CN101337988B

CN101337988B - 一种新的促红细胞生成素类似物

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Publication number: CN101337988B
Application number: CN 200710127362
Authority: CN
Inventors: 娄竞; 耿建玲; 张�杰; 侯绪凤; 赵会林; 陆军; 苏冬梅; 胡金东
Original assignee: SHENYANG SUNSHINE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHENYANG SUNSHINE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2006-10-31
Filing date: 2007-07-02
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2027-07-02
Also published as: CN101337988A

Abstract

本发明涉及一种具有至少一个额外糖基化位点的促红细胞生成素类似物或其变体。本发明还涉及编码该促红细胞生成素类似物或其变体的DNA序列，以及供该类似物或其变体表达的重组质粒和宿主细胞。

Description

一种新的促红细胞生成素类似物

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种具有至少一个额外糖基化位点的促红细胞生成素类似物或其变体。本发明还涉及编码所述促红细胞生成素类似物或其变体的DNA序列，以及表达该类似物或其变体的重组质粒和宿主细胞。

发明背景

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是第一个被发现并应用于临床的造血生长因子。早在1906年，Carnot等发现兔失血后会在外周血中产生一种可作用于造血系统以加速红细胞生成的物质，由此提出存在一种体液因子以反馈方式调节血细胞生成。时隔30多年以后此观点才得以证实，这种因子被命名为促红细胞生成素。促红细胞生成素又称血细胞生成素、红细胞刺激因子，属酸性糖蛋白，是调节前体红细胞增殖、分化以及保持外周血中红细胞浓度处于正常生理范围内的最主要激素。它可与红细胞前体细胞表面的EPO受体结合，促进其血红蛋白的合成使之增殖分化成红细胞，从而调节体内红细胞和血红蛋白的生理平衡。EPO是一个强有力的造血生长因子，体外分析显示在0.05～1U/ml的浓度时即具有剂量依赖效应。EPO可刺激红系祖细胞(BFU-E)和早幼稚红细胞(CFU-E)形成成熟的红细胞集落。EPO除了作用于骨髓巨核前体细胞外，对其他造血细胞均无作用，是迄今认为作用最单一的造血生长因子。当然，对红细胞造血过程的完整调节，除了EPO外，还需要其他因子的协同作用，包括Multi-CSF、GM-CSF和IL-1，这些因子促使干细胞变成BFU-E，并联合刺激使红细胞早期增殖，随后才是EPO的增殖作用。

1977年，Miyake等从重症再障贫血病人的尿中提取得到了EPO的纯品，由于起始来源的匮乏，很难得到大量纯品以充分研究其生物学和分子学性质。1984年，科学家们首次以人肾癌细胞的EPO mRNA为模板，经逆转录合成cDNA并在大肠杆菌中得以克隆并表达，在此基础上获得了EPO的完整基因并在真核细胞中进行高效表达，为深入研究EPO的生物学效应并将之应用于临床奠定了基础。现在国内外已能用基因工程方法生产重组人红细胞生成素(rhEPO)，并用于临床治疗多种红细胞减少症，具有很好的疗效。

真核细胞产生的许多细胞表面蛋白和分泌蛋白，都被一个或更多寡糖基团修饰。这种称为糖基化的修饰能强烈影响蛋白质的理化性质，对蛋白质的稳定性、分泌和亚细胞定位也会起重要作用。正确的糖基化有时是生物活性所必需的。某些真核生物的基因在缺乏使蛋白糖基化的细胞过程的细菌(如大肠杆菌)中表达，所回收到的蛋白由于缺乏糖基化而没有或几乎没有活性。

糖基化作用出现在多肽骨架的特异位置，通常有两类：O连接糖基化和N连接糖基化。O连接的寡糖连在丝氨酸或苏氨酸残基上，而N连接的寡糖则连接在作为序列Asn-X-Ser/Thr一部分的天冬酰胺残基上，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。N连接和O连接的寡糖结构及每种类型中存在的糖残基都是不同的。共同存在于两种类型中的一类糖是N-乙酰基神经氨酸(以下简称唾液酸)。唾液酸通常是N连接和O连接寡糖的末端残基，由于它带负电荷，可能会使糖蛋白具有酸性。

成熟的EPO由166个氨基酸组成，氨基酸序列参见SEQ ID NO：1，肽链结构见图1。EPO分子内有两个二硫键，3个N-键糖基化位点和1个O-键糖基化位点，其中两个二硫键在变性EPO复性并折叠成有生物活性构型时是必不可少的。天然人促红细胞生成素和哺乳动物细胞表达的人促红细胞生成素都含有三个N连接寡糖链和一个O连接寡糖链，它们共占蛋白总分子量的40％。N连接糖基化出现在24、38、83位的天冬酰胺残基，而O连接糖基化则出现在126位的丝氨酸残基(Lai等，J.Biol.Chem.261：3116，1986；Broundy等，Arch.Biochem.Biophys.265：329，1988))。已证明寡糖链被末端唾液酸残基修饰。对糖基化促红细胞生成素进行酶处理而脱除唾液酸残基后，导致体内活性丧失，但不影响体外活性(Lowy等，Nature 185：102，1960；Goldwasser等，J.Biol.Chem.249：4202，1974)。这一现象曾被解释为无唾液酸促红细胞生成素由于与肝无唾液酸糖蛋白结合蛋白相互作用而从循环中迅速清除(Morrell等，J.Bio.Chem.243：155，1968；Briggs等Am.J.Physiol.227：1385，1974；Ashwell，Methods Enzymol.50：287，1978)。因此促红细胞生成素只有在被唾液酸酸化从而避免被肝结合时才具有体内生物活性。

在促红细胞生成素的寡糖中，其作用还不十分确定。已证明，部分脱糖基化的促红细胞生成素与糖基化形式相比，体内活性大大降低，但保留了体外活性(Dordal等，Endocrinology 116：2293，1985)。但另一项研究则表明，如果使作为糖基化位点的天冬酰胺或丝氨酸残基发生突变，从而单独或共同脱除N连接或O连接的寡糖链，则会使在哺乳动物细胞中产生的突变蛋白的体外活性急剧下降(Dube等，J.Biol.Chem.263：17516，1988)。

糖蛋白如促红细胞生成素，可以用诸如等电聚焦(IEF)等技术分离成不同带电形式。粗制及部分纯化的促红细胞生成素制备物的IEF研究已有多方报道(Lukosky等，J.Biochem.50：909，1972；Shelton等，Biochem.Med.12：45，1975；Fuhr等，Biochem.Biophys.Res.Comm.98：930，1981)。在Miyake等人所讨论的从人尿纯化人促红细胞生成素中，通过羟基磷灰石色谱法得到的两个促红细胞生成素组分。这两个组分被定名为II、IIIA。随后对II和IIIA进行的碳水化合物分析表明，组分II的唾液酸含量比组分IIIA高。

进一步研究还表明，一个位点的糖基化程度很大程度上取决于其周围氨基酸的组成(Kasturi等，Biochem.J.323：415，1997；Elliott等，JBC.279：16854，2004)，因此，改变N-糖基化位点附近氨基酸组成会在很大程度上影响糖基化的程度。

增加促红细胞生成素碳水化合物的数目，并因此而增加每个促红细胞生成素分子的唾液酸数目，可以产生一些优越的性质，例如溶解度提高、更耐受蛋白水解作用、免疫原性下降、血清半衰期延长、生物活性提高。

本发明通过突变天然EPO序列中的若干个氨基酸残基增加N-糖基化位点数而提高了EPO类似物的性能。

发明内容

本发明涉及一种具有促红细胞生成素活性的天然人促红细胞生成素类似物或其变体，该类似物包括至少一个额外N-糖基化位点，其位点范围位于人促红细胞生成素氨基酸序列的1-9，28-32，40-55，86-92，112-133，162-166位，以及该变体在该类似物的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸的缺失、替换或添加，且具有该类似物等同的活性。在一优选的实施方案中，额外N-糖基化位点位于人促红细胞生成素氨基酸序列的1-6，28-32，87-90位。在另一优选的实施方案中，额外N-糖基化位点的数为1-3个。在另一优选的实施方案中，本发明的类似物在天然人促红细胞生成素氨基酸序列的2、3、4、28、30、88位中的任何一位置置换上了天冬酰胺。在另一优选的实施方案中，本发明的类似物在天然红细胞生成素氨基酸序列的4、5、6、30位中的任何一位位置置换上了苏氨酸。在另一优选的实施方案中，本发明的类似物在天然红细胞生成素氨基酸序列的4、5、6、30、32、90位中的任何一个位置置换上了丝氨酸。在另一优选的实施方案中，本发明的类似物在天然红细胞生成素氨基酸序列的1、2、3、27、87位置换上了丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸或丝氨酸。在另一优选的实施方案中，本发明的类似物在天然人促红细胞生成素氨基酸序列的3、4、5、31、89位中的任何一个位置置换上了异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸或组氨酸。在另一优选的实施方案中，本发明的类似物选自Z¹Asn²Y³X⁴EPO、Z²Asn³Y⁴X⁵EPO、Z³Asn⁴Y⁵X⁶EPO、Z²⁷Asn²⁸X³⁰EPO、Asn³⁰Y³¹X³²EPO、Z⁸⁷Asn⁸⁸Y⁸⁹Ser⁹⁰EPO或它们任意两种或任意三种的组合，其中X选自丝氨酸和苏氨酸；以及Y和Z选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸。

本发明还涉及一种DNA序列，该DNA序列编码本发明的的人促红细胞生成素类似物或其变体。

本发明还涉及一种真核宿主细胞，其转化有包含本发明DNA序列的载体。在一个优选实施方案中，该真核宿主细胞选自CHO，COS-7或BHK。

本发明进一步涉及一种具有促红细胞生成素活性的天然人促红细胞生成素类似物或其变体的生产方法，包括步骤：(i)培养本发明的真核宿主细胞，和(ii)从培养物中收集具有红细胞生成素活性的糖蛋白。

本发明进一步涉及一种增加红细胞生成的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的本发明的人促红细胞生成素类似物或其变体以及可药用的稀释剂、助剂或载体。该药物组合物优选用于促进红细胞生成，预防或治疗贫血。

具体而言，包含本发明DNA序列的载体转入真核细胞(如CHO细胞、COS-7细胞、BHK)中进行表达，优先选用CHO细胞。向CHO细胞中加入无血清培养基、包含本发明DNA序列的载体、lipofectamine组成的转染混合液，培养一段时间后在培养基中加入氨甲喋呤(MTX)筛选抗性克隆。随后逐渐提高MTX浓度来筛选高表达的抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞能够表达人红细胞生成素类似物。

将能够表达人红细胞生成素类似物的细胞扩增，培养，收集培养液。接着，含重组红细胞生成素类似物的细胞培养液浓缩后上样于QSepharose Fast flow或DEAE Sepharose Fast flow(GE)等同类离子交换层析介质装填的柱上，经缓冲液冲洗后用低pH值缓冲液淋洗柱子。最后，通过含有盐的缓冲液将确定的红细胞生成素类似物由柱上洗脱下来。上述收集到的红细胞生成素类似物进一步经过反相层析纯化，上样C4、C8、Source等反相层析柱，利用0-100％梯度的乙醇、异丙醇或乙腈将红细胞生成素类似物洗脱下来。

本领域技术人员可以预期，在本发明促红细胞生成素类似物的氨基酸序列中缺失，替换或添加一个或几个氨基酸，生成的变体仍具有该类似物等同的活性。例如，在本发明类似物的非关键点位缺失一个或几个氨基酸；同类型氨基酸(非保守性氨基酸)之间的相互替换，例如，酸性氨基酸之间的替换，例如Glu和Asp，碱性氨基酸之间的替换，例如Arg和Lys，芳香族氨基酸之间的替换，例如Phe和Tyr；带羟基的极性氨基酸之间的替换，例如Thr和Ser；在类似物全长氨基酸序列的前后添加一个或几个氨基酸，例如，在N端添加His标签或分泌信号序列，或在C端添加polyA尾等等。

本发明的促红细胞生成素类似物包含至少一个额外糖基化位点的氨基酸序列。额外的糖基化位点会导致比天然人红细胞生成素数目更多的碳水化合物链和更高的唾液酸含量。唾液酸含量高于天然人促红细胞生成素的类似物是通过添加糖基化位点而产生的，而这些糖基化位点不干扰生物活性所需的二级或三级构象。人促红细胞生成素类似物最好有1、2或3个额外N-糖基化位点，从而添加1、2或3个额外N连接碳水化合物链。例如，用天冬酰胺置换2位的脯氨酸，用丝氨酸置换4位的精氨酸，得到序列Asn-Pro-Ser，该序列就成为第4个N-糖基化位点。这样一种变化通常可以每分子提供4个额外唾液酸。本领域技术人员将会认识到，本发明包括具有额外糖基化位点的许多其它人促红细胞生成素类似物。

本发明分析了分别增加1-3个额外糖基化位点的促红细胞生成素类似物中碳水化合物增加的情况。具体方法是，取红细胞生成素类似物的表达上清，用15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，转移到硝酸纤维素上(参见文献：Burnette等，Anal.Biochem.112：195-203，1981；Elliott等，Gen 79：167-180，1989)，用小鼠抗红细胞生成素单克隆抗体进行Western Blot分析。

分析了分别增加1-3个额外糖基化位点的促红细胞生成素类似物的等电点变化。分别用0.1M磷酸和0.1M氢氧化钠作为阳极电解液和阴极电解液，采用含有pH 2.5-5和pH 3-10两性电解质及7M尿素的10％聚丙烯酰胺凝胶，将按照上述培养和纯化方法得到的含各种促红细胞生成素类似物透析后，800V，50mA，30W电泳2小时。电泳结束后，转印至硝酸纤维素膜上，再与小鼠抗红细胞生成素单克隆抗体结合并用羊抗鼠酶标抗体标记，加入底物液显色。

本发明还提供测定上述促红细胞生成素类似物纯化物唾液酸含量的方法。方法简述，利用Bradford蛋白分析法(Bradford，Anal.biochem.72，248.(1976))确定各促红细胞生成素类似物纯化物的蛋白浓度并将其调整到0.2-0.4mg/ml。分别向样品和标准品中加入间苯二酚、硫酸铜、盐酸溶液，煮沸30分钟，加乙酸丁酯-丁醇溶液(4∶1)，充分混匀，静置分层后取有机相检测。在580nm波长测定吸光度。用唾液酸对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，由直线回归方程求出5μg唾液酸的吸光度。按照公式计算促红细胞生成素类似物纯化物唾液酸含量(mol/mol蛋白)＝(A₂×5×3.24×W×D)/(A₁×P×100)，A₁为5μg唾液酸的吸光度，A₂为促红细胞生成素类似物纯化物的吸光度，D为促红细胞生成素类似物纯化物的稀释倍数，P为促红细胞生成素类似物纯化物的蛋白含量(μg/μl)，W为1nmol促红细胞生成素类似物的量(不包括碳水化合物的量)，相当于18.2μg。

本发明还提供一种分离具有不同等电点范围的促红细胞生成素类似物异构体混合物(实施例10)的方法，简单描述，将含促红细胞生成素类似物的细胞培养液浓缩后上样于Q Sepharose Fast flow(GE)装填的柱上，加样后，用缓冲液冲洗柱子。之后用低pH值缓冲液淋洗柱子。最后通过用含有0-400mM NaCl的缓冲液分别将不同组分的红细胞生成素类似物异构体由柱上洗脱下来。

本发明还分析了上述促红细胞生成素类似物异构体混合物在体内刺激红细胞生成的作用变化。依据人红细胞生成素可刺激红细胞生成的作用，按照低、中、高三个剂量组，给小鼠(Balb/c)皮下注射EPO。由于人红细胞生成素(EPO)可促进骨髓中的网织红细胞的释放，使得小鼠血中的网织红细胞数与红细胞数的比值升高，且升高值与注射剂量呈线性关系。通过剂量-反应平行线法检测EPO体内生物学活性。将EPO生物标准品(该标准物来源于中国药品生物制品检定所，用于测定体内生物活性)稀释至浓度80IU/ml、40IU/ml和20IU/ml，促红细胞生成素类似物异构体混合物也分别稀释至接近上述三种浓度。将小鼠随机分为标准组和待检组。每一组设低、中、高三个剂量。按照低、中、高三个剂量组分别腹侧皮下注射小鼠。注射后的第四天于小鼠眼眶采血，用EDTA-K₂(含1％EDTA的生理盐水)抗凝管抗凝。取抗凝血在R-500分析仪(日本Sysmex公司)中自动计数红细胞总数、网织红细胞总数及网织红细胞数对红细胞总数的比值(Ret)。将Ret值输入计算机中，程序自动计算检测样品的生物学活性。这里所述的体内特异活性是相对体内特异活性的测量值，并不是绝对的体内特异活性测量值。特异活性仅用于比较异构体的相对活性，异构体的测定采用相同测量方法，采用相同条件，相同种类的动物，具有用于计算特异活性的相同数据分析，测定蛋白质含量的相同分析方法。

本发明还研究了上述促红细胞生成素类似物及其异构体给小鼠单剂量注射后网织红细胞含量随时间的变化。

注射促红细胞生成素类似物或其异构体后网织红细胞含量的变化测定方法：促红细胞生成素类似物或其异构体以5μg/kg的剂量皮下注射给Balb/c小鼠，并以相同剂量的重组人红细胞生成素为对照品，同时设溶剂对照组。注射后每24小时采血，用网织红细胞记数仪检测网织红细胞含量，检测网织红细胞含量随时间变化情况。

本发明还研究了上述促红细胞生成素类似物异构体在大鼠体内药代动力学以及小鼠血细胞比容增加情况。

药代动力学测定方法

挑选雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，静脉注射¹²⁵I标记的促红细胞生成素和实施例10中得到的促红细胞生成素类似物异构体混合物0.05μg/kg，按照设定的时间间隔(5分钟至10小时)眼眶静脉采血，收集血清，计算药代动力学参数。

促红细胞生成素类似物异构体对小鼠血细胞比容的影响

糖基化程度的增加，导致促红细胞生成素类似物在体内的消除半衰期延长，这为提高给药间隔成为可能。采用不同剂量的促红细胞生成素和实施例10中得到的异构体混合物，分别以每周一次和每周三次皮下注射给BALB/c，连续4周，监测血细胞比容的变化情况。

附图说明

图1显示了人促红细胞生成素氨基酸序列中共有3个天然糖基化位点，分别位于24、38和83位，并且标注了促使红细胞生成素产生额外糖基化位点的位置，分别位于2、3、4、28、30和88位。

图2显示了质粒构建方法。天然EPO cDNA片段通过定点突变几轮PCR后，将引物突变引入天然序列。回收得到突变的全长EPO，用BamHI酶消化，同时用BamHI酶消化真核表达载体pEC4，回收片段，用T4DNA连接酶连接BamHI酶切后的PCR产物和载体，室温5分钟，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑选阳性克隆，用酶消化方法鉴定克隆，并将正确的克隆测序，得到含突变克隆的载体pEC4 EPO。

图3显示了EPO及其类似物表达产物的分子量情况。泳道1为重组人EPO，泳道2-4为含有一个额外糖基化位点的EPO类似物，泳道5为含有二个额外糖基化位点的EPO类似物，泳道6为含三个额外糖基化位点的[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰]EPO，泳道7为突变体[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰Ala¹⁶⁴]EPO。结果显示，增加糖基化位点后，产物分子量都有所增加，并且分子量随糖基化位点的增多而增大。从具有一个额外糖基化位点[Asn²Gly³Thr⁴]EPO、[Asn³Phe⁴Ser⁵]EPO和[Val²Asn³Phe⁴Ser⁵]EPO来看，由于糖基化位点前一位氨基酸的不同，分子量增加有所不同，[Val²Asn³Phe⁴Ser⁵]EPO表达产物较[Asn²Gly³Thr⁴]EPO和[Asn³Phe⁴Ser⁵]EPO表达产物分子量大。突变体[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰Ala¹⁶⁴]EPO表达产物分子量与具有三个额外糖基化位点的[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰]EPO类似物分子量一致，说明非糖基化位点的突变表达产物没有额外糖链合成，对其分子量没有影响。

图4显示了促红细胞生成素类似物培养表达产物IEF免疫印迹分析结果。泳道8为重组人EPO，泳道1-3为含有一个额外糖基化位点的EPO类似物，泳道4-5为含有二个额外糖基化位点的EPO类似物，泳道6为含三个额外糖基化位点的[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰]EPO，泳道7为突变体[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰Ala¹⁶⁴]EPO。结果显示，表达产物酸性分子都有所增加，并且酸性分子随糖基化位点的增多而增多。从具有一个额外糖基化位点[Asn²Gly³Thr⁴]EPO、[Asn³Phe⁴Ser⁵]EPO和[Val²Asn³Phe⁴Ser⁵]EPO来看，由于糖基化位点的位置以及其位点前一位的氨基酸的不同，酸性分子增加比重有所不同，[Val²Asn³Phe⁴Ser⁵]EPO表达产物较[Asn²Gly³Thr⁴]EPO、[Asn³Phe⁴Ser⁵]EPO表达产物酸性分子多。突变体[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰Ala¹⁶⁴]EPO表达产物与[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰]EPO表达产物的酸性分子一致，说明非糖基化位点突变表达产物没有额外糖链合成，对其等电点没有影响。

图5显示了通过对含有不同额外N-糖基化位点的促红细胞生成素类似物的高异构体混合物的SDS电泳分析。说明了增加糖基化位点后，产物的分子量增大。额外增加三个糖基化位点的类似物分子量大于额外增加二个糖基化位点，额外增加二个糖基化位点的类似物分子量高于额外增加一个糖基化位点，并且一个额外糖基化位点[Val²Asn³Phe⁴Ser⁵]EPO产物分子量比同样具有一个额外糖基化位点[Asn²Gly³Thr⁴]EPO和[Asn³Phe⁴Ser⁵]EPO大。说明糖基化位点的前一位氨基酸对其具有一定的影响。[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰]EPO和[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰Ala¹⁶⁴]EPO分子量一致。说明[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰Ala¹⁶⁴]EPO在非糖基化位点的突变没有额外糖链合成，对其分子量没有影响。

图6显示了通过对含有不同额外N-糖基化位点的促红细胞生成素类似物的高异构体混合物的IEF电泳分析。说明了增加糖基化位点后，产物的酸性带增多。额外增加三个糖基化位点的类似物酸性碳水化合物多于额外增加二个糖基化位点，额外增加二个糖基化位点的类似物酸性碳水化合物多于额外增加一个糖基化位点，并且一个额外糖基化位点[Val²Asn³Phe⁴Ser⁵]EPO产物酸性带比同样具有一个额外糖基化位点[Asn²Gly³Thr⁴]EPO和[Asn³Phe⁴Ser⁵]EPO增多。说明糖基化位点的前一位氨基酸对其具有一定的影响。[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰]EPO和[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Glv⁸⁹Ser⁹⁰Ala¹⁶⁴]EPO酸性带一致。说明[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰Ala¹⁶⁴]EPO非糖基化位点突变表达产物没有额外糖链合成，对其等电点没有影响。

图7显示不同突变点的促红细胞生成素类似物单剂量注射小鼠后，体内网织红细胞随时间的变化。在此项研究中，将红细胞生成素类似物的纯化物，以5μg/kg皮下注射给体重为20±2的雌性BALB/c小鼠，并以相同剂量的重组人红细胞生成素为对照品，同时设溶剂对照组。注射后每24小时采血，用网织红细胞记数仪检测网织红细胞含量，考察网织红细胞含量随时间变化情况。结果显示，随额外糖基化位点增加，促红细胞生成素类似物在小鼠体内的作用时间延长，并且时间的延长与糖基化位点的增多正相关，类似物在小鼠体内的作用强度(以曲线下面积计)增强。并且作用时间和强度受到糖基化位点前一位氨基酸的影响。

图8分别显示了用实施例10所述方法制备[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰]EPO类似物异构体并集液的IEF图谱。泳道1为天然EPO，泳道2-5分别为异构体1-5、2-6、3-6、4-8。结果显示随着异构体并集液IEF中酸性条带的增多，体内活性增高。说明额外的糖基化增加了分子中的酸性碳水化合物，这种分子结构的变化导致体内活性升高。

图9显示了红细胞生成素和用实施例10所述方法制备[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰]EPO异构体3-6的混合物给小鼠注射后网织红细胞随时间的变化曲线。将促红细胞生成素异构体3-6混合物，以5μg/kg皮下注射给体重为20±2的雌性Balb/c小鼠，并以相同剂量的重组人红细胞生成素为对照品，同时设溶剂对照组。注射后每24小时采血，用网织红细胞记数仪检测网织红细胞含量，考察网织红细胞含量随时间变化情况。结果显示，红细胞生成素组于用药后第二天RET％开始升高，第4天达高峰，持续约4天；红细胞生成素类似物组RET％也于第二天开始升高，第6天达高峰，持续约7天。由此可见，与重组人红细胞生成素相比异构体3-6混合物在小鼠体内的作用时间明显延长，作用强度(以曲线下面积计)增强。

图10显示了红细胞生成素和[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰]EPO异构体3-6的混合物静脉注射大鼠血药浓度随时间变化曲线，选雄性SD大鼠(SpragueDawley)10～11周，体重300±20g，6只/组。静脉注射¹²⁵I标记的促红细胞生成素和红细胞生成素类似物异构体3-6混合物，每只鼠1μci¹²⁵I标记的促红素或类似物异构体，按照设定的时间间隔(5分钟至10小时)眼眶静脉采血，收集血清。取0.1ml血清加入0.9ml冷无水乙醇(-20℃)，置4℃培养过夜，12000rpm离心15分钟，用咖吗检测仪检测，计算药代动力学参数。与促红细胞生成素相比，异构体3-6混合物体内清除速度明显降低，导致体内消除半衰期延长，二者的静脉注射大鼠后半衰期分别为8.5h和2.6h，促红细胞生成素类似物的消除半衰期是促红细胞生成素的3.3倍。

图11和图12是小鼠注射红细胞生成素和[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰]EPO异构体3-6的混合物后血细胞比容随时间变化情况。实验动物为雌性BALB/c小鼠，清洁级，雌雄各半，8周龄，体重18～22g，按照随机分组的原则分组，每组10只，采用不同剂量的促红细胞生成素和红细胞生成素类似物异构体3-6混合物，分别以每周一次和每周三次皮下注射给BALB/c，对照组注射相同体积的溶剂，连续4周。监测血细胞比容的变化情况，2次/周，给药当天为第1天(1d)，分别于1周内的第4天(4d)和7天(7d)用肝素化处理的毛细管取血，封口，采用离心法检测血细胞比容。结果显示，在每周一次和每周三次给药后，异构体3-6混合物对小鼠血细胞比容的升高作用明显增强，提示临床应用促红细胞生成素类似物可以纠正贫血，每周一次注射，可达到预期的治疗效果。

实施例

通过下列实施例更详细地说明本发明，但这些实施例不应误认为是限制本发明的范围。实施例中所用的促红细胞生成素标准物是重组人红细胞生成素标准物，该标准物来源于中国药品生物制品检定所，用于测定体内生物活性。

实施例1：人促红细胞生成素类似物DNA片段的构建

人促红细胞生成素氨基酸序列中共有3个天然N-糖基化位点，分别位于24、38和83位，促使红细胞生成素产生额外糖基化位点的位置可以是2、3、4、28、30、88(见图1)。

对以上位点进行突变组之间的组合，如构建[Asn²Gly³Thr⁴]、[Asn²⁸Thr³⁰]、[Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰]的组合，加入2、28、88三个位置的N-糖基化位点，并通过改变中间一位或糖基化位点前一位的氨基酸序列增强该位置的糖基化。

额外添加N-糖基化位点突变部分的引物参见SEQ ID NOS：2-85。利用这些引物，以促红细胞生成素DNA为模板进行多聚酶链式反应(PCR)即可获得突变后的促红细胞生成素类似物DNA片段。模板DNA来源于天然EPO cDNA文库。文库的构建简述如下，利用Trizol从胎肝组织中提取总RNA，应用Oligo(dT)Cellulose(Cat.No.15940-026，Lifetechnologies，USA)，按厂家提供的方法，提取PolyA+RNA，之后应用cDNA合成试剂盒(ZAP-cDNA

Synthesis Kit，Cat.No.200400-200402，Stratagene，USA)合成人胎肝双链cDNA，根据US Pat.4703008设计引物从上述cDNA文库中钓取天然促红细胞生成素DNA片段。

以上述EPO DNA片段为模板，设计SEQ ID NOS：86-93的引物：

3’端：2-4位由PPR改为NST

引物1：SEQ ID NO：86

5’端2-4位引物

引物2：SEQ ID NO：87

3’端30-32位由AEH改为NRS

引物3：SEQ ID NO：88

5’端30-32位引物

引物4：SEQ ID NO：89

3’端87-90位由PWEP改为VNIS

引物5：SEQ ID NO：90

5’端87-90位引物

引物6：SEQ ID NO：91

设计EPO两端引物用于PCR

5’端加BamHI位点，及GCCACC

引物7：SEQ ID NO：92

3’端引物，加BamHI位点

引物8：SEQ ID NO：93

用SEQ ID NO：86+92、87+88、89+90、91+93进行第一轮PCR(PCR仪为ABI 2700，试剂为Invitrogen公司的Supermix^TM)，条件为95℃5min，(95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s)×30循环，72℃ 7min。所得的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，利用制造厂家(Omiga公司)提供的eZNA^TM凝胶回收试剂盒及方法回收片段。再分别以SEQ ID NO：86+92与87+88、89+90、91+93为模板，SEQ ID NO：88+92、89+93为引物，进行第二轮PCR，条件同前，回收片段。接着以SEQ ID NO：92+88和SEQ ID NO：89+93为模板，SEQ ID NO：92+93为引物，用相同的PCR条件得到突变的全长EPO。回收片段，用BamHI(Invitrogen)酶消化，同时用BamHI酶消化真核表达载体pEC4，回收片段，用T4DNA连接酶(Invitrogen)连接BamHI酶切后的PCR产物和载体，室温5分钟，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑选阳性克隆，用酶消化方法鉴定克隆，并将正确的克隆测序，得到含突变克隆的载体pEC4 EPO。表达载体pEC4是将小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因片段导入pcDNA3.1(Invitrogen)形成的，小鼠DHFR基因片段是依据GenebankNucleotide AH001899公布的序列合成的。上述方法概述于图2。

用上述方法构建促红细胞生成素类似物。表1中给出了部分类似物的DNA序列变化，否则就是用于突变的寡核苷酸引物的序列与人促红细胞生成素的序列互补。

表1：部分具有N-糖基化位点的促红细胞生成素类似物

编号氨基酸置换顺序变化

N1 Asn²Gly³Thr⁴ CCA CCA CGC→AAT GGC ACT

N2 Asn³Phe⁴Ser⁵ CCA CGC CTC→AAT TTC TCC

N3 Val²Asn³Phe⁴Ser⁵ CCA CCA CGC CTC→GTC AAT TTC TCC

N4 Asn⁴Lys⁵Thr⁶ CGC CTC ATC→AAT AAG ACT

N5 Asn²⁸Thr³⁰ GGC→AAT，GCT→ACT

N6 Asn²⁸Ser³⁰ GGC→AAT，GCT→TCC

N7 Asn³⁰Thr³¹Ser³² GCT GAA CAC→AAT ACT TCC

N8 Asn³⁰Gly³¹Ser³² GCT GAA CAC→AAT GGC TCC

N9 Asn³⁰Lys³¹Ser³² GCT GAA CAC→AAT AAG TCC

N10 Asn³⁰Ile³¹Ser³² GCT GAA CAC→AAT ATC TCC

N11 Asn³⁰Asp³¹Ser³² GCT GAA CAC→AAT GAC TCC

N12 Val⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰ CCG TGG GAG CCC→GTC AAT GGC TCC

N13 Val⁸⁷Asn⁸⁸Ser⁸⁹Ser⁹⁰ CCG TGG GAG CCC→GTC AAT TCC TCC

N14 Val⁸⁷Asn⁸⁸Ile⁸⁹Ser⁹⁰ CCG TGG GAG CCC→GTC AAT ATC TCC

N15 Val⁸⁷Asn⁸⁸Asp⁸⁹Ser⁹⁰ CCG TGG GAG CCC→GTC AAT GAC TCC

N16 Val⁸⁷Asn⁸⁸Ile⁸⁹Ser⁹⁰ CCG TGG GAG CCC→GTC AAT ATC TCC

N17 Val⁸⁷Asn⁸⁸Lys⁸⁹Ser⁹⁰ CCG TGG GAG CCC→GTC AAT AAG TCC

N18 Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰ CCG TGG GAG CCC→TCC AAT GGC TCC

N19 Ser⁸⁷Asn⁸⁸Lys⁸⁹Ser⁹⁰ CCG TGG GAG CCC→TCC AAT AAG TCC

N20 Ser⁸⁷Asn⁸⁸Asn⁸⁹Ser⁹⁰ CCG TGG GAG CCC→TCC AAT AAT TCC

N21 Ser⁸⁷Asn⁸⁸Phe⁸⁹Ser⁹⁰ CCG TGG GAG CCC→TCC AAT TTC TCC

N22 Ser⁸⁷Asn⁸⁸Asp⁸⁹Ser⁹⁰ CCG TGG GAG CCC→TCC AAT GAC TCC

N23 Ser⁸⁷Asn⁸⁸His⁸⁹Ser⁹⁰ CCG TGG GAG CCC→TCC AAT CAC TCC

N24 Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Lys⁸⁹Ser⁹⁰ N5+N19

N25 Asn²⁸Ser³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Asn⁸⁹Ser⁹⁰ N6+N20

N26 Asn²⁸Thr³⁰Val⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰ N5+N12

N27 Asn²⁸Ser³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Asp⁸⁹Ser⁹⁰ N6+N22

N28 Asn²⁸Thr³⁰Val⁸⁷Asn⁸⁸Asp⁸⁹Ser⁹⁰ N5+N15

N29 Asn³⁰Thr³¹Ser³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Ser⁸⁹Ser⁹⁰ N7+N13

N30 Asn³⁰Lys³¹Ser³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Ile⁸⁹Ser⁹⁰ N9+N16

N31 Asn³⁰Ile³¹Ser³²Ser⁸⁷Asn⁸⁸Asn⁸⁹Ser⁹⁰ N10+N20

N32 Asn³⁰Asp³¹Ser³²Ser⁸⁷Asn⁸⁸Asp⁸⁹Ser⁹⁰ N11+N22

N33 Asn³⁰Thr³¹Ser³²Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰ N7+N18

N34 Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰ N5+N18

N35 Asn³⁰Gly³¹Ser³²Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰ N8+N18

N36 Asn³⁰Thr³¹Ser³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Ser⁸⁹Ser⁹⁰ N7+N13

N37 Asn²⁸Ser³⁰Val⁸⁷Asn⁸⁸Ser⁸⁹Ser⁹⁰ N6+N13

N38 Asn³⁰Gly³¹Ser³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Ser⁸⁹Ser⁹⁰ N8+N13

N39 Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Ser³⁰ N1+N6

N40 Asn⁴Gly⁵Ser⁶

N41 Asn³Phe⁴Ser⁵Asn³⁰Ile³¹Ser³² N2+N10

N42 Asn⁴Lys⁵Thr⁶Asn³⁰Gly³¹Ser³² N4+N8

N43 Asn²Gly³Thr⁴Asn³⁰Thr³¹Ser³² N1+N7

N44 Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰ N1+N34

N45 Asn³Phe⁴Ser⁵Asn²⁸Thr³⁰Val⁸⁷Asn⁸⁸Ser⁸⁹Ser⁹⁰ N2+N5+N13

N46 Asn⁴Lys⁵Thr⁶Asn²⁸Thr³⁰Val⁸⁷Asn⁸⁸Asp⁸⁹Ser⁹⁰ N4+N28

N47 Asn²Gly³Thr⁴Asn³⁰Lys³¹Ser³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Ile⁸⁹Ser⁹⁰ N1+N30

N48 Asn³Phe⁴Ser⁵Asn³⁰Ile³¹Ser³²Ser⁸⁷Asn⁸⁸Asn⁸⁹Ser⁹⁰ N2+N31

N49 Asn⁴Lys⁵Thr⁶Asn³⁰Asp³¹Ser³²Ser⁸⁷Asn⁸⁸Asp⁸⁹Ser⁹⁰ N4+N32

N50 Asn⁴Gly⁵Ser⁶Asn³⁰Gly³¹Ser³² N8+N40

N51 Asn³Gly⁴Thr⁵Asn³⁰Gly³¹Ser³²Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰

N52 Asn⁴Gly⁵Thr⁶Asn³⁰Lys³¹Ser³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Ile⁸⁹Ser⁹⁰

N53 Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Ser³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Asp⁸⁹Ser⁹⁰ N1+N27

N54 Asn³Gly⁴Thr⁵Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Lys⁸⁹Ser⁹⁰

N55 Asn⁴Gly⁵Thr⁶Asn²⁸Ser³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Asn⁸⁹Ser⁹⁰

N56 Asn⁴Gly⁵Thr⁶Asn³⁰Thr³¹Ser³²Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰

N57 Asn²Gly³Thr⁴Asn³⁰Thr³¹Ser³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Ser⁸⁹Ser⁹⁰ N1+N29

N58 Asn³Gly⁴Thr⁵Asn²⁸Ser³⁰Val⁸⁷Asn⁸⁸Ser⁸⁹Ser⁹⁰

N59 Asn⁴Gly⁵Thr⁶Asn³⁰Gly³¹Ser³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Ser⁸⁹Ser⁹⁰

N60 Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰Ala¹⁶⁴

将上述克隆载体编号命名为pEC4-X(X为类似物编号)。

实施例2：Asn²Gly³Thr⁴EPO的制备

A.工程细胞的构建、筛选和培养

按照实施例1的方法构建的质粒pEC4-N1转染CHO细胞，宿主细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，为二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO dhfr-)。将此细胞培养于100mm培养皿中，待细胞长至60～95％满时，以无血清培养基淋洗细胞，加入5ml无血清培养基、10μg pEC4-N1、60μg lipofectamine组成的转染混合液，37℃培养4小时，吸出培养基，加入含5％胎牛血清的MEM培养基，37℃培养过夜。随后在培养基中加入MTX，继续培养10-14天至抗性克隆出现。以胰酶消化抗性克隆培养出的细胞，增加MTX浓度，筛选抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞能够表达人红细胞生成素类似物N1。将表达人红细胞生成素类似物N1的细胞扩增、培养，收集培养液，进行纯化。

B.Asn²Gly³Thr⁴EPO的纯化

用由离子交换色谱、反向色谱和凝胶过滤色谱组成的三步法纯化EPO类似物N1。

详细的过程如下：

1.收集表达EPO类似物N1的CHO细胞条件培养基，用带有5k分子截留量的超滤膜将其浓缩15倍后，将缓冲液置换为10mM Tris-HClpH7.0。

2.将浓缩后的溶液以0.5cm/分的流速加到Q Sepharose Fast flow柱上，该柱事先用10mM Tris-HCl pH7.0平衡过。

3.加样结束后，用5个柱体积的10mM Tris-HCl pH7.0洗柱，并用由40mM乙酸，1mM甘氨酸，6M尿素组成的溶液冲洗柱床，随后以10mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH7.0将Asn²Gly³Thr⁴EPO由柱上洗脱下来。

4.将收集到的Asn²Gly³Thr⁴EPO组分以3cm/分的流速加到VydacC₄反相树脂柱上，该柱已经用20％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0平衡过。用20％-95％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0逐步展开洗脱。经50-75％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0洗脱的组分，按照1∶2.5用10mM Tris-HClpH7.0，稀释后，使用pall nanosep 10K omega微浓缩器浓缩20倍，并置换缓冲液为10mM Tris-HCl pH7.0。

5.将浓缩液在以用20mM柠檬酸缓冲液pH6.8平衡过的S-200柱上进行纯化，收集相应的单体类似物峰。

实施例3：Asn³Phe⁴Ser⁵EPO的制备

A.工程细胞的构建、筛选和培养

按照实施例1的方法构建的质粒pEC4-N2转染CHO细胞，宿主细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，为二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO dhfr-)。将此细胞培养于100mm培养皿中，待细胞长至60～95％满时，以无血清培养基淋洗细胞，加入5ml无血清培养基、10μg pEC4-N2、60μg lipoFectamin组成的转染混合液，37℃培养4小时，吸出培养基，加入含5％胎牛血清的MEM培养基，37℃培养过夜。随后在培养基中加入MTX，继续培养10-14天至抗性克隆出现。以胰酶消化抗性克隆培养出的细胞，增加MTX浓度，筛选抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞能够表达人红细胞生成素类似物N2。将表达人红细胞生成素类似物N2的细胞扩增、培养，收集培养液，进行纯化。

B.Asn³Phe⁴Ser⁵EPO的纯化

用由离子交换色谱、反向色谱和凝胶过滤色谱组成的三步法纯化EPO类似物N2。

详细的过程如下：

1.收集表达EPO类似物N2的CHO细胞条件培养基，用带有5k分子截留量的超滤膜将其浓缩15倍后，将缓冲液置换为10mM Tris-HClpH7.0。

3.加样结束后，用5个柱体积的10mM Tris-HCl pH7.0洗柱，并用由40mM乙酸，1mM甘氨酸，6M尿素组成的溶液冲洗柱床，随后以10mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH7.0将EPO类似物N2由柱上洗脱下来。

4.将收集到的EPO类似物N2组分以3cm/分的流速加到Vydac C₄反相树脂柱上，该柱已经用20％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0平衡过。用20％-95％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0逐步展开洗脱。经50-75％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0洗脱的组分，按照1∶2.5用10mM Tris-HClpH7.0，稀释后，使用pall nanosep 10K omega微浓缩器浓缩20倍，并置换缓冲液为10mM Tris-HCl pH7.0。

实施例4：Val²Asn³Phe⁴Ser⁵EPO的制备

A.工程细胞的构建、筛选和培养

按照实施例1的方法构建的质粒pEC4-N3转染CHO细胞，宿主细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，为二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO dhfr-)。将此细胞培养于100mm培养皿中，待细胞长至60～95％满时，以无血清培养基淋洗细胞，加入5ml无血清培养基、10μg pEC4-N3、60μg lipoFectamin组成的转染混合液，37℃培养4小时，吸出培养基，加入含5％胎牛血清的MEM培养基，37℃培养过夜。随后在培养基中加入MTX，继续培养10-14天至抗性克隆出现。以胰酶消化抗性克隆培养出的细胞，增加MTX浓度，筛选抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞能够表达人红细胞生成素类似物N3。将表达人红细胞生成素类似物N3的细胞扩增、培养，收集培养液，进行纯化。

B.Val²Asn³Phe⁴Ser⁵EPO的纯化

用由离子交换色谱、反向色谱和凝胶过滤色谱组成的三步法纯化EPO类似物N3。

详细的过程如下：

1.收集表达EPO类似物N3的CHO细胞条件培养基，用带有5k分子截留量的超滤膜将其浓缩15倍后，将缓冲液置换为10mM Tris-HClpH7.0。

3.加样结束后，用5个柱体积的10mM Tris-HCl pH7.0洗柱，并用由40mM乙酸，1mM甘氨酸，6M尿素组成的溶液冲洗柱床，随后以10mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH7.0将EPO类似物N3由柱上洗脱下来。

4.将收集到的类似物N3组分以3cm/分的流速加到Vydac C₄反相树脂柱上，该柱已经用20％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0平衡过。用20％-95％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0逐步展开洗脱。经50-75％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0洗脱的组分，按照1∶2.5用10mM Tris-HClpH7.0，稀释后，使用pall nanosep 10K omega微浓缩器浓缩20倍，并置换缓冲液为10mM Tris-HCl pH7.0。

实施例5：Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰EPO的制备

A.工程细胞的构建、筛选和培养

按照实施例1的方法构建的质粒pEC4-N34转染CHO细胞，宿主细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，为二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO dhfr-)。将此细胞培养于100mm培养皿中，待细胞长至60～95％满时，以无血清培养基淋洗细胞，加入5ml无血清培养基、10μg pEC4-N34、60μg lipoFectamin组成的转染混合液，37℃培养4小时，吸出培养基，加入含5％胎牛血清的MEM培养基，37℃培养过夜。随后在培养基中加入MTX，继续培养10-14天至抗性克隆出现。以胰酶消化抗性克隆培养出的细胞，增加MTX浓度，筛选抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞能够表达人红细胞生成素类似物N34。将表达人红细胞生成素类似物N34的细胞扩增、培养，收集培养液，进行纯化。

B.Asn²⁸Thr³⁰Serw⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰EPO的纯化

用由离子交换色谱、反向色谱和凝胶过滤色谱组成的三步法纯化EPO类似物N34。

详细的过程如下：

1.收集表达EPO类似物N34的CHO细胞条件培养基，用带有5k分子截留量的超滤膜将其浓缩15倍后，将缓冲液置换为10mM Tris-HClpH7.0。

3.加样结束后，用5个柱体积的10mM Tris-HCl pH7.0洗柱，并用由40mM乙酸，1mM甘氨酸，6M尿素组成的溶液冲洗柱床，随后以10mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH7.0将Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰EPO由柱上洗脱下来。

4.将收集到的Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰EPO组分以3cm/分的流速加到Vydac C₄反相树脂柱上，该柱已经用20％乙醇/10mMTris-HCl，pH7.0平衡过。用20％-95％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0逐步展开洗脱。经50-75％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0洗脱的组分，按照1∶2.5用10mM Tris-HCl pH7.0，稀释后，使用pall nanosep 10K omega微浓缩器浓缩20倍，并置换缓冲液为10mM Tris-HCl pH7.0。

实施例6：Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰EPO的制备

A.工程细胞的构建、筛选和培养

按照实施例1的方法构建的质粒pEC4-N44转染CHO细胞，宿主细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，为二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO dhfr-)。将此细胞培养于100mm培养皿中，待细胞长至60～95％满时，以无血清培养基淋洗细胞，加入5ml无血清培养基、10μg pEC4-N44、60μg lipoFectamin组成的转染混合液，37℃培养4小时，吸出培养基，加入含5％胎牛血清的MEM培养基，37℃培养过夜。随后在培养基中加入MTX，继续培养10-14天至抗性克隆出现。以胰酶消化抗性克隆培养出的细胞，增加MTX浓度，筛选抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞能够表达人红细胞生成素类似物N44。将表达人红细胞生成素类似物N44的细胞扩增、培养，收集培养液，进行纯化。

B.Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰EPO的纯化

用由离子交换色谱、反向色谱和凝胶过滤色谱组成的三步法纯化EPO类似物N44。

详细的过程如下：

1.收集表达EPO类似物N44的CHO细胞条件培养基，用带有5k分子截留量的超滤膜将其浓缩15倍后，将缓冲液置换为10mM Tris-HClpH7.0。

3.加样结束后，用5个柱体积的10mM Tris-HCl pH7.0洗柱，并用由40mM乙酸，1mM甘氨酸，6M尿素组成的溶液冲洗柱床，随后以10mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH7.0将Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰EPO由柱上洗脱下来。

4.将收集到的Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰EPO组分以3cm/分的流速加到Vydac C₄反相树脂柱上，该柱已经用20％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0平衡过。用20％-95％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0逐步展开洗脱。经50-75％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0洗脱的组分，按照1∶2.5用10mM Tris-HCl pH7.0，稀释后，使用pall nanosep 10Komega微浓缩器浓缩20倍，并置换缓冲液为10mM Tris-HCl pH7.0。

实施例7：Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰Ala¹⁶⁴EPO的制备

A.工程细胞的构建、筛选和培养

按照实施例1的方法构建的质粒pEC4-N60转染CHO细胞，宿主细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，为二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO dhfr-)。将此细胞培养于100mm培养皿中，待细胞长至60～95％满时，以无血清培养基淋洗细胞，加入5ml无血清培养基、10μg pEC4-N60、60μg lipoFectamin组成的转染混合液，37℃培养4小时，吸出培养基，加入含5％胎牛血清的MEM培养基，37℃培养过夜。随后在培养基中加入MTX，继续培养10-14天至抗性克隆出现。以胰酶消化抗性克隆培养出的细胞，增加MTX浓度，筛选抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞能够表达人红细胞生成素类似物N60。将表达人红细胞生成素类似物N60的细胞扩增、培养，收集培养液，进行纯化。

B.Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰Ala¹⁶⁴EPO的纯化

用由离子交换色谱、反向色谱和凝胶过滤色谱组成的三步法纯化EPO类似物N60。

详细的过程如下：

1.收集表达EPO类似物N60的CHO细胞条件培养基，用带有5k分子截留量的超滤膜将其浓缩15倍后，将缓冲液置换为10mM Tris-HClpH7.0。

3.加样结束后，用5个柱体积的10mM Tris-HCl pH7.0洗柱，并用由40mM乙酸，1mM甘氨酸，6M尿素组成的溶液冲洗柱床，随后以10mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH7.0将EPO类似物N60由柱上洗脱下来。

4.将收集到的EPO类似物N60组分以3cm/分的流速加到VydacC4反相树脂柱上，该柱已经用20％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0平衡过。用20％-95％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0逐步展开洗脱。经50-75％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0洗脱的组分，按照1∶2.5用10mM Tris-HClpH7.0，稀释后，使用pall nanosep 10K omega微浓缩器浓缩20倍，并置换缓冲液为10mM Tris-HCl pH7.0。

实施例8：促红细胞生成素类似物的测定

A.促红细胞生成素类似物培养表达产物SDS-PAGE免疫印迹分析

按照实施例2-7A所述方法得到的含各表达产物的培养液5ml，使用pall nanosep 10K omega微浓缩器分别浓缩至20μl。用15％聚丙烯酰胺凝胶在0.375M Tris-HCl，0.1％SDS，pH8.8电解液中垂直板电泳2.5小时。电泳结束后，切一块与凝胶一样大小的硝酸纤维素膜和12张Whatman 3MM转移滤纸，将其用转移液浸润后，在MultiphorElectrophoresis System上以0.8mA/cm²半干转移2个小时，转移结束后用含10％牛血清白蛋白的PBST溶液封闭膜1小时，再加入小鼠抗红细胞生成素单克隆抗体孵育2小时，最后再用羊抗鼠酶标抗体孵育1小时，PBST清洗3次后，最终用含DAB的底物液显色。如图3所示泳道1-7分别为正常EPO和含有一个、二个、三个额外糖基化位点的EPO类似物，结果显示，增加糖基化位点后，产物分子量增加，并且分子量随糖基化位点的增多而增大。

B.促红细胞生成素类似物培养表达产物IEF免疫印迹分析

按照实施例2-7A所述方法得到的含各表达产物的培养液6ml，经过分子截留量5k透析膜纯水过夜透析18小时后，使用pall nanosep 10Komega微浓缩器至分别浓缩至20μl。分别用0.1M磷酸和0.1M氢氧化钠作为阳极电解液和阴极电解液，将含有pH3-10和pH2.5-5两性电解质及7M尿素的10％聚丙烯酰胺凝胶15ml，灌入垂直板电泳槽中待胶凝聚后，600V，50mA，30W预电泳30分钟，将透析后样品和样品缓冲液1∶1混合并加入凝胶样品槽内，800V，50mA，30W电泳2小时。电泳结束后，按照实施例8A所述方法进行免疫印迹分析。如图4所示，泳道8为正常EPO，泳道1-7分别是含有一个、二个、三个额外糖基化位点的EPO类似物，结果显示，增加糖基化位点后，产物的酸性带增多。

C.促红细胞生成素类似物纯化产物SDS-PAGE分析

按照实施例2-7B所述方法得到的经纯化的促红细胞生成素类似物40μl。用15％聚丙烯酰胺凝胶在0.375M Tris-HCl，0.1％SDS，pH8.8电解液中垂直板电泳2.5小时。电泳结束后进行考马斯亮兰染色。如图5所示泳道1-7分别为正常EPO和含有一个、二个、三个额外糖基化位点的EPO类似物，结果显示，增加糖基化位点后，产物分子量增加，正是有额外的糖基化产生，并且分子量随糖基化位点的增多而增大，说明糖基化量递增。

D.促红细胞生成素类似物纯化产物IEF分析

按照实施例2-7B所述方法得到的经纯化的促红细胞生成素类似物100μl，经过分子截留量5k透析膜纯水过夜透析18小时。分别用0.1M磷酸和0.1M氢氧化钠作为阳极电解液和阴极电解液，将含有pH3-10和pH2.5-5两性电解质及7M尿素的10％聚丙烯酰胺凝胶15ml，灌入垂直板电泳槽中待胶凝聚后，600V，50mA，30W预电泳30分钟，将透析后样品和样品缓冲液1∶1混合并加入凝胶样品槽内，800V，50mA，30W电泳2小时。电泳结束后进行考马斯亮兰染色。如图6所示泳道1-7分别为正常EPO和含有一个、二个、三个额外糖基化位点的EPO类似物纯化物，结果显示，随着糖基化位点的增多，产物的酸性带增多，说明分子中增加了额外的酸性碳水化合物，并且增加的数量随糖基化位点的增多而增多。

E.促红细胞生成素类似物纯化产物中唾液酸含量分析

以每摩尔促红细胞生成素类似物的唾液酸摩尔数表示。首先用纯化水将按照实施例2-7B所述得到的各促红细胞生成素类似物纯化产物蛋白浓度稀释到0.2-0.4mg/ml。为了确定所存在的促红细胞生成素类似物纯化物蛋白量，使用Bio-Rad提供的分析试剂和微量法步骤，以具有人红细胞生成素氨基酸序列的重组红细胞生成素作为标准，进行Bradford蛋白分析(Bradford，Anal，biochem.72，248.(1976))。然后按照表2取唾液酸工作标准液、纯化水及促红细胞生成素类似物纯化物溶液。分别加入10ml玻璃试管中，混匀，每管中加入含0.2％间苯二酚，250μM硫酸铜，20％盐酸溶液1ml，加盖，沸水煮沸30分钟，取出冰浴3分钟后，每管加乙酸丁酯-丁醇溶液(4∶1)2ml，充分混匀，室温放置10分钟。在580nm波长测定吸光度。用唾液酸对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，由直线回归方程求出5μg唾液酸的吸光度。按照公式计算促红细胞生成素类似物纯化物唾液酸含量(mol/mol蛋白)＝(A₂×5×3.24×W×D)/(A₁×P×100)，A₁为5μg唾液酸的吸光度，A₂为促红细胞生成素类似物纯化物的吸光度，D为促红细胞生成素类似物纯化物的稀释倍数，P为促红细胞生成素类似物纯化物蛋白含量(μg/μl)，W为1nmol促红细胞生成素类似物纯化物的量(不包括碳水化合物的量)，相当于18.2μg。其结果示于表3。

表2

表3

促红细胞生成素类似物	唾液酸的摩尔数/红细胞生成素的摩尔数
		[Asn²Gly³Thr⁴]EPO	10.8±0.5
[Asn³Phe⁴Ser⁵]EPO	10.8±0.3
		[Val²Asn³Phe⁴Ser⁵]EPO	11.5±0.4
[Asn²⁸Ser³⁰Asn⁸⁸Ser⁹⁰]EPO	12.8±0.4
		[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰]EPO	13.6±0.4
[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰Ala¹⁶⁴]EPO	13.7±0.6

实施例9：促红细胞生成素类似物单剂量注射小鼠后，体内网织红细胞随时间的变化

按照实施例2-7B所述方法得到的经纯化的促红细胞生成素类似物，以5μg/kg皮下注射给体重为20±2的雌性Balb/c小鼠，并以相同剂量的重组人红细胞生成素为对照品，同时设溶剂对照组。注射后每24小时采血，用网织红细胞记数仪检测网织红细胞含量，检测网织红细胞含量随时间变化情况，图7是促红细胞类似物给小鼠注射后网织红细胞随时间的变化曲线。结果显示，随额外糖基化位点增加，促红细胞生成素类似物在小鼠体内的作用时间延长，并且时间的延长与糖基化位点的增多正相关，类似物在小鼠体内的作用强度(以曲线下面积计)增强。并且作用时间和强度受到糖基化位点前一位氨基酸的影响。

实施例10：Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰EPO异构体的获得

按照实施例6A提供的方法得到的含有Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰EPO的培养液用由离子交换色谱、反相色谱和凝胶过滤色谱组成的三步法纯化并分离出Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰EPO的不同异构体组分。

详细的过程如下：

1.收集表达Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰EPO类似物的CHO细胞条件培养基，用带有5k分子截留量的超滤膜将其浓缩15倍后，将缓冲液置换为10mM Tris-HCl pH7.0。

3.加样结束后，分别用5个体积的10mM Tris-HCl，pH7.0和由40mM乙酸，1mM甘氨酸，6M尿素组成的溶液冲洗柱床，并用0-0.4MNaCl/10mM Tris-HCl，pH7.0梯度洗脱15个柱体积，以1.5个柱体积为一个组分进行收集。

4.从每个组分中取样按照实施例8D所述方法进行IEF分析，收集4个主要组分，分别含异构体1-5、2-6、3-6、4-8的并集液。

5.将异构体3-6并集液以3cm/分的流速加到Vydac C₄反相树脂柱上，该柱已经用20％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0平衡过。用20％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0和95％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0逐步展开洗脱。经50-75％乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0洗脱的组分，按照1∶2.5用pH7.010mM Tris-HCl稀释后，使用pall nanosep 10K omega微浓缩器浓缩20倍。

6.将浓缩液在以用20mM柠檬酸缓冲液，pH 7.0平衡过的S-200柱上进行纯化，收集相应的类似物异构体3-6。

实施例11 Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰EPO异构体的生物学性质

A.促红细胞生成素类似物异构体IEF分析

按照实施例10所述方法得到促红细胞生成素类似物异构体组分各100μl，经过分子截留量5k透析膜纯水过夜透析18小时。分别用0.1M磷酸和0.1M氢氧化钠作为阳极电解液和阴极电解液，将含有pH3-10两性电解质和7M尿素的10％聚丙烯酰胺凝胶15ml，灌入垂直板电泳槽中待胶凝聚后，600V，50mA，30W预电泳30分钟，将透析后样品和样品缓冲液1∶1混合并加入凝胶样品槽内，800V，50mA，30W电泳2小时。电泳结束后进行考马斯亮兰染色。如图8所示泳道1-5分别为正常EPO和含异构体1-5、2-6、3-6、4-8的并集液，结果显示随着盐浓度的增加获得了一系列酸性碳水化合物含量递增的异构体组分。

B.促红细胞生成素类似物异构体体内活性的测定

本法依据人红细胞生成素可刺激红细胞生成的作用，按照低、中、高三个剂量组，给小鼠(BALB/C)皮下注射EPO。由于人红细胞生成素(EPO)可促进骨髓中的网织红细胞的释放，使得小鼠血中的网织红细胞数与红细胞数的比值升高，且升高值与注射剂量呈线性关系。通过剂量-反应平行线法检测EPO体内生物学活性。用含0.1％牛血清白蛋白生理氯化钠稀释液，将EPO生物标准品(该标准物来源于中国药品生物制品检定所，用于测定体内生物活性)用于测定体内生物活性)稀释至浓度80IU/ml、40IU/ml和20IU/ml，促红细胞生成素类似物异构体混合物也分别稀释至接近上述三种浓度。将小鼠随机分组，每组18只，分为标准组和待检组。每一组设低、中、高三个剂量，每个剂量组为6只小鼠，用苦味酸做好标记。按照低、中、高三个剂量组分别腹侧皮下注射小鼠。每只小鼠的注射体积为0.5ml。在注射后的第四天于小鼠眼眶采血，用EDTA-K₂(含1％EDTA的生理盐水)抗凝管抗凝，采血量：4-5滴/鼠。取抗凝血，每管读数前上下颠倒5次，使其充分混匀，小心打开盖子，将试管插入R-500分析仪(日本Sysmex公司)吸样针中并按动开始，仪器自动计数红细胞总数、网织红细胞总数及网织红细胞数对红细胞总数的比值(Ret)。将Ret值输入计算机中，程序自动计算检测样品的生物学活性。表4显示促红细胞生成素异构体的体内活性随酸性碳水化合物的增多而升高。这里所述的体内特异活性是相对体内特异活性的测量值，并不是绝对的体内特异活性测量值。特异活性仅用于比较促红细胞生成素类似物的相对活性，类似物的测定采用相同测量方法，采用相同条件，相同种类的动物，具有用于计算特异活性的相同数据分析，测定蛋白质含量的相同分析方法。本实施例并不想以所报道的任何类似物的任何体内特异活性值来代表该类似物的固有或绝对值。

表4

促红细胞生成素类似物异构体	体内活性(U/mg多肽)
		异构体1-5	157,600±1400
异构体2-6	201,100±1800
		异构体3-6	254,700±1700
异构体4-8	288,500±3200

C.促红细胞生成素类似物异构体3-6并集液单剂量注射小鼠后，体内网织红细胞随时间的变化

按照实施例10所述方法得到的促红细胞生成素类似物异构体3-6，以5μg/kg皮下注射给体重为20±2的雌性Balb/c小鼠，并以相同剂量的重组人红细胞生成素为对照品，同时设溶剂对照组。注射后每24小时采血，用网织红细胞记数仪检测网织红细胞含量，检测网织红细胞含量随时间变化情况，图9是促红细胞生成素类似物异构体3-6给小鼠注射后网织红细胞随时间的变化曲线。结果显示，红细胞生成素组于用药后第二天RET％开始升高，第4天达高峰，持续约4天；红细胞生成素类似物组RET％也于第二天开始升高，第6天达高峰，持续约7天。由此可见，随唾液酸含量增加、等电点向酸性转移，在体内的作用时间延长。

D.促红细胞生成素类似物异构体3-6并集液静脉注射药代动力学研究

选雄性SD(Sprague Dawley)10～11周大鼠，体重300±20g，6只/组。静脉注射¹²⁵I标记的促红细胞生成素和红细胞生成素类似物异构体3-6混合物，0.05μg/kg，按照设定的时间间隔(5分钟至10小时)眼眶静脉采血，收集血清。取0.1ml血清加入0.9ml冷无水乙醇(-20℃)，置4℃培养过夜，12000rpm离心15分钟，用咖吗检测仪检测，计算药代动力学参数。图10是红细胞生成素和异构体3-6的混合物血药浓度随时间变化曲线，与促红细胞生成素相比，异构体3-6混合物体内清除速度明显降低，导致体内消除半衰期延长，二者的静脉注射大鼠后半衰期分别为8.5h和2.6h，促红细胞生成素类似物的消除半衰期是促红细胞生成素的3.3倍。

E.促红细胞生成素类似物异构体3-6并集液对小鼠血细胞比容的影响

糖基化程度的增加，导致促红细胞生成素类似物在体内的消除半衰期延长，这为提高给药间隔成为可能。实验动物为雌性BALB/c小鼠，清洁级，8周龄，体重18～22g，按照随机分组的原则分组，每组10只，采用不同剂量的天然促红细胞生成素和实施例10中得到的异构体3-6，分别以每周一次和每周三次皮下注射给BALB/c，对照组注射相同体积的溶剂，连续4周。监测血细胞比容的变化情况，2次/周，给药当天为第1天(1d)，分别于1周内的第4天(4d)和7天(7d)用肝素化处理的毛细管取血，封口，采用离心法检测血细胞比容。图11-12是小鼠注射红细胞生成素和红细胞生成素类似物异构体3-6并集液后血细胞比容随时间变化情况见。结果显示，在每周一次和每周三次给药后，异构体3-6混合物对小鼠血细胞比容的升高作用明显增强，提示临床应用促红细胞生成素类似物可以纠正贫血。在周剂量相同的情况下，异构体混合物每周一次注射后对小鼠血细胞比容的升高作用与天然人促红细胞生成素每周三次注射结果无明显差异，每周一次注射，可达到预期的治疗效果。

序列表

Claims

1. 一种具有促红细胞生成素活性的天然人促红细胞生成素类似物，该类似物包括1个额外N-糖基化位点，其中在天然人促红细胞生成素氨基酸序列的第2位置换上了天冬酰胺，第3位置换上了甘氨酸，第4位置换上了苏氨酸；即[Asn²Gly³Thr⁴]EPO；所述的额外N-糖基化位点是氨基酸序列第2位的天冬酰胺。

2. 一种具有促红细胞生成素活性的天然人促红细胞生成素类似物，该类似物包括3个额外N-糖基化位点，其中在天然人促红细胞生成素氨基酸序列的第2位置换上了天冬酰胺，第3位置换上了甘氨酸，第4位置换上了苏氨酸，并在第28、30、87、88、89、90位分别进一步置换上了天冬酰胺、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丝氨酸；即[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰]EPO；所述的3个额外N-糖基化位点分别是氨基酸序列第2、28、88位的天冬酰胺。

3. 一种具有促红细胞生成素活性的天然人促红细胞生成素类似物，该类似物包括3个额外N-糖基化位点，其中在天然人促红细胞生成素氨基酸序列的第2位置换上了天冬酰胺，第3位置换上了甘氨酸，第4位置换上了苏氨酸，并在第28、30、87、88、89、90、164位分别进一步置换上了天冬酰胺、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸；即[Asn²Gly³Thr⁴Asn²⁸Thr³⁰Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Ser⁹⁰Ala¹⁶⁴]EPO；所述的3个额外N-糖基化位点分别是氨基酸序列第2、28、88位的天冬酰胺。

4. 一种DNA序列，该DNA序列编码权利要求1-3任一项的人促红细胞生成素类似物。

5. 一种表达载体，该表达载体含有权利要求4的DNA序列。

6. 一种真核宿主细胞，该宿主细胞用权利要求5的表达载体转染。

7. 权利要求6的真核宿主细胞，其选自CHO，COS-7或BHK。

8. 一种具有促红细胞生成素活性的天然人促红细胞生成素类似物的生产方法，包括步骤：

(i) 培养权利要求6或7的真核宿主细胞，和

(ii) 从培养物中收集具有红细胞生成素活性的糖蛋白。

9. 一种增加红细胞生成的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的权利要求1-3任一项的人促红细胞生成素类似物以及可药用的助剂。

10. 权利要求9的药物组合物，所述的助剂为稀释剂或载体。

11. 权利要求9的药物组合物，其用于促进红细胞生成，预防或治疗贫血。