JPS6255097A - Ｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産　上の１用ノ 本発明はＬ−アミノ酸の製造法に関する。より詳しくは
特定の微生物が産生ずる酵素の作゛用により、ＤＬ−ま
たはし−アミノ酸アミドからＬ−アミノ酸を製造する方
法に関する。

Ｌ−アミノ酸は、食品添加物、飼料添加物、医薬品およ
び各種工業薬品の中間体として重要な化合物である。

眉ｍ週− Ｌ−アミノ酸は、一般に直接発酵法または、有機合成化
学的に製造されたＤＬ−アミノ酸を光学分割する方法に
より製造されているが、最近では化学合成により安価に
得られる前駆物質を酵素により転換させる、いわゆるケ
ミコエンザイマチノク（Ｃｈｅｓｉｃｏ−Ｅｎｚｙ＋ｍ
ａｔｉｃ）な方法による製法も数多く提案、実用化され
ている。

例えば、ＤＬ−アミノ酸のＮ−アシル誘導体に微生物の
産生ずるアシラーゼを作用させる方法（特公昭４１−２
２３８０号公報）、ＤＬ−アミノ酸のヒダントイン誘導
体に微生物の産生ずるヒダントイナーゼを作用させる方
法（特公昭５４−２２７４号公報°）、フマル酸に微生
物の産生するアスパルターゼを作用させる方法（特公昭
５７−１８８６７号および、特開昭５９−１４０８９号
各公ｆＩｌ）および桂皮酸に微生物の産生ずるフェニル
アラニンアンモニアリアーゼを作用させる方法（＾ｐｐ
１．ＥｎｖｉｒｏｎＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、４２７７３
（１９８１）　”ＩなどはＬ−アミノ酸のケミコエンザ
イマチソクな製法の代表例である。

しかしながら、これらの方法は、反応系が複雑であった
り、反応条件が苛酷であったり、また原料が高価である
などの問題点があり、工業的製法として、なお改善の余
地が残されている。

また、最近、微生物が産生ずる酵素により各種ＤＬ−ま
たはＬ−アミノ酸アミドから対応するし一アミノ酸を生
成させる反応について、バチルス届、バタテリジウム属
、ミクロコツカス属およびプレビバクテリジウム属の微
生物が産生する酵素Ｌ−アミダーゼを用いる方法（公表
昭５６−５００３１９号公報）、種々の酵母、細菌類が
産生ずるし一アミダーゼを用いる方法（特開昭５７−１
３０００号、同５９−１５９７８９号および同６０−３
６４４６号各公報）などが提案されている。

しかしながら、これらの方法はいずれもし一アミダーゼ
活性が弱く、多量の菌体を用いてＬ−アミノ酸の生成反
応を行った実験例であったり、ただ単にいろいろの種属
の公知菌株が種々のＤＬ−またはＬ−アミノ酸アミドを
加水分解して対応するＬ−アミノ酸を生成するというこ
とを見出した、などの知見にすぎず、微生物が産出する
酵素の作用によるＤＬ−またはＬ−アミノ酸アミドから
のし一アミノ酸の工業的製造法という観点からみた場合
、これら微生物を用いたのでは到底経済的に有利な製造
法とはなり得ない。

支１立且！ かかる状況から、本発明者らは、特に化学合成で容易か
つ安価に製造できるＤＬ−アミノ酸アミドを原料とし、
これから対応するし一アミノ酸を効率良（生成すること
のできる高いし一アミグーゼ活性をもつ酵素を産生ずる
微生物を得るべく、各地の土壌、汚泥等より菌のスクリ
ーニングを行った結果、エンテロバクタ−・クロアノセ
４Ｎ−７９０１、シュードモナスＳＰ、　Ｎ−７１３１
およびシュードモナスＳＰ、　Ｎ−２２１１の微生物の
産生ずる酵素が極めて高いし一アミダーゼ活性を有し、
本発明の目的達成に極めて有効であることを見出し、本
発明を完成するに到った。

すなわち、本発明は、エンテロバクタ−・クロ７ノセイ
（ＩＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　Ｃ１ｏａｃａｅ）Ｎ−
７９０Ｉ　Ｃ’ＲＩ工研条寄第８７３号〕、シュードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＰ、Ｎ−７１３１（
微工研条寄第８７４号〕またはシュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＰ、　Ｎ　　２２１１　（微工研
条寄第８７５号〕の微生物が産生ずるし一アミノ酸アミ
ド加水分解活性を有する酵素の作用により、一般式　　
　　Ｒ−ＣＨ−ＣＯＮＩ＋□Ｎ１１□ 〔式中、Ｒはアルキル基（炭素数１〜４）、フェニル基
、アラルキル基または置換基を存するこれらの基を表す
。〕 で示されるＤＬ−またはＬ−アミノ酸アミドから対応す
るし一アミノ酸を生成せしめること、を特徴とするＬ−
アミノ酸の製造法を要旨とするものである。

口の具　的説日 本発明において使用される微生物は、前記のように本発
明者らにより新たに分離、見出されたものであり、それ
ぞれ微工研条寄第８７３号（エンテロバター・クロアッ
セイＮ−７９０１）　、同第８７４号（シュードモナス
ＳＰ、　Ｎ−７１３１）および同第８７５号（シュード
モナスＳＰ、　Ｎ−２２１１）として工業技術院微生物
工業研究所（微工研）に寄託されている。

これら微生物の菌学的性質は以下の通りである。

Ｎ−７９０１菌株 ＋１１　　　形　　態 桿　　菌　　　　　　　０．８〜１．２　ｘ　１．０〜
１．５．１７　ｍ鞭　毛　　　　　　周毛１本以上 運動性　　　　　　十 グラム染色性　　　陰　性 （２）　　生理学的性質 硝酸塩の還元　　　十 脱窒反応　　　　　− ＭＲテスト　　　　− ｖＰテスト　　　　＋ インドールの生成　− 硫化水素の生成　　− クエン酸塩の利用　十 色素の生成　　　　− ウレアーゼ　　　　− オキシダーゼ　　　− カタラーゼ　　　　＋ 生育の範囲　　　　ＰＩ（４〜１０ 至適温度　３５〜３７℃ 酸素に対する態度　通性　嫌気性 ０−Ｆテスト　　　Ｆ ＩＪ！類から酸 およびガスの生成　酸の生成　　ガスの生成アドニトー
ル　　　−− アラビノース　　　＋　　　　　　＋ キシロース　　　　＋　　　　　　＋ グルコース　　　　＋　　　　　　＋ マンノース　　　　＋　　　　　　　＋フラクトース　
　　＋　　　　　　＋ ガラクトース　　　＋　　　　　　＋ マルトース　　　　＋　　　　　　＋ シェークロース　　＋　　　　　　＋ ラクトース　　　　＋　　　　　　＋ ラフィノース　　　＋ ラムノース　　　　＋ グリセリン　　　　＋　　　　　　＋ ソルビトール　　　＋　　　　　　＋ マンニトール　　　＋　　　　　　＋ イノシトール　　　−　　　　　　− ズルシトール　　　− ズルシトール　　　−　　　　　　− （３）　　その他 デンプンの分解　　− ゼラチンの分解　　− 尿素の分解　　　　弱 マロン酸塩の利 用　　　　　　　　　　　　　　　　十リジンの脱炭酸 反応　　　　　　　− オルニチンの脱 炭酸反応　　　　　十 フェニルアラニン の脱アミノ反応　　− アルギニンジヒ ドロラーゼ　　　　＋ β−ガラクトシ ダーゼ　　　　　　＋ ムの耐性　　　　　十 Ｎ−７１３１菌株 ＋１１　　　形　　態 桿　　菌 鞭　毛　　　　　　極毛　１本以上 運動性　　　　　　十 芽　胞　　　　　　認めず グラム染色性　　　陰　性 （２）　　生理学的性質 脱窒反応　　　　　十 インドールの生成　− 硫化水素の生成　　− クエン酸塩の利用　十 色素の生成　　　　水溶性色素　　− 蛍光色素　　　− ウレアーゼ　　　　＋ オキシダーゼ　　　＋ カタラーゼ　　　　＋ ４０℃での生育　　　− ０−Ｆテスト　　　０ キシロース　　　　＋ グルコース　　　　＋　　　　　　− マンノース　　　　　＋ ガラクトース　　　＋ ラクトース　　　　− マンニトール　　　＋ 資化性 グルコース　　　＋ フラクトース　　＋ Ｌ−アラビノ　　十 一ス シュークロース　− マロネイト　　　− エタノール　　　− トレハロース　　− ｍｅｓｏ−イノシ トール＋ β−アラニン　　＋ ＤＬ−アルギニン　＋ （３）　　その他 デンプンの分解　　− ゼラチンの分解　　− 尿素の分解　　　　− トの蓄積 アルギニンヒド ラーゼ　　　　　　− アミノベブチダ ーゼ　　　　　　　＋ 下−二λυ」１０１ （１）　　　形　　態 桿　　菌 鞭　　毛　　　　　　　　　　　極毛 運動性　　　　　　十 芽　胞　　　　　　認めず グラム染色性　　　陰　性 （２）　　生理学的性質 脱窒反応　　　　　弱 インドールの生成　− ０ｇ化水素の生成　　− クエン酸塩の利用　十 色素の生成　　　　水溶性色素　　弱 蛍光色素　　　− ウレアーゼ　　　　＋ オキシダーゼ　　　＋ カタラーゼ　　　　＋ ４０℃での生育　　　− ０−Ｆテスト　　　Ｏ キシロース　　　　＋ グルコース　　　　＋　　　　　　− マンノース　　　　　＋ ガラクトース　　　＋ ラクトース　　　　− マンニトール　　　弱 資化性 グルコース　　　＋ フラクトース　　＋ Ｌ−アラビノ　　＋ −ス シュークロース　− マロ名イト　　　− エタノール　　　− トレハロース　　− ｍｅｓｏ−イノシ トール　　　　弱 β−アラニン　　弱 ＯＬ−アルギニン　− （３）　　その他 デンプンの分解　　− ゼラチンの分解　　− 尿素の分解　　　　十 ラーゼ　　　　　　− アミノペプチダ ーゼ　　　　　　＋ 以上の菌学的性質をバージニーズ・マニュアル・オブ・
ブクミネイティブ・バクテリオロジー第８版（Ｂｅｒｇ
ｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｖｅ［１ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　８ｔｈ、　ｅｄ、）
に従って検索すると、Ｎ−７９０１菌株はエンテロバク
タ−・クロアッセイと、Ｎ−７１３１およびＮ−２２１
１菌株はシェードモナス属に属する細菌とそれぞれ同定
された。なお、Ｎ−７１３１菌株は細胞内にポリ−β−
ヒドロキシブチレートを蓄積し、・４０℃での生育およ
びアルギニンジヒドラーゼが共に陰性、脱窒反応は陽性
を示し、糖の資化性等に非典型的性状が認められたが、
本菌はシュードモナス・ソラナシエラムまたはその近縁
種と思われる。

上記微生物を培養して本発明の酵素を生成せしめるには
、炭素源、窒素源、無機塩および有機栄養源を含をする
通常の培地を用い好気的に咳微生物の培養を行えばよい
。

炭素源としてはグルコース、フラクトース、シュークロ
ース、マルトース等の糖類、酢酸、クエン酸等の有機酸
その他が適宜使用でき、その使用量は通常培地中に０．
１〜１０％（ｒｒＬ量％、以下同じ）である。窒素源と
してはペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイ
ープリカー、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の一般天然
窒素源の他に各種の無機酸または有機酸のアンモニウム
塩等が使用できる。無機塩類としてはＫＩＩｊＰＯａ、
　ＫｚｌｌＰＯｎ、　Ｎａ２１１ＰＯ４、ＮａＣｌ、Ｃ
ａＣＩ　１、Ｍｇ５０ｍ　’　ＩＨｚＯおよびＦｅ、　
Ｍｎ、　Ｚｎｓ　Ｃ。

等の重金属イオンが必要に応じて適宜使用される。

なお、この際、高い酵素活性を誘導させるため炭素数２
〜５の脂肪属アミド（例えば、アセトアミド、プロピオ
ンアミド、ブチルアミド、サクシノアミド等）を少量添
加することが効果的であり、その添加量は使用する微生
物によって若干異なるが通常培地中０．０１％以上、と
りわけ０．１〜０．５χ程度とするのが好ましい。

培養はＰ１１５〜１０、温度２０〜４０℃の範囲で１〜
５日間好気的に行う。

本発明は、微生物が産出する酵素の作用を利用するもの
であるが、その酵素作用は上記のように培養して得た微
生物の培養液、分離生菌体、または菌体処理物（例えば
菌体破砕物、菌体抽出物等）、さらには常法に従って菌
体または菌体処理物をポリアクリルアミド、カラギーナ
ン等で固定化した菌体等いずれの使用によっても得るこ
とが可能で、これらの使用形態は全て本発明に適用し得
る。

加水分解反応は、通常、前記一般式で示されるＤＬ−ま
たはＬ−アミノ酸アミド濃度０．５〜５０％（反応基質
溶液はスラリー状であってもよい）、微生物等の使用量
は乾燥菌体として反応液泡たり０．０１〜１０％、反応
温度２０〜６０℃、ＰＩ＋６〜１１、反応時間５〜１０
０時間の範囲で行う。

かくして、反応液中に生成、蓄積したし一アミノ酸は、
イオン交換法、その他公知の方法を組合せて分離、精製
し取得することができる。

本発明に使用されるＤＬ−またはし・アミノ酸アミドは
、前記一般式中、Ｒがアルキル基（炭素Ｂ１〜４）、フ
ェニ、ル基、アラルキル基または置換基を有するこれら
の基で表される化合物であり、置換基としてはメルカプ
ト基、ヒドロキシル基、７ミノ基、カルボキシル基、フ
ェニル基、インドリル基、ピリジル基、イミダゾリル基
等である。

本発明のし一アミノ酸の製造の具体例としては、例えば
、Ｌ〜フェニルアラニン、Ｌ−１−リプトファン、Ｌ−
ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン等を挙げること
ができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらの例のみに限定されるものではない。なお
、各実施例中、Ｌ−アミノ酸の確認、定量はＷｊＷＩク
ロマトグラフィーによるニンヒドリン発色位置および高
速液体クロマトグラフィーにより行った。

実施例１ 下記の組成の培地を使用し、３０℃で４８時間Ｎ−７９
０１菌の振盪培養を行った。

シュークロース　　　１％ 肉エキス　　　　　０，５尭 プロピオンアミド　０．５％ Ｈ５ この培養液１００ｍ　ｌを遠心分離し、得られた生菌体
を５０＋ｗ　Ｉ！のＴ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｌ　緩衝液
（Ｐ　１１９　）に懸濁した。

次いで、この懸濁液１ｍｌを第１表に示した各種アミド
のＯ，Ｓ％水溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ＰＨ９）
使用〕の生成アミノ酸量、Ｌ−アミノ酸／生成アミノ酸
を測定し、第１・表に示す結果を得た。

第　　１　　表 実施例２ 下記の組成の培地を使用し、３０℃で４８時間Ｎ−２２
１１菌株の振盪培養を行った。

グリセロール　　　１％ 酵母エキス　　　　０．０５χ イソブチルアミド　０．５χ 　Ｈ７ 以下、実施例１において反応時間を１〜３時間とした以
外、実施例１と同様の操作を行い第２表に示す結果を得
た。

第　　２　　表 実施例３ 下記の組成の培地を使用し、３０℃で４８時間Ｎ−７１
３１菌の振盪培養を行った グリセロール　　　１％ 肉エキス　　　　　０．５％ イソブチルアミド　０．５％ Ｈ７ 以下、実施例２と同様の操作を行い第３表に示す結果を
得た。

第　　３　　表 実施例４ 実施例１と同様にして得たＮ−７９０１菌の懸濁液１ｍ
ｊ！をＬ−フェニルアラニンアミドに加えて、４０℃で
１５分反応させたところ、フェニルアラニンの収率は７
５％で、生成したフェニルアラニンは全てＬ一体だけで
あった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）エンテロバクター・クロアッセイ（Ｅｎｔｅｒｏ
   −ｂａｃｔｅｒ　Ｃｌｏａｃａｅ）Ｎ−７９０１〔微工
   研条寄第８７３号〕またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
   ｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．Ｎ−７１３１〔微工研条寄第８７
   ４号〕またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
   ）ｓｐ．Ｎ−２２１１〔微工研条寄第８７５号〕の微生
   物が産生するＬ−アミノ酸アミド加水分解活性を有する
   酵素の作用により、 一般式▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒはアルキル基（炭素数１〜４）、フェニル基
   、アラルキル基または置換基を有するこれらの基を表す
   。〕 で示されるＤＬ−またはＬ−アミノ酸アミドから対応す
   るＬ−アミノ酸を生成せしめること、を特徴とするＬ−
   アミノ酸の製造法。
2. （２）上記一般式で示されるＤＬ−またはＬ−アミノ酸
   アミドがフェニルアラニンアミドまたはトリプトファン
   アミドである特許請求の範囲第１項記載の製造法。