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WO2011104758A1 - 二本鎖ｄｎａ中の標的配列を増幅する方法 - Google Patents

二本鎖ｄｎａ中の標的配列を増幅する方法 Download PDF

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WO2011104758A1
WO2011104758A1 PCT/JP2010/001297 JP2010001297W WO2011104758A1 WO 2011104758 A1 WO2011104758 A1 WO 2011104758A1 JP 2010001297 W JP2010001297 W JP 2010001297W WO 2011104758 A1 WO2011104758 A1 WO 2011104758A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequence
target sequence
nucleic acid
amplified
stranded
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/001297
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
林美穂
夜久英信
Original Assignee
パナソニック株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by パナソニック株式会社 filed Critical パナソニック株式会社
Priority to JP2012501526A priority Critical patent/JP4960536B2/ja
Priority to CN2010800626937A priority patent/CN102741429A/zh
Priority to PCT/JP2010/001297 priority patent/WO2011104758A1/ja
Publication of WO2011104758A1 publication Critical patent/WO2011104758A1/ja
Priority to US13/591,918 priority patent/US20120322111A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/113—Modifications characterised by incorporating modified backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/186—Modifications characterised by incorporating a non-extendable or blocking moiety

Definitions

  • the present invention relates to a method for amplifying a target sequence in double-stranded DNA.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the forward primer 4 is composed of a nucleic acid having 5 to 20 bases and is complementary to the 3 'end portion 6c of the single-stranded target sequence 1a.
  • the reverse primer 5 is composed of a nucleic acid having 5 to 20 bases and is complementary to the 3 'end portion of the complementary single-stranded target sequence 1b'. Therefore, forward primer 4 and reverse primer 5 bind to 3 'end portion 6c and 3' end portion 7c, respectively.
  • the amplified double-stranded DNA sequence 2 consists of an amplified single-stranded target sequence 6g that is identical to the single-stranded target sequence 1a and an amplified complementary single-stranded target sequence 7g that is identical to the complementary single-stranded target sequence 1b. .
  • Patent Documents 1 to 3 may be related to the present invention.
  • the forward primer 4 when the first unamplified sequence 6a includes the same sequence 6d as the 3 ′ end portion 6c of the single-stranded target sequence 1a, the forward primer 4 is not limited to the 3 ′ end portion 6c. It also binds to 6d.
  • the forward primer 4 When the first non-amplified sequence 6a includes a sequence 6d similar to the 3 ′ end portion 6c of the single-stranded target sequence 1a, the forward primer 4 erroneously binds not only to the 3 ′ end portion 6c but also to the sequence 6d. obtain.
  • An object of the present invention is to provide an amplification method capable of suppressing the generation of an undesired amplified double-stranded DNA sequence 3.
  • the present invention for solving the above problems is a method for amplifying a double-stranded target sequence in a double-stranded DNA comprising a first single-stranded DNA and a second single-stranded DNA
  • the double-stranded target sequence consists of a single-stranded target sequence (1a) and a complementary single-stranded target sequence (1b)
  • the first single-stranded DNA consists of 3 ′ end—first unamplified sequence (6a) —the single stranded target sequence (1a) —second unamplified sequence (6b) —5 ′ end
  • the second single-stranded DNA consists of 5 ′ end-third non-amplified sequence (7a) -complementary single-stranded target sequence (1b) -fourth non-amplified sequence (7b) -3 ′ end
  • the complementary single-stranded target sequence (1b), the third non-amplified sequence (7a), and the fourth non-amplified sequence (7b) are respectively the single-
  • the method DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphate, the double-stranded DNA (6 ⁇ 7), forward primer, reverse primer, and first block nucleic acid (20) are mixed, and the double-stranded target sequence is mixed using polymerase chain reaction.
  • the forward primer and the reverse primer both act as starting points for the extension reaction by the DNA polymerase,
  • the forward primer is complementary to a portion of the 3 ′ terminal sequence contained in the single-stranded target sequence (1a);
  • the reverse primer is complementary to the sequence of the portion on the 3 ′ end side contained in the complementary single-stranded target sequence (1b);
  • the first block nucleic acid (20) does not act as a starting point for the extension reaction by the DNA polymerase,
  • the first block nucleic acid (20) is complementary to a part of the third non-amplified sequence (7a).
  • Diagram showing conventional PCR Diagram showing PCR according to the present invention The figure which shows PCR concerning this invention following FIG.
  • the figure which shows PCR concerning this invention following FIG. The figure which shows PCR concerning this invention following FIG.
  • the figure which shows PCR concerning this invention following FIG. Diagram showing conventional PCR
  • the figure which shows conventional PCR following FIG. The figure which shows conventional PCR following FIG.
  • the figure which shows conventional PCR following FIG. The figure which shows conventional PCR following FIG.
  • the figure which shows conventional PCR following FIG. The figure which shows conventional PCR following FIG.
  • the graph which shows the result at the time of electrophoresis in Example 1 The graph which shows the result at the time of the electrophoresis in the comparative example 1 Graph comparing the concentration of non-specific amplification products in Example 1 and Comparative Example 1
  • the graph which shows the result at the time of the electrophoresis in Example 2 The graph which shows the result at the time of the electrophoresis in the comparative example 2
  • concentration of the nonspecific amplification product in Example 2 and Comparative Example 2 The graph which shows the result at the time of electrophoresis in Example 3
  • the graph which shows the result at the time of the electrophoresis in the comparative example 3 The graph which compared the density
  • the present invention is characterized by adding a first block nucleic acid 20 in amplifying the double stranded target sequence 1 using the polymerase chain reaction.
  • the first block nucleic acid 20 does not act as a starting point for the extension reaction by the DNA polymerase.
  • the block nucleic acid is a synthetic oligonucleic acid.
  • Examples of the first block nucleic acid 20 are modified DNA, modified Locked Nucleic Acid (hereinafter “LNA”), and peptide nucleic acid (hereinafter “PNA”).
  • LNA lockeded Nucleic Acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • Nucleic acids are biopolymers in which nucleotides composed of sugars, phosphate groups, and bases are linked by phosphate ester bonds.
  • the OH group at the 3-position of the sugar contained in the nucleotide located at the 3 ′ end of the modified DNA and LNA is substituted or modified with hydrogen, phosphate group, amino group, biotin group, thiol group, or derivatives thereof. ing. PNA does not require this modification.
  • the reverse primer 5 is complementary to the 3 'end portion of the complementary single-stranded target sequence 1b. Therefore, as shown in FIG. 2, the reverse primer 5 binds to the part.
  • the DNA extends from the 3 ′ end of the forward primer 4 and the 3 ′ end of the reverse primer 5, and the first replication sequence 6e1, the second replication sequence 7e, and the third replication sequence 6e2 is formed.
  • the first replication sequence 6e1 is complementary to a sequence formed by continuously connecting the single-stranded target sequence 1a and the second non-amplified sequence 6b.
  • the third replication sequence 6e2 is complementary to a sequence formed by continuously connecting a part of the first unamplified sequence 6a, the single-stranded target sequence 1a, and the second unamplified sequence 6b. Is.
  • Block nucleic acid 20 stops DNA extension of reverse primer 5. Therefore, the second replication sequence 7e is complementary to a sequence formed by continuously connecting the complementary single-stranded target sequence 1b and a part of the third non-amplified sequence 7a. However, the second replication sequence 7e does not include the sequence 7h complementary to the sequence on the 5 'end side from the portion of the second single-stranded DNA 7 to which the block nucleic acid 20 is bound.
  • the forward primer 4 binds to the first single-stranded DNA sequence 6 and the second replication sequence 7e as shown in FIG.
  • the reverse primer 5 binds to the second single-stranded DNA sequence 7, the first replication sequence 6e1, and the third replication sequence 6e2.
  • the block nucleic acid 20 also binds to the third non-amplified sequence 7a and the third replication sequence 6e2.
  • the DNA extends from the 3 ′ ends of the two forward primers 4 to form the first replication sequence 6e1 and the amplified complementary single-stranded target sequence 7g.
  • DNA is extended from the 3 'ends of the three reverse primers 5, and one amplified single-stranded target sequence 6g and two second replication sequences 7e are formed.
  • the amplified single-stranded target sequence 6g and the amplified complementary single-stranded target sequence 7g are the same as the single-stranded target sequence 1a and the complementary single-stranded target sequence 1b, respectively.
  • the first replication sequence 6e1 is formed from the first single-stranded DNA sequence 6 and the forward primer 4.
  • An amplified single-stranded target sequence 6g is formed from the first replication sequence 6e1 and the reverse primer 5.
  • a second replication sequence 7e is formed from the second replication sequence 6e2 and the reverse primer 5.
  • a second replication sequence 7e is formed from the second single-stranded DNA sequence 7 and the reverse primer 5.
  • An amplified complementary single-stranded target sequence 7g is formed from the second replication sequence 7e and the forward primer 4.
  • FIG. 6 When PCR is further advanced, as shown in FIG. 6, not only the sequence formed in FIG. 5 but also the amplified single-stranded target sequence from the amplified single-stranded target sequence 6g and forward primer 4 in one cycle.
  • An array 7g is formed.
  • An amplified single-stranded target sequence 6g is also formed from the amplified complementary single-stranded target sequence 7g and the reverse primer 5.
  • FIG. 7 shows a conventional PCR that does not use the block nucleic acid 20.
  • the forward primer 4 is complementary to the 3 'end portion 6c of the single-stranded target sequence 1a. Therefore, as shown in FIG. 7, the forward primer 4 is bound to the 3 'end portion 6c. Furthermore, when the first non-amplified sequence 6a includes a sequence 6d that is the same as or similar to the 3'-end portion 6c, the forward primer 4 can bind not only to the portion 6c but also to the sequence 6d.
  • a second replication sequence 7e2 is formed.
  • the second replication sequence 7e2 includes not only the 3 'end portion 6c but also the sequence 6d.
  • the forward primer 4 binds to the second replication sequence 7e2 as shown in FIG. At this time, the forward primer 4 binds not only to the portion 6c included in the second replication sequence 7e2, but also to the sequence 6d.
  • the present invention can suppress the generation of undesired amplified double-stranded DNA sequence 3.
  • the sequence 100 on the 5 ′ end of the block nucleic acid 20 and the 5 ′ end side of the complementary target sequence 1b is preferably 0 bases or more and 20 bases or less. This is because it is highly undesirable for the sequence 100 to contain a sequence 6d that is identical or similar to the 3 'end portion 6c of the single-stranded target sequence 1a. That is, if sequence 100 includes sequence 6d, forward primer 4 can mistakenly bind to sequence 6d and form an undesired amplified double-stranded DNA sequence 3, as shown in FIG.
  • DNA polymerases used in the present invention are Taq DNA Polymerase and Pfu DNA Polymerase.
  • the DNA polymerase preferably has no 5 '-> 3' exonuclease activity.
  • Deoxynucleoside triphosphate is a mixture of deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxythymidine triphosphate (dTTP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP), and deoxycytidine triphosphate (dCTP).
  • dATP deoxyadenosine triphosphate
  • dTTP deoxythymidine triphosphate
  • dGTP deoxyguanosine triphosphate
  • dCTP deoxycytidine triphosphate
  • Example 1 shows an example of amplifying the Exon6 region of a human ABO blood group gene.
  • Table 1 shows the sequences of forward primer 4 (hereinafter “ABO-F”) and reverse primer 5 (hereinafter “ABO-R”).
  • Table 2 shows the sequence of the block nucleic acid 20 (hereinafter “ABO-Block”).
  • a pair of primers consisting of ABO-F and ABO-R amplifies a target sequence of 135 base pairs of an AB subject in the ABO blood group gene.
  • ABO-Block consists of a 21 base sequence complementary to the 19th to 39th bases counted from the 3 'end side of the third non-amplified sequence 7a. This part is the 201st to 221nd base sequences counted from the 3 'end side of the second single-stranded DNA 7.
  • the sugar at position 3 contained in the nucleotide at the 3 'end of ABO-Block is modified by phosphorylation.
  • Genomic DNA was extracted from 100 ⁇ L of AB subject's blood using DNA Micro Kit (manufactured by QIAGEN) to prepare 10 ng / ⁇ L of template DNA.
  • PCR reaction solution is as follows.
  • FIG. 12 shows the results of electrophoresis. As is clear from FIG. 12, only the target sequence consisting of 135 base pairs was specifically amplified, and non-specific amplification did not occur. Marker in FIG. 3 is a DNA Marker attached to the electrophoresis kit.
  • Comparative Example 1 A PCR reaction was carried out in the same manner as in Example 1 except that the block nucleic acid in the reaction solution in Example 1 was replaced with distilled water.
  • FIG. 13 shows the result of electrophoresis of Comparative Example 1.
  • FIG. 14 is a graph showing the total concentration of non-specific amplification products calculated from the analysis results of electrophoresis in Example 1 and Comparative Example 1.
  • non-specific amplification of 16.15 ng / ⁇ L occurs in Comparative Example 1.
  • Example 1 nonspecific amplification could be completely suppressed. This is considered to be a synergistic effect obtained by suppressing nonspecific amplification. That is, the consumption of extra reagents can be suppressed, and the target sequence can be preferentially amplified by increasing the ratio of the target sequence in the reaction solution.
  • the block nucleic acid 20 contributes to the efficient amplification of the target sequence.
  • Example 2 shows an example in which a region of exon 12 of human acetaldehyde dehydrogenase 2 gene is amplified.
  • Table 3 shows the sequences of forward primer 4 (hereinafter “ALDH2-F”) and reverse primer 5 (hereinafter “ALDH2-R”).
  • Table 4 shows the sequence of the block nucleic acid 20 (hereinafter “ALDH2-Block”).
  • a target sequence consisting of 155 base pairs in the acetaldehyde dehydrogenase 2 gene is amplified by a pair of primers consisting of ALDH2-F and ALDH2-R.
  • Genomic DNA was extracted from 100 ⁇ L of human blood using DNA Micro Kit (manufactured by QIAGEN) to prepare 10 ng / ⁇ L of template DNA.
  • PCR reaction solution is as follows.
  • PCR amplification with the following thermal profiles: 1 cycle at 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 1 second (for denaturation), 58 ° C for 1 second (for annealing) and 72 ° C for 1 second (for DNA extension) ) For 30 cycles.
  • FIG. 15 shows the results of electrophoresis. As is apparent from FIG. 15, a target sequence consisting of 155 base pairs is efficiently amplified.
  • Comparative Example 2 A PCR reaction was carried out in the same manner as in Example 1 except that the block nucleic acid in the reaction solution in Example 2 was replaced with distilled water.
  • FIG. 16 shows the result of electrophoresis of Comparative Example 2.
  • Example 3 In this example, a human dystrophin gene is amplified.
  • Table 5 shows the sequences of forward primer 4 (hereinafter “Dys-F”) and reverse primer 5 (hereinafter “Dys-R”).
  • Dys-Block-1 consists of a 26 base sequence complementary to the 40th to 65th bases counted from the 3 'end of the third non-amplified sequence 7a.
  • Dys-Block-2 consists of a 25 base sequence complementary to the 222nd to 246th bases counted from the 3 'end of the second non-amplified sequence 6b.
  • the 3rd-position sugars contained in the 3 ′ terminal nucleotides of Dys-Block-1 and Dys-Block-2 are both modified by phosphorylation.
  • Genomic DNA was extracted from 100 ⁇ L of human blood using DNA Micro Kit (manufactured by QIAGEN) to prepare 10 ng / ⁇ L of template DNA.
  • PCR reaction solution is as follows.
  • PCR amplification with the following thermal profiles: 1 cycle at 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 1 second (for denaturation), 54 ° C for 1 second (for annealing) and 72 ° C for 1 second (for DNA extension) ) For 50 cycles.
  • FIG. 18 shows the results of electrophoresis. As is apparent from FIG. 18, a target sequence of 147 bp was efficiently amplified.
  • Example 3 A PCR reaction was carried out in the same manner as in Example 1 except that the block nucleic acid in the reaction solution in Example 3 was replaced with distilled water.
  • FIG. 19 shows the result of electrophoresis of Comparative Example 3.
  • FIG. 20 is a graph showing the total concentration of non-specific amplification products calculated from the analysis results of electrophoresis in Example 3 and Comparative Example 3. As is clear from FIG. 20, in Comparative Example 3, nonspecific amplification of 26.93 ng / ⁇ L occurs. On the other hand, in Example 3, the sum is reduced to only 5.97 ng / ⁇ L. This indicates that the first block nucleic acid 20 and the second block nucleic acid 30 contribute to efficient amplification of the target sequence, as in Example 1 and Example 2.
  • the present invention can be used for general PCR reactions.
  • the present invention can also be used for PCR for clinical examination.
  • Double-stranded target sequence 1a Single-stranded target sequence 1b Complementary single-stranded target sequence 2 Desired amplified double-stranded DNA sequence 3 Undesired amplified double-stranded DNA sequence 3a Undesired amplified single-stranded DNA 3b Undesired amplified complementary single-stranded DNA 4 Forward primer 5 Reverse primer 6 First single-stranded DNA 6a First non-amplified sequence 6b Second non-amplified sequence 6c 3 ′ end portion of single-stranded target sequence 1a 6e1 First replicating sequence 6e2 Third replicating sequence 6g Amplified single-stranded target sequence 7 Second single-stranded DNA 7a 3rd non-amplified sequence 7b 4th non-amplified sequence 7c 3 'terminal part of complementary single-stranded target sequence 1b 7e 2nd replication sequence 7e2 2nd replication sequence 7g Amplified complementary single-stranded target sequence 20 1st block nucleic acid 30 Second block
  • SEQ ID NO: 1 Forward primer for amplifying human ABO blood group gene as target sequence
  • SEQ ID NO: 2 Reverse primer for amplifying human ABO blood group gene as target sequence
  • SEQ ID NO: 3 Target sequence Oligonucleic acid (DNA) to suppress non-specific amplification other than
  • SEQ ID NO: 4 Forward primer for amplifying human acetaldehyde dehydrogenase 2 gene as a target sequence
  • SEQ ID NO: 5 Reverse primer for amplifying human acetaldehyde dehydrogenase 2 gene as a target sequence
  • SEQ ID NO: 6 Non-specific other than the target sequence Oligonucleic acid (DNA) to suppress general amplification
  • SEQ ID NO: 7 Forward primer for amplifying human dystrophin gene as target sequence
  • SEQ ID NO: 8 Reverse primer for amplifying human dystrophin gene as target sequence
  • SEQ ID NO: 9 Suppressing non-specific amplification other than the target sequence Oligonucleic acid (DNA) for

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Abstract

　ＰＣＲ法において非特異的増幅を抑制する方法を提供する。　フォワードプライマーとリバースプライマーにより鋳型二本鎖ＤＮＡ中の所望の標的配列を増幅するＰＣＲ法であって、前記ＰＣＲ溶液中に、前記鋳型二本鎖ＤＮＡのうち、前記フォワードプライマーが結合する方の一本鎖ＤＮＡに結合し、その結合位置が前記フォワードプライマーより３'側下流であり、かつ標的配列の外側である、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の起点とならないオリゴ核酸Ａと、前記鋳型二本鎖ＤＮＡのうち、前記リバースプライマーが結合する方の一本鎖ＤＮＡに結合し、その結合位置が前記リバースプライマーより３'側下流であり、かつ標的配列の外側である、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の起点とならないオリゴ核酸Ｂとの少なくともいずれか一方を含み、ＰＣＲを行なうことを特徴とするＰＣＲ法。

Description

二本鎖ＤＮＡ中の標的配列を増幅する方法
　本発明は、二本鎖ＤＮＡ中の標的配列を増幅する方法に関する。
　図１に示されるポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」という）は、第１一本鎖ＤＮＡ６および第２一本鎖ＤＮＡ７からなる二本鎖ＤＮＡに含まれる標的配列１を増幅する代表的な方法である。
　以下、図１を参照しながらＰＣＲ法を簡単に説明する。
　第１一本鎖ＤＮＡ６は、３’末端－第１非増幅配列６ａ－一本鎖標的配列１ａ－第２非増幅配列６ｂ－５’末端からなる。第２一本鎖ＤＮＡ７は、５’末端－第３非増幅配列７ａ－相補的一本鎖標的配列１ｂ－第４非増幅配列７ｂ－３’末端からなる。相補的一本鎖標的配列１ｂ、第３非増幅配列７ａ、および第４非増幅配列７ｂは、それぞれ、一本鎖標的配列１ａ、第１非増幅配列６ａ、および第２非増幅配列６ｂと相補的である。
　まず、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、二本鎖ＤＮＡ１、フォワードプライマー４、およびリバースプライマー５を混合して混合液を調製する。
　フォワードプライマー４は５～２０塩基を有する核酸からなり、かつ一本鎖標的配列１ａの３’末端部分６ｃに相補的である。リバースプライマー５は５～２０塩基を有する核酸からなり、かつ相補的一本鎖標的配列１ｂ’の３’末端部分に相補的である。そのため、フォワードプライマー４およびリバースプライマー５は、それぞれ、３’末端部分６ｃおよび３’末端部分７ｃに結合する。
　次に、当該混合液は９４℃～１００℃で１秒から１００秒間加熱され、その後、５０～７０℃で１秒から１００秒間冷却される。加熱および冷却を繰り返し、増幅二本鎖ＤＮＡ配列２を得る。増幅二本鎖ＤＮＡ配列２は、一本鎖標的配列１ａと同一である増幅一本鎖標的配列６ｇおよび相補的一本鎖標的配列１ｂと同一である増幅相補的一本鎖標的配列７ｇからなる。
　特許文献１から３は、本発明と関連し得る。
特開平５－１９９９００号公報 特表２００３－５３４７７２号公報 特表平３－５０８６３６号公報（特に第３図、第１２図）
　図１に示すように、第１非増幅配列６ａが一本鎖標的配列１ａの３’末端部分６ｃと同一の配列６ｄを含む場合、フォワードプライマー４は、３’末端部分６ｃだけでなく当該配列６ｄにも結合する。第１非増幅配列６ａが一本鎖標的配列１ａの３’末端部分６ｃと類似の配列６ｄを含む場合、フォワードプライマー４は、３’末端部分６ｃだけでなく当該配列６ｄにも誤って結合し得る。
　そのため、得られる増幅二本鎖ＤＮＡ配列は、望まれる増幅二本鎖ＤＮＡ配列２だけでなく、望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３をも含む。当該増幅二本鎖ＤＮＡ配列３は、非特異的増幅の結果物であり、望まれない増幅一本鎖ＤＮＡ３ａおよび増幅相補的一本鎖ＤＮＡ３ｂからなる。
　本発明の目的は、望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３の発生を抑制することができる増幅方法を提供することである。
　上記課題を解決する本発明は、第１一本鎖ＤＮＡおよび第２一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列を増幅する方法であって、
　前記二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
　前記第１一本鎖ＤＮＡは、３’末端－第１非増幅配列（６ａ）－前記一本鎖標的配列（１ａ）－第２非増幅配列（６ｂ）－５’末端からなり、
　前記第２一本鎖ＤＮＡは、５’末端－第３非増幅配列（７ａ）－前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）－第４非増幅配列（７ｂ）－３’末端からなり、
　前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、第３非増幅配列（７ａ）、および第４非増幅配列（７ｂ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ｂ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、および第２非増幅配列（６ｂ）と相補的であり、
　前記方法は、
　ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、フォワードプライマー、リバースプライマー、および第１ブロック核酸（２０）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記二本鎖標的配列を増幅する工程Ａ、
　ここで、
　前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーは、いずれも、前記ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用し、
　前記フォワードプライマーは、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列の部分に相補的であり、
　前記リバースプライマーは、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の部分の配列に相補的であり、
　前記第１ブロック核酸（２０）は、前記ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用せず、
　前記第１ブロック核酸（２０）は、前記第３非増幅配列（７ａ）の一部と相補的である。
　望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３の発生が抑制される。
従来のＰＣＲを示す図 本発明に係るＰＣＲを示す図 図２に続く、本発明に係るＰＣＲを示す図 図３に続く、本発明に係るＰＣＲを示す図 図４に続く、本発明に係るＰＣＲを示す図 図５に続く、本発明に係るＰＣＲを示す図 従来のＰＣＲを示す図 図７に続く、従来のＰＣＲを示す図 図８に続く、従来のＰＣＲを示す図 図９に続く、従来のＰＣＲを示す図 図１０に続く、従来のＰＣＲを示す図 実施例１における電気泳動時の結果を示すグラフ 比較例１における電気泳動時の結果を示すグラフ 実施例１および比較例１における非特異的増幅産物の濃度を比較したグラフ 実施例２における電気泳動時の結果を示すグラフ 比較例２における電気泳動時の結果を示すグラフ 実施例２および比較例２における非特異的増幅産物の濃度を比較したグラフ 実施例３における電気泳動時の結果を示すグラフ 比較例３における電気泳動時の結果を示すグラフ 実施例３および比較例３における非特異的増幅産物の濃度を比較したグラフ
　以下、本発明の方法を図２～図１１を参照しながら説明する。
　（実施の形態）
　本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて二本鎖標的配列１を増幅する際に、第１ブロック核酸２０を加えることによって特徴付けられる。
　第１ブロック核酸２０は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用しない。好ましくは、ブロック核酸は合成オリゴ核酸である。
　第１ブロック核酸２０の例は、修飾されたＤＮＡ、修飾されたＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（以下、「ＬＮＡ」）、およびペプチド核酸（以下、「ＰＮＡ」）である。
　核酸は、糖、リン酸基、および塩基から構成されるヌクレオチドがリン酸エステル結合で連なった生体高分子である。修飾されたＤＮＡおよびＬＮＡの３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基は、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されている。ＰＮＡは当該修飾を必要としない。
　フォワードプライマー４は、一本鎖標的配列１ａの３’末端部分６ｃに相補的である。そのため、図２に示すように、当該３’末端部分６ｃにフォワードプライマー４は結合する。さらに、フォワードプライマー４は、第１非増幅配列６ａに含まれ、一本鎖標的配列１ａと同一または類似の配列６ｄにも結合し得る。
　リバースプライマー５は、相補的一本鎖標的配列１ｂの３’末端部分に相補的である。そのため、図２に示すように、当該部分にリバースプライマー５は結合する。
　ブロック核酸２０は、第３非増幅配列７ａの一部と相補的である。そのため、図２に示すように、ブロック核酸２０は、第３非増幅配列７ａの当該一部と結合する。
　ＰＣＲを開始すると、図３に示すように、フォワードプライマー４の３’末端およびリバースプライマー５の３末端’からＤＮＡが伸長し、第１複製配列６ｅ１、第２複製配列７ｅ、および第３複製配列６ｅ２を形成する。
　第１複製配列６ｅ１は、一本鎖標的配列１ａと第２非増幅配列６ｂとを連続的につなげることによって形成された配列に相補的である。第３複製配列６ｅ２は、第１非増幅配列６ａの一部と一本鎖標的配列１ａと第２非増幅配列６ｂとを連続的に繋（つな）げることによって形成された配列に相補的である。
　ブロック核酸２０は、リバースプライマー５のＤＮＡ伸長を停止する。従って、第２複製配列７ｅは、相補的一本鎖標的配列１ｂと第３非増幅配列７ａの一部とを連続的につなげることによって形成された配列に相補的である。しかし第２複製配列７ｅは、ブロック核酸２０が結合した第２一本鎖ＤＮＡ７の部分から５’末端側の配列に相補的な配列７ｈを含まない。
　さらにＰＣＲを進めると、図４に示すように、フォワードプライマー４は第１一本鎖ＤＮＡ配列６および第２複製配列７ｅに結合する。リバースプライマー５は、第２一本鎖ＤＮＡ配列７、第１複製配列６ｅ１、および第３複製配列６ｅ２に結合する。ブロック核酸２０も、第３非増幅配列７ａおよび第３複製配列６ｅ２に結合する。
　その後、図５に示すように、２つのフォワードプライマー４の３’末端からＤＮＡが伸長し、第１複製配列６ｅ１および増幅相補的一本鎖標的配列７ｇが形成される。３つのリバースプライマー５の３’末端からＤＮＡが伸長し、１本の増幅一本鎖標的配列６ｇおよび２本の第２複製配列７ｅが形成される。増幅一本鎖標的配列６ｇおよび増幅相補的一本鎖標的配列７ｇは、それぞれ、一本鎖標的配列１ａおよび相補的一本鎖標的配列１ｂと同一である。
　すなわち、第１一本鎖ＤＮＡ配列６およびフォワードプライマー４から第１複製配列６ｅ１が形成される。第１複製配列６ｅ１およびリバースプライマー５から増幅一本鎖標的配列６ｇが形成される。第２複製配列６ｅ２およびリバースプライマー５から第２複製配列７ｅが形成される。同様に、第２一本鎖ＤＮＡ配列７およびリバースプライマー５から第２複製配列７ｅが形成される。第２複製配列７ｅおよびフォワードプライマー４から増幅相補的一本鎖標的配列７ｇが形成される。
　さらにＰＣＲが進められると、図６に示すように、１回のサイクルで、図５において形成される配列だけでなく、増幅一本鎖標的配列６ｇおよびフォワードプライマー４から増幅相補的一本鎖標的配列７ｇが形成される。増幅相補的一本鎖標的配列７ｇおよびリバースプライマー５から増幅一本鎖標的配列６ｇも形成される。
　ｎ回のサイクルを行った後には、２ｎ個の増幅一本鎖標的配列６ｇおよび増幅相補的一本鎖標的配列７ｇが得られる。一方、望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３は存在しない。これは、言うまでもないが、ブロック核酸２０のためである。
　図２においても、通常のＰＣＲと同様に、二本鎖ＤＮＡをほどいて一本鎖ＤＮＡを得るために温度が上げられ、そしてプライマー４・５を結合させるために温度が下げられる。
　図７は、ブロック核酸２０を用いない従来のＰＣＲを示す。
　フォワードプライマー４は、一本鎖標的配列１ａの３’末端部分６ｃに相補的である。そのため、図７に示すように、当該３’末端部分６ｃにフォワードプライマー４は結合する。さらに、第１非増幅配列６ａが当該３’末端部分６ｃと同一または類似の配列６ｄを含む場合、フォワードプライマー４は、当該部分６ｃだけでなく当該配列６ｄにも結合し得る。
　ＰＣＲを開始すると、図２～図６と異なり、図８に示すように、相補的一本鎖配列１ｂと第３非増幅配列７ａとが連続的につなげることとによって形成された配列と相補的な第２複製配列７ｅ２が形成される。当該第２複製配列７ｅ２は、３’末端部分６ｃだけでなく配列６ｄも含む。
　さらにＰＣＲを進めると、図９に示すように、第２複製配列７ｅ２にフォワードプライマー４が結合する。このとき、フォワードプライマー４は、第２複製配列７ｅ２に含まれる部分６ｃだけでなく配列６ｄにも結合する。
　そのため、図１０に示すように、増幅一本鎖標的配列６ｇおよび増幅相補的一本鎖標的配列７ｇだけでなく、望まれない増幅一本鎖配列３ａおよび望まれない増幅相補的一本鎖配列３ｂまでもが形成されてしまう。そして、ｎ回のサイクルを行うと、２ｎ個の増幅一本鎖標的配列６ｇおよび増幅相補的一本鎖標的配列７ｇだけでなく、２ｎ個の望まれない増幅一本鎖配列３ａおよび望まれない増幅相補的一本鎖配列３ｂも形成されてしまう。
　図２～図６および図７～図１０から理解されるように、ブロック核酸２０が、望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３を形成する望まれない増幅一本鎖配列３ａおよび望まれない増幅相補的一本鎖配列３ｂの形成を阻害する。このように、本発明は望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３の発生を抑制することができる。
　図２に示すように、ブロック核酸２０の５’末端と相補的標的配列１ｂの５’末端側の配列１００は、０塩基以上２０塩基以下であることが好ましい。配列１００が、一本鎖標的配列１ａの３’末端部分６ｃと同一または類似の配列６ｄを含むことは極めて望ましくないからである。すなわち、配列１００が配列６ｄを含む場合、フォワードプライマー４は誤って当該配列６ｄに結合し得、そして図１に示すように、望ましくない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３を形成する。
　図１１に示すように、第２ブロック核酸３０が用いられ得る。当該第２ブロック核酸３０は、第２非増幅配列６ｂの一部と相補的である。第２ブロック核酸３０は、第１ブロック核酸２０と同様、修飾されたＤＮＡ、修飾されたＬＮＡ、またはＰＮＡからなる。
　図２と比較して、図１１に示すように２つのブロック核酸２０・３０は、望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３の発生をより効率的に抑制し得る。
　本発明において用いられるＤＮＡポリメラーゼの一例は、Ｔａｑ　ＤＮＡ　ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびＰｆｕ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅである。ＤＮＡポリメラーゼは５’－＞３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性を有さないことが好ましい。
　デオキシヌクレオシド三リン酸は、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）の混合物である。デオキシヌクレオシド三リン酸は、通常、等量のこれらの４種類を含み、その濃度は２０μＭ～２００μＭである。
　（実施例）
　以下、本発明の実験例を説明する。
　（実施例１）
　実施例１は、ヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子のＥｘｏｎ６の領域を増幅する例を示す。
　表１は、フォワードプライマー４（以下、「ＡＢＯ－Ｆ」）およびリバースプライマー５（以下、「ＡＢＯ－Ｒ」）の配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表２は、ブロック核酸２０（以下、「ＡＢＯ－Ｂｌｏｃｋ」）の配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＡＢＯ－ＦおよびＡＢＯ－Ｒからなる一対のプライマーにより、ＡＢＯ式血液型遺伝子中のＡＢ型被験者の１３５個の塩基対の標的配列が増幅される。
　ＡＢＯ－Ｂｌｏｃｋは、第３非増幅配列７ａの３’末端側から数えて１９～３９番目の塩基に相補的な２１塩基配列からなる。当該部分は、第２一本鎖ＤＮＡ７の３’末端側から数えて２０１番目から２２１番目の塩基配列である。ＡＢＯ－Ｂｌｏｃｋの３’末端のヌクレオチドに含まれる３位の糖はリン酸化によって修飾されている。
　ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＡＢ型被験者の血液１００μLからゲノムＤＮＡを抽出し、１０ｎｇ／μＬの鋳型ＤＮＡを調製した。
　ＰＣＲの反応溶液は、以下の通りである。
　1×ＴＩＴＡＮＩＵＭ　Ｔａｑ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）
　２００μＭ　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ混合物）、
　１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、
　１μＭ ＡＢＯ－Ｆ
　１μＭ　ＡＢＯ－Ｒ
　０．５ｎｇ／μＬのゲノムＤＮＡ、および
　１０μＭ ＡＢＯ－Ｂｌｏｃｋ
　全量：１０μＬ
　ＰＣＲ増幅を、以下のサーマルプロファイル：９５℃で１分間を１サイクル、９５℃で１秒間（変性のため）と６２℃で１秒間（アニールのため）と７２℃で１秒間（ＤＮＡ伸長のため）を５０サイクル、で行った。
　ＰＣＲ反応後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、ＰＣＲ反応物を電気泳動に供した。図１２は電気泳動の結果を示す。図１２から明らかなように、１３５個の塩基対からなる標的配列のみが特異的に増幅され、非特異的な増幅が発生していない。図３中のＭａｒｋｅｒは電気泳動キットに付属されているＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒである。
　（比較例１）
　実施例１における反応溶液のブロック核酸を蒸留水に置換したこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲ反応を実施した。図１３は比較例１の電気泳動の結果を示す。
　図１３より明らかなように、１３５個の塩基対からなる標的配列が増幅されただけでなく１８３個～１２０９個の塩基対からなる２本鎖ＤＮＡが非特異的に増幅されている。
　これは、ブロック核酸２０が非特異的な増幅を抑制することを示す。
　図１４は、実施例１および比較例１において、電気泳動の解析結果から算出された非特異的な増幅産物の濃度の総和を示すグラフである。図１４から明らかなように、比較例１では１６．１５ｎｇ／μＬの非特異的な増幅が起こっている。一方、実施例１では非特異的な増幅を完全に抑制することができた。これは非特異的な増幅を抑制することによって得られる相乗効果であると考えられる。つまり、余分な試薬の消費を抑えることができ、さらに反応溶液中の標的配列の比率が増すことで、標的配列の優先的な増幅が可能となる。このように、ブロック核酸２０は標的配列の効率的な増幅に寄与することが示された。
　（実施例２）
　実施例２は、ヒトのアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ２遺伝子の第１２エクソンの領域を増幅する例を示す。
　表３は、フォワードプライマー４（以下、「ＡＬＤＨ２－Ｆ」）およびリバースプライマー５（以下、「ＡＬＤＨ２－Ｒ」）の配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表４は、ブロック核酸２０（以下、「ＡＬＤＨ２－Ｂｌｏｃｋ」）の配列に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＡＬＤＨ２－ＦおよびＡＬＤＨ２－Ｒからなる一対プライマーによって、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ２遺伝子中の１５５個の塩基対からなる標的配列が増幅される。
　ＡＬＤＨ２－Ｂｌｏｃｋは第３非増幅配列７ａの３’末端側から数えて７７～９７番目の塩基に相補的な２１塩基配列からなる。ＡＬＤＨ２－Ｂｌｏｃｋの３’末端のヌクレオチドに含まれる３位の糖はリン酸化によって修飾されている。
　ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてヒトの血液１００μLからゲノムＤＮＡを抽出し、１０ｎｇ／μＬの鋳型ＤＮＡを調製した。
　ＰＣＲの反応溶液は以下の通りである。
　１×ＬＡ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社製）
　１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　各２００μＭ　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ混合物）
　０．０５Ｕ／１０μＬ　ＬＡ　Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）
　1μＭ　ＡＬＤＨ２－Ｆ
　１μＭ　ＡＬＤＨ２－Ｒ
　０．５ｎｇ／μＬのＤＮＡ、および
　１０μＭ　ＡＬＤＨ２－Ｂｌｏｃｋ
　全量：１０μＬ
　ＰＣＲ増幅を、以下のサーマルプロファイル：９５℃で１分間を１サイクル、９５℃で１秒間（変性のため）と５８℃で１秒間（アニールのため）と７２℃で１秒間（ＤＮＡ伸長のため）を３０サイクル、で行った。
　ＰＣＲ反応後、実施例１と同様にＰＣＲ反応物を電気泳動に供した。図１５は電気泳動の結果を示す。図１５から明らかな通り、１５５個の塩基対からなる標的配列が効率的に増幅されている。
　（比較例２）
　実施例２における反応溶液のブロック核酸を蒸留水に置換したこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲ反応を実施した。図１６は比較例２の電気泳動の結果を示す。
　図１６から明らかなように、１５５ｂｐの標的配列が増幅されただけでなく、６６５～１２５２個の塩基対からなる２本鎖ＤＮＡが非特異的に増幅されている。
　図１７は、実施例２および比較例２において、電気泳動の解析結果から算出された非特異的な増幅産物の濃度の総和を示すグラフである。図１７から明らかなように、比較例２では４．０７ｎｇ／μＬの非特異的な増幅が生じている。一方、実施例２では当該総和はわずか０．６ｎｇ／μＬに減少している。このことは、実施例１と同様、ブロック核酸２０は標的配列の効率的な増幅に寄与することを示す。
　（実施例３）
　本実施例は、ヒトのジストロフィン遺伝子を増幅する例を示す。
　表５は、フォワードプライマー４（以下、「Ｄｙｓ－Ｆ」）およびリバースプライマー５（以下、「Ｄｙｓ－Ｒ」）の配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表６は、第１ブロック核酸２０（以下、「Ｄｙｓ－Ｂｌｏｃｋ－１」）および第２ブロック核酸３０（以下、「Ｄｙｓ－Ｂｌｏｃｋ－２と表記」）の配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　Ｄｙｓ－ＦおよびＤｙｓ－Ｒからなる一対のプライマーによって、ジストロフィン遺伝子中の１４７個の塩基対からなる標的配列が増幅される。
　Ｄｙｓ－Ｂｌｏｃｋ－１は第３非増補配列７ａの３’末端側から数えて４０～６５番目の塩基に相補的な２６塩基配列からなる。Ｄｙｓ－Ｂｌｏｃｋ－２は第２非増補配列６ｂの３’末端側から数えて２２２～２４６番目の塩基に相補的な２５塩基配列からなる。
　Ｄｙｓ－Ｂｌｏｃｋ－１およびＤｙｓ－Ｂｌｏｃｋ－２の３’末端のヌクレオチドに含まれる３位の糖は、いずれもリン酸化によって修飾されている。
　ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてヒトの血液１００μLからゲノムＤＮＡを抽出し、１０ｎｇ／μＬの鋳型ＤＮＡを調製した。
　ＰＣＲの反応溶液は以下の通りである。
　１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ　Ｔａｑ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）
　各２００μＭ　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ混合物）
　１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）
　１μＭ　Ｄｙｓ－Ｆ
　１μＭ　Ｄｙｓ－Ｒ、０．５ｎｇ／μＬのゲノムＤＮＡ
　１０μＭ　Ｄｙｓ－Ｂｌｏｃｋ－１、および
　１０μＭ　Ｄｙｓ－Ｂｌｏｃｋ－２
　全量：１０μＬ
　ＰＣＲ増幅を、以下のサーマルプロファイル：９５℃で１分間を１サイクル、９５℃で１秒間（変性のため）と５４℃で１秒間（アニールのため）と７２℃で１秒間（ＤＮＡ伸長のため）を５０サイクル、で行った。
　ＰＣＲ反応後、実施例１と同様にＰＣＲ反応物を電気泳動に供した。図１８は電気泳動の結果を示す。図１８から明らかな通り、１４７ｂｐの標的配列が効率的に増幅された。
　（比較例３）
　実施例３における反応溶液のブロック核酸を蒸留水に置換したこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲ反応を実施した。図１９は比較例３の電気泳動の結果を示す。
　図１９から明らかなように、１４７個の塩基対からなる標的配列が増幅されただけでなく、３７５～７１２個の塩基対からなる２本鎖ＤＮＡが非特異的に増幅されている。
　図２０は、実施例３および比較例３において、電気泳動の解析結果から算出された非特異的な増幅産物の濃度の総和を示すグラフである。図２０から明らかなように、比較例３では２６．９３ｎｇ／μＬの非特異的な増幅が生じている。一方、実施例３では当該総和はわずか５．９７ｎｇ／μＬに減少している。このことは、実施例１および実施例２と同様、第１ブロック核酸２０および第２ブロック核酸３０は標的配列の効率的な増幅に寄与することを示す。
　本発明は、一般的なＰＣＲ反応に利用可能である。本発明は、臨床検査のためのＰＣＲにも利用できる。
１　二本鎖標的配列
　１ａ　一本鎖標的配列
　１ｂ　相補的一本鎖標的配列
２　望まれる増幅二本鎖ＤＮＡ配列
３　望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列
　３ａ　望まれない増幅一本鎖ＤＮＡ
　３ｂ　望まれない増幅相補的一本鎖ＤＮＡ
４　フォワードプライマー
５　リバースプライマー
６　第１一本鎖ＤＮＡ
　６ａ　第１非増幅配列
　６ｂ　第２非増幅配列
　６ｃ　一本鎖標的配列１ａの３’末端部分
　６ｅ１　第１複製配列
　６ｅ２　第３複製配列
　６ｇ　増幅一本鎖標的配列
７　第２一本鎖ＤＮＡ
　７ａ　第３非増幅配列
　７ｂ　第４非増幅配列
　７ｃ　相補的一本鎖標的配列１ｂの３’末端部分
　７ｅ　第２複製配列
　７ｅ２　第２複製配列
　７ｇ　増幅相補的一本鎖標的配列
２０　第１ブロック核酸
３０　第２ブロック核酸
配列番号１：標的配列としてのヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー
配列番号２：標的配列としてのヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子を増幅するためのリバースプライマー
配列番号３：標的配列以外の非特異的増幅を抑えるためのオリゴ核酸（ＤＮＡ）
配列番号４：標的配列としてのヒトアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ２遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー
配列番号５：標的配列としてのヒトアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ２遺伝子を増幅するためのリバースプライマー
配列番号６：標的配列以外の非特異的増幅を抑えるためのオリゴ核酸（ＤＮＡ）
配列番号７：標的配列としてのヒトジストロフィン遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー
配列番号８：標的配列としてのヒトジストロフィン遺伝子を増幅するためのリバースプライマー
配列番号９：標的配列以外の非特異的増幅を抑えるためのオリゴ核酸（ＤＮＡ）
配列番号１０：標的配列以外の非特異的増幅を抑えるためのオリゴ核酸（ＤＮＡ）

Claims (8)

  1. 　第１一本鎖ＤＮＡおよび第２一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列を増幅する方法であって、
    　前記二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列および相補的一本鎖標的配列からなり、
    　前記第１一本鎖ＤＮＡは、３’末端－第１非増幅配列－前記一本鎖標的配列－第２非増幅配列－５’末端からなり、
    　前記第２一本鎖ＤＮＡは、５’末端－第３非増幅配列－前記相補的一本鎖標的配列－第４非増幅配列－３’末端からなり、
    　前記相補的一本鎖標的配列、第３非増幅配列、および第４非増幅配列は、それぞれ、前記一本鎖標的配列、前記第１非増幅配列、および第２非増幅配列と相補的であり、
    　前記方法は、
    　ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ、フォワードプライマー、リバースプライマー、および第１ブロック核酸を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記二本鎖標的配列を増幅する工程Ａ、
    　ここで、
    　前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーは、いずれも、前記ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用し、
    　前記フォワードプライマーは、前記一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の配列の部分に相補的であり、
    　前記リバースプライマーは、前記相補的一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の部分の配列に相補的であり、
    　前記第１ブロック核酸は、前記ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用せず、
    　前記第１ブロック核酸は、前記第３非増幅配列の一部と相補的である、方法。
  2. 　前記第１ブロック核酸は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記第１ブロック核酸は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記第１ブロック核酸は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記工程Ａにおいて、第２ブロック核酸も混合される、請求項１に記載の方法。
    　ここで、前記第２ブロック核酸は、前記ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用せず、かつ前記第２非増幅配列の一部と相補的である。
  6. 　前記第２ブロック核酸は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記第２ブロック核酸は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、請求項５に記載の方法。
  8. 　前記第２ブロック核酸は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、請求項５に記載の方法。
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