JPS61207401A - 化学的に修飾したヒアルロン酸製剤とそれの動物組織からの回収法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、新規な化学的、物理化学的、レオロジー的性
質によって特徴づけられる化学的に修飾されたヒアルロ
ン酸製剤及び該製剤の新規な製造法に関する。 （従来技術） ヒアルロン酸（以下五ムと略称する）は天然に存在する
高分子量グリコサミノグリカンであって、Ｄ−グルクロ
ン酸とＮ−アセチルゲルコサミノ−２−アセトアミド−
２−デツキシーク−グルコースとがβ１→８グルコシド
結合で結合した二糖類を繰返単位としている。これらの
二糖類はβ１→４グルコシド結合によって結合し、非分
枝、非架橋の多糖類鎖を形成している。 Ｅムは演帯、目の硝子液、滑液、雄鶏のとさか。 皮膚などの動物組織中に見出される。精製エムの分子量
はその原料９分離法１分子量の測定法などで異るが５万
乃至８００万の範囲であることが文献に報告されている
〔パラズ・イー・エイ（Ｂａｌａｚｓ、　Ｅ、ム、）、
フェト、プロシード、（Ｆｅｄ。 Ｐｒｏｃｅｅｄ、）、１７．１０８５−１０９８（１９
５８））。 動物組織及び細菌培養物からのエムの回収、精製につい
ていくつかの方法が提案されている。これらの方法とし
ては次のものがある。蛋白質の酵素的消化法〔イー・デ
ィ・ティ・アドキンス（Ｅ。 Ｄ、Ｔ、ムｔｋｉｎｓ）　、シイ・エフ・フエルプス（
ｃ，Ｆ。 Ｐｈｅｌｐｓ）　　及びジエイ・ケイ・シーハン（Ｊ、
Ｋ。 ８ｈｅｅｈａｎ）、バイオケミ力に一ジャーナル（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ。 Ｊ、）、１！８．１！５５−１２６８．（１９７２）；
アール−パーマ（Ｒ，マａｒｍａ）　、アール自ニス・
パーマ（Ｌ　８．　Ｖａｒｍａ）　、ダブリュ・ニス・
アルテン（ｗ、ｓ、ム１ｔｅｎ）、エイ・エイチ・ワル
デイ−（ム、Ｉ１．Ｗａｒｄｉ）　、カーポハイド　ｖ
−ト・リサーチ（ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、Ｒｅｓ、）　＃
　８２．８８５−８９６　。 （１９７４）］、イオン交換樹脂での処理法〔ティ・シ
イ・ラウレント（Ｔ、（３，Ｌａｕｒｅｎｔ）　、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。 Ｂｉｏｌ、（！ｈｅｍ、）　、　２１６　、２６８−２
７１　（１９５６）；イー・アール−ベルマン（Ｅ、　
ｕ、Ｂｅｒｍａｎ）　ｅバイオキミカ・工・バイオフイ
ジカ、アクタ（Ｂｉｏ−ｃｈ　ｉｍ、　Ｂ　ｉ　ｏｐｈ
ｙｓ、ムｃｔａ）５８．１２０−１２２（１９６２））
、カチオン界面活性剤による沈降法〔ティ・シイ・ラウ
レン）　（Ｔ、　Ｃ，Ｌａｕｒｅｎｔ）、エム、ライア
ンＣＭ、　Ｂｙｉｎ　）、エイ、ピエトルスキーヴイチ
（ム、　Ｐｉｅｔｒｕｓｚｋｉｅｗｉｃｚ　）　、　　
／（イオキミカ、バイオフイジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ−ムｃｔａ）　、　４２　、４７６−４
８５　（１９５０）１％三ジクロロ酢酸よる処理法〔エ
イチ、ホフマンス。 オー・シュムット、エイチ・ステルクおよびエイチ・り
−プ（Ｈ，Ｈｏｆｍａｎｎ、　０．８ｃｈｍｕｔ　、　
ＩＩｌ、８ｔｅｒｋａｎｄ　Ｈ，ＫＯＯｐ）　Ｉナチュ
ールフオルシュ、　（Ｎａｔｕ−ｒｆｏｒｓｃｈ、）８
４ｃ、５０ｇ−５１１（１９７９）〕。 〔ディ、シュムットおよびエイチ、ホフマンス（Ｄ、　
８ｃｈｍｕｔ　、　ａｎｄ　Ｈ，Ｈｏｆｍａｎｎ　）　
　、バイオキミカ、バイオフイジカ、アクタ（Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ。 ｎｊｏｐｈｙｓ−ムｃｔａ）６７８　．１９２−１９６
（１９８１）３％分分離用度勾配沈降法〔ビイ・シルハ
ナタ、ジエイ・アール・ダンストン、エイ・シイ・オグ
ストン（１’、　８ｉ１ｐａｎａｔａ、　Ｊ、Ｒ。 Ｄｕｎｓｔｏｎｅ　、ム、　Ｇ、　Ｏｇａｔｏｎ）　、
バイオケミカＡ／−ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、
　）　　１０９　、４８−５０（１９６８）”］及び電
着法〔ニス・ローズマン、ディ・アール・ワトンン、ジ
エイ・エフ・ダフおよびダプリュ・アール・ロビンソン
（Ｓ。 ＲＯ８ｅｍａｎ　、　Ｄ、　Ｒ，Ｗａｔ８０ｎ　、　Ｊ
、　Ｆ、　Ｄｕｆｆ　ａｎｄ　ｗ。 Ｄ、　Ｒｏｂｉｎａｏｎ）　、アナルス　　リューｖｆ
７９　　ｆイジージズ（ムｎｎａｌｓ　Ｒｈｅｕｍａｔ
ｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｉｅｓ）　。 １５　、６７−６８　（１９５５）］である。　また数
種の異ったｌ＆処理法えば酵素的消化法とセチルピリジ
ニウムクロライドによる沈降法〔ジエイ・イー・スコツ
ト（Ｊ、　Ｌ　８ｃｏｔｔ）　、　　バイオロジカル・
ジャーナル（Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、　Ｊ、）　ｅ　６２　＃
　８１（１９５６））とを使用した方法を用いることが
できる。 ＩＩＡを生物−°、酊：原料から回収する場合に起る基
本的な問題はエムと共に動物組織から抽出される蛋白質
及びその他の生物り的・・高分子物から高分子物のＲ人
を分離するさいに起こる。原料によっては好ましくない
高分子物の量が非常に多く％Ｈ人量の何倍をも超える場
合がある。上述のＨＡＧ！Ｉ収法はすべて実験室で用い
られるが、これらの方法には夫々固有の種々の欠点があ
るので大規模製造にはほとんど用いることがで会ない。 工業的規模での最も進歩したＲ人の回収１．精製法はＥ
、ム、パテズ（Ｅ、ム、　Ｂａｌａｚｍ　）の米国特許
第４，１４１，９７８号に記載されている。　この方法
によると蛋白質の含有量が０．５重量％以下で分子量が
１２０万の超純品のエムが雄鶏のとさか或いはヒ）Ｉｆ
帯からの水による抽出で得られる。蛋白質類及び他の物
質はｐＨ値を変えて数回クロロホルムで抽出することに
よって除かれる。水抽出物のクロロホルム抽出に於いて
は変性蛋白質及び他の物質が＃！丈る界面層が形成され
る。或種の物質例えば脂肪は多分クロロホルム相に溶解
されている。この方法は又蛋白質分解酵素例えばプロナ
ーゼによる処理法を併用してもよい。数種の正に苦心の
作とも言える処理法の組合せによって発熱性物質を含ま
ず非炎症性のＨＡフラクシ目ンが得られる方法が開発さ
れた。この生成物は「ヒアロン（Ｈｅａｌｏｎ　）　Ｊ
なる登録商標で１％落液として現在市販されてセリ、ビ
スコ外科手術（ｖｉｓｃｏｓｕｒ−ｇｅｒｙ）　　に用
いられ組織の機械的損傷を防止し、スペース（５ｐａｃ
ｅ）を提供し外科手術中に於ける組織への触診を貯容し
ている〔イー・エイ・パラズ（Ｅ、人、　Ｂａ１ａｚｓ
　）　、　　ヒアロン（Ｈｅａｌｏｎ）　、ジエイ・ウ
ィリー・アンド・サン（Ｊ、Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ８ｏｎ
）、ニューａ−り、１９８８．ｐｍ）５−２３］。 （発明の構成） 本発明は抽出に先立って動物組織中の■ムをその場で化
学的に修飾するための新規な方法を提供するものであり
、化学的に修飾された■ムを動物組織から回収、精製す
る新規な方法を提供するものであり、更に新規で超純粋
で発熱性物質を含まず、且つ非炎症性の化学的に修飾さ
れ、ＨＡポリマー鎖に共有結合で結合したアルデヒド架
橋基を約０．００５乃至０．０５重量％含んでいるＨＡ
を提供するものである。 本発明は、ＨＡを、水性媒体中で蛋白質やＨＡと反応す
る物質で動物組織を処理することにより組織から抽出す
る前に、その場で化学的に修飾できるという発見に基づ
くものである。これらの物質にはホルムアルデヒド、グ
ルタルアルデヒド。 グリオキサール等が含まれる。このその場での化学的修
飾は五ム高分子の最初の構造９分子の大きさ９分子間及
び分子内相互作用を、ひいては修飾された生成物から作
られた溶液のレオロジー的性質を実質的に変えてしまう
事が判った。それ故Ｅここの化学的修飾されたＨＡは新
しい名称で呼ばれるのが相当である。本願発明の発明者
らはこの物質を「ハイラン（Ｈｙｌａｎ）Ｊと呼ぶこと
にした（以下ＨＹと呼称する）。五ムが動物組織から抽
出される際、通常は一緒に大量の蛋白質が溶出して来る
。この蛋白質の量は動物組織の性質や抽出法のパラメー
タに実質上依存して変り得る。雄鶏のとさかからＨＡを
抽出する場合、ＨＡ対蛋白質の重量比は１：０．５から
１：４まで変り得る（イー・エイ・パラズの米国特許第
４．８０８．６７６号）。 結局動物組織からの純Ｈ人の回収における第一の問題は
蛋白質の除去である。この発明の発明者らは動物組織の
前記予備処理によって、その処理を行わない場合よりも
実質的に低い蛋白質含量のＨＹの水抽出物が得られるこ
とを見出したのである。 この組織の処理の間に起る化学的な現象の正確な処は充
分には判らないので、本発明は特定の化学反応によって
限定されてはならない。組織中の蛋白質と処理混合物中
の試薬との間の化学反応の結果として、蛋白質は変性さ
れ、組織中に固定され、それ放火の水抽出操作に於いて
不溶性になるものと考えられる。 本発明の目的のためには含水媒体中で蛋白質とＫｒ８す
るいずれの物質も用いることができる。その最も有利な
物質はホルムアルデヒドであることが判った。その他の
アルデヒド例えばグルタルアルデヒド又はグリオキザー
ルも本発明の方法に使用できる。 組織の処理は試薬の水溶液中で行うことができる。しか
しこれを行った場合は「ハイラン」が水に良く溶けるた
めに実質的にロスが起る。そのため組織の処理は水と水
溶性有機溶媒との混合物中で行うのが良い。その溶媒は
蛋白質固定化に用いる試薬と反応するものであってはな
らない。これらの溶媒の例としてはアセトン或いはメチ
ルエチルケトンの如き低級ケトン、エタノール或いはイ
ソプロパノールの如き低級アルコール、ジメチルホルム
アミド、ジメチルアセトアミド、或いはジメチルスルホ
オキシドの如き非プロトン性溶媒などがある。そのよう
な溶媒は通常８０〜９０！量％以上の大量の水を含んで
いる組織と混合すると水−溶媒混合物が形成される。そ
の混合物中の水−溶媒の比は溶媒／組織の比を変え或い
はその混金物に水を加えることによって所望のレベルに
調節できる。好ましい水／溶媒比はＨＹが組織の処理に
用いる該混合物に溶解してはならないという意味に於い
てＥ［Ｙの溶解性によって決められる。 ＨＹの溶解性は用いる溶媒の種類、水／溶媒比、混合物
中の電解質の存在及び濃度、及び混合物のｐＨに依存す
る。ＨＹの溶解性は混合物中に電解質を加えると実質的
に減少することがある。水−溶媒混合物に可溶で、混合
物に所望のｐＨを与えるいずれの電解質も使用できる。 例えばアセトンを溶媒に使用した際には酢酸ナトリウム
を可溶性電解質として好都合に使うことができる。 組織処理用混合物の組成は組織の性状、使用する溶媒の
種類、電解質の種類などによって広範囲に変えることが
できる。上述の如く、組織からのＨＹは処理用混合物に
溶解してはならないが、処理混合物は試薬と組織高分子
物との反応を容易ならしめるため組織を膨潤させるのに
充分な水を含有していなければならない。この発明の発
明者らはＨＹの原料として雄鶏のとさかを用いた場合、
処理混合物の組成は鶏冠からの水を考慮に入れて下記の
範囲の重量％でよいことを見出した。すなわち水＝１０
〜５０、溶媒４０〜８５、電解質０〜２０、試薬０．２
〜１Ｇである。所望によりいくつかの異なる溶剤を同じ
処理混合物に使用できる。 この発明の発明者らは処理混合物中にクロロホルムの如
き水と不混和性の溶媒の少量を使用するのが有利である
ことを見出した。前記混合物のこのような溶媒の含有蓋
は０．５〜１０重量％であってもよい。 処理混合物のｐＨｌ［は試薬の性状、該混合物の組成、
処理温度及び時間によって変えることができる。本発明
による動物組織からのＨＹを回収する際、次の事を考慮
することが非常に重要である。 いくつかの試薬、例えばホルムアルデヒドはＨＡ高分子
物のヒドロキシ基と低いｐＨで反応して水不溶性の架橋
したポリマーを生成することができる。比較的高いｐＨ
の媒体中で長時間処理するとＨＹの分解を招き、低分子
量のポリマーしか回収できないことがある。本発明に於
いてアルデヒド型の試薬を使う際、ｐＨは中性附近例え
ば４〜１０の範囲で行うのが最も良い結果が得られる。 処理混合物の組織に対する比は広い範囲内で変えること
ができる。通常下限は、組織が、−雄鶏のとさかの場合
著しくかさだかであるが一処理混合物で少なくとも充分
に覆われねばならないということを条件にして決められ
る。上限は経済的観点から選ばれる。本発明による雄鶏
のとさかの処理に於いては処理混合物と組織の比は組織
の乾燥重量基準で通常１Ｇ＝１以上である。 温度は本発明による処理の効率に影響する。しかし、Ｈ
Ｙは高温で加水分解しやすいため、高分子量の生成物を
得るためには室温又はそれ以下で処理するのが好ましい
。 処理を完了するために必要な時間は処理混合物の組成、
組織の性状、温度など多くの因子に依存する。処理の制
限要因は組織の薄片中への試薬の拡散であろうと思われ
る。その故に組織薄片の大きさは一つの重要なパラメー
タである。この発明の発明者らは１〜８Ｍ厚の小片にス
ライスされた雄鶏のとさかの処理に於いて、処理時間は
４〜２４時間は４〜２４時間にできることを見出した。 以上の処理を経た組織は次いで溶媒又は溶媒／水混合物
で洗滌し、組織から過剰の処理混合物を除去する。組ａ
ｌ＆理用の混合物中で使われたのと同じ溶媒を使用する
のが便利である。洗滌回数は任意であるが、１回の洗滌
で満足な結果が得られた。 次いで洗滌した組織は直接水で抽出してＨＹを回収する
。抽出の効率は水／組織比、抽出媒体のｐＨ１温度及び
時間に依存することを見出した。 又処理済組織の抽出効率は、最初に処理組織を乾燥させ
ても理及び洗滌工程で使われた溶媒を除去することによ
って実質的に増加させることができることも見出された
。組織を元の重量の１７４から１７２まで乾燥させると
最高の結果が得られる。 抽出工程での水／組織の比はいくつかの考慮を行って選
択される。先ず第一に、抽出生組織を覆うに充分な液相
が存在すべきである。−力水の量は、次の工程での沈澱
剤の量を減らせるよう抽出液中のＨＹの濃度を出来るだ
け高く維持するために、あまり多くてはならない。雄鶏
のとさかの場合について、水の組織に対する比率は未処
理とさかの重量基準で２〜６であるのが好ましい事を見
出した。 抽出媒体の１）Ｈは最終生成物の希望品質によって中性
、酸性、塩基性のいずれかに保つことができる。超高分
子量の生成物を得るためには抽出媒体のｐＨは６〜８．
５の範囲にすべをであることが見出された。高いＩ）Ｈ
にすれば抽出液中のＨＹ濃度は増大するが同時に生成物
の分子量を低下させ、且後に詳述する如くポリマーの他
の性質を変化させることになる。いずれにしても、抽出
工程中でｐＨを調節することによって最終生成物の性質
を希望する方向へ都合よく規制することができる。 ＨＹの高温での分解がポリマーの分子量を実質的に低下
させるので、２５℃以下の温度で処理済組織の抽出を行
うめが好ましい。 処理済組織からＨＹを最大限に抽出するに必要な時間は
ｐＨ９液／組織比、撹拌強度の如き他の抽出パラメータ
によって実質的に変化する。雄鶏のとさかからの水によ
る抽出に於いて処理済とさかを６時間から数日間までの
間で抽出する時に良い結果が得られることを見出した。 処理済組織と抽出媒体との混合物は抽出の間撹拌するこ
とが出来るし或いは何らの撹拌もせずに放置することも
できる。撹拌は明らかにＨＹ分子が組織から抽出液へ拡
散するのを増大させる。他方激しい撹拌はＨＹの分解と
それによる分子量の低下を招来する。加つるに激しい撹
拌は組織の崩壊を招き抽出液から組織を分離するのを困
難ならしめることが明らかになった。従って抽出工程は
撹拌しないか、極めて遅いゆるやかな撹拌の下で行うの
が好ましい。 抽出後組織は濾過、遠心分離、傾瀉等を含む各種の通常
の方法によって抽出液から分離される。 最も簡単で経済的な方法は濾過であることが分かった。 出発物質として用いた組織の種類によっては二段濾過を
用いるのが好ましい場合がある。従って雄鶏のとさかの
場合、組織の大きな切片はナイロンメツシュで容易Ｋ濾
過分離でき、例えばセルロース質の緻密な濾過材でＦ遇
すれば抽出液の良好な精製ができる。 抽出液中のＨＹ濃度は抽出中の１）Ｅ［、時間、液／組
織比、撹拌の強さといった多くの因子に依存しているが
、通常０．８〜８．０　ｍｌ／ｍｌ　（１）範囲である
が時には更に高≦なる。ある場合には、抽出液中のＭＹ
濃度が低いときに、第二回目の組織の抽出を行うのが望
ましいことが分かった。又第二回目の抽出液から沈澱し
た生成物は通常第一回目の抽出液からのＭＹに比して高
分子量であることも判明した。これは、ＨＹの低分子量
画分は組織から抽出液に拡散し易く、第一回目の抽出液
から沈　“澱させた生成物には、これらの低分子量画分
を多く含んでいるという事実で説明できる。 出来る限り高い収率を得るために二面以上の抽出を行う
ことができるが、抽出を繰返す毎に抽出液中のＨＹ濃度
は低下する。 ＨＹは前記Ｆ液から公知の方法で回収できる。 最も都合の良い方法は水混和性溶媒例えばγセトン、エ
タノール、イソプロパノール等を加えて沈澱さす方法で
ある。この沈澱法は酸例えば塩酸。 硫酸、燐酸などの存在下か或いは中性電解質例えば酢酸
ナトリウム、塩化ナトリウム及びこれらの塩類の存在下
で行うことができる。ＨＹ及びその塩類は通常白色の繊
維状又は粉状の物質として沈澱する。この沈澱物は沈澱
に使用したのと同じ溶媒又は生成物を溶解しない他の溶
媒混合物、例えばエーテルで洗滌できる。洗滌法生成物
は通常の手段で乾燥でき、或いは溶媒例えばアセトン、
エタノールなどの層中で貯蔵することができる。又Ｆ液
を凍結乾燥することもできる。 従来技術として知られＨム精製に用いられている工程が
本発明方法にその範囲を限定することなく附加されても
よいことは明らかである。例えば発熱性物質、炎症性物
質を除去するために、ＨＹは溶解せず脂肪蛋白質、糖脂
質もしくは糖脂肪蛋白ｊ！ｉ　（ｇｌｙｃｏｌ　１ｐｏ
ｐｒｏｔｅｉｎ）が可溶か或は分離出来る良く知られた
溶媒例えばクロロホルムによる抽出法を用いることがで
きる。 本発明による方法によれば広範囲に変化した性質をもっ
たＨＹ生成物が得られる。後述の性質が測定された。引
−用した方法は本発明によって得られた生成物の特性を
特徴づけるのに使用された。 溶液中のＨＹ濃度は自動化されたカルバゾール法を用い
たヘキスロン酸検定法〔イー・エイ・バラス、ケイ・オ
ー・ペルンツエン、ジエイ・カロツサおよびディ・エイ
・スワン（Ｅ、ム、Ｂａ１ａｚｓ。 Ｋ、Ｏ，Ｂｅｒｎｔａｅｎ、　Ｊ、Ｋａｒｏｓｓａ　ａ
ｎｄ　Ｊ）、ム、　８ｗａｎｎ）、アナリテイカル、バ
イオケ電ストリ−（ムｎａｌｙｔ。 Ｂｉｏｃｈａｎ、）、１２，５４７−５５８（１９６６
））で測定した。ヘキソサミン含量は自動化比色定量法
〔ディ・エイ・スワンおよびイー・エイ・バラス（Ｄ、
ム、　８ｗ５ｌｎ　　ａｎｄ　Ｅ、ム、Ｂａｌａｚｇ）
、　　バイオケ電力、バイオフイジカ、アクタ（Ｂｉｏ
ｃｈａｎ。 Ｂｉｏｐｂｙａ、ムｃｔａ）、１１１０．１１２−１２
９（１９６６）］で測定した。Ｈム溶液の蛋白質含量は
フェノール試薬法〔ロウリーら（Ｌｏｗｒｙ　ｅｔａｌ
）、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・　ケミストリ
イ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｏｈ他、）、１９８．２６５−２７
５　、（１９５１）］で測定した〇生成物中のホルムア
ルデヒド含量は約０．ＩＩの試料を１０％硫酸水溶液１
０ｍ１！中で２時間煮沸し、次いで得られた溶液を水蒸
気黒部して遊離のホルムアルデヒドを除去し、溜出物中
のホルムアルデヒドをクロモトロブ酸を用いた比色定量
法で測定した〔ニス・ジエイ・ボイドおよびエム・エイ
、ローガン、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリイ、１４６．２７９（１９４２）（Ｍ、　Ｊ、　
Ｂｏｙｄ　ａｎｄ　Ｍ、ム、　Ｌｏｇａｎ、　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ　。 ０ｈａｎ　、　）　］。 極限粘度１に’（ｌｉｌ限粘度）はｌｉｍ（ｎ／ｎｏ−
ｔル℃で定義される。但しｎ及びｆｉ□は夫々溶液及び
溶媒の粘度であり、０は、Ｆ／ＣＣで表わしたＭＹの濃
度である。測定は０．２０モル濃度食塩水溶液中でウペ
ロード毛管型稀簿溶液粘度計で行った。粘度平均分子量
は式（ｎ）　＝　０．０２２３　Ｍ””で計算する〔ア
ール・シイ、クリ−ランド、ジエイ・エル・ワング、パ
イオポリマース　９．７９９（１９７（ｂ）（Ｒ，０，
０１ｅｌａｎｄ　ａｎｄ　Ｊ、Ｌ、Ｗａｎｇ、　Ｂｉｏ
ｐｏｌｙｍｅｒｓ）ｌ。 重量平均分子量は６８！、８ｎｍにセットされたヘリュ
ウムーネオンレーザーを備えた「クロマティックｘ　（
ｃｈｒｏｍａｔｉｘ）　ＩＣＭＸ　−６４装置を用いて
小角レーザー光散乱法（ｌｏｗ　ａｎｇｌｅ　ｌａｔｅ
ｒｌｉｇｈｔ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）
ＪＣより測定される。 重量平均分子量はその外にも分析的超遠心法によって測
定される沈降常数及び拡散常数からも計算できる。 動的光散乱法は比較的高濃度のＭＹ溶液中での分子の凝
集度を測定するのに使われる。この方法によって、溶液
中の相当法直径（Ｅ８ｆｌ）の分布が判る。 レオロジー的性質はボーリン　レオメーターシｘテム（
Ｂｏｈｌｉｎ　Ｒｈｅ＊ｍｅｔｅｒ　８ｙｓｔｅｍ）　
　で測定される。同システムはコンピューター化された
レオメータ−であって粘度、振動、緩和の８つのモード
で動作できる。ＨＹ浴溶液ついて次のパラメータ、すな
わち広範囲の剪断速度下の粘度、並びに種々の振動周波
数及び緩和時間に於ける動的粘度、動的貯蔵弾性率及び
動的損失弾性率が測定される。 上述の如く本発明の生成物（ＨＹ）はエムとホルムアル
デヒドの如き架橋剤とのその場での化学反応の結果得ら
れた新規な高分子物である。ＭＹの化学分析の結果、ホ
ルムアルデヒド含有混合物で処理した雄鶏のとさかから
得られる生成物中の結合ホルムアルデヒドの含有量は処
理の各種のパラメータに依存するがＨＹポリマーの重量
基準で０．００５〜０．０２重量％の範囲内であること
が明らかになった。 生成物中の結合ホルムアルデヒドの存在は放射性同位元
表でラベルされたホルムアルデヒド（１４０Ｉ［！（ｂ
）　　を使用したあ理の実験によっても証明された（後
記実施例１２を参照）。実験の結果は本発明によって得
られた生成物が繰返し沈澱をしても、もしくはポリマー
溶液の徹底的透析（ｅｘｈａｕｓｔｉｎｅ　ｄｉａｌｙ
ｓｉｍ）　によっても除去し得ない結合ホルムアルデヒ
ドを含んでいることを示している。これは生成物のポリ
マー分子にホルムアルデヒドが、共有結合で結合してい
ることを証明する強力な証拠である。ホルムアルデヒド
が明確に五ムと結合しているか否かを知るために、■人
を、細菌もしくはリーチ（１ｅｅｃｈ）のヒアルロニダ
ーゼ、特に■ムを分解する酵素類で処理した。 この処理の結果はホルムアルデヒドの顕著な量がＨＹ高
分子物に直接共有結合で結合していることを示した。 本発明によって得られる生成物中の蛋白質含量は乾燥ポ
リマーの重量基準で通常０．５％を超えることはなく、
０．１％程度に少すくシたりさらに少なくすることがで
きる。 ■ム高分子に架橋剤を共有結合的に結合させることによ
る五ムの化学的修飾、換言すれば該ポリマーの元々の構
造の変化は、分子量や分子の大きさのごとき物理化学的
パラメータ、その上分子間相互作用およびポリマー溶液
のレオロジー的性質に実質的に影響を与える。 本発明によりＨＹの橿めて高い分子量のものが得られる
。従って極限粘度数はＴ、０００ｃｃ／Ｉ以上すなわち
粘度平均分子量にして約６×１０に達する。光散乱法に
よる重量平均分子量は１８×１ｆにも達する。この重量
平均分子量と粘度平均分子量との不一致は後述する如く
極めて大きな意味をもっていることが明らかになった。 例えばＩ　Ｘ　１０’或いはそれ以下の如き実質的に低
い分子量のポリマーも所望により本発明の方法によって
容易に作ることができると理解されるべきである。同様
にＨＹを、回収、精製の任意の工程でそのポリサッカラ
イド鎖のグルコシド結合を切断することが知られている
試薬に＠露させれば、いずれの所望の分子量のポリマー
も得ることができる。上記公知の切断剤とはヒアルロニ
ダーゼの如き特定の酵素、フリーラジカル発生系、剪断
力、熱１強アルカリ。 強酸などである。 ＨＹの溶液中での部分比容積（ｐ　、ａ　ｖ　）　（ｐ
ａｒ−ｔｉａｌ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｖｏｌｕｍｅ）は
溶液のイオン強度に依存する。それはｏ、ｉｓモル食塩
含有の水によるＨＹ溶液（濃度０から６．５　ｍｇｉｒ
ｎｌ　）のデンシトメトリイ（ｄｅｕｓｉｔｏｍｅｔｒ
ｙ）で測定され、０．６２７　ＣＣ／ｌｉであることが
判った。 ０．１６モル食塩水に溶解したＨＹの１％溶液の試料に
ついての相＠球直径の分布を第４図に示した。そのデー
タによると、ＨＹは極めて高度に凝集した形態で存在し
、しかもこの凝集体は安定で沈降することはないことは
明らかである。 本発明により作られた実機的な超高分子量生成物のレオ
ロジー的性質は第１〜８図に示しである。 この生成物は顕著な粘弾性的性質を有する溶液（０，５
重量％及びそれ以上）を作ることが分かった。 下記のパラメータが該ポリマー溶液の弾性的性質を最も
良く表わす。すなわち動的貯蔵弾性率（Ｇ’）、りａ２
オーバ一点（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ　ｐｏｉｎｔ）（動
的貯蔵弾性率ｄが動的損失弾性率ｄより大きくなる点）
の周波数位相角、緩和時間である。 ＨＹは極め粘稠な水もしくは電解質水溶液による溶液を
作る。溶液の粘度はポリマーの濃度、電解質濃度、温度
に依存し、剪断速度によって減少する、すなわちＩＩＹ
溶液は実質的に擬似可塑性（ｐｓｅｕｄｏｐｌａｓ　ｔ
　ｉ　ｃ　ｉ　ｔｙ）をもっている。 ＨＹ溶液のレオロジー的性質を考える場合、これらの性
質が他のポリマーの場合と同様生成物の分子量に大きく
依存することを理解しておくべきである。上述の如＜Ｈ
Ｙは広範囲の分子量のものが得られ、レオロジー的性質
もそれに従って変る。 かくして超高分子量生成物（Ｗ限粘度数４５００Ｃの７
以上）については０．１５モル食塩水による１重量％溶
液の粘度は剪断速度０．０５５　　で１０００Ｐａ、ａ
以上に達するが、一方極限粘度数が約１０００　ｃｃ／
Ｉのポリマーの１重量％溶液は約２　Ｐａ、ａ、にすぎ
ないことが分かった。ＨＡ浴溶液弾性的性質もポリマー
の分子量に依存することが分かった。その故に超高分子
量ＨＹの０．１６モル食塩水の１重量％溶液の動的貯蔵
弾性率ｄは周波数０．０１ヘルツで約４０　Ｐａである
が、一方極限粘度数が約１０００　ＣＣ／ＩのＩ’［Ｙ
溶液では約０．２Ｐａである。ポリマー溶液の弾性的性
質と粘性的性質との比を極めてうまく特徴づけるクロス
オーバ一点の周波数は、ポリマーの分子量がほぼ１．５
×１０　から８×１０の範囲及びそれ以上の場合、８人
の０．１５モル食塩水による１重量％溶液について２５
℃で通常０．０２５ヘルツ以下である。 ＨＹ試料及び溶液の物理化学的及び粘弾性的性質を公知
の方法で得られたＨ人生放物の同じ性質と比較して第１
表及び第４図と５図に示した。比較に用いた生成物は雄
鶏のとさかから水抽出し、数回のクロロホルム抽出を行
う所謂セバグ（ｓｅｖａｇ）法〔シイ・ブリックス、オ
オ・シェルマン、アルキ７・フォア・ケミ、ミネラル　
ゼオル、（Ｇ。 Ｂｌ　ｉｘ　、　０．８ｈｅｌ１ｍａｎ　、　Ａｒｋｉ
ｖ　ｆｏｒ　Ｋｅｍｉ　。 Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｇｅｏｌ、）、　１９　Ａ　、　１　
（１９４５）　）で脱蛋白質して回収した五ムである。

【以下余白、次頁に続く。】

第１表　ＭＹとＨＡ試料の物理化学的及びレオロジー的
データの比較 パラメータ　　　　　　　　　　　　　ＨＹ　　　　Ｈ
Ａ極限粘度数ｃｃ／ｌ／　　　　　　　　　　　　４，
７２９　　８．５６２粘度法分子量データ刈０’　　　
　　　　　８．２３　　　２．８０光散乱法分子量デー
タＸＩＯ’　　　　　　　　１８．８０　　　２．８５
沈降、波数法分子量データＸＩＯ’（ＰＳＵ）　　　　
　１Ｂ、５０　　　２．１４剪断粘度（剪断速度０．０
５５−’）Ｐａ、ｓ　　９６９　　　８０５クロスオ一
バ一点周波数　　ヘルツ　　０．００５６　　０．０８
５緩和時間（弾性率半減）　　　　　　　　５８　　　
１９位相角　　　　　　　　　　度 周波数０．００２ヘルツ　　　　　　　　５８．７　　
　７６１　１０　ヘルツ　　　　　　　　　　　８，５
　　　１２第１表及び第４図のデータはＨＹと五ムとの
明瞭な差異を示している。先ず第一に公知の生成物では
粘度平均分子量と重量平均分子量とは殆んど同じ値であ
るが、重量平均分子量の方がわずかに低い）、本発明の
生成物は重量平均分子量が粘度平均分子ｌの約４倍と大
きい。第二に、ＨＹ浴溶液部分比容積（Ｐ８Ｖ）の値が
Ｈムと比べて大きいということは、ＨＹポリマーの方が
より大きな大きさを有することを証明している。第三に
Ｉ［Ｙポリマーは溶液中で凝集して■ム′溶液と比較し
て実質的により大きい凝集体を与え、このことはＨＹ高
分子がより大きな大きさを有するだけでなく、より強い
分子間相互作用を有することを示している。最後にＨＹ
浴溶液実質的に、Ｈ人の同濃度溶液より粘稠で弾力的で
ある。その大きな粘度は高い粘度平均分子量によるとし
ても、測定された劇的ともいえる弾力性の増加は同じ理
由で説明するのが困難である。 これらの観察の結果組織からの抽出に先立ってその場で
のヒアルロン酸の化学的修飾はポリマーの化学的組成を
ほんの僅かに変えるだけであるが、同時に物理化学的パ
ラメータ及びレオロジー的性質にいくつかの劇的変化を
与えるという結論が得られた。この変化は化学的組成の
変化が高分子構造の何らかの重要な変化に相当する際に
起るだけである。 溶液中の五ム高分子の形態は種々の方法で研究されてお
り、この問題についての文献も多数にのぼる。これらの
研究は溶液中のポリマー濃度が比較的低い（例えば０．
１％）場合ポリマー分子は伸びたランダムコイル形態で
相互に絡み合っていることを示している。高濃度では溶
液は高分子鎖の三次元連続網状構造を含んでいると信じ
られる。 五ム高分子中のグルコシド結合は相当の硬さをもってい
ることが見出された。溶媒と溶質との相互作用、多くの
Ｈム製剤中に存在する少量の蛋白質との相互作用及び分
子内相互作用の如き各種の機構がこれらの現象を説明す
るのに提案されている〔例えばイイ・エイ・パラズ、ヒ
アルロン酸の物理化学、フェト、プロシード０．１７．
１０８５〜１Ｇ９８（１９５８）（Ｅ、人、Ｂａ１ａｚ
ａ、Ｆｅｄ。 Ｐｒｏｃｅｅｄ、　）参照〕。幾人かの著者はＬ（Ａ高
分子に二重らせん構造を提唱し、二重らせんセグメント
がＨ人溶液の異常なレオロジー的性質を与える架橋結合
の役割を演することができると示唆した〔シイ・エム・
ディア、アール・ムアーハウス。 ディ・ディ、リース、ニス、アルノット、ジエイ・エム
・ガスおよびビイ・エイ、バラズ、サイエンス、１７９
，５５０−５６２（１９７２）（ｃ，Δ１゜Ｄｅａｅ　
Ｒ，Ｍｏｏｒｈｏｕｓ、　Ｄ、Ｄ、　Ｒｅｅｓ、８．ム
ｒｎｏ　ｔ　ｔ　。 Ｊ、　Ｍ、　Ｇｕ８ｓ　ａｎｄ　Ｅ、ム、　Ｂａ１ａｚ
ｓｓ　５ｃｉｅｎｃｅ）　；ニス・アルノット、エイ・
アール・ミトラおよびニス・ラグナタン、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジイ、１６９．８５１〜
８７２゜（１９ＪＨ１）（８，ムｒｎｏｔｔ、　　Ａ、
Ｒ，Ｍｉｔｒａ　　　ａｎｄ　　　８゜Ｒａｇｈｕｎａ
ｔａｎ　、　Ｊ、　Ｍｏｌ　、　Ｂｉｏｌ　、　）　］
。 これらの研究及び考察について考えてみて、この発明の
発明者らは本発明による生成物（ＨＹ）は、蛋白質架橋
固定化剤で組織を処理する間に導入された追加の架橋結
合を含有できるという仮説に到達した。本発明で使用す
る反応剤例えばホルムアルデヒドは種々の化学基に対し
て著しく反応性であり、その反応性はｐＨ，温度、濃度
などの反応条件に実質的に依存する。ヒアルロン酸のヒ
ドロキシ基は前記処理条件下ではこれらの試薬と明らか
に反応しない。何故ならば処理して得られた生成物は常
に水溶性であり、それ故かなりの架橋度のポリマーを含
んでいないからである。処理中に、ポリマーに導入され
る追加の架橋結合の量は多分、ポリマーを不溶化するの
には不充分な少ない量であるが、高分子間の相互作用と
それによって起るポリマー溶液の弾性を顕著に増加させ
るに充分なものである。処理剤とのかかる反応の候補は
ヒアルロン酸のアセタミド基、エム中に少量存在し得る
アセチル化されていないアミノ基、並びに処理中の組織
の細胞間マトリックス中に存在する蛋白質のアミド基、
アミノ基および他の活性基である。エムのアセタミド基
自身が分子間架橋を形成するということはほとんど考え
られない。 蛋白質とホルムアルデヒドとの反応の研究に於いて〔例
えばジエイ・エフ・ウォーカー（Ｊ、Ｆ。 Ｗａｌｋｅｒ）　、　　ホルムアルデヒド、ラインホル
ト出版社、ニューヨーク、１９５８Ｐｐ８１２−８１７
を参照〕、蛋白質のアミド基自身は架橋を形成できず、
架橋形成の可能性の最も高い反応の一つはホルムアルデ
ヒドとアミノ基とが反応してＮ−メ、チロールアミノ基
を与え、これが次いでアミド基と反応する反応であるこ
とが見出された。 ノ基との反応が含まれる　〔ビイ・エイ・パラズ。 フェト、プロシード、２５　１８１７−１８２２（１９
６６）（Ｅ、ム、　Ｂａ１ａｚｓ、　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏ
ｃｅｅｄ、））。 第二の予想される機構は、架橋反応への蛋白質又はポリ
ペプチドの関与を示唆している。文献には、蛋白質又は
ポリペプチドは五人分子に共有結合で結合している〔ユ
ーコ、ミクムータカガキおよびビイ・ビイ・ツール、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリイ、２５
８　、（１６）。 ８４６Ｂ−８４８９（１９８１）（ＹｕｋｏＭｉｋｕｍ
−Ｔａｋａｇａｋｉ　ａｎｄ　Ｂ、Ｐ、　Ｔｏｏｌｅ、
　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）］とか、或いは別のしか
たで五人分子と会合することができるという報告が続い
ている。この場合、架橋結合は一つのＨＡ高分子とひと
つの蛋白質成分と別のエム高分子と９間に形成されるか
、或いは２つのＨＡ高分子に共有結合で結合した蛋白質
問に形成することができる。 これらの機構のいずれも本発明を限定するとみなさるべ
きではない。本発明の生成物中に共有結合による架橋結
合を少量導入する他の機構があり得ることは理解さるべ
きである。 いずれにせよ、本発明の本質的な特徴は、おそらく、■
人高分子中に少数の架橋結合を導入することによって、
■ム回収工程中に、組織内のＨムを化学的に修飾するこ
とであり、その化学的修飾の程度は、Ｈムの有利な性質
例えば水性媒体中で高粘度の溶液を与える性能、生物的
適合性などに悪影響を与えることなくポリマー溶液の弾
性的特性を実質的に増大させるに充分なものである。 本発明により製造される化学的に修飾されたヒアルロン
酸すなわちＭＹは医学の分野や化粧品の多くの用途、例
えばビスコ外科の道具、各種の素材の生物的適合性を改
善するための被覆剤、各種医薬製剤の一成分、肌の手入
れ用製品などに利用できる。このポリマーの改良された
性質例えば増大された弾力性はＨＹの使用時に大きな利
益をもたらす。 又、ＨＹは、慣用的な架橋剤による架橋反応の如き化学
的修飾法を更に附加することによって得られる新規生成
物用の出発物質としても使用できる。本発明による化学
的に修飾されたＨ人およびその溶液の特別な性質はいく
つかの珍らしい性質を持った上記の附加的に化学的修飾
された生成物を得る機会を与えてくれることが判った。 か（して本発明による生成物をアルカリ性溶液中ジビニ
ルスルホンで架橋することによって水不溶性のゼリー状
物質が得られることが判った。この物質は高度に膨潤し
たゲルである。このゲル中のポリマーの濃度は水或いは
電解質の如き種々の低分子量物質の水溶液であってもよ
い液相の組成に依存する。生理食塩水（０，１５モル食
塩水溶液）の場合、ポリマー濃度は０．１５〜０．４０
重量％にできる。 この物質は第５．６および７図に示す非常に興味あるレ
オロジー的性質をもっている。すなわち全試験周波数に
ついて、複素動的弾性率（Ｇ５の弾性成分は損失弾性率
（市より大きい。同時にこの物質は低い剪断速度下で擬
似可塑物の如き挙動を示す。すなわち粘度は剪断速度に
よってかなり低下する。またこの物質は緩和時間が著し
く永いという特徴を有する。この事は本発明により得ら
れたＨＹの溶液の特異な構造であって、それが特別のレ
オロジー的性質をもった上記のゼリー状生成物を得るこ
とを可能にしたものと確信している。換言すれば、本発
明の回収法で起こるＨムの化学的変化がＨＹの構造及び
性質に影響するばかりか、それから得られる生成物の性
質にまでも影響を及ぼすのである。従って、その技術分
野で知られている方法すなわちクロロホルム抽出で蛋白
質を除去することによって得られた五ムをジビニルスル
ホンでの架橋の出発物質として使った場合、本発明の生
成物より実質的に劣るレオロジー的性質をもつ不溶性物
質が得られた。 本発明によって得られた生成物の附加的修飾によって多
くの他の変性物質例えば強架橋ゲル、不溶性フィルム、
被覆物などが得られるということは理解されるべきであ
る。 （実施例） 以下の実施例は本発明の好ましい具体例を説明するもの
であって、本発明はこれらに限定さるべきものではない
。 実施例１ 雄鶏のとさかをセチルピリジニウムクロライドの１９６
水溶液で良く洗い、次いで脱イオン水で洗って最後に冷
凍した。冷凍とさかを約１〜２ｕの厚みにスライサーで
薄切りした。アセトン１０００１１８７％ホルマリンｔ
ｏｏｌｉおよび酢酸ナトリウム５０１の混合物を作り、
薄切りとさか１０００．ｐｆジ＋１１　＾　　　ふ寺請
、ふ加重１金鯰　ＬＭ礪シΔルー　／ｘｍ　　−ηＡを
ゆるく撹拌しつつ約２０℃で２４時間保持した。 ナイロン網で濾過して液をとさかから分離した。 次いでこの熟理済とさかをアセトン５００，９で洗滌し
、最終５ｏｏｌｉになるまで空気中で乾燥した。 乾燥とさかを脱イオン水２．５１！と混合し、ゆるい撹
拌下約２０℃で７２時間抽出を行った。ナイロン網布で
濾過して抽出液からとさかを分離し、抽出液は更に繊維
素系Ｆ材〔「ミクロ−メディアＣＭｉｃｒｏ−ｍｅｄｉ
Ｐ）’ＭＴＯＪｘ−ルｆル　ｘンジニャリング社（Ｅｒ
ｔｅｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｏ、）　）　で濾
過した。この第１抽出液中の五ム濃度は０．９２ｍ、５
ｒ、々ばであった。　２Ｉ！の抽出液をアセトン４１お
よび酢酸ナトリウム２Ｇ、５ｉ１と混合した。白色繊維
状沈澱が得られ、これを集めアセトンで洗滌し、８５℃
の真空乾燥機中で乾燥し、１．７！ＳＪの生成物を得た
。生成物のヘキソサミン／ヘキスロン酸比は１±０．０
５であった。生成物中のホルムアルデヒド含量はｏ、ｏ
ｔｓｏ％であることが判った。生成物はへイランと同定
された。生成物中の蛋白質含量は０．８５　！％で極限
粘度数は４．８２０ｃｃ／７７であった。 第１抽出後のとさかを脱イオン水２．５Ｉ！と混合し常
温で４８時間抽出を行った。上述の如くとさかを抽出液
から分離した。第２抽出液中のＨＡ濃度は０．６５ｍ１
／ｍｌであった。上述の沈澱法で抽出液から回収した生
成物は１．２６Ｊであった。この両分は又ホルムアルデ
ヒド含ｊｉｏ、０１４％の化学的に修飾されたヒアルロ
ン酸ナトリウムとして特徴づけられるものであった。そ
の蛋白質含量は０．２７％、＠眼精度数は４，７２９　
ｃｃ／Ｉであった。 ０．１５モル食塩水中の１重量％溶液のロオロジー的性
質を測定し第１表に示した。 このとさかの第８回目の水抽出を上と同様に行った。第
８抽出液中のＵＡ濃度は０．３８　ｍｌｉ／ｍｌで、こ
の抽出液から０．５０．ｐのＩ（Ａを回収した。 蛋白質含量は０５２０％、！眼精度数は４，８８０ＣＣ
／Ｆ％　　ホルムアルデヒド含量はθ、Ｑ　ｌ　１５％
であった。 １都の雄鶏のとさかから化学的に修飾したＨＡナトリウ
ムを合計８．６１１ｉ得た。 実施例２ 実施例１と同様にして薄切りした雄鶏のとさか１即を、
アセトン１即とグルタルアルデヒドの４０％水溶液１５
０．Ｆとの混合物に混合した。該混合物のｐＨは６．９
であった。該混合物をゆるく撹拌しつつ（約１ｒｐｍ）
常温（約２０℃）で１６時間放置した。とさかを液から
分離し、アセトンで洗滌し、元の重量の半分になるまで
風乾した。 乾燥とさかを脱イオン水８Ｉ！にて約２０℃で９６時間
抽出した。抽出液を実施例１と同様にしてとさかから分
離してＦ遇した。抽出液中のＨム含量はｌ、　４　ｒｒ
Ｊ／ｒｒＪであった。実施例１と同様にしてアセトンで
沈澱した生成物は蛋白質含量が０．４２％、極限粘度数
が８，７００ｃｃ／ｐであった。 実施例８ グルタルアルデヒド溶液の代りに同量のグリオキサール
４０重量％水溶液を用いた以外は実施例２と同様にした
。抽出液中の■ム含量は０．９２ｍ１７ｍ１！であった
。生成物の蛋白質含量は０．５％、極限粘度数は８，１
Ｎ１０ＣＣ／Ｊｒであった。 実施例４ 実施例１と同様にして雄鶏のとさかを洗滌し、冷凍し、
スライスし、アセトン−ホルムアルデヒド混合物で処理
した。とさかを元の重量の半分になるまで乾燥した後、
０．０５モル水酸化ナトリウム水溶液（１）Ｈは１１以
上）２．５Ｉ！で約２０℃。 １２０時間抽出した。抽出液は実施例１と同様にして分
離し、濾過した。抽出液中の五ム濃度は３、６　ｍｌ／
ｍｌであった。アセトンと酢酸ナトリウムとの混合物で
沈澱して白色の生成物を得、アセトンで洗滌し乾燥した
。蛋白質含量０．２％、極限粘度数１，８１０　ＣＣ／
＃の生成物７．６１を回収した。 実施例５ 雄鶏のとさかを洗滌、冷凍、スライスし、とさカＩ　Ｙ
４をイソプロパノール１１ｆ、８７％ホルマリンｔＧｏ
！ｉ、酢酸ナトリウム５０．９およびクロロホルム１０
０Ｉの混合物と混合した。処理はゆっくり撹拌しつつ約
２０℃で１６時間行った。実施例１と同様に抽出、沈澱
を行った。抽出液中の五ム濃度は０．６８　ｍｌ／ｍ！
であった。生成物中の蛋白質含量は０．４６％、極限粘
度数は４，９００ｃｃ／Ｉであった。 実施例も 雄鶏のとさかを実施例１同様洗滌し、冷凍し、スライス
し、アセトン−ホルムアルデヒド混合物で処理し、アセ
トンで洗滌し、乾燥し、水で抽出した。抽出液をアセト
ン２１！とクロロホルムＩＩ！との混合物と混合した。 蛋白質含量０，０５％、極限粘度数４．４００ｃｃ／７
の白色繊維状生成物１．９１を得た。 実施例７ 実施例１と同様にして作られた薄切りとさか１即を、ア
セトン１弯と８７％ホルマリン５０ｊｉと酢酸ナトリウ
ム５０Ｉとの混合物でゆるく撹拌しつつ約２０℃で２４
時間地理した。抽出液を実施例１と同様に分離し、濾過
し、生成物を沈澱した。 蛋白質含量０．４６％、極限粘度数５，８００　ＣＣ／
７７、結合ホルムアルデヒド０．００８％の白色生成物
！、６Ｉを得た。 実施例８ アセトン−ホルムアルデヒド処理後にとさかを元の重量
の１／８まで乾燥し、水による第１回抽出を９６時間行
う以外は実施例１と同様の操作を行った。 第１回抽出液中のＨ人濃度は１．０５ｍ１７ｍ１であっ
た。この抽出液からの沈澱生成物は蛋白質含量０．２５
％、極限粘度数４．９８０Ｃ◇１であった。 この生成物の０．１５モル食塩水による１重量％溶液の
振動試験では０．０２０ヘルツの周波数の「クロスオー
バ一点」を存していた。 第２回抽出液中の■ム濃度は０．５８　ｍｌ／／ｍ！で
あった。この抽出液からの両分（フラクション）は蛋白
質含量０．１９％、極限粘度数７．８００ｃｃ／、９で
あった。結合ホルムアルデヒド含量は０．０１％であっ
た。振動試験による「クロスオーバ一点」周波数は０．
００５ヘルツであった。 一連の８回抽出で回収された化学的に修飾されたＨ人の
合計は８．５１であった。 実施例９ 雄鶏のとさかを洗滌し、冷凍し、スライスし、スライス
したもの１）ｆをアセトン１１Ｑｉ＋、８７％ホルマリ
ン２００．９オヨびクロロホルム１ｏｏｙと混合した。 混合物のｐＥ［は塩酸を加えて４．０に調粧した。第１
回抽出液のＨＡ濃度は０．５８　ｍｌ／／ｒｎｌであっ
た。抽出液から実施例１と同様にアセトン−酢酸ナトリ
ウムで沈澱させて生成物を回収した。 生成物の蛋白質含量は０．１２％で極限粘度数は４．０
２５　ＣＣ／１１であった。生成物中の結合ホルムアル
デヒド含量は０．０２％であった。０．１５モル食塩水
による生成物１重量％溶液の振動試験に於ける「クロス
オーバ一点」周波数は０．００５ヘルツであった。 実施例１０ 雄鶏のとさかを５１１：ｌ滌、冷凍、スライスし、スラ
イスしたものＩＫｇを、混合物のｐＨを水酸化ナトリウ
ムで１１．０にＥ！ＩＬ、た以外は実施例１と同様にし
てアセトン−ホルムアルデヒド混合物で処理した。とさ
かを実施例１と同様に乾燥し、水で抽出した。抽出液の
ＨＡ濃度は０．６９　ｍｊｉ／ｍ！であった。アセトン
の代りにイソプロパノールを使用した以外は実施例１と
同様にして抽出液から生成物を沈澱させた。蛋白質含量
０．４５％、極限粘度数５，０５０　ｃｃ／ｊｉ、ホル
ムアルデヒド含量０．０１２％の白色繊維状物１．８．
ｆを得た。この生成−物の０．１６モル食塩水中１重量
％溶液の振動試験に於ける「クロスオーバ一点」周波数
は０．０１２ヘルツであった。 実施例１１ 本実施例は「ハイラン」からのゼリー状物質の製造を示
す。実施例１の第２回抽出液から得た沈澱生成物０．８
８．ｐを０．０５規定水酸化ナトリウム水溶液２３．８
Ｆと混合し、混合物を室温で５０分間撹拌した。得られ
た粘稠溶液にジビニルスルホン０．２６Ｉｉと０．５規
定水酸化ナトリウム水溶液ｔ、ｏ、５ｒとを加えた。得
られた混合物を１０分間撹拌し次いで室温で５０分間放
置した。弾力性のある無色透明のゲルを得た。ゲルを０
．５１！の０．１５モル食塩水中に入れ一夜放置した。 次いで高度に膨潤したゲルから過剰の液体を除去し、新
しい食ｊ＆−ｕ−＆　＃　Ａ　＃　ｔＪ　＋−Ｉｆ　４
＋、ｊ　ＪＪｆｆ　ａＪｍ　１．　＋Ｆｌｌ　ｎ　ｊ吐
Ｅ１ｍ　４ｋ　Ｗｉした。膨潤した不溶性物質から過剰
の液体を除いてゼリー状の透明物質を得た。この生成物
中のＥ人濃度は０．２７５重量％と測定された。この物
質のレオロジー的性質は第５．６及び７図に示した。 実施例１２　　（”ａｕｔｏによる雄鶏とさかの処理）
放射性同位元素で標識されたパラホルムアルデヒド（”
（３ＨｇＯ）［：比放射能ｓ　ｏ　ｏ　ｍ（３ｉ／ｙ　
（工２（３Ｎｌ／イデイオケミカルズｅ　Ｒａｄｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ）　）を、１規定水酸化ナトリウム水
溶液１．　ｏ　ｍ／を加、ｔた８７Ｉｉ％ホルムアルデ
ヒド水溶液１．　Ｏｍｌに５，０ｍ０ｉに相当する量加
えた。混合物をきっちりと栓をした容器に入れ５０℃に
加温しパラホルムアルデヒドを溶解した。次いで混合物
を０℃に冷却し１規定の酢酸水溶液ｏ、　ｉ　ｍｌ！で
中和した。 得られた溶液の放射能は、１０ｍ／の「／Ｘイドロフル
アー（Ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒ”）　Ｊ液状シンチレーシ
ョン計数媒体（１ｌｑｕｉｄ　５ｃｉｎｔｉｌｌａｔｉ
ｏｎ　ｃｏｕｎｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ）　（ナショナル
・ダイアノスチック）（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃ　）中で、外部標準法に基づく効率の補正を
コンピューターで行うリール・アイソキャップ８００液
体シンチレイション・カウンター（８ｅａｒｌｅ　ｌ５
ｏｃａｐ　８００　Ｌｉｑｕｉｄ８ｃｉｎｔｉｌａｔｉ
ｏｎ　Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて測定した。 ホルムアルデヒド濃度はクロモトロープ酸による比色法
で測定した。得られた溶液の比放射能（ｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）は０．５６５ｍＣ３ｉ／（ミリ
モル０Ｈ２（ｂ）であった。この標識されたホルムアル
デヒド溶液をアセトン７、５　Ｆ、クロロホルムＩ１１
酢酸ナトリウム０．５　、ｐと混合した。薄切りした雄
鶏のとさか７．５　Ｉｉをこの溶液と混合し約２０℃で
１８時間処理した。とさかを液から分離し、数回アセト
ンで洗滌し元の重量の１／２になるまで風乾した。２回
反復蒸溜水１５ｍ１！をとさかに加え約２０℃で９６時
抽出を進めた。抽出液はとさかから分離し１紙〔ホワッ
トマン（Ｗｈａｔｍａｎ”）Ｎｌｌ〕を数枚重ねて濾過
した。同じ操作を繰返してとさかの第２抽出液を得た。 ｌ［Ｙは抽出液に酢酸ナトリウムをＩＭ盆％溶液になる
量と、９５％エタノールを４倍量加えて白色繊維状物と
して沈澱した。繊維状物を分離し、アセトンで丁寧に洗
い、乾燥し再びＭＹ濃度が約１　ｍｌ／／ｍｌになるよ
う水に再溶解した。ＨＹをその溶液から上記と同様にし
て再沈澱し、再度アセトンで徹底的に洗い乾燥した。乾
燥物質を今一度蒸溜水に溶解してＨＹを０．８４ｍ１／
ｍ！含有する溶液を得た。この溶液の比放射能を測定し
た処１９４　ｄｙｎ／４　Ｈｙであった。この溶液の放
射能は、０．１６モルの食塩を含みｐＨ７，５の０．０
５モルリン酸緩衝液への完全透析（ｅｘｈａｕｓｔｉｖ
ｅ　ｄｉａｌｙｓｉｓ）によって１０８　ｄｐｍ／（ｓ
ＩＩＩｉＹ）に減少した。この溶液の放射能は４モル濃
度グアニジン塩酸塩に対する完全透析によって１０１　
ｄｐｍ／（＃Ｊ　ＢＹ）にまで減少した。このことは蛋
白質が解離する条件下での溶液の処理後でもホルムアル
デヒドは生成物中に残留していることを示している。生
成物について測定された放射能並びに出発物質のホルム
アルデヒド溶液の比放射能に基づき、ＨＹに関係するホ
ルムアルデヒド含有量は約０．２重量％と算出された。 放射性同位元素で標識されストレプトマイセスしアルロ
ニダーゼによる酵素的分解を受は品いＨＹと結合したホ
ルムアルデヒドがどれくらいかを評価するため、ＨＹ　
０．８　ｍｌｉ／ｒｎｌ：を含み１　、２５０ｄｐｍ／
（１０＃／溶液）の放射能を持つ別の溶液を作った。こ
の溶液２ｍ／にストレプトマイセス・ヒアルロニダーゼ
８８ＴＲＵＣマイルス　ラボラトリ−社（Ｍｉｌｅｓ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、）　、比活性度２
，０ＱＱＴＲＵ／（ｍ、９ＩＩＬ人）、蛋白質加水分解
活性度が６×１０　単位／ＴＲＵ以下〕含んだクエン酸
−りん酸緩衝液（１）Ｈ５，６）０．１ｍ／を加えた。 同じ溶液の別の２ｍｌに酵素を含まない前記緩衝液を０
．１　ｍ／加えた。両方共２０時間かけて１．０００倍
量のクエン酸−りん酸緩衝液へ透析した。透析後の上記
２試料の容積は同じであった。 酵素処理しなかった試料はＨＹ濃度が０．７６　ｍ、ｐ
／ｍｊで放射能は５５２ｄｐｍ／Ｉｏｎ／であツタ。 酵素処理した試料のＥ人濃度は検出レベル（１０ｔｓｌ
／ｍり以下で放射能は４１４ｄｐｍ／（１Ｇ＃ｊ溶液）
であった。ヒアルロニダーゼに敏感な放射能は２０ｄｐ
ｍ／（ＩＩＩＩＩＩＹ）で仁れは酵素的に消化し得るＥ
［Ｙに結合したホルムアルデヒド０．０４９重量％に相
当する。生成物のそのように標識された試料をゲル　パ
ーミェーション　クロマトグラフィーで分析した。この
クロマトグラフィはグリセリール−〇ＰＧ８００Ｇ（孔
の大きさ２３６９±８．８％）（エレクトロヌクレオニ
ックス社（Ｅｌｅ−ｃｔｒｏｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ、　
Ｉｎｃ、）を充填した１、６Ｘ９Ｇ傭のガラスカラムを
使用した。０．１５モル食塩を含む脱気した０、０２モ
ルはう酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）を溶離（ｅｌｕｔｉｏ
ｎ）に使用した。カラムの排除容積（ｅｘｃｌｕｄｅｄ
　ｖｏｌｕｍｅ）（ｙｇ）を分子量４ＸＩＯのＨＹ試料
で測定し、カラムの全容積（Ｖｔ）をスクロースで測定
した。溶離は６℃で１０ｍ１／時間　の流速で行った。 ５ｍｊずつの分ｕｔｅ）及び酵素的消化が、ＨＹとその
放射能との両方を気孔容積の両分から除去することが明
らかになった。計算すると、気孔容積のＨＹと結合した
比放射能は１４．　ｅ　ｄｐｍ／（＃＃ｎｙ）で、これ
はポリマー中のホルムアルデヒド０．０３６重愚丸く対
応することを示した。この数字は透析実験で得た数値と
よく一致する。 勿論本発明の思想及び範囲をいつ脱することなしに変形
、修飾することは可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はハイラン（ＨＹ）の０．１５モル濃度食塩水溶
液（１重置％）の粘度対剪断速度依存性を示すグラフ（
Ｖは粘度、Ｓは剪断応力）、第２図はＨＹの０．１５モ
ル濃度食塩水溶液（１重量％）の振動試験の結果を示す
グラフ（Ｖは粘度、Ｆは位相角（ｐｈａｓｅ　ａｎｇｌ
ｅ　）　、Ｇ’　は動的貯蔵弾性率（ｄＶｎａｌｉ（ｌ
ｊ　５ｔＯｒａ！Ｊｅ　ｌ０ｄＬｌｌ＋）　、Ｇ”は損
失弾性率（１ｏｓｓ　ｍｏｄｕｌｉ　）　）　、第３図
はＨＹの０．１５モル濃度食塩水溶液Ｃｌｌｉ量％）の
緩和面−を示すグラフ、第４図はＨＹ（極限粘度数４，
３００ｃｃ　／σ）の０．１５モル濃度食塩水溶液（１
重量％）の相当球直径の分布を示すグラフ、第５図はＨ
Ａ（極限粘度数３，５６２ｃｃ　／Ｑ　）の０．１５モ
ル濃度食塩水溶液（１重量％）の相当球直径の分布を示
すグラフ、第５図は本発明によるゼリー状生成物の粘度
対剪断速度依存性を示すグラフ、第７図は本発明による
ゼリー状生成物の振動試験の結果を示すグラフ（Ｖは粘
度、Ｆは位相角、Ｇ′は動的貯蔵弾性率、Ｇ　ＬＬは損
失弾性率）、第８図は本発明によるゼリー状生成物の緩
和曲線を示すグラフである。 Ｆ／に、　４ ／ｌ）　２０　　５０　１５０　２０５６１１０　　／
１Ｘ）０　２５１Ｘ）ＦＩ６．５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ヒアルロン酸を含有する動物組織を、蛋白質
   とヒアルロン酸に反応する物質を含有する水性処理混合
   物で処理し、その場で組織中に含まれたヒアルロン酸の
   化学的修飾を行い、 （ｂ）反応混合物から過剰の処理混合物を除去し、 （ｃ）処理した動物組織から化学的に修飾したヒアルロ
   ン酸を水で抽出し、 （ｄ）処理した動物組織から、化学的に修飾したヒアル
   ロン酸含有の抽出物を分離し、 （ｅ）抽出物から化学的に修飾したヒアルロン酸を回収
   する ことからなる化学的に修飾したヒアルロン酸製剤を得る
   方法。 ２、水性処理混合物に含まれる蛋白質とヒアルロン酸に
   反応する物質がアルデヒドである特許請求の範囲第１項
   による方法。 ３、アルデヒドがホルムアルデヒド、グルタルアルデヒ
   ド又はグリオキサールである特許請求の範囲第２項によ
   る方法。 ４、水性処理混合物が、アルデヒドと反応しない水混和
   性溶媒を含む特許請求の範囲第２項による方法。 ５、水混和性溶媒が、低級ケトン、低級アルコール又は
   非プロトン性溶媒である特許請求の範囲第４項による方
   法。 ６、水混和性溶媒が、アセトン、メチルエチルケトン、
   エタノール、イソプロパノール、ジメチルホルムアミド
   、ジメチルアセタミド又はジメチルスルホキシドである
   特許請求の範囲第５項による方法。 ７、水性処理混合物が、任意に電解質と水不溶性有機溶
   媒を含む特許請求の範囲第４項による方法。 ８、電解質が酢酸ナトリウムで水不溶性溶媒がクロロホ
   ルムである特許請求の範囲第７項による方法。 ９、水性処理混合物中の水と水混和性溶媒との重量比が
   、１〜５：４〜８．５であり、水とアルデヒドとの重量
   比が１〜５：０．０２〜１である特許請求の範囲第４項
   による方法。 １０、水性処理混合物が、水１０〜５０、水混和性溶媒
   ４０〜８５、アルデヒド０．２〜１０、水不溶性溶媒０
   ．６〜１０、電解質０〜２０（いずれも重量部）からな
   る特許請求の範囲第７項による方法。 １１、水性処理混合物がｐＨ４〜１０を有し、その処理
   混合物と処理される動物組織との重量比が少なくとも１
   ０：１であり、その処理が約室温もしくはそれ以下の温
   度で約４〜２４時間行われる特許請求の範囲第２項によ
   る方法。 １２、動物組織が雄鶏とさかで、とさかが約１〜３ｍｍ
   厚にスライスされる特許請求の範囲第２項による方法。 １３、過剰の処理混合物が反応混合物から、処理した組
   織を溶媒、又は溶媒／水混合物で洗浄することにより除
   去される特許請求の範囲第２項による方法。 １４、処理した組織を洗浄するのに用いる溶媒が水性処
   理混合物に用いられたのと同じである特許請求の範囲第
   １３項による方法。 １５、化学的に修飾されたヒアルロン酸の抽出が、約２
   ５℃以下の温度で、約６時間ないし数日間行われ、水と
   処理した組織との重量比が未処理組織の重量に対し約２
   〜５：１である特許請求の範囲第２項による方法。 １６、処理した組織が抽出工程前にその処理重量の約２
   ５〜５０％にまで乾燥される特許請求の範囲第１５項に
   よる方法。 １７、抽出物が、ろ過、遠心分離又は傾瀉によって動物
   組織から分離される特許請求の範囲第２項による方法。 １８、分離がろ過により行われる特許請求の範囲第１７
   項による方法。 １９、ろ過が２段法即ち、粗いメッシュを通しての第１
   の粗ろ過で、動物組織片を除去し、セルロース性物質を
   通して第２の細ろ過によって行われる特許請求の範囲第
   １８項による方法。 ２０、化学的に修飾したヒアルロン酸が、溶媒での沈澱
   、次いで洗浄及び生成する沈澱した化学的に修飾したヒ
   アルロン酸を乾燥することにより抽出物から回収される
   特許請求の範囲第２項による方法。 ２１、沈澱に用いる溶媒が、アセトン、エタノール又は
   イソプロパノールである特許請求の範囲第２０項による
   方法。 ２２、鉱酸又は電解質が沈澱工程中に加えられる特許請
   求の範囲第２１項による方法。 ２３、鉱酸がＨＣｌ、Ｈ＿２ＳＯ＿４又はＨ＿３ＰＯ＿
   ４で、電解質が酢酸ナトリウム又は塩化ナトリウムであ
   る特許請求の範囲第２２項による方法。 ２４、化学的に修飾したヒアルロン酸が、凍結乾燥によ
   って抽出物から分離される特許請求の範囲第２項による
   方法。 ２５、化学的に修飾したヒアルロン酸を、アルカリ性条
   件下、室温で約１時間、ジビニルスルホンでの架橋反応
   に付すことからなる特許請求の範囲第２項により得られ
   た化学的に修飾したヒアルロン酸を架橋する方法。 ２６、ヒアルロン酸ポリマー鎖に共有結合したアルデヒ
   ド架橋基が約０．００５〜０．０５重量％存在すること
   により特徴付けられる化学的に修飾したヒアルロン酸製
   剤。