JPS61234794A - Ｌ−カルニチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 本発明は、クロトノベタインに微生物由来の酵素（カル
ニチンニトリアーセ゛）を作用させるととＫより、Ｌ−
カルニチンを酵素反応的Ｋｆｉ造する方法に関する。

（産業上の利用分野） 本発明の新規性は、微生物をＤＬ−カルニチン。

クロトノベタインなどのカルニチンヒドロリアーゼ誘導
物質存在下で嫌気的に培養して得られるカルニチンヒド
ロリアーゼ活性を増強せしめた菌体を用いて、安価に入
手できるクロトノベタインより有利ＫＬ−カルニチンを
生産する点にある。微生物菌体を破砕して得られる細胞
抽出液、更に公知の方法を用いて細胞抽出液より得られ
る部分精製轟該酵素、精製当該＃素の利用も有用である
。

カルニチン（β−ヒドロキシ−γ−トリメチルー７ミノ
酪酸）には０体およびＬ体の２種類の立体異性体が存在
することはよく知られている。Ｌ−カルニチンは、通常
生体内に存在し、活性化した長鎖の遊離脂肪酸をミトコ
ンドリア膜から通過させるキャリアーとしての働きを有
する。

カルニチンは左施性のＬ−カルニチンのみが天然物の形
態であるにもかかわらず、ラセミ体のカルニチンが食欲
増進剤などに用いられてきた。

しかし最近、少なくともいくつかの治療学的使用に対し
ては、Ｌ−カルニチンのみを使用する方が効果的である
ことが男らかにされ、その重要性に対す石関心が高まり
つつある。

実際、心血管系での急性ならびに慢性の心筋虚血、狭心
症、心臓性の不整脈または、心不全の治療に用いられて
いる。

（従来の技術） 光学活性Ｌ−カルニチンの製法としては、例えば下記の
方法が知られている。

（１）化学的な合成法によって得られたラセミ体のカル
ニチンを光学分割する方法。その光学分割の方法は、前
駆体であるＤＬ−カルニチンニトリルにＮ−アセチル−
Ｄ−グルタミン酸または、Ｎ−アセチル−し−グルタミ
ン酸を分割剤として加え塩を生成させ、溶解度の差を利
用して分割し、次いでこれを加水分解して、Ｌ−および
Ｄ−カルニチンクロライドとなす（特公昭４３−８２４
８）。

が代表的なものである。

（２）３−デヒドロカルニチンを微生物の酵素（カルニ
チンデヒドロゲナーゼ）の作用で不斉還元して、Ｌ−カ
ルニチンを得る方法。

（米国特許第４，２２１，８６９号） （３）Ｔ−ブチロベタインに微生物の酵素（ヒドロキシ
ラーゼ）を反応させることにより、Ｌ−カルニチンを製
造する方法。（特開昭５７−３９）電子９１）（４）好
気的培養法、あるいは好気的培養法により得られる菌体
を用いて、クロトノベタインよりＬ−カルニチンを製造
する方法。（特開昭５９−１８３６９４、特開昭５９−
１９２０９５）しかしながら、（１）は光学分割剤とし
て用いるＮ−アセチルーＤ−グルタミン酸が高価であり
、操作が複雑で収率が悪い。

（２）Ｕ、原Ｈの３−デヒドロカルニチンが不安定で取
扱が困錐な上、補酵素として高価なＮＡＤＨあるいはＮ
ＡＤを必要とする。

（３）は、原料となるｒ−ブチロベタインが高価である
などの理由で以上あげたいずれの方法も工業的製造法と
しては有利な方法とは云えない。

また（４）は、本発明者らの追試によれば好気的に培養
した菌体においては、カルニチンヒドロリアーゼ誘導物
質存在下での培養にもかかわらず、カルニチンヒドロリ
アーゼ活性を収得し得ない菌種が多数存在するし、カル
ニチンヒドロリアーゼ活性を取得した菌株についてもそ
の活性が弱い場合が多い。

そこで本発明者らは、エピクロルヒドリンより安価ＫＩ
Ｊ造できるクロトノベタインに着目し、Ｌ−カルニチン
の新規製造法の開発を目的として鋭意検討を行なった結
果、ＤＬ−カルニチン、　　Ｌ　−カルニチン、クロト
ノベタインなどのカルニチンヒドロリアーゼ誘導物質存
在下、微生物を嫌気的に培養すると多数の菌種の菌体く
おいて強いカルニチンヒドロリアーゼ活性が誘導される
ことを見い出し、本発明に至った。

本発明の実施態様の一例を説明すると、菌体取得のため
には例えば、ＫＨ２ＰＯ４０，３％、　Ｋ２ＨＰ０゜０
．７に、　（ＮＨ４）２５０４　０．ＩＸ、　ＭｇＳＯ
４・７Ｂ２００．０１％、ペプトン０．５％、酵母エキ
ス０．５％、ＤＬ−カルニチン　０．３％からなる液体
培地２０ｄＫ、斜面培地からセラチア　マルセンサス（
ＩＦＯ３７３６）の゛種菌を１白金耳量接種し、３０℃
で２日間、嫌気的に培養した。このようにして得られた
培養液より遠心分離により菌体を得た。得られた菌体は
５−の生理食塩水で洗浄後反応に供した。反応は得られ
た菌体をクロトノベタイン１．５％（１０５ｍＭ）’１
含むＱ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）中に添加した後、
３０℃で１８時間振盪することにより行なった。

得られた反応液は遠心分離により菌体を取り除いた後、
８０℃で５分間加熱処理を行ない、Ｄ、　Ｊ。

Ｐｅａｒｓｏｎらの酵素法（Ｍｅ　ｔｈｏｄ　１　ｎ　
Ｅｎｚｙｍｏ　１０ｇ５ｒ　Ｌｔ６１２　（１９６９）
）　　で分析すると５馳ＭのＬ−カルニチンが生成して
いた。

本発明において用いるクロトノベタインをＬ　−カルニ
チン忙変換せしめる能力を、有する微生物としては、例
えば　エシェリヒア　コリ　ＩＦＯ３３０１゜エンテロ
バクタ−クロアカニ　Ｉ　Ｆ　０３３２０．　　クレブ
シェラ　＃苧モニアエ　ＩＦＯ３５１２，エアロバクタ
ークロアカニ　ｌＡＭ１１３４．　　エルビニア　アロ
イデア工　ＩＦ０１２３８０．　　セラチア　マルセン
サス　ＩＦＯ３７３６、プロテラス　ブルガリス　ＩＦ
０３８５１．　　サルモネラ　チフイムリクム　ＩＦ０
１２５２９．　　アルカリゲネス　ファエカリス　ＡＴ
ＣＣ８７５０，７ラボバクテリクムエステロアロマテイ
カム　ＩＦＯ３７５１，アクロモバククー　パルプラス
　ＩＦＯ１３１８１，バクラス　ス７アエリカム　ＩＦ
Ｏ３５２６，アグロパクテリクム　ラジオバククー　Ｉ
ＦＯ１２６６４，アゾトバクタ−ビネランディＩＦ０１
２０１８．　　ミクロコツカス　ロゼラス　ＩＦ０３７
６８゜コリネパクテリクム　ラプス　ＩＦＯ１２１６１
，スタフィロコッカス　オーレラス　ＩＦＯ３０６０，
シュードモナスマルギナリス　ＩＦＯ３９２５，アルス
ロバクタ−シンプレ、ラス　ＩＦＯ１２０６９，プレビ
パクテリクム　リネンス　ＩＦＯ１２１４１，セルロモ
ナス　７ラピゲナ　ＩＦ０３７４Ｂ、　　ハフニア　ア
ルペイ　ＩＦＯ３７３１，アセトバクター　オルレアネ
ンス　ＩＦ０３２５９．　　クロモバクテリクム　イオ
ディナム　ＩＦＯ３５５８，キサントモナス　キャンペ
ストリス　ＩＦＯ１３３０３，ビブリオ　パラハエモリ
ティカス　ＩＦＯ１２７１１，クレプシエ２　ニューモ
二アエ　ＩＦＯ３３１９，エアロモナス　ハイドロフイ
ラＩＦ０１２９）電子８．　　プロタミノバクタ−アル
ボフラバスＩＦＯ３７０７，アシネトバクタ−カルコア
セティカスＩＦＯ１３００６，シトロバクタ−インター
メデラスＩＦＯ１３５４４，バ９テ’）　りＡ　　り”
５シル　ＩＦＯ３２３１゜クロストリジウム　ブチリカ
ム　ＩＦ０３８５＆　　リゾビウム　ジャポニカム　Ｉ
Ｆ０１３３３８．　　グルコノバクタ−セリナス　ＩＦ
Ｏ３２６４ストレプトコッカス　７アエカリス　ＩＦＯ
３１２＆　　ペディオコッカス　ベントサシラス　ＩＦ
０３８９３．　　ロイコノストック　メセンテロイデス
ＩＦＯ３４２６，ラクトバシラス　アシドフィラスＩＦ
Ｏ３２０５，プロビオニパクテリクム　テクニカムＩ　
Ｆ　０１２４２８．　　エアロコツカス　ビリダンス　
ＩＦＯｌ　２３１７、　　マイコパクテリクム　アビク
ム　ＩＦ０３０８２゜７カルデイア　アステロイデス　
ＩＦＯ３４２３ストレプトマイセス　アルプス　ＩＦ０
１３０１４等がある。

菌の培養条件は使用する菌株により多少異なるが、一般
的にいえば炭素源として、グルコース。

７ラクトース、シェークロース、マルトースナトの糖質
やグリセロールなど、窒素源として硫酸アンモニクム、
塩化アンモニクム、硝酸カリタム。

尿素、アミノ酸、ペプトン、カブミノ酸、コーンステイ
ープリカー、ふすま、米ぬか、酵母エキスなど、無機塩
類として硫酸マグネシウム、塩化ナトリクム、炭酸カル
シクム、リン酸−水素カリクを含む培地が用いられるが
、これらに限定されるものではない０更にこの培地に通
常は、０．０１〜２ＸＯＤＬ−カルニチン、Ｌ−カルニ
チン、クロトノベタインなどのカルニチンヒドロリアー
ゼ誘導物質を添加するが、カルニチンヒドロリアーゼ活
性が得られる嬶度であれば、これに限定されるものでは
ない。

この培地に菌株を接種し、嫌気的に培養する。

培養に適した温度は、通常は１５〜６０℃　であるが、
更に好ましくは２５〜４０℃である。培地の初発ｐＨは
、通常は３〜９．好ましくは５〜８の範囲である。

通常８時間〜１０日間の培養で菌を生育させる。

このようＫして得られた嫌気培養液から通常の方法によ
り取り出した菌体は、クロトノベタインを含む溶液と接
触せしめることによって、Ｌ−カルニチンを生産するこ
とが可能である。反応のｐＨは通常２〜１０が、好まし
くは５〜７がよい結果を与える。反応の温度は、通常１
０〜６０℃が、好ましくは２５〜４０℃である。最初に
添加するクロトノベタイン量は、通常０．１〜１０％で
ゝ亡るが、好ましくは１〜５％である。クロトノベタイ
ンを分割添加するとよい結果を与えることもある。また
、反応時【グルコース、シェークロース、マルトース、
グリセロール、酵母エキスナトを加えるとよい結果を与
えることがある。反応系に亜鉛、カリクム、カルシクム
、クロム、コバルト、ストロンチクム、鉄、銅、ナトリ
クム、ニッケル、バリクム、マグネシクム、マンガン、
モリブデン、リチクム化合物を添加すると反応収率が向
上することが多い。

反応の酵素源としては、菌体の＃１かに菌体より公知の
処理方法により得られたカルニチンヒドロリアーゼ活性
画分も利用できる。例えば、公知の方法で得た固定菌体
あるいは、固定化酵素も有効である。固定化に用いる担
体としては、カラギーナン、アルギン酸、寒天、コラー
ゲン、ゼラチン。

ペクチン、などの天然化合物あるいはまたポリアクリル
アミド、ポリアクリル酸、エチレンアクリル酸共重合体
、光架橋性樹脂などの合成高分子が利用できる。また、
　ａｃｅｔｏｎｅ　ｐｏｗｄｅｒやｄｒｙ　ｃｅｌｌに
処理した菌体を用いたり、界面活性剤を添加する方法が
よい結果を与える場合もある。変異処理をほどこした菌
体であっても、カルニチンヒドロリアーゼ活性を有する
限り本発明に含まれる。

以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明する０ 実施例ｌ ＫＨ２ＰＯ４０，３％、　Ｋ２ＨＰＯ４０，７％、　　
（ＮＨ４）２５０４０．１％、　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
０，０１に、ペプトン　０．５％。

酵母エキス　０．５％、カルニチンヒドロリアーゼ銹導
物質（ＤＬ−カルニチンま念はクロトノベタイン）０．
３％からなる液体培地２０ｍに、斜面培地から第１表に
示す菌株の１白金耳量を接種し、３０℃で２日間嫌気的
に培養した。このよう忙して得られた培養液より遠心分
離により菌体を得た。祷られた菌体を５−の生理食塩水
で洗浄後、クロトノベタイン１．５％（１０５ｍＭ）を
含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）中に添加した後、
３０℃で１８時間振盪することにより反応を行なった。

得られた反応液は、遠心分離により菌体を取・り除いた
後、８０℃で５分間加熱処理を行表い分析した。Ｌ−カ
ルニチンの生成量を第１表に示した。

なお、対照として好気的に培養して得られた菌体を用い
て反応を行なったときの結果を第１表中に併記した。条
件は、グリセロール２％、硫酸アンモニクム　０．３に
、　ＫＨ２ＰＯ４０，ＩＮ、　Ｋ２ＨＰＯ４０、３％、
　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５Ｘ、　ＦｅＳＯ４φ７
Ｈ２０１ｍｌ／ｄｉ、　ＭｎＳＯ４−４Ｈ２０１Ｗ／ｄ
ｊＬ　、　　酵母エキス１％。

ペプトンｉｃＸ、マルトエキス　０．５％、クロトノベ
タイン・硫酸塩０．３．９６’、炭酸力ルシクム（別殺
菌）４Ｘ（ｐＨ７，０）よりなる５−の培地に第１表に
示す菌株を接種後１６時間、３０℃で振盪培養した。

この培養液より菌体を遠心分離により採取し、培養液と
同量の生理食塩水で一回洗浄し、菌体を集めた。この菌
体をクロトノベタイン塩酸塩　１．５％（８３，６ｍＭ
）を含む０−　Ｉ　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）５ｄ
Ｋ添加し、３０℃に１６時間保持反応した。

この反応液中のＬ−カルニチン量を上で述べたと同様の
方法にて分析し、第１表の対照に示す結果を得た。

実施例２ 反応に加えたクロトノベタインが３％（２１０ｍＭ）で
、反応時間が４８時間となった以外は、実施例１と同様
に行ない、第２表の結果を得た。数値は生成したＬ−カ
ルニチン量を示す。

第　　２　　表 実施例３ 実施例１の方法に従って、誘導物質としてクロトノベタ
インを用い、エシェリヒア　コリ（ＩＦＯ３３０１）を
培養し、得られた菌体を生理食塩水で洗浄した。

（無傷細胞） 該菌体を超音波破砕した後、遠心分離により沈殿画分を
集め、該沈殿画分を界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００
で処理した後、遠心分離して無細胞抽出液を調製した。

酵素反応は、５０ｍＭ　リン酸緩衝液ＣｐＨ７，０）、
５０ｍＭクロト／ベタイン、２岬／−タンパク質に相轟
する上記騨素調蜆物を用い、温度３７℃、３時間行なっ
た。

無傷細胞を酵素として用いた反応では、　１５ｍＭのＬ
−カルニチンを、無細胞抽出液を酵素として用いた反応
では、２１　ｍＭのＬ−カルニチンをそれぞれ生成した
。

実施例４ 培養スケール、反応スケールを共に１００倍とし、セラ
チア　マルセンサス（ＩＦＯ３７３６）　ヲ用いた以外
は、実施例２と同様だ行なった。この反応スケールでは
、最初に加えるクロトノベタインは７、５　ｇ　（５２
，４ｍ−ｍｏｌ）であった。反応液より、菌体を遠心分
離により除去して得られた上清を、Ｄｏｗｅｘカラム長
さ８０ｃ属、内径５　ｃｔｔｔ　Ｋ通し、カルニチン画
分を得た。

このカルニチン画分より岨硫酸水素ナトリクムで処理す
る方法（特願昭５９−１８７３７７）を用いてクロトノ
ベタインを除き、３．６　ｇ　（２１４ｍｍｏｌ）のＬ
−、カルニチ、／’ｔｍた。このＬ−カルニチンの比旋
光度は〔α〕。＝−３０，５°（（、＋＋１．Ｑ水溶液
）であった。

実施例５ 実施例１に示した組成の培地ｌｊ！にエシェリヒア　コ
リ（ＩＦ０３３０１）を植菌し、３０℃で２日間嫌気的
に培養した。

このようＫして得られた培養液より遠心分離により菌体
を得た。１００−の生理食塩水で菌体を洗浄後、１ｇを
用いて力２ギーナンに固定化し、１０ｇの固定化菌体を
得た。

クロトノベタイン２００　ｍ属、クエン酸ナトリクム１
０　ｍ属、　ＫＮＯ３０，５Ｘ、　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
０５ｍＭ。

ＣａＣｌ２０．５ｍ属、　　リン酸緩衝液１００　ｍＭ
を含む反応液（ｐＨａ、ｏ）ｓｏｔｎｔに５ｇの固定化
１４素を加え、温度３０℃で２４時間反応させた０反応
終了後、反応液中のＬ−カルニチンを定量した。

次に固定化菌体を取り出し洗浄後、上記の反応液に再び
添加し、反応を繰り返し行なった。結果を第３表に示す
。

該固定化菌体は、１５日以上安定にＬ−カルニチンを生
産することができた。

第　　３　　表 実施例６ 第４表に示した化合物をカルニチンヒドロリアーゼ誘導
物質とし、０．１Ｘ濃度で用いた以外は、実施例１と同
様に行ない、第４表の結果を得た。

用いた菌株は、シトロバクタ−インターメデラス（ＩＦ
Ｏ１３５３９）である０数値は生じたＬ−カルニチンの
濃度（ｍＭ）を示す０ 第　　４　　表

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）クロトノベタインを不斉的に水和して、Ｌ−カル
   ニチンを生成する能力を有する微生物を、カルニチンヒ
   ドロリアーゼ誘導物質存在下嫌気条件で培養することに
   より、カルニチンヒドロリアーゼを誘導せしめ、該酵素
   の作用によりクロトノベタインを不斉的に水和して光学
   活性Ｌ−カルニチンを生成させることを特徴とするＬ−
   カルニチンの製造方法。 （２）カルニチンヒドロリアーゼ誘導物質がＤＬ−カル
   ニチンである特許請求の範囲（１）記載の方法。 ただし、エシエリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、
   サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、プロテウス（
   Ｐｒｏｔｅｕｓ）属の微生物は含まない。 （３）カルニチンヒドロリアーゼ誘導物質がＤ−カルニ
   チン、Ｌ−カルニチン、クロトノベタイン、ＤＬ−カル
   ニチンニトリル、クロトン酸、アリルアルコール、アク
   ロレイン、アクリロニトリル、アクリルアミド、アクリ
   ル酸よりなる群より選ばれた少なくとも１つの化合物で
   ある特許請求の範囲（１）記載の方法。ただし、Ｄ−カ
   ルニチンとＬ−カルニチンを同時に加える場合は除く。 （４）微生物がエシエリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
   ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）
   属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エアロ
   バクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルビニア（Ｅ
   ｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、
   プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、サルモネラ（Ｓａｌ
   ｍｏ−ｎｅｌｌａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉ
   ｇｅｎｅｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａ
   ｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍ
   ｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉ−ｌｌｕｓ）
   属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
   ）属。 アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ミクロ
   コッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、コリネバクテ
   リウム（Ｃｏｒｙｎｅ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スタ
   フィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ−ｃｃｕｓ）属
   、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アル
   スロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ブレビ
   バクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セ
   ルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏ−ｍｏｎａｓ）属、ハフニ
   ア（Ｈａｆｎｉａ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂ
   ａｃｔｅｒ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏ−
   ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈ
   ｏｍｏｎａｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、エア
   ロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、プロタミノバクタ
   ー（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、アシネトバ
   クター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、シトロバク
   ター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バクテリウム（Ｂ
   ａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔ
   ｒｉｄｉｕｍ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）
   属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏ−ｂａｃｔｅｒ
   ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
   ｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）
   属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、
   ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、
   プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉ−ｂａｃｔ
   ｅｒｉｕｍ）属、エアロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕ
   ｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
   ｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、スト
   レプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ）属より
   なる群より選ばれた属に属する少なくとも一種の微生物
   である特許請求の範囲（１）記載の方法。 （７）カルニチンヒドロリアーゼとして、微生物菌体あ
   るいは、その処理物を用いる特許請求の範囲（１）記載
   の方法。 （８）嫌気条件下での培養時に微生物の産生する電子を
   受容し得る化合物を添加する特許請求の範囲（１）記載
   の方法。 （９）電子を受容し得る化合物がＫＮＯ＿３または、Ｎ
   ａＮＯ＿３である特許請求の範囲（８）記載の方法。