JP3081649B2 - Ｓ−（＋）−マンデルアミドおよびその誘導体の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は微生物を用いてマンデロ
ニトリルおよびマンデロニトリル誘導体等から対応する
Ｓ−（＋）−マンデルアミドおよびＳ−（＋）−マンデ
ルアミド誘導体を製造する方法に関する。Ｓ−（＋）−
マンデルアミドおよびその誘導体は加水分解することに
よりＳ−（＋）−マンデル酸およびその誘導体に変換す
ることができる。Ｓ−（＋）−マンデルアミドおよびＳ
−（＋）−マンデル酸ならびにこれらの誘導体は医・農
薬の合成原料として重要な物質である。

【０００２】

【従来技術】微生物によりニトリル化合物を水和して対
応するアミドを生産する技術に関する発明は多く、特公
昭５６−１７９１８号、特公昭５９−３７９５１号、特
開昭６２−９１１８９号および特開昭６１−１６２１９
４号公報などが有る。しかしこれらの報告は不斉炭素を
分子内に持たないニトリル化合物を対象としたものであ
る。

【０００３】不斉炭素を分子内に有するニトリルからの
アミドの生産に関しては、バチルス属、バクテリジュー
ム属、マイクロコカス属、ブレビバクテリウム属に属す
る微生物をＤ，Ｌ−α−アミノニトリルに作用させＬ−
α−アミノ酸とＤ−α−アミノアミドの混合物を得る方
法（特表昭５６−５００３１号公報参照）、ブレビバク
テリウム属Ｒ３１２株のＡ４変異株を用いてラセミ体の
α−アミノ−γ−メチルチオブチロニトリル、α−アミ
ノプロピオニトリル、α−アミノブチロニトリル、α−
アミノ−β−フェニルプロピオニトリル、α−アミノ−
γ−メチルペンチルニトリルおよびα−アミノイソバレ
ロニトリルから対応するＬ−体のアミノ酸とＤ−体のア
ミノアミドを５０％づつの混合比で得る方法〔Adv. Bio
chem. Engineer. １４ １（１９８０）参照）、シュー
ドモナス属、ロドコッカス属、ノカルディア属による
Ｄ，Ｌ−アミノニトリルから光学活性なα−アミノ酸お
よび／またはα−アミノアミドを生産する方法（特開平
２−３１６９４号公報参照）およびＤ，Ｌ−α−アミノ
ニトリルから立体特異的加水分解酵素により約４０％ee
のＬ−α−アミノアミドを得る方法（特表昭６３−５０
０００４号公報参照）などが知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする問題点】これらの方法を利用
して光学活性アミドを得るには、共存しているアミノ酸
との分離操作が煩雑であり、また原理的にアミドの収率
が基質の半分にしかならないという問題点が有った。

【０００５】

【発明の構成】本発明者らは、上記状況に鑑み光学活性
マンデルアミドおよびその誘導体の効率良い生産方法を
開発すべく研究を重ねた結果、微生物を用いて、マンデ
ロニトリルおよびその誘導体、またはベンズアルデヒド
およびその誘導体と青酸の混合物から、そのほぼ全てを
Ｓ−（＋）−マンデルアミドおよびその誘導体に変換し
得ることを見出し本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は、下記一般式（１）で
示されるラセミ体のマンデロニトリルおよびその誘導
体、または下記一般式（２）で示されるベンズアルデヒ
ドおよびその誘導体と青酸の混合物に、中性または塩基
性の極性媒体中で、該一般式（１）で示されるラセミ体
のマンデロニトリルおよびその誘導体のニトリル基を立
体特異的に水和する能力を有する微生物またはその処理
物を作用させることにより、原料の一般式（１）で示さ
れるラセミ体のマンデロニトリルおよびその誘導体、ま
たは一般式（２）で示されるベンズアルデヒドおよびそ
の誘導体と青酸の混合物から直接優位量の下記一般式
（３）で示される光学活性なＳ−（＋）−マンデルアミ
ドまたはその誘導体を生成せしめることを特徴とするＳ
−（＋）−マンデルアミドおよびその誘導体の製造法、
である。

【化２】 〔Ｘは水素、メチル基、メトキシ基、ヒドロキシル基お
よびハロゲンを表わす。〕

【０００７】上記したところを要旨とする本発明は、一
般式（１）で示されるマンデロニトリルおよびその誘導
体が、中性ないし塩基性の極性媒体中で解離平衡するこ
とにより容易にラセミ化することを利用し、このラセミ
化反応の系と一般式（１）で示されるラセミ体のマンデ
ロニトリルおよびその誘導体のニトリル基を立体特異的
に水和する能力を有する微生物を共役させることによ
り、原理的に全ての基質を化学量論的にＳ−（＋）−マ
ンデルアミドおよびその誘導体に変換し得るとの本発明
者らにより見出された知見に基づくものである。

【０００８】本発明に用いられる微生物は、例えばロド
コッカス属に属するもので具体的にはロドコッカス ｓ
ｐ．ＨＮ６−１（微工研菌寄第１１７７３号）、ロドコ
ッカス ｓｐ．ＨＴ４０−６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２３
１）およびロドコッカス ｓｐ．ＰＮ４２−２（微工研
菌寄第１１７７５号）の菌株を挙げることができる。こ
れらの微生物はいずれも本発明者らにより新たに見出さ
れたものであり、工業技術院生命工学工業技術研究所に
上記番号にて寄託されており、各々の菌学的性質は以下
に示すとおりである。

【表１】

【０００９】以上の菌学的性質をバージェイズ マニュ
アル オブ システマティック バクテリオロジー（Be
rgey's Manual of Systematic Bacteriology, １９８
６）に従って分類すると３株ともロドコッカス属に属す
る細菌と同定された。

【００１０】次に本発明の実施態様について説明する。
本発明に使用される微生物の培養は資化し得るグルコー
ス、グリセロール、サッカロースなどの炭素源、尿素、
硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの窒素源、生
育に必須の塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化鉄
などの無機栄養素などを含有した通常の培地を用いて行
なわれる。またこれらの培地に酵母エキス、肉エキス、
糖蜜などの天然培地を添加したものも使用することがで
きる。培養初期から中期に生育を大きく阻害しない濃度
のベンゾニトリル、ベンジルシアニド、イソブチロニト
リルなどのニトリル類、またはイソブチルアミド、フェ
ニルアセトアミドなどのアミド類を酵素誘導物質として
添加することにより高い酵素活性が得られる。

【００１１】使用する培地のｐＨは４〜１０、培養温度
は５〜５０℃の範囲で選べばよく、培養は１〜１４日程
度好気的に行い活性が最大となるまで継続すればよい。

【００１２】一般式（１）で示されるマンデロニトリル
等の水和反応は、上記の方法にて培養した微生物の菌体
または菌体処理物（菌体の破砕物、粗・精製酵素、固定
化菌体・酵素等）を極性媒体、例えば水または緩衝液な
どの水性媒体中で、マンデロニトリルまたはその誘導
体、あるいはベンズアルデヒドまたはその誘導体と青酸
との混合物に接触させることによって行なわれる。

【００１３】本発明においては前述のように基質である
マンデロニトリルまたはその誘導体をラセミ化するため
に反応系を中性付近ないしは塩基性に保つことが必須で
ありｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０に調整す
る。基質の濃度はベンズアルデヒドや青酸に対する酵素
の感受性により一概に特定し得ないが、通常、反応液中
のマンデロニトリルおよびその誘導体は０．１〜１０重
量％、好ましくは０．２〜５．０重量％、ベンズアルデ
ヒドまたはその誘導体は０．１〜１０重量％、好ましく
は０．２〜５．０重量％、青酸は０．１〜１．０重量
％、好ましくは０．１〜０．５重量％である。原料とな
る基質に対する微生物等の使用量は乾燥菌体として０．
０１〜５．０重量％、反応温度は０〜５０℃、好ましく
は１０〜３０℃、反応時間は０．１〜２４時間程度であ
る。

【００１４】かくして、ラセミ体のマンデロニトリルお
よびその誘導体、またはベンズアルデヒドおよびその誘
導体と青酸の混合物から高収率で光学活性Ｓ−（＋）−
マンデルアミドが生産、蓄積される。生成物の単離は濃
縮、抽出、晶析などの公知の方法を利用して行うことが
できる。

【００１５】

【発明の効果】本発明によれば、ラセミ体のマンデロニ
トリルおよびその誘導体、またはベンズアルデヒドおよ
びその誘導体と青酸の混合物から直接優位量（５０〜１
００％）のＳ−（＋）−マンデルアミドが製造でき、原
料の全てを化学量論的にＳ−（＋）−マンデルアミドに
変換することも可能であり極めて効率の良いＳ−（＋）
−マンデルアミドとその誘導体の製造方法を提供し得
る。

【００１６】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが該実施例は本発明を限定するものではない。

【００１７】実施例１（１）培養下記平板培地にロドコ
ッカス ｓｐ．ＰＮ４２−２，同ＨＮ６−１および同Ｈ
Ｔ４０−６の３株を各々接種し３０℃で７２時間好気的
に培養した。

【００１８】培地（ｐＨ７．５）グリセロール
５ｇ 酵母エキス０．２ｇ ベンジルシアニド ０．５ｇ Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ５ｇＭｇＣｌ₂ ０．２ｇ ＣａＣｌ₂ ４０ｍｇ ＭｎＳＯ₄ ・４Ｈ₂ Ｏ ４ｍｇ ＦｅＣｌ₃ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．７ｍｇ ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．１ｍｇ 蒸留水 １０００ｍｌ

【００１９】（２）水和反応培地から菌体を採取し、遠
心分離により各々の菌体を２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で３回洗浄した。沈殿菌体を１４ｍＭマンデロ
ニトリルを含む１．５ｍｌの上記緩衝液に懸濁し、３０
℃で１５時間振盪しながら反応を行った。使用した菌体
濃度はＯＤ₆₁₀ ＝１５〜３０であった。反応終了後、各
々の反応液を遠心分離し菌体を除去した後、上清中のマ
ンデルアミド含量を液体クロマトグラフィー（カラム；
ＳＨＯＤＥＸ ＯＤＳＦ５１１Ａ，キャリヤ；０．２Ｍ
Ｈ₃ ＰＯ₄ ：アセトニトリル＝４：１，モニター；２０
８ｎｍ）で分析した。また生成したマンデルアミドの光
学純度は光学分割用カラム（ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＣＡ
−１，ダイセル化学工業、キャリヤ；１００％エタノー
ル）を用いて測定した。結果を表１に示した。

【表２】

【００２０】実施例２ロドコッカス ｓｐ．ＨＴ４０−
６株を実施例１と同様に培養、採取し遠心分離により洗
浄した。沈殿菌体をそれぞれ１４ｍＭの２−クロルマン
デロニトリル、３−クロルマンデロニトリル、４−クロ
ルマンデロニトリル、４−ブロムマンデロニトリル、４
−ヒドロキシマンデロニトリル、４−メチルマンデロニ
トリルおよび４−メトキシマンデロニトリルを含む１．
５ｍｌの２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁
し、３０℃で１５時間振盪しながら反応を行った。使用
した菌濃度はＯＤ₆₁₀ ＝２２であった。反応終了後、遠
心分離により菌体を除去した上清中に含まれるマンデル
アミド誘導体の定量と光学純度の測定は実施例１に示し
た方法で行った。結果を表２に示した。

【表３】

【００２１】実施例３ロドコッカス ｓｐ．ＨＮ６−１
株および同ＰＮ４２−２株を実施例１と同様に培養、採
取し遠心分離により洗浄した。沈殿菌体をそれぞれ１４
ｍＭの２−クロルマンデロニトリル、３−クロルマンデ
ロニトリルおよび４−クロルマンデロニトリルを含む
１．５ｍｌの２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸
濁し、３０℃で１５時間振盪しながら反応を行った。使
用した菌濃度はＨＮ６−１株がＯＤ₆₁₀ ＝２１、ＰＮ４
２−２株がＯＤ₆₁₀ ＝１７であった。生成したマンデル
アミド誘導体の定量と光学純度の測定は実施例１に示し
た方法で行った。結果を表３に示した。

【表４】

【００２２】実施例４ロドコッカス ｓｐ．ＨＴ４０−
６株を実施例１と同様に培養、採取し遠心分離により１
００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて洗浄し
た。沈殿菌体をそれぞれ１４ｍＭベンズアルデヒド、２
−クロルベンズアルデヒド、３−クロルベンズアルデヒ
ド、４−クロルベンズアルデヒド、４−メチルベンズア
ルデヒドおよび４−ヒドロキシベンズアルデヒドと１４
ｍＭシアン化カリウムを含む１．５ｍｌの１００ｍＭり
ん酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、３０℃で２４時間
振盪しながら反応を行った。使用した菌濃度はＯＤ₆₁₀
＝１４であった。生成したマンデルアミドおよびその誘
導体の定量と光学純度の測定は実施例１に示した方法で
行った。結果を表４に示した。

【表５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（１）で示されるラセミ体の
   マンデロニロリルおよびその誘導体、または下記一般式
   （２）で示されるベンズアルデヒドおよびその誘導体と
   青酸の混合物に、中性または塩基性の極性溶媒中で、該
   一般式（１）で示されるラセミ体のマンデロニトリルお
   よびその誘導体のニトリル基にロドコッカス（Ｒｈｏｄ
   ｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物またはその処理物を
   作用させることにより、原料の一般式（１）で示される
   ラセミ体のマンデロニトリルおよびその誘導体、または
   一般式（２）で示されるベンズアルデヒドおよびその誘
   導体と青酸の混合物から直接優位量の下記一般式（３）
   で示される光学活性なＳ−（＋）−マンデルアミドまた
   はその誘導体を生成せしめることを特徴とするＳ−
   （＋）−マンデルアミドおよびその誘導体の製造法。