, Konservierungsstoffe (einschließlich Antioxidantien) und dgl. einschließen können sowie Substanzen, die eingeschlossen werden, um die Formulierung mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers isotonisch zu machen.
Zur Verwendung bei der Bekämpfung von Kokzidiose bei Geflügel kann eine Verbindung der Formel I günstig als Komponente einer Futter-Zusammensetzung verabreicht werden. Eine geeignete Geflügelfutter-Zusammensetzung wird typischerweise etwa 1 ppm bis etwa 1000 ppm, vorzugsweise etwa 0,01 Gewichtsprozent bis etwa 0,1 Gewichtsprozent, einer Verbindung der Formel I enthalten. Die optimalen Niveaus werden natürlicherweise mit der betroffenen Spezies von Eimeria variieren und können von einem Fachmann unschwer bestimmt werden. Konzentrationen im Geflügelfutter von etwa 0,01 Gewichtsprozent bis etwa 0,1 Gewichtsprozent der Nahrung eignen sich insbesondere zur Bekämpfung der mit E. tenella assoziierten Pathologie, während die bevorzugte Konzentration für eine ähnliche Bekämpfung von Spezies, die sich im Darm aufhalten, etwa 0,01 Gewichtsprozent bis etwa 0,1 Gewichtsprozent der Nahrung beträgt. Mengen von etwa 0,01 Gewichtsprozent bis etwa 0,1 Gewichtsprozent sind vorteilhaft bei der Verringerung der pathogenen Wirkungen von sowohl Blinddarm- als auch Darm-Kokzidiose.
Bei der Herstellung von Geflügelfutter kann eine Verbindung der Formel I unschwer dispergiert werden durch mechanisches Mischen derselben in fein gemahlener Form mit dem Geflügelfutterstoff oder mit einer Zwischenformulierung (Vormischung), die anschließend mit anderen Komponenten gemischt wird, um den endgültigen Geflügelfutterstoff herzustellen, der an das Geflügel verfüttert wird. Typische Komponenten von Geflügelfutterstoffen umfassen Molassen, Fermentationsrückstände, Weizenmehl, gemahlener und gewalzter Hafer, Weizenkleie und -mittelmehl, Alfalfa, Klee und Fleischstückchen, zusammen mit mineralischen Ergänzungen wie Knochenmehl, Calciumcarbonat und Vitaminen.
Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Formel I enthalten, können auch in Form eines Pulvers oder flüssigen Konzentrats hergestellt werden. Gemäß veterinärmedizinischer Standardformulierungspraxis können herkömmliche wasserlösliche Exzipienten, wie z. B. Laktose oder Sucrose, in die Pulver inkorporiert werden, um deren physikalische Eigenschaften zu verbessern. So umfassen besonders geeignete Pulver dieser Erfindung 50 bis 100% Gew./Gew. und vorzugsweise 60 bis 80% Gew./Gew. der Kombination und 0 bis 50% Gew./Gew. und vorzugsweise 20 bis 40% Gew./Gew. an herkömmlichen veterinärmedizinischen Exzipienten. Diese Pulver können entweder Tierfutterstoffen zugesetzt werden, beispielsweise über eine Zwischen-Vormischung, oder in Trinkwasser für Tiere verdünnt werden.
Flüssige Konzentrate dieser Erfindung enthalten geeigneterweise eine wasserlösliche Verbindungskombination und können gegebenenfalls ein veterinärmedizinisch annehmbares, mit Wasser mischbares Lösungsmittel umfassen, beispielsweise Polyethylenglycol, Propylenglycol, Glycerin, Glycerin-Formaldehydacetal oder ein solches Lösungsmittel, das mit bis zu 30 % Vol./Vol. Ethanol gemischt ist. Die flüssigen Konzentrate können dem Trinkwasser von Tieren, insbesondere Geflügel, verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele werden zur besseren Erläuterung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt und sind nicht als Beschränkung des Umfangs der Ansprüche in irgendeiner Weise anzusehen.

BEISPIEL 1

Produktion des Tetrapeptids der Formel Ia

(a) Impfkultur von Fusarium pallidoroseum

Eine Portion von Schrägagar, enthaltend Fusarium pallidoroseum ATCC 74289, wurde steril in einen 250-ml-Kolben ohne Schikane überführt, der 50 ml Impfmedium mit der folgenden Zusammensetzung enthielt:
Hefeextrakt (Difco) 4,0 g/l
Malzextrakt (Difco) 8,0 g/l
Glucose 4,0 g/l
Junlon (Polyacrylsäure, Kouyok Trading Co., Tokio) 1,5 g/l
destilliertes Wasser auf 1 l
pH-Wert vor der Sterilisierung auf 7,0 eingestellt.
Die Kultur wurde auf einem 2-Inch-Schleuder-Rotationsschüttler (220 UpM) 2 Tage lang bei 25ºC, 85% relativer Luftfeuchte (rLF) inkubiert, um Biomasse zu erhalten. Portionen der Biomasse wurden in sterile Gefäße mit Glycerin überführt und (als eingefrorene vegetative Myzelien) eingefroren. Diese wurden in einer Endkonzentration von 10-15% Glycerin bei -75ºC gehalten.
Ein Gefäß der obigen eingefrorenen vegetativen Myzelien wurde auf Raumtemperatur aufgetaut und zur Animpfung des Impfmediums (1 ml auf 50 ml Impfmedium) eingesetzt und die Kultur wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen inkubiert.
Eine Impfkultur von Fusarium pallidoroseum ATCC 74289 kann auch unter ähnlichen Bedingungen wie oben beschrieben in dem Medium mit der in Beispiel 7(a) angegebenen Zusammensetzung hergestellt werden.

(b) Produktionskultur von Fusarium pallidoroseum

Ein Aliquot der Impfkultur (12 ml in dem obigen Impfmedium) wurde in 220 ml des flüssigen Teils des Produktionsmediums mit der folgenden Zusammensetzung eingebracht:
Glucose 150,0 g/l
Fructose 15,0 g/l
Sucrose 40,0 g/l
NZ-Amin Typ E (Sheffield Products) 4,0 g/l
Harnstoff 4,0 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 0,5 g/l
KCl 0,25 g/l
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,25 g/l
ZnSO&sub4; 7H&sub2;O 0,9 g/l
CaCO&sub3; 8,0 g/l
destilliertes Wasser auf 1 l (pH 7,0)
Diese Mischung wurde heftig verwirbelt, um die Biomasse zu dispergieren, und dann in ein 2-Liter-Rollkulturgefäß gegossen, welches 675 cm³ von dampfsterilisiertem grobteiligem Vermiculit enthielt (der feste Anteil). Der Inhalt der Rollflasche wurde geschüttelt/gemischt, um eine homogene Beimpfung und Bedeckung sicherzustellen. Die Rollflaschen wurden horizontal und sich mit etwa 4 UpM auf einer Wheaton-Rollapparatur drehend bei 22ºC, 75% rLF, 19 Tage lang inkubiert, um eine Sekundärmetabolitenproduktion im Fermentationsmedium zu erhalten.

(c) Alternative Produktionskultur von Fusarium pallidoroseum

Sterilisierter Vermiculit (50 cm³) in einem 250-ml-Kolben ohne Schikane wurde mit 20 ml des flüssigen Anteils des obigen Produktionsmediums angereichert und mit 2 ml der Impfkultur (hergestellt in einem Medium von entweder Beispiel 1(a) oder Beispiel 7(a)) angeimpft. Der Kolben wurde bei 22ºC, 70% rLF, 10 Tage lang inkubiert.

BEISPIEL 2

Isolierung und Reinigung des Tetrapeptids der Formel Ia (Verfahren A)

Die aus der Produktionskultur von Beispiel 1 erhaltene Fermentationsbouillon wurde mit Methylethylketon (MEK) extrahiert. Der MEK-Extrakt (100 ml) wurde unter vermindertem Druck bis zur Trockne konzentriert und der Rückstand in 8 ml Methylenchlorid-Methanol 1 : 1 gelöst. Eine erste Fraktionierung wurde erhalten durch Gelfiltration auf einer 150-ml-Sephadex LH-20 (Pharmacia)-Säule, in Methanol gepackt und damit gewaschen, welche nach 0,6- 0,65 Säulenvolumina Elution biologisch aktives Material ergab. Präparative Dünnschichtchromatographie (DC) auf einer E. Merck-Silicagel 60F254-Platte, 20 · 20 cm, 250 mm Dicke, eluiert mit Methylenchlorid-Methanol 93 : 7 (Vol./Vol.), wurde anschließend zur Reinigung eingesetzt. Dieser Prozeß ergab die Zielverbindung bei Rf 0,7-0,8.
Die endgültige Reinigung wurde erzielt durch präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf einer 9 mm · 25 cm-Zorbax-RxC&sub8;-Säule, die bei 50ºC und mit 4 ml/- Minute mit einem 60-minütigen Gradienten von 40% bis 60% Acetonitril in Wasser eluiert wurde. Die Verbindung 1a (2,5 mg) wurde in Fraktionen erhalten, die einem k' von 8 entsprachen; deren Homogenität wurde in mehreren DC-Systemen auf sowohl Silicagel 60F254 als auch Whatman-KC&sub1;&sub8;-Platten, durch NMR in CD&sub2;Cl&sub2; und durch HPLC (Zorbax-RxC&sub8;, 4,6 · 250 mm, 60% Acetonitril, 50ºC, k' = 5,5) bestätigt.

BEISPIEL 3

Isolierung und Reinigung des Tetrapeptids der Formel Ia (Verfahren B)

Die wie in Beispiel 2 hergestellte Fermentationsbouillon (1,6 l) wurde mit MEK extrahiert. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurde die restliche wäßrige Suspension gefriergetrocknet. Die resultierende feste Masse wurde ausgiebig mit Methylenchlorid trituriert und filtriert. Die Lösung wurde zuerst mit hoher Geschwindigkeit auf einem 100-ml-Bett von trockenem E. Merck-Silicagel 60 unter Verwendung von Methylenchlorid-Methanol 97 : 3 (Vol./Vol.) fraktioniert. Das so erhaltene angereicherte Material wurde auf einer 100-ml-Silicagel-Säule weiter gereinigt, wobei mit Methylenchlorid-Ethylacetat 3 : 1 (Vol./Vol.) eluiert wurde, was die homogene Verbindung Ia nach 5-6,5 Säulenvolumina Elution ergab. Ausbeute an reinem Material: 85% der im ursprünglichen Extrakt vorhandenen Menge.

BEISPIEL 4

Charakterisierung des Tetrapeptids der Formel Ia

Die Struktur des cyclischen Tetrapeptids der Formel Ia, isoliert aus der Fermentationsbouillon von Fusarium pallidoroseum ATCC 74289, wurde unter Anwendung verschiedener Spektroskopietechniken, einschließlich kernmagnetischer Resonanz (NMR) und Massenspektroskopie (MS), bestimmt.
NMR-Spektren wurden mit einem Varian Unity 400-Spektrometer in d-5-Pyridin gemessen.
¹³C-NMR (δ, ppm) 8,40, 11,40, 16,26, 20,44, 24,22, 25,14, 25,59, 26,25, 26,25, 26,47, 29,32, 30,71, 35,85, 36,04, 42,44, 44,64, 51,35, 54,87, 55,28, 62,08, 66,10, 108,72, 109,32, 119,86, 120,63, 123,28, 123,31, 124,60, 133,38, 172,90, 174,90, 175,25, 177,00, 210,77.
¹H-NMR (δ, ppm) 0,94 (t, J = 7,2 Hz), 1,00 (t, J = 7,6 Hz), 1,00 (d, J = 7,2 Hz), 1,10 (m), 1,25 (m), 1,25 (m), 1,30 (m), 1,40 (m), 1,44 (m), 1,45 (m), 1,48 (m), 1,50 (m), 1,60 (m), 1,80 (m), 1,90 (m), 210 (m), 2,18 (t, J = 7,2 Hz), 2,28 (q, J = 7,2 Hz), 2,42 (m), 3,27 (dt, 13,2, 2,4 Hz), 3,84 (dd, J = 14,4, 6,4 Hz), 3,94 (s), 4,23 (dd, J = 14,4, 10,4 Hz), 4,37 (brd, J = 12,0 Hz), 4,61 (td, J = 10,6, 6,4 Hz), 4,76 (brq, J = 8,0 Hz), 5,18 (t, J = 10 Hz), 5,53 (brd, J = 5,6 Hz), 7,18 (dt, J = 8,0, 0,8 Hz), 7,34 (dt, J = 8,0, 0,6 Hz), 7,36 (d, J = 10 Hz), 7,55 (d, J = 8,0 Hz), 7,58 (s), 7,79 (d, J = 8,0 Hz), 8,27 (d, J = 10,4 Hz), 10,03 (d, J = 6,8 Hz).
Die Massenspektren wurden mit Jeol SX-102A (Elektronenstoß, EI, 90 eV) und JEOL HX110 (Fast Atom Bombardment, FAB) Massenspektrometern aufgezeichnet. Exakte Massenbestimmungen erfolgten bei hoher Auflösung (HR-EI) unter Verwendung von Perfluorkerosin (PFK) als interner Standard. Trimethylsilyl-Derivate wurden mit einer 1 : 1-Mischung von Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA)-Pyridin bei Raumtemperatur hergestellt. Das FAB- Spektrum wurde in einer Matrix von Dithiothreitol/Dithioerthritol (20/80) laufengelassen. Das Molekülion wird mit Elektronenstoß-MS bei m/z 623 beobachtet. Es wurde befunden, ein intensives Monotrimethylsilyl-Derivat zu bilden. Die Molekularformel wurde durch Scanning- Hochauflösungselektronenstoß-MS als C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub9;N&sub5;O&sub6; (gefunden 695,4090, berechnet 695,4077 für C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub9;O&sub6;N&sub5; + C&sub3;H&sub8;Si; gefunden 623,3738, berechnet für C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub9;N&sub5;O&sub6; 623,3683 M&spplus;) bestimmt.
Die Stereochemie der Verbindung Ia wurde durch Hydrolyse und anschließende Analyse von AMBI (α-Methylbenzylisocyanat)-Derivaten der erhaltenen Aminosäuren bestimmt. Nur die Stereochemie von Isoleucin und Tryptophan konnte mit diesem Verfahren mit Sicherheit bestimmt werden und diese wurden befunden, L-Stereochemie zu besitzen. Die Stereochemie von Pipecolinsäure und α-Amino-8-oxodecansäure wurde unter Anwendung von ¹H-NMR- Kopplungskonstanten- und NOE (Nuklearer Oberhauser-Effekt)-Messungen der intakten Verbindung Ia bestimmt. Eine ähnliche Hydrolyse der Verbindung Ih (von Verbindung Id abgeleitet) ergab D-Prolin, L-Isoleucin und L-Tryptophan.

BEISPIEL 5

Aktivität des Tetrapeptids der Formel Ia gegen Protozoen

Die Verbindung der Formel Ia wurde gegenüber Eimeria tenella, Toxoplasma gondii und Plasmodium falciparum nach in der Literatur mitgeteilten Methoden bewertet.

(A) Aktivität gegenüber E. tenella

Zur Bewertung der Aktivität der Verbindung gegenüber Eimeria wurde im allgemeinen dem visuellen Assay unter Verwendung der Madin Darby-Rindernieren (MDBK)-Zellinie wie in Schmatz, Crane and Murray, "Eimeria tenella: Parasite-Specific Incorporation of ³H-Uracil as a Quantitative Measure of Intracellular Development", J. Protozoology, 1986, 33(1): 109-114, beschrieben gefolgt. In diesem Assay zeigte die Verbindung eine minimale Hemmkonzentration von 15 ng/ml.

(B) Aktivität gegenüber T. gondii

Zur Bewertung der Aktivität der Verbindung gegenüber Toxoplasma wurde im allgemeinen dem in Roos et al. in: "Methods in Microbial Pathogenesis", Methods in Cell Biology, 1994, D. G. Russell, Hrsg., (Academic Press), beschriebenen visuellen Assay gefolgt. In diesem Assay zeigte die Verbindung eine minimale Hemmkonzentration von 0,05-0,1 ng/ml.

(C) Aktivität gegenüber P. falciparum

Die Aktivität gegen Malaria wurde in einem radioaktiven Assay bestimmt, der dem allgemeinen Protokoll folgte, welches in Desjardins et al., "Quantitative Assessment of Antimalarial Activity In Vitro by a Semiautomated Microdilution Technique", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1979, 16: 710-718, beschrieben wurde. In diesem Assay zeigte die Verbindung eine IC&sub5;&sub0; (diejenige Konzentration an Arzneimittel, welche die parasitenspezifische Aufnahme der Radiomarkierung um 50% inhibiert) von 54 ng/ml.

BEISPIEL 6

Herstellung des Tetrapeptids der Formel Ib

Zu einer Lösung des Tetrapeptids der Formel Ia (2,8 mg) in einer 2-ml-Mischung von Methanol und Ethylacetat (1 : 1) wurde 10%iges Palladium über Holzkohle (5 mg) zugegeben und die Mischung evakuiert, um gelöste Luft zu entfernen. Diese Mischung wurde mit Wasserstoff gespült und dieser Zyklus von Entgasen und Spülen wurde dreimal wiederholt. Schließlich wurde der Wasserstoff mit dem Kolben verbunden, der die Reaktionsmischung enthielt, und die Mischung 2 h lang gerührt. Der Katalysator wurde mittels Filtration durch Celite entfernt und das Filtrat unter vermindertem Druck verdampft, um 2,6 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver zu ergeben.
¹H-NMR (CD&sub2;Cl&sub2;): 0,86 (3H, d, J = 6,4 Hz), 0,94 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,05 (3H, t, J = 7,6 Hz), 1,10- 1,70 (13H, m), 1,78 (1H, m), 1,99 (1H, m), 2,01 (1H, m), 2,15 (1H, m), 2,38 (2H, dt, J = 7,2, 1,2 Hz), 2,43 (2H, q, J = 7,6 Hz), 3,10 (1H, dt, J = 13,6, 3,2 Hz), 3,48 (1H, dd, J = 14,4, 6,4 Hz), 3,70 (1H, dd, J = 14,6, 10,0 Hz), 3,99 (1H, m), 4,04 (1H, m), 4,18 (1H, dd, J = 10,6, 8,8, 7,0 Hz), 4,69 (1H, t, J = 10,4 Hz), 5,06 (1H, brd, J = 5,2 Hz), 6,36 (1H, d, J = 5,6 Hz), 6,41 (1H, d, J = 10,4 Hz), 6,99 (1H, d, J = 10,4 Hz), 7,10 (1H, brs), 7,12 (1H, ddd, J = 8,0, 6,8, 0,8 Hz), 7,18 (1H, ddd, J = 8,4, 7,2, 1,2 Hz), 7,39 (1H, dt, J = 8,4, 1,2 Hz), 7,60 (1H, dd, J = 7,6, 0,4 Hz), 8,67 (1H, brs); HREI-MS (m/z): M&spplus; 593,3610 (berechnet für C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub7;N&sub5;O&sub5; 593,3577).

BEISPIEL 7

Herstellung des Tetrapeptids Ia unter Verwendung von Fusarium sp. ATCC 74322

(a) Impfkultur von Fusarium sp. ATCC 74322

Eine Portion von Schrägagar, enthaltend Fusarium sp. ATCC 74322, wurde steril in einen 250- ml-Kolben ohne Schikane überführt, der 50 ml des Impfmediums von BEISPIEL 1(a) enthielt.
Die Kultur wurde auf einem 2-Inch-Schleuder-Rotationsschüttler (220 UpM) 3 Tage lang bei 25ºC, 85% relativer Luftfeuchte (rLF) inkubiert, um Biomasse zu erhalten. Portionen der Biomasse wurden in sterile Gefäße mit Glycerin überführt und (als eingefrorene vegetative Myzelien) eingefroren. Diese wurden in einer Endkonzentration von 10-15% Glycerin bei -75ºC gehalten.
Ein Gefäß der obigen eingefrorenen vegetativen Myzelien wurde auf Raumtemperatur aufgetaut und zur Animpfung des Impfmediums (1 ml auf 50 ml Impfmedium) eingesetzt und die Kultur wurde 2-4 Tage lang unter den oben beschriebenen Bedingungen inkubiert. Das Impfmedium der folgenden Zusammensetzung kann ebenfalls zur Herstellung der Impfkultur eingesetzt werden:
Maisquellwasser 5,0 g/l
Tomatenpaste 40,0 g/l,
Hafermehl 10,0 g/l
Glucose 10,0 g/l
Spurenelementmischung* 10 ml/l
destilliertes Wasser auf 1 l
pH vor der Sterilisierung auf 6,8 eingestellt.
*Zusammensetzung (g/l) = FeSO&sub4; 7H&sub2;O (1,0); MnSO&sub4; 4H&sub2;O (1,0); CuCl&sub2; H&sub2;O (0,025); CaCl&sub2; (0,1); H&sub3;BO&sub3; (0,056); (NH&sub4;)&sub6;MoO&sub2; 4H&sub2;O (0,019); ZnSO&sub4; 7H&sub2;O (0,2).

(b) Produktionskultur von Fusarium sp.

Ein Aliquot der Impfkultur (12 ml) wurde in 220 ml des flüssigen Anteils des Produktionsmediums mit der folgenden Zusammensetzung eingebracht:
Glucose 150,0 g/l
NZ-Amin Typ A (Sheffield Products) 4,0 g/l
Harnstoff 4,0 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 0,5 g/l
KCl 0,25 g/l
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,25 g/l
ZnSO&sub4; 7H&sub2;O 0,9 g/l,
CaCO&sub3; 16,5 g/l
destilliertes Wasser auf 1 l (pH 7,0)
Diese Mischung wurde heftig verwirbelt, um die Biomasse zu dispergieren, und dann in ein 2-Liter-Rollkulturgefäß gegossen, welches 675 cm³ von dampfsterilisiertem grobteiligem Vermiculit enthielt (der feste Anteil). Der Inhalt der Rollflasche wurde geschüttelt/gemischt, um eine homogene Beimpfung und Bedeckung sicherzustellen. Die Rollflaschen wurden horizontal und sich mit etwa 4 UpM auf einer Wheaton-Rollapparatur drehend bei 22ºC, 75% rLF, 24 Tage lang inkubiert, um eine Sekundärmetabolitenproduktion im Fermentationsmedium zu erhalten.
Die Kultur produzierte die gewünschten Metaboliten auch in flüssigem Medium (50 ml in 250- ml-Kolben ohne Schikane), das den flüssigen Anteil des obigen Produktionsmediums enthielt. Die Kolben wurden bei 22ºC, 75% rLF, 7-14 Tage lang inkubiert.
Die Fermentation im 23-l-Tank-Fermenter wurde ebenfalls unter Verwendung des obigen flüssigen Produktionsmediums durchgeführt. So wurden 10 I des Produktionsmediums plus 10 ml Polyglycol 2000 (Dow) mit 500 ml der Impfkultur angeimpft und die Fermentation bei 21ºC durchgeführt, wobei die mechanische Bewegung auf 4000 UpM, der Luftstrom auf 5 l/Minute und der Druck auf 0,3 bar eingestellt war. Die mechanische Bewegung wurde auf 500 und dann 600 UpM erhöht und der Luftstrom auf 10 l/Minute am Tag 6 der Fermentation (wobei Tag 0 der Tag ist, an dem die Fermentation begann). Die Fermentationsbouillon wurde nach 14 Tagen zur Produktisolierung geerntet. Die gleichen Bedingungen wurden auch in einer 23- l-Tank-Fermentation unter Verwendung des Produktionsmediums, dessen Zusammensetzung in Beispiel 1(b) angegeben ist, eingesetzt.

BEISPIEL 8

Isolierung und Reinigung der Verbindung Ia aus der Fermentation von Fusarium sp. ATCC 74322

Methylethylketon-Extrakt (100 ml) einer Fermentation von Fusarium sp. ATCC 74322, hergestellt in Rollflaschen wie in Beispiel 7 beschrieben und extrahiert wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde eingedampft und durch Gelfiltration auf einer 150-ml-Sephadex-LH-20- Säule in Methanol fraktioniert. Dies ergab eine angereicherte Präparation der Verbindung Ia nach 0,6 Säulenvolumina Waschen. Eine Endreinigung konnte durch Säulenchromatographie auf EM-Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat in Methylenchlorid als Elutionsmittel (1 : 2 Vol./Vol.) erzielt werden. Ausbeute: etwa 5 mg an homogenem Material.

BEISPIEL 9

Isolierung und Reinigung von Nebenkomponenten

Fermentationsbouillon (5,6 l), hergestellt wie in Beispiel 1, die 225 mg der Verbindung Ia enthielt, wurde mit Methylethylketon durch zweistündiges Rühren und Abfiltrieren der verbrauchten Biomasse extrahiert. Nach Verdampfung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck und Gefriertrocknung der resultierenden wäßrigen Suspension wurde der erhaltene halbfeste Rückstand in 200 ml Methylenchlorid aufgenommen und filtriert, um große Mengen an unlöslichen, nicht-verwandten Materialien zu entfernen.
Die Lösung wurde erneut eingedampft und der neue Rückstand in Methanol gelöst. Die Fraktionierung geschah mittels Gelfiltration auf einer 950-ml-Säule von Sephadex LH-20 in Methanol, wobei Verbindung Ia und mehrere verwandte Analoga nach 0,55-0,65 Säulenvolumina eluierten. Dem folgte ein Blitz-Chromatographieschritt auf einer 120-ml-Säule von Silicagel 60 von E. Merck, die mit einem Stufengradienten von Methanol in Methylenchlorid eluiert wurde. Die Zielverbindungen eluierten wiederum zusammen, in Fraktionen, die den Waschungen mit 3%igem Methanol entsprachen.
Material aus der ersten Silicagel-Säule wurde durch eine neue 120-ml-Säule mit Silicagel 60 von E. Merck geleitet, wobei diesmal mit einer Methylenchlorid-Ethylacetat-Mischung von 3 : 1, Vol./Vol., eluiert wurde und der Ethylacetatgehalt langsam auf 100% erhöht wurde. Dieser Prozeß ergab vier Fraktionen in der Reihenfolge der Elution
I. eine > 90% reine Präparation der Verbindung Ia,
II. eine Fraktion, die eine 1 : 1-Mischung der Verbindung Ia und der Nebenkomponente Verbindung Ic enthielt,
III. eine Mischung der Verbindungen Ib, Id und Ie,
IV. eine angereicherte Präparation der Nebenverbindung If.
Die Fraktion II wurde weiter aufgearbeitet durch präparative DC auf E. M.-Silicagel-60F254- Platten von 0,25 mm Dicke, die mit Hexan-Aceton 2 : 1, Vol.Vol., entwickelt wurden; dies führte zur Abtrennung der Reste von Verbindung Ia von der Nebenverbindung Ic. Die letztere wurde schließlich gereinigt mittels HPLC auf einer bei 50ºC gehaltenen 9 · 250 mm-Zorbax-RxC&sub8;- Säule unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril in Wasser (30% bis 60% im Verlauf von 120 Minuten), der mit 2 ml/Minute zugeführt wurde. Die Verbindung Ic eluierte nach 4,6-5,0 Säulenvolumina an Waschlösung und war gemäß allen analytischen Verfahren rein.
Die Fraktion III wurde direkt mitttels HPLC aufgearbeitet (gleiche Bedingungen wie oben). Die homogene Verbindung Id wurde nach 15,5 Minuten in dem Gradienten gefunden, die Nebenverbindung Ib eluierte nach 18 Minuten in den Gradienten; und die Verbindung Ie nach 20,5 Minuten.
Die Fraktion IV andererseits wurde als immer noch zu komplex für eine erfolgreiche HPLC beurteilt. Dementsprechend wurde sie zuerst durch Gelfiltration auf Sephadex LH-20 weiter angereichert vor der endgültigen Reinigung der Verbindung If mittels HPLC (bei 50ºC gehaltene 9 · 250 mm-Zorbax-RxCB-Säule, isokratische Elution für 1 h mit 2 ml/Minute 30%igen wäßrigen Acetonitrils, gefolgt von einem 2-stündigen Gradienten bis 60% Acetonitril). Ve = 6,9-7,2 Säulenvolumina.
Die Nebenkomponenten waren mit 0,25-1% des Gehalts der Verbindung Ia vorhanden.

BEISPIEL 10

Isolierung und Reinigung der Nebenkomponente Ig

Die Verbindung Ig wurde erst bei einem weiteren Reinigungsprozeß in größerem Maßstab entdeckt. 10 l Fermentationsbouillon wurden durch Extraktion und die beiden in Beispiel 9 beschriebenen Silicagel-Schritte aufgearbeitet. Das letzte Nebenanalogon wurde im letzteren Teil der Waschungen mit Methylenchlorid-Ethylacetat 1 : 3 nachgewiesen. Präparative DC auf EM-Silicagel 60F254-Platten mit Methylenchlorid-Methanol 96 : 4, Vol./Vol., und eine endgültige Reinigung mittels HPLC (bei 50ºC gehaltene 9 · 250 mm-Zorbax-RxC&sub8;-Säule, Elution mit 2 ml/Minute Acetonitril-Wasser 40 : 60, Vol./Vol.) ergab 1,2 mg der Verbindung Ig, d. h., < 0,1% des Gehalts der Verbindung Ia in der Bouillon.
Die Homogenität aller Präparationen wurde in mehreren DC-Systemen (Silicagel 60F254 mit Methylenchlorid-Ethylacetat 1 : 1; Methylenchlorid-Methanol 97 : 3; Hexan-Aceton 2 : 1; Whatman- KC18-Platten mit Methanol-Wasser 85 : 15) und mittels HPLC (4,6 · 250 mm-Zorbax-RxCa- Säule, 1 ml/Minute Acetonitril-Wasser 55: 45, 50ºC, UV-Nachweis bei 222 nm) bestätigt:
Verbindung Ia: k' = 7,8
Verbindung Ic k' = 5,8
Verbindung Id k' = 3,6
Verbindung Ie k' = 4,9
Verbindung Ic k' = 6,1
Verbindung If k' = 3,7
Verbindung Ig k' = 5,7

BEISPIEL 11

Spektroskopische Charakterisierung von Nebenkomponenten

Die NMR- und MS-Daten für die Nebenkomponenten, Verbindungen Ic bis Ig, sind im folgenden angegeben. Die NMR-Spektren wurden entweder mit einem Varian Unity 400- oder einem 500 MHz-NMR-Spektrometer aufgezeichnet. Die MS-Spektren wurden wie zuvor in Beispiel 4 beschrieben erhalten.

Verbindung Ic

¹³C-NMR (100 MHz, Pyridin-d&sub5;): 7,84, 18,63, 19,33, 19,88, 23.67, 25,55, 25,67, 25,67, 25,92, 28,74, 29,42, 30,12, 35,46, 41,86, 44,03, 50,74, 54,70, 55,73, 61,49, 65,45, 108,17, 108,74, 119,29, 120,07, 122,74, 122,74, 124,00, 132,82, 171,86, 174,24, 174,67, 176,44, 210,16.
¹H-NMR (400 MHz, Pyridin-d&sub5;): 1,01 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,02 (3H, d, J = 7,6), 1,10 (2H, m), 1,16 (3H, d, J = 6,8 Hz), 1,22 (2H, m), 1,25 (1H, m), 1,45 (3H, m), 1,49 (1H, m), 1,50 (1H, m), 1,60 (1H, m), 1,89 (1H, m), 2,07 (1H, m), 2,18 (2H, t, J = 7,2 Hz), 2,28 (2H, q, J = 7,6 Hz), 2,34 (1H, m), 2,58 (1H, m), 3,26 (1H, dt, J = 13,2, 2,4 Hz), 3,82 (1H, dd, J = 14,8, 6,4 Hz), 3,94 (3H, s), 4,25 (1H, dd, J = 10,4, 14,4 Hz), 4,36 (1H, brd, J = 13,6), 4,61 (1H, dt, J = 10,8, 6,0 Hz), 4,75 (1H, appq, J = 8 Hz), 5,08 (1H, t, J = 10,4 Hz), 5,52 (1H, brd, J = 5,2), 7,19 (1H, dt, J = 8,0, 0,8 Hz), 7,32 (1H, d, J = 10,5 Hz), 7,34 (1H, dt, J = 8,0, 0,8 Hz), 7,55 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,59 (1H, s), 7,80 (1H, d, J = 8,0 Hz), 8,27 (1H, d, J = 10 Hz), 10,03 (1H, d, J = 6,8 Hz).
HR-EIMS (m/z): 609,3512 (M&spplus;, berechnet für C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub7;N&sub5;O&sub6; : 609,3526).

Verbindung Id

¹³C-NMR (100 MHz, Pyridin-d&sub5;): 8,03, 10,84, 15,84, 23,94, 25,03, 25,24, 25,40, 25,95, 25,95, 29,06, 30,42, 34,78, 35,72, 42,14, 46,90, 55,42, 58,03, 58,24, 61,95, 65,74, 108,44, 108,95, 119,56, 120,26, 122,85, 122,94, 124,32, 133,02, 172,04, 174,07, 175,18, 176,06, 210,47.
¹H-NMR (400 MHz, Pyridin-d&sub5;): 0,92 (3H, t, J = 7,2 Hz), 0,98 (3H, d, J = 6,8 Hz), 1,01 (3H, t, J = 7,2), 1,10 (2H, m), 1,25 (2H, m), 1,35 (1H, m), 1,40 (2H, m), 1,65 (1H, m), 1,66 (1H, m), 1,78 (1H, m), 1,80 (1H, m), 1,90 (1H, m), 2,20 (2H, t, J = 7,6 Hz), 2,28 (1H, m), 2,29 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,36 (1H, m), 2,43 (1H, m), 3,59 (1H, appq, J = 8 Hz), 3,91 (1H, dd, J = 14,4, 7,2 Hz), 3,94 (3H, s), 4,11 (1H, dt, J = 10,0, 4,0 Hz), 4,23 (1H, dd, J = 10,0, 14,8 Hz), 4,54 (1H, dt, 3 = 9,6, 6,8 Hz), 4,74 (1H, brq, J = 8,4 Hz), 4,91 (1H, t, J = 10 Hz), 5,11 (1H, d, J = 7,6 Hz), 7,19 (1H, t, J = 8,0 Hz), 7,33 (1H, t, J = 8,0 Hz), 7,55 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,58 (1H, s), 7,78 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,92 (1H, d, J = 10,0 Hz), 8,33 (1H, d, J = 10 Hz), 9,98 (1H, d, J = 6,4 Hz).
HR-EIMS (m/z): 609,3525 (M&spplus;, berechnet für C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub7;N&sub5;O&sub6;: 609,3526).

Verbindung Ie

¹³C-NMR (100 MHz, Pyridin-d&sub5;): 10,59, 11,01, 15,86, 20,06, 24,74, 25,19, 25,86, 26,05, 26,19, 26,19, 29,69, 30,50, 31,00, 35,48, 37,71, 44,29, 50,99, 54,44, 55,14, 61,35, 65,70, 72,14, 108,31, 108,92, 119,47, 120,24, 122,83, 122,92, 124,23, 132,99, 172,07, 174,50, 174,83, 176,45.
¹H-NMR (400 MHz, Pyridin-d&sub5;): 0,94 (3H, t, J = 7,6 Hz), 1,00 (3H, d, J = 6,8 Hz), 1,09 (3H, t, J = 7,6), 1,30 (3H, m), 1,40 (5H, m), 1,44 (1H, m), 1,45 (2H, m), 1,48 (1H, m), 1,50 (1H, m), 1,60 (2H, Quintett, J = 7,6 Hz), 1,65 (1H, m), 1,85 (1H, m), 1,93 (1H, m), 2,06 (1H, brd, J = 13,6), 2,32 (1H, m), 2,42 (1H, m), 3,27 (1H, dt, J = 13,2, 2,0 Hz), 3,66 (1H, m), 3,86 (1H, dd, J = 14,0, 6,4 Hz), 3,94 (3H, s), 4,23 (1H, dd, J = 10,4, 14,4 Hz), 4,38 (1H, brd, J = 13,6 Hz), 4,61 (1H, dt, J = 10,4, 6,4 Hz), 4,79 (1H, brq, J = 8,4 Hz), 5,19 (1H, t, J = 10 Hz), 5,51 (1H, d, J = 5,5 Hz, OH), 5,54 (1H, d, J = 4,8 Hz), 7,19 (1H, t, J = 8,0 Hz), 7,34 (1H, t, J = 7,2 Hz), 7,37 (1H, d, J = 9,6 Hz), 7,55 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,58 (1H, s), 7,79 (1H, d, J = 7,6 Hz), 8,28 (1H, d, J = 10,0 Hz), 10,05 (1H, d, 3 = 6,4 Hz).
HR-EIMS (m/z): 625,3802 (M&spplus;, berechnet für C&sub3;&sub4;H&sub5;&sub1;N&sub5;O&sub6;: 625,3839).

Verbindung If

¹³C-NMR (125 MHz, Pyridin-d&sub5;): 11,00, 15,87, 20,06, 20,28, 23,55, 24,74, 25,20, 25,86, 25,92, 26,11, 29,06, 30,33, 35,47, 37,50, 44,26, 50,97, 54,47, 54,97, 61,57, 65,71, 73,41, 108,32, 108,94, 119,48, 120,25, 122,90, 122,93, 124,22, 133,01, 172,07, 174,50, 174,86, 176,53, 213,87.
¹H-NMR (500 MHz, Pyridin-d&sub5;): 0,91 (3H, t, J = 7,6 Hz), 0,97 (3H, d, J = 6,8 Hz), 1,10 (2H, m), 1,25 (3H, m), 1,30 (1H, m), 1,35 (1H, m), 1,44 (3H, d, J = 6,8 Hz), 1,45 (2H, m), 1,50 (2H, m), 1,60 (1H, m), 1,84 (2H, m), 2,05 (1H, brd, J = 14,0), 2,30 (1H, m), 2,40 (1H, m), 2,56 (2H, dt, J = 7,2, 1,2 Hz), 3,24 (1H, dt, J = 11,2, 2,0 Hz), 3,82 (1H, dd, J = 14,4, 6,4 Hz), 3,92 (3H, s), 4,20 (1H, dd, J = 10,4, 14,4 Hz), 4,35 (1H, brd, J = 12,8 Hz), 4,43 (1H, m), 4,58 (1H, dt, J = 10,4, 6,4 Hz), 4,72 (1H, brq, J = 7,2 Hz), 5,16 (1H, t, J = 10,4 Hz), 5,50 (1H, d, J = 5,6 Hz), 6,70 (1H, d, J = 4,4 Hz, OH), 7,16 (1H, t, J = 7,2 Hz), 7,30 (1H, t, J = 8,0 Hz), 7,32 (1H, d, J = 10,0 Hz), 7,52 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,56 (1H, s), 7,76 (1H, d, J = 8,0 Hz), 8,26 (1H, d, J = 10,0 Hz), 9,95 (1H, d, J = 6,4 Hz).
HR-EIMS (m/z): 639,3575 (M&spplus;, berechnet für C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub9;N&sub5;O&sub7;: 639,3632).

Verbindung Ig

¹³C-NMR (125 MHz, Pyridin-d&sub5;): 11,02, 15,88, 20,07, 24,35, 24,76, 25,21, 25,87, 26,06, 26,11, 26,30, 29,51, 29,82, 30,47, 35,48, 40,14, 44,27, 50,98, 54,49, 55,00, 61,64, 65,69, 66,97, 108,34, 108,94, 119,50, 120,26, 122,90, 122,94, 124,23, 133,01, 172,10, 174,54, 174,90, 176,68.
¹H-NMR (500 MHz, Pyridin-d&sub5;): 0,91 (3H, t, J = 8,0 Hz), 0,97 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,10 (2H, m), 1,20 (2H, m), 1,30 (3H, m), 1,31 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,35 (1H, m), 1,40 (2H, m), 1,45 (1H, m), 1,48 (1H, m), 1,50 (2H, m), 1,60 (2H, m), 1,84 (1H, m), 1,90 (1H, m), 2,05 (1H, brd, J = 14,0), 2,31 (1H, m), 2,40 (1H, m), 3,25 (1H, dt, J = 11,0, 2,0 Hz), 3,82 (1H, dd, J = 14,5, 6,4 Hz), 3,91 (3H, s), 3,94 (1H, m), 4,20 (1H, dd, J = 10,5, 14,5 Hz), 4,34 (1H, brd, J = 13,5 Hz), 4,61 (1H, dt, J = 10,5, 6,5 Hz), 4,76 (1H, brq, J = 8,5 Hz), 5,16 (1H, t, J = 10 Hz), 5,51 (1H, d, J = 6,0 Hz), 5,65 (1H, d, J = 5 Hz, OH), 7,16 (1H, t, J = 7,5 Hz), 7,31 (1H, t, J = 8,0 Hz), 7,34 (1H, d, J = 10,0 Hz), 7,51 (1H, d, J = 8,0 Hz); 7,55 (1H, s), 7,76 (1H, d, J = 8,0 Hz), 8,27 (1H, d, J = 10,5 Hz), 10,00 (1H, d, J = 7,0 Hz).
HR-EIMS (m/z): 625,3774 (M&spplus;, berechnet für C&sub3;&sub4;H&sub5;&sub1;N&sub5;O&sub6;: 625,3839).

BEISPIEL 11

Herstellung der Verbindung Ih durch Hydrogenolyse der Verbindung Id

Zu einer Lösung der Verbindung Id (0,8 mg) in einer 1-ml-Mischung von Methanol und Ethylacetat (1 : 1) wurde 10%iges Palladium über Holzkohle (2 mg) zugegeben und die Mischung evakuiert, um gelöste Luft zu entfernen. Diese Mischung wurde mit Wasserstoff gespült und dieser Zyklus von Entgasen und Spülen wurde dreimal wiederholt. Schließlich wurde der Wasserstoff mit dem Kolben verbunden und die Mischung 2 h lang gerührt. Der Katalysator wurde mittels Filtration durch Celite entfernt und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft, um 0,7 mg der Verbindung Ih als farbloses Pulver zu ergeben.
¹H-NMR (400 MHz, CD&sub2;Cl&sub2;): 0,86 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,91 (3H, t, J = 7,5 Hz), 1,03 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,10- 1,70 (8H, m), 1,78 (3H, m), 1,93 (1H, m), 1,96 (1H, m), 2,22 (1H, m), 2,32 (1H, m), 2,36 (2H, dt, J = 7,5, 3,0 Hz), 2,42 (2H, q, J = 7,0 Hz), 3,49 (1H, dd, J = 10, 7,5 Hz), 3,53 (1H, dd, J = 14, 7 Hz), 3,76 (1H, dd, J = 14,5, 9,5 Hz), 3,81 (1H, dt, J = 9,8, 4,5 Hz), 3,98 (1H, dt, J = 10, 7 Hz), 4,14 (1H, ddd, J = 10, 8,5, 6,5 Hz), 4,50 (1H, t, J = 10,5 Hz), 4,72 (1H, dd, J = 7,5, 1,5 Hz), 6,30 (1H, d, J = 6 Hz, Trp-NH), 7,06 (1H, d, J = 10,5 Hz), 7,10 (1H, dd, J = 8,1 Hz), 7,14 (1H, d, J = 10,5 Hz), 7,16 (1H, dt, J = 8, 0,5 Hz), 7,36 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,58 (1H, d, J = 8 Hz), 8,55 (1H, brs); ESI (m/z): 580 (M + H).

Claims

1. Verbindung mit der Formel:

worin

R¹ CH&sub3; oder CH&sub2;CH&sub3; ist;

R² H oder -OCH&sub3; ist;

R³ H ist und R&sup4; =O oder (H, OH) ist; oder

R³ OH ist und R&sup4; =O oder (H, H) ist; und

n 0 oder 1 ist;

mit der Maßgabe, daß, wenn n 0 ist, R¹ CH&sub2;CH&sub3; ist, R³ H ist und R&sup4; =O ist;

und daß, wenn R¹ CH&sub3; ist, R³ H ist und R&sup4; =O ist;

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

2. Verbindung nach Anspruch 1, bei der die stereochemische Konfiguration wie folgt ist:

3. Verbindung nach Anspruch 2, bei der die Substituenten wie folgt sind:

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, welches die Kultivierung eines Stammes von Fusarium pallidoroseum, der zur Herstellung dieser Verbindung imstande ist, in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, und die Gewinnung der Verbindung umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Stamm von Fusarium pallidoroseum die identifizierenden charakteristischen Eigenschaften von ATCC 74289 aufweist.

6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel Ia, Ib, Ic, Ie, If oder Ig nach Anspruch 3, welches die Kultivierung eines Stammes von Fusarium sp., der die identifizierenden charakteristischen Eigenschaften von ATCC 74322 aufweist und zur Herstellung dieser Verbindung imstande ist, in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, und die Gewinnung der Verbindung umfaßt.

7. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhütung von Protozoenkrankheiten bei Lebewesen.

8. Verwendung nach Anspruch 7, bei der die Protozoenkrankheit Kokzidiose ist.

9. Verwendung nach Anspruch 7, bei der die Protozoenkrankheit Malaria oder Toxoplasmose ist.

10. Zusammensetzung, die zur Verhütung oder Behandlung von Protozoenkrankheiten geeignet ist, welche einen inerten Träger und eine wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 umfaßt.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, bei der die Protozoenkrankheit Kokzidiose ist.

12. Biologisch reine Kultur von Fusarium pallidoroseum ATCC 74289.

13. Biologisch reine Kultur von Fusarium sp. (MF6058) ATCC 74322.