CH670092A5 - - Google Patents

Description

DESCRIPTION

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L'invention se rapporte à un acide hyaluronique modifié chimiquement, présentant de nouvelles propriétés chimiques, physicochimiques et rhéologiques, ainsi qu'à un nouveau procédé d'obtention d'un tel acide.

55 L'acide hyaluronique (désigné ci-après par HA) est un glycosa-minoglycane existant à l'état naturel, de poids moléculaire élevé, présentant un motif répété disaccharide d'acide D-glucuronique et de N-acétylglucosamino-2-acétamido-2-désoxy-D-glucose, liés par une liaison ßl-»3 glucoside. Les disaccharides sont liés par des liai-60 sons ßl ->4 glucoside pour former une chaîne Polysaccharide non ramifiée, non réticulée.

Le HA est présent dans des tissus animaux, par exemple dans le cordon ombilical, l'humeur vitrée, le liquide synovial, la crête du coq, la peau, etc. Le poids moléculaire du HA purifié a été indiqué 65 dans la littérature comme se situant dans une gamme comprise entre 50 000 et 8 000 000, en fonction de l'origine, de la méthode d'isolement et de la méthode de détermination du poids moléculaire [Balazs, E.A., «Fed. Proceed.» 17,1086-1093 (1958)].

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De nombreuses méthodes ont été proposées pour la récupération et la purification de HA provenant de tissus animaux et de cultures bactériennes. Parmi ces méthodes, on mentionne la digestion enzy-matique des protéines [E.D.T. Atkins, C.F. Phelps et J.K. Sheehan, «Biochem. J.» 128,1255-1263 (1972); R. Varma, R.S. Varma, W.S. Alten et A.H. Wardi, «Carbohydr. Res.» 32, 386-395 (1974)]; le traitement par résines échangeuses d'ions [T.C. Laurent, « J. Biol. Chem.» 216,263-271 (1955); E.R. Berman, «Biochim. Biophys. Acta» 58,120-122 (1962)]; la précipitation par des agents tensio-actifs cationiques [T.C. Laurent, M. Ryan et A. Pietruszkiewicz, «Biochem. Biophys. Acta» 42, 476-485 (I960)]; le traitement par l'acide trichloroacétique [H. Hofmans, O. Schmut, H. Sterk et H. Koop, «Naturforsch.» 34c, 508-511 (1979); D. Schmut et H. Hofmans, «Biochim Biophys. Acta» 673,192-196 (1981)]; la sédimentation préparative par gradient de densité [P. Silpanata, J.R. Dunstone, A.G. Ogston, «Biochem. J.» 109, 43-50 (1968)]; et le dépôt par électrolyse [S. Roseman, D.R. Watson, J.F. Duff et W.D. Robinson, «Annals Rheumatic Diseases» 15, 67-68 (1955)].

On peut également utiliser une méthode englobant plusieurs traitements différents, par exemple digestion enzymatique et précipitation par le chlorure de cétylpyridinium [J.E. Scott, «Biochem. J.» 62, 31 (1956)].

Le principal problème rencontré dans la récupération de HA en provenance de toute source biologique consiste à séparer le polymère (HA) des protéines et autres polymères biologiques qui sont extraits des tissus en même temps que le HA. Suivant la matière première utilisée, la quantité de polymères indésirables peut être très importante, dépassant même parfois la quantité de HA. Les méthodes de récupération de HA précédemment indiquées sont toutes utilisées pour la préparation de HA dans les laboratoires, mais peuvent être difficilement mises en œuvre pour une production de HA à grande échelle, en raison de nombreux inconvénients inhérents à chacune de ces méthodes.

La méthode la plus perfectionnée pour la récupération et la purification de HA à l'échelle industrielle est décrite dans le brevet US N° 4.141.973 (E.A. Balazs). Selon cette méthode, un HA ultrapur, ayant une teneur en protéines inférieure à 0,5% en poids et un poids moléculaire inférieur à 1200 000, est obtenu en pratiquant une extraction à l'eau sur des crêtes de coq ou des cordons ombilicaux humains. Les protéines et autres substances sont séparées par plusieurs extractions au chloroforme à différents pH. Lorsqu'on procède à une extraction au chloroforme du produit extrait à l'eau, il se forme une couche à T'interface, dans laquelle sont rassemblées les protéines dénaturées et autres substances. Certaines substances, par exemple les graisses, sont solubilisées, vraisemblablement dans la phase chloroforme. Le procédé peut également inclure un traitement par une enzyme protéolytique, par exemple la pronase. En combinant plusieurs traitements très élaborés, on a mis au point un procédé permettant d'obtenir une fraction de HA non inflammatoire, exempte de pyrogène. Ce produit est actuellement répandu sur le marché, en solution à 1%, sous la marque commerciale Healon®, et est utilisé en viscochirurgie, où il permet de protéger les tissus contre des dommages mécaniques, d'assurer un espace et la manipulation des tissus au cours d'une opération (E.A. Balazs, Healon, J. Wiley and Son, NY, 1983, pp. 5-28).

Sur le dessin annexé:

— la figure 1 est un graphique illustrant la viscosité en fonction de la vitesse de cisaillement pour une solution à 1% (en poids) de

H Y dans NaCl aqueux 0,15 M (V = viscosité; S = effort de cisaillement);

— la figure 2 est un graphique fournissant les résultats d'un essai d'oscillation pour une solution à 1% (en poids) de HY dans NaCl aqueux 0,15 M (V = viscosité; F = angle déphasé; G' = modules de conservation dynamique; G" = modules de perte);

— la figure 3 est un graphique illustrant la courbe de relaxation pour une solution à 1% (en poids) de HY dans NaCl aqueux

0,15 M;

— la figure 4 est un graphique illustrant la distribution de ESD

pour une solution à 1 % (en poids) de HY (indice de viscosité limite 4300 cc/g) dans NaCl aqueux 0,15 M;

— la figure 5 est un graphique illustrant la distribution de ESD pour une solution à 1% (en poids) de HA (indice de viscosité limite 3562 cc/g) dans NaCl aqueux 0,15 M;

— la figure 6 est un graphique illustrant la viscosité en fonction de la vitesse de cisaillement pour un produit du type en gelée selon l'invention;

— la figure 7 est un graphique illustrant les résultats d'un essai d'oscillation pour un produit du type en gelée selon l'invention (V = viscosité; F = angle de phase; G' = modules de conservation dynamique; G" = modules de perte), et

— la figure 8 est un graphique illustrant la courbe de relaxation pour un produit du type en gelée selon l'invention.

Selon l'un de ses aspects, la présente invention fournit un nouveau procédé pour la modification chimique, in situ, de HA dans des tissus animaux, avant son extraction à partir de ces tissus.

Selon un autre aspect, l'invention fournit un nouveau procédé de récupération et de purification du HA chimiquement modifié provenant des tissus animaux.

Selon encore un autre aspect, l'invention permet d'obtenir un nouveau HA chimiquement modifié ultrapur, exempt de pyrogène, non inflammatoire, contenant environ 0,005 à 0,05% en poids de groupes aldéhyde de réticulation, liés par covalence aux chaînes polymères d'acide hyaluronique.

La présente invention est basée sur la découverte selon laquelle le HA peut être chimiquement modifié in situ avant d'être extrait des tissus animaux par traitement de ces tissus par une substance réagissant avec les protéines et le HA en milieu aqueux. Parmi ces substances, on mentionne le formaldéhyde, le glutaraldéhyde, le glyoxal, etc. On a trouvé que cette modification chimique in situ produit des changements substantiels dans la structure primaire de la macromolécule de HA, à l'échelle moléculaire, des interactions inter- et intra-moléculaires, ainsi que dans les propriétés rhéologiques résultantes des solutions préparées à partir du produit modifié. On a choisi d'appeler ce produit «Hylan» (désigné ici par «HY»). Lorsque le HA est extrait d'un tissu animal, une grande quantité de protéines peut varier sensiblement en fonction de la nature du tissu et des paramètres de l'extraction. Dans l'extraction de HA à partir des crêtes de coq, le rapport en poids de HA aux protéines peut varier de 1 : 0,5 à 1: 4 (brevet US N° 4.303.676, E.A. Balazs). En conséquence, le premier problème qui se pose dans la récupération de HA pur à partir de tissus animaux est l'élimination des protéines. On a trouvé que le traitement préliminaire précité des tissus fournissait un extrait à l'eau de HY avec une teneur en protéines sensiblement plus faible qu'en l'absence d'un tel traitement.

La nature précise des phénomènes chimiques intervenant durant le traitement du tissu n'est pas complètement interprétée et, de ce fait, l'invention ne devra pas être limitée par une quelconque réaction chimique spécifique. On pense qu'à la suite de réactions chimiques entre les protéines dans le tissu et un réactif dans le mélange de traitement, les protéines sont dénaturées et immobilisées dans les tissus et sont par conséquent insolubles dans l'extraction aqueuse ultérieure.

Toute substance réagissant avec des protéines dans un milieu aqueux peut être utilisée pour les besoins de l'invention. On a trouvé que la substance la plus avantageuse était le formaldéhyde. D'autres aldéhydes, tels que le glutaraldéhyde ou le glyoxal, peuvent également être utilisés dans le procédé selon l'invention.

Le traitement du tissu peut être effectué dans une solution aqueuse du réactif. Toutefois, si l'on procède ainsi, il se produira une perte substantielle de HY, du fait de sa bonne solubilité dans l'eau. Pour cette raison, il est préférable d'effectuer le traitement du tissu dans un mélange d'eau et d'un solvant organique miscible à l'eau. Le solvant ne devrait pas réagir avec le réactif utilisé pour l'immobilisation des protéines. On mentionne parmi ces solvants des cétones inférieures, telles que l'acétone ou la méthyléthyl cétone, des alcools, tels que l'éthanol ou l'isopropanol, des solvants aprotiques,

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tels que le diméthyl formamide, le diméthyl acétamide ou le diméthyl sulfoxyde et autres. Lorsqu'un tel solvant est mélangé avec un tissu contenant une grande quantité d'eau, habituellement 80 à 90%, ou plus, en poids, il se forme un mélange eau-solvant. Le rapport eau-solvant dans le mélange peut être ajusté à toute valeur désirée en modifiant le rapport solvant/tissu ou en ajoutant de l'eau au mélange. Le rapport eau/solvant préféré est déterminé par la solubilité de HY, en ce sens que HY ne doit pas être soluble dans le mélange utilisé pour le traitement du tissu. La solubilité de HY dépend du type de solvant utilisé, du rapport eau/solvant, de la présence et de la concentration de tout électrolyte dans le mélange et du pH du mélange. La solubilité de HY peut être sensiblement réduite en introduisant un électrolyte dans le mélange. On peut utiliser tout électrolyte qui est soluble dans le mélange eau-solvant et qui fournit le pH désiré du mélange. Par exemple, lorsqu'on utilise l'acétone comme solvant, on peut utiliser avantageusement de l'acétate de sodium comme électrolyte soluble.

La composition du mélange pour le traitement du tissu peut varier dans un large intervalle, suivant la nature du tissu, le type de solvant utilisé, le type d'électrolyte, etc. Comme mentionné précédemment, HY provenant du tissu ne devrait pas être soluble dans le mélange de traitement, mais ce dernier devrait contenir suffisamment d'eau pour permettre au tissu de gonfler, de manière à faciliter la réaction entre le réactif et les polymères du tissu. On a trouvé que dans le cas des crêtes de coq comme source de HY, la composition du mélange peut présenter, en % en poids, et en tenant compte de l'eau provenant des crêtes, des valeurs comprises dans les plages suivantes: eau 10-50, solvant 40-85, électrolyte 0-20, réactif 0,2-10. Plusieurs solvants différents peuvent être utilisés dans le même mélange de traitement si on le désire. On a trouvé qu'il était avantageux d'utiliser de petites quantités de solvants non miscibles à l'eau, tels que du chloroforme, dans le mélange de traitement. La teneur de ces solvants dans le mélange peut être de 0,5 à 10% en poids.

Le pH du mélange de traitement peut varier suivant la nature des réactifs, la composition du mélange, la température et la durée du traitement. Dans la récupération de HY à partir des tissus animaux, conformément à l'invention, les considérations suivantes sont très importantes. Un certain nombre de réactifs, le formaldéhyde par exemple, peuvent réagir avec des groupes hydroxylés de macromolécules de HA à un faible pH, pour donner un polymère réticulé insoluble dans l'eau. Un traitement prolongé dans un milieu à pH relativement élevé entraîne une dégradation de HA, et seul un polymère de faible poids moléculaire peut être récupéré. On a trouvé que, lorsqu'on utilise un type de réactif aldéhyde conformément à l'invention, les meilleurs résultats sont obtenus avec un pH voisin de la neutralité, par exemple compris entre 4 et 10.

Le rapport du mélange de traitement au tissu peut varier dans de larges limites. On détermine habituellement la limite inférieure en s'assurant que le tissu, très volumineux dans le cas des crêtes de coq, est au moins complètement recouvert par le mélange. La limite supérieure peut être choisie en fonction de considérations économiques. Dans le traitement des crêtes de coq selon l'invention, le rapport du mélange de traitement au tissu (calculé sur le poids à sec du tissu) est généralement supérieur à 10 :1.

La température influe sur l'efficacité du traitement selon l'invention. Toutefois, du fait que H Y est susceptible de s'hydrolyser à température élevée, il est préférable d'effectuer le traitement à la température ambiante ou à une température inférieure à celle-ci, en vue d'obtenir un produit d'un poids moléculaire élevé.

Le temps nécessaire pour effectuer le traitement dépend de nombreux facteurs, y compris la composition du mélange, la nature du tissu, la température, etc. On admet que le facteur de limitation dans le traitement est la diffusion du réactif dans les tranches de tissu. Pour cette raison, la dimension de ces tranches est un paramètre important. On a trouvé que, dans le traitement des crêtes de coq découpées en tranches de 1 à 3 mm d'épaisseur, la durée du traitement pouvait être de l'ordre de 4 à 24 heures.

Le tissu traité de la manière précédemment décrite est ensuite lavé avec un solvant ou un mélange de solvant et d'eau, afin d'éliminer du tissu l'excès de mélange de traitement. Il est commode d'utiliser le même solvant que celui utilisé dans le mélange pour le traite-5 ment du tissu. On pourra effectuer un nombre quelconque de lavages; on a toutefois constaté qu'un seul lavage donnait des résultats satisfaisants.

Le tissu lavé est ensuite extrait directement à l'eau pour récupérer HY. On a constaté que l'efficacité de l'extraction dépendait du io rapport eau/tissu, du pH du milieu d'extraction, de la température et du temps. On a également constaté que l'efficacité de l'extraction du tissu traité pouvait être sensiblement accrue en séchant tout d'abord le tissu traité, afin d'éliminer le solvant utilisé lors des étapes de traitement et de lavage. Les meilleurs résultats sont obtenus en séchant is le tissu jusqu'à Vi à Vi de son poids initial.

Le rapport eau/tissu dans l'étape de l'extraction est choisi en fonction de plusieurs considérations. En premier lieu, il devrait y avoir suffisamment de phase liquide pour recouvrir le tissu durant l'extraction. D'autre part, la quantité d'eau ne devrait pas être trop 20 grande en vue d'avoir une concentration de HY dans l'extrait aussi élevée que possible, afin de réduire la quantité d'agent précipitant dans l'étape suivante du procédé. On a trouvé que, dans le cas des crêtes de coq, le rapport préféré eau/tissu était de 2 à 5, en se basant sur le poids des crêtes non traitées.

25 Le pH du milieu d'extraction peut être maintenu neutre, acide ou alcalin suivant la qualité désirée du produit final. On a trouvé que, pour obtenir un produit d'un poids moléculaire ultra-élevé, le pH du milieu d'extraction devait se situer dans une plage de 6 à 8,5. Un pH plus élevé conduirait à un accroissement de la concentration de HY 30 dans l'extrait mais, en même temps, à une diminution du poids moléculaire du produit, ainsi qu'à des modifications intervenant dans les autres propriétés du polymère, ce que l'on étudiera ultérieurement plus en détail. De toute façon, en contrôlant le pH durant l'étape d'extraction, on peut agir avantageusement sur les propriétés 35 du produit final dans le sens désiré.

Il est préférable d'extraire le tissu traité à une température inférieure à 25° C, du fait que la dégradation de H Y à des températures plus élevées peut occasionner une diminution sensible du poids moléculaire du polymère.

40 Le temps nécessaire pour extraire la quantité maximale de HY du tissu traité varie sensiblement avec d'autres paramètres de l'extraction, tels que le pH, le rapport liquide/tissu et l'intensité de l'agitation. On a trouvé que dans l'extraction des crêtes de coq par l'eau, on obtenait de bons résultats en extrayant les crêtes de coq traitées 45 pendant 6 heures à plusieurs jours.

Le mélange renfermant le tissu traité et le milieu d'extraction peut être agité durant l'extraction ou laissé sans agitation. Plus précisément, l'agitation accroît la vitesse de diffusion des molécules de HY du tissu dans l'extrait. D'autre part, une agitation vigoureuse 50 peut conduire à une dégradation de HY et, de ce fait, à une diminution du poids moléculaire. De plus, on a trouvé qu'une agitation vigoureuse entraînait une désintégration du tissu, ce qui rendait difficile la séparation du tissu de l'extrait. Il est donc préférable d'effectuer l'extraction sans agitation ou en n'agitant que très lentement et 55 doucement.

Après extraction, le tissu est séparé de l'extrait en ayant recours à l'une des méthodes conventionnelles telles que filtration, centrifu-gation, décantation et analogues. On a constaté que la filtration était la méthode la plus simple et la plus économique. Suivant le type de 60 tissu utilisé comme produit de départ, il peut être préférable d'effectuer une filtration en deux stades. Ainsi, dans le cas des crêtes de coq, de gros morceaux de tissu peuvent être facilement séparés sur un filet en nylon, la purification fine de l'extrait pouvant être réalisée par filtration sur un milieu filtrant dense, par exemple une matière 65 cellulosique.

La concentration en HY de l'extrait est fonction de plusieurs facteurs comprenant le pH en cours d'extraction, le temps, le rapport liquide/tissu et l'intensité de l'agitation. Cette concentration se situe

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habituellement dans l'intervalle de 0,3 à 3,0 mg/ml et est même parfois plus élevée. Dans certains cas, lorsque la concentration en HY dans l'extrait présente une faible valeur, on a trouvé qu'il était désirable d'effectuer une seconde extraction du tissu. On a également trouvé que le produit précipité à partir du second extrait présentait généralement un poids moléculaire plus élevé, comparativement au HY provenant du premier extrait. Cela peut s'expliquer par le fait que des fractions de faible poids moléculaire de HY diffusent plus facilement du tissu vers l'extrait et que le produit précipité à partir du premier extrait est enrichi de ces fractions.

On peut effectuer plus de deux extractions pour obtenir un rendement aussi élevé que possible, mais la concentration en HY dans un extrait diminue lors de chaque extraction suivante.

Le HY peut être récupéré des filtrats selon toute méthode connue dans la technique. La méthode la plus commode consiste à effectuer une précipitation avec un solvant miscible à l'eau, tel que l'acétone, l'éthanol, l'isopropanol, etc. La précipitation peut se faire en présence d'un acide, tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, etc., ou en présence d'électrolytes neutres, tels que l'acétate de sodium, le chlorure de sodium et leurs sels. HY et ses sels sont habituellement précipités sous la forme d'une matière fibreuse ou d'une poudre blanche. Le précipité peut être lavé avec le même solvant que celui utilisé pour la précipitation ou avec tout autre mélange de solvants ne dissolvant pas le produit, par exemple l'éther. Le produit lavé peut être séché selon tous moyens conventionnels ou peut être conservé sous une couche d'un solvant, tel que l'acétone, l'éthanol, etc. En variante, le filtrat pourra être lyophilisé.

Il est évident que toute étape supplémentaire connue dans la technique et utilisée dans la purification de HA pourra être comprise dans le procédé selon l'invention, sans en limiter pour cela la portée. Par exemple, pour éliminer des agents pyrogènes ou inflammatoires, on peut procéder à une extraction par des solvants bien connus, tels que le chloroforme, dans lesquels le HY est insoluble, mais les lipoprotéines, les glycolipides ou les glycolipoprotéines sont solubles ou séparés.

Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des produits HY dotés de propriétés variant dans une large mesure. Les propriétés suivantes ont été évaluées. Les méthodes indiquées ont été utilisées pour caractériser les produits obtenus conformément à l'invention.

La concentration en HY dans les solutions a été déterminée par dosage à l'acide hexuronique, en utilisant la méthode automatique au carbazole [E.A. Balazs, K.O. Berntsen, J. Karossa et D.A.

Swann, «Analyt. Biochem.» 12, 547-558 (1965)]. La teneur en hexo-samine a été déterminée par la méthode colorimétrique automatique [D.A. Swann et E.A. Balazs, «Biochem. Biophys. Acta» 130,112-129 (1966)]. La teneur en protéines des solutions de HY a été déterminée par la méthode utilisant le phénol comme réactif [Lowry et al., «J. Biol. Chem.» 193, 265-275 (1951)].

La teneur en formaldéhyde dans le produit a été déterminée par hydrolyse d'environ 0,1 g de l'échantillon dans 10 ml d'acide sulfurique aqueux à 10% pendant 2 heures, avec ébullition suivie d'une séparation du formaldéhyde libre, par entraînement à la vapeur de la solution obtenue et dosage du formaldéhyde dans le distillât, par une méthode colorimétrique à l'acide chromotropique [M J. Boyd et M.A. Logan, «J. Biol. Chem.» 146, 279 (1942)].

L'indice limite de viscosité (viscosité intrinsèque) est défini par lim (n/n0 — l)/c, où n et n0 sont les viscosités de la solution et du solvant, respectivement, et c est la concentration de HY en g/cc. Les mesures ont été effectuées dans des solutions aqueuses de NaCl 0,20M, en utilisant un viscosimètre à dilution du type capillaire de Ubbelohde. La viscosité-poids moléculaire moyen est calculée par l'équation

[n] = 0,0228 M0,81

[R.C. Cleland et J.L. Wang, «Biopolymers» 9, 799 (1970)].

Le poids-poids moléculaire moyen est déterminé par la méthode de dispersion au laser sous petit angle, en utilisant un appareil Chro-matix KMX-6 équipé d'un laser hélium-néon réglé à 632,8 nm. Le poids-poids moléculaire moyen est également calculé à partir des constantes de sédimentation et de diffusion déterminées au moyen d'une ultracentrifugeuse analytique.

La méthode dynamique de dispersion de la lumière est utilisée pour évaluer l'agrégation des molécules dans des solutions de HY relativement concentrées. Cette méthode donne la répartition des diamètres sphériques équivalents (ESD) dans la solution.

Les propriétés rhéologiques ont été évaluées en utilisant le «Bohlin Rheometer System», lequel est un rhéomètre informatisé, capable de fonctionner en trois modes: viscométrie, oscillation et relaxation. Les paramètres suivants sont mesurés pour la solution de HY : viscosité pour une vaste étendue de vitesses de cisaillement, viscosité dynamique, modules de conservation dynamique et modules de perte dynamique pour des fréquences d'oscillation et des temps de relaxation variés.

Comme mentionné précédemment, le produit selon l'invention (HY) est un nouveau polymère, obtenu à la suite d'une réaction chimique in situ entre le HA et un agent de réticulation, tel que le formaldéhyde. On a trouvé par analyse chimique de HY que la teneur en formaldéhyde combiné dans des produits obtenus à partir de crêtes de coq, traitées par un mélange contenant du formaldéhyde, se situait dans une gamme comprise entre 0,005 et 0,02% en poids, calculée par rapport au poids du polymère, suivant les divers paramètres du traitement.

La présence de formaldéhyde combiné dans le produit a également été mise en évidence par un essai au cours duquel le traitement a été effectué en utilisant un formaldéhyde marque 14CH20 (voir plus loin, exemple 12). Les résultats de l'essai montrent que le produit obtenu conformément à l'invention contient du formaldéhyde combiné qui ne peut pas être éliminé par précipitations répétées ou par dyalyse exhaustive des solutions de polymère. C'est une preuve convaincante de l'existence d'une liaison covalente du formaldéhyde aux molécules polymères du produit. En vue de rechercher si le formaldéhyde est spécifiquement combiné au HY, ce dernier a été traité par des hyaluronidases bactériennes ou de sangsues, enzymes dégradant spécifiquement le HA. Les résultats de ce traitement ont montré qu'une quantité notable de formaldéhyde était liée par covalence directement aux macromolécules de HY.

La teneur en protéines dans le produit obtenu conformément à l'invention n'est généralement pas supérieure à 0,5%, calculée par rapport au poids du polymère sec, et peut être de l'ordre de 0,1% et même présenter une valeur encore plus faible.

La modification chimique de l'acide hyaluronique par fixation covalente d'un agent de réticulation sur ses macromolécules, en d'autres termes la modification de la structure primaire du polymère, affecte sensiblement ses paramètres physico-chimiques, tels que le poids moléculaire et les dimensions moléculaires, l'interaction intermoléculaire, ainsi que les propriétés rhéologiques des solutions du polymère.

Le HY obtenu conformément à l'invention peut avoir un poids moléculaire très élevé. Ainsi, l'indice limite de viscosité peut être supérieur à 7000 cc/g, ce qui correspond à une viscosité-poids moléculaire moyen d'environ 6 x 10fi. Le poids-poids moléculaire moyen obtenu à partir des résultats de la dispersion lumineuse peut atteindre une valeur de 13 x 10®. On a constaté que ce désaccord entre les poids moléculaires moyens (poids et viscosité) trouvait toute sa signification, comme on l'expliquera ci-après. Il est bien entendu qu'un polymère de poids moléculaire sensiblement plus faible, par exemple 1 x 10s ou moins, peut être facilement obtenu par le procédé selon l'invention si on le désire. De même, un polymère d'un poids moléculaire désiré peut être obtenu en exposant HY, à une étape quelconque de sa récupération et de sa purification, à des agents connus pour provoquer la rupture de la liaison glucoside de la chaîne Polysaccharide. Ces agents bien connus sont des enzymes spécifiques, par exemple l'hyaluronidase, des systèmes engendrant des radicaux libres, des forces de cisaillement, un apport thermique, des alcalis et des acides forts, etc.

Le volume spécifique partiel (psv) de HY en solution dépend de la force ionique de la solution. Il a été déterminé par densitométrie

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pour une solution de HY dans l'eau contenant 0,15M de NaCl dans une gamme de concentration allant de zéro à 0,5 mg/ml et a été trouvé égal à 0,627 cc/g.

La distribution de ESD pour un échantillon de HY dissous dans une solution de NaCl 0,15M en solution à 1% est représentée à la figure 4. H ressort des données représentées que HY existe sous une forme très fortement agrégée, bien que ces agrégats soient stables et ne se déposent pas.

Les propriétés rhéologiques d'un produit type, de poids moléculaire ultra-élevé, préparé selon l'invention, sont illustrées aux figures 1 à 3. On a trouvé que ce produit formait des solutions (0,5% en poids et davantage) dotées de propriétés viscoélastiques remarquables.

Les paramètres suivants caractérisent au mieux les propriétés élastiques des solutions de polymère: modules de conservation dynamique (G'), fréquence du «point de transposition» (point auquel le module de conservation dynamique G' devient supérieur aux modules de perte dynamique G"), angle de phase et temps de relaxation.

HY forme des solutions très visqueuses dans l'eau ou dans des solutions aqueuses d'électrolytes. La viscosité de la solution dépend de la concentration en polymère, de la teneur en électrolyte, de la température, et diminue avec la vitesse de cisaillement, c'est-à-dire que les solutions de HY présentent une pseudoplasticité marquée.

Lorsqu'on examine les propriétés rhéologiques des solutions de HY, il doit être entendu que ces propriétés sont fonction en grande partie du poids moléculaire du produit, comme dans le cas de tout autre polymère. Il a été mentionné précédemment que HY pouvait être obtenu avec un poids moléculaire variant dans une large mesure et que les propriétés rhéologiques variaient en conséquence. Ainsi, on a trouvé que pour le produit de poids moléculaire ultra-élevé (indice limite de viscosité supérieur à 4500 cc/g), la viscosité d'une solution à 1% en poids dans une solution de NaCl 0,15M dans l'eau atteint des valeurs de 1000 Pa-s et même supérieures pour une vitesse de cisaillement de 0,055, alors qu'elle est seulement d'environ 2 Pa-s pour une solution à 1 % en poids de polymère d'un indice limite de viscosité d'environ 1000 cc/g. On a trouvé que les propriétés élastiques des solutions de HY dépendent également du poids moléculaire du polymère. Ainsi, le module de conservation dynamique G' pour une solution à 1 % en poids de HY à poids moléculaire ultra-élevé dans NaCl 0,15M est d'environ 40 Pa, à une fréquence de 0,01 Hz, tandis qu'il est seulement d'environ 0,2 Pa pour une solution de HY d'indice limite de viscosité d'environ 1000 cc/g. La fréquence du «point de transposition», qui caractérise d'une excellente façon le rapport entre les propriétés élastiques et visqueuses des solutions de polymère, est habituellement inférieure à 0,025 Hz pour des solutions de HY à 1% en poids dans NaCl 0,15M à 25° C, lorsque le poids moléculaire du polymère se situe dans une gamme comprise entre environ 1,5 x 10® et 8 x 106 et davantage.

Les propriétés physico-chimiques et rhéologiques d'un échantillon de HY et de sa solution ont été comparées avec les mêmes propriétés d'un produit HA obtenu suivant un procédé bien connu et sont indiquées au tableau 1 et aux figures 4 et 5. Le produit utilisé comme témoin est le HA récupéré à partir de crêtes de coq par extraction à l'eau suivie d'une déproténéisation selon la méthode dite de Sevag, laquelle comporte plusieurs extractions au chloroforme [G. Blix, O. Shellman, «Arkiv for Kemi, Minerai Geol.» 19A, 1 (1945)].

(Tableau en tête de la colonne suivante)

Les données indiquées au tableau 1 et à la figure 4 font apparaître de nettes différences entre HY et HA. En premier lieu, la viscosité-poids moléculaire moyen et le poids-poids moléculaire moyen pour le produit connu ont approximativement les mêmes valeurs (le poids-poids moléculaire moyen est légèrement inférieur), tandis que, pour le produit selon l'invention, le poids-poids moléculaire moyen est environ quatre fois plus élevé que la viscosité-poids moléculaire moyen. En second lieu, la valeur plus élevée du p s v pour une solu-

Tableau 1

Données comparatives physico-chimiques et rhéologiques pour des échantillons de HY et HA

Paramètre

HY

HA

Indice limite de viscosité, cc/g

4729

3562

Poids moléculaire déduit des données

viscosimétriques, x 106

3,28

2,30

Poids moléculaire déduit des données

de dispersion de la lumière, x 10®

13,30

2,86

Poids moléculaire déduit des

données de sédimentation, de

diffusion, x 106 (PSU)

13,60

2,14

Volume spécifique partiel, cc/g

0,627

0,570

Propriétés rhéologiques d'une solution à

1% en poids dans NaCl aqueux 0,15M:

viscosité de cisaillement à une vitesse

de cisaillement 0,055" \ Pa • s

969

305

Modules de conservation dynamique (G')

à une fréquence de 0,01 Hz, Pa

39,8

10,1

Fréquence au «point de transposition» Hz

0,0056

0,035

Temps de relaxation pour réduire les

modules de moitié

58

19

Angle de phase, degrés

à la fréquence 0,002 Hz

58,7

76

à la fréquence 10 Hz

8,5

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tion de HY comparativement à HA, prouve que les macromolécules de HY ont une plus grande dimension. En troisième lieu, l'agrégation des macromolécules de HY en solution fournit des agrégats sensiblement plus gros, comparativement aux solutions de HA, ce qui conduit à penser qu'il existe non seulement de plus grandes dimensions de macromolécules de HY, mais également une plus forte interaction intermoléculaire. Enfin, les solutions de HY sont sensiblement plus visqueuses et élastiques que des solutions d'égales concentrations en HA. Bien que la viscosité accrue puisse être attribuée à une valeur plus élevée de la viscosité-poids moléculaire moyen, l'accroissement remarquable observé dans l'élasticité ne peut guère être appliqué pour la même raison.

Toutes ces observations ont conduit à la conclusion que la modification chimique de l'acide hyaluronique, in situ avant son extraction du tissu, bien que n'entraînant que des changements mineurs dans la composition chimique du polymère, occasionne en même temps des modifications très marquées des paramètres physicochimiques et des propriétés rhéologiques. Cela ne peut avoir lieu que si la modification de la composition chimique correspond à des modifications importantes dans la structure macromoléculaire.

La forme et la conformation des macromolécules de HA en solution ont été étudiées par diverses méthodes, et on dispose d'une littérature abondante sur ce sujet. Ces études indiquent que les macromolécules ont une configuration en enroulement aléatoire étendu et s'enchevêtrent mutuellement pour une concentration relativement faible (par exemple 0,1%) du polymère dans la solution. A une concentration plus élevée, on considère que la solution contient un réseau tridimensionnel continu de chaînes polymères. On a constaté que les liaisons glucosides dans les macromolécules de HA présentaient une rigidité considérable. Plusieurs mécanismes, tels que l'interaction solvant-soluté, l'interaction avec de petites quantités de protéines présentes dans un grand nombre de préparations de HA et des interactions interchaînes, ont été proposés pour expliquer ces phénomènes [voir par exemple E.A. Balazs, Physical Chemistry of Hyaluroni Acid, «Fed. Proceed.» 17,1086-1093 (1958)]. Certains auteurs ont proposé une double structure en hélice pour les macromolécules de HA et ont pensé que ces segments doubles en hélices pouvaient jouer un rôle de liaisons transversales conférant les propriétés rhéologiques inhabituelles des solutions de HA [C.M. Dea,

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R. Moorhous, D.D. Rees, S. Arhott, J.M. Guss et E.A. Balazs, «Science» 179, 560-562 (1972); S. Arnott, A.R. Mitra et S. Raghu-natan, «J. Mol. Biol.» 169, 861-872 (1983)].

En prenant en considération ces études et observations, on est parvenu à l'hypothèse selon laquelle le produit conforme à l'invention (HY) pouvait contenir un nombre supplémentaire de liaisons transversales introduites, durant le traitement du tissu, avec un agent immobilisant la réticulation de protéines. Les agents utilisés conformément à l'invention, tels que le formaldéhyde, sont très réactifs vis-à-vis de groupes chimiques variés, leur réactivité étant sensiblement fonction de conditions réactionnelles telles que le pH, la température, la concentration, etc. Les groupes hydroxyles d'acide hyaluronique ne réagissent manifestement pas avec ces agents dans les conditions du traitement, du fait que le produit obtenu après traitement est toujours soluble dans l'eau et qu'en conséquence il ne présente pas un degré important de polymère à liaisons transversales. La quantité de liaisons transversales supplémentaires introduites dans le polymère au cours du traitement n'est probablement pas assez faible pour entraîner l'insolubilité du polymère, mais suffisamment importante pour accroître notablement l'interaction entre les macromolécules et, de ce fait, l'élasticité de la solution polymère. Plusieurs représentants pour une telle réaction avec un agent de traitement sont les groupes acétamido de l'acide hyaluronique, les groupes amino non acétylés qui peuvent être présents en petites quantités dans l'acide hyaluronique, et des groupes amido, amino et autres groupes réactifs de protéines, lesquels sont présents dans la matrice intercellulaire du tissu durant le traitement. Il n'est guère probable que les groupes acétamido de HA eux-mêmes puissent fournir des liaisons transversales intermoléculaires. Dans les études de la réaction des protéines avec le formaldéhyde (voir par exemple J.F. Walker, «Formaldehyde», Reinhold Pubi. Corp., NY, 1953, pp. 312-317), on a trouvé que des groupes amides eux-mêmes d'une protéine ne pouvaient pas fournir de liaisons transversales et que l'une des réactions les plus probables dans la formation des liaisons transversales était une réaction du formaldéhyde avec des groupes amino donnant des groupes N-mêthylol amino qui, de leur côté, réagissent avec des groupes amides.

En conséquence, deux mécanismes sont possibles pour l'introduction d'un nombre limité de liaisons transversales dans des macromolécules de HA. Le premier mécanisme implique la réaction entre un agent de réticulation, tel que le formaldéhyde, et des groupes acétamido et amino libres de HA, dont l'existence dans le HA est très probable [E.A. Balazs, «Fed. Proceed.» 25,1817-1822 (1966)].

Le second mécanisme possible envisage la participation des protéines ou des polypeptides dans la réaction'de réticulation. Des rapports maintiennent, dans la littérature, l'idée que des protéines ou des polypeptides sont liés par covalence à la molécule de HA [Yuko Mikum-Takagaki et B.P. Toole, «J. Biol. Chem.» 256 (16), 8463-8469 (1981)] ou peuvent être associés d'une autre manière à des molécules de HA. Dans ce cas, des liaisons transversales peuvent être formées entre une macromolécule de HA, et une partie protéine et une autre macromolécule de HA, ou entre une protéine liée par covalence à deux macromolécules de HA.

Aucun de ces mécanismes ne doit être considéré comme limitant la présente invention. Il est bien entendu que d'autres mécanismes pour l'introduction dans le produit de petites quantités de Maisons transversales covalentes, conformément à l'invention, sont possibles.

De toute façon, la caractéristique essentielle de la présente invention est la modification chimique de HA dans le tissu durant le processus de sa récupération, vraisemblablement par introduction d'un petit nombre de liaisons transversales dans les macromolécules de HA, le degré de modification étant suffisant pour augmenter sensiblement les propriétés élastiques des solutions de polymère sans nuire aux propriétés avantageuses de HA, telles que son aptitude à fournir des solutions très visqueuses en milieu aqueux, sa biocompatibilité, etc.

L'acide hyaluronique HY, chimiquement modifié, préparé conformément à l'invention, peut être utilisé de façon pleinement satisfaisante dans un grand nombre d'applications dans le domaine biomédical et en cosmétique, par exemple comme auxiliaire en viscochi-rurgie, pour des enduits destinés à améliorer la biocompatibilité de divers matériaux, comme constituant de diverses préparations pharmaceutiques, dans des produits pour les soins de la peau, etc. Les propriétés améliorées de ce polymère, telles qu'un accroissement de l'élasticité, procurent des avantages substantiels lorsque HY est utilisé.

HY peut être également utilisé comme matériau de départ pour de nouveaux produits obtenus par modification chimique complémentaire, telle qu'une liaison transversale au moyen d'agents conventionnels de réticulation. On a trouvé que les propriétés spéciales de HA modifié chimiquement conformément à l'invention, ainsi que de ses solutions, constituent une occasion d'obtenir les produits précités modifiés complémentairement, lesquels possèdent également certaines propriétés inhabituelles. Ainsi, on a trouvé qu'un matériau insoluble dans l'eau, ayant l'aspect d'une gelée, pouvait être obtenu à partir du produit selon l'invention par réticulation avec la divinyl sulfone en solution alcaline. Ce matériau est un gel fortement gonflé. La concentration du polymère dans le gel dépend de la composition de la phase liquide, laquelle peut être de l'eau ou des solutions aqueuses de substances de divers faibles poids moléculaires, telles que des électrolytes. Dans le cas d'une solution saline physiologique (NaCl 0,15M dans l'eau), la concentration en polymère peut être comprise entre 0,15 et 0,40% en poids. Ce matériau présente des propriétés rhéologiques très intéressantes (figures 5, 6 et 7). Ainsi, la composante élastique des modules dynamiques complexes (G') est plus élevée que les modules de perte (G") pour toutes les fréquences testées. En même temps, le matériau se comporte comme un composé pseudoplastique à des faibles taux de cisaillement, c'est-à-dire qu'il présente une viscosité importante qui diminue avec le taux de cisaillement. Ce matériau est également caractérisé par un temps de relaxation très long. Il y a tout lieu de penser que c'est une structure unique des solutions de HY, obtenues conformément à l'invention, qui permet d'obtenir le produit précité, du type en gelée, doté de ces propriétés rhéologiques particulières. En d'autres termes, les modifications chimiques dans le HA se produisant lors du procédé de récupération selon l'invention affectent non seulement la structure et les propriétés de HY, mais également les propriétés des produits obtenus à partir de HY. De ce fait, on a trouvé que, lorsque le HA, obtenu conformément aux méthodes connues dans la technique, à savoir en éliminant les protéines par plusieurs extractions au chloroforme, était utilisé comme produit de départ pour une réticulation avec la divinyl sulfone, on obtenait un produit insoluble doté de propriétés rhéologiques sensiblement plus mauvaises que celles de la présente invention.

Il est entendu que bien d'autres matériaux modifiés peuvent être obtenus à la suite d'une modification supplémentaire du produit, obtenu conformément à l'invention, par exemple des gels fortement réticulés, des films insolubles, des enduits, etc.

Les exemples suivants illustrent des formes d'exécution préférées de l'invention, cette description ne présentant toutefois aucun caractère limitatif.

Exemple 1:

Des crêtes de coq sont lavées à fond avec une solution aqueuse à 1% de chlorure de cétylpyridinium, puis avec de l'eau déionisée, puis sont finalement congelées. Les crêtes congelées sont découpées, à l'aide d'une machine à trancher, en tranches d'environ 1 à 2 mm d'épaisseur. On prépare un mélange contenant 1000 g d'acétone, 100 g de formaline à 37% et 50 g d'acétate de sodium et l'on y ajoute 1000 g de crêtes coupées en tranches. On maintient le mélange de crêtes et de liquide de traitement (pH 6,7) pendant 24 heures à une température d'environ 20° C, tout en agitant lentement. On sépare ensuite le liquide des crêtes par filtration sur tamis en nylon. Les crêtes traitées sont alors lavées avec 500 g d'acétone, puis

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séchées avec 2,5 1 d'eau déionisée et on effectue l'extraction pendant 72 heures, à une température d'environ 20° C, tout en agitant lentement. On sépare les crêtes de l'extrait par filtration sur tamis de nylon, l'extrait étant en plus filtré sur une matière filtrante du type cellulosique («Micro-Media»® M70, Ertel Engineering Co.). La concentration en HA dans ce premier extrait est de 0,92 mg/ml. On mélange 21 de l'extrait avec 41 d'acétone et 20 g d'acétate de sodium. Le précipité blanc fibreux formé est rassemblé, lavé à l'acétone et séché dans une étuve à pression réduite, à 35° C. On obtient 1,75 g du produit. Le rapport hexosamine/acide hexuronique pour le produit est trouvé égal à 1 + 0,05. La teneur en formaldéhyde dans le produit est trouvée égale à 0,0150%. Ainsi, le produit est identifié comme étant le Hylan. La teneur en protéines dans le produit est de 0,35% et l'indice limite de viscosité est de 4320 cc/g.

Après la première extraction, on mélange les crêtes avec 2,51 d'eau déionisée et l'on effectue l'extraction pendant 48 heures à la température ambiante. On sépare les crêtes et l'extrait est filtré comme décrit précédemment. La concentration en HA dans le second extrait est de 0,65 mg/ml. On récupère 1,26 g du produit à partir de l'extrait, par précipitation, comme décrit précédemment. Cette fraction est également caractérisée comme étant le hyaluronate de sodium chimiquement modifié avec une teneur en formaldéhyde de 0,014%. La teneur en protéines est de 0,27% et l'indice limite de viscosité est de 4729 cc/g. On évalue les propriétés rhéologiques d'une solution à 1% en poids dans une solution aqueuse de NaCl 0,15M. Les résultats sont indiqués au tableau 1.

On effectue une troisième extraction à l'eau des crêtes, de la manière précédemment décrite. La concentration en HA dans le troisième extrait est de 0,33 mg/ml, et l'on récupère de cet extrait 0,60 g de HA, la teneur en protéines étant de 0,20%, l'indice limite de viscosité de 4830 cc/g et la teneur en formaldéhyde de 0,0115%.

On récupère ainsi au total 3,61 g de hyaluronate de sodium chimiquement modifié, à partir de 1 kg de crêtes de coq.

Exemple 2:

1 kg de crêtes de coq coupées en tranches, préparées comme dans l'exemple 1, est homogénéisé avec un mélange renfermant 1 kg d'acétone et 150 g d'une solution à 40% en poids de glutaraldéhyde dans l'eau. Le pH du mélange est de 6,9. On maintient le mélange pendant 6 heures à température ambiante (environ 20° C), tout en agitant lentement (environ 1 tr/min). On sépare ensuite les crêtes du liquide, on les lave à l'acétone et on les sèche à l'air jusqu'à ce qu'elles atteignent la moitié de leur poids initial. Les crêtes séchées sont extraites avec 3 1 d'eau déionisée pendant 96 heures à une température d'environ 20° C. L'extrait est séparé des crêtes et filtré comme décrit dans l'exemple 1. La teneur en HA dans l'extrait est de 1,4 mg/ml. Le produit présente, après précipitation à l'acétone, conformément à l'exemple 1, une teneur en protéines de 0,42% et un indice limite de viscosité de 3700 cc/g.

Exemple 3:

On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 2, à l'exception qu'on utilise la même quantité de solution à 40% en poids de glyoxal dans l'eau, à la place de la solution de glutaraldéhyde. La concentration en HA dans l'extrait est de 0,92 mg/ml. La teneur en protéines dans le produit est de 0,5% et l'indice limite de viscosité est de 3930 cc/g.

Exemple 4:

Des crêtes de coq sont lavées, congelées, découpées en tranches et traitées par le mélange acétone-formaldéhyde, conformément à l'exemple 1. Les crêtes, après avoir été séchées à la moitié de leur poids initial, sont extraites avec 2,51 d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,05M dans l'eau (pH supérieur à 11), pendant 120 heures, à une température d'environ 20° C. L'extrait est séparé et filtré comme décrit dans l'exemple 1. La concentration en HA dans l'extrait est de 3,6 mg/ml. Un produit blanc est précipité par un mélange acétone-acétate de sodium, lavé à l'acétone et séché. On récupère ainsi 7,5 g d'un produit ayant une teneur en protéines de 0,2% et un indice limite de viscosité de 1310 cc/g.

Exemple 5:

Des crêtes de coq sont lavées, congelées, découpées en tranches, et 1 kg de crêtes est homogénéisé avec un mélange contenant 1 kg d'isopropanol, 100 g de formaline à 37%, 50 g d'acétate de sodium et 100 g de chloroforme. Le traitement est effectué tout en agitant lentement pendant 16 heures, à une température d'environ 20° C. L'extraction et la précipitation sont effectuées comme décrit dans l'exemple 1. La concentration en HA dans l'extrait est de 0,68 mg/ml. La teneur en protéines dans le produit est de 0,46% et l'indice limite de viscosité est de 4900 cc/g.

Exemple 6:

Des crêtes de coq sont lavées, congelées, découpées en tranches, traitées par un mélange d'acétone-formaldéhyde, lavées à l'acétone, séchées et extraites à l'eau, comme décrit dans l'exemple 1. L'extrait est homogénéisé avec un mélange de 21 d'acétone et 11 de chloroforme. On obtient 1,9 g d'un produit blanc du genre fibreux de teneur en protéines 0,05% et d'indice limite de viscosité 4400 cc/g.

Exemple 7:

On traite 1 kg de crêtes découpées en tranches, préparées comme décrit dans l'exemple 1, avec un mélange contenant 1 kg d'acétone, 50 g de formaline à 37% et 50 g d'acétate de sodium, pendant 24 heures, à une température d'environ 20° C, tout en agitant légèrement. L'extrait est séparé et filtré, et le produit est précipité comme décrit dans l'exemple 1. On obtient 1,6 g d'un produit blanc d'une teneur en protéines de 0,45%, d'un indice limite de viscosité de 5300 cc/g et d'une teneur en formaldéhyde combiné de 0,008%.

Exemple 8:

On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, à cette exception près qu'après traitement à l'acêtone-formaldéhyde, les crêtes sont séchées au tiers de leur poids initial et que la première extraction à l'eau est effectuée pendant 96 heures.

La concentration en ELA dans le premier extrait est de 1,05 mg/ml. Le produit précipité de cet extrait présente une teneur en protéines de 0,25% et un indice limite de viscosité de 4930 cc/g. Un essai d'oscillation effectué sur une solution à 1 % de ce produit en solution aqueuse de NaCl 0,15M donne un «point de transposition» à une fréquence de 0,020 Hz.

La concentration en HA dans le second extrait est de 0,58 mg/ml. La fraction obtenue à partir de cet extrait présente une teneur en protéines de 0,19% et un indice limite de viscosité de 7300 cc/g. La teneur en formaldéhyde combiné est de 0,01%. La fréquence du «point de transposition» lors de l'essai d'oscillation est de 0,005 Hz.

On récupère au total 3,5 g de HA chimiquement modifié, au cours des trois extractions consécutives.

Exemple 9:

Des crêtes de coq sont lavées, congelées, découpées en tranches, puis 1 kg de ces tranches est mélangé avec 1 kg d'acétone, 200 g de formaline à 37% et 100 g de chloroforme. On ajuste le pH du mélange à 4,0 avec de l'acide chlorhydrique. La concentration en HA dans le premier extrait est de 0,58 mg/ml. Le produit est récupéré de l'extrait par précipitation à l'acétone-acétate de sodium, conformément à l'exemple 1. La teneur en protéines dans le produit est de 0,12% et l'indice limite de viscosité est de 4025 cc/g. La teneur en formaldéhyde combiné dans le produit est de 0,02%. La fréquence du «point de transposition» lors de l'essai d'oscillation pour une solution à 1% en poids du produit dans une solution aqueuse de NaCl 0,15M est de 0,006 Hz.

Exemple 10:

Des crêtes de coq sont lavées, congelées, découpées en tranches, puis 1 kg de ces tranches est traité par un mélange d'acétone-formal-

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déhyde, comme décrit dans l'exemple 1, excepté que le pH du mélange est ajusté à 11,0 avec de l'hydroxyde de sodium. Les crêtes sont séchées et extraites à l'eau, conformément à l'exemple 1. La concentration en HA dans l'extrait est de 0,69 mg/ml. Le produit est précipité de l'extrait conformément à l'exemple 1, excepté qu'on utilise de l'isopropanol à la place de l'acétone. On obtient 1,3 g d'un matériau blanc fibreux d'une teneur en protéines de 0,45%, d'un indice limite de viscosité de 5050 cc/g et d'une teneur en formaldéhyde de 0,012%. La fréquence du «point de transposition» lors de l'essai d'oscillation pour une solution de 1% en poids du produit dans une solution aqueuse de NaCl 0,15M est de 0,012 Hz.

Exemple 11:

Cet exemple illustre l'obtention d'un matériau du type gelée, à partir du Hylan. On mélange 0,88 g du produit précipité à partir du second extrait dans l'exemple 1 avec 28,3 g d'une solution aqueuse de NaOH 0,05N et on agite le mélange pendant 60 minutes à température ambiante. A la solution visqueuse ainsi obtenue, on ajoute un mélange de 0,26 g de divinyl sulfone et 1,0 g de NaOH aqueux 0,5N. Le mélange résultant est agité pendant 10 minutes, puis abandonné 50 minutes à la température ambiante. On obtient un gel élastique, incolore et limpide. Ce gel est introduit dans 0,5 1 d'une solution saline 0,15M et abandonné une nuit. On élimine ensuite le liquide en excès dans le gel fortement gonflé, puis on ajoute au gel 0,5 1 d'une solution saline récemment préparée, après quoi le mélange est agité sur un agitateur à secousses pendant 24 heures. On décante le liquide en excès à partir du matériau insoluble gonflé. On obtient un matériau limpide du type gelée. La concentration en HA dans le produit est déterminée et trouvée égale à 0,275% en poids. Les propriétés rhéologiques du matériau sont illustrées aux figures 5, 6 et 7.

Exemple 12:

Traitement des crêtes de coq avec 1ACH20

Du paraformaldéhyde marqué (14CH20) ayant une activité spécifique de 500 mCi/g (12CN Radiochemicals) est mélangé en une quantité correspondant à 5,0 mCi avec 1,0 ml d'une solution de formaldéhyde à 37% en poids dans l'eau, à laquelle on ajoute 0,1 ml d'une solution d'hydroxyde de sodium IN dans l'eau. Le mélange est versé dans un récipient bouché hermétiquement, puis chauffé à 60° C et neutralisé avec 0,1 ml d'acide acétique aqueux IN. La radioactivité de la solution obtenue est mesurée dans 10 ml d'un milieu liquide de comptage à scintillation Hydrofluor® (National Diagnostic), en utilisant un compteur à scintillation liquide «Searle Isocap 300» avec correction de calcul pour l'efficacité, basée sur la méthode de l'étalon externe. La concentration en formaldéhyde est déterminée selon une méthode colorimétrique à l'acide chromotropique. L'activité spécifique mesurée de la solution obtenue est de 0,555 mCi/mmol CH20. La solution de formaldéhyde marqué est mélangée avec 7,5 g d'acétone, 1 g de chloroforme et 0,5 g d'acétate de sodium. 7,5 g de crêtes de coq découpées en tranches sont mélangés avec la solution et le traitement est effectué pendant 18 heures à une température d'environ 20° C. Les crêtes sont séparées du liquide, lavées plusieurs fois à l'acétone et séchées à l'air jusqu'à la moitié de leur poids initial. On ajoute aux crêtes 15 ml d'eau bidistillée et on laisse l'extraction se poursuivre pendant 96 heures à une température d'environ 20° C. L'extrait est séparé des crêtes et filtré sur plusieurs couches de papier-filtre (Whatman R N° 1). On répète le même processus pour obtenir un second extrait des crêtes. HY est précipité à partir des extraits, sous la forme d'un matériau blanc

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d'aspect fibreux, en ajoutant à ces extraits du CH3OONa en une quantité fournissant une solution à 1% en poids et 4 volumes d'éthanol à 95%. Le matériau d'aspect fibreux est séparé, lavé à fond avec de l'acétone, séché, puis redissous dans l'eau pour donner une solution d'une concentration en HY d'environ 1 mg/ml. Le HY est reprécipité de cette solution comme précédemment décrit, de nouveau soigneusement lavé à l'acétone, puis séché. Le produit sec est redissous une nouvelle fois dans l'eau distillée pour donner une solution contenant 0,84 mg/ml de HY. On mesure l'activité spécifique de cette solution, ce qui donne 194 dpm/ng de HA. Une dialyse complète de cette solution contre un tampon au phosphate 0,05M, pH 7,5, contenant du NaCl 0,15M, abaisse la radioactivité à 103 dpm/ng de HY. Une dialyse complète de cette solution contre du chlorhydrate de guanidium 4M abaisse l'activité à 101 dpm/ng de HY, ce qui indique que le formaldéhyde demeure dans le produit, même après traitement de la solution dans des conditions de dissociation des protéines. Sur la base de cette radioactivité mesurée du produit et de l'activité spécifique de la solution de formaldéhyde de départ, la teneur en formaldéhyde par rapport à HY a été calculée et trouvée égale à environ 0,2% en poids. Afin d'évaluer quelle quantité de formaldéhyde marqué se trouve associée à HY susceptible d'une dégradation enzymatique par l'hyaluronidase Streptomyces, on a préparé une autre solution du produit contenant 0,8 mg/ml de HY et ayant une activité de 1250 dpm/10 ni de solution. A 2 ml de cette solution, on ajoute 0,1 ml de tampon au citrate-phosphate (pH 5,6) contenant 33 TRU d'hyaluronidase Streptomyces (Miles Laboratories, Inc., activité spécifique 2000 TRU/mg HA, activité protéo-lytique inférieure à 5 x 1014 unités par TRU). A une autre portion de 2 ml de la même solution, on ajoute 0,1 ml du tampon sans l'enzyme. Les deux portions sont dialysées pendant 20 heures contre 1000 volumes de tampon au citrate-phosphate. Les volumes des deux échantillons après dialyse sont les mêmes. L'échantillon traité sans enzyme présente une concentration en HY de 0,76 mg/ml et une radioactivité de 552 dpm/10 (il. La concentration en HY dans l'échantillon traité par l'enzyme se trouve abaissée en dessous de niveaux détectables (10 [xg/ml) et la radioactivité est de 414 dpm/ 10 [il de solution. Ainsi, la radioactivité sensible de la hyaluronidase correspond à 20 dpm/ng de HY, ce qui correspond à 0,049% de formaldéhyde associé à HY capable d'être digéré par voie enzymatique. De tels échantillons marqués du produit sont en outre analysés par Chromatographie d'imprégnation du gel sur une colonne de verre de 1,6 x 90 cm, garnie de glycéryl-CPG 3000, de porosité 2869 + 8,3% (Electronucleonics, Inc.). Un tampon dégazé au borate 0,02M (pH 7,5) contenant du NaCl 0,15M est utilisé pour l'élution. Le volume exclu de la colonne (V0) est déterminé avec un échantillon de HY de poids moléculaire 4 x 10®, et le volume total (V,) de la colonne est déterminé au moyen de saccharose. L'élution se fait à un débit de 10 ml/h à 6°C. On recueille des fractions de 5 ml dont on détermine la concentration en HY et la radioactivité. On a trouvé que la radioactivité était éluée en même temps que HY dans le volume vide et que la digestion enzymatique éliminait à la fois HY et la radioactivité des fractions du volume vide. Le calcul a montré que l'activité spécifique associée au volume vide HY était de 14,6 dpm/ng de HY, ce qui correspond à 0,036% en poids de formaldéhyde dans le polymère. Cette valeur est en bon accord avec la valeur obtenue lors de l'essai de dialyse.

Des variantes et des modifications peuvent bien entendu être apportées dans la description qui précède, sans sortir pour cela du cadre de l'invention.

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4 feuilles dessins

Claims (24)

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   REVENDICATIONS

   1. Procédé d'obtention d'un acide hyaluronique modifié chimiquement, caractérisé en ce qu'il consiste:

   a) à traiter un tissu animal contenant de l'acide hyaluronique par un mélange de traitement aqueux comprenant une substance réagissant avec les protéines et l'acide hyaluronique, en vue d'effectuer une modification chimique in situ de l'acide hyaluronique contenu dans le tissu;

   b) à éliminer du mélange réactionnel l'excès du mélange de traitement;

   c) à extraire par l'eau l'acide hyaluronique modifié chimiquement, provenant du tissu animal traité;

   d) à séparer du tissu animal traité l'extrait contenant l'acide hyaluronique chimiquement modifié et e) à récupérer à partir de l'extrait l'acide hyaluronique chimiquement modifié.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance réagissant avec les protéines et l'acide hyaluronique, contenue dans le mélange de traitement aqueux, est un aldéhyde.
3. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'aldéhyde est le formaldéhyde, le glutaraldéhyde ou le glyoxal.
4. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le mélange de traitement aqueux comprend un solvant miscible à l'eau ne réagissant pas avec l'aldéhyde.
5. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le solvant est une cétone inférieure, un alcool inférieur ou un solvant aprotique.
6. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le solvant est l'acétone, la méthyléthyl cétone, l'éthanol, l'isopropanol, le diméthyl formamide, le diméthyl acétamide ou le diméthyl sul-foxyde.
7. 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le mélange de traitement aqueux renferme facultativement un électro-lyte et un solvant organique insoluble dans l'eau.
8. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'élec-trolyte est l'acétate de sodium et le solvant organique insoluble dans l'eau le chloroforme.
9. 9. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le rapport en poids de l'eau au solvant miscible à l'eau dans le mélange de traitement est de 1-5 : 4-8,5 et le rapport en poids de l'eau à l'aldéhyde de 1-5:0,02-1.
10. 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le mélange de traitement comprend, en parties en poids:

    eau 10-50

    solvant miscible à l'eau 40-85

    aldéhyde 0,2-10

    solvant insoluble dans l'eau 0,5-10

    électrolyte 0-20
11. 11. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le mélange de traitement présente un pH de 4 à 10, que le rapport en poids du mélange du traitement au tissu à traiter est au moins de 10:1 et que le traitement est effectué pendant environ 4 à 24 heures, à peu près à la température ambiante ou à une température inférieure à celle-ci.
12. 12. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le tissu animal est constitué par des crêtes de coq, ces crêtes étant coupées en tranches d'environ 1 à 3 mm d'épaisseur.
13. 13. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'excès du mélange de traitement est éliminé du mélange réactionnel par lavage du tissu traité avec un solvant ou un mélange de solvant et d'eau.
14. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le solvant utilisé pour le lavage du tissu traité est le même solvant que celui utilisé dans le mélange de traitement.
15. 15. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'extraction de l'acide hyaluronique modifié chimiquement est effectuée à une température inférieure à environ 25° C pendant un laps de temps compris entre environ 6 heures et plusieurs jours, le rapport en poids de l'eau au tissu traité étant d'environ 2-5:1, en se basant sur le poids du tissu non traité.
16. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le s tissu traité est séché à environ 25 à 50% de son poids traité avant l'étape d'extraction.
17. 17. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'extrait est séparé du tissu animal par filtration, centrifugation ou décantation.

    io 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la séparation est effectuée par filtration.
18. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la filtration se fait suivant un processus en deux étapes: une première étape, ou filtration grossière sur larges mailles, pour éliminer les

    15 morceaux de tissu animal, et une seconde étape, ou filtration fine, sur une matière cellulosique.
19. 20. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'acide hyaluronique modifié chimiquement est récupéré à partir de l'extrait, par précipitation avec un solvant, suivie du lavage et du

    20 séchage du précipité obtenu d'acide hyaluronique modifié chimiquement.
20. 21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le solvant utilisé pour la précipitation est l'acétone, l'éthanol ou l'isopropanol.

    25 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'un acide minéral ou un électrolyte est ajouté durant l'étape de précipitation.
21. 23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'acide minéral est HCl, H2S04 ou H3P04 et que l'électrolyte est

    30 l'acétate de sodium ou NaCl.
22. 24. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'acide hyaluronique modifié chimiquement est séparé de l'extrait par lyophilisation.
23. 25. Produit obtenu par le procédé selon la revendication 2.

    35 26. Acide hyaluronique modifié chimiquement selon la revendication 25, caractérisé par la présence d'environ 0,005 à 0,05% en poids de groupes aldéhyde de réticulation liés par covalence aux chaînes polymères d'acide hyaluronique.
24. 27. Procédé de réticulation de l'acide hyaluronique modifié chi-

    40 miquement, obtenu suivant le procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on soumet ledit acide hyaluronique modifié chimi-. quement à une réaction de réticulation avec la divinyl sulfone, dans des conditions alcalines, pendant environ 1 heure, à température ambiante.

    45 28. Produit obtenu par le procédé selon la revendication 27.