JPH01317387A - 新規Ｄ―アミダーゼ及びＤ―α―アラニン及び／又はＬ―α―アラニンアミドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はＤ−α−アラニンアミドを特異的に加水分解し
Ｄ−α−アラニンを生成する新規酵素（以下、Ｄ−アミ
ダーゼという）及び該酵素を用いるＤ−α−アラニン及
び／又はＬ−α−アラニンアミドの製造法に関する。

Ｄ−α−アラニンは甘味料または各種生理活性物質合成
のだめの合成中間体あるいは合成原料として用いられる
重要な化合物である。また、Ｌ−α−アラニンアミドは
食品・医薬品として重要なアミノ酸であるＬ−α−アラ
ニンの製造原料であ従来の技術 従来、Ｄ−α−アラニンを製造する方法としては以下に
挙げる方法が知られている。

（１）微生物を用いてＤ−α−アラニンを直接発酵生産
させる方法（特開昭５１−２２８８１．同５２−７６４
８２）。

（２）ＤＬ−α−アラニンにＬ−α−アラニンのみを分
解する能力を持った微生物を作用させ、Ｄ−α−アラニ
ンを製造する方法〔大部、田中；アミノアシド・ヌクレ
イツク・アシド（＾ｍｉｎ。

＾ｃｉｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ）　　１５　８９
〜９３　（１９６６）　〕。

（３）ＤＬ−α−アラニンのＮ−アシル体に微生物の生
産するアシラーゼを作用させ、ＤＬ−α−アラニンを光
学分割することによりＤ−α−アラニンを製造する方法
（特公昭４ｌ−２２３８０）（４）５−メチルヒダント
インにヒダントイナーゼ活性を有する微生物を作用させ
、Ｄ（Ｎ−力ルバモイル）−アラニンとし、さらに化学
的にあるいは微生物を用いてＤ−α−アラニンを製造す
る方法〔山田ら１発酵と工業　邦９３７（＋９８０＞、
特開昭５３−９１１８９．同５４−８９０８８．同５５
−８８６９７．同５５−１０４８９０．同５５−１１４
２９１等〕。

（５）Ｄ−α−アラニンアミドをバチルス属、バタテリ
ジウム属、ミクロコツカス属、ブレビバクテリウム属、
アクロモバクタ−属、アルカリ土類金属、クルチア属、
シュードモナス属、ロドコッカス属及びセラチア属に属
する微生物が有するＤ−α−アラニンアミド加水分解活
性を用いて加水分解し、Ｄ−α−アラニンを製造する方
法（特公表５６−５００３１９．特開昭６０−１８４３
９２゜同６１−９６９８９．同６１−２７４６９０）。

（６）　　ロドコッカス属に属する微生物が有するＤ−
α−アミノ酸アミドを特異的に加水分解する活性を用い
て、ＤＬ−α−アミノ酸アミドからＤ−α−アミノ酸を
製造する方法（特開昭６３−８７９９８）。

（７）　　ピルビン酸にＤ−アミノ酸トランスアミナー
ゼを作用させ、Ｄ−α−アラニンを製造する方法（特開
昭６２−２０５７９０）。

（８）ＤＬ−α−アラニンのｐ−クロルベンゼンスルホ
ン酸塩の優先晶出法による化学的な光学分割法によりＤ
−α−アラニンを製造する方法（特公昭４７−１４３６
９．特開昭４８−５７９１４＞。

上記Ｄ−α−アラニンを製造する方法において、（１）
、　（２）、　（６）、　（８）の方法はＤ−α−アラ
ニンの生産性がないかあるいは低い。（３）、　（４）
、　（７）の方法は反応が数段階になり操作が煩雑であ
る。

又、（５）、　（７）の方法は光学活性な基質を用いる
必要があり、基質が高価であるため製造コストが高い。

Ｄ−α−アラニンアミドを加水分解する酵素は、日本農
会化学会昭和６３年度大会講演要旨集３５２頁に開示さ
れている。

また、工業的に安価でかつ光学純度の高いＬ−α−アラ
ニンアミドの製造方法は知られていない。

発明が解決しようとする課題 現在安価なりＬ−α−アラニンアミドに作用して、直接
光学純度の高いＤ−α−アラニン及びＬ−α−アラニン
アミドを生産する酵素及び該酵素を用いるＤ−α−アラ
ニン及びＬ−α−アラニンアミドの製造法が求められて
いる。

課題を解決するための手段 ＤＬ−α−アラニンアミドからＤ−α−アラニンを工業
的に有利に製造する方法の開発を目的に検討を行った。

その結果、アースロバクター属に属する微生物がＤ−α
−アラニンアミドを特異的に加水分解しＤＬ−α−アラ
ニンアミド又はＤ−α−アラニンアミドよりＤ−α−ア
ラニンを生成する酵素を生産することを見出した。該酵
素を単離、Ｉ！ＬＪＬ、その理化学性質を調べたところ
新規な酵素であることが判明し、本発明を完成した。

本発明は新規Ｄ−アミダーゼ及びアースロバクター属に
属し、Ｄ−アミダーゼ生産能を有する微生物の培養物、
菌体、菌体処理物または菌体より単離、精製したＤ−ア
ミダーゼの存在下、ＤＬ−α−アラニンアミド又はＤ−
α−アラニンアミドを含有する水性媒体中で酵素加水分
解反応を行わせ、反応混合物よりＤ−α−アラニン及び
／又はＬ−α−アラニンアミドの製造法を提供する。

本発明におけるＤ−アミダーゼは下記の理化学的性質を
有する。

１）作用および基質特異性：Ｄ−α−アラニンアミドに
作用してＤ−α−アラニンアミドを加水分解し、ｐ−α
−アラニンを生成する。

Ｄ−α−アラニンアミドに対するＫｍ値は約４ｍＭであ
り、Ｌ−α−アラニンアミドに対するＫｍ値は約２６ｍ
Ｍである。

Ｌ−α−アラニンアミド加水分解活性はＤ−α−アラニ
ンアミド加水分解活性の０〜１．５％である。

２）至適ｐＨ：３０℃でｐＨ７〜８に至適ｐＨを有する
。

３）至適温度：ｐＨ７，５で４０〜４５℃に至適温度を
有する。

４）熱安定性：６０℃以上の温度で１０分間放置すると
失活する。

５）　ｐ　Ｈ安定性：３０℃においてｐ　Ｈ６，５〜１
０で安定である。

６）分子１：５０，０００±５．０００　　（ＳＯ３−
ポリアクリルアミド電気泳動法による） ７）活性化：活性化に補酵素を必要としない。

８）等電点：ｐＨ５，２±０．３ 本発明で用いる微生物としては、アースロバクター属に
属し、上記性質を有する酵素を生産する能力を有する微
生物であればいずれでもよいが、例えば、アースロバク
ター・エスピー（＾ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ、）Ｈ
−４９０４を例示することができる。

アースロバクター・エスピー　Ｈ−４９０４は、自然界
より新たに分離された微生物である。

アースロバクター・エスピーＨ−４９０４（Ｄｉ学的性
質を以下に述べる。

（ａ）形　態 １）細胞の形および大きさ： 球状（直径０．８〜１．ＯＡ＋）と桿状（直径０．８贋
、長さ１．２〜１．５喝）の形態をとる。

２）運動性：極ベン毛を有し運動性がある。

３）胞子：形成しない。

４）ダラム染色性：陽　性 ５）抗酸性：はとんど認められない。

（ｂ）　　各培地における生育状態 １）肉汁寒天平板培養：円形、凸円状のなめらかな集落
を形成する。不透明白黄色を呈す。

抗散性色素は生成しない。

２）肉汁寒天平板培養二十分に生育し、不透明白黄色を
呈す。

３）肉汁液体培養：混濁状に生育し、表面に膜を形成し
ない。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養：液化しない。

５）リドマス・ミルク：リドマスを還元せず、凝固もみ
られない。

（Ｃ）生理学的性質 １）硝酸塩の還元：陽　性 ２）脱窒反応：陽　性 ３）ＭＲテスト：陰　性 ４）ＶＰテスト：陰　性 ５）インドールの生成：陰　性 ６）硫化水素の生成：陰　性 ７）デンプンの加水分解：陰　性 ８）クエン酸の利用（シモンズの培地）：陽　性９）無
機窒素源の利用 硝酸塩：陰　性 アンモニウム塩二弱陽性 １０）色素の生成：陰　性 １１）ウレアーゼ：陰　性 １２）オキシダーゼ：陰　性 １３）カタラーゼ：陽　性 １４）生育の範囲 １）　　ｐＨ：ｐＨ５，０〜９．０（至適６，０〜８．
０）２）　温度＝１５〜３７℃（至適３０℃）１５）酸
素に対する態度：好気性ないし通性嫌気性 １６）ＯＦテスト：陰　性 １７）糖類からの酸、ガスの生成： 酸　　　　ガス　（ペプトン水） し−アラビノース　　−− Ｄ−キシロース　　　−− Ｄ−グルコース　　　−　　　− Ｄ−マンノース　　　−− Ｄ−フラクトース　　−− Ｄ−ガラクトース　　−− 麦芽糖　　　　　　　−− シー３ａ　　　　　　　　−− 乳糖　　　−− トレハロース　　　　　−− Ｄ−ソルビット　　　−− Ｄ−マンニット　　　−− イノジット　　　　　−− グリセリン　　　　−− デンプン　　　　　　−− １８）塩化ナトリウム耐性：１５％Ｎ　ａ　Ｃ１で生育
する。

（ｄ）　　化学的組成 ｌ）ペプチドグリカン構成アミノ酸：リジン。

アラニン、グルタミン酸 ２）ｍｏ１％ｃ＋ｃ　　（Ｔｍ）　：　６３．１７以上
の菌学的性質を有する菌について、バージエイの７ニニ
アル（日ｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　ｖｏｌ、
　２　　（１９８６年）の記載と照合し、ダラム陽性で
球状または桿状の形態をとり、極ベン毛を有し運動性が
あり、好気性ないし通性嫌気性であり、胞子を形成せず
、ペプチドグリカン構成アミノ酸としてリジン、アラニ
ン、グルタミン酸を有し、ＤＮＡのｍｏ１％Ｇ＋Ｃが６
３．１７であることに基づいて検索した結果、本菌株は
アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属
する細菌と同定し、本菌株をアースロバクター・エスピ
ー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ、）　Ｈ−４９０
４と命名した。

本菌株は昭和６３年１月１４日付で工業技術院微生物工
業技術研究所にＦＥＲＭ　ＢＰ−１６４９として寄託さ
れている。

これらの微生物を培養する培地は、微生物が資化し得る
炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、本発明の酵素
を生成する能力を有する微生物の培養を効率的に行える
培地であれば天然培地１合成培地のいずれでも良い。

炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るもので
あれば良く、グルコース、シュークロース、これらを含
有する糖蜜、デンプン加水分解物などの炭水化物、酢酸
、プロピオン酸などの有機酸、およびエタノール、プロ
パツールなどのアルコール類が用いられる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
などの各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、アミン類
、その地合窒素化合物ならびにペプトン、肉エキス、酵
母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物
、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物な
どが用いられる。

無機物としては、リン酸第−カリウム、リン酸第二カリ
ウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナ
トリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カ
ルシウムなどが用いられる。

培養は振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条
件下で行う。培養温度は１５〜３７℃が良く、培養時間
は通常１６〜７２時間である。

培養中ｐＨは５．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は
無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素。

炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。

培養の際、Ｄ−α−アラニンアミド、Ｌ〜α−アラニン
アミドあるいはＤＬ−α−アラニンアミドを０．１ｇ／
１２〜２０ｇ／Ｉｌ培地に添加し、菌体中にＤ−アミダ
ーゼを誘導蓄積させる必要があるが、適当な変異株を用
いることにより、培地にＤ−α−アラニンアミド、Ｌ−
α−アラニンアミドあるいはＤＬ−α−アラニンアミド
（以下、誘導物質と言う）を添加することなく、Ｄ−ア
ミダーゼをＩＩさせることができる。

このような変異株はアースロバクター・エスピー　　Ｈ
−４９０４を親株として通常の変異誘導法、例えば紫外
線照射、Ｘ線照射、放射線照射、変異誘起剤処理などに
より得ることができる。

目的とする変異株は、変異処理後、通常の栄養培地、例
えばブイヨン−酵母エキス培地に生じたコロニーを取得
し、誘導物質を添加しない培地中でＤ−アミダーゼを蓄
積する菌株を選択することにより得ることができる。

このようにして取得した変異株の例としては、アースロ
バクター・エスピー　Ｈ−７０９５があげられる。アー
スロバクター・ｘｘヒ−Ｈ−７０９５は、昭和６３年３
月２日付で工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ
　ＢＰ−１７７３として寄託されている。

培養液から酵素を単離、ｖＩＩ製するには、通常の酵素
の単離、精製法を用いればよい。例えば培養液を遠心分
離して集菌し、超音波破砕、フレンチプレス、マントン
ガラリン、ダイノミルなどによる機械的破砕により菌体
を破砕後、得られる破砕液を遠心分離し、その上清に硫
安などによる塩析、ＤＥＡＥ−セファロース、ＣＭ−セ
ファロースなどのイオン交換クロマトグラフィー等を行
い、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に単一
な酵素を得ることができる。

酵素活性の測定法は、以下の通りである。

２５０ｍＭ　　Ｄ−α−アラニンアミドを含む５０ｍＭ
　　リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）１．０ｍｆｆを３０℃
で５分間加温した後、酵素溶液０．１ｍｌを加えて３０
℃、３０分間反応させる。０．１ｍｌの６Ｎ塩酸を加え
て反応を停止させ、生成したＤ−α−アラニン量を下記
条件下で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によ
り測定する。

カラム：　ＣＨＩＲＡＬＰ＾にＷＢ　（−）ダイセル化
学工業社製溶出液：０．２５ｍＭ　　Ｃｕ５Ｏ，水溶液
流速＝１ｍｌＺ分 カラム温度：４５℃ 検出法：０−フタルアルデヒドを加えて、５０℃で反応
させ、蛍光を検出（励起波長 ：　３４４　ｎｍ、蛍光波長：　４４４　ｎｍ）酵素活
性は上記測定条件下、１分間に１μｍａｔのＤ−α−ア
ラニンを生成させる活性を１単位（Ｕ）として表示する
。

Ｌ−α−アラニンアミドを加水分解し、Ｌ−α−アラニ
ンを生成する活性（以下、Ｌ−アミダーゼ活性という）
は、上記測定条件下、Ｄ−α−アラニンアミドの代わり
にＬ−α−アラニンアミドを用いることにより測定する
ことができる。

ＤＬ−α−アラニンアミド又はＤ−α−アラニンアミド
に本発明の酵素を作用させることにより、Ｄ−α−アラ
ニン及び／又はＬ−α−アラニンアミドを生成させるこ
とができるが、本発明の酵素を生産する能力を有する微
生物の培養物、菌体あるいは菌体処理物の存在下、ＤＬ
−α−アラニンアミド又はＤ−α−アラニンアミドを含
有する水性媒体中で酵素加水分解反応を行わせ、反応混
合物よりＤ−α−アラニン及び／又はＬ−α−アラニン
アミドを採取することが好ましい。

反応は、微生物の培養中でもよく、培養後、培養物、菌
体、菌体処理物または精製酵素とＤＬ−α−アラニンア
ミドまたはＤ−α−アラニンアミドとを水性媒体中で反
応させてもよい。

Ｄ−アミダーゼ活性を有する微生物の菌体処理物として
は、菌体の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤処理物、酵
素処理物、超音波処理物、ｉ械的摩砕処理物、溶媒処理
物、菌体の蛋白質分画、菌体および菌体処理物の固定化
物などがあげられる。

精製したＤ−アミダーゼはそのまま用いてもよいが、固
定化物として用いることもできる。

水性媒体としては水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ
酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、
エタノール、プロパツールなどのアルコ−Ｊｌ／Ｑ、ｊ
ｔ［エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類
、アセトアミドなどのアミド類などがあげられる。

反応に精製した酵素を用いる場合は、酵素の安定化を向
上させるために該水性媒体に５〜５０％のグリセロール
を添加することが好ましい。

反応は通常、温度１５℃〜５０℃でｐＨ６，０〜９．５
で１〜４８時間行う。反応液中の酵素量は、用いるＤＬ
−α−アラニンアミドまたはＤ−α−アラニンアミドの
量及び反応時間により適宜決定すれば良いが、通常は１
〜３００に単位／ｌである。特に反応に菌体を用いる場
合は通常湿菌体で１ｇ／２〜５０ｇ／ｆである。反応に
用いるＤＬ−α−アラニンアミドおよびＤ−α−アラニ
ンアミドは、遊離型、塩酸塩、硫酸塩のいずれでも良く
、ＤＬ−α−アラニンアミドの場合は、１〜５００ｇ／
ｊ’、好ましくは１〜４００ｇ／ｆが用いられる。Ｄ−
α−アラニンアミドの場合は、ｌ〜３００ｇ／Ｌ好まし
くは１〜２００ｇ／ｆが用いられる。

また、一般的に微生物菌体中に含まれるアラニンラセマ
ーゼは、光学活性なアラニンのラセミ化を触媒する酵素
であり、上記反応で生成するＤ−α−アラニンの光学純
度を低下させる。本発明で用いる微生物はアラニンラセ
マーゼ含有量が低く、当該微生物をそのまま用いても充
分な光学純度のＤ−α−アラニンを得ることができるが
、アラニンラセマーゼ活性を抑制する公知の方法、例え
ば、通常の変異処理によりアラニンラセマーゼ活性がな
いかあるいは活性が低下した変異株を取得し反応に用い
る〔ジェイ・ワイルド（Ｊ、Ｗｉｌｄ）ら；モレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジエネテイツクス（Ｍｏ１．
Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）　１９８．　３１５−３２２　
（１９８５）］、熱処理などによりアラニンラセマーゼ
活性を失活させる〔高松、土佐、千畑；日本化学会誌　
旦。

１３６９　（１９８３）　）あるいはアラニンラセマー
ゼ阻害剤を反応時添加する〔化学と生物　２０．７７０
−７７２（１９８６）　；生化学実験講座　旦、　２７
５−２９６１などの方法を適宜用いることにより、さら
に光学純度の高いＤ−α−アラニンを得ることができる
。

反応にＤＬ−α−アラニンアミドを用いる場合、Ｄ−α
−アラニンが水性媒体中に生成蓄積すると共に、反応後
、Ｌ−α−アラニンアミドが反応液中に残存するので、
これを該水性媒体中より採取することによりＬ−α−ア
ラニンアミドを製造することができる。

培養液または水性媒体中からＤ−α−アラニンおよびＬ
−α−アラニンアミドを回収する方法としては、イオン
交換樹脂などを用いるカラムクロマトグラフィーあるい
は晶出法など通常の分離方法が用いられる。

以下、実施例により本発明を説明する。

実施例１゜ ＢＹＧ培地〔粉末ブイヨン（極東社製）２％。

酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社ｍ）０．５％、ポリペプトン
０．５％、グルコース０．２％を含み、６Ｎ　ＮａＯＨ
でｐ　Ｈ７，２に調整した培地〕を２１のバッフル付フ
ラスコに１５０ｍ１ずつ分注し、１２０℃、２０分間殺
菌した。この培地にブイヨンスラントに生育したアース
ロバクター・ニスｌ：’−Ｈ−４９０４を一白金耳植菌
し、３０℃、２０時間振盪培養し、種培養液として用い
た。

一方、グルコース３％、コーン・スチーブ・リカー２％
、ペプトン０．５％、ＮａＣｆ１％。

（ＮＨ４）２５０．２％、Ｍｇ５Ｏａ・７ＨａＯ０，３
％。

Ｆ　ｅ　ＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ０，００１％、　Ｍｎ　Ｓ
ｏ−・７　Ｈ２Ｏ０，０００１％、ＤＬ−α−アラニン
アミド０．６％を含有するｐ　Ｈ７，２の培地を調製し
、３０ｆ容量のジャーファーメンタ−に１８１分注し、
１２０℃。

２０分間殺菌した。この培地に、種培養液２βを無菌的
に接種し、３０℃、４５０ｒｐｍ、通気量１０１／分に
て３０時間培養した。得られた培養液のＤ−アミダーゼ
活性は６４単位／ｍｌであった。

培養液を遠心分離し得た菌体を５０ｍＭ　　リン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７，５）１．９βにｖｉ濁した後、
ダイノミル（ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ；ラボラトリ−ミルＫ
ＤＬ型、ＩＱ、Ａ、　Ｂａｃｈａｆｅｎ　！、１ａｓｃ
ｈｉｎｅｎｆａｂｒｉｋ社製）により菌体破砕を行った
。菌体破砕液を遠心分離して得られた上清を５０ｍＭ　
　）！Ｊスス−酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて平衡化した
ＤＥＡＥ−セファロース−ファーストフロー（ファルマ
シア社製）カラムクロマトグラフィーに供し、０〜０．
４Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液を用いて濃度勾配溶
出を行った。０，２Ｍ塩化す）　ＩＪウム溶出画分にＤ
−アミダーゼが溶出された。活性画分をさらに２０％飽
和濃度の硫安を含む５０ｍＭ）Ｕスー塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）で平衡化したブチルトヨバール（ＴＳに−ＧＥ
シロ５０［：　　東洋曹達社’！ｌ！りカラムクロマト
グラフィーに供し、２０％〜０．１％飽和硫安を含む同
緩衝液を用いて濃度勾配溶出を行った。

１５％〜ｌＯ％飽和硫安溶出画分にＤ−アミダーゼが溶
出された。活性画分をＩＰ膜（ＳＩＰ−１０１３、旭化
成社製）にて脱塩後、グリセロールを２５％（Ｖ／Ｖ）
になるように添加し、グリセロール２５％（ν／ｖ）を
含む５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７゜５）にて平
衡化したＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−ＴｒｉｓａｃｒｙｌＬＳ　
（Ｒ６ａｃｔｉｆｓ　ＩＢＦ　　Ｓｏｃ、Ｃｈｉｍ社製
）カラムクロマトグラフィーに供し、０〜０．４Ｍの塩
化ナトリウムを含む同緩衝液を用いて濃度勾配溶出を行
っｔこ。Ｄ−アミダーゼは、０．２Ｍ塩化ナトリウムを
含む画分に溶出されｔこ。

得られた酵素のＤ−アミダーゼ活性は６．０×１０’単
位であり、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分子置駒５０，０００の単一のバンドを示した。

本酵素のＤ−α−アラニンアミドおよびＬ−α−アラニ
ンアミドに対する比活性及びＫｍ値を第１表に示した。

第　　　　１　　　　表 ０−α−アラニンアミド　　し−α−アブニンアミド比
活性（単位／　ｍｇ蛋白質＞１８００　　　１７．４Ｋ
ｍ　（ｍＭ）　　　　　　　　　４．２　　　２６．１
第１図にｐＨを変化させた場合の活性をρ１１７．５で
の酵素活性を１００とした相対活性で示した。

第１図に示したように、本酵素は３０℃でｐ　）Ｉ　７
〜８に至適ｐＨを有していた。第２図に温度を変化させ
た場合の活性を３７℃での酵素活性を１００とした相対
活性で示した。第２図に示したように、本酵素はｐ　Ｈ
７，５で４０〜４５℃に至適温度を有していた。

本酵素のｐＨ安定性を以下の方法により測定した。

本酵素を１９．２単位含む５０ｍＭト！Ｊスー塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５）０．０５−を２５％グリセロールを含
むｐＨ６〜１０の各種緩衝液０．９５ｍｆ！に加え、３
０℃で２時間放置した。静置後、この酵素溶液０．０５
ｒｒｔＩを、０．５−の［）−ａ−アラニンアミド溶液
〔Ｄ−α−アラニンアミド１２．５ｇ／ｉ、グリセロー
ル２５％（ｖ／ｖ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，５）］に加え３７℃で３０分間反応を行った。反応
後、６Ｎ塩酸０．１　ｌｌ１１２を加えて反応を停止さ
せた後、生成したＤ−α−アラニン量を定量した。酵素
活性は、３０℃、２時間静置前の酵素活性を１００とし
た相対活性で表示した。

結果を第３図に示した。第３図に示したように、本酵素
はｐ　Ｈ６，５〜１０の範囲で安定であった。

本酵素の温度安定性を以下の方法により測定した。

本酵素を１９２単位含む５０ｍＭ）ＩＪスス−酸緩衝液
（ｐＨ７，５）　０．５−を２５％（ｖ／ｖ）グリーＷ
Ｏ−ルを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）で
１０倍に希釈した。この希釈溶液０．５−をとり、各種
の温度で１０分間放置した後、直ちに氷冷した。静置後
、この酵素溶液０．０５−を０．５−のＤ−α−アラニ
ンアミド溶液〔Ｄ−α−アラニンアミド１２．５ｇ／Ｌ
グリセロール２５％（ｖ／ｖ）を含む５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７，５＞）に加え３７℃で３０分間反応を行
った。反応後、６Ｎ塩８０．１−を加えて反応を停止さ
せた後、生成したＤ−α−アラニン量を定量した。酵素
活性は、各温度で１０分間放置する前の酵素活性を１０
０とした相対活性で表示した。結果を第４図に示した。

第４図に示したように、本酵素は６０℃以上の温度で１
０分間放置すると失活した。

実施例２゜ 実施例１と同一組成のＢＹＧ培地を２１のバッフル付フ
ラスコに１５０−ずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌
した。この培地に、ブイヨンスラントに生育したアース
ロバクター・エスピー　Ｈ−４９０４を一白金耳植菌し
、３０℃、２０時間振盪培養し、種培養液として用いた
。

一方、グルコース３％、コーン・スチーブ・リカー２％
、ペプトン０．５％、ＮａＣ１１％。

（ＮＨ４）２５０４２％、Ｍｇ５Ｏ＜・７１−１２０　
０．３％、Ｆｅ５Ｏｓ・７Ｈ−００，００１％１Ｍ　ｎ
　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２００，０００１％、ＤＬ−α−アラ
ニンアミド０，６％を含有するｐ　Ｈ７，２の培地を、
１Ｍし、３１容量のジャーファーメンタ−に１．５β分
注し、１２０℃、２０分間殺菌した。この培地に、種培
養液１５０ｍ１を無菌的に接種し、３０℃、８００　ｒ
ｐｍ。

通気量１νｖｍにて２４時間培養した。得られた培養液
を４℃で５００　Ｏｒｐｍ、　１０分間遠心分離した。

得られた湿菌体１０ｇに、ＤＬ−α−アラニンアミド４
２０ｇ　（塩酸塩として５９２ｇ）、ＮａＨａＰＯ＋　
　・　　２ｌ−（２０１５，６ｇ、　　　Ｎａ　　２Ｈ
ＰＯ４・ｔ２Ｈｚｏ　　３５．８ｇを脱イオン水に溶解
した溶液を加え、全量で２１とした。ＩＯＮ　ＮａＯＨ
にてｐ　Ｈ６，７に調整した後、反応混合液をゆるやか
に攪拌しながら３８℃、１０時間反応を行った。

反応中は、６Ｎ　　ＨＣｌにてｐ　Ｈ６，７に維持した
。

反応終了後、反応混合液中のＤ−α−アラニン量及びＬ
−α−アラニンアミド量を定量した。その結果を第２表
に示した。

第　　　　２　　　　表 り一α−アラニン　　　　　１０５　　　９９　　　９
９．３この反応混合液を１β取り、ｐＨを４．５に調整
した後、イオン交換樹脂ダイヤイオン５ＫＩＢ（ＮＨ，
＋型）（三菱化成社製）３βに通塔し、Ｄ−α−アラニ
ンおよびＬ−α−アラニンアミドを分離した。Ｄ−α−
アラニン、Ｌ−α−アラニンアミドそれぞれを含む両分
を減圧濃縮し、結晶を析出させた結果、Ｄ−α−アラニ
ン８５ｇ（光学純度９９，５％以上）、Ｌ−α−アラニ
ンアミド７５ｇ（光学純度９９．５％以上）を得た。

実施例３゜ ＤＬ−α−アラニンアミドの代わりに、Ｄ−α−アラニ
ンアミド２１０ｇを用いた以外は実施例２と同様に行っ
た。

その結果、反応終了時、Ｄ−α−アラニンが１０３ｇ／
ｆ（光学純度９９．１％）生成蓄積した。

実施例４゜ アースロバクター・エスピー　Ｈ−４９０４ヲ親株とし
て、変異株の分離を行った。親株をＮＢ培地〔粉末ブイ
ヨン（極東社製）２０ｇおよび酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ
社製）５ｇを水１１に含みＮａＯＨでｐＨ７，２に調整
した培地〕で３０℃、１日間培養した。菌体を集菌し、
０．　Ｉ　Ｎ　）リス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ６，０
）に、１０’細胞／　ｍ　ｌの濃度に懸濁し、ここにＮ
−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン（Ｎ
ＴＧ）を４００ｇｇ／ｍｌになるように添加し、室温で
３０分間処理した。

生理食塩水にて菌体を充分洗浄したのち、ＮＢ寒天培地
（ＮＢ培地に寒天２０ｇを加えた培地）に塗布し、３０
℃で１〜６日間培養した。出現したコロニーをＮＢ寒天
培地に一担塗布し、３０℃で１〜２日間培養した。

このようにして取得した菌株を、１２０℃、２０分間殺
菌したＢＹＧ培地４０ｍ１を含有する２５０ｍ１容量の
三角フラスコに一白金耳植菌し、３０℃で２１時間振盪
培養した。得られた培養液を５００　Ｏｒｐｍ、　１０
分間遠心分離し菌体を得た。得られた菌体は湿菌体とし
て２ｇ／βの濃度になるように、Ｄ−α−アラニンアミ
ド塩酸塩を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７，５）に懸濁した。Ｄ−α−アラニンアミド塩酸塩濃
度は終濃度で、Ｄ−α−アラニンアミドとして２５ｇ／
βになるように調整した。３８℃にて１時間反応後、実
施例１の条件に従い高速液体クロマトグラフィーにて、
生成したＤ−α−アラニン量を定量し、湿菌体当りのＤ
−アミダーゼ活性を算出した。

Ｄ−アミダーゼ活性は湿菌体１ｇ当りの単位数で表示し
た。対照として、アースロバクター・工スピー　Ｈ−４
９０４を用い、培地中にＤＬ−α−アラニンアミドを２
ｇ／ｌ添加した以外は上記と同様に行いＤ−アミダーゼ
活性を測定した。

このようにして、誘導物質を添加して培養した親株と誘
導物質無添加培地にてほぼ同じＤ−アミダーゼ活性を蓄
積する変異株として、アースロバクター・エスピー　Ｈ
−７０９５を取得した。

結果を第３表に示す。

第３表 ７−スａバクター−ｘスど−ｆ＠　　　　　　　　　　
　　　　６３３実施例５゜ アースロバクター・エスピー　）（−７０９５ヲ用い、
培地にＤＬ−α−アラニンアミドを添加せずに培養を行
う以外は、実施例２と同様に行った。

結果を第４表に示す。

第　　　　４　　　　表 ローα−アラニン　　　　　１０４　　　９９　　　　
９９．２実施例６゜ ＤＬ−α−アラニンアミドの代わりにＤ−α−アラニン
アミド２１０ｇを用いる以外は実施例５と同様に行った
。

その結果、反応終了時、Ｄ−α−アラニンが１０４ｇ／
ｊ！（光学純度９９．３％）生成蓄積した。

実施例７゜ アースロバクター・エスピー　Ｈ−７０９５を用い、実
施例５と同様に培養を行って得られた湿菌体９０ｇを生
理食塩水で洗浄し、遠心分離した後、蒸留水に全量で１
５０−となるように懸濁した。この懸濁液に、アルギン
酸す）　ＩＪウム（富士化学工業社製）９ｇを蒸留水３
００−に溶解した溶液を加え、得られた混合液を２％塩
化カルシウム溶液に滴下することにより、粒径約２ｍｍ
の固定化菌体を得た。固定化菌体２５ｇ／βを用いて、
実施例２と同様に反応を行った結果、Ｄ−α−アラニン
が１０５ｇ／ｌ（光学純度９８．２％）生成蓄積した。

実施例８、 アースロバクター・エスピー　Ｈ−７０９５ヲ用い、実
施例５と同様に培養を行って得られた湿菌体５０ｇを１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）に全量で２００−
となるように懸濁した。この懸濁液ヲホモゲナイザーに
ッセイーエクセル　オートホモゲナイザー）で氷冷下、
ｌ　５０００　ｒｐｍ。

２０分間処理し、菌体を破砕した。得られた菌体破砕液
を４℃で１２０００　ｒｐｍ、　２０分間遠心分離し、
上清を菌体抽出液として得た。上清１００ｍは、あらか
じめ１０ｍＭリン酸ＣＩ＃ｒ液（ｐＨ７，０）で平衡化
したＨＰＡ−７５（三菱化成社製）２０−に５℃、２４
時間接触させた。このＨＰＡ−７５を更に０．５％グル
タルアルデヒド溶液に懸濁し、４℃で１２０分間反応さ
せ、Ｄ−アミダーゼとＨＰＡ−７５を架橋させた後、１
０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液（ｐ）４７．０）で３回洗浄し、
Ｄ−アミダーゼの固定化物を得た。この固定化物の比活
性は、５５０単位／ｍｌであった。この固定化物２０ｍ
＆／ｆを用いて、実施例２と同様に反応を行った結果、
Ｄ−α−アラニンが１０４ｇ／β（光学純度９９．２％
）生成蓄積した。

発明の効果 本発明により、新規なり一アミダーゼが得られ、甘味料
または各種生理活性物質合成のための中間体あるいは合
成原料としてを用な光学純度の高いＤ−α−アラニン及
び／又は食品・医薬品として重要なアミノ酸であるＬ−
α−アラニンの製造原料であるＬ−α−アラニンアミド
を安価にかつ効率よく製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素のｐＨ依存性、第２図は本酵素の温度依
存性、第３図は本酵素のｐＨ安定性、第４図は本酵素の
温度安定性をそれぞれ示す。 第１図 第２図 温　度　（０Ｃ） 第３図 Ｈ 差　度　（０Ｃ）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記理化学的性質を有する新規Ｄ−アミダーゼ １）作用および基質特異性：Ｄ−α−アラニンアミドに
   作用してＤ−α−アラニンアミドを加水分解し、Ｄ−α
   −アラニンを生成する。 ２）至適ｐＨ：３０℃でｐＨ７〜８に至適ｐＨを有する
   。 ３）至適温度：ｐＨ７．５で４０〜４５℃に至適温度を
   有する。 ４）熱安定性：６０℃以上の温度で１０分間放置すると
   失活する。 ５）ｐＨ安定性：３０℃においてｐＨ６．５〜１０で安
   定である。 ６）分子量：５０，０００±５，０００（ＳＤＳ−ポリ
   アクリルアミド電気泳動法） ７）活性化：活性化に補酵素を必要としない。 ８）等電点：ｐＨ５．２±０．３
2. （２）アースロバクターに属し、Ｄ−アミダーゼ生産能
   を有する微生物の菌体より単離、精製したＤ−アミダー
   ゼの存在下、ＤＬ−α−アラニンアミド又はＤ−α−ア
   ラニンアミドを含有する水性媒体中で酵素加水分解を行
   わせ、反応混合物よりＤ−α−アラニン及び／又はＬ−
   α−アラニンアミドを採取することを特徴とするＤ−α
   −アラニン及び／又はＬ−α−アラニンアミドの製造法
   。
3. （３）アースロバクター属に属し、Ｄ−アミダーゼ生産
   能を有する微生物の培養物、菌体または菌体処理物の存
   在下、ＤＬ−α−アラニンアミド又はＤ−α−アラニン
   アミドを含有する水性媒体中で酵素加水分解を行わせ、
   反応混合物よりＤ−α−アラニン及び／又はＬ−α−ア
   ラニンアミドを採取することを特徴とするＤ−α−アラ
   ニン及び／又はＬ−α−アラニンアミドの製造法。
4. （４）該微生物がアースロバクター・エスピー（Ａｒｔ
   ｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）Ｈ−４９０４（ＦＥＲＭ
   ＢＰ−１６４９）である請求項２または３記載の製造法
   。
5. （５）該微生物がアースロバクター・エスピー（Ａｒｔ
   ｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）Ｈ−７０９５（ＦＥＲＭ
   ＢＰ−１７７３）である請求項２または３記載の製造法
   。