JPS6042400A - ヒトＩｇＭに対する単一クロ−ン抗体 - Google Patents
ヒトＩｇＭに対する単一クロ−ン抗体Info
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- JPS6042400A JPS6042400A JP15215683A JP15215683A JPS6042400A JP S6042400 A JPS6042400 A JP S6042400A JP 15215683 A JP15215683 A JP 15215683A JP 15215683 A JP15215683 A JP 15215683A JP S6042400 A JPS6042400 A JP S6042400A
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- cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ｍ化対する単一クローン抗体シこ関するものである。
近年、特異性の高い抗体を大型に得る方法として、抗体
産生細胞と骨髄肝細胞を融合し、ハイブリドーマ（融合
細胞）を作製し、これを培養することにより単一クロー
ン抗体を生産する方法が知うレ（ミルシュタインら、Ｎ
ａｔｔｉｒｅ、Ｖｏｌ、 ２５６ ＋ｐ４９５（１９７
５〕）、多数の単一クローン抗体が取得されている。
産生細胞と骨髄肝細胞を融合し、ハイブリドーマ（融合
細胞）を作製し、これを培養することにより単一クロー
ン抗体を生産する方法が知うレ（ミルシュタインら、Ｎ
ａｔｔｉｒｅ、Ｖｏｌ、 ２５６ ＋ｐ４９５（１９７
５〕）、多数の単一クローン抗体が取得されている。
抗体産生細胞は、幹細胞→プレＢ細胞→Ｂ細胞−艷活性
化Ｂ細胞−艷抗体産生細胞（形質細胞）と分化する。こ
の過程で、プレＢ細胞ではＩｇＭのＩＩ １Ｍ（μ鎖）
が細胞質内て合成され、Ｂ細胞にな、ると細胞表面に１
ｇＭ分子を保有するようになる。抗原刺激を受けたＢ細
胞は、活性化Ｂ細胞になり、さらに抗体産生細胞へ分化
し、ＩｇＭ 、ＩｇＧ 、 ＩｇＡ 。
化Ｂ細胞−艷抗体産生細胞（形質細胞）と分化する。こ
の過程で、プレＢ細胞ではＩｇＭのＩＩ １Ｍ（μ鎖）
が細胞質内て合成され、Ｂ細胞にな、ると細胞表面に１
ｇＭ分子を保有するようになる。抗原刺激を受けたＢ細
胞は、活性化Ｂ細胞になり、さらに抗体産生細胞へ分化
し、ＩｇＭ 、ＩｇＧ 、 ＩｇＡ 。
■ｇ星などの抗体を分泌する・ようになる。したがって
、蛍光物質もしくは酵素などで標識した抗ＩｇＭことが
できる。さらに、糸球体腎炎の患者では、腎臓に免疫グ
ロブリンが免疫複合体として沈着１することが認められ
、”ＩｇＡが沈着するＩｇＡ腎症や、門 ＩｇＧ 、 Ｉｇｉｌが沈着する場合も知られている。
、蛍光物質もしくは酵素などで標識した抗ＩｇＭことが
できる。さらに、糸球体腎炎の患者では、腎臓に免疫グ
ロブリンが免疫複合体として沈着１することが認められ
、”ＩｇＡが沈着するＩｇＡ腎症や、門 ＩｇＧ 、 Ｉｇｉｌが沈着する場合も知られている。
このような糸球体腎炎の鑑別診断にも抗１ｇＭ抗体は使
用することができる。
用することができる。
しかしながら、ヒトＩｇＭを異種動物に免疫して得られ
た抗血清では、ＩｇＭに対する特異性に問題があり、Ｂ
細胞を特異的に染色することは困難てあった。
た抗血清では、ＩｇＭに対する特異性に問題があり、Ｂ
細胞を特異的に染色することは困難てあった。
ヒトＩｇＭに対する単一クローン抗体につ０てｉｔ、Ｔ
Ｋｕｒｉ’ｔａｎｉ らなとに報告され（ユＥＸｐ、
Ｍｊｄ、、 ＶＯ１１５５、ｐ８３９（１９８２））、
数社から市販されている。しかしながら、これらの単一
クローン抗体はＩｇＭに対する特異性に関しては優れて
Ｉｌするが、Ｂ細胞の組織染色において′は、非特異的
な結合を生してバックグランドまで染色するなどの欠点
を有し、満足できるものではなかった。
Ｋｕｒｉ’ｔａｎｉ らなとに報告され（ユＥＸｐ、
Ｍｊｄ、、 ＶＯ１１５５、ｐ８３９（１９８２））、
数社から市販されている。しかしながら、これらの単一
クローン抗体はＩｇＭに対する特異性に関しては優れて
Ｉｌするが、Ｂ細胞の組織染色において′は、非特異的
な結合を生してバックグランドまで染色するなどの欠点
を有し、満足できるものではなかった。
本発明は、このような技術背景のもとに完成されたもの
であり、ＩｇＭに対して特異性を有し、Ｂ細胞表面上の
μ鎖と特異的な結合能を有する単一クローン抗体を提供
するものである。
であり、ＩｇＭに対して特異性を有し、Ｂ細胞表面上の
μ鎖と特異的な結合能を有する単一クローン抗体を提供
するものである。
本発明抗体は、ＩｇＭに対して特異性を有・し、かつＢ
細胞表面上においてμ鎖に特異的な結合能を有するとい
う特性を兼備するものである。したがって、本発明抗体
を蛍光物質もしくは酵素などで標識して組織染色に用い
れば、Ｂ細胞表面にお０て非特異的な結合を生ぜず、ノ
くツクグランドが染色しないので、明瞭なり細胞の特異
的染色が可能である。このように、本発明抗体はＢ細胞
のμ鎖と特異的に結合を有することから、リンパ節等の
組織においてＢ細胞領域を特異的か゛つ明瞭に染め分け
ることができるなど、前述した抗１ｇＮ抗体の有用性に
おいてずくれた効果を達成するものである。
細胞表面上においてμ鎖に特異的な結合能を有するとい
う特性を兼備するものである。したがって、本発明抗体
を蛍光物質もしくは酵素などで標識して組織染色に用い
れば、Ｂ細胞表面にお０て非特異的な結合を生ぜず、ノ
くツクグランドが染色しないので、明瞭なり細胞の特異
的染色が可能である。このように、本発明抗体はＢ細胞
のμ鎖と特異的に結合を有することから、リンパ節等の
組織においてＢ細胞領域を特異的か゛つ明瞭に染め分け
ることができるなど、前述した抗１ｇＮ抗体の有用性に
おいてずくれた効果を達成するものである。
本発ｉ抗体の調製法、調製形態については特に限定され
ず、目的に応して適宜に選択されるべきである。本発明
抗体を産生ずるハイブリドーマは一般の細胞融合法を応
用して得る２ことがてき−る。
ず、目的に応して適宜に選択されるべきである。本発明
抗体を産生ずるハイブリドーマは一般の細胞融合法を応
用して得る２ことがてき−る。
このような細胞融合法について説明すれば次のとおりで
ある。
ある。
■ 抗体産生細胞の調製
抗体産生細胞の調製は、ヒト血清より精製したヒトＩｇ
−をマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、な
どの異種動物に免疫し、その免疫を獲得した肺細胞、胸
腺細胞゛、リンパ節細胞および／または末梢血細胞の抗
体産生細胞を取得することにより行う。
−をマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、な
どの異種動物に免疫し、その免疫を獲得した肺細胞、胸
腺細胞゛、リンパ節細胞および／または末梢血細胞の抗
体産生細胞を取得することにより行う。
■ ミエローマ細胞の調製
ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ウサギ、ヒ
トなとの種々の動物の細胞株を適用できる。使用する細
胞株は、好ましくは薬剤紙 〈抗性のものであり、未融
合の状態では選択培地で生存できず、融合した状態て生
存てきる性質を自するものであることが好ましい。最も
普通に用いられるのは、８−アザグアニン抵抗性の細胞
株であり、これはヒボキサンチン・ホスホリボメルト５
ンス７ ｘ ５− セ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉ、ｎｅ
ｐｈｏｓｐｂｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅ ）を欠損し、ヒボキサンチン アミノプテリン チ
ミン゛ン（ＨＡＴ ）培地に生育てきない性質を有する
。また、いゎ （ゆる１非分泌型」の細胞株であること
が好ましい。このような細胞株の具体例としては、マウ
スミエローマ・Ｍ ＯＰ Ｃ−２，１ライン由来のＰＢ
／Ｘ ６８−Ａｇ’８ Ｕｌ （ＰＢＵＩ）、Ｐｇ／
Ｘ ６８． Ａｇ８ ６ ５ ・ ３ （Ｘ ６８ ６
・ ５ ８ ）、Ｐ８／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−ＮＳｌ
−１−Ａ、Ｓ、 ２１０−Ａｇ１４ （ＳＦ３）、ラッ
トミエローマ２１゜ＲＣＹ８ Ａｇ１・２・８ （Ｙ８
・Ａｇ １．２３ ） 、 ヒ ト ミ エ ロ −マ
［１−２６６，−ＡＰＩ 。
トなとの種々の動物の細胞株を適用できる。使用する細
胞株は、好ましくは薬剤紙 〈抗性のものであり、未融
合の状態では選択培地で生存できず、融合した状態て生
存てきる性質を自するものであることが好ましい。最も
普通に用いられるのは、８−アザグアニン抵抗性の細胞
株であり、これはヒボキサンチン・ホスホリボメルト５
ンス７ ｘ ５− セ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉ、ｎｅ
ｐｈｏｓｐｂｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅ ）を欠損し、ヒボキサンチン アミノプテリン チ
ミン゛ン（ＨＡＴ ）培地に生育てきない性質を有する
。また、いゎ （ゆる１非分泌型」の細胞株であること
が好ましい。このような細胞株の具体例としては、マウ
スミエローマ・Ｍ ＯＰ Ｃ−２，１ライン由来のＰＢ
／Ｘ ６８−Ａｇ’８ Ｕｌ （ＰＢＵＩ）、Ｐｇ／
Ｘ ６８． Ａｇ８ ６ ５ ・ ３ （Ｘ ６８ ６
・ ５ ８ ）、Ｐ８／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−ＮＳｌ
−１−Ａ、Ｓ、 ２１０−Ａｇ１４ （ＳＦ３）、ラッ
トミエローマ２１゜ＲＣＹ８ Ａｇ１・２・８ （Ｙ８
・Ａｇ １．２３ ） 、 ヒ ト ミ エ ロ −マ
［１−２６６，−ＡＰＩ 。
ＧＭ１５００などを挙げることかできる。
Ｄ 細胞融合
細胞融合は、イーグル最少基本培地（ＭＥＭ ）、ＲＰ
ＭＩ １６４０なとの動物細胞培養用培地中で１０７−
１０８のミエローマ細胞と抗体産生細胞を混合比１：４
〜１０て混合して行う。融合促進剤としては平均分子ｍ
１０００〜６０００のポリエチレングリコロール（Ｐ
ＥＧ）をはしめ、ポリビニルアルコール、ウィルスなと
か使用される。
ＭＩ １６４０なとの動物細胞培養用培地中で１０７−
１０８のミエローマ細胞と抗体産生細胞を混合比１：４
〜１０て混合して行う。融合促進剤としては平均分子ｍ
１０００〜６０００のポリエチレングリコロール（Ｐ
ＥＧ）をはしめ、ポリビニルアルコール、ウィルスなと
か使用される。
リ 選択培地におけるハイフリト−マの選別細胞融合処
理後の細胞からハイブリドーマを選別するには選択培地
における選択的増殖により行う。たとえば、細胞を１５
％ウノ胎児血清含イＴ ＲＰ Ｍ Ｉ’ １６４０４７
：地なとて適当に希釈し、マイクロタイタープレー １
・上に１０５〜１０６／ウエル程度にまき、各ウェルに
選択培地（たとえば、ＨＡＴ培地なと）を加え、以後適
当に選択培地を交換して培養する。たとえばミエロ−マ
細胞として８−アザグアニン抵抗性株、選択培地として
ＨＡＴ培地を用いれば、未融合のミエローマ細胞は培養
１０日１くらいまでに死滅し、また正常細胞である抗体
産生細胞も １ｎｖｉｔｒｏでは長期間生育てきない。
理後の細胞からハイブリドーマを選別するには選択培地
における選択的増殖により行う。たとえば、細胞を１５
％ウノ胎児血清含イＴ ＲＰ Ｍ Ｉ’ １６４０４７
：地なとて適当に希釈し、マイクロタイタープレー １
・上に１０５〜１０６／ウエル程度にまき、各ウェルに
選択培地（たとえば、ＨＡＴ培地なと）を加え、以後適
当に選択培地を交換して培養する。たとえばミエロ−マ
細胞として８−アザグアニン抵抗性株、選択培地として
ＨＡＴ培地を用いれば、未融合のミエローマ細胞は培養
１０日１くらいまでに死滅し、また正常細胞である抗体
産生細胞も １ｎｖｉｔｒｏでは長期間生育てきない。
したがって１、培養１０〜１４日目から生育してくる細
胞はすべてハイブリドーマとなる。
胞はすべてハイブリドーマとなる。
６）抗ヒトＩｇＭ抗体産生ハイブリドーマの検索抗ヒト
ＩｇＭ抗体産生ハイブリドーマの検索は、酵素免疫測定
法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ １ｎｎｎｕｎ。
ＩｇＭ抗体産生ハイブリドーマの検索は、酵素免疫測定
法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ １ｎｎｎｕｎ。
３ｐｒｂｅ’ｎｔ Ａｓ５ａｙ 、Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ
）によって行った。
）によって行った。
′ ヒ
ずなわち、陣ト血ｌｉＶより精製したＩｇＭ、または・
Ｎ髄肺患者血ｉｎより精製したＩｇＭを予め１０〜１０
０μ９ ／ ｍｌにりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、
炭酸水素ナトリウム（ｐｌｌ ８．０ ）なとの緩衝液
Ｉζ溶解させ、Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ ／Ｌノポリ塩化ビ
ニル（ＰＶＣ）なとのソフトプレート（９６穴） ニ５
０ ＩＪずつ添加し、４°Ｃて〜晩装置する。次に上記
抗原を捨て、ＰＢＳて洗浄後、１９６ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを加えて室温て１時間静置し、
抗原の結合していない部位をＢＳＡでブロックする。ハ
イブリドーマの上ｌ青を５０μγ ずつ加え、室温で１
時間放置し、ＰＢＳて８回洗浄する。次に抗マウスイム
ノグロブリン抗血清（第２抗体）をビオチン化したもの
を加え、室温で１時間放置する。ＰＢＳで８回洗浄後、
アビジンＤ−酵素結合体を加え、室温で１５分間静置す
る。ＰＥ３Ｓで４回洗浄後、酵素の基質を°加えて発色
させる。
Ｎ髄肺患者血ｉｎより精製したＩｇＭを予め１０〜１０
０μ９ ／ ｍｌにりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、
炭酸水素ナトリウム（ｐｌｌ ８．０ ）なとの緩衝液
Ｉζ溶解させ、Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ ／Ｌノポリ塩化ビ
ニル（ＰＶＣ）なとのソフトプレート（９６穴） ニ５
０ ＩＪずつ添加し、４°Ｃて〜晩装置する。次に上記
抗原を捨て、ＰＢＳて洗浄後、１９６ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを加えて室温て１時間静置し、
抗原の結合していない部位をＢＳＡでブロックする。ハ
イブリドーマの上ｌ青を５０μγ ずつ加え、室温で１
時間放置し、ＰＢＳて８回洗浄する。次に抗マウスイム
ノグロブリン抗血清（第２抗体）をビオチン化したもの
を加え、室温で１時間放置する。ＰＢＳで８回洗浄後、
アビジンＤ−酵素結合体を加え、室温で１５分間静置す
る。ＰＥ３Ｓで４回洗浄後、酵素の基質を°加えて発色
させる。
抗原と結合力のある抗体を産生じている培養上清を加え
たウェルは、以」二の操作で容易に判別でき、ハイブリ
ドーマの検索を行うことかできる。
たウェルは、以」二の操作で容易に判別でき、ハイブリ
ドーマの検索を行うことかできる。
■ クローニング
各ウェル中には２種以上のハイブリドーマがｌイ′
生育している可能性があるので、限界希釈法なとにより
クローニングを行い、単一クローン抗体産生ハイブリド
ーマを取得する。
クローニングを行い、単一クローン抗体産生ハイブリド
ーマを取得する。
■ 抗体の生産
最も純粋な単一クローン抗体は、その産生ハイブリドー
マを１０〜１５％ウシ胎児血清含自ＲＰ ｔｖｌ Ｉ
１６４０培地なとの動物細胞培養用培地で培養し、その
培養上清液から得゛ることかてきるー。その細胞培養法
および条件は、通隼の動物細胞培養法のものを適宜に応
用すればよい。
マを１０〜１５％ウシ胎児血清含自ＲＰ ｔｖｌ Ｉ
１６４０培地なとの動物細胞培養用培地で培養し、その
培養上清液から得゛ることかてきるー。その細胞培養法
および条件は、通隼の動物細胞培養法のものを適宜に応
用すればよい。
一方、さらに大量に抗体を生産する方法として、ハイブ
リドーマの親ミエローマ細胞の由来動物と同系動物にブ
リスタン（２，６，１０，ｌ ４−テトラメチルベンタ
テカン）なとの鉱物浦を腹腔内に投！りした後、ハイブ
リドーマを腹腔内投！ｊ、 して大量に増殖させる方法
を採用することかできる。ハイフリトーマは１０〜１８
ト１はとて腹水肺癌を形成し、血清および腹水中に高濃
度（約１〜２０ ｍｇ ／ ｒｎ（）の抗体が生産され
る。精製を必すとする場合には、腹水を硫安分画後、Ｄ
ＥＡＥ セルロτスイオン交換クロマトグラフィー、ヒ
Ｉ・ＩｇＭを結合させたセファロース４Ｂなとを用いた
アフイニテイ力ラムクロマトグラフイ−１分子ふるいカ
ラムクロマトグラフィーなどによって精製することによ
り目的を達することができる。
リドーマの親ミエローマ細胞の由来動物と同系動物にブ
リスタン（２，６，１０，ｌ ４−テトラメチルベンタ
テカン）なとの鉱物浦を腹腔内に投！りした後、ハイブ
リドーマを腹腔内投！ｊ、 して大量に増殖させる方法
を採用することかできる。ハイフリトーマは１０〜１８
ト１はとて腹水肺癌を形成し、血清および腹水中に高濃
度（約１〜２０ ｍｇ ／ ｒｎ（）の抗体が生産され
る。精製を必すとする場合には、腹水を硫安分画後、Ｄ
ＥＡＥ セルロτスイオン交換クロマトグラフィー、ヒ
Ｉ・ＩｇＭを結合させたセファロース４Ｂなとを用いた
アフイニテイ力ラムクロマトグラフイ−１分子ふるいカ
ラムクロマトグラフィーなどによって精製することによ
り目的を達することができる。
本発明抗体を生産するに好適なハイブリドーマの例とし
て、２０１２株、８Ｆ１株、４！（７株などが取得され
ている。
て、２０１２株、８Ｆ１株、４！（７株などが取得され
ている。
以下、これらのハイブリドーマの調製法と、それらから
生産される本発明抗体の性質についてより具体的な説明
を加える。
生産される本発明抗体の性質についてより具体的な説明
を加える。
！、 ハイブリドーマの取得
ヒトＩｇＭ （１１＋１ｇ／＊／）を生理食塩水に溶解
させ、完全フロインドアジュバント、と１：１で混合し
てエマルジョンとしたものを、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（雌
、６週令）に２週問おきに数回５０μ９／ｂｅａｄ 腹
腔内投勾し、最後に８０μｇを静注しノこ。
させ、完全フロインドアジュバント、と１：１で混合し
てエマルジョンとしたものを、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（雌
、６週令）に２週問おきに数回５０μ９／ｂｅａｄ 腹
腔内投勾し、最後に８０μｇを静注しノこ。
最終免疫から３日後にマウスの牌細胞を取り出し、ＭＥ
Ｍて洗浄した。マウスミエローマＰ３ｔＪｌをＭＥＭで
洗浄し、牌細胞とｐＢｕｌを１０：１て混合して遠心後
、ペレットに５０％ＰＥＧ１０００ＭＥＭ溶液ＩＩＩＩ
ｔを徐々に加えて細胞融合を？ｊわせた。さらにＭＥＭ
溶液を徐々に加え、最終的に１０ｍ１とした。再び遠心
し、ペレットを１５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭ Ｉ １
６４０培地にｐ８ｕ、として１ ｘ １０５ｃｅｌ１１
０．１ｍ／とナルヨウニ懸濁させ、９６ウエルマイクロ
プレートに０．１肩ｌずつまいた。
Ｍて洗浄した。マウスミエローマＰ３ｔＪｌをＭＥＭで
洗浄し、牌細胞とｐＢｕｌを１０：１て混合して遠心後
、ペレットに５０％ＰＥＧ１０００ＭＥＭ溶液ＩＩＩＩ
ｔを徐々に加えて細胞融合を？ｊわせた。さらにＭＥＭ
溶液を徐々に加え、最終的に１０ｍ１とした。再び遠心
し、ペレットを１５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭ Ｉ １
６４０培地にｐ８ｕ、として１ ｘ １０５ｃｅｌ１１
０．１ｍ／とナルヨウニ懸濁させ、９６ウエルマイクロ
プレートに０．１肩ｌずつまいた。
１日後、ＨＡ Ｔ培地を０．１ ｍｔずつ添加し、その
後３〜４日ごとに培地の半分量を新しいＨＡＴのウェル
で１ハイブリドーマの生育が認められた。
後３〜４日ごとに培地の半分量を新しいＨＡＴのウェル
で１ハイブリドーマの生育が認められた。
ハイブリドーマが生育してきたウェルの上ｌｎｓｅｗｍ
ｇｓｓｇ＋ａ’ｓｓｇ＋ｓａｓｉｇｓｇｇｓ＊ａｗｓａ
ｍ■１１１１ＷＩＷＩＩＩＩＩＷＩＩ５ｏμｌずっをそ
れぞれ予めヒト夏ｇＭでコートした・９６穴ソフトブレ
ーゝトに添加した。アビジンＤ〜酵素結合体としてアビ
ンンＤ−ペルオキシダーゼ（バクターン１製）、基質お
よび発色剤として過酸化水素、４−アミノアンチピリン
、フエノー−レを用いて前記したＥＬ Ｉ ＳＡ法ζこ
より、ヒトＩｇＭとは反応するが。
ｇｓｓｇ＋ａ’ｓｓｇ＋ｓａｓｉｇｓｇｇｓ＊ａｗｓａ
ｍ■１１１１ＷＩＷＩＩＩＩＩＷＩＩ５ｏμｌずっをそ
れぞれ予めヒト夏ｇＭでコートした・９６穴ソフトブレ
ーゝトに添加した。アビジンＤ〜酵素結合体としてアビ
ンンＤ−ペルオキシダーゼ（バクターン１製）、基質お
よび発色剤として過酸化水素、４−アミノアンチピリン
、フエノー−レを用いて前記したＥＬ Ｉ ＳＡ法ζこ
より、ヒトＩｇＭとは反応するが。
ヒトＩｇＧとは反応しないものを選び、限界希釈法によ
りクローニングを行った。
りクローニングを行った。
その結果、ヒ）ＩｇＭに特異性を有する抗体を産生ずる
ハイブリドーマ２ Ｃ１ｌｉｄ、８ Ｆ ｌａ。
ハイブリドーマ２ Ｃ１ｌｉｄ、８ Ｆ ｌａ。
４Ｈ７株を取得した。
■、 単一クローン抗体の生産
バイブリド−゛７２０１２株、８Ｆ１株、４Ｈ７株をそ
れぞれ１５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭ１１６４０培地て
９６ウエルプレート、２５ｃｍフラスコ、７５ｃ４フラ
スコとスケールアップしなから゛培養し、培養上清を集
めて単一クローン抗体を調製した。
れぞれ１５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭ１１６４０培地て
９６ウエルプレート、２５ｃｍフラスコ、７５ｃ４フラ
スコとスケールアップしなから゛培養し、培養上清を集
めて単一クローン抗体を調製した。
ｍ 抗体のサブクラスの決定
９６穴ソフトマイクロプレートに各単一クローン抗体を
コードン、１％ＢＳ、Ａ含有ＰＢＳでブロッキングした
後、ＭＯＮＯＡＢ Ｉ Ｄ ＥＩＡＫＩＴ（ＺＹＭＥＤ
社製）により抗１ｇＡ抗体、抗１ｇＧ１抗体、抗１ｇＧ
２ａ抗体、抗ＩｇＧ２ｂ抗体、抗ＩｇＧ３抗体、抗Ｉｇ
Ｍ抗体との反応をみて、各単一クローン抗体のサブクラ
スを決定した。
コードン、１％ＢＳ、Ａ含有ＰＢＳでブロッキングした
後、ＭＯＮＯＡＢ Ｉ Ｄ ＥＩＡＫＩＴ（ＺＹＭＥＤ
社製）により抗１ｇＡ抗体、抗１ｇＧ１抗体、抗１ｇＧ
２ａ抗体、抗ＩｇＧ２ｂ抗体、抗ＩｇＧ３抗体、抗Ｉｇ
Ｍ抗体との反応をみて、各単一クローン抗体のサブクラ
スを決定した。
またし鎖の抗帆抗体、抗λ抗体との反応性を調へてタイ
プを決定した。
プを決定した。
この結果、２Ｃ１２株の産生ずる抗体はＧ２１）′／′
代、３Ｆ１株および４ Ｈ７株の産生ずる抗体はＩｇＧ
１／にであることが判明した。
代、３Ｆ１株および４ Ｈ７株の産生ずる抗体はＩｇＧ
１／にであることが判明した。
１■、抗体の特異性
ヒト゛ｊ１髄腫蛋白質を精製し、それぞれ１００メ
ｌｌり／ｗｅにして５０１１１ずつマイクロタイターブ
ーレートにコ〜 トシた。次に本発明抗体（１／１ｇ／
Ｉｔ） ５０１ｔ（ｌを加え、洗浄後、それぞれの抗原
への結合性をＥＬ Ｉ ＳＡ法により検討した。
ーレートにコ〜 トシた。次に本発明抗体（１／１ｇ／
Ｉｔ） ５０１ｔ（ｌを加え、洗浄後、それぞれの抗原
への結合性をＥＬ Ｉ ＳＡ法により検討した。
その結果、第１表に示したように、本発明抗体は、Ｉｇ
Ｍとのみ結合し、他のクラスの免疫クロプリンおよび免
疫グロブリント−鎖とは全く反応しないことか確かめら
れた。
Ｍとのみ結合し、他のクラスの免疫クロプリンおよび免
疫グロブリント−鎖とは全く反応しないことか確かめら
れた。
第１表
Ｖ 抗体の力価
２０１２株の培養土清中の抗体の力価をＥＬＩＳＡ法に
より測定した結果、８０００てあった。
より測定した結果、８０００てあった。
なお、力価は、固定化された抗原に対して十分蹴の抗体
が存在する試料についてＥＬ Ｉ ＳＡ法により得られ
た吸光度を１００％とし、その値の５０％をりえる抗体
試料の原液からの希釈倍率で表わした。
が存在する試料についてＥＬ Ｉ ＳＡ法により得られ
た吸光度を１００％とし、その値の５０％をりえる抗体
試料の原液からの希釈倍率で表わした。
この際のノジ価測定曲線は第１図のとおりてあった。対
照として市販のヒトＩｇＭに対する単一クローン抗体と
比較した。第１図から明らかなように本発明抗体は、市
販品に比べ抗体過剰領域での吸光度の値が高かったー。
照として市販のヒトＩｇＭに対する単一クローン抗体と
比較した。第１図から明らかなように本発明抗体は、市
販品に比べ抗体過剰領域での吸光度の値が高かったー。
このことは１ｇＭ１分子あたりに結合する単一クローン
抗体の量が多いことを示している。
抗体の量が多いことを示している。
■０本発明抗体による組゛織染色
ヒト肺臓をＴｉ５ｓｕｅ−Ｔ Ｅ Ｋ Ｉ ｌこより固
定した後、クリオスタットにより切片標本を作製した。
定した後、クリオスタットにより切片標本を作製した。
これらの切片標本を本発明抗体を用いてビオチン−アビ
ジノ系により染色した。
ジノ系により染色した。
すなわち、切片標本をＰＢＳ （０，ＯＩＭ、ｐＨ７，
２ｙにて、−次抗体として本発明抗体（２Ｃ１２株由来
）と４０分間、８７°Ｃでインキュベーションした。そ
の後、再度洗浄した後、二次抗体として抗マウスＩｇＧ
ビオチン標識抗体（ＴＡＧＯ社）を同様に反応させた。
２ｙにて、−次抗体として本発明抗体（２Ｃ１２株由来
）と４０分間、８７°Ｃでインキュベーションした。そ
の後、再度洗浄した後、二次抗体として抗マウスＩｇＧ
ビオチン標識抗体（ＴＡＧＯ社）を同様に反応させた。
さらに再度、洗浄後、−一５ｉｉａｉｉ−フルオレイセ
イン標識アビジン（Ｅ、Ｙラボラトリーズ社、以下１−
Ｆ、 Ｉ ’Ｉ’ ＣＪという）と゛同様に反応させ、
これを洗浄したものをグリセリンにて封入し、染色標本
を作製した。
イン標識アビジン（Ｅ、Ｙラボラトリーズ社、以下１−
Ｆ、 Ｉ ’Ｉ’ ＣＪという）と゛同様に反応させ、
これを洗浄したものをグリセリンにて封入し、染色標本
を作製した。
これらの標本を蛍光顕微鏡により検鏡した。
次に同様の方法により糸球体腎炎患者の腎臓の組織染色
を行った。結果は、写ＩＸ２に示したとおり、ＩｇＭ抗
体が沈着してい４部分が染色された。
を行った。結果は、写ＩＸ２に示したとおり、ＩｇＭ抗
体が沈着してい４部分が染色された。
さらに、蛍光標識したＢ細胞をサイトフローメトリーに
より、分別定■することも可能である。すなわち、ヒト
末梢血液よりフィコール法によりリンパ球画分を調製し
、本発明抗体（２Ｃ１２株Ｉこより産生されたもの）と
４５分インキュベーションした後、３同洗浄し、抗マウ
ス免疫グロブリンＦＩＴＣと４５分インキュヘンヨンＬ
、ＦＡＣ３ＩＶ （ベクｉ・ン・デッキンソン社製）で
解析した。
より、分別定■することも可能である。すなわち、ヒト
末梢血液よりフィコール法によりリンパ球画分を調製し
、本発明抗体（２Ｃ１２株Ｉこより産生されたもの）と
４５分インキュベーションした後、３同洗浄し、抗マウ
ス免疫グロブリンＦＩＴＣと４５分インキュヘンヨンＬ
、ＦＡＣ３ＩＶ （ベクｉ・ン・デッキンソン社製）で
解析した。
その結果、ｌｌ］−細胞は５〜２０％の値を小し、゛
２ １３細胞マーツノ−９ＬＥＵ ｌｌ１ｌ（ベクトン・デ
ツキンソンネｊ製）で測定したＢ細胞の、割合と良い相
関かみられた。
２ １３細胞マーツノ−９ＬＥＵ ｌｌ１ｌ（ベクトン・デ
ツキンソンネｊ製）で測定したＢ細胞の、割合と良い相
関かみられた。
゛第１図は、本発明抗体の力価測定曲線である。
写真ｌは、本発明抗体を用いて組織染色したヒｉ・肺臓
標本の顕微鏡写真図である。写真２は、同しく糸球体腎
炎患者の腎臓標本の顕微鏡写真図である。 特許出願人 （６７７）ヤマサ醤浦ｔ１、式会月￥Ｗｔ
図 徂優獣野牛家借午 手続補正書（方式） 昭和５９年 ８月２３日 １、 事件の表示 昭和５８年特許願第１５２１５６号 ２、 発明の名称 ヒｌ−１ｇＭ に対する単一クローン抗体８、 補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住所 千葉県銚子市新生町２丁目１０番地の１４、補正
命令の日イ＝１ 昭和５９年７月１１日 （昭和５９年７月８１日発送） ５、 補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄、および図面６、 補正
の内容 ｌ）明細書第１７頁第１６〜１９行目の図面の簡単な説
明の欄における「写真ｌは、・・・・（中略）・・・・
顕微鏡写真・図である。」の記載を削除する。 −２）図面から写真１および２を削除する。 ８）“別紙のとおり参考写真を提出する。
標本の顕微鏡写真図である。写真２は、同しく糸球体腎
炎患者の腎臓標本の顕微鏡写真図である。 特許出願人 （６７７）ヤマサ醤浦ｔ１、式会月￥Ｗｔ
図 徂優獣野牛家借午 手続補正書（方式） 昭和５９年 ８月２３日 １、 事件の表示 昭和５８年特許願第１５２１５６号 ２、 発明の名称 ヒｌ−１ｇＭ に対する単一クローン抗体８、 補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住所 千葉県銚子市新生町２丁目１０番地の１４、補正
命令の日イ＝１ 昭和５９年７月１１日 （昭和５９年７月８１日発送） ５、 補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄、および図面６、 補正
の内容 ｌ）明細書第１７頁第１６〜１９行目の図面の簡単な説
明の欄における「写真ｌは、・・・・（中略）・・・・
顕微鏡写真・図である。」の記載を削除する。 −２）図面から写真１および２を削除する。 ８）“別紙のとおり参考写真を提出する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ヒトＩｇＭに対して特異性を有し、Ｂ細胞表面上におい
てμ鎖に特異的な結合能を有する単一クロー ン抗体。 。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15215683A JPS6042400A (ja) | 1983-08-19 | 1983-08-19 | ヒトＩｇＭに対する単一クロ−ン抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15215683A JPS6042400A (ja) | 1983-08-19 | 1983-08-19 | ヒトＩｇＭに対する単一クロ−ン抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6042400A true JPS6042400A (ja) | 1985-03-06 |
Family
ID=15534243
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15215683A Pending JPS6042400A (ja) | 1983-08-19 | 1983-08-19 | ヒトＩｇＭに対する単一クロ−ン抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6042400A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0161596U (ja) * | 1987-10-09 | 1989-04-19 | ||
| US6335175B1 (en) | 1997-07-29 | 2002-01-01 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | Anti-human pre-B cell receptor antibody |
| WO2010026758A1 (ja) | 2008-09-05 | 2010-03-11 | 積水メディカル株式会社 | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 |
-
1983
- 1983-08-19 JP JP15215683A patent/JPS6042400A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS=1982 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0161596U (ja) * | 1987-10-09 | 1989-04-19 | ||
| US6335175B1 (en) | 1997-07-29 | 2002-01-01 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | Anti-human pre-B cell receptor antibody |
| WO2010026758A1 (ja) | 2008-09-05 | 2010-03-11 | 積水メディカル株式会社 | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 |
| EP3056517A1 (en) | 2008-09-05 | 2016-08-17 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Monoclonal antibody and immunoassay using the same |
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