CN101502677B - 一种注射用交联透明质酸钠凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种注射用交联透明质酸钠凝胶以及它的制备方法。该方法特征在于透明质酸钠和缩水甘油醚在碱性溶液混合反应形成水不溶性凝胶后，先在去离子水中纯化，破碎为一定大小的颗粒，然后提高去离子水的离子强度，使凝胶颗粒收缩。该方法制备得到的交联透明质酸钠凝胶无菌无热原，且颗粒细小均匀，可作制备美容或医疗用途的注射剂。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种注射用交联透明质酸钠凝胶以及它的制备方法。
背景技术
透明质酸(hyalouronic acid，以下简称HA)是由(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接组成的一种链状聚阴离子黏多糖，是构成皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要成分，具有独特的理化性质和生物学功能。商品透明质酸钠(sodium hyaluronate，以下简称SH)为HA的钠盐，来源于动物组织或微生物发酵，广泛应用于食品、日化和医药领域，由于纯度的不同，具有食品级、医用级和化妆品级等多种级别产品。经过长期的研究开发，高纯度的医用级SH已被制成注射剂，应用于眼科手术、骨科手术、治疗骨性关节炎及类风湿性关节炎和预防术后粘连。此外，由于具有良好的生物相容性和独特的黏弹性，HA被用于注入面部皮肤，减轻皱纹，改进皮肤外观和结构(RU2272634、RU2194512)或改进唇部形状，阻止皮肤衰老(RU2159111)。但是，天然的HA容易被肌体组织中的酶降解，良好的水溶性使其在组织中容易被扩散，因此它在动物组织局部存留的时间并不令人满意。为了克服天然HA易分散、易降解的缺陷，众多的化合物被用于修饰或交联天然HA(US4713448、US4582865、WO9009401、WO9515168、US2003114406、EP1265116等)，其中采用含缩水甘油醚(环氧基)的化合物交联HA，得到了可注射、毒性小、生物相容性好的产物，可用于制备眼科玻璃体替代、防粘连、软组织填充以及缓释药物储库等产品。用1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)交联的HA已有交联产品上市，如法国CORNEAL公司的眼科产品SKGEL和美国Q-MED公司的美容产品RESTYLANE
，在临床应用多年，鲜见毒副作用报道，是安全性较高的交联HA产品。
缩水甘油醚交联HA的技术已有多个专利公开(WO8600079、WO8600912、WO9704012、US6852255、CN1590444等)，其中专利WO026350公开了BDDE交联HA制备可注射凝胶的工艺过程，交联剂先溶于碱溶液，再与固体HA混合反应，得到均匀度较好的凝胶，经纯化后的凝胶通过均质粉碎工艺获得一定粒度的颗粒凝胶，最后灭菌得到成品，在一定推力下，凝胶颗粒可以经较细的针头(如26～27G)推出。
专利CN1590444公开了在酸性或碱性溶液中，缩水甘油醚和HA在较低的温度条件下(15℃～35℃)反应有利于在反应过程中保护HA大分子链，降低其由于断链而产生的降解。同时该专利还特别提到采用天津大学BD系列脱蛋白产品纯化HA原料，可以提高产品的质量。
本发明方法在凝胶纯化和颗粒制备(破碎)方面有独特之处。本发明利用交联HA凝胶产物在不同离子强度水溶液中膨胀系数不同的特性，让交联产物在去离子水中充分膨胀，然后提高去离子水中离子强度使凝胶收缩，充分除去了未反应物和其它杂质；在凝胶充分膨胀的状态下使凝胶通过一定大小的筛网，形成粒径较均一颗粒，提高去离子水中离子强度后，使其收缩形成均匀细腻的可流动凝胶颗粒，与直接采用机械均质将凝胶制成细小颗粒的工艺(WO0206350)相比，具有凝胶颗粒均匀，粒径分布范围小，纯度高，杂质少，不增加重金属含量等优点。
本发明采用医用级SH原料，缩水甘油醚为交联剂，在碱性条件下，在40～80℃进行交联反应和纯化。与CN1590444的方法相比，医用级SH原料市场有售，其纯度高、蛋白残留极低，无需再次脱蛋白，减少了原料纯化步骤；本发明方法所采用的高温反应、高温纯化，与其常温反应、常温纯化相比，具有工艺简单、耗时短的优点，有利于在生产过程中保持产品无菌、无热原，可以减少终产品除热原的步骤。试验证明，在碱性条件下，较低温度、长时间的反应对SH的降解程度并不低于较高温、短时间的反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种供注射用的交联SH凝胶的制备方法，以及使用该方法制得的凝胶制备美容或医疗用途的注射剂。
本发明注射用交联SH凝胶的制备方法，包括如下步骤：
①：SH和缩水甘油醚在氢氧化钠(NaOH)溶液中混合反应形成凝胶；
②：将步骤①得到的凝胶在去离子水中浸泡纯化后破碎为一定大小的凝胶颗粒；
③：提高步骤②中去离子水的离子强度，使凝胶颗粒收缩。
更具体地，本发明注射用交联SH凝胶的制备方法，包括如下步骤：
①：将缩水甘油醚和SH在0.5％～2％的NaOH溶液混合，于40～80℃保温2～8小时，得到水不溶性凝胶；
②：将步骤①得到的凝胶浸泡于去离子水中，纯化6～12小时，得到体积膨胀的含水凝胶；
③：收集步骤②得到的含水凝胶，使其通过筛孔内径为100～400μm的筛网，得到含水凝胶颗粒；
④：提高步骤③得到的含水凝胶颗粒中去离子水的离子强度，40～80℃保温2～8小时，含水凝胶颗粒收缩、沉降，得到收缩的含水凝胶颗粒；
⑤：收集步骤④中收缩的含水凝胶颗粒，灭菌，包装制得成品。
本发明制备方法中使用的缩水甘油醚为一类带有环氧基活性基团的化合物，在很多场合被称为环氧树脂稀释剂。
本发明制备方法中所述的缩水甘油醚可以选用BDDE，也可以选用乙二醇二缩水甘油醚。其中BDDE是指CA号为2425-79-8的化合物，英文可表示为1，4-butanediol diglycidyl ether、1，4-Bis(2，3-epoxypropoxy)butane或1，4-bisglycidyloxybutane。此外，在文献中还有多种名称或简称(缩写)表示，如1，4-丁二醇缩水甘油醚、丁二醇缩水甘油醚、环氧稀释剂D-1402、AralaiteRD-2、Eqodie750、WSR-622、G96、JX-023、BDGE和BDDE等。乙二醇二缩水甘油醚是指CA号为2224-15-9的化合物，英文可表示为Ethylene glycol diglycidyl ether、1，2-bis(2，3-epoxypropoxy)ethylene、Glycol diglycidyl ether或2，2′-[Ethylenebis(oxymethylene)]bisoxirane。此外，在文献中还有多种名称或简称(缩写)表示，如乙二醇缩水甘油醚环氧稀释剂D-669，Quetol651，EGDGE等。
本发明制备方法中所述SH与NaOH溶液的质量体积比可以在5％～50％，优选10％～25％，更优选15％～20％。
本发明制备方法中所述去离子水为40～80℃的去离子水，优选45～75℃的去离子水，更优选60～70℃的去离子水。
本发明制备方法中所述提高凝胶中去离子水的离子强度的方法为加入渗透压高于300mOsmol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS)或氯化钠(NaCl)溶液，或直接加入固体NaCl。
本发明制备方法中所述收集含水水凝胶颗粒的方法可以采用过滤的方法，也可以采用离心的方法。例如，过滤方法可以采用80～200目(筛孔内径180～75μm)的筛网过滤，离心方法可以采用2000～5000rpm离心5～30分钟。
本发明制备方法中所述灭菌方法可以是湿热灭菌，优选灭菌条件为115℃～125℃灭菌15～30分钟，更优选灭菌条件为121℃灭菌15分钟。
本发明制备方法工艺简单、耗时短，制备获得的凝胶无菌、无热原，杂质少、颗粒均匀细腻，适合用于制备美容和医疗用途的注射剂。
具体实施方式
以下实施例是为了更好地说明本发明，不是限制本发明。
实施例1
取10g SH(平均分子量180万道尔顿)与68ml含有0.5g BDDE的1％NaOH溶液混合均匀，所得反应液于50℃保温3小时，反应形成水不溶性凝胶。为了说明本发明工艺的优点，将反应得到的凝胶平均分成2份，1份按本发明方法制备(A)，另1份按WO026350公开的方法制备(B)，为了便于比较，凝胶B采用了与凝胶A相同的纯化温度和磷酸盐缓冲体系。
A：用去离子水于70℃纯化10小时后，挤压使凝胶通过60目筛(筛孔内径250μm)，收集凝胶颗粒，加入等体积2倍浓度的等渗PBS(每1000ml含有NaH2PO4·2H2O 90mg，Na2HPO4·12H2O 1.12g，NaCl 17g)，65℃保温4小时，2000rpm离心15分钟，收集凝胶沉淀，121℃灭菌15分钟，无菌灌装于事先灭菌的一次性注射器中。
B：用pH 7.2的等渗PBS(每1000ml含有NaH2PO4·2H2O 45mg，Na2HPO4·12H2O0.56g，NaCl 8.5g)于70℃纯化10小时后，过滤收集凝胶，用均质机将打碎，至凝胶最大颗粒的粒径不大于0.5mm，121℃灭菌15分钟，无菌灌装于事先灭菌的一次性注射器中。
为了比较所得凝胶的不同特性，按以下方法对凝胶进行试验：
1.含量(c)测定：取0.5g凝胶，加0.5M硫酸10ml，沸水浴水解15分钟，加水至100ml。咔唑法测定糖醛酸含量，乘系数(2.07)为SH含量。
2.收率测定：凝胶产物(w/g)中SH的量/反应前SH的量，即c×w/5×100％。
3.粒度检查：取凝胶0.1g，用10ml含有亚甲兰的生理盐水稀释后，在50～100倍光学显微镜下观察、计数。
4.重金属检查：参考中国药典2005版二部附录的方法，取凝胶1g，60℃烘干，炽灼至炭化，加0.5ml硫酸加热蒸干，再加0.5ml硝酸加热蒸干，在500～600℃加热使灰化，加2ml盐酸，水浴蒸干，加15ml蒸馏水，用4％氨水调为中性，加2ml pH 3.5的醋酸盐缓冲液，溶解后稀释成25ml，同时取所用试剂蒸干后，加等量醋酸缓冲液和蒸馏水，加适量标准铅试液，稀释成25ml，分别加入硫代乙酰胺试液显色后进行比较检查
5.耐酶性测定：凝胶0.5g加2ml浓度为300U/ml的透明质酸酶溶液，37℃酶解65小时，加pH 7.2的PBS至5ml，取1ml加无水乙醇4ml，10000rpm离心15分钟，取2ml上清液用pH 7.2的PBS定容至5ml，采用改良咔唑显色法(参考文献：Bitter T.，and MuirH.M.(1962)A modified uronic acid carbarbazole reation.Anal.Biochem.4，330～333.)测定糖醛酸含量，折算为SH含量(*2.07)，为a值，以凝胶中SH含量(c)为b值，计算a/b。
两种凝胶的测定数据见表1。
表1两种凝胶测定数据比较
| 项目 | 含量(％) | 收率(％) | 粒径范围/平均粒径(μm) | 重金属(ppm) | 耐酶性(a/b) |
| AB | 1.781.81 | 84.285.1 | 100～250/1505～500/150 | ＜10＞100 | 0.4060.412 |
从表1中的试验结果可以看出，在其它性质基本相同的情况下，B凝胶的重金属严重超标，A凝胶颗粒较均匀，B凝胶粒径范围较大，且A流动性好于B，更利于注射。
实施例2
取10g SH(平均分子量120万道尔顿)溶解于90ml含有0.8g BDDE的1.5％NaOH溶液中。为了说明本发明工艺的优点，将反应液平均分成2份，1份按本发明方法的反应条件制备(C)，另1份按CN1590444公开的反应条件制备(D)。
C反应液于50℃保温2小时，反应形成水不溶性凝胶。
D反应液于20℃保温24小时，反应形成水不溶性凝胶。
为了便于比较，C和D反应得到的凝胶后处理工艺(纯化、颗粒制备和灭菌等)均采用实施例1A凝胶的制备方法。
为了比较所得凝胶的不同特性，按实施例1中描述的方法对凝胶进行试验，结果见表2。
表2两种凝胶测定数据比较
| 项目 | 含量(％) | 收率(％) | 粒径范围/平均粒径(μm) | 重金属(ppm) | 耐酶性(a/b) |
| CD | 1.421.15 | 80.578.6 | 100～250/150100～250/150 | ＜10＜10 | 0.5970.810 |
从表2中的试验结果可以看出，二者收率和粒径相当，而D凝胶含量和耐酶性明显低于C凝胶，说明C凝胶体外抗酶降解性明显好于D凝胶，意味着C凝胶在体内的存留时间长于D凝胶，可以认为D凝胶的反应条件对HA的降解程度并不低于C凝胶的反应条件，或者说与50℃反应2小时相比，20℃反应24小时并不能显著降低HA大分子的断链。
实施例3
将不同分子量的SH(平均分子量30万、42万、57万、78万道尔顿)5g溶解于35ml含有0.25g BDDE的1.0％NaOH溶液中。按实施例1A凝胶的制备方法，分别得到4种具有不同性质的凝胶，按实施例1中描述的方法对凝胶进行试验，结果见表3。
表3 4种凝胶测定数据比较
| 凝胶 | I | II | III | IV |
| 平均分子量(道尔顿)含量(％)收率(％)耐酶性(a/b) | 30万0.6242.90.89 | 42万0.87560.77 | 57万1.1466.10.60 | 78万1.3578.40.46 |
不同分子量的SH，经相同工艺制备成水不溶性凝胶颗粒，其含量、收率和耐酶性随分子量的增大而增加。
实施例4
将不同分子量的SH(平均分子量30万、42万、57万、78万道尔顿)5g溶解于含有0.25g BDDE的1.0％NaOH溶液中。按实施例1A凝胶的制备方法，分别得到4种凝胶，按实施例1中描述的方法对凝胶性质进行试验，结果见表4。
表4 4种凝胶测定数据比较
| 凝胶 | V | VI | VII | VIII |
| 平均分子量(道尔顿)NaOH溶液(ml)含量(％)收率(％)耐酶性(a/b) | 30万26.81.8772.50.41 | 42万28.51.8578.40.39 | 57万30.51.8482.30.38 | 78万32.21.7985.10.40 |
不同分子量的SH，经过调整NaOH溶液的用量，可以得到耐酶性质相似的凝胶，收率随分子量的增大而提高。
Claims (13)
1.一种注射用交联透明质酸钠凝胶的制备方法，包括如下步骤：
①透明质酸钠和1，4-丁二醇缩水甘油醚在1％的NaOH溶液中混合，其中透明质酸钠与NaOH溶液的质量体积比在大于15％、小于等于20％的范围，于50℃保温3小时，得到水不溶性凝胶；
②将步骤①得到的凝胶浸泡于60℃～70℃的去离子水中，纯化6～12小时，得到体积膨胀的含水凝胶；
③收集步骤②得到的含水凝胶，使其通过筛孔内径为100～400μm的筛网，得到含水凝胶颗粒；
④提高步骤③得到的含水凝胶颗粒中去离子水的离子强度，65℃保温4小时，含水凝胶颗粒收缩、沉降，得到收缩的含水凝胶颗粒；
⑤收集步骤④得到的含水凝胶颗粒，115℃～125℃灭菌15～30分钟，包装制得成品。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征还在于所述提高去离子水的离子强度的方法为加入渗透压高于300mOsmol/L的磷酸盐缓冲溶液或氯化钠溶液，或直接加入固体氯化钠。
3.权利要求1所述的制备方法，其特征还在于步骤⑤中所述收集凝胶颗粒的方法为过滤或离心。
4.权利要求1所述的制备方法，其特征还在于步骤⑤所收集的含水凝胶颗粒采用121℃灭菌15分钟。
5.权利要求1所述的制备方法，其特征还在于步骤①所述透明质酸钠与NaOH溶液的质量体积比为100∶536。
6.权利要求1所述的制备方法，其特征还在于步骤①所述透明质酸钠与NaOH溶液的质量体积比为100∶570。
7.权利要求1所述的制备方法，其特征还在于步骤①所述透明质酸钠与NaOH溶液的质量体积比为100∶610。
8.权利要求1所述的制备方法，其特征还在于步骤①所述透明质酸钠与NaOH溶液的质量体积比为100∶644。
9.权利要求1所述的制备方法，其特征还在于步骤①所述NaOH溶液的浓度为1.5％。
10.权利要求1所述的制备方法，其特征还在于步骤①所述透明质酸钠和1，4-丁二醇缩水甘油醚在1％的NaOH溶液中混合后，于50℃保温2小时，得到水不溶性凝胶。
11.权利要求1所述的制备方法，其特征还在于步骤②中将得到的凝胶浸泡于70℃的去离子水中纯化10小时，得到体积膨胀的含水凝胶。
12.权利要求1所述的制备方法制得的凝胶。
13.权利要求12所述凝胶用于制备美容或医疗用途的注射剂。
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