PT93941A - Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais especificos de um isotipo de imunoglobulina - Google Patents

Description

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O invento diz respeito a anticorpos monoclonais dirigidos contra determinantes isotipi-cos de imunoglobulina E (IgE), especialmente de IgE murina ou humana, e seus derivados. Os anticorpos monoclonais .podem ser quiméricos ou bispecificos. Eles reconhecem IgE livre e IgE expressa na superfície de células B positivas para IgE, mas não receonhecem IgE ligada a células portadoras de receptores Fc^> I ou II e não desencadeiam a libertação de mediadores. São também temas do invento processos para a preparação destes anticorpos e seus derivados, linhas celulares contínuas secretando os anticorpos e processos para a preparação das linhas celulares. Os anticorpos mono-donais e/ou seus derivados são úteis na determinação de IgE e de células produtoras de IgE e no tratamento e profilaxia de alergia. 0 invento também diz respeito a "kits" de testes e composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos e/ou seús derivados.

Fundamento do Invento A alergia é um estado de hiper-sensibilidade induzido por uma resposta imune exagerada a um agente estranho (o alergénio). Ã hipersensibilidade imediata (tipo I), caracterizada por· reacções alérgicas imediatamente após o contacto com o alergénio, é mediada por células B e é baseada em reacções de antigénio-anticorpo, enquanto a hipersensibilidade retardada é mediada via células T e baseada em mecanismos de imunidade celular.Nos últimos anos, o termo "alergia" tornou-se cada vez mais sinónimo de hipersensibilidade tipo I. -4-

A hipersensibilidade imediata baseia-se na produção de anticorpos de classe E de imuno-globulinas (anticorpos IgE) pelas células B as quais quando confrontadas com o alergénio diferenciam-se em células do plasma secretoras de anticorpos. A reacção induzida por IgE é um acontecimento localizado ocorrendo no sitio da entrada do alergénio no corpo, i..e nas superfícies das mucosas e/ou nos nódulos linfáticos locais. A IgE localmente produzida sensibilizará primeiro os mastócitos locais i..e, anticorpos IgE ligam-se com as suas regiões constantes aos receptores Fc na superfície dos mastócitos e depois as IgE em excesso entram na circulação e ligam-se a receptores nos basófilos circulantes e mastócitos fixados nos tecidos por todo o corpo. Quando a IgE ligada é subsequentemente posta em contacto como alergénio, os receptores Fcg, são ligados uns aos outros através do alergénio e observa--se desgranulação das células e libertação de uma série de mediadores anafiláticos tais como histamina, prostaglandi-nas, leucotrineos, etc. È a libertação destas substâncias que é responsável pelos sintomas clinicos tipicos da hipersensibilidade imediata, nomeadamente a contracção do músculo liso no trato respiratório ou no intestino, a dilatação dos vasos sanguíneos pequenos e o aumento da sua permeabilidade à água e proteínas do plasma, a secreção do muco resultando e.g. em rinite, exantema atópico e asma e na estimulação das terminações nervosas na pele resultando em ardor e dor.

Em adição, a reacção quando de um segundo contacto com o alergénio é intensificada devido a algumas células B formarem um "reservatório de memória" de células B positivas para IgE de superfície (células BsIgE+) após o primeiro contacto com o alergénio ao expressarem IgE na superfície celular. * #:

0 tratamento corrente da alergia baseia-se em duas abordagens. Uma trata apenas os sintomas de alergia, por exemplo através da utilização de drogas que inibem os mediadores tais como anti-histaminas ou que são imuno-supressores tais como citostáticos ou corti-costeróides. Esta abordagem implica doses reptidas e pode envolver efeitos secundários indesejáveis. Uma outra abordagem terapêutica designada des-sensibilização destina-se a tratar as condições subjacentes à alergia. A finalidade da des-sensibilização é conseguir aumentar a tolerância do paciente contra um alergénio especifico através de administração de doses inicialmente pequenas e crescendo subsequentemente do alergénio durante um certo período de tempo. Esta abordagem pode envolver um desconforto considerável, pressupõe a identificação e disponibilidade do(s) alergénio (s) e necessita de um grande número de visitas ao médico . Ainda, o alergénio a que o paciente é hipersensivel nem sempre pode ser identificado tornando impossível o tratamento por dessensibilização. Ainda, o tratamento não é desprovido de risco. Nenhuma das abordagens referidas pode proteger contra o desenvolvimento de um estado de hipersensibilidade.

Uma alternativa promissora seria um tratamento terapêutico que inibisse as reacções alérgicas por regulação da resposta imune de IgE, a qual é o acontecimento mais precoce na indução de alergia e proporciona manutenção do estado alérgico, sem afectar a resposta de outras classes de anticorpos, conduzindo assim a um efeito imediato e durador sobre os sintomas alérgicos. Tal tratamento pode ser baseado na aplicação de anticorpos, e.g. anticorpos monoclonais, os quais são específicos de isoti-pos IgE e são portanto capazes de ligação a IgE. Em adição, tais anticorpos deverão reagir com células B positivas para IgE de superfície os quais levam a células do plasma pro- -6- dutoras de IgE, de tal forma que podem ser usados para eliminar funcionalmente aquelas células 3. No entanto, os anticorpos contra IgE em principio podem também induzir a liteertação de mediadores por mastócitos sensibilizados com IgE através de ligação dos receptores Fc £,, antagonizando assim o efeito benéfico exercido no nível de IgE do soro e de células fí s IgE+. Em consequência, os anticorpos aplicáveis na terapia de alergia não deverão ser capazes de reagir com IgE ligada em mastócitos sensibilizados e basó-filos, mas deverão reter a capacidade de reconhecer as células B s IgE+.

Os anticorpos específicos do isotipo de IgE foram descritos por vários grupos de investigação. Conrad et al^ (Int. Archs. Allergy, Appl. Immun. 70^ 352, 1983) por exemplo descreve anticorpos monoclonais murinos anti-IgE de rato os quais, no entanto, não interferem com a ligação de IgE aos mastócitos. Chrétien et_ al (J. Immunol 141, 3128, 1988) descrevem anticorpos monoclonais murinos anti-IgE humana, dois dos quais são capazes de inibir a ligação de IgE às células portadoras de receptores Fc^ . No entanto, todos os a±icorpos descritos induzem libertação de mediadores.

Objectivo do Invento

Constitui um objectivo deste invento proporcionar anticorpos monoclonais dirigidos contra determinantes isotópicos de IgE os quais: -7-

. inibem a ligação de IgE a células portadoras de recepto-res Fc I ou II, . reconhecem e ligam-se a IgE expressa na superfície de células B positivas para IgE de superfície (células B s IgE+), . não reconhecem e não se ligam a IgE ligada na superfície de células portadoras de receptores Fc I ou II, por exemplo mastócitos e basófilos sensibilizados e portanto . não induzem a libertação de mediadores a partir de células sensibilizadas.

Os anticorpos monoclonais do invento têm estas caracteristicas e portanto ultrapassam as desvantagens de anticorpos específicos do isotipo IgE conhecidas no campo. Eles são capazes de neutralizar os anticorpos IgE formados e reduzir a população de células Bs IgE sem induzirem a libertação de mediadores a partir das células já sensibilizadas. Eles são portanto extremamente úteis no tratamento assim como na profilaxia de alergia.

Surpreendenfeemente, encontrou--se que os anticorpos monoclonais do invento possuem um efeito inibidor sobre a formação de IgE na resposta imune ao mesmo tempo não afectando a resposta imune de outras classes de anticorpos. Em consequência, eles são especialmente bons agentes terapêuticos e profiláticos uma vez que suprimem a resposta de IgE directamente desde o começo através da inibição da formação de IgE. -8-

Assim é uai objectivo do invento proporcionar um método de tratamento e prevenção de alergia que: .trate as causas subjacentes à alergia em vez dos sintomas, .não necessite da identificação de alergénio(s) especifico(s) .não esteja limitado ao tratamento da resposta de hipersen-sibilidade a alergénio(s) particular(es), .não necessite de um grande número de doses repetidas e .induz um efeito durador. É também desejável produzir anticorpos monoclonais com a especificidade pretendida que são bispecificos, sendo portanto capazes de intensificar o efeito terapêutico ao escolher-se uma especificidade de segundo anticorpo adequada, ou os quais sejam quiméricos ie. possuidores de regiões constantes humans, e que sejam pois menos imunogénicos e que não induzam reacções anafilá-ticas quando da aplicação. As regiões constantes podem ser escolhidas para faculttaivamente mediar funções efecto-ras endógenas.

Descrição do Invento 0 invento diz respeito a anticorpos monoclonais dirigidos contra determinantes isotipi-cos de imunoglobulina E (IgE) que inibem a ligação de IgE livre a células portadoras de receptores Pc £ I ou II e reconhecem IgE expressa na superficie de células B positivas para IgE de superficie, mas não reconhecem IgE ligada à superficie de células portadores de receptores FCg, I ou II e portanto não induzem a libertação de mediadores a partir de tais células, e seus derivados retendo a especificidade do anticorpo a partir do qual derivam. São preferidos os anticorpos monoclonais do invento e seus derivados que não reconhecem IgE ligada à superficie de mastócitos e basóf ilos portadores de receptores Pc <é_.I e não induzem a libertação de mediadores anafiláticos a partir de tais células. São também preferidos os anticorpos monoclonais e seus derivados com a especificidade pretendida os quais em adição inibem especificamente a formação de IgE na resposta imune.

Os anticorpos monoclonais e seus derivados do invento reconhecem determinantes antigé-nicos na cadeia pesada e comum às imunoglobulinas da classe IgE, i..e. eles reagem com moléculas de IgE de diferentes especificidades mas não reagem com imunoglobulinas de outros isotipos ou com cadeias leves. Os anticorpos monoclonais e seus derivados de acordo com o invento neutralizam anticorpos IgE livres, i,.e eles ligam-se a anticorpos IgE livres de tal forma que a ligação de IgE a células portadoras de receptores FCf, I ou II é inibida. Os receptores Fc £ I são receptores de Fcg. de elevada afinidade (constante de dissociação Κβ de aproximadamente 1010 ) e encontram-se em mastócitos e basófilos. -10-

J

I

Os receptores Fc^ II são recep-torss Fcg, de baixa afinidade (Κβ de aproximadamente 10®) e são encontrados em monócitos, macrófagos alveolares, eosi-nófilos e certas células T e B (células B activadas μ^ + de superfície). Em adição, os anticorpos monoclonais e seus derivados do invento são capazes de eliminar funcionalmente células B positivas para IgE de superfície (s Ig E+) uma vez que reconhecem IgE expressa na superfície de tais células B, afectando assim a "memória alérgica". No entanto, eles não reconhecem IgE ligada à superfície de células portadoras de receptores Fc^, I ou II em particular mastó-citos e basófilos sensibilizados, i..e eles reagem com epi-topos de IgE que estão escondidos quando IgE se liga à superfície de tais células. Como resultado desta especificidade, os anticorpos monoclonais e seus derivados do invento não efectuam a inter-ligação de receptores Fc e portanto não induzem a libertação de mediadores a partir de células portadoras de receptores Fc<^ e.g. não provocam desgranulação dos mastócitos e basófilos e portanto libertação de mediadores anafiláticos. São preferidos os anticorpos monoclonais e seus derivados com a especificidade atrás descrita os quais inibem especificamente a formação de IgE na resposta imune, i.e. que evitam a diferenciação de células B para células produtoras de IgE. Ã capacidade dos anticorpos monoclonais do invento para inibirem a ligação de IgE a células portadoras de receptores Fc^ pode ser determinada por exemplo num radioimunoensaio competitivo, em gue eg., mastócitos, por exemplo em suspensão ou ligados a um veiculo adequado, são incitados com igE marcada radioactivamente 125 e.g. Ι-IgE, e o anticorpo monoclonal do invento a ser testado, e a quantidade de igE ligada às células é determinada por medição da radioactividade. A capacidade dos anticorpos monoclonais do invento para inibirem a ligação -li

de IgE a células portadoras do receptor Pc £, II pods ser detectada por exemplo através de determinação da inibição de aglutinação de esferas de borracha revestidas com iGE com e.g. células RPMI 8866 portadoras de receptores Fc£ll.

Experiências de coloração demonstram que os anticorpos monoclonais do invento reconhecem células sIgE+ mas não reconhecem IgE ligada à superfi-cie de e.g. mastócitos e basófilos. A libertação de mediadores induzida pelos anticorpos monoclonais do invento pode ser determinada por exemplo através da incubação de e.g. mastócitos com IgE, adicionando o anticorpo monoclonal do invento e medindo a quantidade de histamina libertada pelas células, por exemplo num radioimunoensaio. O efeito inibidor dos anticorpos monoclonais do invento na formação de IgE na resposta imune pode por exemplo ser determinado num ensaio de resposta imune in vitro ou in vivo em que células B em cultura ou animais são expostos a um alergénio e os anticorpos IgE formados são medidos, eg. por um imunoensaio enzimático ou por um radioimunoensaio ou são determinadas as células produtoras de IgE, por exemplo pelo ensaio de formação de placas celulares descrito abaixo.

Os anticorpos monoclonais do invento podem ser de classe de imunoglobulinas IgG, IgM,

IgA ou IgD, de preferência da classe IgG, ainda mais preferencialmente da classe IgGl. As diferentes classes e subclasses de imunoglobulinas que são essencialmente determinadas pelos segmentos da região constante carboxi-terminal das cadeias H, estão envolvidas em diferentes funções efectoras (ligação do complemento, estimulação da fagocito- se, activação de neutrófilos, etc.) Em consequência, através da utilização de um anticorpo monoclonal do invento de uma classe de Ig especifica, o papel de anticorpo na resposta imune pode ser escolhido dependendo do efeito pretendido. Por exemplo, os antiarpos IgGl desempenham um papel importante na citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células (ADCC), uma reacção em que células efectoras especiais com potencial citotóxico se ligam aos receptores Fcy de anticorpos e lisam as células alvo contra as quais são dirigidos os anticorpos. Assim, os anticorpos monoclonais do invento que são da subclasse de Ig IgGl devem ser usados para eliminar especificamente a população de células B sIgE+ através da ligação de células B IgE+ e atraindo as células citotóxicas que matam as células B sIgE+. São preferidos os anticorpos monoclonais, de preferência anticorpos monõclonais de rato e seus derivados do invento dirigidos contra determinantes isotipicos de IgE murina. 0 mais preferido é o anticorpo monoclonal de rato com a designação MAb 1-5 que é especifico para IgE murina, e seus derivados. São ainda preferidos os anticorpos monoclonais, de preferência os anticorpos monoclonais de ratinho ou de rato e seus derivados do invento dirigidos contra determinantes isotipicos de IgE humana. 0 mais preferido é o anticorpo monoclonal de ratinho com a designação MAb Fl-43-17 que é especifico contra IgE humana e seus derivados. São também preferidos os anticorpos monoclonais quiméricos animais/humanos e seus derivados de acordo com o invento dirigidos contra determinantes isotipicos de IgE humana. Os anticorpos monoclonais -13-

quiméricos deste invento consistem em cadeias de imunoglo-bulinas pesadas e leves quiméricas. Cada cadeia quimérica é um polipeptideo contíguo que tem uma região variável não humana com a especificidade pretendida e uma região constante humana. As cadeias pesada e leve quiméricas são associadas para formar uma molécula com uma região de ligação ao antigénio funcional. Os mais preferidos são os anticorpos monocloaais quiméricos de acorâ© com o invento dirigidos contra determinantes isotipicos de IgE humana que consistem em regiões variáveis murinas e em regiões constantes humanas e seus derivados. A região constante da cadeia pesada para as imunoglobulinas quiméricas pode ser selec-cionada de entre qualquer um dos isotipos alfa, delta, gama ou mu. Podem ser usadas cadeias pesadas de várias subclasses tais como subclasses 1-4 de IgG. As diferentes classes e subclasses de cadeias pesadas estão envolvidas em diferentes funções efectoras e portanto ao escolher-se o tipo de região constante da cadeia pesada, podem ser produzidos anticorpos quiméricos com a função efectora pBstendida. As cadeias leves podem ter uma cadeia constante kapa ou lambda. São também prferidos os anticorpos monoclonais bispecificos compreendendo duas frac-ções diferentes de ligação ao antigénio, uma derivada de um anticorpo monoclonal de acordo com o invento dirigida contra determinantes isotipicos de IgE humana e a segunda derisada de um anticorpo com uma especificidade diferente. Por exemplo, a segunda especificidade pode ser para um agente tal com uma droga citostática ou citotóxica para conseguir libertação de drogas para células B expressando IgE de superfície (Células B slg E+), São substâncias eitos táticas ou citotóxicas adequadas as descritas para os derivados de anticorpos monoclonais abaixo. -14-

χ A segunda especificidade pode também ser derivada de um outro anticorpo monoclonal do invento que reconheça um epítopo de IgE humana diferente do reconhecido pelo primeiro anticorpo, facilitando assim a formação de complexos imunes e fixação do complemento.

Os derivados de um anticorpo monoclonal do invento retêm a especificidade do anticorpo de onde derivam, i.e. eles retêm o padrão de ligação carac-teristico do anticorpo parental contra IgE. São exemplos de tais derivados fragmentos de anticorpos monoclonais, conjugados dos anticorpos monoclonais com uma enzima, uma marca fluorescente, uma marca quimioluminescente, um quela-to de metais, uma substância cistostática ou citotóxica avidina, biotina ou similares, ou anticorpos monoclonais marcados radioactivamente.

Os fragmentos de anticorpo do invento são por exemplo os fragmentos univalentes Pab ou Fab* (Fab: fragmento de ligação ao antigénio) ou o fragmento divalente F (ab')2»

As enzimas usadas para os conjugados de anticorpos do invento são, por exemplo peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, p-D-galactosidase, glucose-oxidase, glucoâmilase, anidrase carbónica, acetil-colinesterase, lisozima, malato-desidrogenase ou glucose--6-fosfato-desidrogenase.

As marcas fluorescentes conjugadas com os anticorpos monoclonais do invento podem ser fluorescexna, fluorocrómio, rodamina ou similares. -15-

As marcas quimioluminescentes são eg., ésteres de acridinio de luminol.

Em tais conjugados o anticorpo é ligado ao parceiro de conjugação directamente ou através de um grupo espaçador ou de ligação. São exemplos de quelatores de metais os ácidos etilenodiaminatetracético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentacético (DPTA), 1,4,8,11,-tetra--azatetradecano, ácido 1,4,8,11-tetra-aza-tetradecano-1,4, 8,11-tetracético, ácido l-oxa-4,7,12,15-tetra-aza-heptade-cano-4,7,12,15-tetracético, ou similares.

Citostáticos, aplicáveis em ligação com os anticorpos monoclonais do invento, são, entre outros, substâncias de alquilação, tais como mecloretamina, trietilenofosforamida, ciclofosfamida, ifosfamida, cloram-bucil, busulfan, meffalan ou triaziquona, igualmente compostos de nitrosureia, tais como carmustina, lomustina ou semustina. Também são usados anti-metabolitos, tais como metotrexato, mercaptopurina, citarabina, fluoro-uracilo, floxuridina ou ftorafur. Um outro grupo de citostáticos inclui vimblastina e vincristina, assim como certos antibióticos, tais como actinomicina D, daunorubicina (daunomi-cina), cloxorrubicina, mitramicina, estreptonigrina, mito-micina e bleomicina. Ainda outros cistostáticos adequados são, entre outros procarbacina, hidroxiureia, L-asparaginase dacarbazina, mitotano, estramustina ou podofilotoxina.

Outros agentes citostáticos podem ser hormonas e antagonistas de hormonas, tais como corticosteróides, e.g. prednisona progestinas, e.g. hidroxiprogesterona ou medroprosgesterona estrogénios, e.g. dietilestilbestrol, antiestrogénios, e.g. tamoxifeno, androgénios, e.g. testerona e inibidores da aromatase, e.g. aminoglutetiamida. -16-

Os conjugados de anticorpos monoclonais do invento com substâncias citotóxicas podem conter a toxina intacta ou a cadeia A derivada dela. Toxinas adequadas para o acoplamento de anticorpos são, entre outros, várias lectinas, tais como ricino ou abrina ou toxina A de difleria e similares.

Os anticorpos monoclonais marcados radioactivamente do invento contêm e.g. iodo radioac-tivo <123I, 125I, 131I), itrio (90Y), tecnécio (99mTc) ou similares.

Os anticorpos monoclonais e seus derivados de acordo com o invento são preparados por processos conhecidos per se em que células de uma linha celular contínua como definido abaixo secretando os anticorpos monoclonais pretendidos são multiplicados de acordo com métodos conhecidos in vitro ou in vivo e, quando necessário, os anticorpos monoclonais obtidos são isolados e/ou convertidos nos seus derivados. A mutliplicação in vitro é efectuada em meios de cultura adequado, os quais são os meios de cultura convencionais, por exemplo "Dulbbecco's Modified Eagle Médium", (DMEM) ou meio RPMI 1640, facultativamente suplementado com um soro de mamífero, e.g. soro fetal de vitela, ou microelementos e suplementos de suporte do crescimento, e.g. células de suporte tais como células normais do exudato peritoneal de ratinho, células do baço, macrófagos da medula óssea, 2-aminoetanol, insulina, transfer rina lipoproteina de baixa desnidade, ácido oleico ou similares. A produção in vitro proporciona preparações de'anticorpos relativamente puras e permite o -17-

aumento da escala de produção para se obter grandes quantidades dos anticorpos pretendidos. São conhecidas as técnicas para a cultura de células de mamífero em condições de cul tura de tecidos e incluem cultura com suspensão homogénea, e.g. num reactor com entrada de ar ou num reactor de agitação contínua ou cultura de células imobilizadas, e.g. em fibras cms, microcápsulas, em microsferas de agarose ou

N em cassetes de cerâmica.

Para o isolamento dos anticorpos monoclonais, as imunoglobulinas nos sobrenadantes de cultura são primeiro concentradas e.g. por precipitação com sulfato de amónio, diálise contra material higroscópico como seja polietilenoglicol (PEG), filtração,através de membranas selectivas, ou similares. Se necessário e/ou pretendido, os anticorpos concentrados são purificados pelos métodos de cromatografia habituais, por exemplo filtração em gel, cromatografia em DEAE-celulose ou proteína A ou cromatografia de imunoafinidade.

Grandes quantidades dos anticorpos monoclonais pretendido podem também ser obtidas através da multiplicação das células in vivo. Com esta finalidade, clones de células de uma linha celular produtora de Ig histocompativel e/ou tolerada são injectadas em mamíferos singeneicos para provocar o crescimento de tumores produto^ res de anticorpos. Facultativamente, os animais são injecta-dos primeiro com um hidrocarboneto, especialmente óleos minerais tais como pristano (tetrametilpentadecano), antes da injecção. Após 1-3 semanas, os anticorpos são isolados a partir dos fluidos do corpo daqueles animas. Por exemplo, células de hibridoma derivadas de ratinhos Balb/C que produzem os anticorpos monoclonais pretendidos são in-jectados íntraperitoneamente em ratinhos Balb/C facultativamente pré-tratados com pristano e após uma a duas semanas, -18- o fluido ascitico é retirado destes animais. Os anticorpos monoclonais pretendidos são isolados a partir do fluido ascitico por métodos convencionais como descrito abaixo.

Fragmentos de anticorpos monoclonais, por exemplo fragmentos Fab, Fab' ou Fíab'^ podem ser obtidos a partir dos anticorpos preparados como descrito atrás por métodos conhecidos per se, e.g. por digestão com enzimas tais como papaina ou pepsina e/ou clivagem de pontes dissulfureto por redução química.

Os conjugados de anticorpos monoclonais do invento são preparados por métodos conhecidos, e.g. através da reacção de um anticorpo monoclonal preparado como aqui descrito atrás com uma enzima na presença de um agente de acoplamento, e.g. glutaraldeido, periodato, N,N1-o-fenilenodimaleimida, N-(m-maleimidobenzoi-loxi)-succinimida, N-(3-/“2'-piridilditio7-propionoxi)-succi nimida, N-etil-N*-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida ou similares. Os conjugados com avidina são preparados de modo semelhante. Os conjugados com biotina são preparados e.g. através da reacção de anticprpos monoclonais com um éster activado de biotina como seja o éster N-hidroxi-su-ccinimida de biotina. Os conjugados com marcas fluorescentes ou quimioluminescentes são preparados na presença de um agente de acoplamento, e.g os referidos atrás ou por reacção com um isotiocianato, de preferência fluoresceina-iso-tiocianato. Os conjugados dos anticorpos monoclonais do invento com substâncias citostáticas/citotoxicas e quela-tos de metais são preparados de modo semelhante.

Os anticorpos monoclonais 123 125 131 marcados radioactivamente com iodo ( I, I, I) são obtidos a partir dos anticorpos monoclonais de acordo com o invento por iodinação conhecida per se, por exemplo com iodeto de sódio ou potássio radioactivo e um agente de -19-

oxidação quimica, como seja hipoclorito de .sódio, cloramina T ou similares, ou um agente decxidação enzimática, como seja lactoperoxidase, glucose oxidase e glucose. Os anticorpos monoclonais quiméricos de acordo com o invento são acoplados a itrio ( Y) por exemplo por quelaçao com, o ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA), Os anticorpos quiméricos marcados com tecnécio-99 m são preparados por processos de permuta de ligandos, por exemplo por redução de pertecuato (TcO“^) com solução do ião estanhoso, quela-ção do tecnécio reduzido numa coluna de Sephadex e aplicação dos anticorpos nesta coluna, ou por técnicas de marcação directa, e.g. por incubação de pertecnato, um agente redutor tal como SuCl2, uma solução tampão como seja solução de ftalato de sódio e potássio e os anticorpos. O invento diz ainda respeito a linhas celulares contínuas. Numa realização do invento tais linhas celulares são linhas celulares de hibridoma que secretam anticorpos monoclonais anti-IgE do invento com a especificidade pretendida.

Em particular, o invento diz ainda respeito a linhas celulares de hibridoma, as quais são hibridos de células de hibridoma e linfócitos B de um mamifero imunizado com IgE. De preferência estas linhas celulares são hibridos de células de mieloma de ratinho e linfócitos B de rato imunizados com IgE murina. É especialmente preferida a linha celular de hibridoma com a designação 654-1-5, a qual foi depositada na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology of Research, Porton Down, Salis-bury, Wilts. SP4 OJG, U.K. com o número ECACC 89041902 em 19 de Abril de 1989. São também preferidas as linhas celulares de hibridomas as quais são hibridos de células de mieloma de ratinho e de linfócitos B de um ratinho sin- 20-

geneico imunizado com IgE humana. A mais preferida é a linha celular de hibridoma com a designação Fl-43-17 a gual foi depositada na European Collection of Animal Cell Culture sob o numero ECACC 90032210 em 22 de Março de 1990 .

As linhas celulares de hibridoma do invento são geneticamente estáveis, secretam os anticorpos monoclonais do invento com especificidade constante e podem ser mantidas como culturas congeladas e reac-tivadas por descongelação e reclonagem facultativa. O invento também diz respeito a um processo para a preparação de linhas celulares de hibridoma secretando os anticorpos monoclonais do invento em que um mamifero adequado é imunizado com IgE, células produtoras de anticorpos deste mamifero são fundidas com células de uma linha celular contínua, as células hibridas obtidas na fusão serem clonadas e os clones celulares secretando os anticorpos pretendidos serem seleccionados. A imunoglobulina E usada como antigénio, para a imunização pode ser IgE murina ou humana respec^ivamente. É preferível usar uma mistura de diversos anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais, da classe IgE com diferentes especificidades para assegurar que os anticorpos especificos de isotipo de IgE são induzidos os quais são dirigidos contra a cadeia pesada £, . Tais anticorpos IgE podem ser adquiridos comercialmente ou podem ser obtidos a partir de colecções de culturas celulares ou instituições depositárias. IgE humana pode também ser obtida a partir de pacientes com mieloma de IgE. -21-

0 antigénio, i.e., IgE murina 011 humana, pode ser misturada com adjuvantes, i.e. agentes que aumentarão mais a resposta imune, para o processo de imunização. São adjuvantes possíveis o adjuvante com-pleto de Freund (emulsão de óleo mineral, água e extractos de micobactérias)", adjuvante incompleto de Freund (emulsão de água e óleo apenas), géis de hidróxido de alumínio ou similares. 0 antigénio é usado para imunizar mamíferos adequados que o reconhecem como molécula estranha, especialmente ratos quando o antigénio é IgE murina, ou ratinhos ou ratos, preferencialmente quando o antigénio á IgE 12 humana.

As vias de imunização incluem entre outras injecções intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravascular e intracranial. Uma vez que se pretende títulos elevados de anticorpos é normalmente administrada uma série de injecções. A imunização é por exemplo efectuada por injecção do antigénio facultativamente misturado com adjuvantes incompleto ou completo de Freund, três a oito vezes parenteralmente, e.g. intraperitonealmente e/ou subcutâneamente em quantidades de aproximadamente 10-150 ug em ratos RA 25, ratinhos Balfo/c ou ratinhos Biozzi em intervalos de 1-3 semanas, seguido de uma injecção de memória de aproximadamente 5-50 yg, 1-5 dias antes do sacrifício dos animais.

As células produtoras de anticorpos dos mamíferos imunizados, de preferência células linfóides tais como linfócitos do baço, retiradas por exemplo 1-5 dias antes da injecção final de memória, são fundidas com as células de uma linha celular contínua, i.e. um clone de células que se replicam continuamente -22

a qual confere esta capacidade de replicação às células híbridas resultantes da fusão. Um exemplo para uma destas linhas celulares é uma linha de células tumorais (mieloma) que não produz por si só imunoglobulinas ou seus fragmentos mas que tem o potencial de produzir e seeretar grandes quantidades de anticorpo e que é portadora de uma marca genética de tal modo que as células híbridas podem ser seleccionadas contra células parentais não fundidas. São conhecidas várias linhas celulares de mieloma adequadas. São preferidas as linhas celulares de meiloma sem a enzima hipoxantina-gunaina-fosforrilbosiltransferase (HGPRT) ou a enzima timidina-cinase (TR), as quais não sobrevivem portanto num meio de cultura selectivo contendo lipoxanti-na, aminopterina e timidina (meio HAT). São particularmente preferidas as células de mieloma e linhas celulares derivadas que não sobrevivem em meio HAT e que não secre-tam imunoglobulinas ou seus fragmentos, como sejam as linhas celulares PAI, X63- Ag 8 S53 ou Sp2/0~Ag 14. A fusão é efectuada na presença de um promotor de fusão, por exemplo virus Sendai ou outros virus paramixo, facultativamente na forma inac-tivada por UV ou fusogénios químicos tais como iões cálcio, lipidos tensioactivos, e.g. lisolecitina, ou poli-etilenoglicol (PEG). De preferência, as células de mieloma são fundidas com um excesso de três a vinte vezes de células do baço de mamíferos imunizados numa solução contendo cerca de 30% a cerca de 60% de polietilenoglicol de um peso molecular entre 1000 e 4000 .

Após a fusão as células são ressuspersaa e cultivadas num meio selectivo, por exemplo meio HAT. Neste meio, apenas sobreviverão as células de hibridoma, uma vez que elas combinam a capacidade de crescer e replicar in vitro tal como as células de mieloma -23-

parentais e os genes HGPRI ou TK, que faltavam e que são essenciais para a sobrevivência no meio HAT, herdados das células do baço produtoras de anticorpos dos mamiferos imunizados.

Meios de cultura adequados para a expansão de células de hibridoma são os meios de cultura convencionais, tais como meio de Eagle modificação de Dubbecco (DMEM) meio minimo essencial, meio RPMI 1640 e similares, facultativamente suplementado com um soro de mamifero, e.g. 10 a 15% de soro fetal de vitela. De preferência, células de suporte, e.g. células normais de exudato peritoneal de ratinho, células de baço, macrófagos da medula óssea, ou similares, são adicionados no começo do crescimento celular imediatamente após o passo de fusão para alimentar as células de hibridoma e suportar o seu crescimento, especialmente quando as densidades celulares são baixas, através do fornecimento de factores de crescimento e similares. Se forem usadas células fagocitárias tais como macrófagos ou monócitos, estas podem desempenhar um serviço útil que consiste na limpeza dos detritos de células de mie-loma mortas sempre encontrados após tratamento com amino-pterina. Os meios de cultura são suplementados com meio se-lectivo para evitar que o crescimento nas células de mielo-ma se sobreponha ao das células de hibridoma.

Os sobrenadantes das culturas celulares de hibridoma são despistados quanto aos anticorpos monoclonais pretendidos, de preferência com um imunoensaio enzimático ou com um radioimunoensaio. Tal imunoensaio é por exemplo um ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) em que um veiaio adequado, e.g. placas de microti-tulação em plástico, é reuestido com imunoglobulinas e/ou poteinas de mieloma de todas as classes e subclasses de imu-noglobulina e incubado com os sobrenadantes de culturas de -24-

células de hibridoma a serem testados. Os anticorpos mono** clonais ligados são detectados por incubação com um anticorpo marcado com enzima que reconhece os anticorpos anti--IgE no sobrenadante celular, e.g, um anticorpo marcado com fosfatase alcalina contra imunoglobulinas das a$>écies animais usadas para imunização e pela adição de uma solução adequada de substracto da enzima, e.g. £-nitrofe-nilfosfato. A reacção enzima-substrato resulta, por exemplo numa alteração de cor que pode ser observada a olho nu ou com sistema de medição óptica. Os hibridomas produzem titulos elevados de anticorpos que reagem com IgE mas não com imunoglobulinas de outras classes são seleccionados para outros estudos.

As células de hibridoma positivas são clonadas, e.g. por diluição limite ou em agar mole, de preferência duas ou mais vezes. Facultativamente, as células de hibridoma são passadas através de animais, e.g. ratinhos por injecção intraperitoneal, e colheita de ascites, o que estabiliza os hibridomas, e melhoras as carac teristicas de crescimento. As linhas celulares clonadas podem ser congeladas de modo convencional. 0 invento também diz respeito a linhas celulares contínuas que são linhas celulares de transfectona secretando anticorpos monoclonais quiméricos animal/humano, de preferência anticorpos monoclonais quiméricos consistindo em regiões variáveis murinas e regiões constantes humanas, de acordo com o invento. Por definição, as linhas celulares de transfectoma são linhas celulares contínuas tais como as linhas celulares de mamifero imortalizadas, e.g. linhas celulares de linfoma, meiloma, hibridoma, tripoma ou quadroma, transfectadas com construções de ácidos nucleicos codificadores das cadeias quiméricas leve e/ou pesada dos anticorpos monoclonais quiméricos animal/humano do invento.

Ainda, o invento diz respeito a um processo para a preparação de linhas celulares de transfectoma secretando anticorpos monoclonais quiméricos aninaL/humano do invento em que células de uma linha celular contínua são transfectadas com construções de ácido nucleico de preferência DNA, codificadoras de cadeias quiméricas animal/humano leve e/ou pesada dos anticorpos monoclonais quiméricos pretendidos, as células transfectadas obtidas são clonadas e seleccionadas os clones celulares secretando os anticorpos monoclonais quiméricos pretendidos, as células transfectadas obtidas são clonadas e seleccionados os clones celulares secretando os anticorpos monaionais quiméricos pretendidos. A construção quimérica de DNA para cada uma das cadeias leve e pesada dos anticorpos monoclonais quiméricos do invento compreende um primeiro segmento de DNA, e.g. um gene funcionalmente rearranjado, codificador de pelo menos uma fracção funcional das regiões variáveis de um anticorpo não humano, de preferência murino com a especificidade pretendida ligada a um segundo segmento de DNA codificador de pelo menos uma fracção das regiões constantes de um anticorpo humano. 0 segmento de DNA codificador das regiões variáveis não humanas pode ser obtido por exemplo a partir de uma linha celular de hibridoma produtora de anticorpos não humanos com a especificidade pretendida, quer por isolamento de DNA genómico quer por preparação de CDNA a partir de mRNA isolado. O despiste do DNA genómico ou de cDNA relativamente à região variável funcionalmente rearranjado pode ser conseguido com a utilização de sondas de DNA adequadas de sequência nucleotidica conhecida, por exemplo DNAs sintéticos, cDNAs derivados de mRNA codificador da imunoglobulina pretendida ou fragmentos de DNA genómico compreendendo e.g. regiões adjacentes variáveis ou constantes conservadas. A identificação e confirmação dos clones correctos pode ser conseguida por seguenciação de DNA dos genes clonados e comparação da sequência com a correspondente sequência do mRNA de tamanho completo correctamente cortado. 0 segmento de DNA codificador das regiões constantes humanas pode ser obtido a partir de uma biblioteca genómica derivada de tecido humano adequado. A biblioteca de DNAçpnómico é despistada com sondas de DNA e os clones pretendidos são identificados como descrito atrás. A ligação dos segmentos de DNA para produzir construções de genes quiméricos é efectuada de acordo com técnicas convencionais, por exemplo por ligação de extremos cerses ou coesivos, digestão com enzimas de restrição para proporcionar os extremos coesivos adequados preenchimento dos extremos coesivos conforme adequado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar ligações indesejáveis e ligação com ligases adequadas.

As construções de DNA quimérico são montadas ou inseridas em vectores híbridos replicáveis.

Os vectores tipicamente desempenham duas funções em colaboração com células hospedeiras compatíveis. Uma função é facilitar a clonagem do ácido nucleico que codifica as cadeias quiméricas de imunoglobulina, i.e. para produzir quantidades utilizáveis do ácido nucleico (vectores de clonagem). A outra função é proporcionar replicação e expressão das construções de genes quiméricos num hospedeiro adequado, quer por manutenção como um ele- -27

mento extracromossómico quer por integração no cromossoma do hospedeiro (vectores de expressão). Um vector de clonagem compreende as construções de genes quiméricos como descrito atrás, uma origem de replicação ou uma sequência de repli-cação autónoma, sequências de marcas dominantes, e, facultativamente, sequências sinal e sitios de restrição adicio-aais. Um vector de expressão compreende ainda sequências de oontrole da expressão essenciais à transcrição e tradução dos genes quiméricos.

Uma origem de replicação ou uma sequência de replicação autónoma é proporcionada pela construção do vector para incluir uma origem exógena como seja a derivada do virus simio 40 (SS7 40 ) ou de uma outra fonte virai, ou pelos mecanismos cromossómicos da célula hospedeira.

As marcas permitem a selecção de células hospedeiras que contenham o vector. As marcas de selecção incluem genes que conferem resistência a metais pesados tais como cobre ou a antibióticos tais como geneticina (G-418) ou higromicina ou genes que completam uma lesão genética da célula hospedeira como seja a ausência de timidina-cinase, hipoxantina-fosforil-transferase, di-hidrofolato-redutase ou similares.

As sequências sinal podem ser por exemplo uma pré-sequência ou uma sequência lider da secreção dirigindo a secreção do anticorpo, sinais de "splicing·' ou similares.

Como sequências de controle ia expressão, o DNA vector compreende um promotor, sequências necessárias à iniciação e terminação da transcrição, e à estabilização do mRNA e, facultativamente, potenciadoras 28-

e outras sequências reguladoras. Pode ser empregue uma grande variedade de sequências promotoras, dependendo da natureza da célula hospedeira. Promotores adequados para células hospedeiras de mamíferos são obtidos a partir de vi-? rus tais como virus Símio 40 (SV 40), virus do sarcoma de Rous (RSV), adenovirus 2, virus do papiloma bovino (BPV), mutante BK dos papovavirus ou citomegalovirus (CMV) de ratinho e humano. Como alternativa os vectores podem compreender promotores dos produtos de expressão em mamíferos, tais como actina, colagénio, miosina, etc., ou o promotor nativo e sequências de controle que estão normalmente associadas às sequências dos genes de imunoglobulina. As sequências necessárias para a iniciação e terminação da transcrição e para a estabilização do mRNA estão normalmente disponíveis a partir das regiões 5' e 3' não codificadoras, respec-tivamente, de cDNAs virais e eucarióticos, e.g. do vector de expressão. Os potenciadores são sequências de DNA estimuladoras da transcrição, de origem virai, e.g. derivadas do virus símio, voirus polioma, virus do papiloma bovino ou virus do sarcoma de Moloney ou de origem genómica, especialmente murina.

Os vários segmentos de DNA do DNA vector são operacionalmente ligados i.e. eles são contíguos e colocados numa relação funcional uns com os outros.

Podem ser construídos vectores separados compreendendo a construção do gene da cadeia L quimérica ou a construção do gene da cadeia H quimérica ou como alternativa, as construções do gene das cadeias L e H são clonados no mesmo vector. -29-

São exemplos de vectores preferidos os derivados do plasmideo pSV em que a trabscrição é controlada pelo promotor precoce do sy 40, especialmente pSV2gpt portador do gene da xantina-guanina-fosforriboâl--transferase ou pSV2 neo portador do gene da fosfotransferase. Células hospedeiras adequadas para a expressão dos vectores têm de poder cultivar-se in vitro e têm de ser derivadas de eucariotas superiores para proporcionarem um ambiente adequado à produção de anticorpos activos, uma vez que a biossintese de moléculas de anticorpos tetraméricas funcionais requere um enrolamento correcto da cadeia polipeptidica nascente, glicosilação e montagem. São exemplos de células hospedeiras adequadas as linhas celulares imortalizadas de mamíferos, tais como linhas celulares de linfoma, mieloma, hibridoma, trioma ou quadroma, e.g. as linhas celulares de meiloma PAI, Sp2/0-Ag 14 ou X63-Ag8.653.

Estas células hospedeiras são transfectadas com a construção do gene quimérico da cadeia L sozinha, com a construção do gene quimérico da cadeia H sozinha ou com ambas, sequenciadamente ou simultaneamente transferidas com a ajuda de dois vectores separados ou num processo de um único passo usando um vector de dupla construção (cadeia L/cadeia H) conforme aqui foi indicado. A transfecção é efectuada por técnicas convencionais, tais como precipitação com fosfato de cálcio, microinjecção, fusão de protoplastos, electro-poração, i.e. introdução de DNA através de um pulso eléctri-co curto que transitoriamente aumenta a permeabilidade da membrana celular ou similares.

Após o processo de transfecção -30-

as células transfectadas são identificadas e seleccionadas através de cultura num meio selectivo escolhido dependendo da natureza da marca selectiva, por exemplo o meio aqui descrito para a selecção de células de hibridoma, no qual apenas sobrevivem as células transfectadas. O invento também diz respeito a linhas celulares contínuas, e.g. linhas celulares imortalizadas de mamifero, tais como linhas celulares de hibridoma, trioma, ou quadroma, secretando anticorpos monoclonais bispecificos do invento.

Ainda, o invento diz respeito a um processo para a preparação de linhas celulares contínuas secretando anticorpos monoclonais bispecificos do invento em que as células produtoras de cadeias pesadas e/ou leves de um anticorpo monoclonal anti-IgE do invento com a especificidade pretendida e células produtoras das cadeias pesada e/ou leve de um anticorpo monoclonal com uma especificidade diferente são fundidas, as células híbridas obtidas na fusão são clonadas e seleccionados os clones celulares secretando os anticorpos monoclonais nbispecificos pretendidos . A fusão pode ser efectuada por exemplo através da fusão de um hibridoma produtor de anticor pos monoclonais do invento com células linfóides de um mamifero imunizado com um antigénio determinante da segunda especificidade do anticorpo monoclonal bispecifico, com um mieloma secretando proteínas de meiloma que possuem a segunda especificidade pretendida do anticorpo monoclonal bispecifico ou com um hibridoma produtor de um anticorpo monoclonal que proporciona a segunda especificidade pretendida. São conhecidas as técnicas gerais para a preparação de linhas celulares que secretam anticorpos monoclonais bispecificos as quais, por exemplo, estão descritas no pedido de patente -31-

europeia 68 763.

Depois da fusão, as células secretando os anticorpos bispecificos pretendidos são identificadas e seleccionadas por cultura num meio selectivo como descrito atrás e por despiste dos clones quanto à capacidade de um único clone em reagir com ambos os antigé-nios pretendidos.

Os anticorpos monoclonais e/ou seus derivados de acordo com o invento são úteis na determinação qualitativa e quantitativa de IgE, especialmente em fluidos do corpo, e.g. em soro.

Por exemplo, os anticorpos monoclonais ou seus derivados podem ser usados em qualquer um dos imunoensaios conhecidos que se baseiam na interacção da ligação entre os determinantes antigénicos de IgE e os paratopos dos anticorpos monoclonais. São exemplos de tais ensaios os radioimunoensaios RIA, e imunoensaios com enzimas imunofluorescência, quimioluminescência, imunoprecipi-tação, aglutinação de latex ou hemaglutinação.

Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser usados como tal ou na forma de derivados marcados radioactivamente num radioimu-noensaio (RIA). Pode ser usada qualquer uma das modificações conhecidas de RIA, por exemplo RIA em fase solúvel (homogénea), RIA em fase sólida (heterogénea), RIA simples ou RIA dupla (sanduíche) com determinação directa ou in-directa (competitiva) de IgE.

Um exemplo de um destes radioimunoensaios é uma RIA em sanduíche na qual um veiculo adequado, por exemplo a superfície de plástico de uma placa -32-

de microtitulação ou do um tubo de ensaio, e.g. de polistire no, polipropileno ou polivinilcloreto, esferas de vidro ou de plástico, papel de filtro, dextrano, etc. folhas de acetato de celulose ou de nitrocelulose, partículas magnéticas ou similares é revestida com um anticorpo monoclonal do invento por simples adsorção ou facultativamente após activação do veiculo. Depois são adicionados as soluções a testar contendo IgE e finalmente anticorpos policlonais que também reagem com o antigénio e que são marcados radio- 125 activamente, e.g. com I. A quantidade de IgE nas soluções a testar é directamente proporcional à quantidade de anticorpos policlonais ligados e é determinada medindo a radio-actividade ligada ao veiculo. Os anticorpos policlonais podem ser substituídos por um segundo anticorpo monoclonal marcado radioactivamente do invento o qual reconhece um epi-topo do antigénio diferente do reconhecido pelo anticorpo monoclonal ligado ao veiculo.

Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser usados como tal ou na forma de derivados conjugados com enzimas num imunoensaio com enzimas. Conforme descrito atrás para os radioimunoensaios pode ser usado qualquer uma das modificações conhecidas de um imunoensaio com enzimas.

Os testes são efectuados de modo análogo dos radioimunoensaios descritos atrás usando uma marca enzimática em vez de uma marca radioactiva. A quantidade de complexo imune formado a qual corresponde à quantidade de IgE presente nas soluções a testar é determinada pela adição de uma solução do substrato da enzima. A reacção enzima-substrato resulta, por exemplo, numa mudança de cor que pode ser observada a olho nu ou com um sistema de medição óptica. -33-

Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser usados como tal ou na forma de derivados conjugados com marcas quimioluminescentes num ensaio de quimioluminescência. Como foi descrito atrás para os radioimunoensaios, pode ser usada qualquer uma das modificações conhecidas de um ensaio de quimioluminescência.

Os testes sao efectuados de modo análogo aos radioimunoensaios descritos atrás usando uma marca quimioluminescente em vez de uma marca radio-activa. A quantidade de complexo imune formado que correspon de à quantidade de IgE presente nas soluções a testar é determinada pela adição de um composto que induza luminescência, e.g. e NaOH e medição da emissão de luz com sistemas de medição óptica. A utilização de acordo com o invento de anticorpos monoclonais e seus derivados como aqui foi descrito atrás para a determinação de IgE também inclui outros imunoensaios conhecidos per se, por exemplo ensaios de imunofluorescência, aglutinação com latex partículas de latex revestidas com anticorpos ou revestidas com antigénio, hemaglutinação com corpúsculos de eritrócitos revestidos com anticorpo ou revestidos com antigénio, ensaios de luz evamescente usando uma fibra óptica revestida com anticorpo e outros imuno-sensores de actuação directa que convertem o acontecimento de ligação num sinal eléctrico ou óptico ou similares.

Os anticorpos monoclonais e/ou seus derivados de acordo com o invento são também úteis na determinação de células produtoras de IgE, preferencialmente num ensaio de células formadoras de placas (PFC).

Um ensaio de células formado- ras de placas de acordo com o invento baseia-se nos princípios de um imunoensaio em fase sólida. Pode ser usado qualquer uma das modificações conhecidas de um imunoensaio em fase sólida, por exemplo um radioimunoensaio, um imunoensaio com enzimas, imunofluorescência a quimioluminescência similares.

Um exemplo deste ensaio de células formadoras de placas é um ensaio PPc baseado num ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA). Para determinação da quantidade total de células produtoras de IgE um veiculo adequado como descrito atrás para uma RIA de sanduíche é revestido com um anticorpo monoclonal do invento. Uma suspasão de células produtoras de IgE que são obtidas a partir de fluidos do corpo contendo tais células por centrifugação, filtração ou similares e adiciona-se um segundo anticorpo policlonal ou monoclonal especifico para IgE, e.g. um anticorpo monoclonal do invento reconhecendo um epitopo de IgE diferente do reconhecido pelo primeiro anticorpo, o qual é conjugado com uma enzima, e.g. fosfatase alcalina. A quantidade de células produtoras de IgE nas suspensões a testar é directamente proporcional à quantidade de segundo anticorpo ligado e é determinado pela adição de uma solução de substrato adequado, o que resulta por exemplo no aparecimento de um produto de reacção corado e contagem de pontos corados (placas). Para a determinação da fracção de células produtoras de IgE que produzem IgE dirigida contra um alergénio especifico, o veiculo é primeiro revestido com o alergénio ou um conjugado adsor-vivel do alergénio antes da adição de uma suspensão celular como descrito atrás. A fracção de IgE na suspensão a testar que é dirigida contra o alergénio, liga-se ao alergénio ligado à superficie e é determinada pela adição de um anticorpo monoclonal do invento conjugado com uma enzima e uma solução de substrato adequado resultando por exemplo no aparecimento de um produto de reacção corado e contagem dos pontos corados (placas).

Ainda, o invento diz respeito a "kits" de testes para a determinação qualitativa e quantitativa de IgE e/ou células produtoras de IgE compreendendo anticorpos monoclonais e/ou seus derivados do invento e, facultativamente outros anticorpos monoclonais ou policlo-nais e/ou aditivos.

Os “kits" de testes de acordo com o invento para um radioimunoensaio contêm, por exemplo um veiculo adequado, facultativamente liofilizado ou em soluções concentradas de um ou mais anticorpos monoclonais soluções de um anticorpo monoclonal marcado radioactivamen-te ou de IgE marcada radioactivamente, soluções padrão de IgE, soluções tampão e, facultativamente, detergentes para a prevenção de adsorção inespecifica e formação de agregados pipetas, recipientes para reacção, curvas de calibração e similares. Um ou nais dos anticorpos monoclonais do "kit" de testes são anticorpos monoclonais do invento. Os "kits" de testes para a determinação de células produtoras de IgE que produzem IgE dirigida contra um alergénio especifico contem ainda soluções do alergénio ou um conjugado adsorvi-vel do alergénio.

Os "kits" de testes de acordo com o invento para um imunoensaio com enzimas contem, por exemplo, um veiculo adequado, facultativamente liofilizado ou em soluções concentradas um ou mais anticoirpos monoclonais , facultativamente soluções liofilizadas ou concentradas de um anticorpo monoclonal marcado com enzima, de IgE marcada com enzima, de um soro policlonal anti-IgE e/ou de anticorpos monoclonais ou policlonais marcados com enzimas os quais reconhecem e se ligam ao anticorpo anti-IgE substratos de enzima na forma sólida ou dissolvida, solu- -36-

ções padrão de IgE, soluções tampão, detergentes, pipetas vasos de reacção, curvas de califoração, tabelas de escalas de cor e similares. Um ou mais dos anticorpos monoclonais do "kit" de testes são anticorpos monoclonais do invento.

Os "kits" de testes para a determinação de células produtoras de IgE que produzem IgE dirigida contra um alergénio especifico contem ainda soluções do alergáio ou um conjugado adsorvivel do alergénio.

Ainda, os anticorpos monoclonais de acordo com o invento e seus derivados podem ser usados para a determinação qualitativa e quantitativa de células B positivas para IgE de superficie (sIG E+) através de qualquer uma das técnicas de coloração convencionais conhecidas, e.g. por análise de citométrica de fluxo. Até aqui foi práticamente impossivel usar tais técnicas para a determinação selectiva de células B slg E+ uma vez que a reacção dos anticorpos monoclonais anti-IgE conhecida com IgE lxpda a mastócitos e basófilos sensibilizados interfere com a reacção de coloração. Os anticorpos monoclonais e seus derivados do invento ultrapassam este problema uma vez que eles não reconhecem IgE nos mastócitos e basófilos.

Em adição, os anticorpos monoclonais do invento e/ou seus derivados são úteis em terapia, em particular no tratamento e/ou profilaxia de alergia. O efeito terapêutico é conseguido por regulação negativa da resposta imune de IgE devido às caracteristicas especificas dos anticorpos monoclonais e seus derivados de acordo com o invento: -37-

Eles são capazes de neutralizar a IgE formada através da ligação de IgE livre e inibição da ligação de IgE às células portadoras de receptores Fc£l ou II, em parti cular mastócitos e foasófilos,

Eles reconhecem e ligam ^E expressa na superfície de células B positivas para IgE de superfície (células BsIgE+) e são portanto úteis na redução da população de tais células que formam um “grupo de memória" lesulfèando na produção de IgE após uma segunda exposição ao alergé-nio. A possibilidade de produzir anticorpos monoclonais especialmente anticorpos quiméricos, das (sub)classes de imunoglobulinas escolhidas permite a activação de mecanismos celulares do sistema imune do hospedeiro resultando na morte especifica de células sIgE+. Isto pode também ser conseguido com conjugados dos anticorpos monoclonais do invento com drogas citotóxicas ou por anticorpos bispecificos que libertarão tais drogas para as células alvo.

Uma vez que os anticorpos monoclonais do invento e seus derivados não reconhecem IgE citofilica nas células portadoras* receptores Fcg, I ou II, e.g. mastócitos e basófilos, eles não induzem a libertação de mediadores.

Os anticorpos monoclonais e seus derivados de acordo com o invento também têm um efeito terapêutico durador devido a terem um efeito inibidor significativo na formação de IgE na resposta imune. 38- 38-

Ξπι consequência, os anticorpos ínonoclonais do invento e seus derivados proporcionam um tratamento que, em vez de tratar sintomas, de facto afecta a causa subjacente da alergia, por exemplo através da remoção de anticorpos IgE e de células B positivas para IgE de superficie, eliminando assim o potencial para uma resposta alérgica e inibição da formação de IgS. É especialmente vantajoso que o tratamento não requeira a administração de doses repetidas e que os anticorpos monoclonais e seus derivados do invento podem ser usados no tratamento profilático por administração antes da detecção de quaisquer sintomas de alergia. Devido à sua reduzida imunogenicidade os anticorpos monoclonais quiméricos e seus derivados de acordo com o invento são sspecialmente úteis para aplicação terapêutica e profiláxia. A dose diária terapêutica para mamíferos está entre aproximadamente 0,1 mg e 10 mg por kg de peso do corpo dependendo do estado do paciente e do modo de aplicação. O invento também está relacionado com preparações farmacêuticas compreendeddo um anticorpo monoclonal e/ou seus derivados de acordo com o invento. As preparações farmacêuticas compreendem, por exemplo, os anticorpos monoclonais e/ou seus derivados numa quantidade terapêuticamente eficaz juntamente ou misturado com veículos farmacêuticos inorgânicos ou orgânicos, sólidos ou líquidos. São preferidas as preparações farmacêuticas para aplicação parenteral e inalação. As preparações para aplicação intramuscular, subcutânea ou intravenosa ou para inalação são e.g. soluções ou suspensões iso-tónicas aquosas, facultativamente preparadas imediatamente antes de usar a partir das preparações liofilizadas ou concentradas. As preparações farmacêuticas podem ser este- -39-

rilizadas e conterem adjuvantes e.g. para conservação, estabilização, humedecimento, emulsionação ou solubilização dos ingredientes, sais para a regulação da pressão osmóti-ca, tampão e/ou compostos que regulam a viscosidade, e.g. carboxicelulose de sódio, dextrano, polivinilpirrolidona ou gelatina. Eles são preparados por métodos conhecidos, e.g. por mistura, dissolução ou liofilizaçao convencionais e contêm entre aproximadamente 0,01% e aproximadamente 50% de ingrediente activos. As preparações para injecções são processadas, introduzidas em ampolas ou frascos e seladas em condições assépticas de acordo com métodos conhecidos.

Os exemplos que se seguem ilustram o invento mas não o limitam em qualquer grau.

Abreviaturas ΒΡΟ benzilpenicilina (benzilpeniciloil) BSA albumina do soro bovina BSS solução equilibrada de sais CFA adjuvante completo de Freund PCS soro fetal de vitela HAT hipoxantina/aminopterina/timidina HEPES acido N-/~*2-hidroxietil7piperazina--N'-/"ácido 21-etanossulfónico 7 Ig imunoglobulina i.p. intraperitonealmente i .V. intravenosamente MAb anticorpo monoclonal PBS tampão de fosfatos salino PC fos forilcolina rpm revoluções por minuto EXEMPLO 1: Preparação de linhas celulares de hibridoma se- cretando anticorpos monoclonais de rato anti--IgE murina 1.1 Imunização de ratos com IgE murina 25 ratos RA (anteriormente SItf 50 ) são imunizados com uma série de anticorpos monoclonais murinos purificados da classe de imunoglobulinas IgE (IgE MAbs) conforme apresentado na Tabela 1. Estes IgE MAbs têm diferentes especificidades para favorecer a indução de anticorpos anti-isotipos e não anti-idiotipicos i.e. anticorpos que selectivamente reconhecem os sitios antigénicos partilhados pelas imunoglobulinas da classe IgE não presentes em todas as outras classes de imunoglobulinas .

Tabela 1; IgE MAbs murinos usados na imunização designação da IgE murina fonte especificidade aPC4-33 Ciba-Geigy fosforilcolina (PC) grupo II a-PC7-l-30 (mutante da mudança Ciba-Geigy PC T15 + grupo I de grelha de lei-aPC12-3 tura) Blaser & Heusser, Int. Rev. Immunol. 2, 93, 1987 PC grupo II aDNP69-3 Prof. G. Kõhler, 2,4-dinitrofenol Freiburg, Germany (DNP)

Uma mistura de IgE MAbs da Tabela 1 (10 g de cada) em adjuvante completo de Preund foi injectado intraperitoSealmente (i.p.) nos ratos. No dia 14 a partir de então, deu-se uma outra injecção da mesma mistura na mesma concentração em adjuvante incompleto de Freund i.p. Os títulos dos soros foram determinados como descrito no Exemplo 1.3 e o rato com o titulo do soro mais alto contra IgE murina foi injectado intravenosamente com a mistura de IgE MAbs da Tabela 1 em PBS 4 dias antes da fusão. 1.2 Fusão celular A fusão celular foi conseguida o 7 usando 10 células de baço de ratos imunizados e 3 x 10 células da linha celular de mieloma murino Sp2/0-Ag 14 (Shulman et al., Nature 176. 269, 1978) na presença de 1 ml de polietilenoglicol a 50% (PEG 4000, Merck) de acordo com métodos convencionais anteriormente descritos (Kohler & Milstein, Nature 256, 495, 1975). Após lavagem, as células foram ressuspensas em 300 ml de Standard Dulbecco*s Minimum Essential Médium (Seroned). Adicionou-se 15% de g soro fetal de vitela e 3 x 10 células de exudato peritoneal de ratinhos normais como células de suporte. As células são distribuídas entre seis placas Costar 48 x 1 ml. As. ©alturas foram alimentadas duas vezes por semana com meio se-lectivo convencional HAT, mais tarde com meio HT, durante 3 a 6 semanas. Quando o crescimento das células de hibridoma se torna visivel, os sobrenadantes das culturas são despista dos quanto à ligação a IgE murina pelo teste de ELISA do Exemplo 1.3 e são depois testados quanto à libertação de histamina e ligação à IgE de superfície de ratinho (ver Exemplos 5 e 7).

As células de hibridoma selec-cionadas podem ser multiplicadas em cultura, congeladas a -802C ou em azoto liquido e depois reactivadas. As células são clonadas por diluição limite (Goding, J. Immunol. Methods 39, 1980) e expendidas por formação de ascites em ratinhos Balb/c pré-injectados com pristano (ver Exemplo 2.1). -44-

1.3 Selecção de hibridomas secretores de anticorpos de rato anti-IgE murina pelo ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) em sanduíche

Os hibridomas em crescimento são testados quanto à presença de anticorpos dirigidos contra o isotipo de IgE murina (anticorpos anti-IgE murina) pelo ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA).

As placas de microtitulação em plástico são revestidas com imunoglobulinas incubando 500 ug dos quatro IgEMAbs da Tabela 1 (ver Exemplo 1.1) ou, como testemunhas, dos MAbs murinos e proteínas de mielo-ma (Bionetics) das outras classes de imunoglobulinas (ver Tabela 2 abaixo) em 50 ui de tampão bicarbonato de sódio 0,05M pH 9,6 durante 2 horas a 37QC e 15 horas a 4õC.

Tabela 2

MAbs taurinos e proteínas de mieloma de diferentes isotipos empregues na ELISA cadeia H cadeia L K λ1 λ2 μ aPC35'-2-2 aPCll-1 MOPC104E Yl aPC59-D4 M0PC21 aPC56-l Y2a aPC55-l-8 UPC10 RPC5 Y2b aPC281-l-l MOPC195 M0PC141 Y3 aPC61-l J606 J5606 a T15 MOPC315 ε aPC12-3 aPC4-33 aDNP69-3 aTNPSPE7 -46- %

Após lavagem com PBS, os sítios reactivos das proteinas que ainda estão presentes na superfície de plástico são saturados por incubação durante 2 horas a 37QC com 150 yl de tampão PBS-Tween (0,05¾

Tween 20 em PBS contendo 0,2¾ NaN^ e 1% BSA, pH 7,4) e as placas foram lavadas com PBS 100 yl dos sobrenadantes das culturas celulares e correspondentes diluições são incubados durante 2 horas a 37QC e, após lavagem das placas, os anticorpos monoclonais de rato ligados são revelados por incubação com 100 yl de uma diluição correspondentemente predeterminada de uma preparação de IgG de cabra anti-imu-noglobulina de rato (Sigma). A quantidade de enzima retida é determinada por incubação (30 minutos, 37QC) com 100 yl de uma solução do substracto da enzima p-nitrofenilfosfato (1 mg/ml em tampão dietanolamina a 10¾ contendo 0,5 mmol de MgCl2, pH 9,8) e medição da densidade óptica do produto reagido a 405 nm (°D4q5) usando um Multiscan Photometer (Flow Irvine).

Com base nos resultados do processo ou despiste dados na Tabela 3, abaixo, 6 hibrido-mas designados 18-20, 46-48, 4A1-28, 4B3-39, 1-5 e 3-11 foram seleccionados para posteriores estados. Eles derivam de 4 fusões diferentes e secretam anticorpos monoclonais que apresentam elevada reactividade de ligação (100¾) a IgE murina enquanto apresentam apenas uma reactividade cruzada de fundo com MAbs e proteinas de mieloma de outros isotipos de Ig. A designação completa do hibridoma 1-5 é 654-1-5 mas os três primeiros dígitos estão omitidos por conveniência. Os MAbs são designados MAb 18-20, MAb 46-48, Mab-4Al-28, MAb 4B3-39, MAb 1-5 e MAb 3-11, referindo-se à linha celular de hibridoma que os secreta. -47-

Tabela 3

Selecção de hibridomas quanto à especificidade anti-isotipos de IgE murina hibridoma ligação Tabela 2 {%) aos MAbs murinos e proteínas de mieloma da μ Yi Y2a Y2b Y3 δ ε 18-20 0.05 <0.002 0.009 0.006 0.013 0.006 100 46-48 <0.3 <0.3 <0.3 <0.3 0.54 <0.3 100 4A1-28 0.005 <0.002 0.008 0.006 0.03 0.002 100 4B3-39 <0.002 <0.002 <0.002 <0.002 0.004 0.002 100 1-5 <0.002 <0.002 <0.002 <0.002 0.017 <0.002 100 3-11 <0.001 <0.001 <0.003 <0.001 0.015 <0.001 100 EXEMPLO 2; Produção, isolamento e purificação de anticorpos monoclonais de rato anti-IgE murina 2.1 Expansão de hibridomas in vivo e purificação de anticorpos monoclonais

Para a produção de ascites ratinhos fêmea Balb/c (20-25 g) (Tiefarm Sisseln, Switzer-land) são pré-tratados com 0,3 ml de éleo de pristano (Aldrich) intraperitonealmente 1 a 3 semanas mais tarde, os ratinhos receberam uma segunda injecção de pristano (0,2 ml i.p.) e foram simultaneamente inoculados i.p. com 2 x 10® células de hibridomas com 0,2 ml de PBS. Após 8--10 dias, o fluido de ascites resultante foi colhido, centri-fugado a 800 x g e guardado a -20SC ou a -80SC. O fluido de ascites descongelado foi clarificado por centrifugação a 30 000 xg durante 1 hora. Após remoção da camada de topo contendo lipidos, a concentração de proteína foi determinada e ajustada a 10-12 mg/ml com PBS. A fracção de imunoglobulina G (IgG) foi precipitada pela adição gota a gota de 0,9 volumes de sulfato de amónio saturado a OSC. Após 1 hora, a fracção de IgG foi sedimentada por centrifugação durante 1 hora a 22 000 xg. O sedimento foi dissolvido em tampão 20 mM Tris-HCl pH 7,9 contendo 50 mM NaCl e foi dialisado contra o mesmo tampão durante a noite a 4SC. A fracção de IgG foi ainda purificada por cromatografia de permuta aniónica numa coluna de DE 52 dietilaminoetilcelulose (Whatman). A amostra foi diluida 1:2 (v/v) em 20 mM Tris-HCl pH 7,9 para uma concentração final de 25 mM NaCl e 10 mg de proteina por ml de gel foram aplicados na coluna. A eluição foi obtida aumentando a concentração de cloreto de sódio de 25 mM para 200 mM (gradiente linear). Em geral, os MAbs são eluidos à volta de 80 mM naCl. As fracções são dialisa-das contra PBS durante a noite a 4SC e guardadas a -70 QC. A pureza é testada por SDS-PAGE e focagem isoeléctrica. A pureza é superior a 959». 2.2 Expansão dos hibridomas in vitro

Preculturas das linhas celulares de hibridoma foram obtidas por cultura das células de hibridoma à temperatura fisioloógica (cerca de 372C) em meio RPMI 1640 (Seroned) contendo 10% de soro fetal de vi- 5 tela (PCS) para uma densidade celular final de 5 x 10 a 10 células por ml. Toda a précultura foi introduzida em frascos de cultura Bellco e ajustada a um volume total de 1500 ml com meio fresco RPMI 1640 /10% PCS. A cultura foi agitada a cerca de 37sc em 5% de CC^ a 30 rpm durante dois a três dias, depois diluida para um volume total de 3000 ml com RPMI 1640/10% FCS e agitada durante mais sete a dez dias. Após este tempo 95% das células estavam mortas. O caldo de cultura foi centrifugado a 1000 xg durante 20 min a 42C. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro com um peso de 0,2 ym em condições de esterilidade. A imu-noglobulina bruta foi precipitada pela adição lenta gota a gota de 0,9 volumes de sulfato de amónio saturado a oôC.

Este precipitado foi purificado como descrito no Exemplo 2.1. -50-

EXEMPLO 3 Determinação do isotipo dos anticorpos monoclo-nais de rato anti-IgE murino A classe e subclasse dos MAbs de rato anti-IgE murina do Exemplo 1-3 foram determinadas como descrito por Ouchterlony. MAb 4B 3-39, MAb 1-5 e MAb 3-11 são da classe IgGl, MAb 46-48 é da classe IgG2a e MAb 18-20 e MAb 4A1-28 são da classe IgG2b. EXEMPLO 4: Análise dos epitopos de IgE reconhecidos pelos anticorpos monoclonais de rato anti-IgE murina

As placas de microtitulação são revestidas com os anticorpos monoclonais de rato anti--IgE murina do Exemplo 1.3 de tal modo que aproximadamente 150 ng dos anticorpos monoclonais são ligados por poço. 3 pg (excesso de 20 vezes) do mesmo anticorpo monoclonal ou de um anticorpo monoclonal diferente são pré-incubados com 5 ng do MAb a PC 12-2 anti-IgE de ratinho marcado com I em 10 pl de tampão RIA (PBS contendo 1¾ BSA e 0 ,256 NaN^) durante 4 horas a 37SC e depois incubados nos poços das placas de microtitulação revestidas durante 2 horas a 372C e durante 15 horas a 4QC. As placas são então lavadas e a IgE ligada é determinada por medição da radioactividade. Os resultados desta experiência de inibição cruzada estão apresentados na Tabela 4.

Tabela 4: Inibição cruzada dos anticorpos monoclonais de rato anti-IgE raurina | MAb ligado Inibição da ligação a IgE por monoclípnal MAb MAb MAb 4B3-39 46-48 3-11 excesso de anticorpo MAb MAb 18-20 4A1-28 MAb 1-5 MAb 4B3-39 +++ + + - - - - MAb 46-48 +++ + + + ++ - - - MAb 3-11 - + + +++ - - - MAb 18-20 - - - ++ + - - MAb 4A1-28 - - - - +++ ++ MAb 1-5 - - - - - +++ - 0-30% inibição + 31-60% inibição ++ 61-95% inibição +++ 96-100% inibição -52-

A ligação de IgE ao anticorpo monoclonal ligado à superfície é totalmente inibida (mais de 95%) por pré-incubação com o mesmo anticorpo monoclonal em solução (Tabela 4 diagonal). O anticorpo monoclonal MAb 46-48 que dá reacção cruzada com o MAb 4B3-39 é igualmente inibido de modo cruzado pelo anticorpo monoclonal MAb 3-11, mas os anticorpos MAb 4B3-39 e MAb 3-11 não têm qualquer efeito um sobre o outro. Estes três anticorpos monoclonais reconhecem portanto epítppos sucessivos parcialmente sobreponiveis Ba molécula de IgE. Apenas um outro par de anticorpos monoclonais apresenta qualquer reactividade cruzada, nomeadamente MAb 4A1-28 e MAb 1-5. A inibição é portanto apenas num sentido; o antivcorpo monoclonal MAb--1-5 inibe a ligação do MAb 4A1-28 à molécula de IgE, mas o MAb 4A1-28 é incapaz de inibir a ligação do MAb 1-5 a IgE. Estes dois anticorpos monoclonais reconhecem portanto epítopos vizinhos com o MAb 1-5 impedindo especialmente a ligação do MAb 4A1-28 à molécula de IgE. Todos os outros emparelhamentos de anticorpos monoclonais não apresentam efeito recíproco e portanto ligam-se a epítopos especialmente separados na molécula de IgE. EXEMPLO 5: Determinação da libertação especifica de hista-mina induzida pelos MAbs de rato anti-IgE murina 5.1 Preparação de células RBL-2H3 0 clone RBL-2H3 de leucemia basófila de rato (Europ num. Ll, 317, 1981) foi cultivado em meio mínimo essencial mais 15% PCS em frascos Palcon de 2 75 cm numa câmara húmida a 373C e com 7,5% de COg. Para o ensaio as células foram tripsinizadas, lavadas com solução equilibrada de sais e contadas. 1 yg do MAb a PC 12-3 contra IgE murina (especifica para fosforilcolina, ver Tabela 1, Exemplo 1-1) foi adicionado por 10 células RBL-2H3 e incubado a 372C durante 30 minutos com agitação simultânea. As células foram então lavadas uma vez em meio ajustadas a 10 células/50 Dl e incubadas durante 15 minutos num banho-maria com agitação a 37-2C com: (1) diluições dos vários MAbs anti-IgE (0,5 yg em 50 yl) (2) PC-BSA (1 yg em 50 yl) como testemunha positiva ou (3) 50 yl de BSS para determinação da libertação espontânea de Hstamina, ou durante 15 minutos a 902C com (4) 50 yl BSS para determinação de libertação da histamina total. -54-

Os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a 3000 xg e 50 yl do sobrenadante foi transferido para um outro tubo para determinação da libertação de histamina como descrito no Exemplo 5-2. 5.2 Determinação da libertação de histamina 60 yl do "cocktail" SAM (10 yli H-adenosilmetionina /"DuPont NEL 155 H 7 em 1 ml de PBS + histamina-L-metil-transferase) foram adicionados aos 50 yl de sobrenadante e incubado durante 90 minutos a 37SC num banho-maria com agitação, 40 yl de 1,5 N HC1C>4, seguido de 40 yl de 10 N NaOH e 500 yl de álcool-isomamilico/toluol (proporção de 2:8) foram adicionados ao tubo, agitados com vortex durante 1 minuto e depois centrifugados a 1Í0 xg durante 5 minutos. A metil-histarnina marcada radioacti-vamente, em condições alcalinas, está na fase orgânica, 300 yl da fase orgânica foi transferido para frascos contendo 1 ml de etanol e 10 ml de "cocktail" de cintilação mu (1 litro de toluol + 42 ml de Liquiflor , Du Pont)

TH e cortados num analisador de cintilação liquida Tri-Carb A radioactividade medida é proporcional à libertação de histamina.

Os resultados estão apresentados na Tabela 5. -55

Tabela 5:

Libertação especifica de histamina induzida pelos MAbs de rato anti-IgE murina agente indutor da ção liberta- Libertação de histamina / MAb 4B3-39 (1 μ$> 112 MAb 46-48 (1 \iÇ) 109 MAb 3-11 (1 m) 109 MAb 18-20 (1 μς) 84 MAb 4A1-28 (1 ug) 84 MAb 1-5 (1 μ9) < 0.5 MAb 1-5 (2 μ9> < 0.5 PC-BSA (1 μ9) 100* * 2.14 ng de histamina/10 5 células

Os resultados indicam clara mente que vários MAbs anti-IgE induzem a libertação de histamina a partir de mastócitos RBL sensibilizados com IgE. No entanto, o MAb 1-5 não induz a libertação de histamina se bem que seja altamente reactivo com IgE não ligada a mastócitos. EXEMPLO 6: Inibição da ligação de IgE a mastócitos portadorai do receptor Fcg, I peles anticorpos monoclonais de rato anti-IgE murina A capacidade dos anticorpos monoclonais de rato anti-IgE murina do Exemplo 1.3 para 125 inibir a ligação de IgE murina marcada com I a mastócitos PB3 (Bali et al., Differentiation 24, 74, 1983) é determinada num imunoensaio de inibição como descrito a seguir.

Placas de microtitulação em cloreto de polivinilo de fundo plano foram revestidas com 50 μΐ de poli-L-lisina numa concentração de 20 vg/ml em 5 , PBS. Após lavagem com PBS, 3 x 10 mastócitos PB3 (50 μΐ g a 6 x 10 /ml) foram adicionados por cavidade e depois suavemente imersos em 0 ,25% de glutaraldeido em PBS preparado de fresco a 4°C e deixados assim durante 5 minutos. Com um movimento suave o glutaraldeido é removido das cavidades e as placas são então lavadas era três banhos sucessivos de 1 litro de PBS. Quaisquer sitios reactivos residuais da proteina que ainda estejam presentes na superfície de plástico são saturados incubando as placas durante 1 hora a -57-

37QC com 205 yl de PBS contendo 1% de BSA e 0,2% de NaN^,.

Após lavagem em PBS, adicionou-se às cavidades adequadas 25 yl de tampão ou 25 yl das diluições dos anticorpos mono- clonais anti-IgE em tampão. A cada cavidade adicionou-se 125 25 yl de MAb aPC 12-3 anti IgE de ratinho marcado com I (40 000 cpm, ca 3 ng), As placas foram agitadas suavemente e incubadas durante 15 minutos a 379C e 1 hora à temperatura ambiente 175 yl de PBS foram então adicionados a cada cavidade e as placas foram revestidas sobre toalhas de plástico até os poços estarem vazios. As placas foram então lavadas 4 vezes em banhos de 1 litro de PBS e secas. A radioactivi-dade nos poços foi contada e calculado o grau de inibição.

Os resultados para o anticorpo MAb 1-5 estão apresentados na Tabela 6.

Tabela 6: 125

Inibição da ligação de I-IgE a mastócitos PB3 pelos MAb 1-5 anti-IgE murina

Quantidade de MAb 1-5 (ng/poço) Grau de inibição (56) 1000 73,3 100 66,0 10 52,0 1 9,5 * 50% de inibição = 9,5 ng MAb 1-5

Exemplo 7;

Ligação dos MAbs de rato anti-IgE murina a células B portadoras de IgE e a mastócitos revestidos com IgE A ligação dos MAbs de rato anti-IgE murina a células B portadoras de IgE e a mastócitos revestidos com IgE foi determinada por análise de cito-metria de fluxo. As células de hibridoma produtoras do MAb aPC 12-3 anti-IgE (ver Tabela 1) servem de células B porta- -t» dores de IgE de superfície (células B slgE ), As células da linha celular basofila de rato RBL-2H3 sensibilizadas com o MAbaPC 12-3 anti-IgE como descrito no Exemplo 5.1 foram usados como mastócitos revestidos com IgE. A coloração foi efectuada como se segue: 1-5 pg de MAbs de rato biotinilados anti- g _iGE murina foram incubados com 10 células em 200 pl de tampão RlA contendo 5% FCS durante 30 minutos a 4°C.

Após lavagem as células foram resuspensas em 200 pl de tampão RIA contendo 3 pl de avidina-FITC (Becton-Dickinson,

No.9011) durante 30 minutos a 4°C e novamente lavados.

Elas foram ressuspensas em 200 pl de tampão RIA e analisadas por citometria de fluxo (Ortho Diagnostic System 50 HH ligado a um computador 2150). -60

Tabela 7: Ligação dos MAfos de rato anti-IgE murina a células s!gE+ e a mastócitos revestidos com IgE íMAb anti-IgE murina (1 yg) % células coradas células B sIgE+ células RBL-2H3 revestidas lom TgR- 0 < 1 < 1 MAb 4B3-39 99.9 99.9 MAb 46-48 93.3 99.8 MAb 3-11 99.9 99.9 MAb 4A1-28 99.4 99.7 MAb 1-5 99.8 < 1.2 MAb de rato inspe- < 1 < 1 cifico

Os resultados demonstram claramente que vários MAbs anti-IgE murina reagem com ambos os tipos de células. No entanto, o MAB 1-5 não se liga a mastócitos revestidos com IgE se bem que seja altamente reactivo com IgE de superfície presente nas células B. EXEMPLO 8:

Efeito in vitro dos MAbs de rato anti-IgE murina 8.1 Ensaio de resposta imune in vitro induzida por anti-génio

Numa primeira série de testes foi estudada a resposta imune in vitro induzida por um antigénio especifico. 8.1.1 Indução de anticorpos específicos de benzilpenici-lina (BPO)

Ratinhos Balb/C (da quinta

Sisseln) foram injectados duas vezes, i.p. com duas semanas de intervalo, com 10 v<? ds benzilpenicilina (BPO, Serva) acoplada a hemociamina de lapa (KLH, Calhiochem) em 200 igtl de Alu-S-gel * (Serva). A acoplagem foi efectuada de acordo com Nakawaga et al. (Int. Archs. Allergy, Appl. Immunol. 63, 212, 1980 ). Os baços foram removidos de três ratinhos, nunca antes de três meses após a segunda injecção, homogeneizados e lavados três vezes em BSS frio. As células foram adxionadas a placas de 24 cavidades numa concentração de g 16 /ml em meio de Iscove (Seroned FO 465) com 5% FCS (testado para culturas in vitro) na presença de 0,5 gg de BPO-KLH com diferentes concentrações de vários MAbs de rato anti-IgE murina. As placas foram incthadas numa câmara húmida a 37SC. e 7,5% CC^ durante 6 dias. Os sobrenadantes foram então transferidos para uma outra placa para determinação de IgGl e de IgE na ELISA descrita nos Exemplos -62-

8.1.3 e 8.1.4. As células foram testadas quanto à sua acti-vidade de produção de anticorpos no ensaio de células formadoras de placas do Exemplo 8.1.2. 8.1.2 Ensaio de células formadoras de placas para determinação de células produtoras de anticorpos

Desenvolveu-se um novo ensaio de ELISA com placas para a detecção de células produtoras de anticorpos para se analisar o efeito de anticorpos mono-clonais anti-IgE no desenvolvimento de tais células. 1 ml de BSS frio foi adicionado às cavidades das placas de microtitulação do Exemplo 8.1.1 e as células foram cuidadosamente ressuspensas e transferidas para tubos Falcon de 5 ml. O volume foi ajustado a 3 ml pela adição de mais BSS frio e os tubos foram mantidos em getlo.

Placas de 48 cavidades foram revestidas com BPO acoplado a BSA/a acoplagem de acordo com o processo descrito no Exemplo 8.1.1 para KLH; 200 yl a 500 vg/ml) em PBS durante 15 horas a 4SC. Após lavagem as placas foram incubadas durante 1 hora a 37SC com 1 ml (d) de PBS contendo 1% de BSA, 0,2% de NaN^ e 0,05% de Tween 20 para bloquear quaisquer sitios reactivos da proteína que ainda estivessem livres. As placas foram novamente lavadas em PBS. As células colhidas foram centrifugadas durante 7 minutos a 190 xg e ressuspensas em 1 ml de meio deailtura. Dependendo do isotipo a ser medido, adicionou-se 1 ml de diluições diferentes de células (1/1 para IgE, 1/10 para -63-

IgG2 e V30 para IgGl) às placas revestidas que foram então incubadas a 372C numa câmara húmida com 7,5% CC^ durante 18 horas. Após lavagem, adicionou-se às placas 100 yl de anticorpos marcados com fosfatase alcalina com a especificidade do isotipo apropriada e incubou-se durante 2 horas a 37QC. Após lavagem com PBS, adicionou-se às cavidades 100 yl do substracto 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP, Sigma) em tampão 2-amino-2-metil-l-propanol (AMP, Pluka) e incubou-se à temperatura ambiente até se tornarem visíveis manchas distintas coradas de azul (placas) (apro-ximadamente 50 minutos).

Os resultados estão apresentados na Tabela 8 (ver Exemplo 8.2.3). 8.1.3 ELISA para determinação de anticorpos IgE específicos de BPO nos sobrenadantes celulares

Anticorpos IgE especificos de BPO presentes nos sobrenadantes celulares do Exemplo 8.1.1 foram medidos quantitativamente por ELISA como descrito a seguir. 1 yg de BPO-BSA em 50 yl de tampão bicarbonato de sódio 0,05M (pH 9,6) foi incubado durante 2 horas a 37QC ou durante 15 horas a 49C em placas de microtitulação em plástico. Após lavagem com PBS, os sitios reactivos da proteína que ainda estivessem presentes na superfície de plástico foram saturados por incubação (R) durante 2 horas a 37QC com 200 yl de tampão PBS-Tween (0,05% Tween^R^ 20 em PBS contendo 0,2% de NaN^, pH 7,4) e as placas foram lavadas com PBS. 50 yl do sobrenadante -64-

das células e suas diluições foram incubadas durante 2 horas a 378C ou durante 15 horas a 4sc. 50 çl de diluição de concentração conhecida do MAb 13-10 Ig de ratinho especifico de BPO (Ciba-Geigy) foram também incubados durante 2 horas a 372C e 15 horas a 42C. Após lavagem das placas, os anticorpos específicos de IgE ligados foram revelados por incubação com 50 gl de uma diluição correspondente prédeteminada de uma preparação de anticorpo monoclonal de rato anti-IgE murina conjugado com biotina durante 2 horas a 372C, lavagem das placas novamente e incubação com 50 μΐ de avidina marcada com fosfatase alcalina (Calbiochem) a 1/1000 durante mais 1 hora a 372C. A quantidade de enzima capturada foi determinada por incubação (1 hora, temperatura ambiente) com 150 yl de substracto enzimático g-nitro--fenilfosfato (1 rag/ml em tampão 10¾ de dietanolamina contendo 0,5 mmoles de MgClg, pH 9,8) e medindo a densidade óptica do produto que reagiu a 405 nm (OD4Q5) usando um fotómetro Multiskam (Flow irvine, Scotland). A concentração de anticorpos IgE específicos de BPO nos sobrenadantes celulares foi calculada usando a curva padrão obtida a partir das diluições de anticorpos monoclonais IgE específicos de BPO. 8.1.4 ELISA para determinação de anticorpos IgGl especi ficos de BPO nos sobrenadantes celulares

Anticorpos IgGl específicos de BPO presentes nos sobrenadantes de células do Exemplo 8.1.1 foram medidos quantitativamente numa ELISa que é análoga à ELISA do Exemplo 8.1.3. -65-

Obteve-se uma curva padrão por incubação de 50 çl de diluições de concentrações conhecidas do MAb kl 16 IgGl de ratinho especifico de BPO (cedido pelo Dr. K. Blaser, Swiss Inst. for Allergy and Asthma Research Davos). Os anticorpos IgGl ligados específicos de BPO foram revelados por incubação com 50 çl de uma diluição correspondente predeterminada de uma preparação de IgG de coelho anti IgGl de ratinho marcada com fosfatase alcalina. A quantidade de enzima capturada foi determinada do mesmo modo que para IgE e a concentração de anticorpos IgGl específicos de BPO foi calculada usando as curvas padrão obtidas a partir das diluições de anticorpos monoclonais específicos de BPO. 8.2 Ensaio de resposta imune in vitro induzida policlonal-mente

Numa segunda sérid de testes foi estudada a resposta imune in vitro induzida policlonal-mente. 8.2.1. Indução policlonal de anticorpos de diversas especi ficidades

Culturas de células B pequenas em repouso isoladas com Percoll (Pharmacia) (Julius et al., Eur. J. Immunol. 14, 753, 1984) foram ressuspensas em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com L-glutamina (2 mM) penicilina, estreptimicina (100 UI/ml), 2-mercaptoetanol (2 x 10^M), piruvato de sódio (1 mM) e 1056 de soro fetal de c vitela seleccionado (Seroned) em 5% CO£ a 372C, 5 x 10 células/ml foram cultivadas durante 7 dias na presença ou ausência de mitogénio (lipopolissacárido /~LPS 7 de E. coli B 026; B6 /“Difco 3920-10_7; 25 yg/ml) e interleucina 4 murina e diferentes concentrações dos MAbs de rato anti--IgE murina num volume total de 0,2 ml em placas de micro-titulação de fundo plano com 46 cavidades (Costar). Os sobrenadantes das culturas celulares foram colhidos e analisai dos quanto a IgE total e IgG3 numa ELISA em sanduíche descrita nos Exemplos 8.2.2 e 8.2.3. 8.2.2. ELISA para determinação da quantidade de total de IgE nos sobrenadantes de células A quantidade total de anticorpos IgE nos sobrenadantes celulares do Exemplo 8.2.1. foi medida por ELISA descrita a seguir. 1 yg do MAb 4B3-39 de rato anti-IgE murina em 50 yl de tampão bicarbonato de sódio 0,05M (pH 9,6) foi incubado durante 2 horas a 37QC e durante 15 horas a 4SC em placas de microtitulação de plástico.

Após lavagem com PBS, os sitios reactivos da proteína que ainda estivessem presentes na superfície de plástico foram saturados por incubação durante 2 horas a 37SC com 200 yl (D) í R ) de tampão PBS-Tween (0,05% Tween 20 em PBS contendo 0,2% NaNg, pH 7,4). As placas foram lavadas com PBS e 50 yl do sobrenadante celular e suas diluições foram incubadas durante 2 horas a 372C ou durante 15 horas a 4QC. 50 de diluições de concentrações conhecidas de um anticorpo monoclonal IgE de ratinho foram também incubados durante 2 horas a 37SC ou durante 15 horas a 4SC. -67-

Após lavagem das placas, os anticorpos IgE ligados foram revelados como descrito para os anticorpos IgE específicos de BPO no Exemplo 8.1.3 usando ο MAB3-11 de rato anti-IgE murina. A quantidade total de anticorpos IgE nos sobrenadantes celulares foi calculada usando a curva padrão obtida a partir de diluições dos anticorpos monoclonais IgE.

Os resultados estão apresentados na Tabela 8 (ver Exemplo 8.2.3). 8.2.3 ELISA para determinação da quantidade total de IgG3 nos sobrenadantes celulares A quantidade total de anticorpos IgG3 nos sobrenadantes de células do Exemplo 8.2.1 foi medida numa ELISA análoga à ELISA do Exemplo 8.2.2.

Como anticorpo de revestimento usou-se um IgG de coelho anti-IgG3 de ratinho (Ciba--Geigy). Obteve-se uma curva padrão através da incubação de diluições de concentrações conhecidas do anticorpo mono-clonal aPC61-l anti-Ig G3 de ratinho (ver Tabela 2). O anticorpo monoclonal de rato Ra 33-18-12 anti-cadeia kapa de ratinho (cedido pelo Prof. G. Hamming, Freiburg, Germany) foi usado como anticorpo de revelação.

Os resultados estão apresentados na Tabela 8 abaixo. -68-

Tabela 8: Inibição da resposta de IgE in vitro por MAbs de rato anti-IgE imirina MAb % de inibição da resposta de imunoglobulinas induzido por anti- (1) induzido policlonalmente (2) genio anti-BPO anti-BPO IgGl IgE total IgG3 total IgE MAb 1-5 0 65 0 55 MAb 4B3-39 5 ’ 100 0 88 (X) culturas de 6 dias de células do baço de ratinho

(10^/ml) na presença de 0,5 gg^i de BPO-KLH e 1 yg/ml de MAbs arti-IgE; análise por ensaio de células formadoras de placas (Exemplos 8.1.3, 8.1,4) 100% = 6640 -1527 células formadoras (PFC) de placas IgGl ou 53± 11 PFC IgE -69-

(2) culturas de 7 dias de células B pequenas em repouso isoladas com Percoll (5 x 10^/ml) ça presença de LPS (25 yg/ml) e 1 yg/ml de MAbs anti-IgE; análise por ELISA (Exemplos 8.2.2; 8.2.3); 100% = 479 - 200 yg/ml de IgG3 ou 518 í 64 ug/ml de IgE. EXEMPLO 9: Efeito in vivo dos MAbs de rato anti-IgE murina

9.1 Indução e determinação de anticorpos específicos de BPO

Ratinhos BAlb/c de 6-8 semanas de iadde (fornecidos por Sisseln) foram imunizados ip. duas vezes (com duas semanas de intervalo) com 0,2 ml de hidróxido de alumínio aquoso a 2% (Serva) contendo 10 yg de BPO-KLH (ver Exemplo 8.1.1). Om ano mais tarde estes ratinhos pré-imunizados foram tratados como se segue:

Grupo 1 (6 ratinhos) recebeu 0,2 ml i.p. de Al(OH)3 contendo 50 yg de BPO-KLH no dia O; grupo 2 (6 ratinhos) recebeu 200 yg de MAb 1-5 de rato anti-IgE murina purificada nos dias 1 (i.p.) o (i.v.), 2 (i.p.) e 5 (i.v.); e grupos 3 & 4 (ambos 6 ratinhos) foram tratados de modo idêntico ao grupo 2 mas com o MAb 4B3-39 de rato anti IgE-murina e com Ig G normal de rato (Calbiochem) respectivamente.

Em adição, os grupos 2, 3 e 4 receberam 0,2 ml i.p. de AI(OH)3 contendo 50 yg de BPO-KLH no dia 0. -70-

No dia 14, todos os ratinhos foram sangrados e o soro foi analisado quanto à presença de IgE e IgGl especificas de BPO por testes de ELISA descri^ tos nos Exemplos 8.1.3 e 8.1.4 para sobrenadantes de células. Os resultados estão apresentados na Tabela 9 (ver Exemplo 9.2). 9.2 Ensaio de células formadoras de placas para determinação de células produtoras de anticorpos

Os ratinhos foram pré-imuni zados como descrito no Exemplo 9.1. Um ano mais tarde, os ratinhos foram tratados de modo idêntico ao Exemplo 9.1 com excepção dos grupos 2, 3 e 4 receberam anticorpo nos dias -1,0 , 1 e 3.

No dia 6, os baços foram re movidos dos ratinhos e analisados pelo ensaio de células formadoras de placas descrito no Exemplo 8.1.2. Os resultados estão apresentados na Tabela 9 abaixo.

Tabela 9

Efeito in vivo dos MAbs de rato anti IgE raurina grupo 1 (testemunha grupo 2 (MAb 1-5) grupo 3 (MAb 4B3-39) grupo 4 (normal de rate IgG) IgGl 1.25 1.46 1.39 1.58 14) mg/ml ± 0.26 £ 0.11 £ 0.22 £ 0.15 IgE 47.66 7.81 3.52 42.97 |ig/ml £ 10.2 £ 5.1 £2.0 £ 9.4 PFC IgGl 297 271 266 577 106 ± 59 £ 55 £ 87 £ 103 IgE 23 8 14 28 ± 2 £ 2 £ 2 £ 5 (1) média de 6 animais - 1 SEM (erro padrão das médias) (2) média de 5 animais - 1 SEM (erro padrão das médias) 72- EXEMPLO 10: Preparação de linhas celulares de hibridomas secretoras de anticorpos monoclonais de ra- tinho anti-IgE humana 10.1 Imunização de ratinhos cora IgE humana

Ratinhos Biozzi (Inst. Curie

Paris) foram imunizados com anticorpos humanos purificados da classe de imunoglobulina IgE conforme apresentado na Tabela 10. Estes anticorpos IgE têm diferentes especificidades para favorecer a indução de anticorpos anti-isotipi-cos

Tabela XO: IgE humana usada para imunização

Designação de IgE humana fonte caracteristicas PS Prof. K. Jshizaka, Johns Hopkins Univ., Baltimore/ USA produzido por um mieloma humano WT Prof. D. Standworth, Univ. of Birir.ingham, England produzido por um mieloma de IgE humano JW8 Serotec (see Neuberger.et al., Nature 314, 268, 1985) MAb quimérico com regiões constantes e humanas e regiões variáveis muri-nas especificas para NIP

Uma mistura dos anticorpos IgE da Tabela 10 (25 yg de cada) em adjuvante completo de Freund foi injectada intraperitonealmente (i.p.) nos ratinhos. Quatorze dias depois, uma outra injecção da mesma mistura na mesma concentração em adjuvante incompleto de Freund foi injectado i.p. Os tituloé do soro foram determinados como descrito no Exemplo 1.3 e o ratinho com o titulo de soro mais elevado contra IgE humana foi então novamente injectado metade intravenosamente, metade intraperitonealmente com a mistura de anticorpos IgE (7,5 yg de cada) da Tabela 10 em PBS 3 dias depois da fusão. 10.2 Fusão celular A fusão celular foi consegui da usando 10 células do baço de um ratinho imunizado e 7 3 x 10 células da linha celular de mieloma de ratinho PAI (J.W. Stocker, H.K. Forster, V. Miggãano, C. Stãhli, G. Staiger, B. Takaco e Th. Stachelin, Generation of two new mouse myeloma cell lines “PAI” and "PAI-O" for hybri-doma production, Research Disclosure 21713, May 1982, p--155) na presença de 1 ml de 50% de polietilenoglicol como descrito no Exemplo 1.2. Os sobrenadantes das culturas foram testados quanto à ligação a IgE humana pelo teste de ELISA e pela RIA do Exemplo 10.3. Depois disto eles foram testados quanto à libertação de histamina de acordo cora o Exemplo 11.

As células de hibridoma se- leccionadas podem ser cultivadas em cultura, congeladas a -80QC ou em azoto liquido e depois reactivadas. As células foram clonadas por diluição limite (Goding, J. Immunol Methods 39_f 285, 1980 ) e expandidas pela formação de ascites em ratinhos mu/mu ou Balb/C anteriormente injectados com pristano (ver Exemplo 10.4). 10.3 Selecção de hibridoma secretores de anticorpos de ratinho anti-IgE humana 10.3.1 Ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) de sanduíche

Os hibridomas em crescimento foram testados quanto à presença de anticorpos dirigidos -75-

contra o isotipo IgE humano (anticorpos anti-IgE humana) por um ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) de sanduíche em analogia com a ELISA do Exemplo 1.3.

As placas de microtitulação foram revestidas com imunoglobulinas incubando 1 yg dos anticorpos IgE da Tabela 10 (ver Exemplo 10.1) ou, como testemunhas, com proteinas de mieloma humano (WHO Standards) de todas as outras classes de imunoglobulinas (ver Tabela 11 abaixo) em 50 yl de tampão bicarbonato de sódio 0,05M pH 9,6. As incubações e lavagens foram feitas como descrito no Exemplo 1.3. Os anticorpos monoclonais de ratinho ligados foram revelados com IgG monoelonal de rato Ra33--18-12 arid-cadeia leve k de ratinho marcada com fosfatase alcalina. 10.3.2. Radioimunoensaio em fase sólida (RIA)

Num segundo despiste, os hibridomas do Exemplo 10.2 foram testados relativamente a anticorpos dirigidos contra o isotipo IgE humano (anti--anticorpos IgE humana) por radioimunoensaio (RIA) em fase sólida.

Placas de microtitulação em cloreto de polivinilo foram revestidas por incubação de 1 yg de anticorpos de anti-Ig de ratinho em 50 yl de tampão bicarbonato de sódio 0 ,Q5M pH 9,6 durante 2 horas a 372C e 15 horas a 4SC. Após lavagem com PBS, quaisquer sítios reactivos da proteína que estivessem ainda presentes na superfície de olástico foram saturados por incubação (R) durante 2 horas a 37SC com 200 yl de tampão PBS-Tween -76-

(η) (0,05% Tween 20 em PBS contendo 0,2% NaNg e 1% BSA, pH 7,4) e as placas foram lavadas com PBS 50 yl de todos os sobre- nadantes de cultura foram incubados nas placas durante 4 horas a 37SC, e após lavagem das placas com PBS, 50 yl de 125

IgE humana iodinada com I foi adicionado e as placas foram incubadas durante 1 hora a 37QC. As placas foram lavadas e a quantidade de IgE ligada foi determinada por con-

TM tagem aos poços num contador gama Packard Cobra 5005.

Tabela 11: Proteinas de mieloma humano purificados de

diferentes isotipos, empregues na ELISA e RIA cadeia cadeia - L H K λ μ Jakop Orelli Yi HU 0781 Lob 0284 Ϊ2 G263 0783 Ma 0981 Y3 Vai 1080 Hun 1283 Ϊ4 Bru 1183 Gta 0184 a GRA 0386 SCHN 0386 SCHZ 0386 e WT PS JW8

Com base nos resultados do processo de despiste seleccionaram-se para posterior análise 7 hibridomas designados Fl-18-22, Fl-30-3, Fl-43-17, Fl-62-48, Fl-73-63, Fl-74-20 e Fl-75-14. Eles secretam os anticorpos monoclonais que apresentam reactividade de ligação com IgE humana enquanto que apresentam apenas reactividade cruzada de fundo com proteinas de mieloma de outros isotipos de Ig. Os MAbs anti-IgE foram designados de acordo com a linha celular de hibridoma pela qual são secretados. -78-

10,4. Produção, isolamento e purificação dos anticorpos monoclonais de ratinho anti-IgE humana

Os hibridomas foram expendidos in vivo em ratinhos nu/nu ou em ratinhos Balb/C inocu-lados com 10 células de hibridoma como descrito no Exemplo 2.1. Para expansão in vitro seguiu-se o processo do Exemplo 2.2 exceptuando o meio de cultura das células que é DMEM (Gibco) em vez de F.PMI 1640. A fracção de imuno-globulina G foi precipitada e cromatografada como descrito no Exemplo 2.1. 10.5 Determinação do isotipo dos anticorpos monoclonais de ratinho anti-IqE humana A classe e subclasse de imu-noglobulinas dos MAbs de ratinho anti-IgE humana do Exemplo 10.3 foram determinadas como descrito por Ouchterlony.

Todos os anticorpos monoclonais testados são da classe IgGl. -79-

EXEMPLO 11: Determinação da libertação especifica de hista-mina induzida pelos MAbs de ratinho anti-IgE humana

Os MAbs de ratinho anti- -IgE humana foram testados quanto à sua capacidade para induzir a libertação por histamina por um método de acordo com Subramanian & Bray (J. Immunol. 138, 271, 1987) descrito a seguir. 11.1 Preparação de mastócitos

Sangue periférico humano de voluntários saudáveis foi colhido em tubos siliconiza-dos e misturado com 6% de dextrano (2 ml para 8 ml de sangue) em tubos de plástico revestidos com EDTA. Após mistura por inversão, as células foram deixadas a sedimentar à temperatura ambiente e a camada de plasma rica em leucócitos foi retirada e centrifugada a 1000 xg durante 10 minutos. 0 sobrenadante foi aspirado e o sedimento de células foi ressuspenso em solução tamponada HEPES (25 mM HEPES, 0,9% NaCl, 0,5 mM glucose, pH 7,4) e recentrifugado a 1000 xg durante 10 minutos. O passo de lavagem foi repetido duas vezes. O sedimento final de células foi ressuspenso no mesmo tampão contendo 0,6 mM CaCl2 e 0,6 mM MgCl2. -80-

11.2 Determinação de libertação de histamina

Amostras de aproximadamente 1000 células foram incubadas com uma dose apropriada de MAbs anti-IgE humana do Exemplo 10.3 (diluição V3) durante 15 minutos a 37QC. O teor total de histamina das células foi calculado a partir de sobrenadantes de células lisa-das (95SC, 10 minutos). Outros compostos a testar foram adicionados na mesma altura. Todos os testes foram feitos a triplicado e foram feitos cálculos de histamina em duplicado para cada amostra.

Após incubação, amostras dos sobrenadantes a testar foram testadas quanto ao teor de histamina usando um ensaio enzimático-isotópico. 50 yl de sobrenadante (ou uma amostra diluida para 50 yl com tampão de fosfatos, pH 7,9) foram incubados durante 90 minutos a 37SC com 60 yl de um "cocktail” contendo histamina-metil-transferase de rim de rato (25-30 yg de proteina) e 0,6 yCi de / H_/-S-adenosilmetionina (Amersham, 60-80 Ci/mmol). A reacção foi parada pela adição de 40 yl de 1,5 N HCIO^ e agitação num vibrador de placas (Eppendorf). Subsequentemente adicionou-se 40 yl de NaOH 10 N e após mistura adi-cionou-se mais 500 yl da mistura de tolueno: álcool isoami-lico (80:20 *v/v). As amostras foram bem misturadas para extrair a metil-histamina marcada formada pela reacção en-zimática. Os tubos foram então centrifugados a 4000 rpm durante 5 minutos e 300 yl de fase orgânica foi transferido para frascos de cintilação em polipropileno. Após adição de 1 ml de etanol e 10 ml de "cocktail” de cintilação

TM (Liquifor ; diluido com tolueno para cintilação para dar uma concentração final de 4 g/1 de PPO e 50 mg/1 de POPOP). A radioactividade foi contada num contador de cintilação liquida (Tricarb™ 1530 ; Packard).

Dos 7 MAbs anti-IgE humana testados, o MAb Pl-43-17 não induz a libertação de histamina (menos de 5%) até 10 yg/ml de MAb a partir de mastócitos que foram revestidos com IgE in vivo, se bem que ele expresse reactividade elevada contra IgE humana conforme determinado na ELISA do Exemplo 10.3.1. Os resultados estão apresentados na Tabela 12.

Tabela 12

Actividade anti-IgE humana e libertação de histamina dos MAbs de ratinhos anti-IgE humana MAb anti-humana IgE 'actividade A 0Γ (μg/ml) ^ctividade de libertação de his-b ^ (μg/ml) tãiriina razão ^^2. Fl-18-22 1.83 ± 0.65 1 0.13 ± 0.02 14.1 Fl-30-3 7.54 ± 3.64 0.31 ± 0.19 24.3 Fl-43-17 1.84 ± 0.77 > 10 < 0.1 Fl-62-48 5.65 ± 3.0 0.85 ± 0.15 6.6 Fl-73-63 4.78 ± 3.31 C.90 ± 0.3 5.3 Fl-74-20 4.66 ± 2.57 1.33 ± 0.18 3.5 Fl-75-14 9.72 ± 5.76 0.90 ± 0.20 10.8 (1) determinado no ensaio ELISA de sanduiche de acordo com o Exemplo 10.3.1; concentração que resulta numa leitura da densidade óptica de 0,5. (2) determinado de acordo com o Exemplo 11.2; concentração que resulta em 5% da libertação máxima 1 desvio padrão 11.3

Determinação da inibição cã ligação de IgE a células linfoblastóides portadoras do receptor Fc ç, II

Anticorpos monoclonais anti--IgE humana foram testados quanto à sua capacidade para inibir a ligação de particulas de latex revestidas com IgE a células portadoras de receptores Fc^, II como descrito a eeguir.

Esferas de latex (Sigma) foram revestidas com um conjugado de ácido 4-hidroxi-3-iodo--5-nitrofenilacético (NIP) com BSA (Brownstone et al., Immunol. 10^, 465, 1966) de acordo com as especificações do fabricante. As esferas foram lavadas, ressuspensas em PBS contendo 0,1% de BSA, 0,2% NaN3, pH 7,4 e incubadas com 100 yg do anticorpo quimérico IgE humano JW8 anti-NIP (Neu-berger et al., Nature 314, 268, 1985) em 500 yl durante 45 minutos à temperatura ambiente, seguido de lavagem. 100 yg de antricorpos monoclonais anti-IgE humana numa concentração de 0,1 mg/ml (ou tampão como testemunha) foram incubados com 20 yl de suspensão de esferas de latex revestidas com IgE diluída durante 45 minutos à temperatura am-biente, seguido da adição de 2 x 10 células linfoblásti-cas RPMI 8866 (Jensen et al., Immunol. 53, 1, 1984) em 100 yl de tampão e incubação durante mais 60 minutos à temperatu ra ambiente. A inibição da aglutinação de latex com células RPMI 8866 foi determinada por observação ao microscópio.

De facto, encontraram-se anticorpos monoclonais anti-IgE humana que inibem a inter-acção entre particulas revestidas com IgE e as células RPMI 8866.

Claims (1)

1. -84-

   REIV INDICAÇÕES: lã. - Processo para a preparação de anticorpos monoclonais dirigidos contra determinantes isotípicos de imunogloculina E(IgE) que inibam a ligação de igE livre a células portadoras de receptores Fcg; I ou II e reconheçam IgE expressa na superficie de células B positivas para IgE de superfície, mas que não reconheçam IgE ligada à superficie de células portadoras de receptores Fct, I ou II e que não induzam a libertação de mediadores por tais células e de seus derivados mantendo a especificidade do anticorpo do qual derivam, caracterizado por as células de uma linha celular contínua secretando os referidos anticorpos monoclonais serem multiplicadas in vitro ou ϊϋ vivo e» quando necessário, os anticorpos monoclonais obtidos serem isolados e/ou convertidos nos seus derivados . 2ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem anticorpos monoclonais e seus derivados que não reconhecem IgE ligada na superficie de mastócitos e basófilos portadores de receptores Fcg. I e que não induzem a libertação de mediadores anafiláticos por tais células. 3ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem anticorpos monoclonais e seus derivados que inibem especificamen-te a formação de IgE na resposta imune. 4ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem anticorpos monoclonais os quais são da classe de imunoglobulina

   IgG e seus derivados. 5ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem anticorpos monoclonais e seus derivados os quais são dirigidos contra determinantes isotipicos de IgE murina. 6ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1", caracterizado por se prepararem anticorpos monoclonais de rateeana e seus derivados os quais são dirigidos contra determinantes isotipicos de IgE murina. 7ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar o anticorpo monoclonal com a designação MAb 1-5 e seus derivados. 8ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem anticorpos monoclonais e seus derivados que sejam dirigidos contra determinantes isotipicos de IgE humana. 9â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem anticorpos monoclonais de ratinho ou de ratazanas e seus derivados que sejam dirigidos contra determinantes isotipicos de IgE humana. 10ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem anticorpos monocbnais de ratinho e seus derivados que sejam dirigidos contra determinantes isotipicos de IgE humana. -36-

   11 i. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar o anticorpo monoclonal com a designação MAb Fl-43-17 e seus derivados . 12 §. - Processo de acordo com a reivindicação 1f caracterizado por se prepararem anticorpos monoclonais quiméricos animal/humano e seus derivados os quais são dirigidos contra determinantes isotipi-cos de IgE humana. 13i. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem anticorpo monoclonais quiméricos animal/humano e seus derivados os quais são dirigidos contra determinantes isotipicos de IgE humana e que consistem em regiões variáveis murinas e regiões constantes humanas. 14i. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem anticorpos monoclonais bispecificos compreendendo duas fracções diferentes de ligação ao antigénio, uma derivada de um anticorpo monoclonal dirigido contra determinantes isotipicos de IgE humana e em seguida derivada de um anticorpo com uma especificidade diferente e seus derivados. 15ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem anticorpos monoclonais bi-especificos compreendendo duas fracções diferentes de ligação ao antigénio, uma derivada de um anticorpo monoclonal dirigido contra determinantes isotipicos de IgE humana e a segunda derivada de um anticorpo dirigido contra ràna substância citostática ou citotóxica, e de seus derivados. 87-

   16 §. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem derivados de anticorpos monoclonais os quais são fragmentos de anticorpos. 17§. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem derivados de anticorpos monoclonais os quais são conjugados de anticorpos com uma enzima, uma marca fluorescente, uma marca quimioluminescente, um quelato de metal, avidina, biotina ou similares. 18i. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem derivados de anticorpos monoclonais qme são anticorpos marcados radioactivamente. 19ã. - Processo para a preparação de uma linha celular contínua que é uma linha celular de hibridoma secretando, e anticorpos monoclonais como definidos na reivindicação 1, caracterizado por um mamifero adequado ser imunizado com IgE, células produtoras de anticorpos deste mamifero serem fundidas com células de uma linha celular contínua, as células híbridas obtidas na fusão serem clonadas e os clones celulares secretando os anticorpos monoclonais pretendidos serem seleccionados. 20ã. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se preparar uma linha celular de hibridoma como definido na reivindicação 19, a qual é um híbrido de células de unicloma e de linfócitos B de um mamifero imunizado com IgE. -83-

   21ã. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se preparar uma linha celular de hibridoma que é um híbrido de células de mieloma de ratinho e de linfócitos B de um rato imunizado com IgE murina. 22 §. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se preparar uma linha celular de hibridoma que com a designação 654-1-5 que foi depositado na European Collection of Animal Cell Culture com o número ECACC 89041902 em 19 de Abril de 1989. 23ã. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se preparar uma linha celular de hibridoma que é um híbrido de células de mieloma de ratinho e linfócitos B de um ratinho sin-geneico imunizado com IgE humana. 24§. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se preparar uma linha celular de hibridoma que com a designação Fl-43-17 que foi depositada no European Collection of Animal Cell Cultures sob o número ECACC 90032210 em 22 de Março de 1990 . 25ã. - Processo para a preparação de linhas celulares que transfectam secretando anticorpos monoclonais quiméricos animal/humano, como definido na reivindicação 12, caracterizado por as células de uma linha celular contínua serem transfectadas com construção de ácido nucleico codificadores de cadeias leves e/ou pesadas quiméricas animal/humano dos anticorpos monoclonais quiméricos prtendidos, as células transfectadas obtidas serem clonadas e os clones celulares secretando os anticorpos monoclonais quiméricos pretendidos serem seleccionados. -89- t

   26§. - Processo para a preparação de uma linha celular contínua secretando anticorpos monoclonais bi-especi£icos como definido na reivindicação 14, caracterizado por as células produtoras de cadeias leves e/ou pesadas de um anticorpo monoclonal dirigido contra determinantes isotípicos de IgE humana e células prcHu-toras de cadeias leves e/ou pesadas de um anticorpo monoclonal com uma especificidade diferente serem fundidas, as células híbridas obtidas em fusão serem clonadas e os clones celulares secretando os anticorpos monoclonais bi--especificos pretendidos serem seleccionados. 27ã. - Processo para a determinação qualitativa, e quantitativa de IgE, caracterizado por se utilizar um anticorpo monoclonal e/ou seu derivado como definido na reivindicação 1. 28â. - Processo para a determinação quelativa e quantitativa de IgE células B positivas para IgE de superficie (sIgE+), caracterizado por ser utilizado um anticorpo monoclonal e/ou um seu derivado como definido na reivindicação 1. 29ã. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por um anticorpo monoclonal ou um seu derivado obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ser misturado numa quantidade entre 0,01% e 50% com um veiculo farmaceu-ticamente aceitável. -90- 30i. - Método para o tratamento terapêutico e profilático de alergia, caracterizado por se administrar um anticorpo monoclonal ou um seu derivado obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, numa dose entre 0,1 mg e 10 mg por kg de peso corporal por dia. Lisboa, 2 de Maio de 1990

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