JPS60193926A

JPS60193926A - 単クローン性抗ヒトアポリポ蛋白質ｂ１００抗体

Info

Publication number: JPS60193926A
Application number: JP59049598A
Authority: JP
Inventors: Tatsuhiko Kodama; 龍彦児玉; Hiroshige Itakura; 弘重板倉; Makoto Onishi; 真大西; Hiroyuki Yuya; 浩幸油谷
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 1984-03-15
Filing date: 1984-03-15
Publication date: 1985-10-02
Also published as: JPH0226959B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】技　術　分　野本発明は単クローン性抗ヒトアポリボ蛋白質Ｂ１００抗
体およびそれを産生ずるハイプリドーマ心間するもので
ある。

従来技術アポリボ蛋白質Ｂは、ヒト血漿トリグリセリド、リッチ
リボ蛋白質の合成および公租に重要な役割をもっている
蛋白質である。このアポリボ蛋白質Ｂには、肝で産生さ
れＶＬＤＬ（超低比重リボ蛋白質）の合成に関与するア
ポリボ蛋白質Ｂ１００　（以下、アポＢ１００と略称す
る）と、小腸で産生されカイロミクロン合成に関与する
アポリボ蛋白質Ｂ４８（以下、アポＢ４８と略称する）
がある。アポリボ蛋白質Ｂの遺伝的欠損による疾患であ
る無βリボ蛋白血症には、アポＢ１００とアポＢ４８が
共に欠損する無βリボ蛋白血症古典型と、アポＢ１００
のみの欠損するトリグリセリド正常型態βリボ蛋白血゛
症がある。そのいずれもが、赤血球異常、精神神経症状
など重篤な症状を呈するが、トリグリセリド正常型無β
リボ蛋白血症ではカイロミクロンが合成されうる。また
アポリボ蛋白質Ｂを含むリボ蛋白質は動脈硬化を惹起す
る性質を有すると考えられ、アポＢ１００とアポＢ４８
が異なる代謝経路を有するため、動脈硬化の発症機序を
知る上で゛も両者の分別は重要である。

上記の如く、アポリボ蛋白質Ｂは、様々な機能を有する
にもかかわらず、難溶性であり、分解しやすい高分子蛋
白質から成るため、その研究は今だ詳細になされていな
い。この研究のためには、アポリボ蛋白質Ｂの各構成部
分を特異的に認識する必要がある。従来、我々は抗ヒ）
ＬＤＬ（正常者血中低比重リボ蛋白質）単クローン性抗
体を作成してきた。しかし、この場合、アポＢ１００と
脂質の複合体を見ており、また、アポＢ１００以外のア
ポリボ蛋白質も混入しており、最近、アポＢ１００とそ
の他のアポリボ蛋白質との特定の複合体を認識したとい
う報告もある。

発明の目的本発明の目的はこのようなアポリボ蛋白質Ｂの各構成部
分を特異的に認識する特に抗ヒトアポ１ノボ蛋白質Ｂ１
００の単クローン性抗体（以下、抗アポＢ　１００−　
Ｉと略称する）を得ることにあり、また、この抗アポＢ
　１００−　Ｉを産生ずるノ＼イプリドーマを得ること
にある。

発明の構成本発明の抗アポＢ　１００−　Ｉを産生するノ１イプリ
ドーマは、アポＢ１００で予め免疫されたマウスの牌細
胞と、マウスの骨髄腫細胞ラインからの細胞との融合に
よって形成される。このような本発明の抗アポＢ　１０
０−　Ｉおよびこの抗体を産生ずるノ１イプリドーマは
、例えば次の４行程によって作成することができる。

（１）　アポＢ１００の精製（２）免疫（３）細胞融合（４）　ハイブリドーマの選択および単クローン化。

このようにして作成された本発明の抗アポＢ１００−Ｉ
は、２元拡散法の結果、ＩｇＧ１ａサブクラスに属する
ことがわかった。ＳＤＳポリアクリルアミド・グラジエ
ンｔｔａ気泳動法を用いて正常者血中のアポリボ蛋白質
Ｂをその亜種に分け、それをトランス・プロッティング
法にてニトロセルソース用紙に転移させ、抗アポＢ１０
０−工との結合を見た。その結果、抗アポＢ１００−Ｉ
はアポＢＩＯ（１と結合するが、アルブミンやアポリボ
蛋白’Ｊ［Ａ−Ｈなどの蛋白質とは結合しない。同じ方
法で、アポＢ１００．アポＢ４８およびアポＢ１００の
分解産物との結合を調べると、抗アポＢ１００−ＩはＬ
ＤＬ　およびＶＬＤＬのアポＢ１００と結合するがカイ
ロミクロンのアポＢ４８とは結合できない。更に、アポ
Ｂ４８と類似した分子量（約２０万）を有するアポＢ１
００の分解産物とは結合する。即ち、この抗体はアポＢ
１００の分解産物とアポＢ４８を識別しうる特長を有す
る。

更に、この抗アポＢ１００−Ｉを用いて免疫酵素抗体の
測定法を開発した。この方法として、測定したいサンプ
ルをポリスチレン９６穴プレートへ付着させる間接法と
、プレートにあらかじめウサギ抗アポＢポリクロナール
抗体を付着させておき、ｌＳこれにサンプルを結合させ
るサンドインチ法を用いた。本発明の抗アポＢ１００−
Ｉを用いると、比較的よい精度で、ヒ）ＬＤＬの定量が
可能である。

前に述べた無βリボ蛋白血症の患者には、本邦ではアポ
Ｂ１００の単独欠損であるトリグリセリド天常型（名古
屋家系）と、アポＢＩＧＯとアポＢ４８が共に欠損する
古典型（神奈川家系）とが知られている。この両家系患
者のリボ蛋白質中アポリポ蛋白質は、トランスブロッテ
ィング法および免疫酵素抗体法のいずれを用いても、本
発明の抗アポＢ１００−Ｉと結合できなかった。このこ
とはこの抗体がアポＢ１００以外のいがなるアポリポ蛋
白質とも結合できないことを支持している。

以上まとめると、本発明の抗アポＢ１００−Ｉは、ｌ）
正常者人血中、アポＢ１００と反応するが、アポＢ４８
とは反応しない、ｇ）ＴＧ正常型無βリボ蛋白血症患者
の血中リボ蛋白質とは反応しない、８）正常者人血中の
ＬＤＬおよびＶＬＤＬと反応する各性質を有することが
わかった。

次に、本発明の抗アポＢ１００−Ｉおよびこの抗体を産
生ずるハイプリドーマを作成するための好適例を説明す
る。

まず、アポＢ１００みを精製するために、正常者から採
血した血漿を速やかに超遠心法にて分離してＬＩ）Ｌ分
画を採取し、その後ウォーターシャケ、ットで加温した
セファロース４Ｂ−ＯＬカラムを用いて、５ＤＳ（ドデ
シル硫酸ナトリウム）を含む溶液でゲル濾過する。この
工程を２日以内に終える場合、アポＢ１００の分解は極
めて少なく、はぼ完全なアポＢ１００分画を得ることが
できる。この方法によると、アポＢ４８やアポリボ蛋白
質Ｅ１アポリボ蛋白質ムー工の混入が妨げられる。また
、脱脂は９９％行われ、ＳＤＳとのミセルに置き換わる
。

これによりアポＢ１００のみのミセルが得られる。

このようにして精製したアポＢ１００をマウスに投与し
、免疫されたマウスの肺細胞を取り出す。

このマウスの肺細胞とマウスの骨髄腫細胞ラインからの
細胞とを融合させて本発明のハイプリドーマを得る。こ
のハイプリドーマの作成は、例えばオーイらの方法を用
いることができる（　ＳＫＬＥＯＴＥＤＭＥ’ｌ’ＨＯ
ＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬＵＬＡＲＩＭｌｌ［ＵＮＯＬＯＧ
Ｙ、８５１−８７２゜Ｆｒｅｅｍａｎ　１９８０　）。

得られたハイプリドーマから本発明の抗アポＢＩＧＯ−
Ｉを作成するには、例えば次の２方法を用−ることがで
きる。

、１の方法は、ハイプリドーマを適当な培養液中（ｉｎ
　ＶｉｔｒＯ）で培養し、その上澄みに生成された抗体
を回収する方法である。他の方法は、ハイプリドーマを
マウスに注射しく　ｉｎ　ｖｉｖｏ　）生体内で培養し
、マウスの腹水中に生成された抗体を回収する方法であ
る。前者の方法では、抗体価が低いが純度の良いものが
得られるが、後者の方法では純度はやや劣るが非常に抗
体価の高いものが得られる。どちらの方法を選択するか
は目的によって使いわけられる。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説　（明す
る。

実施例　１この実施例では、本発明の抗アポＢ１００−Ｉ。

およびそれを産生ずるためのハイプリドーマを作成した
。

（リアボＢ１００の精製正常者から採血したヒト血漿約２００−を超遠心法にて
分離し、比重１．Ｏ！！１０〜１．０５０の純粋なＬＤ
Ｌ分画を採取する。その約８　ＣＣをｌ　ＣＣのｌＯ％
ＳＤＳおよび１％２−メルカプトエタノール溶液と混合
し、５０℃で１０分間培養する◇この混合液を２　ｃｍ
　Ｘ　１００　ａｍの５０℃にウォータージャケットし
た七７ア四−ス４Ｂ、ＯＬカラムに通してゲ／Ｉ／Ｐ遇
する。その際に、流出液として０．５％ＳＤＳおよび０
．０１　Ｍ　）リスＨｅ／を０．１５　ＭＮａＯｔでｐ
Ｈ７，２に調整した緩衝液を流速２０−７時で使用した
。その結果、はぼ純粋なアポＢ１００が得られる。脱脂
は９９％以上完全である。

２）免　疫精製したＳＤＳ溶液中のアポＢ１００を１００μす、７
０インド完全アジユバントと共に雄のバルブ／Ｑマウス
（６週令）に皮下注射した。

８週後に再度、前記アポＢ１００の１０μｑを前記アジ
ュバントと共に腹腔内へ注射した。

′８ン細胞融合２回目の免疫から８日後に、マウスの肺臓を取り出し、
肺細胞の懸濁液とする。この肺細胞１ＸＩＯ８個を、８
Ｘ１０’個の８−アザグアニン耐性骨髄細胞１ｙ　Ｎ　
Ｓ　−１とポリエチレングライコール＋４０００を用い
て融合した。細胞は９６六マイクロ培養プレ一ト５枚に
分配した。

２４時間後、上澄みの半分をＨＡＴ培地（ヒボキサンチ
ンｌＸｌ０　Ｍ、アミノプテリン４Ｘ１０−７Ｍ　、チ
ミジン１．６Ｘ１０−８Ｍ　）に置きかえた。ＨＡ’Ｉ
’耐性細胞（ハイブリドーマ）が２〜３週間後に大半の
培地に増殖するのが観察される。

（４）ハイブリドーマの選択および単クローン化マイク
ロプレート中の培養液上澄み１００μｌをＬＤＬをコー
トしたアッセイ用プレートに入れ、室温で１時間放置後
、８回洗浄する。そこへ、１０００倍に希釈した抗マウ
スエｇＧ・パーオキシデース標該を加え、また１時間室
温で反応させ、さらに３回洗浄後、発色液を加え、光度
計で比色した。

ＨＤＬ　（α−リボ蛋白質）や１．２１ボトム分画と反
応せず、ＬＤＬと強く反応する抗体を分秘するハイブリ
ドーマを選択した。

単クローン化は、この選択したハイブリドーマを、フィ
ーダー細胞にマウス胸腺細胞を用い、限界希釈法に２度
かけることによって行った。

（５）抗アポＢ１００−　工の作成ａ）インビトロ法前記工程で得られたハイブリドーマは、適当な培養液（
例えば、牛胎児血清１０％を含むＲ、Ｐ　Ｍ工１６４０
培地）で培養し、その培養上好みを回収した。上澄み中
に分秘された抗体は、精製せずそのまま使用できる純粋
の高いものが得られた。

ｂ）インビボ法ハイブリドーマを注射するマウスにあらかじめ（４日前
）、２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカンを
腹腔内に注射しておく。

次に抗体を産生ずるハイブリドーマをマウス１匹あたり
５Ｘ１０’個、腹腔内に注射する。注射後４〜１０日で
、マウス腹腔内に高濃度の抗体を有する腹水が生成して
くる。この腹水は抗体としてそのまま使用できる。

、実施例　２この実施例では本発明の抗アポＢ１００−Ｈの特異性を
調べた。

抗アポＢ１００−　工と各柚リポ蛋白質との結合は免疫
酵素抗体法を用い、また各種アポリボ蛋白質との結合は
トランスブロッティング法を用いて行った。

第１表に各棟リボ蛋白質と本発明抗体との反応性を示す
。

第１表＊　アポＢ１００単独欠損患者からの血漿を精製し、ア
ポＢ４８およびアポＥを含む。

測定は次のように行った。

９６六マイクロプレートに、ウサギのポリクロナール抗
アポＢ血清を固定化しておく。そこに測定したいリボ蛋
白試料１００　ｔｔｌを入れ、室温１時間放置後８回洗
浄する。洗浄後、抗アポ３３１００−Ｉ（腹水の場合は
約１０００倍に希釈）を１００μｌ入れ°Ｃ，１時間室
温で反応させた後、８回洗浄する。その後、各ウェルに
抗マウスエｇＧ・パーオキシデース標識を入れ、発色液
を加え、吸光度を測定する（サンドインチ法）。

この結果をみると、抗アポＢ１００−ＩはアポＢ１００
をａｔｒＶＬＤＬ、ＬＤＬと結合するが、アポＢ４８の
みを含むカイロミクロンとは結合できない。

次に、各種アポリボ蛋白質と抗アポＢ１００−■との結
合性をトランスプロッティング法により検討した。その
結果を第２表に示す。

第２表各種リボ蛋白質から調整されたアポ蛋白質は、油谷らの
方法（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９４１２４１−１２４５
　、１９Ｈ）によって、５ＤＳ−ポリアクリルアミドグ
ラジェントゲル電気泳動により分離される。このゲル中
の蛋白質はトウビンらの方法（Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔｌ　
Ｊｃａｄ、。

ＳＣｉ、ＵＳＡ、　７６４３５０−４８５４＋　、　１
９７９　）により、セルロース−トレー１紙にうつされ
る。このセルロースニトレート紙は、本発明の抗体溶液
中で、１時間室温で反応させた後、洗浄する。セルロー
スニトレート紙に付着した抗体は、１！５ニブ四テイン
Ａを用い、オートラジオグラシイ−で検出するか、ツア
ングらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ　、　９２８７７−８９０　、　Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　１９８３　
）にて、パーオキシデース標識抗マウスエｇＧと発色液
を用いて検出される。

このトランスブロッティング法による検討でも、本発明
の抗アポＢ１００−ＩはアポＢ１００およびその分解産
物とは反応しうるが、アポＢ４８とは反応し得ないこと
がわかった。また、ＴＧ正正常型無口リボ蛋白血症患者
血中アポＢ４８とは結合することがＩｌｌできなった。

以上、本発明の単クローン性抗体は各種リボ蛋白質およ
びアポリボ蛋白質を特異的に認識すやことができるので
、血液の清葎、定置または定性、あるいは臨床上の治療
や病気の診断等に利用することが可能である。

Claims

【特許請求の範囲】Ｌ　ヒトアポリボ蛋白質Ｂ１００で予め免疫されたマウ
スの牌細胞と、マウスの骨髄腫細胞ラインからの細胞と
の融合によって形成されたハイブリドーマによって産生
され、１）正常者人血中、アポリボ蛋白質Ｂ１００と反応し、
アポリボ蛋白質Ｂ４８とは反応しない、２）　ＴＧ正常型無βリボ蛋白血症患者の血中リボ蛋白
質とは反応しない、８）正常者人血中低比重リボ蛋白質（ＬＤＬ）および超
低比重リボ蛋白質（ＶＬＤＬ）と反応する各性質を有す
る単クローン性抗ヒトアポリポ蛋白質Ｂ１００抗体。２　ヒトアポリボ蛋白質Ｂ１００で予め免疫されたマウ
スの牌細胞と、マウスの骨髄腫細胞ラインからの細胞と
の融合によって形成され、２）　正常者人血中、アポリ
ボ蛋白質Ｂ１００と反応し、アポリボ蛋白質Ｂ４８とは
反応しない、り　ＴＧ正常型無βリボ蛋白血症患者の血中リボ蛋白質
とは反応しない、８）正常者人血中低比重リボ蛋白質（ＬＤＬ）および超
低比重リボ蛋白質（ＶＬＤＬ）と反応する各性質を有す
る単り四−ン性抗ヒトアポリボ蛋白質Ｂ１００抗体を産生ずるハイブリドーマ。