JPS61271995A - Ｌ−カルニチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の目的） 本発明は、クロトノベタインを含まない培地で培養した
微生物菌体を用いて、栄養および酸素量を制限した反応
系でクロトノベタインよりＬ−カルニチンを生成させる
方法、すなわち培養液よシ遠心分離等で得た微生物菌体
をクロトノベタインを含む溶液に加えることＫより、ク
ロトノベタインよりＬ−カルニチンを生成させる方法に
関する。

（産業上の利用分野） 本発明は、クロトノベタインを含まない通常の培地で培
養した微生物菌体を用い、安価に入手できるクロトノベ
タインよシ有利ＫＬ−カルニｆｌｙを生産する点にある
。

カルニチン（β−ヒドロキシ−ｒ−トリメチル漬アミノ
酪酸）には０体およびＬ体の２種類の立体異性体が存在
することはよく知られている。Ｌ−カルニチンは、通常
生体内に存在し、活性化した長鎖の遊離脂肪酸をミトコ
ンドリア膜から通過させるキャリアーとしての働きを有
する。

カルニチンは左旋性のＬ−カルニチンのみが天然物の形
態であるＫもかかわらず、ラセミ体のカルニチンが食欲
増進剤などに用いられてきた。

しかし最近、少なくともいくつかの治療学的使用に対し
ては、Ｌ−カルニチンのみを使用する方が効果的である
ことが明らかにされ、その重要性に対する関心が高まり
つつある。

実際、心血管系での急性ならびに慢性の心筋虚血、狭心
症、心臓性の不整脈または、心不全の治療に用いられて
いる。

（従来の技術） （発明が解決しようとする問題点） 光学活性り一カルニチンの製法としては、例えば下記の
方法が知られている。

（１）化学的な合成法によって得られたラセミ体のカル
ニチンを光学分割する方法。その光学分割の方法は、前
駆体であるＤＬ−カルニチンニトリルＫＮ−アセチル−
Ｄ−グルタミン酸または、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミ
ン酸を分割剤として加え塩を生成させ、溶解度の差を利
用して分割し、次いでこれを加水分解して、Ｌ−および
Ｄ−カルニチンクロライドとなす（特公昭４３−８２４
８）。

が代表的なものである。

（２）３−デヒドロカルニチンを微生物の酵素（カルニ
チンデヒドロゲナーゼ）の作用で不斉還元して、Ｌ−カ
ルニチンを得る方法。

（米国特許第４，２２１，８６９号） （３）Ｔ−ブチロベタインに微生物の酵素（ヒドロキシ
ラーゼ）を反応させることにより、Ｌ−カルニチンを製
造する方法。（特開昭５７−３９７９１）（４）好気的
培養法、あるいは好気的培養法により得られる菌体を用
いて、クロトノベタインよりＬ−カルニチンを製造する
方法。（特開昭５９−１８３６９４、特開昭５９−１９
２０９５　”）しかしながら、（１）は光学分割剤とし
て用いるＮ−アセチル−Ｄ−グルタミン酸が高価であり
、操作が複雑で収率が悪い。

（２）は、原料の３−デヒドロカルニチンが不安定で取
扱が困難な上、補酵素として高価なＮＡＤＨあるいはＮ
ＡＤを必要とする。

（３）は、原料となるγ−ブチロベタインが高価である
などの理由で以上あげたいずれの方法も工業的製造法と
しては有利な方法とは云えない。

また（４）は、本発明者らの追試によれば好気的に培養
した菌体においては、カルニチンヒドロリアーゼ誘導物
質存在下での培養にもかかわらず、カルニチンヒドロリ
アーゼ活性を取得し得ない菌種が多数存在するし、カル
ニチンヒドロリアーゼ活性を取得した菌株についてもそ
の活性が弱い場合が多い。

そこで本発明者らは、原料としてエピクロルヒドリンよ
り安価に製造できるクロトノベタインに着目し、Ｌ−カ
ルニチンの新規製造法の開発を目的として検討を行なっ
た結果、ＤＬ−カルニチン。

Ｌ−カルニチン、クロトノベタインなどのカルニチンヒ
ドロリアーゼ誘導物質存在下、微生物を嫌気的に培養す
ると多数の菌種の菌体において強いカルニチンヒドロリ
アーゼ活性が誘導されることを見い出した。（特願昭５
９−１８７３７８　）しかしながら、この方法において
は嫌気条件下の培養であるために、好気条件下での培養
にくらべ菌の生育が悪い場合が多い。

（問題点を解決するための手段） そこで本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、クロトノ
ベタインを含まない通常の培地で好気的に培養した菌体
を取シ出して栄養を制限したクロトノベタインを含む溶
液に加えると、クロトノベタインよりＬ−カルニチンが
生成することを見い出し、本発明に至った。

本発明の方法によれば、好気的培養によって高濃度に培
養された菌体を、栄養制限下クロトノベタインと共存さ
せるとＬ−カルニチンが得られ、酸素量を制限するほど
Ｌ−カルニチンの収率の向上が認められた。

同時に、本発明によると好気的に増殖させた菌体を用い
るため高濃度の菌体液が調製でき、反応にあずかる菌体
数も多くなるため、結果として反応時間の短縮、基質濃
度の向上が可能となる。換言すれば小容量の好気的培養
で大容量の反応を行なうことも可能となる。

（作　用） 従来の方法では培養時にクロトノベタインあるいは、Ｄ
Ｌ−カルニチンを加えたため、培養液からそれらに由来
するベタイン化合物の分離が必要であった。

しかも副生じてくるγ−ブチロベタインのためにクロト
ノベタイン、カルニチンを純粋な形で回収することは、
かなりの困難を伴なった。しかし本発明の方法において
は、培養液からのベタイン化合物の回収を考慮する必要
は全くない。しかも反応系において特筆すべきことに、
γ−ブチロベタインの生成が全く認められない。

さらに１本発明の方法において生成されるし一カルニチ
ン濃度は従来の方法において培養液中に蓄積されるＬ−
カルニチン濃度よりも高い場合が多い。

本発明の方法は、無栄養または微栄養溶液中での反応で
あるため菌体の増殖は、はとんどなく培養法で問題とな
るコンタミネーションが起こらない。また反応系のｐＨ
の変化もほとんどないためｐＨｖ４整用の緩衝剤をほと
んど添加しなくてもすむ。これらの点は、Ｌ−カルニチ
ン精製時に用いる　イオン交換樹脂に負荷を与える培地
成分や緩衝剤の量を低減させるという効果も併せ持つ。

また本発明の方法は、好気性のみならず嫌気性条件下で
生育するいずれの菌株にも適用できるので、嫌気性条件
下でしか生育しない乳酸菌や絶対嫌気性菌を対象にする
ことができる。

すなわち、クロトノベタインを含まない培地を用い、嫌
気性条件下で該当する菌株を生育させて得られる菌体を
用いて同様に反応を行なうと、Ｌ−カルニチンが得られ
る。

このような嫌気性菌や通性嫌気性菌にも本発明の方法の
適用が可能であり、上述のような種々の利点がある。こ
の結果これまで用いられなかった多種の菌体が用いられ
ることになった。

次に本発明の実施態様の一例を説明すると、菌体取得の
ためには例えば、ＫＨ２ＰＯ４０，３％。

Ｋ２ＨＰＯ４０，７％、　　（ＮＨ４）２Ｓ０４０．１
％、ＭｇＳＯ４゜７Ｈ２００，０１％、ペプトン　０．
５％、酵母エキス０．５Ｘからなる液体培地５−に、針
面培地からシトロバクタ−インターメゾウス（Ｃｉｔｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ　）　　Ｉ　Ｆ
Ｏ１３５４４の種菌を１白金耳量接種し、３０℃で２日
間、好気的に培養した。

この培養液から遠心分離によシ得られた菌体を、５ｆｎ
ｔ生理食塩水で洗浄後、反応に供した。この菌体を無栄
讐状態で、クロトノベタイン　１．５％（１０５ｍＭ）
を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）５０ｗＩｌ中
に添加した後、３０℃で２日間密栓下酸素を制限した状
態で振盪することにより反応を行なった。得られた反応
液から遠心分離により菌体を取り除いた後、８０℃で５
分間加熱処理を行なった。この処理液は、Ｄ、　Ｊ、　
Ｐｅａｒｓｏｎらの酵素法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇ）’　ｉｉ、　６１２（１９６９））で
分析すると、５５ｍＭのＬ−力ルニチンを含んでいた。

本発８Ａにおいて用いるクロトノベタインをＬ　−カル
ニチンに変換せしめる能力を有する微生物としては、例
えばニジエリ°ヒア　コリ　ＩＦＯ３３０１゜エンテロ
バクタ−クロアカニ　ＩＦＯ３３２０，クレブシェラ　
ニ二一モニアエ　ＩＦＯ３５１２，エアロバクター　ク
ロアカニ　ＩＡＭ１１３４．　エルピニア　アロイデア
エ　ＩＦＯ１２３８０，セラチア　マルセンサス　ＩＦ
Ｏ３７３６，プロテウス　ブルガリス　ＩｒＯ２８５１
、サルモネラ　チフイムリウムＩ　ＦＯ１２５２９゜ア
ルカリゲネス　ファエ力リス　ＡＴＣＣ８７５０，フラ
ボバクテリウム　エステロアロマティカムエ■３７５１
、　　アクロモバクタ−パルプラス　ＩＦｏｌ　３１８
１、　　バララス　スファエリカム　ＩＦＯ３５２６゜
アグロバクテリウム　ラジオバクター　ＩＦＯ１２６６
４゜アゾトバクタ−ビネランディ　ＩＦ０１２０１８゜
ミクロコツカス　ロゼウス　ＩＦ０３７６８．コリネバ
クテリウム　ラサユ　ＩＦＯ１２１６１，スタフィロコ
ッカス　オーレウス　ＩＦＯ３０６０，シェードモナス
　マルギナリス　ＩＦＯ３９２５，アルスロバクタ−シ
ンプレックス　ＩＦＯ１２０６９，ブレビバクテリウム
　リネンス　ＩＦＯ１２１４１，セルロモナス７ラビゲ
ナ　ＩＦＯ３７４１３，ハフニア　アルベイＩＦＯ３７
３１，アセトバクター　オルレアネンスＩＦＯ３２５９
，クロモバクテリウム　イオディナムＩＦＯ３５５８，
キサントモナス　キャンペストリスＩＦＯ１３３０３，
ビブリオ　バラハエモリティカスＩＦＯ１２７１１，エ
アロモナス　ハイトロフイラＩＦ０１２９７８．　　プ
ロタミノバクタ−アルボフラバス　ＩＦＯ３７０７，ア
シネトバクタ−カルコアセティカス　ＩＦＯ１３００６
，シトロバクタ−インターメゾウス　ＩＦＯ１３５４４
，バクテリウムグラシル　ＩＦＯ３２３１，クロストリ
ジウム　ブチリカム　ＩＦ０３８５８．　　リゾビウム
　ジャポニカムＩＦ０１３３３８．　グルコノバクタ−
セリナス　ＩｒＯ２２６４、ストレプトコッカス　７ア
エカリスＩＦ０３１２８．　　ペディオコッカスベント
サシウスＩＦ０３８９３．　　ロイコノストック　メセ
ンテロイデス　ＩＦＯ３４２６，ラクトパシラス　アシ
ドフィラス　ＩＦＯ３２０５，プロピオニバクテリウム
　テクニカム　ＩＦ０１２４２８．　　エアロコツカス
　ビリダンス　ＩＦＯ１２３１７，等がある。

菌の培養条件は使用する菌株により多少異なるが、一般
的にいえば炭素源として、グルコース。

フジクトース、シ真−クロース、マルトースなどの糖質
やグリセロールなど、窒素源として硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硝酸カリウム。

尿素、アミノ酸、ペプトン、カザミノ酸、コーンステイ
ープリカー、ふすま、米ぬか、酵母エキスなど、無機塩
類として硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カル
シウム、リン醗−水素カリウを含む培地が用いられるが
、これらに限定されるものではない。

この培地に菌株を接種し、好気的あるいは嫌気的に培養
する。培養に適した温度は、通常は１５〜６０℃である
が、さらに好ましくは２５〜４０℃である。培地の初発
ｐＨは、通常は３〜９．好ましくは５〜８の範囲である
。通常８時間〜１０日間の培養で菌を生育させる。

このようＫして得られた培養液から通常の方法により取
り出した菌体は、クロトノベタインを含む溶液と接触せ
しめることによって、Ｌ−カルニチンを生産することが
可能である。反応のｐＨは通常２〜１０が、好ましくは
５〜７がよい結果を与える。反応の温度は、通常１０〜
６０℃が瀞ましくは２５〜４０℃である。最初に添加す
るクロトノベタイン量は、通常０．１〜１０％であるが
、好ましくは１〜６％である。クロトノベタインを分割
添加するとよい結果を与えることもある。また、反応時
に例えば１１００ｐｐ程度以下の実質的に菌体が増殖し
ない微量のコーンステイープリカー、ファーマメディア
、酵母エキスなどを加えるとよい結果を与えることがあ
る。反応系に亜鉛。

カリウム、カルシウム、クロム、コバルト、ストロンチ
ウム、鉄、鋼、ナトリウム、ニッケル、バリウム、マグ
ネシウム、マンガン、モリブデン。

リチウム化合物を添加すると反応収率が向上することも
ある。反応は嫌気条件下などの酸素量を制限した条件で
行なうほど、Ｌ−カルニチンの収率が向上する。

（実施例） 以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明する。

実施例１ ＫＨ２ＰＯ４Ｑ、３％、に２ＨＰＯ４０，７％、　　（
ＮＨ４）２ＳＯ４０，１％、　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００
，０１％、クエン酸ナトリウム　０．２　％からなるｐ
Ｈ７の合成培地５−に斜面培地から、エシェリヒア　コ
リＩＦＯ３３０１の１白金耳量を接種し、３０℃で２日
間好気的に培養した。このようＫして得られた培養液よ
シ遠心分離により菌体を得た。得られた陶体を５ｍの生
理食塩水で洗浄後、クロトノベタイン１．５％（１０５
ｍＭ）を含む０．ＯＩＭのリン酸緩衝液＜ｐＨ６）５〇
−中に添加し、窒素置換した後、密栓下３０℃で２日間
振盪することにより反応を行なったＯ 得られた反応液は遠心分離により菌体を取シ除いた後、
８０℃で５分間加熱処理を行ない、酵素法で分析すると
、４９ｍＭのＬ−力ルニチンが生成していた。

実施例２ 培養Ｋ　ＫＨ２ＰＯ４０，３％、　Ｋ２ＨＰＯ４０，７
％。

（ＮＨ４）２Ｓ０４　０．１％、　ＭｇＳＯ４−７Ｈｚ
ＯＯ，０１へペプトン　０．５％、酵母エキス　０．５
％からなる液体培地を用い、種菌として第１表に示す菌
株を用いた以外は、実施例１と同様に行ない、第１表の
結果を得た。

第　　　１　　　表 実施例３ 培養にグｋ　：ｆｆ　−ス１％、　ＣＨ３ＣＯＯＮａ　
１％。

ＫＨ２ＰＯ４０，０５Ｘ　、　　Ｋ２ＨＰＯ４０，０５
％、酵母エキス　１％、ペプトン　１％＊　　ＣａＣＯ
３１％からなる液体培地を用い、攬菌として第２表に示
す菌株を用いて、嫌気条件下で培養した以外は実施例１
と同様に行ない、第２表の結果を得た。

第　　　２　　　表 実施例４ 培養スケール、反応スケールを共に１０倍とし、シトロ
バクタ−、インターメゾウス　ＩＦＯ１３５４４を用い
た以外は、実施例２と同様に行なった。この反応スケー
ルでは最初に加えるクロトノベタインは、７．５Ｆ　（
５２，４ｍｍｏｌ　）で６．た０反応液より、菌体を遠
心分離により除去して得られた上清をＤｏｗｅｘカラム
長さ８０ｃｍ、内径５σに通し、カルニチン画分を得た
。

このカルニチン画分より亜硫酸水素ナトリウムで処理す
る方法（特願昭５９−１８７３７７）を用いてクロトノ
ベタインを除き、４０５’　（２４，８ｍｍｏｌ　）の
Ｌ−カルニチ／を得た。このＬ−カルニチンの比旋光度
は〔α）２０−−３０．５°　（Ｃ＝１．０水溶液）で
あった。

（発明の効果） 本発明の実施によシ微生物菌体を用いて、工業的に有利
にクロトノベタインよシ光学活性り一カルニチンを生成
することができ、下記の様な効果を奏することができる
。

１．　小容量の培養で大容量の反応を行なうことができ
る。

２　γ−ブチロベタインの副生が全く認められｋｔ。

ず、反応液よりの分離回収＃専容易である。

３、　反応時にコンタミネーションが起こらない。

４、ｐＨ調整の必要がない。

５、　イオン交換樹脂の量を低減することができる。

出願人　　製鉄化学工業株式会社 代表者　佐々木　　浩

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）クロトノベタインを含まない培地で培養した微生
   物菌体を用い、栄養および酸素量を制限した反応系でク
   ロトノベタインよりＬ−カルニチンを生成させることを
   特徴とするＬ−カルニチンの製造法。
2. （２）微生物菌体が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
   ｈｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ
   ｅｒ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、
   エアロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルビニ
   ア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ
   ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、サルモネラ（
   Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａ
   ｌｉｇｅｎｅｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏ
   ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒ
   ｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
   ｍ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属
   、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、コリ
   ネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
   、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
   ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ）属
   、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、
   ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
   属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、ハ
   フニア（Ｈａｆｎｉａ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔ
   ｏｂａｃｔｅｒ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍ
   ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔ
   ｈｏｍｏｎａｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、エ
   アロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、プロタミノバク
   ター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、アシネト
   バクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、シトロバ
   クター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バクテリウム（
   Ｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏ
   ｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
   ｍ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅ
   ｒ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
   ｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏ−ｃｏｃｃｕ
   ｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）
   属、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属
   、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔ
   ｅｒｉｕｍ）属、エアロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕ
   ｓ）属、よりなる群より選ばれた属に属する少なくとも
   一種である特許請求の範囲（１）記載の方法。