ITPD20120098A1 - "nuove formulazioni faramaceutiche contenenti condroitin solfato e derivati dell'acido ialuronico" - Google Patents

Description

Descrizione di una domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo “ Nuove formulazioni farmaceutiche comprendenti condroitin solfato e derivati dell’acido ialuronico"

CAMPO DELL’ INVENZIONE

La matrice cartilaginea à ̈ costituita da una struttura tridimensionale formata da molecole di collagene e da complessi aggregati di proteoglicani che risultano, a loro volta, costituiti da una struttura di supporto a base di acido ialuronico (HA) che interagisce con molecole di glicosamminoglicani (GAG) non covalentemente legate a sequenze polipeptidiche, conferendo così alla cartilagine proprietà sia biomeccaniche che viscoelastiche.

Infatti, ΓΗΑ à ̈ una molecola che possiede particolari proprietà viscoelastiche, sintetizzata e secreta in cavità articolare principalmente dai sinoviociti (Asari A. et al., Arch Histol Cytol, 1995, 58(l):65-76) e, per i suddetti motivi, à ̈ uno dei principali componenti dei liquido sinoviale che esibisce proprietà sia viscose che elastiche in modo dipendente dal numero e dal peso molecolare (MW) delle molecole di HA contenute in esso.

La natura viscoelastica del liquido sinoviale à ̈ quindi legata al contenuto di HA presente in cavità articolare e la sua concentrazione varia con l’età: infatti, nell’uomo inizia a diminuire già dopo i 25 anni. Le caratteristiche viscoelastiche del liquido sinoviale sono quantificabili tramite la misurazione dei suoi moduli: il primo modulo à ̈ chiamato G’ o modulo elastico perché rappresenta l’energia immagazzinata quando il polisaccaride à ̈ sottoposto ad una tensione/deformazione, il secondo modulo à ̈ definito G†o modulo viscoso poiché rappresenta l’energia che viene dissipata quando la molecola à ̈ sottoposta ad una tensione: in breve, G’ conferisce elasticità al fluido sinoviale mentre G†à ̈ indice di resistenza all’ attrito tra due superfici articolari, quindi di resistenza ad una tensione che potrebbe determinare la deformazione delle cartilagini articolari.

Durante i movimenti lenti, ΓΗΑ agisce come un lubrificante viscoso (proprietà conferita dal suo modulo G†), mentre durante i movimenti veloci assorbe con proprietà elastiche eventuali traumi o microtraumi che possono investire l’articolazione.

L’osteoartrosi/osteoartrite (OA) à ̈ una patologia fortemente invalidante caratterizzata dalla progressiva erosione delle cartilagini articolari per la degradazione della matrice articolare e la perdita dei componenti cellulari.

È noto come lo sbilanciamento meccanico che può coinvolgere l’articolazione nella sua complessità può essere Γ iniziale causa dell’ insorgenza della suddetta patologia.

Quest’instabilità articolare può essere sostanzialmente causata da diversi fattori (quali il trauma, Γ infiammazione del sistema articolare, l’erosione della cartilagine, una errata deambulazione o postura) e può determinare un’alterazione del delicato equilibrio esistente tra sintesi e degradazione della matrice extracellulare sintetizzata principalmente dai condrociti e dai sinoviociti.

Quando questa situazione di perfetta ma delicata omeostasi si spezza, la degradazione della matrice supera la sua sintesi e, conseguentemente, inizia un lento ma progressivo processo di degradazione male compensato dal corrispondente processo di sintesi, in seguito all’ avvenuta perdita dei condrociti.

Infatti, un eccessivo e/o non corretto caricamento delle articolazioni può causare una risposta condrocitaria che si esprime nella sintesi di quegli enzimi responsabili della degradazione della cartilagine stessa (chiamati Metalloproteasi (MMP)) sintetizzati dai condrociti quando stimolati da citochine infiammatorie come IL- 1 e TNF-a, che vengono prodotte e liberate nella cavità articolare soprattutto all’ instaurarsi di una patologia infiammatoria come ΓΟΑ. IL-1 infatti stimola la sintesi di alti livelli di ossido nitrico e inibisce la sintesi dei proteoglicani da parte dei condrociti stessi (Dozin B. et al., Matrix Biology, 2002, 21:449-459). La cartilagine infiammata produce inoltre elevate quantità di COX-2 che, a sua volta, determina la super-produzione e il rilascio in cavità articolare di PGE2che contribuisce ad esacerbare il grado di infiammazione e, quindi, il danno cartilagineo (Amin A. et al., i Clin Invest,1997, 99:1231).

Nell’ infiammazione acuta e cronica e nei maggiori processi degenerativi delle articolazioni (OA), la concentrazione e il MW dell’HA presente nel fluido sinoviale articolare diminuisce sensibilmente compromettendo così la sua capacità lubrificante. È noto che le caratteristiche funzionali del liquido sinoviale dipendono sia dalla concentrazione che dal grado di polimerizzazione dell’HA, e che loro alterazioni possono determinare un danno istologico articolare di tipo OA.

Infatti, il fluido sinoviale di articolazioni OA non riesce a proteggere in modo efficiente il tessuto sinoviale e la cartilagine articolare dagli effetti “negativi†degli stress meccanici che quotidianamente sollecitano le articolazioni: nei fluidi sinoviali non patologici all’ aumentare della strain frequency (frequenza di sforzo) i due moduli normalmente aumentano: a bassa frequenza prevale la componente viscosa mentre ad alta frequenza il valore del modulo elastico à ̈ maggiore di quello viscoso; nel liquido sinoviale di articolazioni OA si riscontrano invece valori di G’ e G†decisamente inferiori alla norma.

Il ricambio dell’ HA all’ interno del liquido sinoviale non patologico à ̈, generalmente, molto veloce, mentre nell’OA à ̈ stato riscontrato sia il suo calo in concentrazione (associato ad una diminuzione di GAG), sia Γ abbassamento del suo MW che una netta diminuzione del suo flusso di ricambio (Balazs EA. et al., J Rheumatol Suppl, 1993, 12:75-82; Belcher C. et al., Annals of thà ̈ Rheumathic Disease, 1997, 56:299-307).

Per questi motivi, Balazs per primo suggerì la possibilità di modificare l’evoluzione del processo osteoartrosico mediante rapporto di HA esogeno direttamente in cavità articolare.

Diversi sono i farmaci attualmente in commercio per la somministrazione intra- articolare di HA nell’OA, tra i quali troviamo: Hvalgan<®>. HA purificato da creste di gallo con MW:5-7,3 X IO<5>Da (US5,925,626), Svnvisc<®>. (Hylan G-F 20) HA crosslinkato con formaldeide e divinilsulfone con MW:6-7 X IO<6>Da (US 4,713,448), Artz<®>. HA con MW : 6, 2- 1,2 X IO<5>Da.

Dati clinici ormai consolidati, hanno dimostrato come ΓΗΑ iniettato intra- articolarmente svolga una significativa azione di viscosupplementazione che migliora le capacità funzionali dell’arto affetto da patologia OA, con conseguente riduzione del dolore articolare.

L’HA à ̈ un etero-polisaccaride composto da residui alternati di acido D-glucuronico e N-acetil-D-glucosammina. E’ un polimero a catena lineare con peso MW che può variare tra 50.000 e 13 x IO<6>Da, a seconda della fonte dalla quale viene ottenuto e dai metodi di preparazione impiegati. E’ presente in natura nei gel pericellulari, nella sostanza fondamentale del tessuto connettivo degli organismi vertebrati (dei quali rappresenta uno dei componenti principali), nel fluido sinoviale delle articolazioni, nell’ umor vitreo e nel cordone ombelicale. E’ noto come ΓΗΑ, attraverso il suo recettore di membrana CD44, moduli molti e diversi processi relativi alla fisiologia e alla biologia della cellula come, ad esempio, la proliferazione, la migrazione, il differenziamento cellulare e l’angiogenesi, e come svolga altresì altre funzioni come Γ idratazione dei tessuti e la lubrificazione delle articolazioni.

Recentemente à ̈ stato sperimentato con successo Γ utilizzo intraarticolare del condroitin solfato (CS) come agente antiinfiammatorio dell’ articolazione OA: costituente dei proteoglicani di matrice, in situazioni non patologiche contribuisce all’ idratazione delle cartilagini e conferisce resistenza alla compressione meccanica; à ̈ stata invece dimostrata la sua capacità nel diminuire l’espressione delle MMP nei condrociti di articolazioni OA, ed anche la sua capacità nell’ indurre la sintesi di HA ad alto MW in fibroblasti sinoviali OA (David-Raoudi M et al., Glyeobiology, 2009, 19:813-815).

È un glicosamminoglicano solfatato, costituito da unità disaccaridiche formate da N-acetil-galattosammina e acido D-glucuronico in cui la maggior parte dei residui di gaiatto sammina sono solfatati in posizione 4 o 6, rendendo il polisaccaride fortemente anionico.

Il CS si à ̈ rivelato anche capace di ridurre l’attività osteocl astica riducendo così il riassorbimento osseo in generale e, in modo particolare, il riassorbimento subcondrale, processo che coinvolge sia le fasi iniziali che finali dell’OA; l’attivazione osteoclastica à ̈ determinante anche “nell’ osteoporosi transitoria regionale†, patologia potenzialmente invalidante che determina osteopenia e infiammazione focali (Massara A. et al., Reumatismo, 2005, 57:5-15). Inoltre, CS à ̈ stato testato con buoni risultati anche in patologie infiammatorie come le sinoviti e le tendiniti (Wildi LM. et al., Ann Rheum Dis, 201 1 , 70:982-989).

Per le proprietà anti-infiammatorie sopra scritte, il CS à ̈ stato inizialmente sperimentato in chirurgia oftalmica in associazione con HA di specifico MW, associati in buffer acquosi a specifici rapporti ponderali (US6, 051,560).

Il CS in associazione con ΓΗΑ di MW 500-750KD à ̈ stato sperimentato con notevole successo anche come terapia intraarticolare dell’OA di stadio I e II, in rapporto ponderale 4:3 con HA, in tampone fosfato e sodio cloruro, con una viscosità finale complessiva compresa da 68 a 1 15 cps misurata a 1 sec-1 a 25°C, per una terapia complessiva di 2-6 iniezioni per un periodo di efficacia terapeutica da 1-3 mesi (EP1 443945).

Infine, ampliamente noti all’esperto del ramo sono i cambiamenti di viscosità dei fluidi viscoelastici costituiti dall’associazione di CS con HA: i risultati sperimentali evidenziano come il CS aumenti la viscosità di soluzioni di HA con MW da 50 a 1900KD (vs formulazioni contenenti solo HA alla medesima concentrazione) benché la viscosità del CS sia molto bassa ed irrilevante vs quella dell’ HA; tuttavia i due moduli G’ e G†delle soluzioni di HA non vengono modificati in seguito all’aggiunta di CS (Nishimura M. et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1998, 1380:1-9).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

Oggetto della presente invenzione sono nuove formulazioni farmaceutiche comprendenti CS in associazione con derivati dell’ HA scelti tra:

• HA salificato con metalli alcalini o alcalino/terrosi, di MW medio ponderale compreso tra i 2500-3000KD (HA-HMW); • HYADD<®>: ammidi dell<*>HA con ammine della serie alifatica, aralifatica, cicloalifatica, aromatica, ciclica ed eterociclica, con un grado (molare) di amidazione dal 0,1 al 10% (HPLC) , à ̈ preferibile l’ammide dell’ HA con esadecilammina con una percentuale di amidazione tra Γ 1 e il 8% (EP 1095064);

• Derivati O-solfatati dell’ HA di 1° grado di solfatazione : HAS1 (EP 702699);

• ACP : esteri interni dell’HA (autocrosslinkati) con una percentuale di esterificazione non superiore al 10%, preferibilmente tra Γ1 e il 5% di esterificazione (EP 341745); • Derivati dell’HA costituiti dalla miscelazione di ACP+HBC (l’HBC à ̈ HA crossi inkato con BDDE, in rapporto ponderale con ACP da 25:75 a 75:25; WO201 1/023355).

Queste nuove composizioni farmaceutiche presentano caratteristiche reologiche completamente diverse dai derivati di HA di partenza e dalle composizioni costituite da HA e CS precedentemente descritte e quindi note allo stato dell’arte. Infatti, queste nuove composizioni evidenziano importanti modifiche reologiche dei moduli G’ e G†rispetto al derivato di partenza, a parità di concentrazione e condizione d’analisi.

Questo risultato à ̈ del tutto inaspettato poiché i dati noti all’esperto del ramo (precedentemente citati) hanno invece dimostrato, in modo chiaro e inequivocabile, che i moduli elastici e viscosi dell’HA non vengono assolutamente modificati dall’aggiunta di CS (Nishimura M. et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1998, 1380:1-9).

I risultati ottenuti dalla Richiedente hanno invece evidenziato come: • l’associazione di CS ad HAS di 1° grado di solfatazione determini un aumento altamente significativo del modulo viscoso G†della nuova composizione farmaceutica HAS1/CS. conferendole caratteristiche reologiche proprie di un viscosupplementante (come lo Hyalgan<®>, di seguito dimostrato), associando ad esse sia le note proprietà anti- infiammatorie del CS che le capacità anti- infiammatorie dell’HASl (di seguito riportate), in sinergia tra loro.

• Per tutti gli altri derivati dell’HA sopra rivendicati, la loro associazione con CS (composizioni HYADD/CS, ACP+HBC/CS, ACP/CS e HA-HMW/CS) ha determinato una significativa diminuzione del valore del modulo elastico G’ mantenendo inalterato il modulo viscoso G†: di conseguenza, le nuove composizioni farmaceutiche presenteranno caratteristiche reologiche proprie di un viscosupplementante in cui la componente viscosa risulta proporzionalmente aumentata rispetto al derivato di partenza, tale nuova composizione sarà quindi capace di maggiore resistenza agli attriti e presenterà maggiori capacità di lubrificazione articolare, associando ad esse sia le note proprietà anti- infiammatorie del CS che le capacità antiinfiammatorie proprie dei derivati dell’ HA (di seguito, ad esempio, vengono riportati i dati sperimentali per il derivato HYADD).

Per questi motivi le nuove composizioni possono essere utilizzate come terapia intra-articolare o loco-regionale nel trattamento e/o nella cura di patologie come:

• ΓΟΑ, sia nella sua fase iniziale che nella sua fase cronica, quindi sia in una fase di attiva infiammazione che in quella di cronica infiammazione, determinando:

o la diminuzione del livello di infiammazione articolare e, quindi, del danno cartilagineo grazie alla sinergia tra le proprietà anti- infiammatorie del derivato di HA e del CS. o il ripristino della corretta funzionalità del fluido sinoviale per il miglioramento della capacità d’assorbimento degli stress meccanici della nuova composizione farmaceutica che, in questo caso, agisce come viscosupplementante,

o una maggiore lubrificazione viscosa delle superile i articolari ma, soprattutto, una aumentata capacità di resistenza dell’ articolazione stessa all’ attrito delle superfici articolari; le nuove composizioni risultano quindi capaci di rallentare/curare il processo osteoartrosico;

• il danno subcondrale, cioà ̈ il riassorbimento osseo determinato dall’ attivazione osteoclastica;

• l’ osteoporosi, in particolare “Γ osteoporosi transitoria regionale†; • il danno osteo-condrale da trauma/microtrauma;

• le sinoviti e le tenosinoviti, le tendiniti e/o le tendinosi.

La richiedente ne descrive e ne rivendica Γ utilizzo anche come liquido di lavaggio e quindi come sostituto del fluido sinoviale dopo chirurgia osteo-condrale (come, ad esempio, artroscopie e ricostruzione di legamenti).

Infine, descrive e rivendica l’utilizzo delle suddette nuove composizioni farmaceutiche specificatamente come lubrificante viscoso nel trattamento intra-articolare dell’OA, del danno subcondrale e del danno osteo-condrale.

Il trattamento terapeutico non comprende più una terapia complessiva di 2-6 iniezioni per un periodo da 1-3 mesi come noto allo stato dell’arte, ma, per gli effetti sinergici reologici/antiinfiammatori ottenuti, à ̈ possibile ridurre la posologia a 1-2 iniezioni per un periodo di efficacia terapeutica compreso da 3 a 6 mesi.

L’HA utilizzato per la preparazione dei derivati rivendicati, può derivare da qualsiasi fonte, ad esempio, per estrazione da creste di gallo (EP1 38572), per via fermentativa (da Streptocuccus), o per via biosintetica (da Bacillus) come noto all’esperto del ramo, ed avere un MW ponderale medio compreso tra i 400 e i 3000KDa, in particolare tra 2500-3 000KD per ΓΗΑ salificato con metalli alcalini o alcalino-terrosi (HA-HMW), in particolare tra 500 e 750KDa per la preparazione del derivato HYADD<®>, e ancor più in particolare per l’amide esadecilica dell’HA con grado di amidazione medio compreso tra 1 e 8%, tra i 200 e 750KDa per la preparazione del derivato HBC, tra i 150 e i 300KD per il derivato ACP e HAS1. Il condroitin solfato utilizzato per la presente invenzione possiede un MW medio ponderale compreso tra 10-80KD, à ̈ attualmente prodotto per estrazione dalle cartilagini di animali e pesci (squali e balene) (ad esempio, il CS utilizzato per gli esperimenti di seguito descritti à ̈ stato prodotto da Seikagaku Kogyo, Tokyo), e contiene sia condroitin 4-solfato che 6-solfato in rapporti che possono variare a seconda della cartilagine di estrazione di partenza.

Il CS à ̈ aggiunto e miscelato ai derivati di HA in rapporti ponderali di HA derivatùCS compresi da 1:0,1 a 1 :6, a seconda del derivato scelto per la preparazione della nuova composizione farmaceutica, in modo particolare sono preferìbili i seguenti rapporti:

• derivato HAS1:CS: à ̈ preferibile 1:2-1 :6, ancor più preferibile 1 :4;

• derivato HYADD:CS: à ̈ preferibile 1 : 0,2-1 ; 1 ;

• derivato ACP+HBC:CS: à ̈ preferibile 1:0, 2- 1 :1, 5;

• derivato ACP:CS: à ̈ preferibile 1:0,2- 1 :2;

• derivato HA-HMW:CS: à ̈ preferibile 1:0,5- 1:2, ancor più preferibile 1 :1.

La nuova composizione farmaceutica à ̈ ottenuta associando il CS in polvere o precedentemente preparato come soluzione, con il derivato di HA scelto, anch’esso presente in polvere o precedentemente sciolto e quindi in forma di gel e/o di soluzione. I due componenti devono essere mescolati per il tempo necessario affinché la loro associazione sia completa e omogenea, quindi devono essere messi in agitazione meccanica ad una temperatura compresa da 25 a 80°C, a seconda dei rapporti scelti e dei derivati preparati, per un tempo variabile da 1 alle 24h; generalmente risulta sufficiente un tempo massimo d’agitazione di 8-1 Oh.

I tamponi utilizzati per le preparazioni sopra dette sono preferibilmente scelti tra:

sodio fosfato dibasico e sodio fosfato monobasico sciolti in acqua con sodio cloruro, oppure il semplice sodio cloruro, preferibilmente a concentrazioni fisiologiche, per un pH di composizione farmaceutica compreso tra 6, 5-7, 4 e una osmolarità che deve essere compresa tra 100 e 350 mOs/1.

A scopo puramente descrittivo, e non limitativo, vengono riportati alcuni esempi di preparazione delle nuove composizioni farmaceutiche di cui alla presente invenzione:

Esempio 1: composizione HAS1/CS: 1:4

Per questo esperimento à ̈ stato utilizzato HAS1 preparato come da EP 702699 utilizzando un HA di partenza (in particolare il suo sale con tetrabutilammonio) con MW medio ponderale compreso tra i 150-300KD.

20g di HAS1 sono stati solubilizzati in IL di tampone acquoso formato da sodio fosfato monobasico (0,05g), sodio fosfato bibasico (0,6g), sodio cloruro (8,5g) con pH di 7,4. Ad esso sono stati aggiunti 80g di CS (Seikagaku Kogyo, Tokyo) avente MW di 50-60KD, la miscela à ̈ stata messa in agitazione meccanica a 40 °C per Ih fino a completa e omogenea solubilizzazione dei due componenti.

La miscela à ̈ stata fatta raffreddare a T ambiente e successivamente sono stati determinati i suoi moduli utilizzando un reometro Thermo Haake Mars II Rheometer, a 20°C.

I valori sono stati misurati in Pa da 0.01 a 100 rad/s, a valori fissi di strain del 10%. Tutti i campioni sono stati processati con Haake Rheowin Job Manager 4.0 software.

Risultati: Figura 1 evidenza come il modulo viscoso G†di HAS1/CS possegga, a tutte le frequenze esaminate, valori estremamente più elevati dei valori di G†del derivato HAS1 di partenza. Il modulo viscoso della nuova composizione risulta maggiore sia del G†del fluido sinoviale di pazienti OA (tratto da Balazs E., in Disorders of thà ̈ knee, 1974, 63-75), che dei G†del viscosupplementante di controllo Hyalgan® a tutte le frequenze esaminate, dimostrando quindi un profilo reologico sorprendente e del tutto inaspettato (caratteristico del fluido sinoviale), che inizialmente non possedeva come HAS 1 (non associato a CS).

Esempio 2: composizione HYADD/CS: 1:1

Per questo esperimento à ̈ stato utilizzata l’amide (HYADD) esadecilica dell’HA con un grado medio di amidazione del 5%, preparata come da EP 1095064 utilizzando un HA di partenza con MW medio ponderale compreso tra i 500-750KD.

8g di HYADD sono stati solubilizzati in IL di tampone acquoso formato da sodio fosfato monobasico (0,1 1 g), sodio fosfato bibasico (0,45g), sodio cloruro (8,5g) a pH 7,0. Ad esso sono stati aggiunti 8g di CS (Seikagaku Kogyo, Tokyo) avente MW di 50-60KD, la miscela à ̈ stata messa in agitazione meccanica a 60 °C per 10-12h fino a completa e omogenea solubilizzazione dei due componenti.

La miscela à ̈ stata fatta raffreddare a T ambiente e successivamente sono stati determinati i suoi moduli utilizzando un reometro Thermo Haake Mars II Rheometer, a 20°C.

I valori sono stati misurati in Pa da 0.01 a 100 rad/s, a valori fissi di strain del 10%. Tutti i campioni sono stati processati con Haake Rheowin Job Manager 4.0 software.

Risultati: Figura 2 mostra come il modulo elastico G’ della nuova composizione diminuisca in modo significativo mentre rimanga sostanzialmente invariato il suo modulo viscoso G†.

Esempio 3: composizione ACP+HBC/CS: 1:1

Per questo esperimento à ̈ stato utilizzato il derivato ACP+HBC preparato come da Esempio 12 di WO20 11/023355, per ottenere IL di gel contenente 25g di ACP+HBC. Ad esso sono stati aggiunti 25g di CS (Seikagaku Kogyo, Tokyo) avente MW di 50-60KD, la miscela à ̈ stata messa in agitazione meccanica a 40 °C per Ih fino a completa e omogenea solubilizzazione dei due componenti.

La miscela à ̈ stata fatta raffreddare a T ambiente e successivamente sono stati determinati i suoi moduli utilizzando un reometro Thermo Haake Mars II Rheometer, a 20°C.

I valori sono stati misurati in Pa da 0.01 a 100 rad/s, a valori fissi di strain del 10%. Tutti i campioni sono stati processati con Haake Rheowin Job Manager 4.0 software.

Risultati: Figura 3 mostra come anche il modulo elastico G’ di questa nuova composizione diminuisca in modo significativo mentre rimanga sostanzialmente invariato il suo modulo viscoso

Esempio 4: composizione HA-HMW/CS: 1:1.

Per questo esperimento à ̈ stato utilizzato il sale sodico del derivato HA-HMW con MW medio ponderale compreso tra 2500 e 3000KD, preparato come da EP07 16688.

20g di HA-HMW sono stati solubilizzati in IL di tampone acquoso formato da sodio fosfato monobasico (0,05g), sodio fosfato bibasico (0,6g), sodio cloruro (8,5g) a pH 7,4. Ad esso sono stati aggiunti 20g di CS (Seikagaku Kogyo, Tokyo) avente MW di 50-60KD, la miscela à ̈ stata messa in agitazione meccanica a 40 °C per 8h fino a completa e omogenea solubilizzazione dei due componenti.

La miscela à ̈ stata fatta raffreddare a T ambiente e successivamente sono stati determinati i suoi moduli utilizzando un reometro Thermo Haake Mars II Rheometer, a 20°C.

I valori sono stati misurati in Pa da 0.01 a 100 rad/s, a valori fissi di strain del 10%. Tutti i campioni sono stati processati con Haake Rheowin Job Manager 4.0 software.

Risultati: Figura 4 mostra come anche il modulo elastico G’ di questa nuova composizione diminuisca in modo significativo mentre rimanga invariato il suo modulo viscoso G†.

Esempio 5: valutazione in vitro dell’ efficacia anti-infiammatoria dell’amide esadecilica di HA (HYADD)

Per il suddetto test sono stati utilizzati condrociti provenienti da articolazione umane OA sottoposte a chirurgia articolare. La preparazione delle cellule per la sperimentazione in vitro à ̈ stata effettuata come noto alfesperto del ramo (Tallheden T. et al., Arthritis Research & Therapy, 2005, 7:R560-R568).

Trattamento: le suddette cellule sono state trattate con 0,5 o lmg/ml di Hyagan® o di HYADD, in questo caso con fammide esadecilica di HA con grado medio di amidazione del 5%, direttamente nel medium di coltura a cui à ̈ stato successivamente aggiunta la citochina prò- infiammatoria IL- 1 β (2ng/ml). Dopo 24h a 37°C i campioni sono stati testati per la quantificazione dell’espressione del gene per la sintesi di COX-2 tramite real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

Risultati: Figura 5 mostra chiaramente l’efficacia di entrambe le concentrazioni del derivato HYADD nel determinare la diminuzione dell’espressione del gene della COX-2 in condrociti umani provenienti da cartilagini OA, e quest’effetto à ̈ risultato decisamente superiore a quello elicitato dal viscosupplementante di controllo. Quest’esperimento dimostra l’efficacia antiinfiammatoria del derivato HYADD e quindi conferma il suo utilizzo nelle patologie infiammatorie come ΓΟΑ.

Esempio 6: valutazione in vivo dell’ efficacia anti-infiammatoria di HAS1

La resezione del legamento crociato anteriore (TLC A) del ginocchio della zampa posteriore di coniglio, à ̈ un approccio ampiamente utilizzato in letteratura per indurre una patologia articolare in animale che riproduca le caratteristiche dellOsteoartrosi umana, poiché l’animale operato andrà incontro a tutti quei fenomeni degenerativi caratteristici dell’OA.

Protocollo sperimentale: la procedura operativa si à ̈ svolta inducendo un’anestesia generale, di breve durata (10÷20 minuti), mediante iniezione endovena di 0.25 mg/kg di una soluzione di Ketamina/Xilazina/Acepromazina/fisiologica in rapporto di volume: 1:0, 5:0, 5:1.

L’animale anestetizzato à ̈ stato preparato per l’intervento ed operato per la TLCA, successivamente, l’articolazione operata à ̈ stata lavata con soluzione fisiologica sterile e chiusa con opportuna sutura. Gli animali sono stati periodicamente controllati e trattati con farmaci antibiotici ed analgesici per un corretto trattamento postoperatorio. Trascorsi 9/10 gg. dall’intervento, i conigli sono stati trattati per via intra- articolare con le sostanze sperimentate, un secondo trattamento à ̈ stato effettuato dopo 17 gg, ed infine, un terzo trattamento à ̈ stato effettuato dopo 24 gg dall’intervento chirurgico. Dopo 35 gg. dall’intervento iniziale gli animali sono stati sacrificati per verificare l’efficacia dell’azione del derivato HAS1 somministrato per via intrarticolare.

Sostanze sperimentate:

HASl(10mg/ml), Hyalgan® (10mg/ml), il derivato cortisonico Depo-Medrol (metilprednisolone acetato, 40mg/ml); il controllo era rappresentato da animali operati e trattati con soluzione fisiologica tamponata.

Una volta esaurito lo schema sperimentale, agli animali à ̈ stata praticata l’eutanasia mediante somministrazione intracardiaca di Tanax, ed à ̈ stato prelevato il liquido sinoviale dell’ articolazione trattata per la determinazione quantitativa della prostaglandina PGE? mediante test Elisa per PGE2, Immunoassay R&D Systems.

Risultati: Figura 6 evidenzia l’effetto sorprendente determinato da HAS1 : il fluido sinoviale di articolazioni OA, quindi infiammate per alte concentrazioni di PGE2,presenta una concentrazione di prostaglandina decisamente inferiore non solo in paragone al viscosupplementante Hyalgan® normalmente utilizzato nella patologia OA, ma soprattutto nei confronti del derivato cortisonico Depo-Medrol, farmaco steroideo antiinfiammatorio comunemente utilizzato nella pratica clinica per tutte le patologie infiammatorie, in particolare il Depo-Medrol à ̈ utilizzato nel trattamento delle infiammazioni intra-articolari acute. Conseguentemente, il derivato H AS 1 si conferma come potente agente antiinfiammatorio.

Conclusione: come precedentemente affermato, i dati sperimentali confermano e dimostrano che l’associazione del CS ai derivati di HA sopra elencati e testati, determina una inaspettata diminuzione del modulo elastico delle nuove composizioni preparate vs il corrispondente modulo dei derivati di partenza analizzati, con il contemporaneo significativo aumento del modulo viscoso (per alcune composizioni preparate con specifici derivati, come l’HASl), oppure la sostanziale “tenuta†del suddetto modulo G†vs i moduli viscosi dei derivati di HA di partenza. Si sono quindi ottenute composizioni farmaceutiche con caratteristiche reologiche proprie di un viscosupplementante in cui la componente viscosa risulta proporzionalmente aumentata rispetto al derivato di partenza, tale associazione sarà quindi capace di maggiore resistenza agli attriti e presenterà maggiori capacità di lubrificazione articolare, potrà quindi essere utilizzata come lubrificante viscoso associando le proprietà altamente antiinfiammatorie del CS con le capacità anti-infiammatorie dei derivati dell’ HA precedentemente dimostrate. Per questi motivi le nuove composizioni possono essere utilizzate nel trattamento e/o nella cura delle patologie sopra elencate come, ad esempio, nella terapia intra-articolare dell Ό A e della perdita d’osso sub-condrale, o nel trattamento e/o cura loco-regionale di patologie come Γ osteoporosi, in modo particolare “dell’ osteoporosi transitoria regionale†, ed infine come liquido di lavaggio e quindi come sostituto del fluido sinoviale dopo chirurgia osteo-condrale.

Claims (10)

1. Descrizione di una domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo “ Nuove formulazioni farmaceutiche comprendenti condroitin solfato e derivati dell’acido ialuronico †RIVENDICAZIONI 1. Nuove formulazioni farmaceutiche comprendenti condroitin solfato in associazione con derivati dell’acido ialuronico scelti tra: a. Acido ialuronico salificato con metalli alcalini o alcalino/terrosi, di peso molecolare medio ponderale compreso tra i 2500-3000KD; b. Ammidi dell’ HA con ammine della serie alifatica, aralifatica, cidoalifatica, aromatica, ciclica ed eterociclica, con una percentuale di amidazione dal 0,1 al 10%; c. Derivati O-solfatati dell’acido ialuronico di 1° grado di solfatazione; d. Esteri interni dell’acido ialuronico con una percentuale di esterificazione non superiore al 10%; e. Derivati dell’ acido ialuronico costituiti dalla miscelazione del derivato autocrosslinkato dell’acido ialuronico ACP con il derivato crosslinkato dell’acido ialuronico con BDDE, HBC, in rapporto ponderale da 25:75 a 75:25.
2. 2. Nuove formulazioni farmaceutiche secondo rivendicazione 1 in cui il derivato scelto à ̈ l’ammide dell’acido ialuronico preparata con un acido ialuronico con peso molecolare medio ponderale compreso tra 500 e 750KD, e preferibilmente in cui à ̈ l’ammide esadecilica con grado di amidazione medio compreso tra 1 e 8%.
3. 3. Nuove formulazioni farmaceutiche secondo rivendicazione 1 in cui il derivato scelto à ̈ il derivato O-solfatato dell’acido ialuronico di 1° grado di solfatazione preparato con un acido ialuronico con peso molecolare medio ponderale compreso tra 150 e 300KD.
4. 4. Nuove formulazioni farmaceutiche secondo rivendicazione 1 in cui il derivato scelto à ̈ l’estere interno dell’acido ialuronico preparato con un acido ialuronico con peso molecolare medio ponderale compreso tra 150 e 300KD.
5. 5. Nuove formulazioni farmaceutiche secondo rivendicazione 1 in cui il derivato scelto à ̈ il derivato dell’acido ialuronico costituito dalla miscelazione del derivato autocrosslinkato dell’acido ialuronico ACP con il derivato crosslinkato dell’acido ialuronico con BDDE, HBC, in rapporto ponderale 25:75.
6. 6. Nuove formulazioni farmaceutiche secondo le rivendicazioni 1-5 nel trattamento e/o nella cura dell’osteoartrosi nella fase iniziale e nella fase cronica, del danno subcondrale, dell’osteoporosi e in modo particolare “dell’ osteoporosi transitoria regionale†, del danno osteo-condrale da trauma/microtrauma, delle sinoviti e tenosinoviti, delle tendiniti e/o lendinosi, e come liquido di lavaggio e sostituto del fluido sinoviale dopo chirurgia osteo-condrale.
7. 7. Nuove formulazioni farmaceutiche secondo rivendicazione 6 nel trattamento e/o nella cura intra- articolare dell’osteoartrosi, del danno subcondrale, del danno osteo-condrale.
8. 8. Nuove formulazioni farmaceutiche secondo rivendicazione 6 nel trattamento e/o nella cura loco-regionale dell’ osteoporosi e in modo particolare “dell’ osteoporosi transitoria regionale†, delle sinoviti e tenosinoviti, delle tendiniti e/o tendinosi.
9. 9. Nuove formulazioni farmaceutiche secondo rivendicazione 6-8 in cui il condroitin solfato à ̈ miscelato ai derivati di acido ialuronico in rapporti ponderali di acido ialuronico: condroitin solfato compresi da 1:0,1 a 1:6.
10. 10. Uso delle nuove formulazioni farmaceutiche secondo rivendicazione 1-5 come nuovi lubrificanti viscosi nel trattamento intra-articolare deH’osteoartrosi, del danno subcondrale del danno osteo-condrale