JPH08501681A

JPH08501681A - 核酸増幅の阻害における核酸類似物の使用

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Publication number: JPH08501681A
Application number: JP6501101A
Authority: JP
Inventors: ブシャート，オーレ; エグホルム，ミカエル; ニールセン，ペーター・エイギル; ベアウ，ロルフ・ヘンリク; スタンリィ，クリストファー・ジョン
Original assignee: ブシャート，ドアテ; エグホルム，ミカエル; ニールセン，ペーター・エイギル; ベアウ，ロルフ・ヘンリク
Priority date: 1992-06-05
Filing date: 1993-06-07
Publication date: 1996-02-27
Anticipated expiration: 2015-07-10
Also published as: KR0140836B1; NO317111B1; EP0646181B1; DK0646181T3; CZ282786B6; ES2098752T3; DE69307317D1; AU4323593A; KR950702252A; FI110694B; ATE147441T1; SK149394A3; CA2136831C; HU219371B; CA2136831A1; GB9211979D0; JP3061064B2; HU9403463D0; US5972610A; FI945725A0

Abstract

(57)【要約】核酸に強くハイブリダイズするＰＣＴ／ＥＰ９２／１２２０に開示されている種類の核酸類似物（ＰＮＡ）を使用して、ＰＣＲなどの核酸増幅方法を阻害する。次なるＰＣＲアッセイにおける擬陽性物は、ＰＮＡをＰＣＲ増幅生成物にハイブリダイズさせることによって防止される。１つの塩基対突然変異体間で区別する能力を有するアッセイは、その型のＰＣＲ増幅を選択的に阻害するために２つの対立型のうちの１つへのＰＮＡハイブリダイゼーションを使用することによって行われる。非対称的ＰＣＲ増幅は、同様の量のフォワードおよびリバースプライマーを使用して対称的にＰＣＲを開始することによって行われ、増幅は、ＰＮＡをそれにハイブリダイズさせることによって１つのプライマーを無能力にすることを確立する。

Description

【発明の詳細な説明】核酸増幅の阻害における核酸類似物の使用本発明は、核酸増幅方法を阻害することにおける核酸類似物の使用およびそれに基づく診断／分析技術に関する。核酸増幅技術は、現在、広く使用されている。これらの技術としては、最も広く使用されている技術であるＥＰ−Ａ−０２００３６２およびＥＰ−Ａ−０２０１１８４に開示されている「ＰＣＲ」（ポリメラーゼ連鎖反応）法が挙げられ、ＥＰ−Ａ−０３２０３０８に開示されている「ＬＣＲ」（リガーゼ連鎖反応）およびプロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第８７巻、第１８７４−１８７８頁、１９９０年３月およびネイチャー（Nature）、第３５０巻、第６３１３号、第９１−９２頁、１９９１年３月７日に開示されている、いわゆる「ＮＡＳＢＡ」または「３ＳＲ」法も挙げられる。診断におけるこれらの方法の使用における主な問題は、前の反応からの増幅核酸配列の持ち越しによる偽陽性物の生成である。これらの方法は、標的配列を含有する１つの分子さえ存在すれば、陽性の結果を生じる能力を有するので、もちろん、かかる偽陽性物を生じるのは非常に簡単である。現在、増幅方法が行われたかまたは行われなかったかを測定する前に、かかる方法の反応生成物を後処理するのが必要である。これは、反応生成物とピペットなどのいくつかの実験器具との間、および利用可能な増幅生成物の追跡を行うことができる人員との接触を含み、今後の実験を汚染する。現在、増幅生成物を手で扱わず、非開放系反応容器中で増幅反応の成功をモニターすることができる、いわゆる「イントリンジック（intrinsic）」法を研究する多くの試みが行われている。相補的配列の慣用の核酸を選択的に結合して、加熱によるデハイブリダイゼーションに対して、慣用の核酸間の同様のハイブリッドよりも安定なハイブリッドを形成する新しい形態の核酸類似物は、１９９２年５月２２日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１２２０に開示されている。本発明者らは、今、このより大きなハイブリッド安定性を利用して、核酸増幅方法を選択的に阻害することができることを見いだした。この技術を使用して、かかる増幅方法における偽陽性物を防止することもできる。該技術は、ある診断／分析法の必須の部分として利用することもできる。第１の態様では、本発明は、増幅方法において必須の方法で関与する核酸の配列に対して充分に相補的な有効量の核酸類似物を供給して、増幅方法において該配列の有効な関与を防止するのに充分に強く該配列にハイブリダイズさせることからなる核酸増幅の阻害方法を提供するものである。したがって、この本発明の態様は、二本鎖標的核酸の各鎖が、鋳型に対して相補的な第２鋳型を形成するために伸長または連結される１つ以上のプライマーについて鋳型として使用される領域を有しており、該鋳型または該プライマーの配列に対して、該配列とハイブリダイズするのに充分に相補的な核酸類似物を供給し、該核酸類似物が、該方法の条件下でプライマー鋳型ハイブリダイゼーションを阻害するか、または、プライマー伸長もしくはプライマー連結を阻害するのに充分に強く個々の鋳型またはプライマーにハイブリダイズすることを特徴とする核酸増幅方法の阻害方法を含む。好ましくは、該方法は、ＰＣＲまたはＬＣＲまたは３ＳＲ法である。「アンカー」および「逆」ＰＣＲ法が含まれる。各鎖中に鋳型として作動する領域を有する「二本鎖標的核酸」は、必ずしも出発物質ではなく、該方法における所望の増幅の直接的な標的である必要もない。ＰＣＲでは、「二本鎖標的核酸」は、通常、出発物質に取り込まれ、一般に、その少なくとも１本の鎖の増幅が望ましい。しかしながら、唯一のＤＮＡ鎖を用いてＰＣＲ反応を開始することができ、該相補鎖は、プライマー伸長法の第１サイクルにおいて生成される。後のサイクルでは、「二本鎖標的核酸」は、前のサイクルからの生成物で構成されるのが顕著である。ＬＣＲでは、「二本鎖標的核酸」は、同様に、最初に、通常、出発物質に取り込まれ、後のサイクルでは、増幅生成物であるのが顕著である。必ずしも、プライマーは、増幅サイクルの同一の部分において、または、実際は、二本鎖標的核酸が形成された後にだけ各鎖にハイブリダイズするわけではない。したがって、３ＳＲ法では、リバーストランスクリプターゼによって相補的なＤＮＡ鎖として伸長される第１プライマーに出発ＲＮＡ鎖をハイブリダイズさせて、「二本鎖標的核酸」を形成する。ＲＮase ＨによるハイブリダイズしたＲＮＡ鎖の分解後、第２プライマーをＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせ、リバーストランスクリプターゼによって伸長させて、二本鎖ＤＮＡ分子を形成させる。したがって、この段階では、ＤＮＡ／ＲＮＡに存在する両方の鎖は、その時に、プライマーにハイブリダイズされ、次いで、該プライマーを伸長させた。第１プライマーは、ＤＮＡ／ＤＮＡ生成物が該ＤＮＡ／ＤＮＡ生成物を鋳型として使用してＲＮＡ出発物質に対応する多くのＲＮＡコピーを生成するＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼについてのプロモーターを含み、次いで、該ＲＮＡコピーの各々が第１プライマーおよび作用せしめるリバーストランスクリプターゼについての出発物質となるように構築される。該核酸類似物の不在下で、該増幅方法を行い、所望のレベルの増幅生成物を構築し、次いで、該核酸類似物を添加する。好ましくは、該核酸類似物は、増幅生成物にハイブリダイズする。このことによって、増幅が遮断され、次反応を汚染すると鋳型として作用するのが不可能である安定な核酸−核酸類似物ハイブリッドの形態で生成物を残すことができる。したがって、「イントリンジック」法よりも「オープン」法の方が、持ち越し汚染に対して安全になる。別にまたはさらに、かかるタイプの増幅方法で使用される装置を、核酸類似物を含有する溶液で処理して、汚染として存在する増幅生成物にかかる類似物をハイブリダイズさせることができ、その後、該装置を洗浄し、該増幅方法で使用する。該装置における汚染として最初に存在する増幅生成物の該増幅方法における増幅は、該類似物へのハイブリダイゼーションによって防止される。したがって、本発明は、核酸増幅生成物が次の増幅方法において鋳型として作用することを防止するための方法であって、該核酸増幅生成物と次の増幅方法の条件下で安定なハイブリッドを形成する核酸類似物を該核酸増幅生成物にハイブリダイズさせることからなる防止方法を含む。本発明は、また、環境中に存在する核酸増幅生成物が核酸についての次の増幅方法において汚染鋳型として作用することを防止する方法であって、該核酸増幅生成物と次の増幅方法の条件下で安定なハイブリッドを形成する核酸類似物で該環境を処理することからなる防止方法を含む。実際には、該類似物と増幅のための標的配列を含有する存在するいずれの核酸との間でも安定なハイブリッドを形成するように、例えば、ハイブリダイゼーションバッファー中に核酸類似物を含有する溶液で、該方法で利用される装置の全てまたはいくつかを洗浄してもよい。核酸類似物で形成されたハイブリッドは、次の増幅方法の条件に耐えるのに充分に安定であり、これによって、汚染標的配列は、かかる方法における参加して偽陽性を生じるのを防止する。本発明のこの態様および他の態様において使用される核酸類似物は、５〜２０個の核塩基結合リガンド、例えば、１０〜１５個のリガンドを含有する。特異的核酸配列の増幅を停止させるように設計された核酸類似物を供給することができるか、あるいは、多くの異なる増幅を停止させる核酸類似物配列の混合物を含有する試薬を供給することができる。好ましくは、この後者の目的のための試薬は、多様な配列または多数の配列を含有する。究極的には、各々、リガンドのランダム配列を含有する分子を構築するために各段階で単量体シンソン（４種類のＤＮＡ塩基の各々に対して相補的な、リガンドを含む）の混合物を使用して、核酸合成類似物を合成することができる。充分量のかかる試薬は、増幅方法を阻害することができる増幅生成物に対して相補的な、充分に多量の分子を含有すべきである。一般に、かかる試薬における核酸類似物の各分子は、少なくとも１０mer、より好ましくは、少なくとも１２mer、例えば、１５〜２０merであるのが好ましい。増幅方法の選択的阻害は、診断プロセスの一部としてより有効に作動せしめられる。現在、別の配列からの１つの塩基変化（例えば、遺伝子における「正常な」配列からの１つの塩基突然変異）などの特定の配列が存在するかを測定することに関して、配列を増幅させるためのＰＣＲなどの方法を使用する場合、増幅生成物における配列を検出するための方法は困難である。これらは、全生成物を配列決定して、変化した塩基の存在を証明することを含む。それらは、遺伝子配列の変化が制限部位に影響を及ぼす場合、１つ以上の制限酵素によって生成された変化したパターンの消化生成物を検出することも含む。それらは、可能な配列間で区別するのに充分にストリンジェントな条件下で、該生成物に、突然変異した配列についての標識核酸プローブをハイブリダイズさせることを含む。突然変異が存在する場合にだけＰＣＲ標的配列と安定なハイブリッドを形成する能力を有する核酸類似物を設計し、ハイブリダイゼーション条件下で試料核酸に該類似物を供給することによって、突然変異含有配列の指数増幅が起こらないように、ＰＣＲ反応を選択的に阻害できる。この原理は、他の増幅方法にまでも広がる。したがって、本発明は、標的核酸配列の存在または不在を検出する方法であって、該標的配列が存在する場合に位置する該核酸のその部分を含む鋳型として使用される領域を有する二本鎖核酸の各鎖が、１つ以上のプライマーの該鋳型へのハイブリダイゼーションおよび鋳型に対して相補的な第２鋳型を形成するための該プライマーの伸長または連結によって増幅される増幅方法を行うことからなり、標的配列に対して相補的な核酸類似物を供給し、標的配列が存在する場合に増幅方法を阻害するのに充分に強く鋳型とハイブリダイズすることを特徴とする検出方法を含む。核酸類似物が増幅反応の全体にわたって存在する場合、標的配列を有する他の鎖の増幅は、指数的よりもむしろ線形であり、その結果、有意な量の増幅生成物は生成されない。したがって、標的配列の存在は、有意な生成物レベルを生成するためのＰＣＲまたはＬＣＲまたは３ＳＲである増幅反応が行われないことに基づいて導かれる。例えば、ゲルに対して該反応生成物を走行させて、バンドが生じないことは、該配列の存在を示す。いくつかの他の理由のために行われなかった反応に対してガードするために内部対照を含むことが望ましい。したがって、好ましくは、対照としては、増幅によって標的配列の増幅生成物とは異なる生成物を生じせしめる同一プライマーを使用する増幅方法による増幅能力を有する第２核酸基質が含まれる。特異的な位置での特定の塩基の存在を検出するため、例えば、特異的な１つの塩基突然変異の存在を示すために、このようにして該方法を行うことができる。一連のかかる分析は、各分析で個々の突然変異を作成した核酸類似物を使用することによって、可能な突然変位の範囲が遺伝子領域内に存在するかを同定するために並行してまたは連続的に行われる。より一般的な配列からの突然変異の場合、突然変異または「正常な」配列を「標的核酸配列」とみなす。したがって、核酸類似物が突然変異配列に対して相補的である場合、増幅が行われないことは、突然変異の存在を示す。別法としては、「正常な」配列に対して相補的な核酸類似物を使用することもでき、これにより、増幅が行われないことは、「正常な」配列の存在を示し、好結果の増幅は、非特異的な突然変異の存在、すなわち、「正常な」配列の不在を示す。ＰＮＡがＰＣＲプライマー結合部位または該プライマー結合部位から実質的に離れた鋳型におけるヌクレオチド配列のいずれにハイブリダイズさせられようとＰＮＡなどの核酸類似物がＰＣＲ増幅反応を妨げることができることが判明したが、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション部位の選択が重要ではない場合はない。一般に、ＰＣＲ反応を停止させるために必要なＰＮＡとＤＮＡ鋳型との間の親和性のレベルは、ＰＮＡがプライマー結合部位またはその近くにハイブリダイズする場合、わずかに少ない。親和性は、最も強く結合するホモピリミジン領域を含む特定の塩基配列を考慮に入れてＰＮＡ配列長さの適切な選択によって非常によくすることができる。したがって、一方が対照として使用され、かつ、他方を阻害する好適なＰＮＡの存在に鈍感である２つのＰＣＲ反応を同時に１つの鋳型上で行うことができるような条件を選択することができる。したがって、一方がより長い増幅生成物を生成し、他方がより短い増幅生成物を生成する２つの異なるリバースプライマーと合わせて１つのフォワードプライマーを使用する場合、ＰＮＡの親和性を賢明に選択すると、より短い生成物プライマーの結合部位またはその近くにＰＮＡを指向させ、より長い生成物ＰＣＲ反応を同時に阻害することなく各ＰＣＲ反応を防止することができる。ＰＮＡハイブリダイゼーション部位が検出しようとする１つの塩基対突然変異を含有するものである場合、該突然変異が存在する場合、ＰＮＡは結合し、唯一のＰＣＲ生成物が生成されるが、突然変異が存在しない場合、該ＰＮＡは、より短い生成物ＰＣＲを阻害するのに充分に強くはＤＮＡを結合せず、より長い生成物およびより短い生成物の両方を生成する。したがって、阻害が有効ではないより長い生成物ＰＣＲは、突然変異の存在または不在についてのアッセイにおいて正しい条件の使用を変化させる内部対照として作動する。本発明は、同一のプライマーを使用する一連のＰＣＲ増幅方法を行い、各方法において、複数の配列の各々１つに対して相補的な各核酸類似物を供給して、それとハイブリダイズさせて、各配列が存在する場合に増幅方法を阻害することによって、次いで、標的核酸配列内の複数の配列の各々の存在または不在を検出する方法を含む。したがって、各鎖に１つずつ一対の間隔をおいたＰＣＲプライマー結合部位を有する標的配列を与えるとすると、特異的配列への結合能を有する核酸類似物を供給して、ＰＣＲ条件下で安定であり、かつ、指数的増幅を阻害するハイブリッドを形成させることによって、これらの部位の間で一つの鎖上に特に特異的な配列を生じるかを測定することができる。この原理は、有用には、多くの可能な配列が遺伝子または遺伝子クラスターなどの大きな領域内の核酸の領域に連続的に存在するかを測定するために適用される。一例として、イー・コリにおいて、３０個までの遺伝子は、抗生物質耐性を測定する短い遺伝領域においてクラスターされる。抗生物質耐性遺伝子が特定の微生物中に存在するかを測定するためには、通常、関心のある各遺伝子についてＰＣＲプライマーを増殖させることを含む。選択的ＰＣＲブロックのために核酸類似物を使用すると、領域全体をフランクする一対のプライマーを使用して、存在する遺伝子を測定することができる。特異的配列核酸類似物は、同定されるべき各遺伝子配列についてのいずれかの鎖に対しても相補的にされ、次いで、ＰＣＲ反応は、存在する各核酸類似物を用いて行われる。試験下の該類似物がハイブリダイズする核酸における配列が存在する場合、ＰＣＲ反応は阻害される。慣用のＰＣＲを使用する場合、研究されるべき各配列に対して特異的な一対のプライマーが必要である。各プライマー対は、多くのパラメータを変化させることによって最適にされるべき増幅における条件を必要とする。前記ＰＣＴ出願に開示されている種類の核酸類似物は、所望の配列において容易に合成されるので、多くの異なるＰＣＲプライマーを得ることおよび各プライマー対の組合せに対して好適な増幅方法を開発することの問題が解消される。本発明は、ハイブリダイゼーション条件下で、プライマー部位またはプライマー部位から下流でプライマーまたは鋳型と安定なハイブリッドを形成する核酸類似物を供給することからなる核酸鋳型にハイブリダイズさせたプライマーのポリメラーゼ媒介伸長を阻害する方法を含む。増幅方法の生成物が配列決定されるか、または検出され、標識オリゴヌクレオチドでプローブすることによって同定される場合、通常、一本鎖形態で得られることが必要である。相補鎖は、通常、等量で存在し、該鎖は、組換えに役立つ。したがって、２つの生成物鎖の一方を主に生成するような方法（非対称ＰＣＲ）で、ＰＣＲ反応を行うことが望まれる。現在、これは、１つのプライマーを他方よりも多く使用することによって試みられる。理想的には、所望の配列の指数的生成は、１つのプライマーを使い果たし、結果として線形増幅が生じるまで起こる。反応の初期段階に影響を及ぼす固有のプライマー濃度のため、しばしば、ＰＣＲ方法が適正に開始されないという問題がある。したがって、本発明は、二本鎖標的核酸の各鎖が、伸長して鋳型に対して相補的な第２鋳型を形成するプライマーに対する鋳型として使用される領域を有しており、多数の増幅サイクルの後、反応条件下で該プライマーをその標的にハイブリダイズさせることを阻害するのに充分に強くプライマーの１つにハイブリダイズする核酸類似物を添加することを特徴とする非対称核酸増幅方法を行う方法を含み、この方法は、次に、多数のさらなるサイクルを通して連続させる。好ましくは、増幅方法は、ＰＣＲである。本発明は、この方法で非対称増幅を行い、次いで、増幅生成物を検出または配列決定することを含む。試みたＰＣＲまたは他の増幅反応の間のＰＮＡ濃度は、好ましくは、０．５μ Ｍよりも多く、好ましくは、２．０μＭよりも多く、最も好ましくは、３μＭよりも多く、例えば、３〜１５μＭである。前記の全てにおいて使用される核酸類似物は、好ましくは、骨格に沿って個々の間隔をおいた位置に複数のリガンドを有するポリアミド骨格からなっており、該リガンドが、各々、独立して、天然核塩基、非天然核塩基または核塩基結合基であり、各リガンドが該骨格における窒素原子に直接または間接的に結合され、窒素原子を有する該リガンドが、主に、骨格において４〜８介在原子によってお互いに離されていることを特徴とするぺプチド核酸（ＰＮＡ）である。しかしながら、それは、一般に、加熱による変性に対して、核酸類似物に対応する慣用のデオキシリボヌクレオチドと核酸との間のハイブリッドよりも安定なハイブリッドを形成するために相補的な配列の核酸にハイブリダイズする能力を有する核酸類似物である。好ましくは、１つの鎖が類似物に対して相補的な配列を有している二本鎖核酸にハイブリダイズして、その結果、この１つの鎖を他の鎖に代える能力を有している核酸類似物である。前記定義のぺプチド核酸（ＰＮＡ）の骨格における窒素原子の分離は、好ましくは、５個の原子による。式Ｉ（下記）で示される核酸類似物において、これは、ＤＮＡに対する最強の親和性を提供することが見いだされた。しかしながら、あまり最適ではないスペーシングによって、例えば、５個よりも多いの原子のスぺーシングによって、例えば、１４個までまたはそれ以上の原子によって、１つ以上のリガンドの間隔をおくことによってＰＮＡおよびＤＮＡ間の結合強度を低下させることが望ましい場合もある。好ましくは、リガンド間スペーシングの２５％以下は、６個以上の原子である。より好ましくは、リガンド間スペーシングの１０〜１５％以下は、６個以上の原子である。リガンドを有する（直接またはリンカー基を介して）アザ窒素原子は、前記スペーシングとみなされない。ＤＮＡ結合の強度を低下させるための別法またはさらなる方法は、ＤＮＡの結合にあまりまたは全く寄与しない部分、例えば、水素をそれらの場所において、いくつかのリガンドを省略することである。好ましくは、リガンド位置の２５％以下、例えば、１０〜１５％以下は、非結合部分によって占められている。代表的なリガンドとしては、好適なリンカーを介してぺプチド骨格に結合した４つの主な天然ＤＮＡ塩基（すなわち、チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン）または他の天然核塩基（例えば、イノシン、ウラシル、５−メチルシトシンまたはチオウラシル）または合成塩基（例えば、ブロモウラシル、アザアデニンまたはアザグアニンなど）が挙げられる。好ましい具体例において、本発明で使用される核酸類似物は、一般式(Ｉ)：［式中、ｎは、少なくとも２であり、Ｌ¹−Ｌⁿは、各々、独立して、水素、ヒドロキシ、(Ｃ₁−Ｃ₄)アルカノイル、天然核塩基、非天然核塩基、芳香族基、ＤＮＡインターカレーター(intercalato r)、核塩基結合基およびレポーターリガンドから選択され、Ｌ¹−Ｌⁿのうち少なくとも１つは、天然核塩基、非天然核塩基、ＤＮＡインターカレーター、または核塩基結合基であり；Ａ¹−Ａⁿは、各々、単結合、メチレン基または式(ＩＩａ)もしくは(ＩＩｂ)：（式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂またはＣ(ＣＨ₃)₂であり；Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ⁴であり；ｐおよびｑは、各々、１〜５の整数であり、ｐ＋ｑは、１０以下であり；ｒおよびｓは、各々、０または１〜５の整数であり、ｒ＋ｓは、１０以下であり；Ｒ¹およびＲ²は、各々、独立して、水素、ヒドロキシ−またはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換されていてもよい(Ｃ₁−Ｃ₄)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンから選択され；Ｒ³およびＲ⁴は、各々、独立して、水素、(Ｃ₁−Ｃ₄)アルキル、ヒドロキシ− またはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換(Ｃ₁−Ｃ₄)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよびアミノからなる群から選択される）で示される基であり；Ｂ¹−Ｂⁿは、各々、ＮまたはＲ³Ｎ⁺であり、ここで、Ｒ³は、前記定義と同じであり；Ｃ¹−Ｃⁿは、各々、ＣＲ⁶Ｒ⁷、ＣＨＲ⁶ＣＨＲ⁷またはＣＲ⁶Ｒ⁷ＣＨ₂であり、ここで、Ｒ⁶は、水素であり、Ｒ⁷は、天然アルファーアミノ酸の側鎖からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ⁶およびＲ⁷は、独立して、水素、(Ｃ₂−Ｃ₆)アルキル、アリール、アラルキル、へテロアリール、ヒドロキシ、(Ｃ₁−Ｃ₆)アルコキシ、(Ｃ₁−Ｃ₆)アルキルチオ、ＮＲ³Ｒ⁴およびＳＲ⁵からなる群から選択され、ここで、Ｒ³およびＲ⁴は、前記定義と同じであり、Ｒ⁵は、水素、(Ｃ₁−Ｃ₆ )アルキル、ヒドロキシ−、アルコキシ−またはアルキルチオ−置換(Ｃ₁−Ｃ₆) アルキルであるか、あるいは、Ｒ⁶およびＲ⁷は、一緒になって、脂肪族環系または複素環系を形成し；Ｄ¹−Ｄⁿは、各々、ＣＲ⁶Ｒ⁷、ＣＨ₂ＣＲ⁶Ｒ⁷またはＣＨＲ⁶ＣＨＲ⁷であり、ここで、Ｒ⁶およびＲ⁷は、前記定義と同じであり；Ｇ¹−Ｇ^n-1は、いずれかの向きで、（式中、Ｒ³は、前記定義と同じである）であり；Ｑは、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ'Ｒ"、−ＳＯ₃Ｈもしくは−ＳＯ₂ＮＲ'Ｒ"または−ＣＯ₂Ｈもしくは−ＳＯ₃Ｈの活性誘導体であり；Ｉは、−ＮＨＲ"'Ｒ""または−ＮＲ"'Ｃ(Ｏ)Ｒ""であり、ここで、Ｒ'、Ｒ"、Ｒ"'およびＲ""は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、インターカレーター、キレーター、ぺプチド、タンパク、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌクレオチドならびに可溶性および不溶性ポリマーからなる群から選択される］で示される。別法としては、ＣおよびＤは、ＣＨＲ⁶(ＣＨ₂)_sＣＨＲ⁷てあり、ここで、ｓは、０〜２である。好ましいペプチド核酸は、一般式(ＩＩＩ)：［式中、Ｌは、各々、独立して、水素、フェニル、複素環（例えば、１、２または３個の環）、天然核塩基、および非天然核塩基からなる群から選択され；Ｒ⁷'は、各々、独立して、水素および天然アルファーアミノ酸の側鎖からなる群から選択され；ｎは、１〜６０の整数であり；ｋ、ｌおよびｍは、各々、０または１〜５の整数であり；好ましくは、ｋとｍの合計は、１または２、最も好ましくは、１であり；Ｒ^hは、ＯＨ、ＮＨ₂または−ＮＨＬysＮＨ₂であり；Ｒⁱは、ＨまたはＣＯＣＨ₃である］で示される。特に好ましくは、Ｌが各々独立して核塩基チミン(Ｔ)、アデニン( Ａ)、シトシン(Ｃ)、グアニン(Ｇ)およびウラシル(Ｕ)からなる群から選択され、特にチミンであり、ｎが１〜３０の整数であり、特に、４〜２０である式(ＩＩＩ)で示される化合物である。本発明のぺプチド核酸は、溶液中または固相上のいずれかで、標準的なぺプチド合成法の適用によって合成される。使用されるシンソンは、特別に設計された単量体アミノ酸または標準的な保護基によって保護されたそれらの活性誘導体である。オリゴヌクレオチド類似物は、対応する二酸およびジアミンを使用することによって合成することもできる。したがって、本発明で使用される化合物の製造に使用される単量体シンソンは、一般式：［式中、Ｌ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、アミノ基がアミノ保護基によって保護されていてもよいことを除いて、前記定義と同じであり；Ｅは、ＣＯＯＨ、ＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ₂ＯＨまたはその活性誘導体であり；Ｆは、ＮＨＲ³またはＮＰ gＲ³であり、ここで、Ｒ³は、前記定義と同じであり、Ｐgは、アミノ保護基である］で示されるアミノ酸、二酸およびジアミンからなる群から選択される。好ましい単量体シンソンは、式(ＶＩＩ)：［式中、Ｌは、水素、フェニル、複素環、天然核塩基、非天然核塩基およびその保護誘導体からなる群から選択され；Ｒ⁷'は、独立して、水素または天然アルファ−アミノ酸の側鎖からなる群から選択される］で示されるアミノ酸またはそのアミノ保護および／または酸末端活性誘導体である。特に、Ｒ⁷'が水素であり、Ｌが核塩基チミン(Ｔ)、アデニン(Ａ)、シトシン (Ｃ)、グアニン(Ｇ)およびウラシル(Ｕ)ならびにその誘導体からなる群から選択される式(４)で示されるかかるシンソンが好ましい。かかるＰＮＡの生成は、前記ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１２２０に詳述されている。本発明は、増幅についての複数のプライマーおよび該プライマーのうちの１つにおける配列または該増幅反応において該プライマーを使用して増幅されるべき標的核酸配列に対して相補的な配列を有する少なくとも１つの核酸類似物からなる核酸増幅反応を行うことにおいて使用されるキットを含む。かかるキットは、さらに、該プライマーの伸長または連結を生ずるための増幅反応におけるポリメラーゼまたはリガーゼ、例えば、ＴaqポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼからなる。「３ＳＲ」タイプの方法における使用について、該キットは、さらに、リバーストランスクリプターゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮase Ｈなどのヌクレアーゼの１つ以上を含んでもよい。一般に、かかるキットは、さらに、１種類以上が公知方法または好適な方法で標識（放射性標識）されていてもよいヌクレオチド（ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰのいくつかまたは全て）を含んでもよい。かかる標識を検出するための試薬も含んでもよい。キットは、さらに、バッファー、塩、安定化剤および核酸認識剤の１つ以上を含んでもよい。これらは、特異的な配列を認識する試薬または非配列特異的方法において核酸を認識する試薬である。例えば、前者の例は、オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ型の核酸類似物であり、所望により、検出可能な標識を有していてもよく、後者の例は、核酸に対する抗体である。本発明において使用する好適な標識としては、放射性同位体標識、酵素標識、ビオチン、スピン標識、フルオロフォア、化学蛍光標識、抗原標識および抗体標識が挙げられる。キットは、さらに、核酸増幅反応のものとは異なる増幅生成物を生成するためにプライマーを使用する増幅のための鋳型を含む正の対照実験を行うための試薬が挙げられるキットは、さらに、核酸増幅生成物を配列決定するのに使用する試薬、例えば、Ｔaqポリメラーゼなどのポリメラーゼおよび１つ以上のジデオキシヌクレオチドを含んでもよい。以下の実施例において、全てのＰＮＡは、式ＶＩＩで示される単量体シンソンから誘導された骨格を有しており、各々の場合、各Ｌは、常法でＡ、Ｃ、ＧまたはＴによって表される天然核塩基の１つである。使用される命名法は、前記ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１２２０において使用されたものに従う。本発明は、添付した図面に言及される以下の詳細な実施例によってさらに説明される。第１図は、ＰＮＡによるプライマーのポリメラーゼ媒介伸長の阻害を示すゲルのオートラジオグラフである。第２図は、１つの塩基対によって異なる配列間て区別するＰＮＡによるＰＣＲ反応の選択的な阻害を示す臭化エチジウムゲルである。第３図は、ＰＣＲのＰＮＡ指向阻害のさらなる実施例を示す臭化エチジウムゲルである。第４図は、プライマー標的部位と重複するか、または、それからの変化する量によって間隔をおいたＰＣＲ鋳型上の部位に指向されたＰＮＡによるＰＣＲの阻害を示す臭化エチジウムゲルである。第５図は、１つのプライマーに対して相補的なＰＮＡによるＰＣＲ反応の完全な阻害を示す臭化エチジウムゲルである。第６図は、１つの塩基変化を同定するためにＰＣＲ阻害をさらに説明する実施例６の結果を示す臭化エチジウムゲルである。実施例１ＰＮＡによるプライマー伸長停止１０チミジン残基の挿入配列を含有するプラスミド［Bluescript、ストラータジーン，インコーポレイテッド（Ｓtrategene，Ｉnc.）］（ｐＴ１０ＫＳ）０．５μgを制限エンドヌクレアーゼＰvuＩＩで切断し、１０×濃度バッファー（イー・コリ（Ｅ.coli）クレノウＤＮＡポリメラーゼに対して：１００mＭトリスーＨＣl、１００mＭＭgＣl₂、５０mＭＮaＣl、１mＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、pＨ７.５；Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼに対して：１００mＭトリス−ＨＣl 、１５mＭＭgＣl₂、５００mＭＮaＣl、１mg／mlゼラチン、pＨ８．３）１μl およびＨ₂Ｏ６μlを添加した「リバースプライマー」（５'−ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ）０.１μgおよびプラスミド中のＴ₁₀挿入部に対して相補的なＡ₁₀ＰＮＡ１００ngを９０℃で１０分間、３７℃で６０分間インキュベートし、次いで、２０℃に冷却した。次いで、１０mＭＤＴＴ１μl、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび１μＣiのα³²Ｐ−ｄＡＴＰの１０μＭ溶液１μlおよび１Ｕの適切なＤＮＡポリメラーゼを添加した。２０℃で５分後、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの１mＭ溶液２μlを添加し、イー・コリ（Ｅ .coli）ＤＮＡポリメラーゼに対して３７℃で、またはＴaqポリメラーゼに対して６０℃で、１５分間インキュベーションを続けた。次いで、エタノール５０μ l、２％（w／v）酢酸カリウムの添加によってＤＮＡを沈澱させ、８％（w／v）アクリルアミド／７Ｍ尿素配列決定ゲル中での電気泳動、次いで、オートラジオグラフィによって分析した。結果を第１図に示す。レーンは、以下のとおり示される：レーン１：イー・コリ（Ｅ.coli）ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメント、ＰＮＡは含まない。レーン２：ＰＮＡの存在下以外は、レーン１と同様。レーン３：Ｔaqポリメラーゼ、ＰＮＡは含まない。レーン４：ＰＮＡの存在下でのＴaqポリメラーゼ。レーン５：ＢamＨＩで切断されたプラスミドを有する対照。このダイアグラムから、Ａ₁₀ＰＮＡがＢamＨＩ部位に隣接する鋳型ＤＮＡの一本の鎖にハイブリダイズしていることが判明する。したがって、Ａ₁₀ＰＮＡがプライマーのポリメラーゼ伸長を阻害する場合、ゲル上を走行する生成物は、レーン５に示されるＢamＨＩ切断生成物で生成される。ポリメラーゼ伸長がＰＮＡによってチェックされない場合、より長い伸長生成物が得られる。各ＰＮＡ含有レーン（２および４）において、ＢamＨＩ位置における予想されるバンドが生成される。ＰＮＡの不在下では、ＰＮＡによってＴaqの完全な阻害を示す実質的にＰＮＡ／Ｔaqレーン（レーン４）に全く存在しない、より長い生成物が見られる。実施例２ＰＣＲＤＮＡ増幅のＰＮＡ指向阻害による１つの塩基突然変異の検出相補的オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴＣＣＴ₁₀Ｇおよび５’−ＧＡＴＣＣＡ₁₀ ＧをＢluescriptＫＳ＋プラスミド（ストラータジーン(Ｓtratagene)）のＢam ＨＩ部位で個々の鎖にクローン化することによって、プラスミドpＴ１ＯＫＳを構築した。プラスミドpＴ９ＣＫＳは、相補的オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＣＴ₅ＣＴ₄Ｇおよび５’−ＴＣＧＡＣＡ₄ＧＡ₅ＧをpＵＣ１９のＳalＩにクローン化することによって構築した。バッファー（１０mＭトリス−ＨＣl、３.５mＭＭgＣl₂、５０mＭＫＣl、０．１mｇ／mlゼラチン、pＨ８．３）５０μl中にプラスミド１２５ng、プラスミド２ＤＮＡ２５ng、１.２５mＭ dＡＴＰ、１.２５mＭ dＣＴＰ、１.２５mＭ d ＧＴＰ、１.２５mＭ dＴＴＰ、プライマー１０.２μg、プライマー２０.２μg およびＰＮＡ２.５μgを含有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。該試料を９４℃に５分間加熱し、次いで、６５℃に冷却し、この段階で、１ＵのＴaqＤＮＡポリメラーゼ［ベーリンガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍannheim)］を添加した。次いで、３０温度サイクル（９４℃（２分間）、４０℃（３分間）および６５℃（２分間））を行った。ＴＢＥバッファー（９０mＭトリス−ホウ酸塩、１mＭＥＤＴＡ、pＨ８．３）中で操作する６％（w／v）ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動によって、得られたＤＮＡを分析し、該ＤＮＡを臭化エチジウムで染色することによって可視化した。プライマー１として「Ｍ１３プライマー」を、プライマー２として「リバースプライマー」を使用して、実施例１の記載に従って実験を行った。得られたゲルを第２図に示す。以下のプラスミドおよびＰＮＡを使用した：レーン１：pＴ９ＣＫＳ（dＡ₅ＧＡ₄／dＴ₄ＣＴ₅ ＰＮＡ標的をＳal Ｉ部位にクローン化させたpＢluescriptＫＳ＋）およびpＴ１０ＫＳ（dＡ₁₀／dＴ₁₀ＰＮＡ標的をＢamＨＩ部位にクローン化させたpＢluescriptＫＳ＋）、ＰＮＡを含まない。レーン２：ＰＮＡＨ−Ｔ₅ＣＴ₄ＬysＮＨ₂を有する以外は、レーン１と同様。レーン３．ＰＮＡＨ−Ｔ₁₀ＬysＮＨ₂を有する以外は、レーン１と同様。レーン４：ＰＮＡＨ−Ｔ₅ＣＴ₄−ＬysＮＨ₂を有するpＴ１０ＫＳおよびpＴ９ＣＫＳ。レーン５：ＰＮＡＨ−Ｔ₁₀ＬysＮＨ₂を有するpＴ１０ＫＳおよびpＴ９ＣＫＳ。レーン１において、各プラスミドから１つずつの２つのＰＣＲ生成物が明らかに見られる。pＴ１０ＫＳの増幅によって、１１８bpフラグメントが得られ、pＴ９ＣＫＳの増幅によって、２２１bpフラグメントが得られる。プラスミドpＴ９ＣＫＳは、ＰＮＡＴ₅ＣＴ₄ＬysＮＨ₂についての標的配列を含有する。レーン２において、ＰＮＡによるＰＣＲの阻害を示すこのプラスミドについてのバンドは見られない。実施例３ＰＣＲのＰＮＡ指向阻害のさらなる実証エゴルム，エム（Ｅgholm,Ｍ.）、ブチャード，オー（Ｂuchardt,Ｏ.）、ニールセン，ピー・イー（Ｎielsen,Ｐ.Ｅ.）およびバーグ，アール・エイチ（Ｂerg ,Ｒ.Ｈ.）（１９９２）ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ.Ａmer.Ｃhem.Ｓoc.）１１４、１８９５−１８９７およびエゴルム，エム、ブチャード，オー、ニールセン，ピー・イーおよびバーグ，アール・エイチ（１９９２）ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ１１４、９６７７−９６７８におけると同様に、ＰＮＡＴ₁₀−ＬysＮＨ₂を合成した。ブラスミドpＴ１０ＫＳおよびpＴ９ＣＫＳは、実施例２の記載と同じであった。９９bp ＰＣＲフラグメント（この実施例で使用されるＰＮＳaのいずれについても標的部位を有しない）をbluescript ＫＳ＋プラスミドのＳmaＩ部位にクローニング化させることによって、対照プラスミドpＣＫＳを構築した。標準的な技術を使用して、組換えイー・コリＪＭ１０３の選択されたクローンからプラスミドを単離し、ＣsＣl勾配液中で浮揚性密度遠心によって精製し、次いで、ジデオキシ法によって配列決定させた。ＰＣＲ反応で以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した：リバースプライマー（５’−ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）およびフォワードプライマー（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）。各プラスミド１ｎｇ、各プライマー０．２μＭ、２００μＭｄＮＴＰ、１０mＭトリス−ＨＣl 、ｐＨ８．３（２５℃で）、１０mＭＫＣl、および３mＭＭgＣl₂を含有する５０μlの体積中でＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応は、パラフィン油２滴で覆い、９０℃で２分間インキュベートした後、３Ｕのストッフェル(stoffel)ポリメラーゼ［パーキン・エルマー・セタス( Ｐerkin Ｅlmer Ｃetus)］の添加によって、増幅プロセスを開始させた。全て実験において、ＬＥＰ増幅器［ＩgＧバイオテク(ＩgＧＢiotech)］を使用し、ＰＣＲサイクルプロフィルは、９６℃、２分−５５℃、３分−３５℃、１分−６５ ℃、２分−３５サイクルであった。ＰＣＲプライマー結合および伸長に先立つＰＮＡ／ＤＮＡ複合物の形成を確実にするため、通常の３ステップＰＣＲサイクルを、ＰＣＲプライマーのＴmよりも上の充分な温度での異なったＰＮＡアニーリング工程で拡大させた。第３図には、ＰＮＡＴ₁₀−ＬysＮＨ₂の存在下でのＰＣＲ阻害の実験機構および結果を示す。前記２つのプラスミド鋳型、すなわち、Ａ₁₀標的部位を含有する２４６bpフラグメントを増幅させるpＴ１０ＫＳプラスミド、および、３２９b p非標的フラグメントを増幅させる対照プラスミドpＣＫＳを使用した。ＰＮＡＴ₁₀ −ＬysＮＨ₂が存在しない場合（レーン２）、pＴ１０ＫＳプラスミドは、予想された２４６bp pＣＲフラグメントを合成させる。しかしながら、ＰＮＡＴ₁₀ −ＬysＮＨ₂ ３．２μＭの存在下では、生成物は、生成されない（レーン３〜５）。ＰＮＡＴ₁₀−ＬysＮＨ₂は、pＣＫＳ対照プラスミド（レーン１）からの予想された３２９bpフラグメントの増幅を阻害しないので、生成物の不在は、ＰＣＲ反応に対するＰＮＡＴ₁₀−ＬysＮＨ₂の非特異的阻害剤効果に依存しない。したがって、ＰＮＡＴ₁₀−ＬysＮＨ₂が配列特異的方法でその類似した標的ＤＮＡの増幅を防止することができることが判明する。実施例４ＰＮＡおよびＰＣＲプライマー標的部位の相対的な位置が阻害に影響を及ぼさずに変化されうることの実証この実施例は、ＰＮＡ標的部位がＰＣＲ領域の中央に位置するか（１）、ＰＣＲプライマー部位に直接隣接する位置にあるか（２）、あるいは、ＰＣＲプライマー部位の１つと重複する（３）場合に得られる影響を示す。これら３つの場合における阻害の基本的なメカニズム間には基本的な差異がある。ＰＮＡ標的部位がＰＣＲプライマー部位から少し離れて位置する場合、阻害は、ポリメラーゼによる読み過ごしを防止することによって操作されることが予想される。反対に、ＰＮＡおよびＰＣＲプライマー標的部位が重複している場合、阻害は、プライマー排除によって操作されることが予想される。最後に、ＰＮＡ標的がＰＣＲプライマー部位に隣接して位置する場合、阻害は、ＰＣＲプライマーへのポリメラーゼアクセスを防止することによって、および／または、プライマー伸長の開始を防止することによって操作されると思われる。３つの全ての場合、有効な阻害は、第４図に示すとおり、ＰＮＡＴ₁₀−ＬysＮＨ₂を用いて得られる。この実施例では、ＰＣＲは、各操作において、「フォワードプライマー」、「ＳＫプライマー」および「Ａ１０プライマー」と称される３種類のフォワードプライマーを使用して行われる。これらは、フォワードプライマー（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）、Ｔ１０プライマー（５’−ＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ）およびＳＫプライマー（５’−ＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣ）である。この実施例で使用されるプラスミドpＴ１０ＫＳ（詳細は、実施例２を参照）において、フォワードプライマー標的部位の３’−末端は、Ａ１０標的の１０１bp下流に位置しており、ＳＫプライマーの３’−末端は、Ａ１０標的のすぐ下流に位置しており、Ａ１０プライマーは、各々、５’−および３’−側に５および１bpを含むＡ１０標的部位をスパンする。レーン１−２：ＰＮＡ−Ｔ₁₀− ＬysＮＨ₂の不在下（１）または３．２μＭの存在下（２）でリバースおよびフォワードブライマーを用いたｐＴ１０ＫＳプラスミドの増幅を示す。レーン３および４：ＰＮＡＴ₁₀−ＬysＮＨ₂の不在下（３）または３．２μＭの存在下（２）でリバースおよびＳＫプライマーを用いるpＴ１０ＫＳの増幅を示す。レーン７および８：ＰＮＡＴ₁₀−ＬysＮＨ₂の不在下（７）または３．２μＭの存在下（８）でリバースおよびＴ１０プライマーを用いるpＴ１０ＫＳプラスミドの増幅を示す。ＰＣＲサイクル条件は、９６℃、２分−５５℃、３分−３５℃、１分−６５℃、２分−３５サイクルであった。ＰＮＡＴ₁₀ＬysＮＨ₂は、幅広く間隔があいたＰＮＡおよびＰＣＲプライマー標的部位（レーン２）、隣接するＰＮＡおよびＰＣＲプライマー標的部位（レーン４）および重複ＰＮＡおよびＰＣＲブライマー標識部位（レーン８）を用いて鋳型からＰＣＲ生成物の形成を防止する。実施例５ＰＣＲ反応は、一般に、１つのプライマーに対して相補的なＰＮＡの不在下および存在下で、実施例２の記載と同様に行った。結果を第５図に示す。レーン１では、予想されたＰＣＲ生成物が見られる。レーン２では、ＰＣＲ反応が完全に阻害されることを示す。実施例は、プライマー１として「Ｍ１３プライマー」を、プライマー２としてＧＡＴＣＣＴ₁₀Ｇを使用して行った。標的プラスミドは、pＴ１０ＫＳであった。３０サイクルの各々の第２期で使用される温度は、４０℃に代えて３０℃であった。実施例６混合配列ＰＮＡによるＰＣＲ阻害前記実施例で使用したＰＮＡは、単にピリミジン残基を含有するだけであり、それらの標的配列を用いてトリプレックスを形成することが判明した。したがって、原理の一般性を示すために、標的ＤＮＡを用いて標準的なワトソン−クリックデュプレックスを形成する混合配列ＰＮＡを用いて、一連の実験を行った。第６図には、１つのヌクレオチドによって異なる２つの混合配列ＰＮＡ（ＰＮＡ− Ａ：Ｈ−ＴＴＣＣＧＧＴＴＧＣＣ−ＮＨ₂およびＰＮＡ−Ｂ：Ｇly−ＴＴＣＣＧＧＣＴＧＣＣ−ＮＨ₂）を用いた１つの塩基突然変異分析の実験機構および結果を示す。対応する点突然変異を含有する２つの鋳型（「Ａ」および「Ｂ」）を使用する。３つのオリゴヌクレオチドプライマーは、この実験に含まれる。７５０ bp ＰＣＲフラグメントを生成するフォワードおよびリバースオリゴ対ならびに変性プライマーは、点突然変異を含有する領域に対して指向した。フォワードプライマーと一緒に、変性プライマーは、鋳型としてＡまたはＢ対立因子（allele ）を使用して１５０bpフラグメントを増幅させる。ＰＮＡは、点突然変異を含有する領域に対して指向させられ、したがって、クランピングは、プライマー排除によって操作されると思われる。この実験では、各ＰＣＲ反応（５０μl）は、前記ような２００μＭ dＮＴＰ、１０mＭトリス−ＨＣl、pＨ９．９（２０℃）、５０mＭＫＣl、１．５mＭＭgＣl₂、０．０１％ゼラチン、０．１％トリトンＸ−１００、１Ｕのスーパータグ（supertag）酵素［ストラータジーン(Ｓtratagene)］、対立因子特異的プラスミド１ng、突然変異を含有する領域に対して指向する変性プライマー１０pm ol、フォワードプライマー１０pmol、リバースプライマー１０pmolおよびＰＮＡを含有する。図面において、レーンは、以下のとおりである：レーン１：Ａ−対立因子、ＰＮＡは存在しない。レーン２：Ａ−対立因子および１０μＭＰＮＡ−Ａ。レーン３：Ａ−対立因子および１０μＭＰＮＡ−Ｂ。レーン４：Ｂ−対立因子、ＰＮＡは存在しない。レーン５：Ｂ−対立因子および１０μＭＰＮＡ−Ａ。レーン６：Ｂ−対立因子および１０μＭＰＮＡ−Ｂ。ＰＣＲ条件は、９６℃ １分−６０℃２分−４０℃３０秒−６０℃２分−３０サイクルであった。Ａ−対立因子を鋳型として使用する場合、７５０bp（内部ＰＣＲ対照）および１５０bpフラグメント（対立因子の診断薬）は、共に、ＰＮＡ−Ａの不在下で生成される（レーン１）。しかしながら、反応がＰＮＡ−Ａを含有する場合、７５０bp ＰＣＲ対照フラグメントだけが生成される（レーン２）。これに対して、７５０bpおよび１５０bp ＰＣＲフラグメントは、共に、ＰＮＡ−Ｂの存在下で生成される（レーン３）。鋳型をＢ−対立因子に変えると、結果は逆である。したがって、ＰＮＡ−Ｂの存在は、１５０bpフラグメントの生成を阻害し（レーン６）、ＰＮＡ−Ａの存在は、阻害しない（レーン５）。したがって、本発明者らは、両方の混合配列ＰＮＡ（ＡおよびＢ）は、点突然変異精度でそれらの類似するＰＣＲ生成物を阻害することができると推論する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (71)出願人ベアウ，ロルフ・ヘンリクデンマーク国デーコー―2000フレデリクスベアウ、ランゲランズヴァイ20ベー番、トレジエ・チル・ヘイア (72)発明者ブシャート，オーレデンマーク国デーコー―3500ヴェアレーセ、セナガーズヴァイ73番 (72)発明者エグホルム，ミカエルデンマーク国デーコー―2000フレデリクスベアウ、シンズヴィーレヴァイ５番、トレジエ・チル・ヴェンストレ (72)発明者ニールセン，ペーター・エイギルデンマーク国デーコー―2980コケダール、ヒョアテヴェンゲット509番 (72)発明者ベアウ，ロルフ・ヘンリクデンマーク国デーコー―2000フレデリクスベアウ、ランゲランズヴァイ20ベー番、トレジエ・チル・ヘイア (72)発明者スタンリィ，クリストファー・ジョンイギリス国ケンブリッジシャー・ピーイー 17・４ジェイビー、ハンチングドン、セイント・アイヴズ、クロムウエル・プレイス、12アー番

Claims

【特許請求の範囲】１．二本鎖標的核酸の各鎖が、鋳型に対して相補的な第２鋳型を形成するために伸長または連結される１つ以上のプライマーについて鋳型として使用される領域を有しており、該鋳型または該プライマーの配列に対して、該配列とハイブリダイズするのに充分に相補的な核酸類似物を供給し、該核酸類似物が、該方法の条件下でプライマー鋳型ハイブリダイゼーションを阻害するか、または、プライマー伸長もしくはプライマー連結を阻害するのに充分に強く個々の鋳型またはプライマーにハイブリダイズすることを特徴とする核酸増幅方法を阻害する方法。２．増幅方法がＰＣＲまたはＬＣＲ法である請求項１記載の方法。３．増幅方法が核酸類似物の不在下で行われて、所望のレベルの増幅生成物が構築され、次いで、核酸類似物が添加される請求項１または２記載の方法。４．核酸類似物を増幅生成物にハイブリダイズさせる請求項３記載の方法。５．汚染として存在する増幅生成物に核酸類似物をハイブリダイズさせるために、該タイプの増幅方法において使用されるべき装置を該核酸類似物を含有する溶液で処理し、次いで、該装置を洗浄し、増幅方法において使用し、該方法における、装置中に汚染として最初に存在する増幅生成物の増幅を該類似物へのハイブリダイゼーションによって防止する請求項１または２記載の方法。６．次の増幅方法の条件下で安定なハイブリッドを形成する核酸類似物を核酸増幅生成物にハイブリダイズさせることを特徴とする、核酸増幅生成物が次の増幅方法で鋳型として供されることを防止する方法。７．増幅生成物を用いて、次の増幅方法の条件下で安定なハイブリッドを形成する核酸類似物で環境を処理することを特徴とする、環境中に存在する核酸増幅生成物が次の増幅方法で核酸に対する汚染鋳型として供されることを防止する方法。８．標的核酸配列の存在または不在を検出する方法であって、該標的配列が存在する場合に位置する該核酸のその部分を含む鋳型として使用される領域を有する二本鎖核酸の各鎖が、１つ以上のプライマーの該鋳型へのハイブリダイゼーションおよび鋳型に対して相補的な第２鋳型を形成するための該プライマーの伸長もしくは連結によって増幅される増幅方法を行うことからなり、標的配列に対して相補的な核酸類似物を供給し、標的配列が存在する場合に増幅方法を阻害するのに充分に強く鋳型とハイブリダイズすることを特徴とする検出方法。９．同一のプライマーを使用して一連のＰＣＲ増幅方法を行い、各方法において、複数の配列の各々１つに対して相補的な各核酸類似物を供給して、それとハイブリダイズさせて、各配列が存在する場合に該増幅方法を阻害することによって、次に、一対のプライマー結合部位間の標的核酸配列内の複数の配列の各々の存在または不在を検出する請求項８記載の方法。１０．対照として、増幅によって標的配列の増幅生成物とは異なる生成物を生じせしめる同一プライマーを使用する増幅方法による増幅能力を有する第２核酸基質を含む請求項８または９記載の方法。１１．二本鎖標的核酸の各鎖が、伸長して鋳型に対して相補的な第２鋳型を形成するプライマーに対する鋳型として使用される領域を有しており、多数の増幅サイクルの後、反応条件下で該プライマーをその標的にハイブリダイズさせることを阻害するのに充分強くプライマーの１つにハイブリダイズする核酸類似物を添加することを特徴とする非対称的核酸増幅方法を行う方法。１２．ハイブリダイゼーション条件下で、プライマー部位またはプライマー部位から下流でプライマーまたは鋳型と安定なハイブリッドを形成する核酸類似物を供給することを特徴とする、核酸鋳型にハイブリダイズさせたプライマーのポリメラーゼ媒介伸長を阻害する方法。１３．実質的に、前記実施例のうちいずれか１つに記載されているＰＣＲ反応阻害方法。１４．増幅についての複数のプライマーおよび該プライマーのうちの１つにおける配列または該増幅反応において該プライマーを使用して増幅されるべき標識核酸配列に対して相補的な配列を有する少なくとも１つの核酸類似物からなることを特徴とする核酸増幅反応用キット。１５．さらに、プライマーの伸長または連結を生ずるための増幅反応で使用されるポリメラーゼまたはリガーゼからなる請求項１４記載のキット。１６．さらに、リバーストランスクリプターゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよびヌクレアーゼのうち１つ以上を含む請求項１４記載のキット。１７．さらに、ヌクレオチドを含む請求項１４〜１６のいずれか１項記載のキット。１８．標識ヌクレオチドを含む請求項１７記載のキット。１９．さらに、バッファー、塩、安定化剤および核酸認識剤のうち１つ以上を含む請求項１４〜１８のいずれか１項記載のキット。２０．さらに、核酸増幅反応のものとは異なる増幅生成物を生成するためにプライマーを使用する増幅のための鋳型を含む正の対照実験を行うための試薬を含む請求項１４〜１９のいずれか１項記載のキット。２１．さらに、核酸配列決定試薬を含む請求項１４〜２０のいずれか１項記載のキット。２２．ハイブリダイゼーション条件下で、増幅方法でプライマーまたは鋳型として作動する核酸を妨害するのに充分に強く、存在する場合に相補的配列の対応する核酸にハイブリダイズする能力を有する核酸類似物の混合物からなることを特徴とする核酸増幅方法をできなくする際に使用される試薬。２３．混合物が異なる様々な配列の核酸類似物分子を含有する請求項２２記載の試薬。２４．配列がランダムである請求項２３記載の試薬。