JPH0513635B2 - - Google Patents
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- JPH0513635B2 JPH0513635B2 JP59126663A JP12666384A JPH0513635B2 JP H0513635 B2 JPH0513635 B2 JP H0513635B2 JP 59126663 A JP59126663 A JP 59126663A JP 12666384 A JP12666384 A JP 12666384A JP H0513635 B2 JPH0513635 B2 JP H0513635B2
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- Japan
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- apob48
- antibody
- apolipoprotein
- apo
- binds
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明はアポリポ蛋白B48（以下「アポB48」
を略す）に高い特異性を有する抗体に関する。 〔従来の技術〕 アポリポ蛋白Ｂ（以下「アポＢ」と略す）はヒ
ト血漿トリグリセリドリツチリポ蛋白の合成、分
泌に重要な役割をもつている。アポＢには肝で産
生され超低比重リポ蛋白（VLDL）合成に関与す
るアポリポ蛋白B100（以下アポB100と略す）と、
小腸で産生されカイロミクロン合成に関与するア
ポB48がある。アポＢを含むリポ蛋白は動脈硬化
起性を有すると考えれ、両者を分析、定量する事
は重要である。アポＢの遺伝的欠損によりひきお
こされる無βリポ蛋白血症には、アポB100、ア
ポB48両者共欠損する古典型と、アポB100のみ
が欠損するTG正常型があり、アポB100とアポ
B48は異なる遺伝的支配の下にある。このよう
に、アポＢは様々な機能を有するにもかかわら
ず、難溶性であり、分解しやすい高分子蛋白のた
めその研究は遅れている また、アポＢの特異的抗原決定基を認識する単
クローン性抗体としてはアポB100のみに結合す
る抗体（単クローン性抗体B100−）と、アポ
B100及びアポB48に同様に結合する抗体（単ク
ローン性抗体抗B48−）が知られる。しかしな
がら、アポB100に比しアポB48に高い特異性を
有する抗体は従来えられていなかつた。 〔本発明が解決しようとする問題点〕 叙上の現状において、各種免疫疾患の治療、診
断及びこれらに関する研究で利用し得る、アポ
B48に高い特異性を有する抗体及びこれを有利に
製造する方法の開発が望まれていた。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らはアポB48に高い特異性を有するる
抗体を得べく鋭意研究をおこなつた結果、精製し
たアポB48に対する単クローン性抗体の中からア
ポB100、LDLに比しアポB48に高い特異性を有
する抗体を見出した。 すなわち本発明は精製されたヒトアポリポ蛋白
B48で予め免疫されたマウスの脾細胞と、マウス
の骨髄腫細胞ラインからの細胞との細胞融合で得
られたハイブリドーマによつて産生され、次の特
徴を有する単クローン性抗体を提供するものであ
る。 (1) 正常ヒト血中アポリポ蛋白B48と結合する。 (2) アポリポ蛋白B100に対する結合性は、アポ
リポ蛋白B48に対する結合性に対し１／25〜１／
11.8であり、その他の正常ヒト血中蛋白とは反応
しない。 (3) TG正常型無βリポ蛋白血症患者の血中リポ
蛋白と結合する。 本発明のアポB48に特異的な抗体（以下「抗ア
ポB48−」と称する）は、次のようにして調製
される。まず抗アポB48−を産生するハイブリ
ドーマを準備する。このハイブリドーマは次の５
工程により得られる。 アポB48の精製 免疫 細胞融合 ハイブリドーマの選択 単クローン性抗体産生株の確立 アポB48の精製に当つては、カイロミクロンを
多量に要するので正常人の大量脂肪食摂取後の血
漿を用いる。サンプルは、EDTA、NaN3及びカ
ナマイシンを加えて処理後、100000ｇで20時間超
遠心し、VLDL＋カイロミクロン分画をえる。こ
の分画より、再び超遠心法でカイロミクロン分画
を分散する。得られたカイロミクロン分画をエー
テル：エタノール＝１：３で脱脂後、10％SDSを
含有する１％２−メルカプトエタノール溶液に溶
解する。この溶液を、ウオータージアケツトで50
℃に保つたセフアロース4B・CLカラムにて、ゲ
ル過する。（溶媒は0.5％SDS、0.01MTrisHC
PH7.4）。得られたアポロB48にとむ分画をプレ
パレテイブ（Preparative）SDS電気泳動装置を
用いて更に精製する。この工程を２日以内におえ
ることにより、アポＢの分解を少なくすることが
でき、ほぼ純粋なアポB48をうることができる。 次いでこのアポB48を用い、常法によりマウス
に免疫を行なう。免疫されたマウスより取り出さ
れた脾細胞とマウス骨髄腫（NS−１）からのハ
イブリドーマの作成はOiの方法（SELECTED
METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY
p351−372（1980））により行なつた。ハイブリド
ーマの中には、種々のアポB48に対する抗体を作
る細胞が存在するが、アポB48に対し特異性を有
する抗体産生株は次の方法により選択される。ま
ず、低比重リポ蛋白（LDL）、カイロミクロンそ
してSDSにより脱脂したアポLDL、アポカイロ
ミクロンのリポ蛋白もしくはアポ蛋白でコートし
た４種のEIA法用プレートを用意する。なお、ア
ポカイロミクロンはこれを脱脂後、純水と半透膜
にて透析することにより、効率よくプレートに付
着させられ、アポB48に対する特異性の高い抗体
をひろい出すことが容易となる。次にチエツクし
たい細胞の培養上清を適量各プレートに取りイン
キユベートし、結合した免疫グロブリン量をパー
オキシダーゼ標識抗マウスＩｇ抗体で測定する。
LDL及びアポLDLは、アポB100のみを含むのに
対し、カイロミクロン及びアポカイロミクロン
は、アポB100とアポB48両者を含む。この結果、
LDL又はアポLDLに比し、カイロミクロン及び
アポカイロミクロンに高い親和性を有する抗体及
びこれを産生するハイブリドーマが選択される。
この中からアポB48との結合性がアポB100と比
し10倍以上高い抗体（抗アポB48−）を産生す
るハイブリドーマが選択され２回の限界稀釈法に
て単クローン化される。 こうして目的のハイブリドーマが得られたな
ら、目的の抗体（抗アポB48−）は次の２つの
方法で量産される。その１つはハイブリドーマを
適当な培養液中（in vitro）で培養し、その上清
に生成された抗体を回収する方法であり、他の１
つはハイブリドーマをマウスに注射し、（in
vivo）生体内で培養し、マウスの腹水中に生成さ
れる抗体を回収する方法である。前者の方法では
抗体価は低いが純度の高いものが得られる。これ
に対し、後者の方法では純度はやや劣るが、非常
に抗体価の高いものが得られる。どちらの方法と
選択するかは目的により使いわけられる。 〔作用〕 次に斯くして得られた抗アポB48−を利用し
ておこなわれる免疫酵素抗体測定方法（EIA法）
について説明する。このEIA法としては、測定し
たいサンプルをポリスチレン製96穴マイクロプレ
ートへ付着させ、その後抗アポB48−、パーオ
キシダーゼ標識抗マウスIgGを反応させる間接法
と、プレートへあらかじめウサギ（又はヤギ）抗
アポＢポリクローナル抗体を付着させておき、こ
れにサンプルを結合させ、次いで抗アポB48−
を添加するサンドイツチ法のいずれをも採用する
ことができる。そして、本発明の抗アポB48−
は上記したようにアポB48には結合するがアポ
B100との結合性はアポB48の結合性の１／10程
度又はそれ以下と弱く、また、他の血中アポリポ
蛋白、例えばアルブミン、アポリポ蛋白Ｅ等とは
結合しないのであるから、他の従来知られている
単クローン性抗体を用いた場合の結果と照合する
ことによりアポB48の正確な定量が可能となつ
た。この結果、カイロマイクロンレムナントの検
出、アポB100欠損者のアポＢの測定、腸管で合
成されるアポリポ蛋白の数量的診断、食後に血中
に増加するTGリツチリポ蛋白における小腸由来
リポ蛋白の割合、食事性因子の動脈硬化におよぼ
す影響等を知ることができるようになつた。 〔実施例〕 次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明す
る。実施例 １ 単クローン性抗体抗アポB48−及びそれを
産生するハイブリドーマの製法： (1) アポB48の精製 カイロミクロンの分取は種々のサンプルより
行なわれるが、ここでは血漿よりの分離法につ
いてのべる。 正常人の大量脂肪食摂取後の血漿約２を採
取後直ちに1mM EDTA、0.02％NaN3となる
よう調製し、Beckman Sw27ローター100000
ｇで20時間超遠心し、カイロミクロン＋VLDL
分画を得る。更にこの分画をBeckman40、３
ローターで20000rpm30間遠心し、浮上したカ
イロミクロン分画を取る。このカイロミクロン
分画は20倍量のエーテル：エタノール（１：
3vol／vol）溶液中にて10時間脱脂する。沈澱
した蛋白を2000rpm5分遠沈にて回収したのち、
約10mlの10％SDS、１％２−メルカプトエタノ
ール溶液に溶解する。このうち約５mlをウオー
タージヤケツトで50℃にしたセフアロース
4B・CLカラムによりゲル過する。溶媒は0.5
％SDS、0.01MTris−HCPH7.2 0.15MNaC
を用いる。得られたアポB48にとむ分画をダイ
アフローメンブレンPM10（アミコン社）を用
いて濃縮後、３％ポリアクリルアミド、0.1％
SDS電気泳動を行ないゲルを切断してアポB48
のみを含む分画を回収し、0.5％
SDS0.01MTris HC溶液中にアポB48を溶出
させる。 (2) 免疫 精製したSDS溶液中のアポB48 100μｇを、
フロインド完全アジユバンドと共にBALB／
ｃマウス（６週令）に皮下注射し、３週後に
50μｇをアジユバンドと共に腹腔内へ注射し
た。 (3) ２回目の免疫より３日後、マウスの脾臓をと
りだし、脾細胞の懸濁液とする。１×108個の
脾細胞を３×107個の８−アザダアニン耐性骨
髄細胞腫（NS−１）とポリエチレングリコー
ルを用いて融合した。細胞は、96穴マイクロ培
養プレート５枚に分配された。24時間後、上清
の半分をHAT培地（ヒポキサンチン１×
10-4M、アミノプテリン４×10-7M、チミジン
1.6×10-3M）におきかえる。HAT耐性細胞
（ハイブリドーマ）が、２−３週後に大半のウ
エルに増殖するのが観察される。 (4) ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマの産生する抗体が、アポB48
に高い特異性を有するか否かは、EIA法を用い
て検討した。アポB100のみを有するLDL又は
アポLDLをコートしたEIA用プレートと、アポ
B100及びアポB48を有するカイロミクロン及
びアポカイロミクロンをコートしたEIA用プレ
ートの計４種のプレートを用意する。アポカイ
ロミクロンのEIA用プレートへの固相化にあた
つては次の処置を要する。まず、カイロミクロ
ンを既述のごとくエーテル：エタノール脱脂後
SDS溶液に可溶化する。しかしながらSDSを多
量に含むままでは、プレートへのコートの効率
が悪いため、アポカイロミクロンを含む溶液を
純水と２時間半透膜にて透析後、プレートへの
コートに用いるのが好ましい。この処置を行な
うことで、アポB48を含むアポカイロミクロン
を効率よくプレートへ付着することができる。
これらのEIA用プレートへマイクロプレート中
の培養上清（25−100μ）を試料穴へ添加し
プレートに付着する免疫グロブリン量をパーオ
キシダーゼ標識抗マウスＩｇ抗体を用いて測定
した。抗アポB48−のハイブリドーマ上清
は、アポB48を多く含むカイロミクロン又はア
ポカイロミクロンに強い親和性を有した。 (5) 単クローン化 単クローン化は、選択されたハイブリドーマ
を、フイーダー細胞にマウス胸腺細胞を用いる
限界稀釈法に２度かけ、EIA法でアポB48に強
い親和性を有する株のみを選択、増殖させた。 (6) 単クローン性抗体の作成 (a) in vitro法 ハイブリドーマは適当な培養液（例えば牛胎
児血清を10％含むRPMI1640培地）で培養し、
その培養上清を回収した。上清中に分泌された
抗体は、50％飽和硫安で沈澱精製し抗体濃度を
高めて使用できる。 (b) in vivo法 ハイブリドーマを注射するBALB／ｃマウ
ス（４月令）には、あらかじめ（４日前）２，
６，10，14−テトラメチルペンタデカンを腹腔
内に注射しておく。次に抗体を産生するハイブ
リドーマをマウス１匹あたり５×106個腹腔内
に注射する。その後１〜２週後に腹水により腹
部が腫大したマウスより腹水を採取する。この
腹水はプロテアーゼ活性をのぞくため56℃で30
分加熱し不活化する。このように処理された腹
水は特に精製することなくそのまま使用でき
る。 実施例 ２ 単クローン性抗体の特異性 抗抗アポB48−の各種アポリポ蛋白との結合
性はEIA法及びトランスブロツテイング法を用い
て検討した。まずEIA法では、抗アポB48−
は、ヒト血漿カイロミクロンと強く反応し、
VLDL、LDLとは弱く反応し、HDL、比重1.21
以下の分画とは結合しない。８種のLDLとアポ
カイロミクロンとの抗アポB48−の結合の比率
を表１に示す。なお、８種のLDL、カイロミク
ロンに結合した抗B48−に対し、パーオキシダ
ーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体を結合さ
せ、発色後OD492-610を測定した。また、LDL及
びアポカイロミクロンはそれぞれほぼ同量のアポ
Ｂを含むよう調整した。
を略す）に高い特異性を有する抗体に関する。 〔従来の技術〕 アポリポ蛋白Ｂ（以下「アポＢ」と略す）はヒ
ト血漿トリグリセリドリツチリポ蛋白の合成、分
泌に重要な役割をもつている。アポＢには肝で産
生され超低比重リポ蛋白（VLDL）合成に関与す
るアポリポ蛋白B100（以下アポB100と略す）と、
小腸で産生されカイロミクロン合成に関与するア
ポB48がある。アポＢを含むリポ蛋白は動脈硬化
起性を有すると考えれ、両者を分析、定量する事
は重要である。アポＢの遺伝的欠損によりひきお
こされる無βリポ蛋白血症には、アポB100、ア
ポB48両者共欠損する古典型と、アポB100のみ
が欠損するTG正常型があり、アポB100とアポ
B48は異なる遺伝的支配の下にある。このよう
に、アポＢは様々な機能を有するにもかかわら
ず、難溶性であり、分解しやすい高分子蛋白のた
めその研究は遅れている また、アポＢの特異的抗原決定基を認識する単
クローン性抗体としてはアポB100のみに結合す
る抗体（単クローン性抗体B100−）と、アポ
B100及びアポB48に同様に結合する抗体（単ク
ローン性抗体抗B48−）が知られる。しかしな
がら、アポB100に比しアポB48に高い特異性を
有する抗体は従来えられていなかつた。 〔本発明が解決しようとする問題点〕 叙上の現状において、各種免疫疾患の治療、診
断及びこれらに関する研究で利用し得る、アポ
B48に高い特異性を有する抗体及びこれを有利に
製造する方法の開発が望まれていた。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らはアポB48に高い特異性を有するる
抗体を得べく鋭意研究をおこなつた結果、精製し
たアポB48に対する単クローン性抗体の中からア
ポB100、LDLに比しアポB48に高い特異性を有
する抗体を見出した。 すなわち本発明は精製されたヒトアポリポ蛋白
B48で予め免疫されたマウスの脾細胞と、マウス
の骨髄腫細胞ラインからの細胞との細胞融合で得
られたハイブリドーマによつて産生され、次の特
徴を有する単クローン性抗体を提供するものであ
る。 (1) 正常ヒト血中アポリポ蛋白B48と結合する。 (2) アポリポ蛋白B100に対する結合性は、アポ
リポ蛋白B48に対する結合性に対し１／25〜１／
11.8であり、その他の正常ヒト血中蛋白とは反応
しない。 (3) TG正常型無βリポ蛋白血症患者の血中リポ
蛋白と結合する。 本発明のアポB48に特異的な抗体（以下「抗ア
ポB48−」と称する）は、次のようにして調製
される。まず抗アポB48−を産生するハイブリ
ドーマを準備する。このハイブリドーマは次の５
工程により得られる。 アポB48の精製 免疫 細胞融合 ハイブリドーマの選択 単クローン性抗体産生株の確立 アポB48の精製に当つては、カイロミクロンを
多量に要するので正常人の大量脂肪食摂取後の血
漿を用いる。サンプルは、EDTA、NaN3及びカ
ナマイシンを加えて処理後、100000ｇで20時間超
遠心し、VLDL＋カイロミクロン分画をえる。こ
の分画より、再び超遠心法でカイロミクロン分画
を分散する。得られたカイロミクロン分画をエー
テル：エタノール＝１：３で脱脂後、10％SDSを
含有する１％２−メルカプトエタノール溶液に溶
解する。この溶液を、ウオータージアケツトで50
℃に保つたセフアロース4B・CLカラムにて、ゲ
ル過する。（溶媒は0.5％SDS、0.01MTrisHC
PH7.4）。得られたアポロB48にとむ分画をプレ
パレテイブ（Preparative）SDS電気泳動装置を
用いて更に精製する。この工程を２日以内におえ
ることにより、アポＢの分解を少なくすることが
でき、ほぼ純粋なアポB48をうることができる。 次いでこのアポB48を用い、常法によりマウス
に免疫を行なう。免疫されたマウスより取り出さ
れた脾細胞とマウス骨髄腫（NS−１）からのハ
イブリドーマの作成はOiの方法（SELECTED
METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY
p351−372（1980））により行なつた。ハイブリド
ーマの中には、種々のアポB48に対する抗体を作
る細胞が存在するが、アポB48に対し特異性を有
する抗体産生株は次の方法により選択される。ま
ず、低比重リポ蛋白（LDL）、カイロミクロンそ
してSDSにより脱脂したアポLDL、アポカイロ
ミクロンのリポ蛋白もしくはアポ蛋白でコートし
た４種のEIA法用プレートを用意する。なお、ア
ポカイロミクロンはこれを脱脂後、純水と半透膜
にて透析することにより、効率よくプレートに付
着させられ、アポB48に対する特異性の高い抗体
をひろい出すことが容易となる。次にチエツクし
たい細胞の培養上清を適量各プレートに取りイン
キユベートし、結合した免疫グロブリン量をパー
オキシダーゼ標識抗マウスＩｇ抗体で測定する。
LDL及びアポLDLは、アポB100のみを含むのに
対し、カイロミクロン及びアポカイロミクロン
は、アポB100とアポB48両者を含む。この結果、
LDL又はアポLDLに比し、カイロミクロン及び
アポカイロミクロンに高い親和性を有する抗体及
びこれを産生するハイブリドーマが選択される。
この中からアポB48との結合性がアポB100と比
し10倍以上高い抗体（抗アポB48−）を産生す
るハイブリドーマが選択され２回の限界稀釈法に
て単クローン化される。 こうして目的のハイブリドーマが得られたな
ら、目的の抗体（抗アポB48−）は次の２つの
方法で量産される。その１つはハイブリドーマを
適当な培養液中（in vitro）で培養し、その上清
に生成された抗体を回収する方法であり、他の１
つはハイブリドーマをマウスに注射し、（in
vivo）生体内で培養し、マウスの腹水中に生成さ
れる抗体を回収する方法である。前者の方法では
抗体価は低いが純度の高いものが得られる。これ
に対し、後者の方法では純度はやや劣るが、非常
に抗体価の高いものが得られる。どちらの方法と
選択するかは目的により使いわけられる。 〔作用〕 次に斯くして得られた抗アポB48−を利用し
ておこなわれる免疫酵素抗体測定方法（EIA法）
について説明する。このEIA法としては、測定し
たいサンプルをポリスチレン製96穴マイクロプレ
ートへ付着させ、その後抗アポB48−、パーオ
キシダーゼ標識抗マウスIgGを反応させる間接法
と、プレートへあらかじめウサギ（又はヤギ）抗
アポＢポリクローナル抗体を付着させておき、こ
れにサンプルを結合させ、次いで抗アポB48−
を添加するサンドイツチ法のいずれをも採用する
ことができる。そして、本発明の抗アポB48−
は上記したようにアポB48には結合するがアポ
B100との結合性はアポB48の結合性の１／10程
度又はそれ以下と弱く、また、他の血中アポリポ
蛋白、例えばアルブミン、アポリポ蛋白Ｅ等とは
結合しないのであるから、他の従来知られている
単クローン性抗体を用いた場合の結果と照合する
ことによりアポB48の正確な定量が可能となつ
た。この結果、カイロマイクロンレムナントの検
出、アポB100欠損者のアポＢの測定、腸管で合
成されるアポリポ蛋白の数量的診断、食後に血中
に増加するTGリツチリポ蛋白における小腸由来
リポ蛋白の割合、食事性因子の動脈硬化におよぼ
す影響等を知ることができるようになつた。 〔実施例〕 次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明す
る。実施例 １ 単クローン性抗体抗アポB48−及びそれを
産生するハイブリドーマの製法： (1) アポB48の精製 カイロミクロンの分取は種々のサンプルより
行なわれるが、ここでは血漿よりの分離法につ
いてのべる。 正常人の大量脂肪食摂取後の血漿約２を採
取後直ちに1mM EDTA、0.02％NaN3となる
よう調製し、Beckman Sw27ローター100000
ｇで20時間超遠心し、カイロミクロン＋VLDL
分画を得る。更にこの分画をBeckman40、３
ローターで20000rpm30間遠心し、浮上したカ
イロミクロン分画を取る。このカイロミクロン
分画は20倍量のエーテル：エタノール（１：
3vol／vol）溶液中にて10時間脱脂する。沈澱
した蛋白を2000rpm5分遠沈にて回収したのち、
約10mlの10％SDS、１％２−メルカプトエタノ
ール溶液に溶解する。このうち約５mlをウオー
タージヤケツトで50℃にしたセフアロース
4B・CLカラムによりゲル過する。溶媒は0.5
％SDS、0.01MTris−HCPH7.2 0.15MNaC
を用いる。得られたアポB48にとむ分画をダイ
アフローメンブレンPM10（アミコン社）を用
いて濃縮後、３％ポリアクリルアミド、0.1％
SDS電気泳動を行ないゲルを切断してアポB48
のみを含む分画を回収し、0.5％
SDS0.01MTris HC溶液中にアポB48を溶出
させる。 (2) 免疫 精製したSDS溶液中のアポB48 100μｇを、
フロインド完全アジユバンドと共にBALB／
ｃマウス（６週令）に皮下注射し、３週後に
50μｇをアジユバンドと共に腹腔内へ注射し
た。 (3) ２回目の免疫より３日後、マウスの脾臓をと
りだし、脾細胞の懸濁液とする。１×108個の
脾細胞を３×107個の８−アザダアニン耐性骨
髄細胞腫（NS−１）とポリエチレングリコー
ルを用いて融合した。細胞は、96穴マイクロ培
養プレート５枚に分配された。24時間後、上清
の半分をHAT培地（ヒポキサンチン１×
10-4M、アミノプテリン４×10-7M、チミジン
1.6×10-3M）におきかえる。HAT耐性細胞
（ハイブリドーマ）が、２−３週後に大半のウ
エルに増殖するのが観察される。 (4) ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマの産生する抗体が、アポB48
に高い特異性を有するか否かは、EIA法を用い
て検討した。アポB100のみを有するLDL又は
アポLDLをコートしたEIA用プレートと、アポ
B100及びアポB48を有するカイロミクロン及
びアポカイロミクロンをコートしたEIA用プレ
ートの計４種のプレートを用意する。アポカイ
ロミクロンのEIA用プレートへの固相化にあた
つては次の処置を要する。まず、カイロミクロ
ンを既述のごとくエーテル：エタノール脱脂後
SDS溶液に可溶化する。しかしながらSDSを多
量に含むままでは、プレートへのコートの効率
が悪いため、アポカイロミクロンを含む溶液を
純水と２時間半透膜にて透析後、プレートへの
コートに用いるのが好ましい。この処置を行な
うことで、アポB48を含むアポカイロミクロン
を効率よくプレートへ付着することができる。
これらのEIA用プレートへマイクロプレート中
の培養上清（25−100μ）を試料穴へ添加し
プレートに付着する免疫グロブリン量をパーオ
キシダーゼ標識抗マウスＩｇ抗体を用いて測定
した。抗アポB48−のハイブリドーマ上清
は、アポB48を多く含むカイロミクロン又はア
ポカイロミクロンに強い親和性を有した。 (5) 単クローン化 単クローン化は、選択されたハイブリドーマ
を、フイーダー細胞にマウス胸腺細胞を用いる
限界稀釈法に２度かけ、EIA法でアポB48に強
い親和性を有する株のみを選択、増殖させた。 (6) 単クローン性抗体の作成 (a) in vitro法 ハイブリドーマは適当な培養液（例えば牛胎
児血清を10％含むRPMI1640培地）で培養し、
その培養上清を回収した。上清中に分泌された
抗体は、50％飽和硫安で沈澱精製し抗体濃度を
高めて使用できる。 (b) in vivo法 ハイブリドーマを注射するBALB／ｃマウ
ス（４月令）には、あらかじめ（４日前）２，
６，10，14−テトラメチルペンタデカンを腹腔
内に注射しておく。次に抗体を産生するハイブ
リドーマをマウス１匹あたり５×106個腹腔内
に注射する。その後１〜２週後に腹水により腹
部が腫大したマウスより腹水を採取する。この
腹水はプロテアーゼ活性をのぞくため56℃で30
分加熱し不活化する。このように処理された腹
水は特に精製することなくそのまま使用でき
る。 実施例 ２ 単クローン性抗体の特異性 抗抗アポB48−の各種アポリポ蛋白との結合
性はEIA法及びトランスブロツテイング法を用い
て検討した。まずEIA法では、抗アポB48−
は、ヒト血漿カイロミクロンと強く反応し、
VLDL、LDLとは弱く反応し、HDL、比重1.21
以下の分画とは結合しない。８種のLDLとアポ
カイロミクロンとの抗アポB48−の結合の比率
を表１に示す。なお、８種のLDL、カイロミク
ロンに結合した抗B48−に対し、パーオキシダ
ーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体を結合さ
せ、発色後OD492-610を測定した。また、LDL及
びアポカイロミクロンはそれぞれほぼ同量のアポ
Ｂを含むよう調整した。
【表】
トランスブロツテイング法による抗アポB48−
とアポＢ群の結合性の検討は次の様に行なつ
た。まず各アポリポ蛋白は油谷らの方法*により
SDS−ポリアクリルアミドグラジエントゲル電気
泳動を行ない、その後Towbinの方法**により、
セルロースニトレート膜へ移される。このセルロ
ースニトレート膜を抗アポB48−と室温で１時
間インキユベートしたのち、パーオキシダーゼ標
識抗マウスＩｇ抗体を用いて各アポリポ蛋白を検
出した。すなわち、正常者脂肪食後３時間の血漿
中のTG・リツチリポ蛋白（ｄ＜1.006分画）のア
ポ蛋白をSDS・ポリアクリルアミドグラジエント
ゲル電気泳動し（第１図，Ａ）それをセルロース
ニトレート膜へトランスブロツテイングした後抗
B48−と結合させ、抗マウスＩｇＧ・パーオキ
シダーゼで発色させた（第１図，Ｂ）。第１図，
Ａのクマジー染色ではB100がB48よりかなり多
いが、抗B48−は、B48とよく結合することが
第１図，Ｂに示されている。アポB100とB48を
SDSポリアクリルアミド電気泳動後、セルロース
ニトレート膜へトランスブロツトしその後抗B48
−、抗B48−と反応させ、結合したIgをパー
オキシダーゼ標識抗マウスＩｇにより検討した結
果を第２図に示す。従来より知られる抗B48−
は主にB100へ結合するが（第２図，Ｂ）、抗B48
−はB100へはほとんど結合せず、B48へはよ
く結合する。（第２図，Ａ）。 これらの結果から、抗アポB48−は、アポ
B48とは強く結合するが、アポB100とは弱く結
合するにすぎないことがわかる。 表１の結果とあわせ考えると抗アポB48−
は、アポB48に対する結合量の約100％以下しか
アポB100に結合しえない。 ＊油谷らの方法： Journal of Biochemistry，94，1241−1245
（1983） ＊＊Towbinの方法： Proccedings of National Academy of
Seience U.S.A.，76，4350−4354（1979）
とアポＢ群の結合性の検討は次の様に行なつ
た。まず各アポリポ蛋白は油谷らの方法*により
SDS−ポリアクリルアミドグラジエントゲル電気
泳動を行ない、その後Towbinの方法**により、
セルロースニトレート膜へ移される。このセルロ
ースニトレート膜を抗アポB48−と室温で１時
間インキユベートしたのち、パーオキシダーゼ標
識抗マウスＩｇ抗体を用いて各アポリポ蛋白を検
出した。すなわち、正常者脂肪食後３時間の血漿
中のTG・リツチリポ蛋白（ｄ＜1.006分画）のア
ポ蛋白をSDS・ポリアクリルアミドグラジエント
ゲル電気泳動し（第１図，Ａ）それをセルロース
ニトレート膜へトランスブロツテイングした後抗
B48−と結合させ、抗マウスＩｇＧ・パーオキ
シダーゼで発色させた（第１図，Ｂ）。第１図，
Ａのクマジー染色ではB100がB48よりかなり多
いが、抗B48−は、B48とよく結合することが
第１図，Ｂに示されている。アポB100とB48を
SDSポリアクリルアミド電気泳動後、セルロース
ニトレート膜へトランスブロツトしその後抗B48
−、抗B48−と反応させ、結合したIgをパー
オキシダーゼ標識抗マウスＩｇにより検討した結
果を第２図に示す。従来より知られる抗B48−
は主にB100へ結合するが（第２図，Ｂ）、抗B48
−はB100へはほとんど結合せず、B48へはよ
く結合する。（第２図，Ａ）。 これらの結果から、抗アポB48−は、アポ
B48とは強く結合するが、アポB100とは弱く結
合するにすぎないことがわかる。 表１の結果とあわせ考えると抗アポB48−
は、アポB48に対する結合量の約100％以下しか
アポB100に結合しえない。 ＊油谷らの方法： Journal of Biochemistry，94，1241−1245
（1983） ＊＊Towbinの方法： Proccedings of National Academy of
Seience U.S.A.，76，4350−4354（1979）
第１図はアポ蛋白をSDS・ポリアクリルアミド
グラジエントゲル電気泳動した結果及び更にこれ
を抗B48−と結合させ染色せしめた結果を示す
図面である。第２図は、アポB48とアポB100を
SDS・ポリアクリルアミド電気泳動せしめ、抗
B48−Ａ及び抗B48−Ａと結合させた後発色
せしめた結果を示す図面である。
グラジエントゲル電気泳動した結果及び更にこれ
を抗B48−と結合させ染色せしめた結果を示す
図面である。第２図は、アポB48とアポB100を
SDS・ポリアクリルアミド電気泳動せしめ、抗
B48−Ａ及び抗B48−Ａと結合させた後発色
せしめた結果を示す図面である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 精製されたヒトアポリポ蛋白B48で予め免疫
されたマウスの脾細胞と、マウスの骨髄腫細胞ラ
インからの細胞との細胞融合で得られたハイブリ
ドーマによつて産生され、次の特徴を有する単ク
ローン性抗体。 (1) 正常ヒト血中アポリポ蛋白B48と結合する。 (2) アポリポ蛋白B100に対する結合性は、アポ
カイロミクロンに対する結合性に対し１／25〜
１／11.8であり、その他の正常ヒト血中蛋白と
は反応しない。 (3) TG正常型無βリポ蛋白血症患者の血中リポ
蛋白と結合する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59126663A JPS617299A (ja) | 1984-06-20 | 1984-06-20 | ヒトアポリポ蛋白ｂ４８に高い特異性を有する単クローン性抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59126663A JPS617299A (ja) | 1984-06-20 | 1984-06-20 | ヒトアポリポ蛋白ｂ４８に高い特異性を有する単クローン性抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS617299A JPS617299A (ja) | 1986-01-13 |
| JPH0513635B2 true JPH0513635B2 (ja) | 1993-02-23 |
Family
ID=14940791
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59126663A Granted JPS617299A (ja) | 1984-06-20 | 1984-06-20 | ヒトアポリポ蛋白ｂ４８に高い特異性を有する単クローン性抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS617299A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2005093415A1 (ja) * | 2004-03-29 | 2008-02-14 | 株式会社シバヤギ | アポリポタンパク質ｂ−４８の測定方法およびその用途 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3734015A1 (de) * | 1987-10-08 | 1989-04-20 | Behringwerke Ag | Diagnostisches mittel und verfahren zur bestimmung von apolipoprotein b |
| US6309844B1 (en) | 1997-10-15 | 2001-10-30 | Fujirebio Inc. | Anti-apo-B-48 monoclonal antibody, hybridoma producing the same, and method for measuring apo-B-48 using the same |
| FR2841249A1 (fr) * | 2002-06-19 | 2003-12-26 | Genfit S A | Compositions et methodes pour le dosage de l'apo b48 et de l'apo b100 |
| CN105738628A (zh) * | 2014-12-12 | 2016-07-06 | 上海复星长征医学科学有限公司 | 一种纯化羊抗人血浆载脂蛋白a-i多克隆抗体的方法 |
-
1984
- 1984-06-20 JP JP59126663A patent/JPS617299A/ja active Granted
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J.BIOL.CHEM=1982 * |
| PROC.NATL.ACAD.SCI=1980US * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2005093415A1 (ja) * | 2004-03-29 | 2008-02-14 | 株式会社シバヤギ | アポリポタンパク質ｂ−４８の測定方法およびその用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS617299A (ja) | 1986-01-13 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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