JPH11155584A - エリトロポエチン類似体 - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
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-
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ヒトエリトロポエチンの本来のグリコシレーシ
ョン部位と異なる部位に炭水化物鎖を有するヒトエリト
ロポエチン誘導体を提供すること。 【解決手段】ヒトエリトロポエチンのマチュアなアミノ
酸配列の３０、５１、５７、６９、８９、１３６又は１
３８位のいずれかの位置のアミノ酸残基がアスパラギン
残基で置換された少なくとも１つのグリコシレーション
部位を含み、この部位に炭水化物鎖が結合しており、か
つ８８位のアミノ酸残基がアスパラギン残基で置換され
ていないことを特徴とするエリトロポエチン活性を有す
るヒトエリトロポエチン類似体、その類似体をコードす
るDNA、そのDNAでトランスフェクトされた真核宿主細
胞、その類似体を含む赤血球細胞の産生を増進するため
の医薬組成物。
ョン部位と異なる部位に炭水化物鎖を有するヒトエリト
ロポエチン誘導体を提供すること。 【解決手段】ヒトエリトロポエチンのマチュアなアミノ
酸配列の３０、５１、５７、６９、８９、１３６又は１
３８位のいずれかの位置のアミノ酸残基がアスパラギン
残基で置換された少なくとも１つのグリコシレーション
部位を含み、この部位に炭水化物鎖が結合しており、か
つ８８位のアミノ酸残基がアスパラギン残基で置換され
ていないことを特徴とするエリトロポエチン活性を有す
るヒトエリトロポエチン類似体、その類似体をコードす
るDNA、そのDNAでトランスフェクトされた真核宿主細
胞、その類似体を含む赤血球細胞の産生を増進するため
の医薬組成物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、少なくとも１つの
グリコシレーション部位の付加または少なくとも１つの
グリコシレーション部位の転位を有するヒトエリトロポ
エチン類似体に関する。本発明はまた、該ヒトエリトロ
ポエチン類似体をコードするＤＮＡ、並びに、該類似体
発現用の宿主細胞に関する。本発明はさらに、該ヒトエ
リトロポエチン類似体を含有する医薬組成物に関する。
グリコシレーション部位の付加または少なくとも１つの
グリコシレーション部位の転位を有するヒトエリトロポ
エチン類似体に関する。本発明はまた、該ヒトエリトロ
ポエチン類似体をコードするＤＮＡ、並びに、該類似体
発現用の宿主細胞に関する。本発明はさらに、該ヒトエ
リトロポエチン類似体を含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】エリ
トロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球系前駆細胞から赤血
球への成熟に関与する糖タンパク質ホルモンである。エ
リトロポエチンは、血流中の赤血球のレベル調節に必須
である。天然産生エリトロポエチンは、胎内期の肝臓及
び成人の腎臓によって産生され、血液中を循環し、骨髄
で赤血球の産生を刺激する。貧血の原因はほとんど例外
なく腎不全であり、腎臓からのエリトロポエチンの産生
が低下する。エリトロポエチンをコードする遺伝子で形
質転換した宿主細胞にタンパク質産物を発現させる遺伝
子工学技術によって産生された組換えエリトロポエチン
が、慢性腎不全を原因とする貧血の治療に使用されたと
きに有効であることが知見されている。
トロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球系前駆細胞から赤血
球への成熟に関与する糖タンパク質ホルモンである。エ
リトロポエチンは、血流中の赤血球のレベル調節に必須
である。天然産生エリトロポエチンは、胎内期の肝臓及
び成人の腎臓によって産生され、血液中を循環し、骨髄
で赤血球の産生を刺激する。貧血の原因はほとんど例外
なく腎不全であり、腎臓からのエリトロポエチンの産生
が低下する。エリトロポエチンをコードする遺伝子で形
質転換した宿主細胞にタンパク質産物を発現させる遺伝
子工学技術によって産生された組換えエリトロポエチン
が、慢性腎不全を原因とする貧血の治療に使用されたと
きに有効であることが知見されている。
【０００３】通常はヒト尿中に低レベルのエリトロポエ
チンが存在しているが、再生不能性貧血患者では高レベ
ルの尿エリトロポエチンが検出される。Miyakeら、J. B
iol.Chem., 252, 5558 (1977)は、ヒト尿エリトロポエ
チンを精製するために再生不能性患者の尿を出発物質と
して使用した。しかしながら今日まで、尿エリトロポエ
チンが治療的に有効であると証明されたことはない。
チンが存在しているが、再生不能性貧血患者では高レベ
ルの尿エリトロポエチンが検出される。Miyakeら、J. B
iol.Chem., 252, 5558 (1977)は、ヒト尿エリトロポエ
チンを精製するために再生不能性患者の尿を出発物質と
して使用した。しかしながら今日まで、尿エリトロポエ
チンが治療的に有効であると証明されたことはない。
【０００４】エリトロポエチンをコードする遺伝子の同
定、クローニング及び発現は、Linの米国特許第 4,703,
008号明細書に記載されている。該特許の記載内容は本
明細書に含まれるものとする。 Laiらの米国特許第 4,6
67,016号明細書は、細胞培地から組換えエリトロポエチ
ンを精製する方法に関する記載を含んでいる。組換えプ
ラスミド上のエリトロポエチン遺伝子を含む哺乳類宿主
細胞に生物活性組換えエリトロポエチンを発現させこれ
を回収することによって、治療用途に適した量のエリト
ロポエチンが初めて入手可能になった。更に、遺伝子配
列が解明され、精製タンパク質をより多量に入手するこ
とが可能になったので、このタンパク質の作用機序もい
っそうよく判ってきた。
定、クローニング及び発現は、Linの米国特許第 4,703,
008号明細書に記載されている。該特許の記載内容は本
明細書に含まれるものとする。 Laiらの米国特許第 4,6
67,016号明細書は、細胞培地から組換えエリトロポエチ
ンを精製する方法に関する記載を含んでいる。組換えプ
ラスミド上のエリトロポエチン遺伝子を含む哺乳類宿主
細胞に生物活性組換えエリトロポエチンを発現させこれ
を回収することによって、治療用途に適した量のエリト
ロポエチンが初めて入手可能になった。更に、遺伝子配
列が解明され、精製タンパク質をより多量に入手するこ
とが可能になったので、このタンパク質の作用機序もい
っそうよく判ってきた。
【０００５】真核細胞によって産生される多くの細胞表
面タンパク質及び分泌タンパク質は１つまたはそれ以上
のオリゴ糖基によって修飾される。グリコシレーション
と呼ばれるこの修飾は、タンパク質の物性に著明な影響
を与え、また、タンパク質の安定、分泌に重要であり、
タンパク質の細胞内局在(subcellular localization)に
も重要である。適正なグリコシレーションは生物活性に
不可欠である。実際、真核生物のある種の遺伝子は、細
胞性タンパク質グリコシレーションプロセスをもたない
細菌（例えば大腸菌）中で発現されたとき、タンパク質
を産生するが、このタンパク質は、グリコシレーション
欠如が原因で活性を殆どまたは全く有することなく回収
される。
面タンパク質及び分泌タンパク質は１つまたはそれ以上
のオリゴ糖基によって修飾される。グリコシレーション
と呼ばれるこの修飾は、タンパク質の物性に著明な影響
を与え、また、タンパク質の安定、分泌に重要であり、
タンパク質の細胞内局在(subcellular localization)に
も重要である。適正なグリコシレーションは生物活性に
不可欠である。実際、真核生物のある種の遺伝子は、細
胞性タンパク質グリコシレーションプロセスをもたない
細菌（例えば大腸菌）中で発現されたとき、タンパク質
を産生するが、このタンパク質は、グリコシレーション
欠如が原因で活性を殆どまたは全く有することなく回収
される。
【０００６】グリコシレーションは、ポリペプチド主鎖
に沿った特定位置に生じ、通常は２つの型、即ちＯ−結
合及びＮ−結合に分類される。配列 Asn-X-Ser/Thr (式
中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸を示し得る）の
一部を形成するとき、Ｏ−結合オリゴ糖はセリンまたは
トレオニン残基に結合し、Ｎ−結合オリゴ糖はアスパラ
ギン残基に結合する。Ｎ−結合オリゴ糖とＯ−結合オリ
ゴ糖との構造並びに各結合中で観察される糖残基は異な
っている。双方に共通に観察される１種類の糖はＮ−ア
セチルノイラミン酸（本文中では以後シアル酸と呼ぶ）
である。シアル酸は通常は、Ｎ−結合オリゴ糖及びＯ−
結合オリゴ糖の双方の末端残基であり、負電荷を有する
ことによって糖タンパク質に酸性を与え得る。
に沿った特定位置に生じ、通常は２つの型、即ちＯ−結
合及びＮ−結合に分類される。配列 Asn-X-Ser/Thr (式
中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸を示し得る）の
一部を形成するとき、Ｏ−結合オリゴ糖はセリンまたは
トレオニン残基に結合し、Ｎ−結合オリゴ糖はアスパラ
ギン残基に結合する。Ｎ−結合オリゴ糖とＯ−結合オリ
ゴ糖との構造並びに各結合中で観察される糖残基は異な
っている。双方に共通に観察される１種類の糖はＮ−ア
セチルノイラミン酸（本文中では以後シアル酸と呼ぶ）
である。シアル酸は通常は、Ｎ−結合オリゴ糖及びＯ−
結合オリゴ糖の双方の末端残基であり、負電荷を有する
ことによって糖タンパク質に酸性を与え得る。
【０００７】ヒト尿由来エリトロポエチン及びヒトエリ
トロポエチンのアミノ酸配列1-165を有する組換えエリ
トロポエチン（哺乳類細胞中で発現）の双方は、３つの
Ｎ−結合オリゴ糖鎖と１つのＯ−結合オリゴ糖鎖とを含
んでおり、これらの鎖は合計で糖タンパク質の総分子量
の約40％を構成している。Ｎ−結合糖タンパク質は、2
4、38及び83位のアスパラギン残基に生じ、Ｏ−結合糖
タンパク質は 126位のセリン残基に生じる(Laiら、J. B
iol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudyら、Arch.Bioche
m. Biophys. 265, 329 (1988))。オリゴ糖鎖は、末端シ
アル酸残基によって修飾されることが判明した。シアル
酸残基を完全に除去するためにグリコシル化エリトロポ
エチンを酵素処理すると、in vivo 活性は低下するがin
vitro活性は影響を受けない（Lowyら、Nature 185, 10
2 (1960); Goldwasserら、J. Biol. Chem. 249, 4202
(1974))。この挙動は、肝臓のアシアログリコプロテイ
ン結合タンパク質との相互作用によってアシアロエリト
ロポエチンが血流から速やかに除去されるためであると
説明されている（Morrell ら、J. Biol. Chem. 243,155
(1968); Briggsら、Am. J. Physiol. 227, 1385 (197
4); Ashwell ら、Methods Enzymol. 50, 287 (1978))。
従って、エリトロポエチンは、肝臓の結合タンパク質と
の結合を阻害するようにシアル化されたときにのみin v
ivo 生物活性を有している。
トロポエチンのアミノ酸配列1-165を有する組換えエリ
トロポエチン（哺乳類細胞中で発現）の双方は、３つの
Ｎ−結合オリゴ糖鎖と１つのＯ−結合オリゴ糖鎖とを含
んでおり、これらの鎖は合計で糖タンパク質の総分子量
の約40％を構成している。Ｎ−結合糖タンパク質は、2
4、38及び83位のアスパラギン残基に生じ、Ｏ−結合糖
タンパク質は 126位のセリン残基に生じる(Laiら、J. B
iol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudyら、Arch.Bioche
m. Biophys. 265, 329 (1988))。オリゴ糖鎖は、末端シ
アル酸残基によって修飾されることが判明した。シアル
酸残基を完全に除去するためにグリコシル化エリトロポ
エチンを酵素処理すると、in vivo 活性は低下するがin
vitro活性は影響を受けない（Lowyら、Nature 185, 10
2 (1960); Goldwasserら、J. Biol. Chem. 249, 4202
(1974))。この挙動は、肝臓のアシアログリコプロテイ
ン結合タンパク質との相互作用によってアシアロエリト
ロポエチンが血流から速やかに除去されるためであると
説明されている（Morrell ら、J. Biol. Chem. 243,155
(1968); Briggsら、Am. J. Physiol. 227, 1385 (197
4); Ashwell ら、Methods Enzymol. 50, 287 (1978))。
従って、エリトロポエチンは、肝臓の結合タンパク質と
の結合を阻害するようにシアル化されたときにのみin v
ivo 生物活性を有している。
【０００８】エリトロポエチンのオリゴ糖鎖中のその他
の成分の役割は十分には解明されていない。部分的に脱
グリコシル化されたエリトロポエチンはグリコシル化形
態に比較するとin vivo 活性が顕著に低下しているがin
vitro活性を維持していることが判明した（Dordalら、
Endocrinology 116, 2293 (1985); Lin 特許、前出）。
しかしながら別の研究によれば、グリコシレーション部
位であるアスパラギンまたはセリン残基の突然変異誘発
によってＮ−結合オリゴ糖鎖またはＯ−結合オリゴ糖鎖
を単独でまたは一緒に除去すると、哺乳類細胞中で産生
された変異エリトロポエチンのin vitro活性が急激に低
下する（Dubeら、J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988))
。
の成分の役割は十分には解明されていない。部分的に脱
グリコシル化されたエリトロポエチンはグリコシル化形
態に比較するとin vivo 活性が顕著に低下しているがin
vitro活性を維持していることが判明した（Dordalら、
Endocrinology 116, 2293 (1985); Lin 特許、前出）。
しかしながら別の研究によれば、グリコシレーション部
位であるアスパラギンまたはセリン残基の突然変異誘発
によってＮ−結合オリゴ糖鎖またはＯ−結合オリゴ糖鎖
を単独でまたは一緒に除去すると、哺乳類細胞中で産生
された変異エリトロポエチンのin vitro活性が急激に低
下する（Dubeら、J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988))
。
【０００９】エリトロポエチンのような糖タンパク質
は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）のような技術を用いて種
々の荷電形態に分離され得る。いくつかの研究グループ
は、粗エリトロポエチン調製物及び部分精製エリトロポ
エチン調製物のＩＥＦ試験を報告している（Lukowsky
ら、J. Biochem 50, 909 (1972); Sheltonら、 Bioche
m.Med. 12, 45 (1975); Fuhrは、Biochem. Biophys. Re
s. Comm. 98, 930 (1981))。これらの研究では、ＩＥＦ
によって識別されたエリトロポエチン活性分画はせいぜ
い３つか４つであり、どの分画も炭水化物含量に関する
特性は決定されなかった。更に、分画の等電点とそれら
の生物活性との相関関係も全く解明されなかった。
は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）のような技術を用いて種
々の荷電形態に分離され得る。いくつかの研究グループ
は、粗エリトロポエチン調製物及び部分精製エリトロポ
エチン調製物のＩＥＦ試験を報告している（Lukowsky
ら、J. Biochem 50, 909 (1972); Sheltonら、 Bioche
m.Med. 12, 45 (1975); Fuhrは、Biochem. Biophys. Re
s. Comm. 98, 930 (1981))。これらの研究では、ＩＥＦ
によって識別されたエリトロポエチン活性分画はせいぜ
い３つか４つであり、どの分画も炭水化物含量に関する
特性は決定されなかった。更に、分画の等電点とそれら
の生物活性との相関関係も全く解明されなかった。
【００１０】Miyakeら、前出、に記載されたヒト尿由来
の尿エリトロポエチンの精製中に、ヒドロキシルアパタ
イトクロマトグラフィーから得られた２つのエリトロポ
エチン分画、即ち分画II及び分画IIIAが同様の比活性を
有することが報告された。分画II及び分画IIIAに関する
その後の炭水化物分析では、分画IIが分画IIIAよりも大
きい平均シアル酸含量を有することが判明した（Dordal
ら、前出）。
の尿エリトロポエチンの精製中に、ヒドロキシルアパタ
イトクロマトグラフィーから得られた２つのエリトロポ
エチン分画、即ち分画II及び分画IIIAが同様の比活性を
有することが報告された。分画II及び分画IIIAに関する
その後の炭水化物分析では、分画IIが分画IIIAよりも大
きい平均シアル酸含量を有することが判明した（Dordal
ら、前出）。
【００１１】本発明の１つの目的は、所定のシアル酸含
量及び生物活性を有するエリトロポエチンの分離及び単
離されたイソ形（isoform)を提供することである。かか
る分子を含有する医薬組成物は治療的にも有益であろ
う。
量及び生物活性を有するエリトロポエチンの分離及び単
離されたイソ形（isoform)を提供することである。かか
る分子を含有する医薬組成物は治療的にも有益であろ
う。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、少なくとも１
つの付加的グリコシレーション部位を含むアミノ酸配列
から成るヒトエリトロポエチン類似体に関する。詳しく
は、本発明は、ヒトエリトロポエチンのマチュアなアミ
ノ酸配列の３０、５１、５７、６９、８９、１３６又は
１３８位のいずれかの位置のアミノ酸残基がアスパラギ
ン残基で置換された少なくとも１つのグリコシレーショ
ン部位を含み、この部位に炭水化物鎖が結合しており、
かつ８８位のアミノ酸残基がアスパラギン残基で置換さ
れていないことを特徴とする、エリトロポエチン活性を
有するヒトエリトロポエチン類似体を提供する。
つの付加的グリコシレーション部位を含むアミノ酸配列
から成るヒトエリトロポエチン類似体に関する。詳しく
は、本発明は、ヒトエリトロポエチンのマチュアなアミ
ノ酸配列の３０、５１、５７、６９、８９、１３６又は
１３８位のいずれかの位置のアミノ酸残基がアスパラギ
ン残基で置換された少なくとも１つのグリコシレーショ
ン部位を含み、この部位に炭水化物鎖が結合しており、
かつ８８位のアミノ酸残基がアスパラギン残基で置換さ
れていないことを特徴とする、エリトロポエチン活性を
有するヒトエリトロポエチン類似体を提供する。
【００１３】本発明の類似体は、前記活性に影響を及ぼ
さない1個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加からな
る他の変異を含むことができる。具体的には、以下の類
似体を例示することができる。すなわち、 [Ａｓｎ30Ｔ
ｈｒ32]ＥＰＯ； [Ａｓｎ51Ｔｈｒ53]ＥＰＯ； [Ａｓｎ
57Ｔｈｒ59]ＥＰＯ； [Ａｓｎ89Ｉｌｅ90Ｔｈｒ91]ＥＰ
Ｏ； [Ｓｅｒ87Ａｓｎ89Ｉｌｅ90Ｔｈｒ91]ＥＰＯ；
[Ａｓｎ136Ｔｈｒ138]ＥＰＯ；及び [Ａｓｎ138Ｔｈｒ
140]ＥＰＯ。
さない1個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加からな
る他の変異を含むことができる。具体的には、以下の類
似体を例示することができる。すなわち、 [Ａｓｎ30Ｔ
ｈｒ32]ＥＰＯ； [Ａｓｎ51Ｔｈｒ53]ＥＰＯ； [Ａｓｎ
57Ｔｈｒ59]ＥＰＯ； [Ａｓｎ89Ｉｌｅ90Ｔｈｒ91]ＥＰ
Ｏ； [Ｓｅｒ87Ａｓｎ89Ｉｌｅ90Ｔｈｒ91]ＥＰＯ；
[Ａｓｎ136Ｔｈｒ138]ＥＰＯ；及び [Ａｓｎ138Ｔｈｒ
140]ＥＰＯ。
【００１４】本発明の類似体は、グリコシレーション部
位が付加された結果として、ヒトエリトロポエチンより
も多い数の炭水化物鎖を有し高いシアル酸含量を有する
ことができる。本発明はまた、少なくとも１つのグリコ
シレーション部位の転位を含むアミノ酸配列から成り、
88位のアミノ酸残基がアスパラギン残基で置換されてい
ないヒトエリトロポエチン類似体を提供する。また、ヒ
トエリトロポエチンのカルボキシ末端に１つまたはそれ
以上のアミノ酸から成りかつ少なくとも１つのグリコシ
レーション部位を有する付加体を含み、88位のアミノ酸
残基がアスパラギン残基で置換されていないヒトエリト
ロポエチン類似体も包含する。付加体の例は、ヒト絨毛
性ゴナドトロピンのカルボキシル末端由来のペプチドフ
ラグメントであり、特にアミノ酸配列がSer-Ser-Ser-Se
r-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-
Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Glnを
有するペプチドフラグメントである。また、転位は、ヒ
トエリトロポエチンの本来のＮ−結合炭水化物部位のい
ずれかの欠失、及び、前記部位と異なる位置へのＮ−結
合炭水化物部位の付加から成ることを包含する。
位が付加された結果として、ヒトエリトロポエチンより
も多い数の炭水化物鎖を有し高いシアル酸含量を有する
ことができる。本発明はまた、少なくとも１つのグリコ
シレーション部位の転位を含むアミノ酸配列から成り、
88位のアミノ酸残基がアスパラギン残基で置換されてい
ないヒトエリトロポエチン類似体を提供する。また、ヒ
トエリトロポエチンのカルボキシ末端に１つまたはそれ
以上のアミノ酸から成りかつ少なくとも１つのグリコシ
レーション部位を有する付加体を含み、88位のアミノ酸
残基がアスパラギン残基で置換されていないヒトエリト
ロポエチン類似体も包含する。付加体の例は、ヒト絨毛
性ゴナドトロピンのカルボキシル末端由来のペプチドフ
ラグメントであり、特にアミノ酸配列がSer-Ser-Ser-Se
r-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-
Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Glnを
有するペプチドフラグメントである。また、転位は、ヒ
トエリトロポエチンの本来のＮ−結合炭水化物部位のい
ずれかの欠失、及び、前記部位と異なる位置へのＮ−結
合炭水化物部位の付加から成ることを包含する。
【００１５】本発明はさらに、上記のエリトロポエチン
類似体をコードするＤＮＡ、並びに、該類似体を発現さ
せる宿主細胞を包含する。本発明はさらにまた、治療有
効量の上記定義のエリトロポエチン類似体を医薬として
許容される希釈剤、アジュバント又は担体と共に含む、
赤血球細胞の産生を増進するための医薬組成物を提供す
る。
類似体をコードするＤＮＡ、並びに、該類似体を発現さ
せる宿主細胞を包含する。本発明はさらにまた、治療有
効量の上記定義のエリトロポエチン類似体を医薬として
許容される希釈剤、アジュバント又は担体と共に含む、
赤血球細胞の産生を増進するための医薬組成物を提供す
る。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明はエリトロポエチンのイソ
形を提供する。本発明によって得られる特定のエリトロ
ポエチンイソ形及びそれらの特性は、出発物質のソース
次第で様々に異なるであろう。例えば、尿由来ヒトエリ
トロポエチンイソ形は、組換えエリトロポエチンイソ形
と比べて異なる。好ましい実施態様において、本発明
は、エリトロポエチン１分子あたり１〜14から成るグル
ープから選択された特定数（即ち０より大きい所定数）
のシアル酸を有するエリトロポエチンイソ形に関する。
好ましい数は９、10、11、12、13または14である。別の
実施態様においては、この数は14よりも大きく、好まし
くは16〜23である。
形を提供する。本発明によって得られる特定のエリトロ
ポエチンイソ形及びそれらの特性は、出発物質のソース
次第で様々に異なるであろう。例えば、尿由来ヒトエリ
トロポエチンイソ形は、組換えエリトロポエチンイソ形
と比べて異なる。好ましい実施態様において、本発明
は、エリトロポエチン１分子あたり１〜14から成るグル
ープから選択された特定数（即ち０より大きい所定数）
のシアル酸を有するエリトロポエチンイソ形に関する。
好ましい数は９、10、11、12、13または14である。別の
実施態様においては、この数は14よりも大きく、好まし
くは16〜23である。
【００１７】本明細書中で使用される「エリトロポエチ
ンイソ形」なる用語は、単一等電点（pI) を有し且つ同
じアミノ酸配列を有するエリトロポエチン調製物を意味
する。本明細書中で使用される「エリトロポエチン」な
る用語は、天然エリトロポエチン、尿由来ヒトエリトロ
ポエチン、及び、天然エリトロポエチンに十分類似した
アミノ酸配列及びグリコシレーションを有しており骨髄
細胞による網状赤血球及び赤血球細胞の産生を増進する
in vivo 生物特性を有している非天然ポリペプチドを意
味する。
ンイソ形」なる用語は、単一等電点（pI) を有し且つ同
じアミノ酸配列を有するエリトロポエチン調製物を意味
する。本明細書中で使用される「エリトロポエチン」な
る用語は、天然エリトロポエチン、尿由来ヒトエリトロ
ポエチン、及び、天然エリトロポエチンに十分類似した
アミノ酸配列及びグリコシレーションを有しており骨髄
細胞による網状赤血球及び赤血球細胞の産生を増進する
in vivo 生物特性を有している非天然ポリペプチドを意
味する。
【００１８】尿由来ヒトエリトロポエチンのアミノ酸配
列を有する組換えエリトロポエチンの個別のイソ形は１
〜14個のシアル酸を有するエリトロポエチン分子に対応
していること、及び、精製された組換えエリトロポエチ
ン中に存在するイソ形の各々は該イソ形が有しているシ
アル酸の数に関連したin vivo 活性を有していることが
知見された。
列を有する組換えエリトロポエチンの個別のイソ形は１
〜14個のシアル酸を有するエリトロポエチン分子に対応
していること、及び、精製された組換えエリトロポエチ
ン中に存在するイソ形の各々は該イソ形が有しているシ
アル酸の数に関連したin vivo 活性を有していることが
知見された。
【００１９】好ましい実施態様において、エリトロポエ
チンは、ヒト以外の真核宿主細胞にトランスフェクトさ
れた外因性ＤＮＡ配列の発現産物である。即ち、好まし
い実施態様において、エリトロポエチンは、「組換えエ
リトロポエチン」である。組換えエリトロポエチンは、
参照によって本明細書に含まれる Lin名義の米国特許第
4,703,008号明細書に記載の手順に従って有利に産生さ
れる。組換えエリトロポエチンは、参考として本明細書
に含まれる Laiら名義の米国特許第 4,667,016号明細書
の実施例２に記載の汎用手順に従って精製されるか、ま
たは、 Laiらの実施例２に記載の手順を修正しDEAE−ア
ガロースクロマトグラフィーに代えてＱ−セファロース
クロマトグラフィーを用いる処理によって精製され得
る。
チンは、ヒト以外の真核宿主細胞にトランスフェクトさ
れた外因性ＤＮＡ配列の発現産物である。即ち、好まし
い実施態様において、エリトロポエチンは、「組換えエ
リトロポエチン」である。組換えエリトロポエチンは、
参照によって本明細書に含まれる Lin名義の米国特許第
4,703,008号明細書に記載の手順に従って有利に産生さ
れる。組換えエリトロポエチンは、参考として本明細書
に含まれる Laiら名義の米国特許第 4,667,016号明細書
の実施例２に記載の汎用手順に従って精製されるか、ま
たは、 Laiらの実施例２に記載の手順を修正しDEAE−ア
ガロースクロマトグラフィーに代えてＱ−セファロース
クロマトグラフィーを用いる処理によって精製され得
る。
【００２０】Lai ら、前出、の実施例２に従って精製さ
れたエリトロポエチンは、ＩＥＦによって分析すると主
として６つのイソ形を含んでいる。更に、実施例４に記
載のクロマトグラフィー手順を用いて、より高い酸性度
を有する少なくとも１つの追加のイソ形が検出された。
(ＩＥＦゲル上で＞14シアル酸に泳動するより高度に酸
性のこのイソ形は、ある種の電荷がシアリダーゼ消化に
対して耐性を示すので非シアル酸負電荷を含んでいるで
あろう）。これらのイソ形の相互間の違いはシアル酸含
有の違いに基づく。このことは、実施例に示すように、
10個のイソ形を分取用ＩＥＦによって単離し、そのうち
の５つのイソ形のシアル酸含有を測定することによって
証明される。シアル酸含有を検定したイソ形のうちの５
つのイソ形が９、10、11、12または13個のシアル酸残基
を含むことが知見された。
れたエリトロポエチンは、ＩＥＦによって分析すると主
として６つのイソ形を含んでいる。更に、実施例４に記
載のクロマトグラフィー手順を用いて、より高い酸性度
を有する少なくとも１つの追加のイソ形が検出された。
(ＩＥＦゲル上で＞14シアル酸に泳動するより高度に酸
性のこのイソ形は、ある種の電荷がシアリダーゼ消化に
対して耐性を示すので非シアル酸負電荷を含んでいるで
あろう）。これらのイソ形の相互間の違いはシアル酸含
有の違いに基づく。このことは、実施例に示すように、
10個のイソ形を分取用ＩＥＦによって単離し、そのうち
の５つのイソ形のシアル酸含有を測定することによって
証明される。シアル酸含有を検定したイソ形のうちの５
つのイソ形が９、10、11、12または13個のシアル酸残基
を含むことが知見された。
【００２１】エリトロポエチンの相対in vivo 比活性と
イソ形５〜11のエリトロポエチン１分子あたりのシアル
酸残基の数との間には関係がある（本明細書では各イソ
形をエリトロポエチン分子あたりのシアル酸の数に基づ
いて命名する）。イソ形11〜14は、ほぼ等しい相対的in
vivo 比活性を有している。イソ形５〜14のin vivo活
性を、低酸素症でない（exhypoxic)赤血球増加症マウス
のバイオアッセイによって検定し、各イソ形の存在量を
Bradfordタンパク質アッセイ、280nm の吸光度またはエ
リトロポエチン用ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によ
って測定する。単位／mlで示されるＲＩＡの測定値(Egr
ieら、Immonobiology 172, 213 (1986))を、ＲＩＡによ
って測定された精製エリトロポエチンの平均比活性即ち
212,770単位／mgエリトロポエチンポリペプチドによっ
て除算すると、単離イソ形またはイソ形混合物のタンパ
ク質濃度が、１mlあたりのエリトロポエチンポリペプチ
ドのmgとして得られる。実施例に示すように、相対的in
vivo 比活性は、イソ形５からイソ形11まで段階的に増
加する（表２）。
イソ形５〜11のエリトロポエチン１分子あたりのシアル
酸残基の数との間には関係がある（本明細書では各イソ
形をエリトロポエチン分子あたりのシアル酸の数に基づ
いて命名する）。イソ形11〜14は、ほぼ等しい相対的in
vivo 比活性を有している。イソ形５〜14のin vivo活
性を、低酸素症でない（exhypoxic)赤血球増加症マウス
のバイオアッセイによって検定し、各イソ形の存在量を
Bradfordタンパク質アッセイ、280nm の吸光度またはエ
リトロポエチン用ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によ
って測定する。単位／mlで示されるＲＩＡの測定値(Egr
ieら、Immonobiology 172, 213 (1986))を、ＲＩＡによ
って測定された精製エリトロポエチンの平均比活性即ち
212,770単位／mgエリトロポエチンポリペプチドによっ
て除算すると、単離イソ形またはイソ形混合物のタンパ
ク質濃度が、１mlあたりのエリトロポエチンポリペプチ
ドのmgとして得られる。実施例に示すように、相対的in
vivo 比活性は、イソ形５からイソ形11まで段階的に増
加する（表２）。
【００２２】本明細書中のin vivo 比活性なる用語は、
相対的in vivo 比活性の測定値を意味しており、絶対的
in vivo 比活性の測定値を意味しない。本明細書では、
同じアッセイを使用し、同じ内部標準も含めた同じ条件
及び同じ種類の動物を使用し、比活性の計算に同じデー
タ分析を使用し、同じタンパク質含量測定アッセイを使
用して検定されたイソ形の相対的活性を比較するために
のみ比活性を使用する。任意のイソ形について報告され
たin vivo 比活性は該イソ形の固有値即ち絶対的な値を
示すものではない。
相対的in vivo 比活性の測定値を意味しており、絶対的
in vivo 比活性の測定値を意味しない。本明細書では、
同じアッセイを使用し、同じ内部標準も含めた同じ条件
及び同じ種類の動物を使用し、比活性の計算に同じデー
タ分析を使用し、同じタンパク質含量測定アッセイを使
用して検定されたイソ形の相対的活性を比較するために
のみ比活性を使用する。任意のイソ形について報告され
たin vivo 比活性は該イソ形の固有値即ち絶対的な値を
示すものではない。
【００２３】本発明はまた、２種以上のエリトロポエチ
ンイソ形から成る組成物を提供する。１つの実施態様で
は、組成物が、エリトロポエチン１分子あたり所定数よ
りも多いシアル酸、例えばエリトロポエチン１分子あた
り11よりも多いシアル酸、または１分子あたり12よりも
多いシアル酸を有するイソ形の混合物、例えばイソ形1
2、13及び14の混合物から成る。別の実施態様では、組
成物が、エリトロポエチン１分子あたり所定数、例えば
１分子あたり９以上12未満のシアル酸を有するイソ形の
混合物、例えばイソ形９、10及び11の混合物から成る。
本発明はまた、イソ形を同じ相対量または異なる相対量
で含むエリトロポエチンイソ形の組成物を提供する。例
えば、イソ形９、10及び11の混合物には、これらのイソ
形が１：１：１、２：３：１または20：20：１のような
種々の割合で存在し得る。
ンイソ形から成る組成物を提供する。１つの実施態様で
は、組成物が、エリトロポエチン１分子あたり所定数よ
りも多いシアル酸、例えばエリトロポエチン１分子あた
り11よりも多いシアル酸、または１分子あたり12よりも
多いシアル酸を有するイソ形の混合物、例えばイソ形1
2、13及び14の混合物から成る。別の実施態様では、組
成物が、エリトロポエチン１分子あたり所定数、例えば
１分子あたり９以上12未満のシアル酸を有するイソ形の
混合物、例えばイソ形９、10及び11の混合物から成る。
本発明はまた、イソ形を同じ相対量または異なる相対量
で含むエリトロポエチンイソ形の組成物を提供する。例
えば、イソ形９、10及び11の混合物には、これらのイソ
形が１：１：１、２：３：１または20：20：１のような
種々の割合で存在し得る。
【００２４】好ましくは、組成物が、４種未満のイソ形
の混合物、例えばイソ形11、12及び13の混合物、または
12と14との混合物、または７と13との混合物から成る。
本発明はまた、エリトロポエチンイソ形の混合物を産生
するために、選択されたエリトロポエチンイソ形を同時
に単離する方法を提供する。これらの方法は、分取用等
電点電気泳動のような技術による個々のイソ形の単離、
またはイオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点ク
ロマトグラフィーのような技術による１分子あたり所定
数（例えば11よりも多い数）のシアル酸を有するイソ形
の混合物の調製を含む。これらの技術はすべて、電荷に
よるタンパク質の分離に基づく技術である。
の混合物、例えばイソ形11、12及び13の混合物、または
12と14との混合物、または７と13との混合物から成る。
本発明はまた、エリトロポエチンイソ形の混合物を産生
するために、選択されたエリトロポエチンイソ形を同時
に単離する方法を提供する。これらの方法は、分取用等
電点電気泳動のような技術による個々のイソ形の単離、
またはイオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点ク
ロマトグラフィーのような技術による１分子あたり所定
数（例えば11よりも多い数）のシアル酸を有するイソ形
の混合物の調製を含む。これらの技術はすべて、電荷に
よるタンパク質の分離に基づく技術である。
【００２５】概して、イオン交換クロマトグラフィー及
び等電点クロマトグラフィーでは、粗ヒトエリトロポエ
チン（細胞馴化培地）または精製物質を、エリトロポエ
チンイソ形の一部または全部が樹脂に結合し得る条件下
で使用する。粗エリトロポエチン調製物の場合は、pH約
７のカラムにタンパク質を添加するのが好ましく、精製
調製物の場合はpH７以下約pH４までのカラムにタンパク
質を添加し得る。pH約４の緩衝液でカラムを洗浄後、緩
衝液のpH及び塩濃度を増加させるかまたは漸減pH及びpH
約４の漸増イオン強度の勾配を使用することによって、
イオン交換カラムに結合したエリトロポエチンイソ形を
溶出させる。等電点クロマトグラフィーの場合は、漸減
pHの勾配を用いるかまたはカラム高濃度の塩で洗浄する
ことによってカラムからイソ形を溶出させる。
び等電点クロマトグラフィーでは、粗ヒトエリトロポエ
チン（細胞馴化培地）または精製物質を、エリトロポエ
チンイソ形の一部または全部が樹脂に結合し得る条件下
で使用する。粗エリトロポエチン調製物の場合は、pH約
７のカラムにタンパク質を添加するのが好ましく、精製
調製物の場合はpH７以下約pH４までのカラムにタンパク
質を添加し得る。pH約４の緩衝液でカラムを洗浄後、緩
衝液のpH及び塩濃度を増加させるかまたは漸減pH及びpH
約４の漸増イオン強度の勾配を使用することによって、
イオン交換カラムに結合したエリトロポエチンイソ形を
溶出させる。等電点クロマトグラフィーの場合は、漸減
pHの勾配を用いるかまたはカラム高濃度の塩で洗浄する
ことによってカラムからイソ形を溶出させる。
【００２６】好ましい実施態様では、イオン交換クロマ
トグラフィーを用いて個々のイソ形を単離する。一例と
して、実施例８に記載のようなイオン交換クロマトグラ
フィーを用いてイソ形14を単離した。また、ヒトエリト
ロポエチンのいくつかの類似体も本発明に包含される。
本明細書中で使用される「ヒトエリトロポエチン類似
体」なる表現は、ヒトエリトロポエチンのアミノ酸配列
中に１つまたはそれ以上の変異を有しその結果としてシ
アル酸結合部位の数が増加したエリトロポエチンを意味
する。類似体は、グリコシレーション可能な部位を増加
させるかまたは変異させるアミノ酸残基の付加、欠失ま
たは置換を有する部位特異的突然変異誘発によって作製
される。このような類似体は、ヒトエリトロポエチンよ
りも多い数の炭水化物鎖を有し得る。
トグラフィーを用いて個々のイソ形を単離する。一例と
して、実施例８に記載のようなイオン交換クロマトグラ
フィーを用いてイソ形14を単離した。また、ヒトエリト
ロポエチンのいくつかの類似体も本発明に包含される。
本明細書中で使用される「ヒトエリトロポエチン類似
体」なる表現は、ヒトエリトロポエチンのアミノ酸配列
中に１つまたはそれ以上の変異を有しその結果としてシ
アル酸結合部位の数が増加したエリトロポエチンを意味
する。類似体は、グリコシレーション可能な部位を増加
させるかまたは変異させるアミノ酸残基の付加、欠失ま
たは置換を有する部位特異的突然変異誘発によって作製
される。このような類似体は、ヒトエリトロポエチンよ
りも多い数の炭水化物鎖を有し得る。
【００２７】本発明のエリトロポエチン類似体は、少な
くとも１つの付加的グリコシレーション部位を含むアミ
ノ酸配列から成る。ヒトエリトロポエチン中で観察され
るレベルを上回るシアル酸レベルを有する類似体は、生
物活性に必要な二次または三次コンホメーションを妨害
しないグリコシレーション部位を付加することによって
作製される。好ましくは、ヒトエリトロポエチン類似体
は、１、２または３個の付加的なＮ−グリコシレーショ
ン部位またはＯ−グリコシレーション部位を有してお
り、１、２または３個の付加的なＮ−結合またはＯ−結
合炭水化物鎖が付加される。例えば、69位のロイシンを
アスパラギンで置換すると、配列Asn-Leu-Ser が形成さ
れ、これは第４のＮ−グリコシレーション部位として作
用する。このような変異は通常は１分子あたり４個以下
の付加的シアル酸を提供し得る。付加的Ｏ−グリコシレ
ーション部位を生じさせる変異の例は、 125位のアラニ
ンからトレオニン、 124位及び 125位の夫々のアラニン
からプロリン及びトレオニンへの変異である。１つまた
はそれ以上の付加的Ｎ−結合及びＯ−結合鎖を有する類
似体、例えば表５に記載の類似体NO1 及びNO2 を構築し
てもよい。当業者には明らかであろうが、本発明は付加
的グリコシレーション部位を有するヒトエリトロポエチ
ンの他の多くの類似体を包含する。
くとも１つの付加的グリコシレーション部位を含むアミ
ノ酸配列から成る。ヒトエリトロポエチン中で観察され
るレベルを上回るシアル酸レベルを有する類似体は、生
物活性に必要な二次または三次コンホメーションを妨害
しないグリコシレーション部位を付加することによって
作製される。好ましくは、ヒトエリトロポエチン類似体
は、１、２または３個の付加的なＮ−グリコシレーショ
ン部位またはＯ−グリコシレーション部位を有してお
り、１、２または３個の付加的なＮ−結合またはＯ−結
合炭水化物鎖が付加される。例えば、69位のロイシンを
アスパラギンで置換すると、配列Asn-Leu-Ser が形成さ
れ、これは第４のＮ−グリコシレーション部位として作
用する。このような変異は通常は１分子あたり４個以下
の付加的シアル酸を提供し得る。付加的Ｏ−グリコシレ
ーション部位を生じさせる変異の例は、 125位のアラニ
ンからトレオニン、 124位及び 125位の夫々のアラニン
からプロリン及びトレオニンへの変異である。１つまた
はそれ以上の付加的Ｎ−結合及びＯ−結合鎖を有する類
似体、例えば表５に記載の類似体NO1 及びNO2 を構築し
てもよい。当業者には明らかであろうが、本発明は付加
的グリコシレーション部位を有するヒトエリトロポエチ
ンの他の多くの類似体を包含する。
【００２８】グリコシレーション部位に増加した炭水化
物結合レベルを有する類似体も本発明に包含される。こ
のような類似体は通常、Ｎ−結合またはＯ−結合部位の
極めて近傍に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含
む。これらのアミノ酸変異の結果として、炭水化物修飾
を有するエリトロポエチンポリペプチドの割合が増加し
ているであろう。グリコシレーション部位は天然産生で
もよくまたは突然変異によって生じてもよい。例えば、
類似体N13 は、88位にグリコシレーション部位が導入さ
れても付加的炭水化物鎖を生じない。しかしながら、87
位に置換セリン残基及び置換バリン残基を夫々有する類
似体N14 及びN18 は、88位に付加的炭水化物鎖を有して
いる。
物結合レベルを有する類似体も本発明に包含される。こ
のような類似体は通常、Ｎ−結合またはＯ−結合部位の
極めて近傍に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含
む。これらのアミノ酸変異の結果として、炭水化物修飾
を有するエリトロポエチンポリペプチドの割合が増加し
ているであろう。グリコシレーション部位は天然産生で
もよくまたは突然変異によって生じてもよい。例えば、
類似体N13 は、88位にグリコシレーション部位が導入さ
れても付加的炭水化物鎖を生じない。しかしながら、87
位に置換セリン残基及び置換バリン残基を夫々有する類
似体N14 及びN18 は、88位に付加的炭水化物鎖を有して
いる。
【００２９】本発明はまた、エリトロポエチンのカルボ
キシ末端から延長する１つまたはそれ以上のアミノ酸を
有しカルボキシ末端延長部が少なくとも１つの付加的炭
水化物部位を与える類似体を提供する。１つの実施態様
では、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）のカルボキ
シ末端の28個のアミノ酸をヒトエリトロポエチンの 166
のアルギニン残基に融合させることによって類似体を構
築した。ＨＣＧ−カルボキシ末端フラグメントは４つの
Ｏ−グリコシレーション部位を有している（Kessler
ら、J. Biol. Chem. 254, 7907 (1979))。
キシ末端から延長する１つまたはそれ以上のアミノ酸を
有しカルボキシ末端延長部が少なくとも１つの付加的炭
水化物部位を与える類似体を提供する。１つの実施態様
では、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）のカルボキ
シ末端の28個のアミノ酸をヒトエリトロポエチンの 166
のアルギニン残基に融合させることによって類似体を構
築した。ＨＣＧ−カルボキシ末端フラグメントは４つの
Ｏ−グリコシレーション部位を有している（Kessler
ら、J. Biol. Chem. 254, 7907 (1979))。
【００３０】表３、表４及び表５は、付加的なＮ−結合
及び／またはＯ−結合炭水化物鎖部位を有するエリトロ
ポエチン類似体の一覧である。類似体は、Ｎ−結合部位
を生じるようにヒトエリトロポエチンポリペプチド鎖中
の種々の位置で置換されたAsn-X-Ser/Thr 配列を有して
いるかまたはＯ−結合部位を生じるように導入されたセ
リンもしくはトレオニン残基を有している。
及び／またはＯ−結合炭水化物鎖部位を有するエリトロ
ポエチン類似体の一覧である。類似体は、Ｎ−結合部位
を生じるようにヒトエリトロポエチンポリペプチド鎖中
の種々の位置で置換されたAsn-X-Ser/Thr 配列を有して
いるかまたはＯ−結合部位を生じるように導入されたセ
リンもしくはトレオニン残基を有している。
【００３１】表６は、ＳＤＳゲル上の糖タンパク質の泳
動によって証明されるように（実施例７）、少なくとも
１つの付加的なＮ−結合もしくは１つの付加的なＯ−結
合炭水化物鎖が付加されているか、または付加的なＮ−
結合及びＯ−結合鎖が同時に付加されている類似体の一
覧である。表３〜６から明らかなように、１つ以上の付
加的な炭水化物結合部位を有する類似体が必ずしも付加
的な炭水化物鎖を有するエリトロポエチン分子になると
は限らない。例えば、 123位及び125 位のトレオニン残
基の置換の結果としてはＯ−結合炭水化物鎖が付加され
るが、その他の位置のセリンまたはトレオニンの置換は
付加的なＯ−結合鎖を有する類似体を生じない（表４参
照）。しかしながら、ヒトエリトロポエチンアミノ酸配
列中の30、51、57、69、88、89、136 及び138 位のアス
パラギン残基の置換の結果としては、これらの部位にＮ
−結合鎖が付加される。ＨＣＧポリペプチドフラグメン
トをヒトエリトロポエチンの 166位のアルギニン残基に
融合させると、少なくとも２つの付加的Ｏ−結合炭水化
物鎖を有するエリトロポエチン−ＨＣＧ融合分子が得ら
れる。
動によって証明されるように（実施例７）、少なくとも
１つの付加的なＮ−結合もしくは１つの付加的なＯ−結
合炭水化物鎖が付加されているか、または付加的なＮ−
結合及びＯ−結合鎖が同時に付加されている類似体の一
覧である。表３〜６から明らかなように、１つ以上の付
加的な炭水化物結合部位を有する類似体が必ずしも付加
的な炭水化物鎖を有するエリトロポエチン分子になると
は限らない。例えば、 123位及び125 位のトレオニン残
基の置換の結果としてはＯ−結合炭水化物鎖が付加され
るが、その他の位置のセリンまたはトレオニンの置換は
付加的なＯ−結合鎖を有する類似体を生じない（表４参
照）。しかしながら、ヒトエリトロポエチンアミノ酸配
列中の30、51、57、69、88、89、136 及び138 位のアス
パラギン残基の置換の結果としては、これらの部位にＮ
−結合鎖が付加される。ＨＣＧポリペプチドフラグメン
トをヒトエリトロポエチンの 166位のアルギニン残基に
融合させると、少なくとも２つの付加的Ｏ−結合炭水化
物鎖を有するエリトロポエチン−ＨＣＧ融合分子が得ら
れる。
【００３２】本発明のエリトロポエチン類似体はまた、
少なくとも１つのグリコシレーション部位の転位を含む
アミノ酸配列を有するエリトロポエチンを含有する。本
明細書中で使用されるグリコシレーション部位の転位
（rearrangement)という表現は、ヒトエリトロポエチン
中の１つまたはそれ以上のグリコシレーション部位の欠
失及び１つまたはそれ以上の非天然グリコシレーション
部位の付加を意味する。類似体R1、R2及びR3は、かかる
転位の例であり、夫々24、38または83位のＮ−結合部位
の欠失及び88位のＮ−結合部位の付加によって構築され
た。しかしながら、その他の多数種の炭水化物部位の転
位が可能であり、得られる類似体は、ヒトエリトロポエ
チンに比べて増加した数のグリコシレーション部位を有
していてもよく有していなくてもよい。
少なくとも１つのグリコシレーション部位の転位を含む
アミノ酸配列を有するエリトロポエチンを含有する。本
明細書中で使用されるグリコシレーション部位の転位
（rearrangement)という表現は、ヒトエリトロポエチン
中の１つまたはそれ以上のグリコシレーション部位の欠
失及び１つまたはそれ以上の非天然グリコシレーション
部位の付加を意味する。類似体R1、R2及びR3は、かかる
転位の例であり、夫々24、38または83位のＮ−結合部位
の欠失及び88位のＮ−結合部位の付加によって構築され
た。しかしながら、その他の多数種の炭水化物部位の転
位が可能であり、得られる類似体は、ヒトエリトロポエ
チンに比べて増加した数のグリコシレーション部位を有
していてもよく有していなくてもよい。
【００３３】類似体R1、R2及びR3のin vivo 生物活性を
分析し、結果を表７に示す。Asn88にＮ−結合鎖を導入
すると、生物活性は、３つの天然産生Ｎ−結合部位のい
ずれかが欠失したエリトロポエチンまで回復した。これ
らの結果は、生物活性に有意な影響を与えることなく有
用な類似体を作製するために、エリトロポエチン中の炭
水化物鎖の位置を変更してもよいことを示す。
分析し、結果を表７に示す。Asn88にＮ−結合鎖を導入
すると、生物活性は、３つの天然産生Ｎ−結合部位のい
ずれかが欠失したエリトロポエチンまで回復した。これ
らの結果は、生物活性に有意な影響を与えることなく有
用な類似体を作製するために、エリトロポエチン中の炭
水化物鎖の位置を変更してもよいことを示す。
【００３４】また、付加的なＮ−結合及び／またはＯ−
結合鎖部位を有するエリトロポエチン類似体、少なくと
も１つの炭水化物鎖結合部位の転位を有する類似体エリ
トロポエチンのカルボキシ末端から延長する１つまたは
それ以上のアミノ酸を有する類似体をコードするＤＮＡ
配列も本発明に包含される。炭水化物結合部位を生成さ
せ変異させる目的でヒトエリトロポエチンＤＮＡ配列中
に変異を導入する手順は実施例６に開示されている。
結合鎖部位を有するエリトロポエチン類似体、少なくと
も１つの炭水化物鎖結合部位の転位を有する類似体エリ
トロポエチンのカルボキシ末端から延長する１つまたは
それ以上のアミノ酸を有する類似体をコードするＤＮＡ
配列も本発明に包含される。炭水化物結合部位を生成さ
せ変異させる目的でヒトエリトロポエチンＤＮＡ配列中
に変異を導入する手順は実施例６に開示されている。
【００３５】これらのエリトロポエチン類似体は、組換
えＤＮＡ技術によって産生された外因性ＤＮＡ配列の発
現産物でもよく、または合成産物でもよい。外因性ＤＮ
Ａ配列としては、エリトロポエチン類似体をコードする
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは化学合成ＤＮＡがある。
これらの類似体の発現に有用な組換えＤＮＡプラスミド
及び真核性宿主細胞も提供される。発現ベクターとして
は、クローニングされたＤＮＡ配列を真核性宿主細胞中
で発現させ得る任意のベクター、特にＣＯＳ及びＣＨＯ
細胞中で発現させるために使用されるベクターがある。
かかるベクターの例としては、本明細書の実施例６に記
載のプラスミドpEC 及びpDECΔがある。エリトロポエチ
ン類似体を発現するＣＯＳ及びＣＨＯ宿主細胞の培養は
当業者に公知の手順を用いて行った。
えＤＮＡ技術によって産生された外因性ＤＮＡ配列の発
現産物でもよく、または合成産物でもよい。外因性ＤＮ
Ａ配列としては、エリトロポエチン類似体をコードする
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは化学合成ＤＮＡがある。
これらの類似体の発現に有用な組換えＤＮＡプラスミド
及び真核性宿主細胞も提供される。発現ベクターとして
は、クローニングされたＤＮＡ配列を真核性宿主細胞中
で発現させ得る任意のベクター、特にＣＯＳ及びＣＨＯ
細胞中で発現させるために使用されるベクターがある。
かかるベクターの例としては、本明細書の実施例６に記
載のプラスミドpEC 及びpDECΔがある。エリトロポエチ
ン類似体を発現するＣＯＳ及びＣＨＯ宿主細胞の培養は
当業者に公知の手順を用いて行った。
【００３６】エリトロポエチン類似体に由来の単離イソ
形及びイソ形混合物は、上述のヒトエリトロポエチンイ
ソ形の調製方法を用いて得られる。これらの方法として
は、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー及
び等電点クロマトグラフィーがある。エリトロポエチン
類似体に由来の個々のイソ形またはイソ形混合物を調製
するためにはイオン交換クロマトグラフィーを使用する
のが好ましい。
形及びイソ形混合物は、上述のヒトエリトロポエチンイ
ソ形の調製方法を用いて得られる。これらの方法として
は、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー及
び等電点クロマトグラフィーがある。エリトロポエチン
類似体に由来の個々のイソ形またはイソ形混合物を調製
するためにはイオン交換クロマトグラフィーを使用する
のが好ましい。
【００３７】エリトロポエチンの炭水化物鎖の数、従っ
てエリトロポエチン１分子あたりのシアル酸の数が増加
すると、溶解度の増加、タンパク質分解に対する耐性の
強化、免疫原性の低下、血清半減期の延長及び生物活性
の増加などの有利な特性が与えられるであろう。エリト
ロポエチン類似体を発現するＣＨＯ細胞からの馴化培地
でin vivo 生物活性を分析し、結果を表６に示す。試験
したいくつかの類似体はヒトエリトロポエチンの３倍以
上の活性を有していた。特に、30位または88位に付加的
なＮ−結合炭水化物鎖を有する類似体はヒトエリトロポ
エチンの２〜３倍高い活性を示し、ヒトエリトロポエチ
ンをＨＣＧポリペプチドフラグメントに融合した結果得
られた付加的なＯ−結合部位を有する類似体は２倍以上
の活性を有している。
てエリトロポエチン１分子あたりのシアル酸の数が増加
すると、溶解度の増加、タンパク質分解に対する耐性の
強化、免疫原性の低下、血清半減期の延長及び生物活性
の増加などの有利な特性が与えられるであろう。エリト
ロポエチン類似体を発現するＣＨＯ細胞からの馴化培地
でin vivo 生物活性を分析し、結果を表６に示す。試験
したいくつかの類似体はヒトエリトロポエチンの３倍以
上の活性を有していた。特に、30位または88位に付加的
なＮ−結合炭水化物鎖を有する類似体はヒトエリトロポ
エチンの２〜３倍高い活性を示し、ヒトエリトロポエチ
ンをＨＣＧポリペプチドフラグメントに融合した結果得
られた付加的なＯ−結合部位を有する類似体は２倍以上
の活性を有している。
【００３８】付加的な炭水化物鎖を有する２つのエリト
ロポエチン類似体を精製し、異なるシアル酸含量を有す
るイソ形の混合物を単離した（実施例８)。Thr125及びS
er87Asn88Thr90(EPO N14) 類似体を個別の３つのイソ形
分画に分離し、各分画毎のin vivo 生物活性を測定し
た。表８に与えた結果は、より高いシアル酸含量を有す
るEPO N14 イソ形分画がより大きいin vivo 活性を有す
ることを示す。
ロポエチン類似体を精製し、異なるシアル酸含量を有す
るイソ形の混合物を単離した（実施例８)。Thr125及びS
er87Asn88Thr90(EPO N14) 類似体を個別の３つのイソ形
分画に分離し、各分画毎のin vivo 生物活性を測定し
た。表８に与えた結果は、より高いシアル酸含量を有す
るEPO N14 イソ形分画がより大きいin vivo 活性を有す
ることを示す。
【００３９】EPO N14 類似体及び組換えヒトエリトロポ
エチンの高シアル酸イソ形（イソ形９〜14）のプール
を、受容体結合アッセイ、薬物動態実験及びマウスのヘ
マトクリット増加測定実験で試験した。これらのアッセ
イの結果は、シアル酸含量、クリアランス半減期及び処
理マウスのヘマトクリット増加能力の間に直接的関係が
あることを示す。従って、図13、図14及び図15に示すよ
うに、EPO N14 の高シアル酸イソ形プールは、単離イソ
形14または組換えヒトエリトロポエチンに比較して、同
様に強力な受容体結合を示すことはなかったが、in viv
o 半減期の有意な延長及びヘマトクリット増加の促進を
示した。
エチンの高シアル酸イソ形（イソ形９〜14）のプール
を、受容体結合アッセイ、薬物動態実験及びマウスのヘ
マトクリット増加測定実験で試験した。これらのアッセ
イの結果は、シアル酸含量、クリアランス半減期及び処
理マウスのヘマトクリット増加能力の間に直接的関係が
あることを示す。従って、図13、図14及び図15に示すよ
うに、EPO N14 の高シアル酸イソ形プールは、単離イソ
形14または組換えヒトエリトロポエチンに比較して、同
様に強力な受容体結合を示すことはなかったが、in viv
o 半減期の有意な延長及びヘマトクリット増加の促進を
示した。
【００４０】本発明の別の実施態様は、ヒトエリトロポ
エチンイソ形、または１分子あたり特定数よりも多いシ
アル酸、例えば１分子あたり10よりも多いシアル酸を有
するエリトロポエチン類似体を優先的に合成する哺乳類
（例えばチャイニーズハムスター卵巣、ＣＨＯ）宿主細
胞に関する。エリトロポエチン分子は、分子のシアル酸
含量を限定し得るＮ−結合またはＯ−結合オリゴ糖構造
を有している。例えば、４つの受容部をもつ（４枝の）
Ｎ−結合オリゴ糖は概して４つのシアル酸結合可能部位
を与えるが、４枝形のアスパラギン結合部位に置換し得
る２枝または３枝のオリゴ糖鎖は通常は２個または３個
以下のシアル酸と結合できるだけである。Ｏ−結合オリ
ゴ糖は通常、２つのシアル酸結合部位を与える。従っ
て、エリトロポエチン分子は、３つのＮ−結合部位全部
が４枝であるならば合計14個のシアル残基を受容し得
る。組換えエリトロポエチンに４枝の鎖を優先的に付加
しこれによって最大数のシアル酸結合部位を提供し得る
細胞を哺乳類細胞培養物からスクリーニングする。
エチンイソ形、または１分子あたり特定数よりも多いシ
アル酸、例えば１分子あたり10よりも多いシアル酸を有
するエリトロポエチン類似体を優先的に合成する哺乳類
（例えばチャイニーズハムスター卵巣、ＣＨＯ）宿主細
胞に関する。エリトロポエチン分子は、分子のシアル酸
含量を限定し得るＮ−結合またはＯ−結合オリゴ糖構造
を有している。例えば、４つの受容部をもつ（４枝の）
Ｎ−結合オリゴ糖は概して４つのシアル酸結合可能部位
を与えるが、４枝形のアスパラギン結合部位に置換し得
る２枝または３枝のオリゴ糖鎖は通常は２個または３個
以下のシアル酸と結合できるだけである。Ｏ−結合オリ
ゴ糖は通常、２つのシアル酸結合部位を与える。従っ
て、エリトロポエチン分子は、３つのＮ−結合部位全部
が４枝であるならば合計14個のシアル残基を受容し得
る。組換えエリトロポエチンに４枝の鎖を優先的に付加
しこれによって最大数のシアル酸結合部位を提供し得る
細胞を哺乳類細胞培養物からスクリーニングする。
【００４１】尿エリトロポエチンのＮ−結合オリゴ糖
は、ガラクトースに対してα２，３及びα２,６の双方
の結合でシアル酸を含有している（Takeuchiら、J. Bio
l. Chem. 263, 3657 (1988))。典型的には、α２，３結
合のシアル酸はマンノースα１，６ブランチ上のガラク
トースに付加され、α２，６結合のシアル酸はマンノー
スα１，３ブランチ上のガラクトースに付加される。こ
れらのシアル酸を付加する酵素（β−ガラクトシドα
２，３シアリルトランスフェラーゼ及びβ−ガラクトシ
ドα２，６シアリルトランスフェラーゼ）は夫々、マン
ノースα１，６ブランチ及びマンノースα１，３ブラン
チにシアル酸を極めて効率的に付加する。
は、ガラクトースに対してα２，３及びα２,６の双方
の結合でシアル酸を含有している（Takeuchiら、J. Bio
l. Chem. 263, 3657 (1988))。典型的には、α２，３結
合のシアル酸はマンノースα１，６ブランチ上のガラク
トースに付加され、α２，６結合のシアル酸はマンノー
スα１，３ブランチ上のガラクトースに付加される。こ
れらのシアル酸を付加する酵素（β−ガラクトシドα
２，３シアリルトランスフェラーゼ及びβ−ガラクトシ
ドα２，６シアリルトランスフェラーゼ）は夫々、マン
ノースα１，６ブランチ及びマンノースα１，３ブラン
チにシアル酸を極めて効率的に付加する。
【００４２】ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ) 欠
失チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、組換
えエリトロポエチンのような組換え糖たんぱく質産生の
ための常用の宿主細胞である。これらの細胞は酵素β−
ガラクトシドα２，６シアリルトランスフェラーゼを発
現せず、従ってこれらの細胞中で産生された糖タンパク
質のＮ−結合オリゴ糖にα２，６結合でシアル酸を付加
しない。(Mutsaersら、Eur. J. Biochem. 156, 651, (1
986); Takeuchi ら、J. Chromatogr. 400, 207 (1987))
。その結果、ＣＨＯ細胞中で産生された組換えエリト
ロポエチンは、ガラクトースに対し２，６結合するシア
ル酸を欠失している（Sasakiら、(1987)、前出；Takeuc
hiら、(1987)、前出）。
失チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、組換
えエリトロポエチンのような組換え糖たんぱく質産生の
ための常用の宿主細胞である。これらの細胞は酵素β−
ガラクトシドα２，６シアリルトランスフェラーゼを発
現せず、従ってこれらの細胞中で産生された糖タンパク
質のＮ−結合オリゴ糖にα２，６結合でシアル酸を付加
しない。(Mutsaersら、Eur. J. Biochem. 156, 651, (1
986); Takeuchi ら、J. Chromatogr. 400, 207 (1987))
。その結果、ＣＨＯ細胞中で産生された組換えエリト
ロポエチンは、ガラクトースに対し２，６結合するシア
ル酸を欠失している（Sasakiら、(1987)、前出；Takeuc
hiら、(1987)、前出）。
【００４３】本発明の別の実施態様においては、ヒトエ
リトロポエチンまたはエリトロポエチン類似体が、ガラ
クトースに対しα２，６結合でシアル酸を取り込むため
に機能性β−ガラクトシドα２，６シアリルトランスフ
ェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中
で産生される。得られたイソ形は、ガラクトースへのα
２，３及びα２，６結合の双方を有するシアル酸を含有
するであろう。修飾ＣＨＯ細胞またはその他の哺乳類宿
主細胞を作製する技術の記載に関しては、Leeら、J. Bi
ol. Chem. 264, 13848 (1989)を参照されたい。該文献
の記載内容は本明細書に含まれるものとする。
リトロポエチンまたはエリトロポエチン類似体が、ガラ
クトースに対しα２，６結合でシアル酸を取り込むため
に機能性β−ガラクトシドα２，６シアリルトランスフ
ェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中
で産生される。得られたイソ形は、ガラクトースへのα
２，３及びα２，６結合の双方を有するシアル酸を含有
するであろう。修飾ＣＨＯ細胞またはその他の哺乳類宿
主細胞を作製する技術の記載に関しては、Leeら、J. Bi
ol. Chem. 264, 13848 (1989)を参照されたい。該文献
の記載内容は本明細書に含まれるものとする。
【００４４】治療有効量の特定のイソ形またはイソ形混
合物を、エリトロポエチン治療に有用な適当な希釈在、
アジュバント及び／または担体と共に含む医薬組成物も
本発明の範囲に包含される。治療有効量のエリトロポエ
チン類似体を適当な希釈剤、アジュバント及び／または
担体とともに含む医薬組成物も本発明の範囲に包含され
る。本明細書中で使用される「治療有効量」なる用語
は、所与の症状及び投与養生法に対して治療効果を与え
る量を意味する。ヒトエリトロポエチンのイソ形または
エリトロポエチン類似体の投与は非経口経路によるのが
好ましい。選択される特定経路は治療される病状次第で
ある。ヒトエリトロポエチンのイソ形またはエリトロポ
エチン類似体は好ましくは、ヒト血清アルブミンのよう
な適当な担体、緩衝生理食塩水溶液のような適当な希釈
剤及び／または適当なアジュバントを含む製剤の一部と
して投与される。必要な投与量は、患者のヘマトクリッ
トを増加させるために十分な量であり、治療される病状
の重症度、使用される投与法などに従って加減できる。
合物を、エリトロポエチン治療に有用な適当な希釈在、
アジュバント及び／または担体と共に含む医薬組成物も
本発明の範囲に包含される。治療有効量のエリトロポエ
チン類似体を適当な希釈剤、アジュバント及び／または
担体とともに含む医薬組成物も本発明の範囲に包含され
る。本明細書中で使用される「治療有効量」なる用語
は、所与の症状及び投与養生法に対して治療効果を与え
る量を意味する。ヒトエリトロポエチンのイソ形または
エリトロポエチン類似体の投与は非経口経路によるのが
好ましい。選択される特定経路は治療される病状次第で
ある。ヒトエリトロポエチンのイソ形またはエリトロポ
エチン類似体は好ましくは、ヒト血清アルブミンのよう
な適当な担体、緩衝生理食塩水溶液のような適当な希釈
剤及び／または適当なアジュバントを含む製剤の一部と
して投与される。必要な投与量は、患者のヘマトクリッ
トを増加させるために十分な量であり、治療される病状
の重症度、使用される投与法などに従って加減できる。
【００４５】以下の実施例は、本発明をより十分に説明
するために与えられたものであるが、本発明の範囲を限
定すると理解されてはならない。実施例で使用したin v
ivoバイオアッセイに使用したエリトロポエチン標準
は、部分精製した尿エリトロポエチン標準に対して標準
化したものである。従って、相対的なin vivo 比活性だ
けを測定している。また、使用したエリトロポエチン標
準を既存のいかなる国際標準にも直接相関させなかった
ので、in vivo比活性を、「IU／ｍｌ」、「IU／mg」及
び「IU／A280」でなく「単位／ml」、「単位／mg」及び
「単位／A280」で示している。実施例1：組換えエリトロポエチンイソ形の単離 Linら、前出、の記載に従って組換えエリトロポエチン
を産生する。第1及び第3のイソ形単離用の出発物質とし
て使用される組換えエリトロポエチンを、Laiら名義の
特許、前出、の実施例2に記載の手順で精製する。第2及
び第5のイソ形単離用の出発物質を、Q-セファロースを
用いるように修正したLaiら、前出、に記載の方法に従
って精製する。これらの調製物は、尿由来ヒトエリトロ
ポエチンと同じアミノ酸配列を有する組換えエリトロポ
エチンのイソ形混合物を含有し、主としてイソ形９〜１
４を含有している。第４のイソ形調製用の出発物質は、
Laiらの実施例２のアニオン交換カラムの５mMの酢酸／
１mMのグリシン／6Mの尿素洗浄の間に溶出する物質であ
る。この分画は、９個以下のシアル酸を有するイソ形を
含有しており、分取用等電点電気泳動手順に使用する前
にLaiらの実施例２に記載されたようなゲル濾過クロマ
トグラフィーによって更に精製した。第６のイソ形調製
用の出発物質としては４〜１３個のシアル酸残基を有す
る組換えエリトロポエチンの精製調製物を使用した。こ
の物質は、出発物質中に存在するイソ形をほぼ保持する
イオン交換カラムを用いるように修正した（pH8.4の塩
化ナトリウム勾配によって組換えエリトロポエチンを溶
出させ酢酸／尿素洗浄液を除く）Laiらの実施例２の手
順で精製した。
するために与えられたものであるが、本発明の範囲を限
定すると理解されてはならない。実施例で使用したin v
ivoバイオアッセイに使用したエリトロポエチン標準
は、部分精製した尿エリトロポエチン標準に対して標準
化したものである。従って、相対的なin vivo 比活性だ
けを測定している。また、使用したエリトロポエチン標
準を既存のいかなる国際標準にも直接相関させなかった
ので、in vivo比活性を、「IU／ｍｌ」、「IU／mg」及
び「IU／A280」でなく「単位／ml」、「単位／mg」及び
「単位／A280」で示している。実施例1：組換えエリトロポエチンイソ形の単離 Linら、前出、の記載に従って組換えエリトロポエチン
を産生する。第1及び第3のイソ形単離用の出発物質とし
て使用される組換えエリトロポエチンを、Laiら名義の
特許、前出、の実施例2に記載の手順で精製する。第2及
び第5のイソ形単離用の出発物質を、Q-セファロースを
用いるように修正したLaiら、前出、に記載の方法に従
って精製する。これらの調製物は、尿由来ヒトエリトロ
ポエチンと同じアミノ酸配列を有する組換えエリトロポ
エチンのイソ形混合物を含有し、主としてイソ形９〜１
４を含有している。第４のイソ形調製用の出発物質は、
Laiらの実施例２のアニオン交換カラムの５mMの酢酸／
１mMのグリシン／6Mの尿素洗浄の間に溶出する物質であ
る。この分画は、９個以下のシアル酸を有するイソ形を
含有しており、分取用等電点電気泳動手順に使用する前
にLaiらの実施例２に記載されたようなゲル濾過クロマ
トグラフィーによって更に精製した。第６のイソ形調製
用の出発物質としては４〜１３個のシアル酸残基を有す
る組換えエリトロポエチンの精製調製物を使用した。こ
の物質は、出発物質中に存在するイソ形をほぼ保持する
イオン交換カラムを用いるように修正した（pH8.4の塩
化ナトリウム勾配によって組換えエリトロポエチンを溶
出させ酢酸／尿素洗浄液を除く）Laiらの実施例２の手
順で精製した。
【００４６】本質的にLKB Application Note 198に記載
の顆粒状ゲルベッド(U1trodex, LKB)を用いた分取用等
電点電気泳動によって異なる６つの個別イソ形を調製し
た。Pharmalyte(Pharmacia)2.5-5アンホライト(Pharmac
ia)を使用し、ゲルベッドは5Mの尿素を含有している。
第一の調製では、6.8mlの20mMのクエン酸ナトリウム/10
0mMの塩化ナトリウム、p H7.0中の約20mgの組換えエリ
トロポエチンをゲルに添加し、８ワットで約１６時間フ
ォーカシングする。等電点電気泳動後、ゲルベッドの紙
接触プリントによってゲル内のイソ形バンドを可視化す
る。プリントを作成し、次いで定着溶液（40%エタノー
ル／10%酢酸／10%TCA／3.5%スルホサリチル酸）を３回
交換して浸漬（各回約１０分間、室温）させることによ
って定着し、40%メタノール／10％酢酸（30〜60℃) で
１回（約10分間）処理し、 0.125％クマシーブルー R-2
50／40％メタノール／10％酢酸中で60℃で15分間染色
し、次いで7.５％メタノール／10％酢酸中で脱色して、
分離されたイソ形を可視化する。イソ形を含有する顆粒
状ゲルベッドの領域（樹脂の〜50％）を取り出し、水
（〜16ml）を添加し、スラリーを5.５×24.5インチのト
レーに注ぎ、正味重量〜40ｇまで蒸発させる。この調製
物を２回目にフォーカシングし、前回と同様にゲルベッ
ドの接触プリントを作成する。識別可能な６つのイソ形
の各々を含むゲル部分をゲルベッドから取り出す。
の顆粒状ゲルベッド(U1trodex, LKB)を用いた分取用等
電点電気泳動によって異なる６つの個別イソ形を調製し
た。Pharmalyte(Pharmacia)2.5-5アンホライト(Pharmac
ia)を使用し、ゲルベッドは5Mの尿素を含有している。
第一の調製では、6.8mlの20mMのクエン酸ナトリウム/10
0mMの塩化ナトリウム、p H7.0中の約20mgの組換えエリ
トロポエチンをゲルに添加し、８ワットで約１６時間フ
ォーカシングする。等電点電気泳動後、ゲルベッドの紙
接触プリントによってゲル内のイソ形バンドを可視化す
る。プリントを作成し、次いで定着溶液（40%エタノー
ル／10%酢酸／10%TCA／3.5%スルホサリチル酸）を３回
交換して浸漬（各回約１０分間、室温）させることによ
って定着し、40%メタノール／10％酢酸（30〜60℃) で
１回（約10分間）処理し、 0.125％クマシーブルー R-2
50／40％メタノール／10％酢酸中で60℃で15分間染色
し、次いで7.５％メタノール／10％酢酸中で脱色して、
分離されたイソ形を可視化する。イソ形を含有する顆粒
状ゲルベッドの領域（樹脂の〜50％）を取り出し、水
（〜16ml）を添加し、スラリーを5.５×24.5インチのト
レーに注ぎ、正味重量〜40ｇまで蒸発させる。この調製
物を２回目にフォーカシングし、前回と同様にゲルベッ
ドの接触プリントを作成する。識別可能な６つのイソ形
の各々を含むゲル部分をゲルベッドから取り出す。
【００４７】ゲルからイソ形を溶出させるために、10mM
のTris-HCl, pH 7.0／５mMのChapsを含有する溶液を各
イソ形に添加してスラリーを調製する。スラリーを小カ
ラムに入れ、Tris-Chaps緩衝液で洗浄する。素通り分
（flow through) を収集し、20％エタノール／10mMのTr
is-HCl, pH 7.0中で平衡させたVydac C4逆相樹脂を収容
した小カラム（オープンカラム構造）に別々に導入す
る。20％エタノール／10mMのTris-HCl, pH 7.0、35％エ
タノール／10mMのTris-HCl, pH 7.0及び65％エタノール
／10mMのTris-HCl, pH 7.0によってカラムを段階的に展
開させる。65％エタノール／10mMのTrisに溶出する分画
を、10mMのTris-HCl, pH 7.0によって１：１に希釈し、
濃縮し、次いでCentricon-10 (Amicon) 微量濃縮装置
（microconcentrator)を用いて、緩衝液を10mMのTris-H
Cl, pH 7.0と交換する。５M の尿素を含むポリアクリル
アミドゲル中で、 Servalyte３−５アンホライン（Serv
a)を用い、本質的にＬＫＢテクニカルノート 250に記載
された手順で、この調製物を分析用等電点電気泳動にか
ける。
のTris-HCl, pH 7.0／５mMのChapsを含有する溶液を各
イソ形に添加してスラリーを調製する。スラリーを小カ
ラムに入れ、Tris-Chaps緩衝液で洗浄する。素通り分
（flow through) を収集し、20％エタノール／10mMのTr
is-HCl, pH 7.0中で平衡させたVydac C4逆相樹脂を収容
した小カラム（オープンカラム構造）に別々に導入す
る。20％エタノール／10mMのTris-HCl, pH 7.0、35％エ
タノール／10mMのTris-HCl, pH 7.0及び65％エタノール
／10mMのTris-HCl, pH 7.0によってカラムを段階的に展
開させる。65％エタノール／10mMのTrisに溶出する分画
を、10mMのTris-HCl, pH 7.0によって１：１に希釈し、
濃縮し、次いでCentricon-10 (Amicon) 微量濃縮装置
（microconcentrator)を用いて、緩衝液を10mMのTris-H
Cl, pH 7.0と交換する。５M の尿素を含むポリアクリル
アミドゲル中で、 Servalyte３−５アンホライン（Serv
a)を用い、本質的にＬＫＢテクニカルノート 250に記載
された手順で、この調製物を分析用等電点電気泳動にか
ける。
【００４８】第２の調製では、６.５mlの脱イオン水中
の約26mgの組換えエリトロポエチンをゲルに添加し、2.
５ワットで35分間及び10ワットで約17時間フォーカシン
グ処理する。ゲルベッドで観察された泳動タンパク質バ
ンドを11個の異なるプールとして取り出す。各プールを
脱イオン水で約7.５mlにし、得られた各プールの20mlの
上清を上述のような分析用等電点電気泳動にかける。各
プールに５mlの1.５MのTris-HCl, pH 8.8を添加し、ス
ラリーの各々を小カラムに導入し、液相を流通させる。
樹脂を約３倍容の0.5MのTris-HCl, pH７で洗浄し、洗浄
液を素通り分と合わせる。カットオフ分子量10,000ダル
トンのAmicon使い捨て限外濾過デバイスを用いて、溶出
液を濃縮し、緩衝液を20mMのクエン酸ナトリウム／100m
M の塩化ナトリウム、pH 7.0と交換する。濃縮した溶液
（約0.５ml）を次に、カットオフサイズ0.22ミクロンの
酢酸セルロースフィルターに通す。分析用等電点電気泳
動に基づいて、５つのプールが単一イソ形10、11、12、
13及び14を主として含むことが知見される。
の約26mgの組換えエリトロポエチンをゲルに添加し、2.
５ワットで35分間及び10ワットで約17時間フォーカシン
グ処理する。ゲルベッドで観察された泳動タンパク質バ
ンドを11個の異なるプールとして取り出す。各プールを
脱イオン水で約7.５mlにし、得られた各プールの20mlの
上清を上述のような分析用等電点電気泳動にかける。各
プールに５mlの1.５MのTris-HCl, pH 8.8を添加し、ス
ラリーの各々を小カラムに導入し、液相を流通させる。
樹脂を約３倍容の0.5MのTris-HCl, pH７で洗浄し、洗浄
液を素通り分と合わせる。カットオフ分子量10,000ダル
トンのAmicon使い捨て限外濾過デバイスを用いて、溶出
液を濃縮し、緩衝液を20mMのクエン酸ナトリウム／100m
M の塩化ナトリウム、pH 7.0と交換する。濃縮した溶液
（約0.５ml）を次に、カットオフサイズ0.22ミクロンの
酢酸セルロースフィルターに通す。分析用等電点電気泳
動に基づいて、５つのプールが単一イソ形10、11、12、
13及び14を主として含むことが知見される。
【００４９】第３の調製では、21.8mlの蒸留水中の約30
mgの組換えエリトロポエチンをゲルに添加し、２ワット
で25分間、10ワットで20時間及び15ワットで15分間フォ
ーカシング処理する。個々のイソ形に対応するタンパク
質バンドを肉眼で観察しゲルベッドから取り出す。ゲル
単離したイソ形に蒸留水を添加してスラリーを調製し、
得られた上清を分析用等電点電気泳動によって分析す
る。等量の１M のTris-HCl, pH 7.2 を各スラリーに添
加し、懸濁液を個別の小カラムに入れ、液相をカラムに
通過させてイソ形を溶出させる。カットオフ分子量10,0
00ダルトンのAmicon使い捨て限外濾過デバイスを用い
て、各素通り分を濃縮し、緩衝液を20mMのクエン酸ナト
リウム／100mM の塩化ナトリウム，pH 7.0と交換する。
分析用等電点電気泳動ゲルは、単一イソ形９、10、11、
12、13及び14を主として含むプールが得られることを示
した。
mgの組換えエリトロポエチンをゲルに添加し、２ワット
で25分間、10ワットで20時間及び15ワットで15分間フォ
ーカシング処理する。個々のイソ形に対応するタンパク
質バンドを肉眼で観察しゲルベッドから取り出す。ゲル
単離したイソ形に蒸留水を添加してスラリーを調製し、
得られた上清を分析用等電点電気泳動によって分析す
る。等量の１M のTris-HCl, pH 7.2 を各スラリーに添
加し、懸濁液を個別の小カラムに入れ、液相をカラムに
通過させてイソ形を溶出させる。カットオフ分子量10,0
00ダルトンのAmicon使い捨て限外濾過デバイスを用い
て、各素通り分を濃縮し、緩衝液を20mMのクエン酸ナト
リウム／100mM の塩化ナトリウム，pH 7.0と交換する。
分析用等電点電気泳動ゲルは、単一イソ形９、10、11、
12、13及び14を主として含むプールが得られることを示
した。
【００５０】第４のイソ形調製では、イソ形３〜９を含
むエリトロポエチン（上述の手順で調製）を出発物質と
して使用した。調製物１〜３に関する上記の記載とほぼ
同様に行う分取用等電点電気泳動に先立って、等電点の
低い出発物質により適したアンホライト範囲を与えるた
めに、アンホライト（Pharmalyte 2.5−5)をRotofor(Bi
o-Rad, Richmond, CA) 液相等電点電気泳動槽中で予め
分画した。予分画は、6.７mlのPharmalyte 2.5−５を15
ｇの尿素と混合し、容量50mlまで純水を添加することに
よって行った。この混合物をRotofor 内で0.1Mのリン酸
及び0.1Mの水酸化ナトリウムを夫々陽極液及び陰極液と
して用い10ワット、１℃で５時間半処理することによっ
て分画した。pH測定値4.５〜約６を有するアンホライト
分画をフラットベッド等電点電気泳動に使用した。
むエリトロポエチン（上述の手順で調製）を出発物質と
して使用した。調製物１〜３に関する上記の記載とほぼ
同様に行う分取用等電点電気泳動に先立って、等電点の
低い出発物質により適したアンホライト範囲を与えるた
めに、アンホライト（Pharmalyte 2.5−5)をRotofor(Bi
o-Rad, Richmond, CA) 液相等電点電気泳動槽中で予め
分画した。予分画は、6.７mlのPharmalyte 2.5−５を15
ｇの尿素と混合し、容量50mlまで純水を添加することに
よって行った。この混合物をRotofor 内で0.1Mのリン酸
及び0.1Mの水酸化ナトリウムを夫々陽極液及び陰極液と
して用い10ワット、１℃で５時間半処理することによっ
て分画した。pH測定値4.５〜約６を有するアンホライト
分画をフラットベッド等電点電気泳動に使用した。
【００５１】Centrieluter(Amicon, Danvers, MA)及び
カットオフ分子量10,000のCentricon(Amicon) を用い、
以下のパラメーター、即ち、0.18のTris緩衝液pH 8.8、
100ボルト、25〜30mA、３時間を用いてイソ形からアン
ホライトを除去した。次に、Sephadex G-25 (Pharmaci
a) を用いたゲル濾過によってイソ形の緩衝液を0.1Mの
塩化ナトリウムに交換した。得られた５つのプールの分
析用等電点電気泳動は、これらのプールがイソ形４、
５、６、７及び８を含むことを示した。イソ形４は複数
のバンドとして溶出し、これはこのイソ形がある程度分
解されたことを示す。
カットオフ分子量10,000のCentricon(Amicon) を用い、
以下のパラメーター、即ち、0.18のTris緩衝液pH 8.8、
100ボルト、25〜30mA、３時間を用いてイソ形からアン
ホライトを除去した。次に、Sephadex G-25 (Pharmaci
a) を用いたゲル濾過によってイソ形の緩衝液を0.1Mの
塩化ナトリウムに交換した。得られた５つのプールの分
析用等電点電気泳動は、これらのプールがイソ形４、
５、６、７及び８を含むことを示した。イソ形４は複数
のバンドとして溶出し、これはこのイソ形がある程度分
解されたことを示す。
【００５２】第５のイソ形調製は、フラットベッド等電
点電気泳動手順にプレフォーカシング段階を加えること
によって修正した。この修正では、タンパク質を電気泳
動前にアンホライト／尿素／ゲル混合物を添加せず、ゲ
ルベッド中でpH勾配を作成した後に等電点電気泳動装置
に添加した。75分間（1500ボルト−時）のプレフォーカ
シング後、2.25〜4.25cmのゲルベッド切片を陰極から取
り出し、エリトロポエチン溶液と混合し、ゲルベッドに
戻した。等電点電気泳動等、イソ形10、11、12、13及び
14がゲルベッドから溶出し、Centricon-10（Amicon) デ
バイスを用いた限外濾過によってこれらのイソ形をアン
ホライトから分離した。
点電気泳動手順にプレフォーカシング段階を加えること
によって修正した。この修正では、タンパク質を電気泳
動前にアンホライト／尿素／ゲル混合物を添加せず、ゲ
ルベッド中でpH勾配を作成した後に等電点電気泳動装置
に添加した。75分間（1500ボルト−時）のプレフォーカ
シング後、2.25〜4.25cmのゲルベッド切片を陰極から取
り出し、エリトロポエチン溶液と混合し、ゲルベッドに
戻した。等電点電気泳動等、イソ形10、11、12、13及び
14がゲルベッドから溶出し、Centricon-10（Amicon) デ
バイスを用いた限外濾過によってこれらのイソ形をアン
ホライトから分離した。
【００５３】プレーフォーカシング段階は、イソ形調製
物の紫外線吸光特性を出発組換えエリトロポエチンの特
性にいっそう近いものにするために加えた修正である。
スペクトル特性のこのような改良は、単離イソ形の280n
m 及び260nm の吸光度の比として現れる。調製物２及び
３（プレフォーカシング非使用）で得られたイソ形の場
合には280nm の吸光度と260nm の吸光度との平均比 (A2
80/A260)が1.36±0.11であるが、調製物５及び６（プレ
フォーカシング使用）の場合にはA280/A260比が1.68±
0.20である。イソ形#14 を計算から除外すると、調製物
２及び３並びに調製物５及び６の平均A280/A260比は夫
々、1.39±0.11及び1.74±0.09である。（イソ形14は、
最小量で存在し従ってアンホライト成分の微量夾雑によ
って干渉され易い、またはフラットベッド等電点電気泳
動手順中に電極に最も近い、などの理由で、最も変速的
なスペクトルを有するであろう）。（アニオン交換樹脂
としてＱ−セファロースを用いるように修正した）Lai
らの実施例２に従って調製した組換えエリトロポエチン
の平均A280/A260比は1.91±0.04である。
物の紫外線吸光特性を出発組換えエリトロポエチンの特
性にいっそう近いものにするために加えた修正である。
スペクトル特性のこのような改良は、単離イソ形の280n
m 及び260nm の吸光度の比として現れる。調製物２及び
３（プレフォーカシング非使用）で得られたイソ形の場
合には280nm の吸光度と260nm の吸光度との平均比 (A2
80/A260)が1.36±0.11であるが、調製物５及び６（プレ
フォーカシング使用）の場合にはA280/A260比が1.68±
0.20である。イソ形#14 を計算から除外すると、調製物
２及び３並びに調製物５及び６の平均A280/A260比は夫
々、1.39±0.11及び1.74±0.09である。（イソ形14は、
最小量で存在し従ってアンホライト成分の微量夾雑によ
って干渉され易い、またはフラットベッド等電点電気泳
動手順中に電極に最も近い、などの理由で、最も変速的
なスペクトルを有するであろう）。（アニオン交換樹脂
としてＱ−セファロースを用いるように修正した）Lai
らの実施例２に従って調製した組換えエリトロポエチン
の平均A280/A260比は1.91±0.04である。
【００５４】上述のごとく、イソ形調製物#6の出発物質
は、イソ形４〜13を含む組換えエリトロポエチン調製物
であった。アンホライトを第４の調製と同様にRotofor
装置内でプレフォーカシングした。pH測定値3.７〜4.８
を有するアンホライト分画をフラットベッド等電点電気
泳動に使用した。処理#5と同様にフラットベッドをプレ
フォーカシングし、アンホライト担体を除去するために
限外濾過（Centricon-10) した後、イソ形９、10、11、
12及び13が得られた。実施例２：組換えエリトロポエチンイソ形のシアル酸含
量 実施例１に記載のごとく単離したイソ形及び Laiら、前
出、に記載の手順で精製したエリトロポエチン（イソ形
９〜14の混合物）の緩衝液を0.10〜0.15M の塩化ナトリ
ウムに交換し、Jourdianら、J. Biol. Chem.246, 430
(1971) 、の手順の修正手順によってシアル酸含有を分
析する。0.35M の硫酸で80℃で30分間加水分解すること
によって糖タンパク質からシアル酸残基を開裂し、分析
前に水酸化ナトリウムで溶液を中和する。エリトロポエ
チンタンパク質の存在量を推定するために、Bio-Rad に
よって供給されるアッセイ試薬及び微量法手順を用い、
ヒトエリトロポエチンのアミノ酸配列を有する組換えエ
リトロポエチンを標準として用いてBradfordタンパク質
アッセイ(Bradford Anal. Biochem. 72, 248 (1976)を
行う。その結果を、エリトロポエチン１モルあたりのシ
アル酸のモル数として表１に示す。１分子あたりのシア
ル酸の数に従って低酸性（イソ形９）から高酸性（イソ
形14）の範囲までイソ形を命名する。イソ形９〜13は図
１のゲルレーン６〜10に示されている。イソ形14はシア
ル酸含量を正確に測定するために十分な量で得られない
ため、このイソ形のシアル酸含量はＩＥＦゲル上の泳動
を他のイソ形に比較することによって推定する。イソ形
５〜８（調製物#4) のシアル酸含量は測定しなかったが
ＩＥＦゲル上の移動度から同様にして推定する。
は、イソ形４〜13を含む組換えエリトロポエチン調製物
であった。アンホライトを第４の調製と同様にRotofor
装置内でプレフォーカシングした。pH測定値3.７〜4.８
を有するアンホライト分画をフラットベッド等電点電気
泳動に使用した。処理#5と同様にフラットベッドをプレ
フォーカシングし、アンホライト担体を除去するために
限外濾過（Centricon-10) した後、イソ形９、10、11、
12及び13が得られた。実施例２：組換えエリトロポエチンイソ形のシアル酸含
量 実施例１に記載のごとく単離したイソ形及び Laiら、前
出、に記載の手順で精製したエリトロポエチン（イソ形
９〜14の混合物）の緩衝液を0.10〜0.15M の塩化ナトリ
ウムに交換し、Jourdianら、J. Biol. Chem.246, 430
(1971) 、の手順の修正手順によってシアル酸含有を分
析する。0.35M の硫酸で80℃で30分間加水分解すること
によって糖タンパク質からシアル酸残基を開裂し、分析
前に水酸化ナトリウムで溶液を中和する。エリトロポエ
チンタンパク質の存在量を推定するために、Bio-Rad に
よって供給されるアッセイ試薬及び微量法手順を用い、
ヒトエリトロポエチンのアミノ酸配列を有する組換えエ
リトロポエチンを標準として用いてBradfordタンパク質
アッセイ(Bradford Anal. Biochem. 72, 248 (1976)を
行う。その結果を、エリトロポエチン１モルあたりのシ
アル酸のモル数として表１に示す。１分子あたりのシア
ル酸の数に従って低酸性（イソ形９）から高酸性（イソ
形14）の範囲までイソ形を命名する。イソ形９〜13は図
１のゲルレーン６〜10に示されている。イソ形14はシア
ル酸含量を正確に測定するために十分な量で得られない
ため、このイソ形のシアル酸含量はＩＥＦゲル上の泳動
を他のイソ形に比較することによって推定する。イソ形
５〜８（調製物#4) のシアル酸含量は測定しなかったが
ＩＥＦゲル上の移動度から同様にして推定する。
【００５５】
【表１】 実施例３：組換えエリトロポエチンイソ形の活性 実施例１に記載のごとく単離したイソ形について、組換
えエリトロポエチンの存在量を測定するために、280nm
の吸光度、Bradfordタンパク質アッセイ及びエリトロポ
エチン用ＲＩＡによって検定する。低酸素症でない赤血
球増加症マウス（exhypoxic polycythemic mouse) のバ
イオアッセイ（Cotes ら、Nature 191,1065 (1961))を
用い、相対的in vivo 生物活性を測定する。エリトロポ
エチン用ラジオイムノアッセイを用いてエリトロポエチ
ンタンパク質の存在量を定量する場合、大量のシアル酸
を含有するイソ形では免疫反応性の見かけの減少が生
じ、そのためエリトロポエチン濃度が過小評価され従っ
て大抵の陰性イソ形の相対的in vivo 比活性が過大評価
されるので、ある種のイソ形では他の定量法よりも高い
相対的in vivo 比活性の値が得られた。単位／mlで表さ
れたマウスバイオアッセイの測定値を対応タンパク質濃
度によって除算すると、エリトロポエチンポリペプチド
１mgあたりの単位で表されるin vivo 比活性が算出され
る。これらの比活性を表２に示す。
えエリトロポエチンの存在量を測定するために、280nm
の吸光度、Bradfordタンパク質アッセイ及びエリトロポ
エチン用ＲＩＡによって検定する。低酸素症でない赤血
球増加症マウス（exhypoxic polycythemic mouse) のバ
イオアッセイ（Cotes ら、Nature 191,1065 (1961))を
用い、相対的in vivo 生物活性を測定する。エリトロポ
エチン用ラジオイムノアッセイを用いてエリトロポエチ
ンタンパク質の存在量を定量する場合、大量のシアル酸
を含有するイソ形では免疫反応性の見かけの減少が生
じ、そのためエリトロポエチン濃度が過小評価され従っ
て大抵の陰性イソ形の相対的in vivo 比活性が過大評価
されるので、ある種のイソ形では他の定量法よりも高い
相対的in vivo 比活性の値が得られた。単位／mlで表さ
れたマウスバイオアッセイの測定値を対応タンパク質濃
度によって除算すると、エリトロポエチンポリペプチド
１mgあたりの単位で表されるin vivo 比活性が算出され
る。これらの比活性を表２に示す。
【００５６】表２において、「ｎ」は、比活性値の測定
に用いた個別のイソ形調製物の数である。多くの場合、
イソ形調製物の各々に複数のin vivo アッセイを実施し
た。同じin vivo データを用いて３つのカラム全部の比
活性を計算し、単位／mgエリトロポエチンポリペプチド
を、280nm の吸光度、ラジオイムノアッセイ力価または
Bradfordタンパク質アッセイ結果から決定した。イソ形
９〜14を含有する精製組換えエリトロポエチンをBradfo
rdタンパク質アッセイの標準として使用した。Bradford
アッセイを行うときには足りなくなっていた調製物もい
くつかあったので、Bradfordタンパク質アッセイを用い
た計算では「ｎ」が少ないものもある。
に用いた個別のイソ形調製物の数である。多くの場合、
イソ形調製物の各々に複数のin vivo アッセイを実施し
た。同じin vivo データを用いて３つのカラム全部の比
活性を計算し、単位／mgエリトロポエチンポリペプチド
を、280nm の吸光度、ラジオイムノアッセイ力価または
Bradfordタンパク質アッセイ結果から決定した。イソ形
９〜14を含有する精製組換えエリトロポエチンをBradfo
rdタンパク質アッセイの標準として使用した。Bradford
アッセイを行うときには足りなくなっていた調製物もい
くつかあったので、Bradfordタンパク質アッセイを用い
た計算では「ｎ」が少ないものもある。
【００５７】Lai ら、前出、に記載の手順に従って精製
されイソ形９〜14の混合物を含有するエリトロポエチン
をＲＩＡ及びin vivo アッセイ用標準として使用する。
単位／mgエリトロポエチンポリペプチドで表された相対
的比活性に、エリトロポエチンポリペプチド0.807mg/A2
80を乗算することによって、単位／A280に変換し得る。
この変換係数は、エリトロポエチンの吸光係数（1.345m
g/A280) に、エリトロポエチン糖タンパク質のタンパク
質含量（約60重量％、Davis ら、Biochemistry 26, 263
3 (1987)) を乗算して算出されたエリトロポエチンポリ
ペプチドmg/A280 である（即ち、エリトロポエチン1.34
5mg/A280×ポリペプチド0.60mg／mgエリトロポエチン＝
ポリペプチド0.807mg/A280) 。更に、単位／mgエリトロ
ポエチンポリペプチドで表された比活性に、ポリペプチ
ド0.60mg／mgエリトロポエチン糖タンパク質という係数
を乗算すると、比活性を単位／mgエリトロポエチン糖タ
ンパク質で表すことができる。
されイソ形９〜14の混合物を含有するエリトロポエチン
をＲＩＡ及びin vivo アッセイ用標準として使用する。
単位／mgエリトロポエチンポリペプチドで表された相対
的比活性に、エリトロポエチンポリペプチド0.807mg/A2
80を乗算することによって、単位／A280に変換し得る。
この変換係数は、エリトロポエチンの吸光係数（1.345m
g/A280) に、エリトロポエチン糖タンパク質のタンパク
質含量（約60重量％、Davis ら、Biochemistry 26, 263
3 (1987)) を乗算して算出されたエリトロポエチンポリ
ペプチドmg/A280 である（即ち、エリトロポエチン1.34
5mg/A280×ポリペプチド0.60mg／mgエリトロポエチン＝
ポリペプチド0.807mg/A280) 。更に、単位／mgエリトロ
ポエチンポリペプチドで表された比活性に、ポリペプチ
ド0.60mg／mgエリトロポエチン糖タンパク質という係数
を乗算すると、比活性を単位／mgエリトロポエチン糖タ
ンパク質で表すことができる。
【００５８】
【表２】 表２のデータは図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃのグラフにも
示されている。これらのデータは、エリトロポエチンの
相対in vivo 活性がイソ形#11 まではシアル酸含量の関
数として増加することを示す。イソ形11〜14は本質的に
同じ相対的 invivo生物活性を有している。（このこと
はイソ形14の濃度をBradfordアッセイを用いて表すとき
に極めて明らかである。イソ形14に関してはBradford値
が最も正確であろう。何故なら、得られる結果が概して
低レベルであるため A280 による測定は難しく、またＲ
ＩＡではまさに上述のような陰性形態の反応性減少が最
も明白に生じるからである）。シアル酸の含量が多いほ
どエリトロポエチンイソ形の相対的in vivo 比活性が大
きい理由は恐らく、これらの形の血流中の半減期がより
長いからであろう。イソ形９及び13を放射性ヨウ素（12
5Ｉ）で標識し、ラット中でのクリアランス率を測定し
た。血流中の半減期はイソ形13のほうがイソ形９よりも
かなり長かった。実施例４：Ｑ−セファロースクロマトグラフィーによる
組換えエリトロポエチンイソ形混合物の選択 Lin ら、前出、に記載の手順に従って組換えエリトロポ
エチンを産生した細胞馴化培地を濃縮し、10mMのTris,
pH 7.2に対し透析濾過する。ウシ血清アルブミンを標準
として用いるBradfordマイクロタンパク質アッセイによ
ってタンパク質濃度を測定する。40mgの総タンパク質を
含有する19.6mlの溶液をCuSO4中で20μMにし、カットオ
フサイズ0.45ミクロンのフィルターで濾過し、４℃の10
mMのTris,pH 6.8〜7.0 で平衡化しておいたＱ−セファ
ロースFast Flow (Pharmacia) を充填したベッドボリュ
ーム４ml（高さ1.05cm×直径2.２cm）のカラムに充填す
る。試料を添加した後、カラム容量の２倍の同じ緩衝液
でカラムを洗浄する。カラムの流速は約１ml／分であ
る。所定のエリトロポエチンイソ形混合物を選択するた
めにこの手順を用いる個別の６個のカラムを準備する。
示されている。これらのデータは、エリトロポエチンの
相対in vivo 活性がイソ形#11 まではシアル酸含量の関
数として増加することを示す。イソ形11〜14は本質的に
同じ相対的 invivo生物活性を有している。（このこと
はイソ形14の濃度をBradfordアッセイを用いて表すとき
に極めて明らかである。イソ形14に関してはBradford値
が最も正確であろう。何故なら、得られる結果が概して
低レベルであるため A280 による測定は難しく、またＲ
ＩＡではまさに上述のような陰性形態の反応性減少が最
も明白に生じるからである）。シアル酸の含量が多いほ
どエリトロポエチンイソ形の相対的in vivo 比活性が大
きい理由は恐らく、これらの形の血流中の半減期がより
長いからであろう。イソ形９及び13を放射性ヨウ素（12
5Ｉ）で標識し、ラット中でのクリアランス率を測定し
た。血流中の半減期はイソ形13のほうがイソ形９よりも
かなり長かった。実施例４：Ｑ−セファロースクロマトグラフィーによる
組換えエリトロポエチンイソ形混合物の選択 Lin ら、前出、に記載の手順に従って組換えエリトロポ
エチンを産生した細胞馴化培地を濃縮し、10mMのTris,
pH 7.2に対し透析濾過する。ウシ血清アルブミンを標準
として用いるBradfordマイクロタンパク質アッセイによ
ってタンパク質濃度を測定する。40mgの総タンパク質を
含有する19.6mlの溶液をCuSO4中で20μMにし、カットオ
フサイズ0.45ミクロンのフィルターで濾過し、４℃の10
mMのTris,pH 6.8〜7.0 で平衡化しておいたＱ−セファ
ロースFast Flow (Pharmacia) を充填したベッドボリュ
ーム４ml（高さ1.05cm×直径2.２cm）のカラムに充填す
る。試料を添加した後、カラム容量の２倍の同じ緩衝液
でカラムを洗浄する。カラムの流速は約１ml／分であ
る。所定のエリトロポエチンイソ形混合物を選択するた
めにこの手順を用いる個別の６個のカラムを準備する。
【００５９】カラム容量の６〜９倍の低pH緩衝液でカラ
ムを洗浄する。緩衝液は、カラム#1では、NaOHでpH 4.7
に調整した150mM の酢酸、１mMのグリシン、20μMのCuS
O4、６M の尿素から成り、カラム#2では、NaOHでpH 4.7
に調整した200mM の酢酸、１mMのグリシン、20μM のCu
SO4 、６M の尿素から成り、カラム#3では、NaOHでpH4.
7に調整した250mM の酢酸、１mMのグリシン、20μM のC
uSO4 、６M の尿素から成り、カラム#4では、NaOHでpH
4.7に調整した300mM の酢酸、１mMのグリシン、20μM
のCuSO4 、６M の尿素から成り、カラム#5では、150mM
の酢酸、１mMのグリシン、20μM のCuSO4 、６M の尿素
から成り、カラム#6では、300mM の酢酸、１mMのグリシ
ン、20μM のCuSO4 、６M の尿素から成る。カラム容量
の８〜11倍の10mMのTris-HCl、55mMのNaCl、20μM のCu
SO4 ，pH７によって各カラムを洗浄することによってカ
ラムのpHを約７に上げる。10mMのTris-HCl、140mM のNa
Cl、20μM のCuSO4 ，pH 7.0で洗浄することによって、
所定のエリトロポエチンイソ形混合物をカラムから溶出
させる。
ムを洗浄する。緩衝液は、カラム#1では、NaOHでpH 4.7
に調整した150mM の酢酸、１mMのグリシン、20μMのCuS
O4、６M の尿素から成り、カラム#2では、NaOHでpH 4.7
に調整した200mM の酢酸、１mMのグリシン、20μM のCu
SO4 、６M の尿素から成り、カラム#3では、NaOHでpH4.
7に調整した250mM の酢酸、１mMのグリシン、20μM のC
uSO4 、６M の尿素から成り、カラム#4では、NaOHでpH
4.7に調整した300mM の酢酸、１mMのグリシン、20μM
のCuSO4 、６M の尿素から成り、カラム#5では、150mM
の酢酸、１mMのグリシン、20μM のCuSO4 、６M の尿素
から成り、カラム#6では、300mM の酢酸、１mMのグリシ
ン、20μM のCuSO4 、６M の尿素から成る。カラム容量
の８〜11倍の10mMのTris-HCl、55mMのNaCl、20μM のCu
SO4 ，pH７によって各カラムを洗浄することによってカ
ラムのpHを約７に上げる。10mMのTris-HCl、140mM のNa
Cl、20μM のCuSO4 ，pH 7.0で洗浄することによって、
所定のエリトロポエチンイソ形混合物をカラムから溶出
させる。
【００６０】各カラムから溶出したイソ形プールを濃縮
し、Amicon Centricon-10 微量濃縮装置を用いて溶媒を
水に交換する。これらの濃縮プールの分析用等電点電気
泳動の結果を図３に示す。ゲルレーン１〜６は、カラム
１〜６から夫々溶出した所定のエリトロポエチンイソ形
混合物を示す。図３の右端のゲルレーンに示す「イソ形
混合物」は、上述のようなＱ−セファロースカラムに添
加される細胞培地を示す。５mMの酢酸、１mMのグリシ
ン、20μM のCuSO4 、６M の尿素でカラムを洗浄し、上
述の手順を用いてエリトロポエチンイソ形混合物をカラ
ムから溶出させる。溶出したこのイソ形混合物を分析用
等電点電気泳動に掛ける前に Laiら、前出、に記載の手
順に従って更に精製する。実施例５：Ｑ−セファロース上の低pH勾配を用いる組換
えエリトロポエチンイソ形の分画 別の手順では、pH漸減及びイオン強度漸増の勾配の勾配
を用いてエリトロポエチンイソ形を分離する。濃縮し透
析濾過したエリトロポエチン含有培地を、ゲル１mlあた
り総タンパク質約40mgの割合でＱ−セファロースカラム
に充填する。次に、カラム容量の約２倍の10mMのTris-H
Cl，pH 7.0でカラムを洗浄し、次いでカラム容量の約10
倍の２mMの酢酸／１mMのグリシン／20μM のCuSO4 ／６
M の尿素(pH 約4.8)で洗浄して、夾雑タンパク質及び約
７個未満のシアル酸残基を含むエリトロポエチンイソ形
を除去する。６M の尿素／１mMのグリシン／20μM のCu
SO4中の約２mMの酢酸から出発して40mMの酢酸／６M の
尿素／１mMのグリシン／20μM のCuSO4 (pH 約４）に到
達する勾配を用いて、約８個から約12個のシアル酸を含
むイソ形をカラムから溶出させる。勾配の総容量はカラ
ム容量の約40倍であり、約１カラム容量の各分画を容器
に収集する。この容器は、収集した分画が低pHに長期間
接触することを防止するために、pHを６〜8.５の範囲に
維持する十分な量のTris緩衝液を収容している。分画の
アリコートを分析用等電点電気泳動にかけて分離をモニ
ターする。
し、Amicon Centricon-10 微量濃縮装置を用いて溶媒を
水に交換する。これらの濃縮プールの分析用等電点電気
泳動の結果を図３に示す。ゲルレーン１〜６は、カラム
１〜６から夫々溶出した所定のエリトロポエチンイソ形
混合物を示す。図３の右端のゲルレーンに示す「イソ形
混合物」は、上述のようなＱ−セファロースカラムに添
加される細胞培地を示す。５mMの酢酸、１mMのグリシ
ン、20μM のCuSO4 、６M の尿素でカラムを洗浄し、上
述の手順を用いてエリトロポエチンイソ形混合物をカラ
ムから溶出させる。溶出したこのイソ形混合物を分析用
等電点電気泳動に掛ける前に Laiら、前出、に記載の手
順に従って更に精製する。実施例５：Ｑ−セファロース上の低pH勾配を用いる組換
えエリトロポエチンイソ形の分画 別の手順では、pH漸減及びイオン強度漸増の勾配の勾配
を用いてエリトロポエチンイソ形を分離する。濃縮し透
析濾過したエリトロポエチン含有培地を、ゲル１mlあた
り総タンパク質約40mgの割合でＱ−セファロースカラム
に充填する。次に、カラム容量の約２倍の10mMのTris-H
Cl，pH 7.0でカラムを洗浄し、次いでカラム容量の約10
倍の２mMの酢酸／１mMのグリシン／20μM のCuSO4 ／６
M の尿素(pH 約4.8)で洗浄して、夾雑タンパク質及び約
７個未満のシアル酸残基を含むエリトロポエチンイソ形
を除去する。６M の尿素／１mMのグリシン／20μM のCu
SO4中の約２mMの酢酸から出発して40mMの酢酸／６M の
尿素／１mMのグリシン／20μM のCuSO4 (pH 約４）に到
達する勾配を用いて、約８個から約12個のシアル酸を含
むイソ形をカラムから溶出させる。勾配の総容量はカラ
ム容量の約40倍であり、約１カラム容量の各分画を容器
に収集する。この容器は、収集した分画が低pHに長期間
接触することを防止するために、pHを６〜8.５の範囲に
維持する十分な量のTris緩衝液を収容している。分画の
アリコートを分析用等電点電気泳動にかけて分離をモニ
ターする。
【００６１】図４は、この手順によって達成されたイソ
形８〜11の分離を示す。勾配の終端でカラムに結合して
維持されたイソ形12〜14は、10mMのTris-HCl、140mM の
NaCl、20mMのCuSO4 (pH 7.0)から成る緩衝液で洗浄する
ことによって溶出させる。（勾配中で分離したかまたは
塩化ナトリウム溶液によって溶出した）イソ形を、Lai
らの実施例２に記載のような逆相クロマトグラフィー及
びゲル濾過クロマトグラフィーで順次処理して夾雑タン
パク質を除去する。実施例６：ヒトエリトロポエチン類似体の構築 ヒトエリトロポエチンアミノ酸配列内部の既存の炭水化
物結合部位の位置を図５に示す（SEQ ID.NO:26) 。エリ
トロポエチンの付加的グリコシレーション部位の作製手
順を図６Ａ−Ｃに要約し以下に説明する。
形８〜11の分離を示す。勾配の終端でカラムに結合して
維持されたイソ形12〜14は、10mMのTris-HCl、140mM の
NaCl、20mMのCuSO4 (pH 7.0)から成る緩衝液で洗浄する
ことによって溶出させる。（勾配中で分離したかまたは
塩化ナトリウム溶液によって溶出した）イソ形を、Lai
らの実施例２に記載のような逆相クロマトグラフィー及
びゲル濾過クロマトグラフィーで順次処理して夾雑タン
パク質を除去する。実施例６：ヒトエリトロポエチン類似体の構築 ヒトエリトロポエチンアミノ酸配列内部の既存の炭水化
物結合部位の位置を図５に示す（SEQ ID.NO:26) 。エリ
トロポエチンの付加的グリコシレーション部位の作製手
順を図６Ａ−Ｃに要約し以下に説明する。
【００６２】in vitro突然変異誘発に使用するために以
下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。 ［Asn4，Ser6］EPO:5'CGCCCACCAAACCTCAGCTGTGACAGCCGA
3'（SEQ ID NO:１)； ［Asn9，Ser11］EPO:5'ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT3'
（SEQ ID NO:２)； ［Asn69］EPO:5'GGGCCTGGCCAACCTGTCGGAAG3'（SEQ ID N
O:３)； ［Asn124］EPO:5'TCCCCTCCAGATAATGCCTCAGCTGC3'（SEQ
ID NO:４)； ［Asn125，Ser127］EPO:5'CAGATGCGAACTCATCTGCTCCAC3'
（SEQ ID NO:５)； ［Asn163，Ser165］EPO:5'AGGCCTGCAGGAATGGGAGCAGATGA
CCAGGTG3'（SEQ ID NO:６)； ［Thr125］EPO:5'TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC3'（SEQ ID
NO:７)； ［Pro124，Thr125］EPO:5'CCTCCAGATCCGACCTCAGCTGC3'
（SEQ ID NO:８)。
下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。 ［Asn4，Ser6］EPO:5'CGCCCACCAAACCTCAGCTGTGACAGCCGA
3'（SEQ ID NO:１)； ［Asn9，Ser11］EPO:5'ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT3'
（SEQ ID NO:２)； ［Asn69］EPO:5'GGGCCTGGCCAACCTGTCGGAAG3'（SEQ ID N
O:３)； ［Asn124］EPO:5'TCCCCTCCAGATAATGCCTCAGCTGC3'（SEQ
ID NO:４)； ［Asn125，Ser127］EPO:5'CAGATGCGAACTCATCTGCTCCAC3'
（SEQ ID NO:５)； ［Asn163，Ser165］EPO:5'AGGCCTGCAGGAATGGGAGCAGATGA
CCAGGTG3'（SEQ ID NO:６)； ［Thr125］EPO:5'TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC3'（SEQ ID
NO:７)； ［Pro124，Thr125］EPO:5'CCTCCAGATCCGACCTCAGCTGC3'
（SEQ ID NO:８)。
【００６３】下線を付したコドンは、野生型アミノ酸が
括弧内のアミノ酸によって置換された不適正領域を示
す。SEQ ID NO:は配列番号を示す。Asn4にＮ−グリコシ
レーション部位を付加するために［Asn4，Ser6］EPO を
構築した。Asn９にＮ−グリコシレーション部位を付加
するために［Asn9，Ser11］EPO を構築した。Asn６９
にＮ−グリコシレーション部位を付加するために［Asn
69］EPO を構築した。Asn125にＮ−グリコシレーション
部位を付加するために［Asn125，Ser127］EPO を構築し
た。Thr125にＯ−グリコシレーション部位を付加するた
めに［Thr125］EPO 及び［Pro124，Thr125］EPO を構築
した。
括弧内のアミノ酸によって置換された不適正領域を示
す。SEQ ID NO:は配列番号を示す。Asn4にＮ−グリコシ
レーション部位を付加するために［Asn4，Ser6］EPO を
構築した。Asn９にＮ−グリコシレーション部位を付加
するために［Asn9，Ser11］EPO を構築した。Asn６９
にＮ−グリコシレーション部位を付加するために［Asn
69］EPO を構築した。Asn125にＮ−グリコシレーション
部位を付加するために［Asn125，Ser127］EPO を構築し
た。Thr125にＯ−グリコシレーション部位を付加するた
めに［Thr125］EPO 及び［Pro124，Thr125］EPO を構築
した。
【００６４】in vivo 突然変異誘発に使用するために以
下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。 ［Asn69, Thr71］EPO:5'GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGCTGTC
3'（SEQ ID NO:９)； ［Ser68, Asn69, Thr71］EPO:5'CAGGGCCTGTCCAACCTGACA
GAAGCTGTC3'（SEQ ID NO:10)； ［Asn125, Thr127］EPO:5'CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC3'
（SEQ ID NO:11)； ［Asn125, Thr127, Thr131］EPO:5'ATGCGAACTCAACGGCTC
CACTCACAACAATCACT3'（SEQ ID NO:12)； ［Pro124, Asn125, Ser127］EPO:5'CCAGATCCAAATTCATCT
GCTCCACTC3'（SEQ ID NO:13)； ［Pro124, Asn125, Thr127］EPO:5'CCAGATCCAAATTCAACA
GCTCCACTC3'（SEQ ID NO:14)； ［The125, Thr126］EPO:5'CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA3'
（SEQ ID NO:15)。 ［Pro124, Thr125, Thr126, Thr131］EPOの作製:［Pro
124, Thr125］EPO cDNAから出発し、オリゴヌクレオチ
ドプライマー5'AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC3'(SEQ IDNO.1
6)を使用して、[Pro124, Thr125, Thr126] EPOを作製す
る。次にオリゴヌクレオチドプライマー5'TGCTCCACTCAC
AACAATCACTG3'(SEQ ID.:17)を使用して、［Pro124, Thr
125, Thr126, Thr131］EPO を作製する。
下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。 ［Asn69, Thr71］EPO:5'GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGCTGTC
3'（SEQ ID NO:９)； ［Ser68, Asn69, Thr71］EPO:5'CAGGGCCTGTCCAACCTGACA
GAAGCTGTC3'（SEQ ID NO:10)； ［Asn125, Thr127］EPO:5'CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC3'
（SEQ ID NO:11)； ［Asn125, Thr127, Thr131］EPO:5'ATGCGAACTCAACGGCTC
CACTCACAACAATCACT3'（SEQ ID NO:12)； ［Pro124, Asn125, Ser127］EPO:5'CCAGATCCAAATTCATCT
GCTCCACTC3'（SEQ ID NO:13)； ［Pro124, Asn125, Thr127］EPO:5'CCAGATCCAAATTCAACA
GCTCCACTC3'（SEQ ID NO:14)； ［The125, Thr126］EPO:5'CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA3'
（SEQ ID NO:15)。 ［Pro124, Thr125, Thr126, Thr131］EPOの作製:［Pro
124, Thr125］EPO cDNAから出発し、オリゴヌクレオチ
ドプライマー5'AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC3'(SEQ IDNO.1
6)を使用して、[Pro124, Thr125, Thr126] EPOを作製す
る。次にオリゴヌクレオチドプライマー5'TGCTCCACTCAC
AACAATCACTG3'(SEQ ID.:17)を使用して、［Pro124, Thr
125, Thr126, Thr131］EPO を作製する。
【００６５】Asn69 にＮ−グリコシレーション部位を付
加しこの部位のＮ−グリコシレーションを強化するため
に［Asn69, Thr71］EPO 及び［Ser68, Asn69, Thr71］
EPOを構築する。Asn125にＮ−グリコシレーション部位
を付加しこの部位のグリコシレーションを強化するため
に［Asn125, Thr127］EPO 、[Asn125, Thr127, Thr131]
EPO 、[Pro124, Asn125, Ser127] EPO及び［Pro124, As
n125, Thr127］EPO を構築する。Thr125にＯ−グルコシ
レーション部位を付加しこの部位のグリコシレーション
を強化するために、[Thr125, Thr126] EPO及び［Pr
o124, Thr125, Thr126, Ser131］EPO を構築する。
加しこの部位のＮ−グリコシレーションを強化するため
に［Asn69, Thr71］EPO 及び［Ser68, Asn69, Thr71］
EPOを構築する。Asn125にＮ−グリコシレーション部位
を付加しこの部位のグリコシレーションを強化するため
に［Asn125, Thr127］EPO 、[Asn125, Thr127, Thr131]
EPO 、[Pro124, Asn125, Ser127] EPO及び［Pro124, As
n125, Thr127］EPO を構築する。Thr125にＯ−グルコシ
レーション部位を付加しこの部位のグリコシレーション
を強化するために、[Thr125, Thr126] EPO及び［Pr
o124, Thr125, Thr126, Ser131］EPO を構築する。
【００６６】in vitro突然変異誘発用エリトロポエチン
ＤＮＡのソースは、プラスミドHu13、pUC8中のヒトエリ
トロポエチンｃＤＮＡクローンであった（Law ら、Proc
Natl. Acad. Sci. 83, 6920 (1986))。Hu13に由来のプ
ラスミドＤＮＡを、BstEII及びBglII 制限酵素で消化
し、得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気
泳動にかけ、 810塩基対（bp) のエリトロポエチンＤＮ
Ａフラグメントを、GeneCleanTMキット及び製造業者に
よって提供された手順（BIO 101, Inc.)を用いてゲルか
ら単離した。Lin 特許、前出、に記載されているよう
に、プラスミドpBRgHuEPO は、エリトロポエチンゲノム
遺伝子をpBR322の誘導体に挿入されたBamHIフラグメン
トとして含む。pBRgHuEPO を同じくBstEII及びBglII で
消化し、6517bpのベクターフラグメントを回収した。２
つのフラグメントを結合してIGT1が得られた。pEC-1 を
構築するために、pDSVL (Lin特許、前出、に記載及び図
５Ｂに図示）をBamHI で消化し、エリトロポエチンｃＤ
ＮＡ含有のIGT1に由来の2.8キロ塩基（kb) の単離BamHI
フラグメントIGT1に結合した。
ＤＮＡのソースは、プラスミドHu13、pUC8中のヒトエリ
トロポエチンｃＤＮＡクローンであった（Law ら、Proc
Natl. Acad. Sci. 83, 6920 (1986))。Hu13に由来のプ
ラスミドＤＮＡを、BstEII及びBglII 制限酵素で消化
し、得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気
泳動にかけ、 810塩基対（bp) のエリトロポエチンＤＮ
Ａフラグメントを、GeneCleanTMキット及び製造業者に
よって提供された手順（BIO 101, Inc.)を用いてゲルか
ら単離した。Lin 特許、前出、に記載されているよう
に、プラスミドpBRgHuEPO は、エリトロポエチンゲノム
遺伝子をpBR322の誘導体に挿入されたBamHIフラグメン
トとして含む。pBRgHuEPO を同じくBstEII及びBglII で
消化し、6517bpのベクターフラグメントを回収した。２
つのフラグメントを結合してIGT1が得られた。pEC-1 を
構築するために、pDSVL (Lin特許、前出、に記載及び図
５Ｂに図示）をBamHI で消化し、エリトロポエチンｃＤ
ＮＡ含有のIGT1に由来の2.8キロ塩基（kb) の単離BamHI
フラグメントIGT1に結合した。
【００６７】in vitro突然変異誘発用の一本鎖ＤＮＡを
作製するために、pEC-1 をBamHI及びBglII で消化し、8
20bp のエリトロポエチンｃＤＮＡフラグメントを単離
した。このフラグメントをm13mp18のBamHI部位に結合し
てm13-EC-1を作製した。Kunkelら、Methods in Enzymo
l. 154, 367 (1987) 及びMessing、Methods in Enzymo
l. 101, 20 (1983)に記載された手順でm13-EC-1に感染
させた大腸菌RZ1032株の上清から一本鎖ＤＮＡを回収し
た。in vitro突然変異誘発のために、約１μg の一本鎖
ＤＮＡと0.２ピコモルの上記合成プライマーの１つと
を、６μlの緩衝液（250 mMのTris, pH 7.8, 50mMのMgC
l2 及び50mMのジチオトレイトール）と混合した。プラ
イマーを鋳型にアニーリングするために、反応容量を水
で10μl に調整し、混合物を65℃で５分間加熱し、次い
で室温まで放冷した。伸長反応のために、各 2.5μl の
dTTP、dATP、dGTP、dCTP及びATP （すべて10μM)を添加
し、次いで１μl（１単位）の大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼ（Klenowフラグメント）と１μl（１単位）のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼと添加した。次に混合物を14℃で一夜イン
キュベートし、記載された手順（Messing 、前出）で大
腸菌JM109 (Yanisch-Perron ら、Gene 33, 103 (1985))
の形質転換に使用した。
作製するために、pEC-1 をBamHI及びBglII で消化し、8
20bp のエリトロポエチンｃＤＮＡフラグメントを単離
した。このフラグメントをm13mp18のBamHI部位に結合し
てm13-EC-1を作製した。Kunkelら、Methods in Enzymo
l. 154, 367 (1987) 及びMessing、Methods in Enzymo
l. 101, 20 (1983)に記載された手順でm13-EC-1に感染
させた大腸菌RZ1032株の上清から一本鎖ＤＮＡを回収し
た。in vitro突然変異誘発のために、約１μg の一本鎖
ＤＮＡと0.２ピコモルの上記合成プライマーの１つと
を、６μlの緩衝液（250 mMのTris, pH 7.8, 50mMのMgC
l2 及び50mMのジチオトレイトール）と混合した。プラ
イマーを鋳型にアニーリングするために、反応容量を水
で10μl に調整し、混合物を65℃で５分間加熱し、次い
で室温まで放冷した。伸長反応のために、各 2.5μl の
dTTP、dATP、dGTP、dCTP及びATP （すべて10μM)を添加
し、次いで１μl（１単位）の大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼ（Klenowフラグメント）と１μl（１単位）のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼと添加した。次に混合物を14℃で一夜イン
キュベートし、記載された手順（Messing 、前出）で大
腸菌JM109 (Yanisch-Perron ら、Gene 33, 103 (1985))
の形質転換に使用した。
【００６８】識別用ハイブリダイゼーションによって突
然変異クローンを同定するために、栄養寒天上のプラー
クをGene Screen フィルター（New England Nuclear)に
移した。フィルターを加熱ランプ下に乾燥し、次いで１
％ＳＤＳ含有の６×ＳＳＣ中で60℃で１時間インキュベ
ートした。ハイブリダイゼーションのために、上記オリ
ゴヌクレオチドプライマー（８ピコモル）を、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ及びγ32Ｐ−標識ＡＴＰで末端標
識し、フィルターと共に６×ＳＳＣ、0.５％ＳＤＳ及び
100mg/ml のサケ精子ＤＮＡ中で、［Asn124］突然変異
のためには37℃、［Asn4, Ser6］突然変異のためには55
℃、［Thr125］及び［Pro124, Thr125］突然変異のため
には65℃並びに［Asn9, Ser11］及び［Asn163，Se
r165］突然変異のためには70℃で、一夜インキュベート
した。翌日、フィルターを６×ＳＳＣによって室温で３
回洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた。必要な場
合には、野生型エリトロポエチンｃＤＮＡ配列を有する
プラークへのハイブリダイゼーションがほとんどまたは
全く検出されなくなるまで温度を上げながら６×ＳＳＣ
中でフィルターを洗浄した。これらの条件下で陽性のハ
イブリダイゼーションシグナルを与えたクローンを同定
し、純粋なクローンを単離するためにJM109 に再度トラ
ンスフェクトした。ジデオキシチェーンターミネーショ
ン配列分析は、アスパラギン、セリン、トレオニン及び
プロリン残基への突然変異が存在することを示した。
然変異クローンを同定するために、栄養寒天上のプラー
クをGene Screen フィルター（New England Nuclear)に
移した。フィルターを加熱ランプ下に乾燥し、次いで１
％ＳＤＳ含有の６×ＳＳＣ中で60℃で１時間インキュベ
ートした。ハイブリダイゼーションのために、上記オリ
ゴヌクレオチドプライマー（８ピコモル）を、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ及びγ32Ｐ−標識ＡＴＰで末端標
識し、フィルターと共に６×ＳＳＣ、0.５％ＳＤＳ及び
100mg/ml のサケ精子ＤＮＡ中で、［Asn124］突然変異
のためには37℃、［Asn4, Ser6］突然変異のためには55
℃、［Thr125］及び［Pro124, Thr125］突然変異のため
には65℃並びに［Asn9, Ser11］及び［Asn163，Se
r165］突然変異のためには70℃で、一夜インキュベート
した。翌日、フィルターを６×ＳＳＣによって室温で３
回洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた。必要な場
合には、野生型エリトロポエチンｃＤＮＡ配列を有する
プラークへのハイブリダイゼーションがほとんどまたは
全く検出されなくなるまで温度を上げながら６×ＳＳＣ
中でフィルターを洗浄した。これらの条件下で陽性のハ
イブリダイゼーションシグナルを与えたクローンを同定
し、純粋なクローンを単離するためにJM109 に再度トラ
ンスフェクトした。ジデオキシチェーンターミネーショ
ン配列分析は、アスパラギン、セリン、トレオニン及び
プロリン残基への突然変異が存在することを示した。
【００６９】［Asn4，Ser6］、［Asn9，Ser11］、［Asn
69］、［Asn124］、［Asn125］、［Ser127］、［As
n163，Ser165］、［Thr125］及び［Pro124，Thr125］の
ような変異を含む二本鎖m13-EC-1 DNA沸騰法（Holmes
ら、Anal. Biochem 117, 193 (1981))によって、トラン
スフェクトJM109 細胞から回収した。ＤＮＡをBstEII及
びXhoII によって消化し、810bp のエリトロポエチンＤ
ＮＡフラグメントを単離した。pEC-1 をBstEIIで消化し
次いでBglII で部分消化し、得られたフラグメントの5'
末端を、10mMのTris, pH８中の細菌性アルカリホスファ
ターゼによって60℃で60分間脱リン酸処理した。810bp
のBstEII-BglIIフラグメントが欠失した７kbのベクター
フラグメントを単離し、上記のエリトロポエチンフラグ
メントに結合した。得られたプラスミド（pEC-X と命
名、このＸは類似体番号）は指定位置に変異アミノ酸残
基を有するエリトロポエチン類似体をコードするＤＮＡ
を含んでいる。
69］、［Asn124］、［Asn125］、［Ser127］、［As
n163，Ser165］、［Thr125］及び［Pro124，Thr125］の
ような変異を含む二本鎖m13-EC-1 DNA沸騰法（Holmes
ら、Anal. Biochem 117, 193 (1981))によって、トラン
スフェクトJM109 細胞から回収した。ＤＮＡをBstEII及
びXhoII によって消化し、810bp のエリトロポエチンＤ
ＮＡフラグメントを単離した。pEC-1 をBstEIIで消化し
次いでBglII で部分消化し、得られたフラグメントの5'
末端を、10mMのTris, pH８中の細菌性アルカリホスファ
ターゼによって60℃で60分間脱リン酸処理した。810bp
のBstEII-BglIIフラグメントが欠失した７kbのベクター
フラグメントを単離し、上記のエリトロポエチンフラグ
メントに結合した。得られたプラスミド（pEC-X と命
名、このＸは類似体番号）は指定位置に変異アミノ酸残
基を有するエリトロポエチン類似体をコードするＤＮＡ
を含んでいる。
【００７０】または、アミノ酸残基41−55を欠失させる
in vitro突然変異誘発によってエリトロポエチン類似体
（pEC34)を構築した。この結果としては、より小さい(7
75bp)のＥＰＯ含有BstEII-BglIIフラグメントが得られ
た。このフラグメントを上述のようにpEC1に挿入した。
エリトロポエチン類似体をクローニングするために、上
述のようにpEC34 をBstEIIで消化し、BglII で部分消化
し、脱リン酸化し、ベクターを単離した。７kbのベクタ
ーフラグメントを次に、上記のエリトロポエチンフラグ
メントに結合した。pEC34 と共にクローニングすること
によって組換え体と異なる再閉鎖とを容易に識別し得
る。再閉鎖の場合には類似体よりも小さいBstEII-BglII
フラグメントが生じ、これらはアガロースゲル上で識別
が容易である。これらの汎用手順を使用して表３、４及
び５に示すエリトロポエチン類似体を構築した。各類似
体毎にＤＮＡ配列変異を示している。また、突然変異誘
発に使用したオリゴヌクレオチドプライマーはヒトエリ
トロポエチンの配列に相補性の配列を有していた。
in vitro突然変異誘発によってエリトロポエチン類似体
（pEC34)を構築した。この結果としては、より小さい(7
75bp)のＥＰＯ含有BstEII-BglIIフラグメントが得られ
た。このフラグメントを上述のようにpEC1に挿入した。
エリトロポエチン類似体をクローニングするために、上
述のようにpEC34 をBstEIIで消化し、BglII で部分消化
し、脱リン酸化し、ベクターを単離した。７kbのベクタ
ーフラグメントを次に、上記のエリトロポエチンフラグ
メントに結合した。pEC34 と共にクローニングすること
によって組換え体と異なる再閉鎖とを容易に識別し得
る。再閉鎖の場合には類似体よりも小さいBstEII-BglII
フラグメントが生じ、これらはアガロースゲル上で識別
が容易である。これらの汎用手順を使用して表３、４及
び５に示すエリトロポエチン類似体を構築した。各類似
体毎にＤＮＡ配列変異を示している。また、突然変異誘
発に使用したオリゴヌクレオチドプライマーはヒトエリ
トロポエチンの配列に相補性の配列を有していた。
【００７１】
【表３】
【００７２】
【表４】
【００７３】
【表５】 プラスミド pDSα2 の誘導体であるpDECΔにエリトロポ
エチンｃＤＮＡを挿入することによってpDEC-X（Ｘは類
似体番号）と命名されたプラスミドを構築した。発現ベ
クター pDSα2 は、ＰＣＴ特許出願No.WO90/14363 に概
説されている。pDECΔは pDSα2 から以下の段階によっ
て誘導された。
エチンｃＤＮＡを挿入することによってpDEC-X（Ｘは類
似体番号）と命名されたプラスミドを構築した。発現ベ
クター pDSα2 は、ＰＣＴ特許出願No.WO90/14363 に概
説されている。pDECΔは pDSα2 から以下の段階によっ
て誘導された。
【００７４】（１） pDSα2 のＤＮＡをHindIII で消化
し、HindIII 付着末端を大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ
（Klenowフラグメント）及びdNTPで処理し、平滑末端化
ベクターを再結合することによって、 pDSα2 のHindII
I 部位を欠失させた。得られたプラスミドは pDSα2ΔH
であった。 （２） pDSα2ΔH をSalIで消化し、これにSV40スプラ
イスシグナルをスプライスシグナルの3'端に結合したSa
lIリンカーと共に有する合成オリゴヌクレオチドを結合
した。合成オリゴヌクレオチドは以下の配列（SEQ ID N
O:18)を有していた。 5'TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTT
GTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTG
CTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACT
TCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC3'。 得られたプラスミドは pDSα2ΔH スプライスであっ
た。
し、HindIII 付着末端を大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ
（Klenowフラグメント）及びdNTPで処理し、平滑末端化
ベクターを再結合することによって、 pDSα2 のHindII
I 部位を欠失させた。得られたプラスミドは pDSα2ΔH
であった。 （２） pDSα2ΔH をSalIで消化し、これにSV40スプラ
イスシグナルをスプライスシグナルの3'端に結合したSa
lIリンカーと共に有する合成オリゴヌクレオチドを結合
した。合成オリゴヌクレオチドは以下の配列（SEQ ID N
O:18)を有していた。 5'TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTT
GTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTG
CTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACT
TCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC3'。 得られたプラスミドは pDSα2ΔH スプライスであっ
た。
【００７５】（３） pDSα2ΔH スプライスをSalIで消
化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びdNTPで付着末端を処
理することによって平滑末端化した。820bp のBanHI-Bg
lIIヒトエリトロポエチンｃＤＮＡフラグメントを同じ
方法で平滑末端化し、プラスミドに結合した。得られた
プラスミドはpDEC-1であった。 （４）pDECをKpnI及びPvuII で消化し、付着末端をmung
bean ヌクレアーゼで処理することによって平滑末端化
した。切除したKpnI-PvuIIフラグメントを欠失させるた
めにプラスミドを再結合させてプラスミドpDECΔを得
た。
化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びdNTPで付着末端を処
理することによって平滑末端化した。820bp のBanHI-Bg
lIIヒトエリトロポエチンｃＤＮＡフラグメントを同じ
方法で平滑末端化し、プラスミドに結合した。得られた
プラスミドはpDEC-1であった。 （４）pDECをKpnI及びPvuII で消化し、付着末端をmung
bean ヌクレアーゼで処理することによって平滑末端化
した。切除したKpnI-PvuIIフラグメントを欠失させるた
めにプラスミドを再結合させてプラスミドpDECΔを得
た。
【００７６】BstEIIで完全消化し次いでBglII で部分消
化することによってpDECΔからpDEC-Xプラスミドを作製
した。エリトロポエチンコーディング配列の欠失したベ
クターフラグメントを単離し、所望のプラスミドを含む
810bp のBstEII-BglIIフラグメントに結合した。複数の
アミノ酸変異を有するいくつかの類似体の構築を以下に
詳細に説明する。pDEC(N47)及びpDEC(N48)の構築 Asn30, Thr32, Val87, Asn88及びThr90 突然変異を含む
pDEC(N47)を、pDEC(N18)及びpDEC(N4)から構築した。pD
EC(N18) をHindII及びBglII で消化し、445bpのフラグ
メントを単離した。pDEC(N4)をBstEII及びHindIII で消
化し、377bp のフラグメントを単離した。これらの２つ
のフラグメントを、上述のようにBstEII及びBglII で切
断したpDECΔに結合してpEDC(N47) を得た。
化することによってpDECΔからpDEC-Xプラスミドを作製
した。エリトロポエチンコーディング配列の欠失したベ
クターフラグメントを単離し、所望のプラスミドを含む
810bp のBstEII-BglIIフラグメントに結合した。複数の
アミノ酸変異を有するいくつかの類似体の構築を以下に
詳細に説明する。pDEC(N47)及びpDEC(N48)の構築 Asn30, Thr32, Val87, Asn88及びThr90 突然変異を含む
pDEC(N47)を、pDEC(N18)及びpDEC(N4)から構築した。pD
EC(N18) をHindII及びBglII で消化し、445bpのフラグ
メントを単離した。pDEC(N4)をBstEII及びHindIII で消
化し、377bp のフラグメントを単離した。これらの２つ
のフラグメントを、上述のようにBstEII及びBglII で切
断したpDECΔに結合してpEDC(N47) を得た。
【００７７】Asn69, Thr71, Ser87, Asn88及びThr90 突
然変異を含むpDEC(N48)を、pDEC(N14)及びpDEC(N11) か
ら構築した。pDEC(N14) をHindII及びBglII で消化し、
445bp のフラグメントを単離した。pDEC(N11) をBstEII
及びHindIII で消化し、377bp のフラグメントを単離し
た。これらの２つのフラグメントを、上述のようにBstE
II及びBglII で切断したpDECΔに結合してpEDC(N48) を
得た。pDEC(O62)の構築(HCG-エリトロポエチン融合） pEC1と、ヒト絨毛性ゴナドトロンピンのカルボキシ末端
の28個のアミノ酸(ser-ser-ser-ser-lys-ala-pro-pro-p
ro-ser-leu-pro-ser-pro-ser-arg-leu-pro-gly-pro-ser
-asp-thr-pro-ile-leu-pro-gln)(SEQ ID. NO:25)(Pierc
eら、Ann. Rev.Biochem. 50, 465 (1981)) を含む107
塩基対のStuI-BglII合成ＤＮＡリンカーとからpDEC(O6
2) を組立てた。リンカーの配列を以下に示す。 5'CCTGTAGGACAGGGGACAGATCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCA
GCCTTC-3'GGACATCCTGTCCCCTGTCTAGGAGAAGGAGTTTCCGGGGA
GGGGGGTCGGAAG-5'CAAGTCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACAC
CCCGATCCTCCCACAATGA(SEQ ID. NO:19) 3'GTTCAGGTAGGGCTGAGGGCCCCGGGAGCCTGTGGGGCTAGGAGGGTG
TTACTCTAG(SEQ ID. NO: 20) pEC1をStuI及びBglII で消化し、610bp のＤＮＡフラグ
メントを単離した。合成リンカーを ATP及びポリヌクレ
オチドキナーゼによってリン酸化し、pEC1フラグメント
と共に、上述のように予めBstEIIで消化しBglII で部分
消化したpDECΔに結合した。pDEC(NO1)の構築 pDEC(O62)(HCG-EPO)及びpDEC(N14)(Ser87Asn88Thr90)か
らpDEC(NO1) を組立てた。pDEC177 をStuI及びBalIIで
消化し、Ser87Asn88Thr90 突然変異を含む610bpのＤＮ
Ａフラグメントをgene-cleanで単離した。pDEC(O62) を
StuI及びBglII で消化し、107 塩基対のフラグメントを
単離した。これらの２つのＤＮＡフラグメントを、上述
のように予めBstEIIで消化しBglII で部分消化したpDEC
Δに結合した。pDEC(NO2)の構築 pDEC(O62)(HCG-EPO)及びpEDC(N47)(Asn30Thr32Vaｌ87As
n88Thr90)からpDEC(NO2) を組立てた。pDEC(N47) をStu
I及びBalIIで消化し、Asn30Thr32Val87Asn88Thr90突然
変異を含む610bp のＤＮＡフラグメントを GeneCleanTM
で単離した。pDEC(O62) をStuI及びBglII で消化し、10
7 塩基対のフラグメントを単離した。これらの２つのＤ
ＮＡフラグメントを、上述のように予めBstEIIで消化し
BglII で部分消化したpDECΔに結合した。pDEC(N16)(Ser87Asn88Thr90Ala162)の構築 pDEC(N14)(Ser87Asn88Thr90)及びpEDC258(Ala162) から
pDEC(N16) を組立てた。pDEC258 は上述のin vitro突然
変異誘発手順を用いて構築し、162 位のAGG コドンをGC
G に変異させた。pDEC(N14) をStuI及びBalIIで消化
し、Ser87Asn88Thr90突然変異を含む610bpのＤＮＡフラ
グメントを GeneCleanTMで単離した。pDEC258をStuI及
びBglII で消化し、210 塩基対のフラグメントを単離し
た。これらの２つのＤＮＡフラグメントを、上述のよう
に予めBstEIIで消化しBglII で部分消化したpDECΔに結
合した。pDEC(R1)、(R2)及び(R3)の構築 pDEC(N14) からグリコシレーション部位を除去するため
に、ser87 asn88 及びthr90 突然変異を含むm13-EPO(N1
4)を、以下のプライマーを用いて上述のようにin vitro
突然変異誘発した。 5'GGAGGCCGAGCAGATCACGACGG3' GLN24(SEQ ID. NO:2
1)； 5'CTTGAATGAGCAGATCACTGTCC3' GLN38(SEQ ID. NO:2
2)； 5'CTGTTGGTCCAGTCTTCCCAG3' GLN83(SEQ ID. NO:2
3)。
然変異を含むpDEC(N48)を、pDEC(N14)及びpDEC(N11) か
ら構築した。pDEC(N14) をHindII及びBglII で消化し、
445bp のフラグメントを単離した。pDEC(N11) をBstEII
及びHindIII で消化し、377bp のフラグメントを単離し
た。これらの２つのフラグメントを、上述のようにBstE
II及びBglII で切断したpDECΔに結合してpEDC(N48) を
得た。pDEC(O62)の構築(HCG-エリトロポエチン融合） pEC1と、ヒト絨毛性ゴナドトロンピンのカルボキシ末端
の28個のアミノ酸(ser-ser-ser-ser-lys-ala-pro-pro-p
ro-ser-leu-pro-ser-pro-ser-arg-leu-pro-gly-pro-ser
-asp-thr-pro-ile-leu-pro-gln)(SEQ ID. NO:25)(Pierc
eら、Ann. Rev.Biochem. 50, 465 (1981)) を含む107
塩基対のStuI-BglII合成ＤＮＡリンカーとからpDEC(O6
2) を組立てた。リンカーの配列を以下に示す。 5'CCTGTAGGACAGGGGACAGATCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCA
GCCTTC-3'GGACATCCTGTCCCCTGTCTAGGAGAAGGAGTTTCCGGGGA
GGGGGGTCGGAAG-5'CAAGTCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACAC
CCCGATCCTCCCACAATGA(SEQ ID. NO:19) 3'GTTCAGGTAGGGCTGAGGGCCCCGGGAGCCTGTGGGGCTAGGAGGGTG
TTACTCTAG(SEQ ID. NO: 20) pEC1をStuI及びBglII で消化し、610bp のＤＮＡフラグ
メントを単離した。合成リンカーを ATP及びポリヌクレ
オチドキナーゼによってリン酸化し、pEC1フラグメント
と共に、上述のように予めBstEIIで消化しBglII で部分
消化したpDECΔに結合した。pDEC(NO1)の構築 pDEC(O62)(HCG-EPO)及びpDEC(N14)(Ser87Asn88Thr90)か
らpDEC(NO1) を組立てた。pDEC177 をStuI及びBalIIで
消化し、Ser87Asn88Thr90 突然変異を含む610bpのＤＮ
Ａフラグメントをgene-cleanで単離した。pDEC(O62) を
StuI及びBglII で消化し、107 塩基対のフラグメントを
単離した。これらの２つのＤＮＡフラグメントを、上述
のように予めBstEIIで消化しBglII で部分消化したpDEC
Δに結合した。pDEC(NO2)の構築 pDEC(O62)(HCG-EPO)及びpEDC(N47)(Asn30Thr32Vaｌ87As
n88Thr90)からpDEC(NO2) を組立てた。pDEC(N47) をStu
I及びBalIIで消化し、Asn30Thr32Val87Asn88Thr90突然
変異を含む610bp のＤＮＡフラグメントを GeneCleanTM
で単離した。pDEC(O62) をStuI及びBglII で消化し、10
7 塩基対のフラグメントを単離した。これらの２つのＤ
ＮＡフラグメントを、上述のように予めBstEIIで消化し
BglII で部分消化したpDECΔに結合した。pDEC(N16)(Ser87Asn88Thr90Ala162)の構築 pDEC(N14)(Ser87Asn88Thr90)及びpEDC258(Ala162) から
pDEC(N16) を組立てた。pDEC258 は上述のin vitro突然
変異誘発手順を用いて構築し、162 位のAGG コドンをGC
G に変異させた。pDEC(N14) をStuI及びBalIIで消化
し、Ser87Asn88Thr90突然変異を含む610bpのＤＮＡフラ
グメントを GeneCleanTMで単離した。pDEC258をStuI及
びBglII で消化し、210 塩基対のフラグメントを単離し
た。これらの２つのＤＮＡフラグメントを、上述のよう
に予めBstEIIで消化しBglII で部分消化したpDECΔに結
合した。pDEC(R1)、(R2)及び(R3)の構築 pDEC(N14) からグリコシレーション部位を除去するため
に、ser87 asn88 及びthr90 突然変異を含むm13-EPO(N1
4)を、以下のプライマーを用いて上述のようにin vitro
突然変異誘発した。 5'GGAGGCCGAGCAGATCACGACGG3' GLN24(SEQ ID. NO:2
1)； 5'CTTGAATGAGCAGATCACTGTCC3' GLN38(SEQ ID. NO:2
2)； 5'CTGTTGGTCCAGTCTTCCCAG3' GLN83(SEQ ID. NO:2
3)。
【００７８】得られたプラスミドを、pDEC(R1)(gln24se
r87asn88thr90)、pDEC(R2)(gln38ser87asn88thr90)及び
pDEC(R3)(gln83ser87asn88thr90)と命名した。また、m1
3EC-1 を上記オリゴヌクレオチドプライマーでin vitro
突然変異誘発すると、pEC10(gln24) 及びpEC8(gln38)
が得られた。プライマー： 5'CCTGTTGGTCCAGTCTTCCCAGC3' GLN83 (SEQ ID. NO:24) を用いてpEC9(gln83) を構築した。
r87asn88thr90)、pDEC(R2)(gln38ser87asn88thr90)及び
pDEC(R3)(gln83ser87asn88thr90)と命名した。また、m1
3EC-1 を上記オリゴヌクレオチドプライマーでin vitro
突然変異誘発すると、pEC10(gln24) 及びpEC8(gln38)
が得られた。プライマー： 5'CCTGTTGGTCCAGTCTTCCCAGC3' GLN83 (SEQ ID. NO:24) を用いてpEC9(gln83) を構築した。
【００７９】ヒトエリトロポエチンのｃＤＮＡクロー
ン、[Asn4, Ser6] EPO、[Asn9, Ser11] EPO、[Asn69] E
PO、[Asn124] EPO、[Asn125, Ser127] EPO、[Asn163, S
er165]EPO、［Thr125］EPO 及び［Pro124, Thr125］EPO
に対応する類似体のｃＤＮＡクローン、並びに、表
３、４及び５に記載の類似体のｃＤＮＡクローンを、エ
レクトロポレーションによって COS-1細胞（ATCC NO. C
RL-1650)に移入した。半密集状態のシャーレから COS-1
細胞を採取し、培地（５％のウシ胎仔血清と１％のＬ−
グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（Irvine
Scientific)とを含むダルベッコの改良必須培地）で洗
浄し、４×106 細胞／mlで再浮遊させた。１mlの細胞を
エレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad)に移し、
100〜200μgの担体ＤＮＡと２〜20μg のエリトロポエ
チン類似体コーディングプラスミドＤＮＡとの存在下
に、25μファラッド及び1600ボルトでBio-Rad Gene Pul
ser によってエレクトロポレートした。エレクトロポレ
ートした細胞を５mlの培地中で60mmの組織培養皿あたり
２×106 細胞で平板培養した。２〜４時間の平板培養
後、培地を５mlの新鮮培地に交換した。エレクトロポレ
ーションの３〜５日後に馴化培地を収集した。実施例７：エリトロポエチン類似体のキャラクタリゼー
ション Ａ．炭水化物付加の測定 実施例６に記載のようなエリトロポエチン類似体ｃＤＮ
ＡでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞から得られた５〜
20単位を含有する量のＣＯＳ細胞上清を、ウサギ抗エリ
トロポエチンポリクローナル抗体と共に室温で一夜免疫
沈降させた。リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の20
〜80μl の１：１プロテインＡ−セファロースを免疫沈
降物に添加し、室温で１時間インキュベートした。試料
を遠心し、ＰＢＳで洗浄し、指示されている場合にはＮ
−結合炭水化物鎖を除去するためにペレットをＮ−グリ
カナーゼで処理した。試料を、15％ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって分析し、ニトロセルロー
スに移し、マウス抗エリトロポエチンモノクローナル抗
体混合物を用いて文献に記載のウェスタン分析（Burnet
teら、 Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981);Elliott
ら、Gene 79, 167-180 (1989))によって処理した。この
ような抗体の１つ、9G8Aは、Elliott ら、(1989) Blood
74, Supp. 1, A. 1228 に記載されている。
ン、[Asn4, Ser6] EPO、[Asn9, Ser11] EPO、[Asn69] E
PO、[Asn124] EPO、[Asn125, Ser127] EPO、[Asn163, S
er165]EPO、［Thr125］EPO 及び［Pro124, Thr125］EPO
に対応する類似体のｃＤＮＡクローン、並びに、表
３、４及び５に記載の類似体のｃＤＮＡクローンを、エ
レクトロポレーションによって COS-1細胞（ATCC NO. C
RL-1650)に移入した。半密集状態のシャーレから COS-1
細胞を採取し、培地（５％のウシ胎仔血清と１％のＬ−
グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（Irvine
Scientific)とを含むダルベッコの改良必須培地）で洗
浄し、４×106 細胞／mlで再浮遊させた。１mlの細胞を
エレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad)に移し、
100〜200μgの担体ＤＮＡと２〜20μg のエリトロポエ
チン類似体コーディングプラスミドＤＮＡとの存在下
に、25μファラッド及び1600ボルトでBio-Rad Gene Pul
ser によってエレクトロポレートした。エレクトロポレ
ートした細胞を５mlの培地中で60mmの組織培養皿あたり
２×106 細胞で平板培養した。２〜４時間の平板培養
後、培地を５mlの新鮮培地に交換した。エレクトロポレ
ーションの３〜５日後に馴化培地を収集した。実施例７：エリトロポエチン類似体のキャラクタリゼー
ション Ａ．炭水化物付加の測定 実施例６に記載のようなエリトロポエチン類似体ｃＤＮ
ＡでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞から得られた５〜
20単位を含有する量のＣＯＳ細胞上清を、ウサギ抗エリ
トロポエチンポリクローナル抗体と共に室温で一夜免疫
沈降させた。リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の20
〜80μl の１：１プロテインＡ−セファロースを免疫沈
降物に添加し、室温で１時間インキュベートした。試料
を遠心し、ＰＢＳで洗浄し、指示されている場合にはＮ
−結合炭水化物鎖を除去するためにペレットをＮ−グリ
カナーゼで処理した。試料を、15％ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって分析し、ニトロセルロー
スに移し、マウス抗エリトロポエチンモノクローナル抗
体混合物を用いて文献に記載のウェスタン分析（Burnet
teら、 Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981);Elliott
ら、Gene 79, 167-180 (1989))によって処理した。この
ような抗体の１つ、9G8Aは、Elliott ら、(1989) Blood
74, Supp. 1, A. 1228 に記載されている。
【００８０】［Asn69] EPO及び［Asn125, Ser127］EPO
のｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞上清の分
析によれば、ヒト配列エリトロポエチンに比べてタンパ
ク質サイズが増大していた。このサイズ増加は、付加的
なＮ−結合炭水化物鎖の指標となる（図７）。［Th
r125］EPO 及び［Pro124, Thr125］EPO のｃＤＮＡでト
ランスフェクトしたＣＯＳ細胞上清をＮ−グリカナーゼ
で処理すると、ヒト配列エリトロポエチンに比べてタン
パク質サイズが増大していることが判明した。このサイ
ズ増加は、付加的なＯ−結合炭水化物鎖の指標となる
（図８）。選択されたその他の類似体のウェスタンブロ
ット分析を図10に示す。
のｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞上清の分
析によれば、ヒト配列エリトロポエチンに比べてタンパ
ク質サイズが増大していた。このサイズ増加は、付加的
なＮ−結合炭水化物鎖の指標となる（図７）。［Th
r125］EPO 及び［Pro124, Thr125］EPO のｃＤＮＡでト
ランスフェクトしたＣＯＳ細胞上清をＮ−グリカナーゼ
で処理すると、ヒト配列エリトロポエチンに比べてタン
パク質サイズが増大していることが判明した。このサイ
ズ増加は、付加的なＯ−結合炭水化物鎖の指標となる
（図８）。選択されたその他の類似体のウェスタンブロ
ット分析を図10に示す。
【００８１】ＥＰＯに結合したＮ−結合炭水化物鎖の数
を測定するために、Ｎ−グルカナーゼによる部分消化を
実施した。類似体またはrHuEPOをＣＨＯ細胞中で発現さ
せ、無血清の馴化培地を収集した。試験管に40単位のＥ
ＰＯ(H2Oで15μl の量に調整）を入れ、各試験管に10μ
l の0.５％ＳＤＳを添加し、各試料を３分間沸騰させ
た。次いで、以下の成分、即ち10.8μl の0.５M のNa3P
O4, pH 8.6、５μl の7.５％のnonidet P40 及び1.５μ
l の 250単位／mlのＮ−グリカナーゼ（Genzyme)を添加
した。試料を37℃で指定時間インキュベートした。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（上記参照）を添加して反応を
停止させ、次いで抗ＥＰＯポリクローナル抗体及び抗ウ
サギVectastainTMキット（Vector laboratories)を用
い、４−クロロナフトールを基質としてＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅウエスタン分析（10％アクリルアミド）処理した。こ
の方法によるヒトエリトロポエチン及び類似体N14 のＮ
−結合鎖の分析を図11に示す。 Ｂ．エリトロポエチン類似体活性アッセイ Egrie ら、前出、に従ってＲＩＡを実施した。CLINIGEN
TM EIAキット（Ｒ及びＤシステム）を製造業者から提供
された手順を用いてＥＩＡを実施した。低酸素症でない
赤血球増加症マウスのバイオアッセイ（Cotes ら、前
出）を用い、エリトロポエチン類似体を発現するＣＨＯ
細胞の上清または後述するようなＣＨＯ細胞馴化培地か
ら得られた精製エリトロポエチンを用いてエリトロポエ
チン類似体のin vivo 生物活性を測定した。
を測定するために、Ｎ−グルカナーゼによる部分消化を
実施した。類似体またはrHuEPOをＣＨＯ細胞中で発現さ
せ、無血清の馴化培地を収集した。試験管に40単位のＥ
ＰＯ(H2Oで15μl の量に調整）を入れ、各試験管に10μ
l の0.５％ＳＤＳを添加し、各試料を３分間沸騰させ
た。次いで、以下の成分、即ち10.8μl の0.５M のNa3P
O4, pH 8.6、５μl の7.５％のnonidet P40 及び1.５μ
l の 250単位／mlのＮ−グリカナーゼ（Genzyme)を添加
した。試料を37℃で指定時間インキュベートした。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（上記参照）を添加して反応を
停止させ、次いで抗ＥＰＯポリクローナル抗体及び抗ウ
サギVectastainTMキット（Vector laboratories)を用
い、４−クロロナフトールを基質としてＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅウエスタン分析（10％アクリルアミド）処理した。こ
の方法によるヒトエリトロポエチン及び類似体N14 のＮ
−結合鎖の分析を図11に示す。 Ｂ．エリトロポエチン類似体活性アッセイ Egrie ら、前出、に従ってＲＩＡを実施した。CLINIGEN
TM EIAキット（Ｒ及びＤシステム）を製造業者から提供
された手順を用いてＥＩＡを実施した。低酸素症でない
赤血球増加症マウスのバイオアッセイ（Cotes ら、前
出）を用い、エリトロポエチン類似体を発現するＣＨＯ
細胞の上清または後述するようなＣＨＯ細胞馴化培地か
ら得られた精製エリトロポエチンを用いてエリトロポエ
チン類似体のin vivo 生物活性を測定した。
【００８２】Iscoveら、J. Cell Physiol. 83, 309-320
(1974) に記載の方法に修正を加えた赤血球系コロニー
形成アッセイによって、in vitroエリトロポエチン活性
を測定した。ヒト骨髄細胞の単核細胞を、 ficoll-paqu
e クッションで部分精製し、Iscove 培地中で洗浄後、
付着細胞を除去するために平板培養した。培養培地は0.
９％のメチルセルロースを含有していたがウシ血清アル
ブミンは全く含んでいなかった。８〜10日間培養後に赤
血球系コロニー数を測定した。
(1974) に記載の方法に修正を加えた赤血球系コロニー
形成アッセイによって、in vitroエリトロポエチン活性
を測定した。ヒト骨髄細胞の単核細胞を、 ficoll-paqu
e クッションで部分精製し、Iscove 培地中で洗浄後、
付着細胞を除去するために平板培養した。培養培地は0.
９％のメチルセルロースを含有していたがウシ血清アル
ブミンは全く含んでいなかった。８〜10日間培養後に赤
血球系コロニー数を測定した。
【００８３】実施例６に記載のようなＣＯＳ細胞にトラ
ンスフェクトされ発現されたエリトロポエチン類似体
を、粗ＣＯＳ細胞上清中で、ＲＩＡ、ＥＩＡ及び赤血球
系コロニー形成アッセイを用いて分析した。これらのア
ッセイによれば、精製ヒト配列エリトロポエチンは、Ｒ
ＩＡ活性と同等のin vitro活性を有している。類似体
［Asn69 ］EPO 、［Thr125］EPO 及び［Prp124, Th
r125］EPO はＲＩＡ活性と同等のin vitro活性を示し、
これは（前項Ａで測定したような）付加的炭水化物鎖を
有する証拠となる。[Thr125] EPO及び類似体N4、 N11、
N14、 N16、 N18、N47、N48、O62 、NO1 及びNO2 を更
に分析するために、エリトロポエチン類似体をコードす
るｃＤＮＡクローンをＣＨＯ細胞にトランスフェクト
し、ＣＨＯ細胞上清をＲＩＡまたはＥＩＡ及びin vivo
生物アッセイにかけた。結果を表６に示す、ＣＨＯ細胞
上清中で発現された類似体R1、R2及びR3のin vivo 活性
を表７に示す。
ンスフェクトされ発現されたエリトロポエチン類似体
を、粗ＣＯＳ細胞上清中で、ＲＩＡ、ＥＩＡ及び赤血球
系コロニー形成アッセイを用いて分析した。これらのア
ッセイによれば、精製ヒト配列エリトロポエチンは、Ｒ
ＩＡ活性と同等のin vitro活性を有している。類似体
［Asn69 ］EPO 、［Thr125］EPO 及び［Prp124, Th
r125］EPO はＲＩＡ活性と同等のin vitro活性を示し、
これは（前項Ａで測定したような）付加的炭水化物鎖を
有する証拠となる。[Thr125] EPO及び類似体N4、 N11、
N14、 N16、 N18、N47、N48、O62 、NO1 及びNO2 を更
に分析するために、エリトロポエチン類似体をコードす
るｃＤＮＡクローンをＣＨＯ細胞にトランスフェクト
し、ＣＨＯ細胞上清をＲＩＡまたはＥＩＡ及びin vivo
生物アッセイにかけた。結果を表６に示す、ＣＨＯ細胞
上清中で発現された類似体R1、R2及びR3のin vivo 活性
を表７に示す。
【００８４】
【表６】 表6の脚注a 実施例7Ａに記載のようなSDSゲル中の類似体ポリペプ
チドの移動度に基づいて、付加的なN−結合鎖の数を推
定した。b エリトロポエチン類似体のin vivo活性の比。マウス赤
血球増加症のバイオアッセイを用い、ＣＨＯ細胞上清中
の類似体の活性を測定した。ＣＨＯ細胞上清中のエリト
ロポエチン類似体の量を本明細書中に記載のようなＲＩ
ＡまたはＥＩＡによって測定した。c 実施例７Aに記載のようなＮ−グリカナーゼによる部分
消化後のＳＤＳ−ゲル中の糖タンパク質の泳動を試験す
ることによって付加的炭水化物鎖の数を確認した。d Ｓｅｒ126の０‐結合鎖はヒトエリトロポエチン分子の
７０%に存在する。e ０−グリコシレーションが減少した類似体分子の７０%
未満はＳｅｒ126に炭水化物鎖を有している。f 60%を上回るＴｈｒ123ＥＰＯ分子が2つの０−結合鎖を
有している。約40%のＴｈｒ125ＥＰＯ分子が２つの０−
結合鎖を有している。８０%を上回るＰｒｏ124Ｔｈｒ
125ＥＰＯ分子が２つの０−結合鎖を有している。g これらの類似体は少なくとも３つの０−結合鎖を有し
ており、4個または5個有することもある。ＨＣＧ単独で
は4個の０−結合鎖を有することが判っている。 Ｎ．Ｔ．試験せず。
チドの移動度に基づいて、付加的なN−結合鎖の数を推
定した。b エリトロポエチン類似体のin vivo活性の比。マウス赤
血球増加症のバイオアッセイを用い、ＣＨＯ細胞上清中
の類似体の活性を測定した。ＣＨＯ細胞上清中のエリト
ロポエチン類似体の量を本明細書中に記載のようなＲＩ
ＡまたはＥＩＡによって測定した。c 実施例７Aに記載のようなＮ−グリカナーゼによる部分
消化後のＳＤＳ−ゲル中の糖タンパク質の泳動を試験す
ることによって付加的炭水化物鎖の数を確認した。d Ｓｅｒ126の０‐結合鎖はヒトエリトロポエチン分子の
７０%に存在する。e ０−グリコシレーションが減少した類似体分子の７０%
未満はＳｅｒ126に炭水化物鎖を有している。f 60%を上回るＴｈｒ123ＥＰＯ分子が2つの０−結合鎖を
有している。約40%のＴｈｒ125ＥＰＯ分子が２つの０−
結合鎖を有している。８０%を上回るＰｒｏ124Ｔｈｒ
125ＥＰＯ分子が２つの０−結合鎖を有している。g これらの類似体は少なくとも３つの０−結合鎖を有し
ており、4個または5個有することもある。ＨＣＧ単独で
は4個の０−結合鎖を有することが判っている。 Ｎ．Ｔ．試験せず。
【００８５】
【表７】 ＲＩＡまたはＥＩＡに対するin vivo活性の比は、表６
の脚注に記載の手順で測定した。 Ｃ．エリトロポエチン類似体に由来のイソ形混合物の調
製〔Ｔｈｒ125〕ＥＰＯ(EPO ０５０) 実施例６の〔sectionA〕に記載のようにエリトロポエチ
ン類似体〔Ｔｈｒ125〕ＥＰＯを構築した。〔Ｔｈ
ｒ125〕突然変異を含むプラスミドｐＥＣをＢｓｔＥＩ
Ｉ及びＢｇＩＩＩで開烈し、フラグメントをｐＤＥＣ△
〔ｐＤＳα２の誘導体〕(実施例６に記載)に結合するこ
とによって、〔Ｔｈｒ125〕突然変異を含む８１０ｂｐ
のエリトロポエチンｃＤＮＡフラグメントを単離した。
の脚注に記載の手順で測定した。 Ｃ．エリトロポエチン類似体に由来のイソ形混合物の調
製〔Ｔｈｒ125〕ＥＰＯ(EPO ０５０) 実施例６の〔sectionA〕に記載のようにエリトロポエチ
ン類似体〔Ｔｈｒ125〕ＥＰＯを構築した。〔Ｔｈ
ｒ125〕突然変異を含むプラスミドｐＥＣをＢｓｔＥＩ
Ｉ及びＢｇＩＩＩで開烈し、フラグメントをｐＤＥＣ△
〔ｐＤＳα２の誘導体〕(実施例６に記載)に結合するこ
とによって、〔Ｔｈｒ125〕突然変異を含む８１０ｂｐ
のエリトロポエチンｃＤＮＡフラグメントを単離した。
【００８６】〔Ｔｈｒ125〕エリトロポエチンｃＤＮＡ
を含むプラスミドｐＤＥＣ△をＤHＦＲ欠失ＣＨＯ細胞
にトランスフェクトした。７７０ｍｌのCHO細胞馴化
培地を、カットオフ分子量10,000ダルトンの膜を用いて
濃縮し、10ｍＭのＴｒｉｓ−HC１、ｐH８．６に対し最
終容量３４ｍｌまで透析濾過した。濃縮物の１７ｍｌの
アリコートを、同じ緩衝液で平衡させたＱ−セファロー
スFast Flowカラム(ベッドボリューム５ｍｌ)に充填
し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−HC１、ｐＨ８．６中０−２５
０ｍＭのＮａCｌの直線勾配で溶出させた。カラム分画
のアリコートを、非処理でまたはＮ−グリカナーゼで消
化後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＩＥＦによって分析し、
分画のイソ形及び／または炭水化物組成に基づいてプー
ルを作製した（２，３及び４と命名）。各プールをVyda
c Ｃ４カラム(214TPB２０３０；直径１ｃｍ；ベッドボ
リューム1.8〜2.5ｍｌ；0.34ｍｌ／分)に充填し、10ｍ
ＭのTris-HC1，pH7.0のカラム容量の2倍の20％エタノー
ルで洗浄した。10ｍＭのTris，pH7.0中の20-94％のエタ
ノールの直線勾配でカラムを溶出させた。プールを作製
し、10mMのTris-HC1，pH7.0に希釈し、Q−セファロース
Fast Flowカラムに充填した。10mMのTris-HC1，pH7.0
中で洗浄後、試料を20ｍMのクエン酸ナトリウム、250mM
のNacl、pH７．０で溶出させた。精製した〔Thr125〕プ
ールをIEFによって分析し図９に示す。更に、上述の方
法(Cotesら、前出)これらのプールのin vivo生物活性
を分析し、結果を表8に示す。Ser87Asn88Thr90EP０(EP0 N１４) 調製方法1 イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー及びゲル濾過クロマトグラフィーから成る3段階手順
を用いてEPO N14類似体を精製した。イオン交換段階中
に、高レベルのシアル酸を含むイソ形の混合物を与える
分画をプールした。逆相クロマトグラフィー中に、類似
体を擬集物と共に含むかまたは擬集物を伴わずに含む追
加の2つのプールを作製した。精製手順を以下に詳細に
説明する。 １．EP０ N１４類似体を発現するCHO細胞の馴化培地を
採集し、YM１０膜（Amicon）と共に撹拌槽を用いて約2.
5倍に濃縮し、１０ｍMのTris,pH８．５に対し透析濾過
した。 ２．濃縮培地を、１０ｍMのTris,pH８．５中で平衡化さ
せたQ-セファロース FF(Pharmacia)カラムに、流速0.2
cm/分で、樹脂１mlあたりＡ280が〜12となるように充填
した。 ３．充填後、カラム容量(CV)の3倍の10MmのTris,pH8.5
でカラムを洗浄し、50CV中の0-0.5MのNacl/10mMのTris,
pH8.5の勾配で溶出させた。1CVの分画を収集した。 ４．各分画の試料をIEFゲルpH3〜５に添加した。IEF上
のイソ形分布に基づいて、主としてイソ形11〜18を含む
分画プールを作製した。EDTAを最終濃度１ｍMまでプー
ルに添加した。 ５．20％エタノール／１０ｍMのTris,pH7.0中で平衡化
させた逆相C4カラム（Vydac）に、イソ形プールを流速
２．５ｃｍ／分で樹脂1mあたりA280が〜5になるように
充填した。カラムを１CVの20％エタノール／10mMのTri
s,pH7.0で洗浄し、30CV中の20−94％エタノール／10mM
のTris,pH7.0の勾配で流速1cm／分で溶出させた。0.2CV
の分画を収集した。 ６．各分画の試料を非還元性12％SDS−PAGEによって分
析した。SDSゲル上に観察された擬集物の存在に基づい
て個々の2つのプールを作製した。プール♯1はEPO類似
体を含んでいたが擬集物を含んでいなかった。プール♯
２はEPO類似体と擬集物とを含んでいた。 ７．Centricon 10(Amicon)を用いてプール♯１を約65
倍に濃縮し、プール♯２を約250倍に濃縮した。各プー
ルの緩衝液を20ｍMのクエン酸ナトリウム／100ｍMのNac
l,pH7.0に交換した。 ８．２０ｍMのクエン酸ナトリウム／100mMのNaCl,pH7.0
中で平衡化させたHPLC BioSil SEC−250(BioRad)カラ
ムで各プールを個別に精製した。プールを流速2.26cm／
分で樹脂1mlあたりA280が<6となるように充填した。類
似体モノマーに対応するピークを各処理試料から収集し
た。 ９．各プールの吸光度を測定し、各プールの一部分を濃
縮してSDS−PAGE及びIEFゲルで分析した。プール♯1は
イソ形15−17の分布を有しており、このプールを薬物動
態試験及び受容体結合試験に使用した。調製方法2 イオン交換クロマトグラフィー、逆相HPLC及びヒドロキ
シルアパタイトクロマトグラフィーから成る3段階手順
を用いてEPO N14類似体を精製した。イオン交換段階中
に、類似体を、異なるイソ形混合物を含む3つのプール
に分割した。精製手順を以下に説明する。 1．EPO N14を発現するCHO細胞の上清を採集し、Filtro
n Mini−Ultrasette正接流デバイスを用いて約10倍に
濃縮し、10mMのTris,pH8.5に対し透析濾過した。 2．10mMのTris,pH8.5中に平衡化させたQ−セファロース
FF(Pharmacia)カラムに濃縮倍地を流速0.2cm／分で樹
脂１mlあたりA280が〜10となるように充填した。 3．充填後、カラム容量(CV)の3倍の10MmのTris，pH8.5
でカラムを洗浄し、50CV中の0−0.5MのNaCl／10mMのTri
s，pH8.5の勾配で溶出させた。1CVの分画を収集した。 4．各分画の試料をIEFゲル、pH３〜５で泳動した。IEF
によって測定したイソ形分布に基づいて個々の3つの分
画プールを調整した。低イソ形プール(イソ形４〜12)、
中イソ形プール(イソ形５〜15)及び高イソ形プール(イ
ソ形６〜18)を作製した。 5．各イソ形プールをVydac C4逆相HPLCカラムで個別に
精製した。アセトニトリルが毎分1%の割合で増加する0.
1%TFA／H2Oから0.1%TFA／75%アセトニトリルまでの勾配
でカラムを展開させた。 6．各プールから類似体のピークを収集し、4倍容の80mM
のTris−HC1／20mMのTris塩基で希釈し、次いで濃縮
し、溶媒耐性Centricon 3を用いて緩衝液を10mMのTri
s，pH7.2に交換した。 7．各試料を1mlあたりA280が２になるまで10mMのTris,p
H7.2で希釈し、等量の4MグアニジンHCl(GuHCl)、10mMの
CHAPS、10mMのTris，pH7.2を添加して、試料の最終濃度
を1mlあたりのA280が１になるようにした。各試料を2M
のGuHcl、5mMのCHAPS、10mMのTris，pH7.2で平衡化させ
たヒドロキシルアパタイトミニカラムに充填した。平衡
緩衝液でカラムを洗浄し、1CVの素通り分画を収集し
た。 8．分画の吸光度を測定し、プールを作製し、Centricon
10を用いて緩衝液を10ｍMのTris，pH7.2に交換した。
各プールの吸光度を測定した。
を含むプラスミドｐＤＥＣ△をＤHＦＲ欠失ＣＨＯ細胞
にトランスフェクトした。７７０ｍｌのCHO細胞馴化
培地を、カットオフ分子量10,000ダルトンの膜を用いて
濃縮し、10ｍＭのＴｒｉｓ−HC１、ｐH８．６に対し最
終容量３４ｍｌまで透析濾過した。濃縮物の１７ｍｌの
アリコートを、同じ緩衝液で平衡させたＱ−セファロー
スFast Flowカラム(ベッドボリューム５ｍｌ)に充填
し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−HC１、ｐＨ８．６中０−２５
０ｍＭのＮａCｌの直線勾配で溶出させた。カラム分画
のアリコートを、非処理でまたはＮ−グリカナーゼで消
化後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＩＥＦによって分析し、
分画のイソ形及び／または炭水化物組成に基づいてプー
ルを作製した（２，３及び４と命名）。各プールをVyda
c Ｃ４カラム(214TPB２０３０；直径１ｃｍ；ベッドボ
リューム1.8〜2.5ｍｌ；0.34ｍｌ／分)に充填し、10ｍ
ＭのTris-HC1，pH7.0のカラム容量の2倍の20％エタノー
ルで洗浄した。10ｍＭのTris，pH7.0中の20-94％のエタ
ノールの直線勾配でカラムを溶出させた。プールを作製
し、10mMのTris-HC1，pH7.0に希釈し、Q−セファロース
Fast Flowカラムに充填した。10mMのTris-HC1，pH7.0
中で洗浄後、試料を20ｍMのクエン酸ナトリウム、250mM
のNacl、pH７．０で溶出させた。精製した〔Thr125〕プ
ールをIEFによって分析し図９に示す。更に、上述の方
法(Cotesら、前出)これらのプールのin vivo生物活性
を分析し、結果を表8に示す。Ser87Asn88Thr90EP０(EP0 N１４) 調製方法1 イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー及びゲル濾過クロマトグラフィーから成る3段階手順
を用いてEPO N14類似体を精製した。イオン交換段階中
に、高レベルのシアル酸を含むイソ形の混合物を与える
分画をプールした。逆相クロマトグラフィー中に、類似
体を擬集物と共に含むかまたは擬集物を伴わずに含む追
加の2つのプールを作製した。精製手順を以下に詳細に
説明する。 １．EP０ N１４類似体を発現するCHO細胞の馴化培地を
採集し、YM１０膜（Amicon）と共に撹拌槽を用いて約2.
5倍に濃縮し、１０ｍMのTris,pH８．５に対し透析濾過
した。 ２．濃縮培地を、１０ｍMのTris,pH８．５中で平衡化さ
せたQ-セファロース FF(Pharmacia)カラムに、流速0.2
cm/分で、樹脂１mlあたりＡ280が〜12となるように充填
した。 ３．充填後、カラム容量(CV)の3倍の10MmのTris,pH8.5
でカラムを洗浄し、50CV中の0-0.5MのNacl/10mMのTris,
pH8.5の勾配で溶出させた。1CVの分画を収集した。 ４．各分画の試料をIEFゲルpH3〜５に添加した。IEF上
のイソ形分布に基づいて、主としてイソ形11〜18を含む
分画プールを作製した。EDTAを最終濃度１ｍMまでプー
ルに添加した。 ５．20％エタノール／１０ｍMのTris,pH7.0中で平衡化
させた逆相C4カラム（Vydac）に、イソ形プールを流速
２．５ｃｍ／分で樹脂1mあたりA280が〜5になるように
充填した。カラムを１CVの20％エタノール／10mMのTri
s,pH7.0で洗浄し、30CV中の20−94％エタノール／10mM
のTris,pH7.0の勾配で流速1cm／分で溶出させた。0.2CV
の分画を収集した。 ６．各分画の試料を非還元性12％SDS−PAGEによって分
析した。SDSゲル上に観察された擬集物の存在に基づい
て個々の2つのプールを作製した。プール♯1はEPO類似
体を含んでいたが擬集物を含んでいなかった。プール♯
２はEPO類似体と擬集物とを含んでいた。 ７．Centricon 10(Amicon)を用いてプール♯１を約65
倍に濃縮し、プール♯２を約250倍に濃縮した。各プー
ルの緩衝液を20ｍMのクエン酸ナトリウム／100ｍMのNac
l,pH7.0に交換した。 ８．２０ｍMのクエン酸ナトリウム／100mMのNaCl,pH7.0
中で平衡化させたHPLC BioSil SEC−250(BioRad)カラ
ムで各プールを個別に精製した。プールを流速2.26cm／
分で樹脂1mlあたりA280が<6となるように充填した。類
似体モノマーに対応するピークを各処理試料から収集し
た。 ９．各プールの吸光度を測定し、各プールの一部分を濃
縮してSDS−PAGE及びIEFゲルで分析した。プール♯1は
イソ形15−17の分布を有しており、このプールを薬物動
態試験及び受容体結合試験に使用した。調製方法2 イオン交換クロマトグラフィー、逆相HPLC及びヒドロキ
シルアパタイトクロマトグラフィーから成る3段階手順
を用いてEPO N14類似体を精製した。イオン交換段階中
に、類似体を、異なるイソ形混合物を含む3つのプール
に分割した。精製手順を以下に説明する。 1．EPO N14を発現するCHO細胞の上清を採集し、Filtro
n Mini−Ultrasette正接流デバイスを用いて約10倍に
濃縮し、10mMのTris,pH8.5に対し透析濾過した。 2．10mMのTris,pH8.5中に平衡化させたQ−セファロース
FF(Pharmacia)カラムに濃縮倍地を流速0.2cm／分で樹
脂１mlあたりA280が〜10となるように充填した。 3．充填後、カラム容量(CV)の3倍の10MmのTris，pH8.5
でカラムを洗浄し、50CV中の0−0.5MのNaCl／10mMのTri
s，pH8.5の勾配で溶出させた。1CVの分画を収集した。 4．各分画の試料をIEFゲル、pH３〜５で泳動した。IEF
によって測定したイソ形分布に基づいて個々の3つの分
画プールを調整した。低イソ形プール(イソ形４〜12)、
中イソ形プール(イソ形５〜15)及び高イソ形プール(イ
ソ形６〜18)を作製した。 5．各イソ形プールをVydac C4逆相HPLCカラムで個別に
精製した。アセトニトリルが毎分1%の割合で増加する0.
1%TFA／H2Oから0.1%TFA／75%アセトニトリルまでの勾配
でカラムを展開させた。 6．各プールから類似体のピークを収集し、4倍容の80mM
のTris−HC1／20mMのTris塩基で希釈し、次いで濃縮
し、溶媒耐性Centricon 3を用いて緩衝液を10mMのTri
s，pH7.2に交換した。 7．各試料を1mlあたりA280が２になるまで10mMのTris,p
H7.2で希釈し、等量の4MグアニジンHCl(GuHCl)、10mMの
CHAPS、10mMのTris，pH7.2を添加して、試料の最終濃度
を1mlあたりのA280が１になるようにした。各試料を2M
のGuHcl、5mMのCHAPS、10mMのTris，pH7.2で平衡化させ
たヒドロキシルアパタイトミニカラムに充填した。平衡
緩衝液でカラムを洗浄し、1CVの素通り分画を収集し
た。 8．分画の吸光度を測定し、プールを作製し、Centricon
10を用いて緩衝液を10ｍMのTris，pH7.2に交換した。
各プールの吸光度を測定した。
【００８７】最終プールをSDS−PAGE及びIEFゲルで分析
した。IEFゲルを図12に示す。RIA及びin vivo活性アッ
セイを実施例7Aに記載の手順で行った。最終イソ形プー
ルのin vivo活性を表8に示す。マウスのヘマトクリッ
ト増加を測定する試験に高シアル酸イソ形プールを使用
した。
した。IEFゲルを図12に示す。RIA及びin vivo活性アッ
セイを実施例7Aに記載の手順で行った。最終イソ形プー
ルのin vivo活性を表8に示す。マウスのヘマトクリッ
ト増加を測定する試験に高シアル酸イソ形プールを使用
した。
【００８８】
【表８】 aエリトロポエチンペプチドのミリグラム数をSer87Asn
88Thr90EPOイソ形プールのA280から、溶液1mlあたり1mg
の場合の吸光係数0.93を用いて算出した。bThr125EPOイ
ソ形プールについては、実施した活性アッセイが1回ま
たは2回だったので標準偏差を記録していない。実施例8：EPO N14類似体の生物学的特性 EPO N14類似体のイソ形プール、組換えヒトエリトロポ
エチン(rHuEPO)及び単離rHuEPOイソ形14の活性を、ｉ．
ｖ．薬物動態アッセイ、受容体結合アッセイ及びヘマト
クリット試験で比較した。EPO N14イソ形プールは、実
施例7Cに記載の手順で調製した。ｒHuEPOは、Laiら、前
出、に従って調製した。ｒHuEPOイソ形14は、以下の手
順で調製した。イソ形10，11，12，13，14及び15の混合
物から成るrHuEPOを、10ｍMのTris，pH7.2中で平衡化さ
せたQ−セファロースFast Flowカラム(寸法＝直径2.2
ｃｍ×高さ3.4cm)に充填した。充填カラムを2mMの酢酸
／６Mの尿素（緩衝液「A」）に平衡化させ、イソ形13及び
14の精製を最適にするように設計された多相勾配を実施
した。勾配は、750ml中0%−7.3%の800mM酢酸／6M尿素
(緩衝液「B」)、750ml中7.3%−11.4%の緩衝液B、1250ml中
11.4%−26.8%の緩衝液B、1250ml中26.8%−62.4%の緩衝
液B、次いで700ml中62.4%−100%の緩衝液Bであった。1
2.5mlの分画を収集し、アンモニア水で中和し、次いで
ポリアクリルアミドゲル中の等電点電気泳動によって検
定した。純粋なイソ形14を含む分画を一緒にプールし、
YM−10膜を備えたAmicon撹拌槽で濃縮し、緩衝液を水に
交換した。 A．ｉ．ｖ．薬物動態 EPO N14類似体（イソ形15〜17）及び単離イソ形14の薬
物動態パラメーターをrHuEPOのものと比較するために個
々の2つの試験を実施した。
88Thr90EPOイソ形プールのA280から、溶液1mlあたり1mg
の場合の吸光係数0.93を用いて算出した。bThr125EPOイ
ソ形プールについては、実施した活性アッセイが1回ま
たは2回だったので標準偏差を記録していない。実施例8：EPO N14類似体の生物学的特性 EPO N14類似体のイソ形プール、組換えヒトエリトロポ
エチン(rHuEPO)及び単離rHuEPOイソ形14の活性を、ｉ．
ｖ．薬物動態アッセイ、受容体結合アッセイ及びヘマト
クリット試験で比較した。EPO N14イソ形プールは、実
施例7Cに記載の手順で調製した。ｒHuEPOは、Laiら、前
出、に従って調製した。ｒHuEPOイソ形14は、以下の手
順で調製した。イソ形10，11，12，13，14及び15の混合
物から成るrHuEPOを、10ｍMのTris，pH7.2中で平衡化さ
せたQ−セファロースFast Flowカラム(寸法＝直径2.2
ｃｍ×高さ3.4cm)に充填した。充填カラムを2mMの酢酸
／６Mの尿素（緩衝液「A」）に平衡化させ、イソ形13及び
14の精製を最適にするように設計された多相勾配を実施
した。勾配は、750ml中0%−7.3%の800mM酢酸／6M尿素
(緩衝液「B」)、750ml中7.3%−11.4%の緩衝液B、1250ml中
11.4%−26.8%の緩衝液B、1250ml中26.8%−62.4%の緩衝
液B、次いで700ml中62.4%−100%の緩衝液Bであった。1
2.5mlの分画を収集し、アンモニア水で中和し、次いで
ポリアクリルアミドゲル中の等電点電気泳動によって検
定した。純粋なイソ形14を含む分画を一緒にプールし、
YM−10膜を備えたAmicon撹拌槽で濃縮し、緩衝液を水に
交換した。 A．ｉ．ｖ．薬物動態 EPO N14類似体（イソ形15〜17）及び単離イソ形14の薬
物動態パラメーターをrHuEPOのものと比較するために個
々の2つの試験を実施した。
【００８９】各試験で、1μCiの125I−単離イソ形14、
125I−EPO N14類似体または125I−組換えヒトエリトロ
ポエチン（Amersham）を、頸動脈カニューレによって体
重310〜378gの雄スプレーグ・ド−リーラットに静注し
た。投与後の種々の時点に、0.3mlの血液を採取し、遠
心によって血清を調製した。0.1mlの各血清試料中の125
I−EPO（組換えヒト、単離イソ形14またはEPO N14類似
体）濃度を、90％エタノールと共に４℃で一夜インキュ
べーション後に測定した。各血清試料中のエタノール沈
殿した125I−EPOをガンマカウンタでカウントし、得ら
れた薬物動態グラフを図13に示す。PCNONLIN 4.0非線
形回帰分析（Statistical Consultants，1992）を用い
て各ラットの薬物動態パラメーターを測定し、各グルー
プの結果を平均化した。EPO N14類似体及び単離イソ形
14の薬物動態試験の結果を表９にまとめる。
125I−EPO N14類似体または125I−組換えヒトエリトロ
ポエチン（Amersham）を、頸動脈カニューレによって体
重310〜378gの雄スプレーグ・ド−リーラットに静注し
た。投与後の種々の時点に、0.3mlの血液を採取し、遠
心によって血清を調製した。0.1mlの各血清試料中の125
I−EPO（組換えヒト、単離イソ形14またはEPO N14類似
体）濃度を、90％エタノールと共に４℃で一夜インキュ
べーション後に測定した。各血清試料中のエタノール沈
殿した125I−EPOをガンマカウンタでカウントし、得ら
れた薬物動態グラフを図13に示す。PCNONLIN 4.0非線
形回帰分析（Statistical Consultants，1992）を用い
て各ラットの薬物動態パラメーターを測定し、各グルー
プの結果を平均化した。EPO N14類似体及び単離イソ形
14の薬物動態試験の結果を表９にまとめる。
【００９０】表9に示すように、EPO N14類似体の血清
クリアランスは組換えヒトエリトロポエチンの計算値に
比較して有意な差を示す。組換えヒトエリトロポエチン
は、単離イソ形14の3.97時間及びEPO N14類似体の4.36
時間に比べて3.10時間という最も速いベータ半減期を示
した。組換えヒトエリトロポエチングループはまた、単
離イソ形14の2.40時間及びEPO N14類似体の3.03時間に
比べて1.78時間という最速のクリアランス半減期を有し
ていた。
クリアランスは組換えヒトエリトロポエチンの計算値に
比較して有意な差を示す。組換えヒトエリトロポエチン
は、単離イソ形14の3.97時間及びEPO N14類似体の4.36
時間に比べて3.10時間という最も速いベータ半減期を示
した。組換えヒトエリトロポエチングループはまた、単
離イソ形14の2.40時間及びEPO N14類似体の3.03時間に
比べて1.78時間という最速のクリアランス半減期を有し
ていた。
【００９１】
【表９】 B.受容体結合アッセイ EPO N14類似体（イソ形15〜17）とエリトロポエチン受
容体との相互作用を、ヒト赤白血球OCIMI細胞（Papayan
nopoulouら、Blood 64（supp.1），116a（1984））を用
いた低温置換アッセイで試験した。受容体との結合にお
いて125I−rHuEPOと競合するEPO N14の必要量を決定す
るために、漸増濃度の非標識EPO N14を一定濃度の125I
−rHuEPOと共にOCIM1細胞とインキュベートした。比較
として、漸増濃度の非標識rHuEPOも一定濃度の125I−rH
uEPOと競合させた。
容体との相互作用を、ヒト赤白血球OCIMI細胞（Papayan
nopoulouら、Blood 64（supp.1），116a（1984））を用
いた低温置換アッセイで試験した。受容体との結合にお
いて125I−rHuEPOと競合するEPO N14の必要量を決定す
るために、漸増濃度の非標識EPO N14を一定濃度の125I
−rHuEPOと共にOCIM1細胞とインキュベートした。比較
として、漸増濃度の非標識rHuEPOも一定濃度の125I−rH
uEPOと競合させた。
【００９２】非標識EPO N14をアッセイ緩衝液に希釈
し、0.03ｎg、0.1ｎg、0.3ｎg、1.0ｎg、3.0ｎg、10.0
ｎg及び30.0ｎg（ペプチド質量に基づく）の量で添加し
た。全部のアッセイ管に、0.5ｎgの125I−組換えヒトEP
Oを添加し、次いで約0.5×106のOCIM1細胞を添加した。
アッセイ管を次に、振盪水浴中で37℃ で2時間インキ
ュベートした。インキュベーション後、OCIM1細胞に結
合した125I−rHuEPOから未結合の125I−rHuEPOを分離す
るために、溶液をジブチルフタレート／ビ−フタレート
油溶液中で遠心した。細胞ペレットを単離し、細胞に結
合した125I−rHuEPOをガンマカウンティングによって測
定した。細胞に特異的に結合したカウント数を計算し、
競合物質の非存在下で125I−rHuEPOの50%結合に結合す
るために必要な非標識タンパク質の濃度を線形回帰分析
によって決定した。
し、0.03ｎg、0.1ｎg、0.3ｎg、1.0ｎg、3.0ｎg、10.0
ｎg及び30.0ｎg（ペプチド質量に基づく）の量で添加し
た。全部のアッセイ管に、0.5ｎgの125I−組換えヒトEP
Oを添加し、次いで約0.5×106のOCIM1細胞を添加した。
アッセイ管を次に、振盪水浴中で37℃ で2時間インキ
ュベートした。インキュベーション後、OCIM1細胞に結
合した125I−rHuEPOから未結合の125I−rHuEPOを分離す
るために、溶液をジブチルフタレート／ビ−フタレート
油溶液中で遠心した。細胞ペレットを単離し、細胞に結
合した125I−rHuEPOをガンマカウンティングによって測
定した。細胞に特異的に結合したカウント数を計算し、
競合物質の非存在下で125I−rHuEPOの50%結合に結合す
るために必要な非標識タンパク質の濃度を線形回帰分析
によって決定した。
【００９３】3つのアッセイの結果は、OCIM1細胞への
125I−rHuEPOの結合を50%減少させるために平均2.67±
0.73ｎgの非標識EPO N14ペプチドが必要であることを
示した。同じ3つのアッセイにおいて、0.5ｎgの125I−r
HuEPOの結合と競合するために必要な非標識rHuEPOは平
均0.51±0.15ｎgであった。これらの結果に基づくと、E
PO受容体への結合において125I−rHuEPOと競合するため
には、非標識r−HuEPO（ｐ<0.01）の5.25倍のEPO N14
が必要であった。
125I−rHuEPOの結合を50%減少させるために平均2.67±
0.73ｎgの非標識EPO N14ペプチドが必要であることを
示した。同じ3つのアッセイにおいて、0.5ｎgの125I−r
HuEPOの結合と競合するために必要な非標識rHuEPOは平
均0.51±0.15ｎgであった。これらの結果に基づくと、E
PO受容体への結合において125I−rHuEPOと競合するため
には、非標識r−HuEPO（ｐ<0.01）の5.25倍のEPO N14
が必要であった。
【００９４】エリトロポエチン受容体との結合に関して
ＥＰＯ Ｎ14類似体、単離イソ形14及び組換えエリトロ
ポエチンを直接比較するために追加実験を実施した。こ
の実験の結果は、EPO N14類似体が受容体に対して単離
イソ形14よりも低い親和性を有していることを示した。
受容体との結合において125I−rHuEPOと競合するために
は、非標識イソ形14の約2倍過剰のEPO N14類似体が必
要であった（図14）。 C.ヘマトクリット試験 （実施例7Cに記載の調製物2から得られた）EPO N14の
高イソ形プール及び低イソ形プール、単離イソ形14並び
に組換えヒトEPOの処置マウスへマトクリット増加能力
を比較するためにin vivo試験を実施した。この試験で
使用したEPO N14の高イソ形プール及び低イソ形プール
のイソ形分布を図12に示す。
ＥＰＯ Ｎ14類似体、単離イソ形14及び組換えエリトロ
ポエチンを直接比較するために追加実験を実施した。こ
の実験の結果は、EPO N14類似体が受容体に対して単離
イソ形14よりも低い親和性を有していることを示した。
受容体との結合において125I−rHuEPOと競合するために
は、非標識イソ形14の約2倍過剰のEPO N14類似体が必
要であった（図14）。 C.ヘマトクリット試験 （実施例7Cに記載の調製物2から得られた）EPO N14の
高イソ形プール及び低イソ形プール、単離イソ形14並び
に組換えヒトEPOの処置マウスへマトクリット増加能力
を比較するためにin vivo試験を実施した。この試験で
使用したEPO N14の高イソ形プール及び低イソ形プール
のイソ形分布を図12に示す。
【００９５】CD1マウス（約30ｇ）に、0.25%マウス血清
アルブミン中で調製された上記調製物の1つ、またはプ
ラシーボ（0.25%マウス血清アルブミンを含むＰＢＳ）
を毎週3回ずつ合計6週間腹腔内注射した。ペプチド質量
に基づくエリトロポエチン調製物の投与量は、30ｇのマ
ウスがＥＰＯ Ｎ14の高プール、ＥＰＯ Ｎ14の低プー
ル、イソ形14及びr−HuEPO標準の各々を投与あたり0.07
1μg受容する量とした。EPO N14の高プール及びイソ形
14の場合には、ペプチド投与量を投与あたり0.036μgと
した追加グループも試験した。眼窩後方から採血するこ
とによって全部のマウスのヘマトクリットの基線量を測
定しその後毎週2回測定した。実験の終了後、全部の動
物から血清を収集し、注射物質に対する抗体を検定し
た。抗体中和が陰性であると判定された動物で得られた
データを以後の分析に使用した。
アルブミン中で調製された上記調製物の1つ、またはプ
ラシーボ（0.25%マウス血清アルブミンを含むＰＢＳ）
を毎週3回ずつ合計6週間腹腔内注射した。ペプチド質量
に基づくエリトロポエチン調製物の投与量は、30ｇのマ
ウスがＥＰＯ Ｎ14の高プール、ＥＰＯ Ｎ14の低プー
ル、イソ形14及びr−HuEPO標準の各々を投与あたり0.07
1μg受容する量とした。EPO N14の高プール及びイソ形
14の場合には、ペプチド投与量を投与あたり0.036μgと
した追加グループも試験した。眼窩後方から採血するこ
とによって全部のマウスのヘマトクリットの基線量を測
定しその後毎週2回測定した。実験の終了後、全部の動
物から血清を収集し、注射物質に対する抗体を検定し
た。抗体中和が陰性であると判定された動物で得られた
データを以後の分析に使用した。
【００９６】図15に示すように、EPO N14の高イソ形プ
ールで処理した動物は、他の調製物に比較して最高の群
平均ヘマトクリットに達した。イソ形１４、組換えヒト
EPO及びEPO Ｎ14の低イソ形プールではヘマトクリット
が増加していたが増加の程度はもっと低かった。種々の
エリトロポエチン調製物をより定量的に比較するため
に、ヘマトクリット増加の平均初期速度（０〜11日）、
グラフ下面積（０〜39日）及び総ヘマトクリット増加を
計算した（表10）。これらの判定基準のいずれによって
も、EPO Ｎ14の高イソ形プールは、試験した他の調製物
のどれよりもペプチドの基準質量で活性であると考えら
れる。EPO Ｎ14の高イソ形プール及びイソ形14は組換え
ヒトEPO よりも活性であった。EPO Ｎ14の低プールはど
の分析物と比較したときにも最低の活性を有していた。
ールで処理した動物は、他の調製物に比較して最高の群
平均ヘマトクリットに達した。イソ形１４、組換えヒト
EPO及びEPO Ｎ14の低イソ形プールではヘマトクリット
が増加していたが増加の程度はもっと低かった。種々の
エリトロポエチン調製物をより定量的に比較するため
に、ヘマトクリット増加の平均初期速度（０〜11日）、
グラフ下面積（０〜39日）及び総ヘマトクリット増加を
計算した（表10）。これらの判定基準のいずれによって
も、EPO Ｎ14の高イソ形プールは、試験した他の調製物
のどれよりもペプチドの基準質量で活性であると考えら
れる。EPO Ｎ14の高イソ形プール及びイソ形14は組換え
ヒトEPO よりも活性であった。EPO Ｎ14の低プールはど
の分析物と比較したときにも最低の活性を有していた。
【００９７】
【表１０】 本発明を好ましい実施態様に基づいて説明してきたが、
本発明は、開示された実施態様に限定されることなく、
特許請求の範囲の思想及び範囲に包含される種々の修正
及び均等を包含する。特許請求の範囲は、かかる修正及
び均等をすべて包含する最も広い範囲に解釈されるべき
である。
本発明は、開示された実施態様に限定されることなく、
特許請求の範囲の思想及び範囲に包含される種々の修正
及び均等を包含する。特許請求の範囲は、かかる修正及
び均等をすべて包含する最も広い範囲に解釈されるべき
である。
【００９８】
SEQUENCE LISTING <110> Kirin-Amgen Inc. <120> Erythropoietin analogs <130> PA98-299 <150> US 08/108,016 <151> 1993-8-17 <160> 26 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 cgcccaccaa acctcagctg tgacagccga 30 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 atctgtacaa ccgaagcctg gagaggt 27 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gggcctggcc aacctgtcgg aag 23 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 tcccctccag ataatgcctc agctgc 26 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 cagatgcgaa ctcatctgct ccac 24 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 aggcctgcag gaatgggagc agatgaccag gtg 33 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 tccagatgcg acctcagctg ctc 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 cctccagatc cgacctcagc tgc 23 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 gggcctggcc aacctgacag aagctgtc 28 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 cagggcctgt ccaacctgac agaagctgtc 30 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 cagatgcgaa ctcaacggct ccac 24 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 atgcgaactc aacggctcca ctcacaacaa tcact 35 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ccagatccaa attcatctgc tccactc 27 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 ccagatccaa attcaacagc tccactc 27 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 ccagatgcga caacagctgc tcca 24 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 agatccgacc accgctgctc cac 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 tgctccactc acaacaatca ctg 23 <210> 18 <211> 184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 tcgaggaact gaaaaaccag aaagttaact ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc 60 aggtcccgga tccggtggtg gtgcaaatca aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt 120 acttctaggc ctgtacggaa gtgttacttc tgctctaaaa gctgctgcaa caagctggtc 180 gacc 184 <210> 19 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 cctgtaggac aggggacaga tcctcttcct caaaggcccc tccccccagc cttccaagtc 60 catcccgact cccggggccc tcggacaccc cgatcctccc acaatga 107 <210> 20 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 gatctcattg tgggaggatc ggggtgtccg agggccccgg gagtcgggat ggacttggaa 60 ggctgggggg aggggccgag gaagaggatc tgtcccctgt cctacagg 108 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 ggaggccgag cagatcacga cgg 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 22 cttgaatgag cagatcactg tcc 23 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 23 ctgttggtcc agtcttccca g 21 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 24 cctgttggtc cagtcttccc agc 23 <210> 25 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <301> Pierce et al. <303> Ann. Rev. Biochem. <304> 50 <306> 465 <307> 1981 <400> 25 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 1 5 10 15 Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 20 25 <210> 26 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg
【図1】この図は、個々の組換えエリトロポエチン形の
分析用等電点電気泳動ゲルを示す写真である。ゲルレー
ン１〜11は、レーン１の低酸性（高pI) からレーン11の
高酸性（低pI) までのイソ形を示す。また、イソ形９〜
14の混合物を含む精製組換えエリトロポエチンをゲルの
左端及び右端のレーンに示す。
分析用等電点電気泳動ゲルを示す写真である。ゲルレー
ン１〜11は、レーン１の低酸性（高pI) からレーン11の
高酸性（低pI) までのイソ形を示す。また、イソ形９〜
14の混合物を含む精製組換えエリトロポエチンをゲルの
左端及び右端のレーンに示す。
【図2Ａ】この図は、各エリトロポエチン形のシアル酸
の数と各イソ形のin vivo 比活性との関係を、エリトロ
ポエチンペプチド１mgあたりの単位（units)で示す。各
エリトロポエチンイソ形の濃度をＲＩＡによって測定し
た。
の数と各イソ形のin vivo 比活性との関係を、エリトロ
ポエチンペプチド１mgあたりの単位（units)で示す。各
エリトロポエチンイソ形の濃度をＲＩＡによって測定し
た。
【図3】この図は、種々の条件の下のアニオン交換クロ
マトグラフィーによって調製した組換えエリトロポエチ
ンイソ形の所定の混合物の分析用等電点電気泳動ゲルを
示す写真である。ゲルレーン１〜６の各々は、150mM の
酢酸，pH 4.7、150mM の酢酸（非緩衝）、200mM の酢
酸，pH 4.7、250mM の酢酸，pH 4.7、300mM の酢酸，pH
4.7または300mM の酢酸（非緩衝）を夫々用いてＱ−セ
ファロース高速流カラムを洗浄した後の高塩洗浄液中に
溶出したエリトロポエチンイソ形を示す。また、Lai
ら、前出、の実施例２に記載の手順を修正し、DEAE−ア
ガロースクロマトグラフィーに代えてＱ−セファロース
クロマトグラフィーを用いて得られたイソ形混合物を含
む精製組換えエリトロポエチンをゲルの左端レーンに示
す。
マトグラフィーによって調製した組換えエリトロポエチ
ンイソ形の所定の混合物の分析用等電点電気泳動ゲルを
示す写真である。ゲルレーン１〜６の各々は、150mM の
酢酸，pH 4.7、150mM の酢酸（非緩衝）、200mM の酢
酸，pH 4.7、250mM の酢酸，pH 4.7、300mM の酢酸，pH
4.7または300mM の酢酸（非緩衝）を夫々用いてＱ−セ
ファロース高速流カラムを洗浄した後の高塩洗浄液中に
溶出したエリトロポエチンイソ形を示す。また、Lai
ら、前出、の実施例２に記載の手順を修正し、DEAE−ア
ガロースクロマトグラフィーに代えてＱ−セファロース
クロマトグラフィーを用いて得られたイソ形混合物を含
む精製組換えエリトロポエチンをゲルの左端レーンに示
す。
【図4】この図は、Ｑ−セファロースのカラムに使用し
た細胞馴化培地に、漸減pH及び漸増イオン強度の勾配を
与えることによって得られたエリトロポエチンイソ形８
〜12の分離を示す分析用等電点電気泳動の写真である。
分画２から分画40までの偶数番号の分画のアリコートを
分析用等電点電気泳動に掛けた。また、Lai ら、前出、
の実施例２に記載の手順を修正し、DEAE−アガロースク
ロマトグラフィーに代えてＱ−セファロースクロマトグ
ラフィーを用いて得られたイソ形混合物を含む精製組換
えエリトロポエチンをゲルの左端レーンに示す。
た細胞馴化培地に、漸減pH及び漸増イオン強度の勾配を
与えることによって得られたエリトロポエチンイソ形８
〜12の分離を示す分析用等電点電気泳動の写真である。
分画２から分画40までの偶数番号の分画のアリコートを
分析用等電点電気泳動に掛けた。また、Lai ら、前出、
の実施例２に記載の手順を修正し、DEAE−アガロースク
ロマトグラフィーに代えてＱ−セファロースクロマトグ
ラフィーを用いて得られたイソ形混合物を含む精製組換
えエリトロポエチンをゲルの左端レーンに示す。
【図5】この図は、ヒトエリトロポエチンのアミノ酸配
列を示す。□はＮ−結合炭水化物鎖が結合したアスパラ
ギン残基を示す、＊は、Ｏ−結合炭水化物鎖で修飾され
たセリン残基を示す。
列を示す。□はＮ−結合炭水化物鎖が結合したアスパラ
ギン残基を示す、＊は、Ｏ−結合炭水化物鎖で修飾され
たセリン残基を示す。
【図6Ａ】この図は、ヒトエリトロポエチン類似体の構
築及び分析用のプラスミドの作製に使用された一連のク
ローニング段階を示す。これらの類似体は図５に示すよ
うな付加的グリコシレーション部位を与えるアミノ酸変
異を有している。
築及び分析用のプラスミドの作製に使用された一連のク
ローニング段階を示す。これらの類似体は図５に示すよ
うな付加的グリコシレーション部位を与えるアミノ酸変
異を有している。
【図6Ｂ】この図は、ヒトエリトロポエチン類似体の構
築及び分析用のプラスミドの作製に使用された一連のク
ローニング段階を示す。これらの類似体は図５に示すよ
うな付加的グリコシレーション部位を与えるアミノ酸変
異を有している。
築及び分析用のプラスミドの作製に使用された一連のク
ローニング段階を示す。これらの類似体は図５に示すよ
うな付加的グリコシレーション部位を与えるアミノ酸変
異を有している。
【図6Ｃ】この図は、ヒトエリトロポエチン類似体の構
築及び分析用のプラスミドの作製に使用された一連のク
ローニング段階を示す。これらの類似体は図５に示すよ
うな付加的グリコシレーション部位を与えるアミノ酸変
異を有している。
築及び分析用のプラスミドの作製に使用された一連のク
ローニング段階を示す。これらの類似体は図５に示すよ
うな付加的グリコシレーション部位を与えるアミノ酸変
異を有している。
【図7】この図は、ヒト配列エリトロポエチン及び図示
のエリトロポエチン類似体のＣＯＳ細胞上清の電気泳動
／ウェスタンブロット分析を示す写真である。類似体
[Asn9，Ser11] EPO、[Asn69］EPO 、［Asn125，Se
r127］EPO 及び［Pro124, Thr125］EPOを実施例６に記
載の手順で構築する。比較のために、付加的炭水化物鎖
を含まない追加の類似体［Pro125, Thr127］EPO 及び
［Asn126，Ser128］EPO を示している。
のエリトロポエチン類似体のＣＯＳ細胞上清の電気泳動
／ウェスタンブロット分析を示す写真である。類似体
[Asn9，Ser11] EPO、[Asn69］EPO 、［Asn125，Se
r127］EPO 及び［Pro124, Thr125］EPOを実施例６に記
載の手順で構築する。比較のために、付加的炭水化物鎖
を含まない追加の類似体［Pro125, Thr127］EPO 及び
［Asn126，Ser128］EPO を示している。
【図8】この図は、Ｎ−グリカナーゼ処理後のヒト配列
エリトロポエチン及び図示のエリトロポエチン類似体の
ＣＯＳ細胞上清の電気泳動／ウェスタンブロット分析を
示す写真である。類似体［Thr125］EPO 及び［Pro124,
Thr125］EPO を実施例６に記載の手順で構築した。比較
のために、類似体［Val126］EPO 、［Pro124］EPO 、
［Pro125］EPO 、[Thr127] EPO、［Pro125，Ser127］EP
O 及び［Thr125，Ser127］EPO を示している。
エリトロポエチン及び図示のエリトロポエチン類似体の
ＣＯＳ細胞上清の電気泳動／ウェスタンブロット分析を
示す写真である。類似体［Thr125］EPO 及び［Pro124,
Thr125］EPO を実施例６に記載の手順で構築した。比較
のために、類似体［Val126］EPO 、［Pro124］EPO 、
［Pro125］EPO 、[Thr127] EPO、［Pro125，Ser127］EP
O 及び［Thr125，Ser127］EPO を示している。
【図9】この図は、［Thr125］突然変異を含むエリトロ
ポエチンｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の
増殖を支持した細胞培地のＱ−セファロース及びC4逆相
クロマトグラフィーによって得られたプール２、３及び
４の等電点電気泳動ゲルを示す写真である。更に、 Lai
ら、前出、の実施例２に記載の手順を修正し、DEAE−ア
ガロースクロマトグラフィーに代えてＱ−セファロース
クロマトグラフィーを用いて得られたイソ形の混合物を
含む精製組換えエリトロポエチンをゲルの左端及び右端
のレーンに示す。
ポエチンｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の
増殖を支持した細胞培地のＱ−セファロース及びC4逆相
クロマトグラフィーによって得られたプール２、３及び
４の等電点電気泳動ゲルを示す写真である。更に、 Lai
ら、前出、の実施例２に記載の手順を修正し、DEAE−ア
ガロースクロマトグラフィーに代えてＱ−セファロース
クロマトグラフィーを用いて得られたイソ形の混合物を
含む精製組換えエリトロポエチンをゲルの左端及び右端
のレーンに示す。
【図１０】この図は、組換えヒトエリトロポエチン（rH
uEPO) 及び選択された類似体のＣＯＳ細胞上清の電気泳
動／ウエスタンブロット分析を示す写真である。類似体
の構築は実施例６に記載されている。類似体N9、 N14、
N18、 N19、 N21、N24及びN39 は、ゲル移動度の遅延
によって証明されるように少なくとも１つの付加的炭水
化物鎖を有する。
uEPO) 及び選択された類似体のＣＯＳ細胞上清の電気泳
動／ウエスタンブロット分析を示す写真である。類似体
の構築は実施例６に記載されている。類似体N9、 N14、
N18、 N19、 N21、N24及びN39 は、ゲル移動度の遅延
によって証明されるように少なくとも１つの付加的炭水
化物鎖を有する。
【図１１】この図は、Ｎ−グリカナーゼ消化中の組換え
ヒトエリトロポエチン及び EPO N14類似体のＣＯＳ細胞
上清の電気泳動／ウェスタンブロット分析を示す写真で
ある。０、４、12及び45分消化後及び一夜消化後を測定
時点とした。
ヒトエリトロポエチン及び EPO N14類似体のＣＯＳ細胞
上清の電気泳動／ウェスタンブロット分析を示す写真で
ある。０、４、12及び45分消化後及び一夜消化後を測定
時点とした。
【図１２】この図は、 EPO N14類似体イソ形調製物の等
電点電気泳動ゲルを示す写真である。等電点の低いイソ
形プールは１分子あたり概して６〜12個のシアル酸を有
する EPO N14類似体を含み、中間のイソ形プールは１分
子あたり概して10〜15個のシアル酸を有する類似体N14
を含み、高いイソ形プールは１分子あたり概して12〜17
個のシアル酸を有するEPO N14類似体を含んでいる。
電点電気泳動ゲルを示す写真である。等電点の低いイソ
形プールは１分子あたり概して６〜12個のシアル酸を有
する EPO N14類似体を含み、中間のイソ形プールは１分
子あたり概して10〜15個のシアル酸を有する類似体N14
を含み、高いイソ形プールは１分子あたり概して12〜17
個のシアル酸を有するEPO N14類似体を含んでいる。
【図１３】この図は、ラットに静注後の組換えヒトエリ
トロポエチン、単離イソ形14及びEPO N14 類似体（イソ
形15-17)の薬物動態を示す。
トロポエチン、単離イソ形14及びEPO N14 類似体（イソ
形15-17)の薬物動態を示す。
【図１４】この図は、種々の量の非標識rHuEPO、単離イ
ソ形14または EPO N14類似体の存在下でエリトロポエチ
ン受容体に結合する125I標識組換えヒトエリトロポエチ
ンの低温置換エッセイを示す。
ソ形14または EPO N14類似体の存在下でエリトロポエチ
ン受容体に結合する125I標識組換えヒトエリトロポエチ
ンの低温置換エッセイを示す。
【図１５】この図は、 EPO N14の高イソ形プール（0.03
6 及び0.0712μg)、単離イソ形14（0.036 及び0.0712μ
g)、 EPO 177の低イソ形プール（0.0712μg)及びrHuEPO
（0.071μg)の活性を比較するマウスヘマトクリット試
験を示す。
6 及び0.0712μg)、単離イソ形14（0.036 及び0.0712μ
g)、 EPO 177の低イソ形プール（0.0712μg)及びrHuEPO
（0.071μg)の活性を比較するマウスヘマトクリット試
験を示す。
【表３】
【表３】
【表３】
【表３】
【表４】
【表４】
【表４】
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/24 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (11)
- 【請求項１】ヒトエリトロポエチンのマチュアなアミノ
酸配列の３０、５１、５７、６９、８９、１３６又は１
３８位のいずれかの位置のアミノ酸残基がアスパラギン
残基で置換された少なくとも１つのグリコシレーション
部位を含み、この部位に炭水化物鎖が結合しており、か
つ８８位のアミノ酸残基がアスパラギン残基で置換され
ていないことを特徴とする、エリトロポエチン活性を有
するヒトエリトロポエチン類似体。 - 【請求項２】前記活性に影響を及ぼさない1個以上のア
ミノ酸の置換、欠失又は付加からなる他の変異を含むこ
とを特徴とする請求項１に記載の類似体。 - 【請求項３】下記の群：[Ａｓｎ30Ｔｈｒ32]ＥＰＯ；
[Ａｓｎ51Ｔｈｒ53]ＥＰＯ；[Ａｓｎ57Ｔｈｒ59]ＥＰ
Ｏ；[Ａｓｎ89Ｉｌｅ90Ｔｈｒ91]ＥＰＯ；[Ｓｅｒ87Ａ
ｓｎ89Ｉｌｅ90Ｔｈｒ91]ＥＰＯ；[Ａｓｎ136Ｔｈ
ｒ138]ＥＰＯ；及び[Ａｓｎ138Ｔｈｒ140]ＥＰＯから選
択されることを特徴とする請求項１に記載の類似体。 - 【請求項４】ヒトエリトロポエチンのカルボキシ末端に
１つ又はそれ以上のアミノ酸から成りかつ少なくとも１
つのグリコシレーション部位を有する付加体を含み、８
８位のアミノ酸残基がアスパラギン残基で置換されてい
ないことを特徴とするヒトエリトロポエチン類似体。 - 【請求項５】付加体が、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのカ
ルボキシル末端由来のペプチドフラグメントからなるこ
とを特徴とする請求項４に記載の類似体。 - 【請求項６】ペプチドフラグメントが、アミノ酸配列Se
r-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-
Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Le
u-Pro-Glnを有することを特徴とする請求項５に記載の
類似体。 - 【請求項７】少なくとも１つのグリコシレーション部位
の転位を含むアミノ酸配列から成り、８８位のアミノ酸
残基がアスパラギン残基で置換されていないことを特徴
とするヒトエリトロポエチン類似体。 - 【請求項８】転位が、ヒトエリトロポエチンの本来のＮ
−結合炭水化物部位のいずれかの欠失、及び、前記部位
と異なる位置へのＮ−結合炭水化物部位の付加から成る
ことを特徴とする請求項７に記載の類似体。 - 【請求項９】請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒト
エリトロポエチン類似体をコードするＤＮＡ。 - 【請求項１０】宿主細胞がヒトエリトロポエチン類似体
を発現できるように請求項９に記載のＤＮＡでトランス
フェクトされた真核宿主細胞。 - 【請求項１１】治療有効量の請求項１〜８のいずれか一
項に記載のエリトロポエチン類似体を医薬として許容さ
れる希釈剤、アジュバント又は担体と共に含む、赤血球
細胞の産生を増進するための医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10801693A | 1993-08-17 | 1993-08-17 | |
| US08/108016 | 1993-08-17 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8507153A Division JPH09508557A (ja) | 1994-08-08 | 1995-07-10 | 迅速交換構成の薬剤搬送用カテーテルおよび膨張型薬剤搬送用カテーテル |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004188815A Division JP3664723B2 (ja) | 1993-08-17 | 2004-06-25 | エリトロポエチン類似体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11155584A true JPH11155584A (ja) | 1999-06-15 |
| JP3664590B2 JP3664590B2 (ja) | 2005-06-29 |
Family
ID=22319789
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7507153A Expired - Lifetime JP2938572B2 (ja) | 1993-08-17 | 1994-08-16 | エリトロポエチン類似体 |
| JP25324498A Expired - Lifetime JP3664590B2 (ja) | 1993-08-17 | 1998-08-24 | エリトロポエチン類似体 |
| JP2004188815A Expired - Lifetime JP3664723B2 (ja) | 1993-08-17 | 2004-06-25 | エリトロポエチン類似体 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7507153A Expired - Lifetime JP2938572B2 (ja) | 1993-08-17 | 1994-08-16 | エリトロポエチン類似体 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004188815A Expired - Lifetime JP3664723B2 (ja) | 1993-08-17 | 2004-06-25 | エリトロポエチン類似体 |
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| Country | Link |
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| JP (3) | JP2938572B2 (ja) |
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| AT (1) | ATE155796T1 (ja) |
| AU (1) | AU677097B2 (ja) |
| CA (1) | CA2147124C (ja) |
| CZ (3) | CZ291229B6 (ja) |
| DE (2) | DE69404401T3 (ja) |
| DK (1) | DK0640619T4 (ja) |
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| FI (1) | FI117136B (ja) |
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